ANALISIS INSTRUMENTAL

ANALISIS INSTRUMENTAL ESPECTROSCOPÍA Estudio de la interacción entre la radiación electromagnética (luz) y la materia, con absorción o emisión de la energía radiante. Espectroscopía atómica Luz se comporta como onda y partícula. Espectro electromagnético: electromagnético: Distribución energética del conjunto de las ondas electromagnéticas.

Técnica

Excitación

Relajación

Espectroscopía de emisión atómica

Calor

UV-vis

Espectroscopía de absorción atómica

U V- v i s

Calor  

Referido a un objeto se denomina espectro Espectroscopía de U V- v i s UV-vis electromagnético o fluorescencia atómica simplemente espectro a la radiación Espectroscopía de Rayos X Rayos X rayos X electromagnética que emite (espectro ( espectro de Espectroscopía molecular emisión) emisión ) o absorbe (espectro ( espectro de absorción) absorción ) Técnica Radiación electromagnética una sustancia. Dicha radiación sirve para Espectroscopía de identificar la sustancia de manera análoga resonancia magnética Radiofrecuencias a una huella dactilar . Los espectros se nuclear  Espectroscopía de microondas Microondas  pueden observar  Espectroscopía infrarroja Infrarrojo mediante espectroscopios que, además de Espectroscopía  permitir observar el espectro, permiten Ultravioleta-visible ultravioleta-visible realizar medidas sobre éste, como Espectroscopía de la longitud de onda, onda , la frecuencia y la fluorescencia Ultravioleta-visible ultravioleta-visible intensidad de la radiación. El espectro electromagnético se extiende desde la radiación de menor longitud de onda, como los rayos gamma y los rayos X, X, pasando por la luz ultravioleta, ultravioleta , la luz visible y los rayos infrarrojos, infrarrojos, hasta las ondas electromagnéticas de mayor longitud de onda, como son las ondas de radio. radio .

ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION 1. Molecular 2. Atómica El analito absorbe la energía transportada por un fotón pasando a un estado de mayor  energía. Intensidad de fotones que pasa a través de una muestra se atenúa debido a absorción, medida = absorbancia. Instrumentación Fuente de energía • de radiación electromagnética: fuente continua: radiación dentro de una amplia gama de λ  fuente lineal: emiten radiación en algunas gamas estrechas de λ 

• de energía térmica: llamas y plasmas • de energía química: reacciones exotérmicas Selección de λ: se intenta seleccionar solo una, para que sólo el analito absorba.

• Filtros de absorción o interferencia (no permiten selección continua de λ) • Selectores monocromáticos: utiliza red de difracción o prisma que permite la variación continua de la λ que se deja pasar  Slit: rendija por la que pasa la luz Slit pequeño: baja sensibilidad y alta resolución (análisis cualitativo) Slit grande: alta sensibilidad y baja resolución (análisis cuantitativo) Detectores: utilizan un transductor que convierte la señal formada por fotones en señal eléctrica fácil de medir. Lo ideal es que la señal del detector sea una función lineal de la  potencia de la radiación electromagnética. Detector Fototubo Fotomultiplicador Fotodiodo de Si Fotoconductor Célula fotovoltaica

Transductores Transductores de fotones Rango λ 200-1000nm 110-1000nm 250-1100nm 750-6000nm 400-5000nm

Termopar Termopar Termistor Neumático Piroeléctrico

Transductores Transductores térmicos 0,8-40 mm Voltaje 0,8-40 mm Cambio de resistencia 0,8-1000 mm Desplazamiento membrana 0,3-1000 mm Corriente

Señal emitida Corriente Corriente Corriente Cambio de resistencia Corriente o voltaje

Procesadores de la señal: La señal eléctrica generada por el transductor se envía a un procesador que la presenta de forma más cómoda para el analista. analista. El procesador puede usarse también para calibrar  la respuesta del detector, amplificar la señal procedente del detector, eliminar ruido mediante filtración o transformar matemáticamente la señal. 1. ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION MOLECULAR 

• UV/VISIBLE Cuando una molécula o ión absorbe radiación UV o visble sufre un cambio de su configuración de electrones de valencia. Transiciones en que un electrón pasa de un orbital ocupado a otro no ocupado σ  σ* n  σ* π  π* n  π* Los enlaces y grupos funcionales que originan la absorción de radiación UV y visible = cromóforos. Transmitancia: cuociente entre la luz transmitida y la incidente. T= P/Po x 100 se obtiene transmitancia porcentual 100%T es una sustancia totalmente transparente 0% T una sustancia totalmente opaca Ley de Lambert Beer: relación lineal entre la absorbancia (o transmitancia) transmitancia) y la concentración concentración de la muestra. A=εbc A = log 1/T ε coeficiente de extinción molar: probabilidad de que el analito absorba un fotón de una energía determinada, por lo tanto depende de λ y del disolvente. En muestras con múltiples componentes las absorbancias son aditivas. Limitaciones ley L-B: - fundamen fundamental tales: es: váli válida da solo solo para concentr concentracio aciones nes bajas bajas de analito analito (concentraciones altas se pierde la independencia de partículas del analito de las demás. Las interacciones pueden cambiar el valor del coeficiente de extinción molar) - química químicas: s: cuando cuando las especie especiess absorbent absorbentes es partic participa ipann en una una reacció reacciónn de equilibrio - instrumen instrumental tales: es: váli válida da solo solo para para radiac radiación ión monocromá monocromática tica.. Radiac Radiación ión  policromática  policromática produce desviación desviación negativa. negativa. Radiación difusa (alanza detector pero no sigue el camino óptico entre fuente y detector) por 

imperfecciones del selector de λ que permiten que luces extrañas se cuelen también interfieren. Instrumentación: Fotómetro de filtro: utiliza un filtro de absorción o interferencia. Espectrómetro: utiliza un monocromador. Puede ser mono haz o doble haz (con ayuda de un chopper). Doble haz: se puede desdoblar haz a intervalos regulares. La mitad de la luz atraviesa la muestra y la otra un blanco. La absorbancia medida tiene en cuanta la tasa de absorción muestra/banco y permite corregir desviaciones en el detector y en la fuente de salida. Fuentes: dependiendo de la zona de trabajo. Deben ser uniformes en intensidad - Lámpara H2 y D2: continua 160-380 (UV) - Lámpara tungsteno: continua: 320-2400nm (VIS) Cubetas:

-

vidrio o sílice (VIS) cuarzo (UV)

Monocromador: debe tener: rendija de entrada, elemento dispersante (prisma o red de difracción), espejos que guían los haces, rendija de salida. Slit pequeño: baja sensibilidad, alta resolución Slit grande: alta sensibilidad y baja resolución (se puede perder linealidad pq deja entrar  luz policromática) Detectores (de fotones): conversión de radiación en flujo de electrones y  posteriormente en corriente o voltaje en el circuito de lectura: -

-

célula fotovoltaica: Consisten en un electrodo (ánodo) de un metal (Cu, Fe, Al) en el que se deposita un material semiconductor como selenio y después se recubre con fina película de Ag o Au. Esto sirve como electrodo colector (Ag). La energía radiante genera una corriente en la interfase entre el semiconductor y el metal. Al incidir radiación el semiconductor se vuelve conductor, se liberan electrones y huecos +. Electrones pasan a circuito externo para recombinarse con huecos que migran hacia el metal base, se crea una corriente cuya magnitud es  proporcional al número de fotones que inciden. (es difícil amplificar la señal de salida, manifiestan fatiga) fototubo: fotón incide en cátodo recubierto con una superficie fotoemisora. Se obtiene corriente proporcional a intensidad fotónica. Tubos producen pequeñas corrientes oscuras debidas a efectos térmicos Tubo fotomultiplicador: la señal se amplifica mediante el uso de dinodos en serie. Cada dinodo se conecta a una fuente externa de 90V generando en el colector una avalancha de 10 6-107 electrones por fotón incidente Fotodiodos de silicio: la absorción de la radiación electromagnética aumenta la conductividad a través de una unión pn de polarización inversa. Se pueden miniaturizar y utilizar en series lineales de fotodiodos Detector de arreglo de diodos: permite detectar simultáneamente la radiación de varias λ. Rápida adquisición de espectros.

Factores que influyen en absorción: - solventes: pueden absorber luz, interaccionar con analito y disminuir  absorción, interferir con absorción - pH - ancho slit Aplicaciones espectrometría de absorción molecular - Titulaciones fotométricas - Estequiometría de un complejo ML - Determinación constantes de equilibrio - Determinación constante de acidez - Determinación de 2 compuestos que absorben a 2 λ distintas Evaluación: - Exactitud: 1-5% errores relativos. Está limitada por la calidad del blanco - Precisión: limitada por errores indeterminados o ruido instrumental - Sensibilidad: equivalente a la pendiente de la curva de calibrado de ley lambert-beer. Mejora cuando se selecciona la λ en el máx de absorbancia o cuando se aumenta longitud del paso de luz Error fotométrico: ∆c/c= (0,434 * ∆T ) / TlogT ∆T: característica del instrumento Es conveniente ajusta el intervalo óptimo de transmitancia en que el error de concentración es mínimo. Es fácilmente demostrable que calibrado que suponga un 2080% de transmitancia, el error es mínimo. ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL IR  Región que se utiliza en espectro infrarrojo: 2500-16000nm. En esta zona se consigue excitar transiciones vibracionales de la molécula: estiramientos y flexiones de los enlaces. Cuando una molécula se irradia con radiación electromagnética de la zona IR, el enlace de vibración absorbe energía radiante si la frecuencia de vibración es igual a la de la radiación. Cuando una molécula absorbe radiación IR, la vibraciones molecular con frecuencia igual a la luz aumenta en intensidad, es decir, el enlace que une 2 átomos se estira y comprime un poco más Cada frecuencia de luz absorbida por la molécula corresponde a la frecuencia de vibración de un enlace específico. Cada molécula dará lugar a un IR diferente. Así observando su IR podemos saber qué enlaces hay y por lo tanto los grupos funcionales que existen en un compuesto orgánico. La frecuencia exacta de una transición para un enlace determinado va a depender entre otras cosas de la fuerza de enlace y de la masa de los átomos en los extremos del enlace. Espectro IR: % transmitancia v/s número de onda (cm -1). Intensidad se puede expresar como transmitância o absorbancia.

Instrumentación Fuentes: - Lámpara tungsteno em IR cercano - Bombilla nerst (oxidos de tierras raras): continua, 04-20mm - Globar nicrom (carburo de silício): continua, 1-40 mm - Filamento de wolframio - Laser de CO 2 Constan de um sólido interte que se calienta eléctricamente a 1500-2200K y se obtiene una radiación continua. Detectores: energía de IR no es suficiente para producir una corriente medible cuando se utiliza un detector de fotones. La absorción de fotones infrarrojos por detectores térmicos aumenta su temperatura cambiando sus propiedades. Detectores térmicos: - termopar: la radiación incide sobre la unión de 2 metales (ej Bi y Sb) la cual genera una diferencia de potencial que varía en función de la temperatura. Detecta variaciones del orden de 10 -6K. 600-20.000nm - bolómetro: tipo de termómetro de Pt o Ni en los cuales cambia la resistencia en función de un pequeño cambio de temperatura. Si está constituido por Si se llama termistor. 600-20.000nm Detectores piroeléctricos: Cambia la polarización en función de la temperatura generando un potencial eléctrico  producido por movimiento de cargas + y – a los extremos opuestos de la superficie a través de la migración. Se usa un material piroeléctrico como el sulfato de glicina. En IR se puede acoplar al detector un procesador de Transformada de Fourier (FTIR): se sustituye el monocromador por un interferómetro (hace que todas las λ  lleguen al mismo tiempo al detector) Aplicaciones: útil para identificar compuestos orgánicos e inorgánicos puros. Analisis cuantitativo menos útil que rango uv-vis. Hay más desviaciones a ley de beer. Se  pueden determinar hidrocarburos totales por enlace C-H. Determinación de contaminantes en el aire. Espectro: % T v/s n° de onda (cm -1)

2. ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA Moléculas se atomizan hasta átomos o iones elementales en estado gaseoso. Así se mide la absorción UV-VIS, la emisión o la fluorescencia de las especies. Instrumentación:

Métodos introducción de la muestra: sometida a un proceso de preparación en que pasa a disolución orgánica o acuosa: - nebulización neumática (disolución o suspensión) - nebulización ultrasónica (disolución) - vaporización electrotérmica (sólido, líquido, disolución) - generación de hidruros (disolución de ciertos elementos) - inserción directa (sólido, polvo) - ablación por laser (sólido, metal) - ablación por arco o chispa (sólido conductor) - chisporroteo de descarga luminiscente (sólido conductor) Atomización de llama y electrotérmica requieren muestra líquida o en disolución. Las muestras sólidas deben disolverse en solvente adecuado, si no es solublel deben digerirse usando HNO 3, H2SO4, o HClO4. Para concentrar los analitos suele recurrirse a extracción líquido-líquido. Atomizador: llama, electrotérmico, generador hidruros, vapor en frío (Hg) Fuente: lámpara cátodo hueco Monocromador  Detector: fototubos, tubos fotomultiplicadores, etc Sistema de lectura y procesamiento de la señal

• Absorción atómica con llama (FAAS): Atomización: llama (cámara de aerosol, gases de combustión: combustible y oxidante) Ventajas: mínimas interferencias espectrales, pequeña dependencia de la temperatura,  buena sensibilidad y exactitud Desventajas: solo metales (otros elementos forman óxidos rápidamente), análisis cuantitativo. Ionización: si hay exceso de energía se produce ionización además de atomización. Iones interfieren. Agregar otro elemento con potencial de ionización mayor. A concentraciones bajas. Autoabsorción: desviaciones a concentraciones altas. Átomos absorben la radiación de átomos vecinos y no de la fuente de excitación. Análisis cuantitativo: A = KbC K: involucra eficiencia de la atomización y el paso al estado excitado (sensibilidad)  b: paso a través de la llama C: concentración de átomos en la llama Se pueden analizar 67 elementos, la muestra debe estar líquida y disponer de al menos 2-4 mL.

• Atomización electrotérmica Se utiliza calentamiento calentamiento por resistencia resistencia en lugar de por llama. LD menor. Atomizador típico: Horno de grafito: por el tubo pasa una corriente eléctrica eléctrica que  produce un calentamiento por resistencia. 3 fases: 1. Secado 50-200 °C 2. Calcinación 200-800°C 3. Atomización 2000-3000°C Muestras entre 5-50uL. Señal de salida: abs v/s ug/ml. Se deben utilizar patrones.

• Atomización por generador de hidruros Reacción química que produce un producto volátil. Elementos como As, Se, Sb, Bi, Ge, Sn, Te y Tb forman hidruros volátiles cuando reaccionan con NaBH 4 en medio ácido. Un gas inerte transporta hidruros volátiles a una llama o tubo de observación de cuarzo calentado situado en la vía óptica. • Atomización en vapor frío Sólo para mercurio. Se trata muestra con ácido nítrico y sulfúrico (Hg 2+) y luego reducción del mercurio con SnCl 2. mercurio elemental conducido conducido a tubote absorción en camino óptico largo. Elección método de atomización: depende principalmente de la concentración de analito. LD menor para atomización electrotérmica, gran sensibilidad. Atomización con llama mayor precisión, menos interferencias, mayor cantidad de muestra y menos experiencia por lo tanto se elige este cuando la concentración del analito es mayor al LD, sino se utiliza la atomización electrotérmica. Selección λ y amplitud de rendija: lámpara de cátodo hueco proporciona líneas de emisión que corresponden con el espectro de absorción del analito. La sensibilidad de una línea de absorción atómica se describe por su concentración carácterística (concentración del analito que proporciona un 99% de transmitancia) en general se elige la λ que proporciona mejor sensibilidad (y que absorba solo analito y no interferente) Interferencias de matriz: se produce por el cambio en la viscosidad y densidad de la muestra con respecto a las disoluciones estándares. Hay que igualar propiedades físicas de patrones y muestras: método de la adición de estándar. Si la composición de la matriz es conocida se pueden preparara patrones de matriz idéntica. Si el fondo se debe a un componente conocido de la matriz se puede agregar un exceso de él a todas las muestras. Interferencias espectrales: cuando la línea de absorción de un analito se superpone con la línea o banda de absorción de un interferente. interferente. Absorción y dispersión se corrigen analizando un blanco. Interferencias Interferencias químicas: presencia de compuestos compuestos que forman productos estables con el analito. Se pueden añadir agentes protectores y liberadores. Ionización.

Estandarización método: ley de beer también se aplica pero en general no hay buena linealidad. Curvas se pueden adaptar usando ecuaciones cuadráticas y cúbicas. Lo mejor  es hacer análisis cuantitativo con patrones externos, aunque las interferencias de matriz son frecuentes. A menudo se recurre al método de adición del patrón aunque tiene la limitación de que debe haber relación lineal entre absorbancia y concentración. Sensibilidad: depende de la composición de la llama y la posición. Se puede mejorar  aspirando un patrón y ajustando las condiciones de funcionamiento. En atomización electrotérmica depende de las fases de secado y formación de cenizas. Para cada tipo de muestra han de establecerse la temperatura y tiempo utilizados en cada fase. Excelente selectividad. ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN (molecular) Relajación: analito pasa de estado de alta energía a baja energía, la liberación puede ser  en forma de calor o radiación electromagnética. Fluorescencia: emisión de un fotón cuando el analito regresa a un estado de menor  energía con el mismo espin que el estado de mayor energía Fosforescencia: Fosforescencia: emisión de un fotón cuando el analito regresa al estado de baja energía con espin contrario al estado de alta energía. Espectro de excitación: controlando la emisión en una λ fija y variando la λ de excitación. Permite seleccionar la mejor λ para análisis cuantitativos o cualitativos. Una molécula solo tiene 1 espectro de excitación, pero 2 de emisión (fluorescencia y fosforescencia). Instrumentación: Para fluorescencia: fluorescencia: 2 diseños para medirla 1. Fluorímetro: las λ de excitación y emisión se seleccionan seleccionan mediante filtros de absorción o interferencia. Fuente de excitación: lámpara de vapor de mercurio de baja  presión que proporciona intensas líneas distribuidas por toda la región UV/VIS. 2. Espectrofluorímetros: Espectrofluorímetros: utilizan selectores monocromáticos para λ de emisión y excitación. Fuente de excitación: lámpara de arco de Xe de alta presión con espectro de emisión continuo. Cubetas: similares a absorción óptica molecular. Ambos útiles para análisis cuantitativos, para obtener espectro de emisión o excitación solo puede usarse espectrofluorímetro. espectrofluorímetro.

Fosforescencia: se debe discriminar entre fosforescencia y fluorescencia. Esta última tiene menor tiempo de vida, se logra retrasando la medición entre la excitación y la medición de la emisión de fosforescencia. 2 hélices controlan esto. Aplicaciones cuantitativas de luminiscencia molecular: fluorescencia (en mayor medida que fosforescencia) utilizada para análisis cuantitativo directo o indirecto. Indirecto cuando analito no fluorescente y se hace reaccionar con reactivo para formar producto con propiedades fluorescentes. También se puede medir la disminución en la fluorescencia debida al analito. Analitos inorgánicos generalmente no tienen fluorescencia suficiente. Los orgánicos muchas veces contienen anillos aromáticos que suelen ser fluorescentes. Alta selectividad. Sensibilidad depende de: rendimiento cuántico, fuente de excitación, volumen muestra. ESPECTROSCOPÍA DE EMISIÓN ATÓMICA Emisión atómica: cuando un electrón de valencia pasa a un nivel de mayor energía a uno menor. Equipo similar al de absorción atómica. atómica. Atomización y excitación La misma fuente de energía térmica suele servir también como fuente de excitación Por llama o plasma Fuentes de llama: atomización y excitación con el mismo conjunto de nebulizador y cámara de aerosol utilizado en absorción atómica. Poca utilidad (mejor plasma) salvo  para el análisis de metales alcalinos y ocasionalmente calcio. Estos elementos se excitan a temperaturas relativamente bajas y dan espectros sencillos y exentos de interferencias. Debido a la simplicidad fotómetros de filtros son suficientes para las determinaciones. Dependencia con temperatura de la llama. Fuentes de plasma: plasma: gas caliente y parcialmente ionizado con concentración abundante de cationes y electrones que lo convierten en conductor. Frecuentemente se emplea plasma de argón. Elevadas temperaturas temperaturas se alcanzan por el calor de la resistencia desarrollado por el movimiento de electrones y iones de argón. 3 tipos: 1. Plasma de acoplamiento acoplamiento inductivo (ICP) 2. Plasma de corriente continua (DCP) 3. Plasma inducido por microondas (MIP) 1. Plasma de acoplamiento inductivo: antorcha: 3 tubos concéntricos de cuarzo a través de los cuales fluye corriente de argón. Ionización de argón se inicia por medio de una chispa proveniente de bobina tesla. Iones resultantes y sus electrones interaccionan con el campo magnético oscilante producido por bobina de inducción. Esto hace que iones y electrones se muevan en trayectorias circulares; calentamiento es consecuencia de la resistencia que presentan iones y electrones a este movimiento. - circular Ar por la antorcha - se aplica radiofrecuencia

- una chispa produce electrones libres en argón - se aceleran electrones en la antorcha causando más ionización - la muestra atraviesa la antorcha Se puede hacer análisis multielemental: porque todos los analitos se excitan al mismo tiempo. Puede programarse selector monocromático variable para que se mueva rápidamente entre λ. O se puede usar un aparato de canales múltiples que permita controla de forma simultánea muchos analitos (red de difracción con 48-60 rendijas de salida separadas y detectores colocados en disposición semicircular alrededor de la red de difracción) Introducción de la muestra: mediante flujo de argón a través de tubo central de cuarzo. Se utilizan nebulizadores (con corriente de argón) gotitas se introducen en plasma. Selección fuente de atomización y excitación: mejor plasma Selección λ: (harta interferencia por superposición), forma más fácil es obtener espectro de emisión de la muestra y después buscar una línea de emisión del analito que  proporcione señal intensa y que se encuentre separada de las demás líneas de emisión. Interferencias espectrales: más importantes son una fuente continua de emisión de fondo a partir de llama o plasma, se hace insignificante a altura 10-30 mm por encima del centro, donde se hacen las mediciones. Interferencias químicas: se disminuyen añadiendo agentes protectores, liberadores y supresores de ionización. Estandarización método: intensidad de emisión proporcional a la población del estado excitado de la que se origina la línea de emisión. ESPECTROSCOPIA DE DISPERSIÓN ESPECTROMETRÍA DE MASAS ATÓMICA Muy utilizada para identificar elementos presentes en muestras de materia y determinar  sus concentraciones. Ventajas: mejores LD, espectros sencillos únicos y fácilmente interpretables. Puede medir relaciones isotópicas atómicas. Desventajas: caro, deriva del instrumento del 5-10% por hora. Etapas: 1. Atomización 2. Conversión de una fracción significativa de átomos en iones (generalmente +) 3. Separación de iones según masa/carga 4. Recuento del número de iones de cada tipo o medida de la corriente iónica producida cuando iones inciden en detector. 1 y 2 igual que en espectroscopía atómica. 3 y 4 se hacen en espectrómetro de masas.

Distintos tipos de espectrometría de masas: plasma de acoplamiento inductivo (ICPMS); plasma de corriente continua (DCPMS); plasma por inducción de microondas (MIPMS); fuente de chispa (SSMS); ionización térmica(TIMS); descarga luminiscente (GDMS); microonda láser (LMMS); ión secundario (SIMS). Espectrómetro de masas: separa los inoes que se desplazan rápidamente según su relación carga/masa. 3 tipos más corrientes - cuadrupolar  - de tiempo de vuelo - de doble enfoque Componentes de espectrómetro de masas Fuente de iones gaseosos Entrada

Analizador de masas

Detector iones Procesador 

La función del analizador de masas es análoga a la de un monocromador. La dispersión se realiza en función de la relación masa/carga de los iones del analito. El detector  convierte el haz de iones en una señal eléctrica que pueda ser procesada, almacenada y registrada de alguna forma. Componentes requieren bajas presiones (salvo procesador). Detectores: - Canales multiplicadores de electrones: similar a fotomultiplicador. Cada dinodo se mantiene a un potencial más alto que el anterior. Cátodo y los dinodos tienen superficies de Cu/Be de las que se emiten ráfagas de electrones cuando son alcanzados por los iones o electrones de alta energía. Son robustos y fiables, capaces de proporcionar  ganancias de corriente elevadas y tiempos de respuesta de nanosegundos. Iones que alcanzan el detector tiene suficiente energía como para expulsar electrones desde la  primera zona del dispositivo. - Copa de Faraday. Analizador de masas cuadrupolar: más común. Elevada velocidad de barrido. 4  barras paralelas que actúan como electrodos. Bandas opuestas se conectan elléctricamente. Se aplican a cada par de barras potenciales variables de corriente alterna de radiofrecuencia, que están desfasados 180 grados. El que un ión choque o no contra la barra depende de la velocidad del movimiento del ión a lo largo del eje z-y, su relación masa/carga y la magnitud de la señal de corriente alterna y continua. Espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICPMS) Bajo limite de detección, alto grado de selectividad y su razonable buena precisión y exactitud lo han hecho muy importante para el análisis elemental. Antorcha de ICP sirve como atomizador y ionizador. Se introduce muestra por  nebulizador. Iones producidos en la antorcha se introducen a través de interfase de vació diferencial unido a un espectrómetro de masas cuadrupolar. Se obtienen espectros

sencillos que se utilizan para determinación cualitativa y cuantitativa (por curvas de calibrado en que se representa el cuociente entre el recuento de iones para el analito respecto del recuento para un patrón interno en función de la concentración). Análisis cuantitativos: el más utilizado emplea un conjunto de patrones de calibración  para preparar curva e calibrado. Un patrón único en disolución acuosa adecuado si muestra problema esta lo suficientemente diluida (<2000ug/ml) de sólidos disueltos totales. Para concentraciones elevadas de elementos de matriz se intenta igualar los elementos presentes en la matriz de las muestras con los patrones. Patrón interno (elemento ausente de las muestras y que tiene una masa atómica y un  potencial de ionización próximo al de los analitos) para compensar la deriva del instrumento, las inestabilidades y los efectos de matriz.

CROMATOGRAFÍA Eficiencia cromatografía:

Resolución: separacion de 2 picos cromatográficos

t = tR2 – tR1

Factor de capacidad (k ´) : Medida de la fuerza con que la FE retiene el analito K´= t´R/tm

Factor de selectividad ( = k´1/k´2

) : Selectividad relativa de la FE para un par de analitos

Al comenzar una separación cromatográfica el soluto ocupa una estrecha banda de anchura finita. A medida que el soluto atraviesa la columna la anchura de su banda va

auementando. La eficacia de la columna proporciona una medida cuantitativa de la magnitud del ensanchamiento de banda. Plato teórico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar la columna como si estuviera compuesta de pequeñas zonas, o platos, en las que tiene lugar el reparto entre las fases móvil y estacionaria. La eficacia de una columna mejora con el aumento del número de platos teóricos o con la disminución de la altura del plato. Capacidad del pico: número máximo de solutos que pueden separarse en una columna dada. Factores que contribuyen al ensanchamiento de banda: (altura del plato se establece a partir de 4 contribuciones: 1. Difusión longitudinal: una contribución al ensanchamiento de la banda debida a la difusión del soluto desde las áreas de mayor concentración a las de menor  concentración. 2. Difusión en remolino: moléculas en disolución que atraviesan una columna cromatográfica siguen remolinos distintos de longitud variada. Así moléculas inyectadas al mismo tiempo se mueven con tiempos distintos. 3 y 4. Transferencia de masa: una contribución al ensanchamiento de la banda debida al tiempo necesario para que un soluto se desplace desde las fases móvil o estacionaria a la interfaz entre las dos fases. Ecuación de Van Deemter: ecuación que demuestra el efecto de la velocidad de flujo de la fase móvil sobre la altura de un plato teórico (cuenta los 4 factores antes mencionados).

CROMATOGRAFIA DE GAS Cromatografía gas-líquido: Fase móvil: gas inerte (He, Ar, N 2) Columna: empaquetada o capilar  • Empaquetada: de vidrio, acero, cobre o aluminio. Se llena co soporte sólido en forma de partículas (tierra datomeas) • capilar: FSOT: columna cubierta de sílice fundida recubierta con polímero protector  WCOT: columna abierta de pared recubierta (fina capa de fase estacionaria que reviste  pared interna de capilar) SCOT: columna abierta recubierta con soporte (sobre pared interna existe fina capa de sorte sólido revestido por fase estacionaria líquida)

Fase estacionaria: depende de lo que se quiera separar, polar apolar. Da selectividad. Debe ser químicamente inerte, térmicamente estable, baja volatilidad, polaridad adecuada. (ej escualeno no polar, polietilenglicol polar, polidimetil siloxano ligeramente  polar, se puede aumentar polaridad cambiando sus grupos metilo) Problema común a fase estacionaria líquida: sangrado (tendencia de la fase estacionaria a eluir de la columna), límites de temperatura disminuyen esto Separación mejor cuanto más fina es la película de fase estacionaria (para solutos muy volátiles hay que usar películas más gruesas) ELECCIÓN DE LA COLUMNA: •

Polaridad: Las fases móviles no polar separan los compuestos basados  principalmente en sus temperaturas de ebullición. Las fases de polaridad intermedia separan los compuestos de acuerdo a la temperatura de ebullición y a la interacción de los dipolos inducidos o a los puentes de hidrógeno. Las fases

• • • •

• • • •

móviles polares y altamente polares retienen los compuestos polares debido a la interacción dipolo-dipolo entre los grupos funcionales de la muestra y de la fase estacionaria. Estabilidad térmica de columnas Polares y Apolares. Generalmente, a medida que la polaridad de una columna aumenta, la estabilidad térmica disminuye. Espesor del film. Por regla general debería usarse film delgados para compuestos con temperaturas de ebullición altas y film mas gruesos para compuestos que eluyen rápidamente. De esta forma, los compuestos se produce interacción con la fase estacionaria y se retarda la elución. 3 -5 µ m: gases, solventes y compuestos de temperatura de ebullición cercana a la ambiente. 1 - 1.5 µ m: muestras que eluyen entre 100 a 200 oC. 0.25 - 0.5 µ m: muestras que eluyen sobre los 300 oC (esteroides, triglicéridos, ceras). 0.1 µ m: son ideales para compuestos de alto peso molecular y que eluyen sobre los 300 oC.

Inyector: Con divisor: solo entra pequeña parte de la muestra a la columna capilar (0,1-1%) Sin divisor: permite paso de más muestra (columna empaquetada) En columna: para muestras termolábiles Control de temperatura: columna se encuentra en horno con termostato. Separación isotérmica: T constate, ligeramente por debajo del punto de ebullición más  bajo de los solutos, favoreciendo interacción de solutos con fase estacionaria (problema, tiempos de retención muy largos para solutos con mayor punto de ebullición, se soluciona con hornos de temperatura regulable, a medida que separación progresa, se aumenta la temperatura). Detectores: Detector Límite de Rango detección g lineal TCD 10-5-10-6 103-104 FID

10-12

ECD

10-14

NPD

10-8-10-14

MSD

10-12

Comentarios Tratamiento analito Detector   No destructivo universal 6 7 10 -10 Detector  Destructivo universal 2 3 10 -10 Detector   No destructivo selectivo 5 7 10 -10 Detector  Destructivo Selectivo N,P Según tipo Detector  Destructivo detector  universal

TCD: detector de conductividad térmica (helio como fase móvil). Ventajas: universal (señal para cualquier analito), su respuesta a las concentraciones de soluto es lineal en

un amplio rango, no destructivo. Desventajas: peores LD (imposibilita la utilización en columnas capilares debido al pequeño tamaño de muestras) FID: detector de ionización de llama. Número de iones que se produce es relativamente roporcional al número de átomos de carbono reducidos en la llama. El detector responde al número de átomos de carbono que entra en el detector por unidad de tiempo por ello es más un detector sensible a la masa, que un sistema sensible a concentración. No  producen señal los grupos carbonilo ni carboxilo (ni alcohol, halógeno y amina). Ventajas: LD, respuesta lineal, detector para muestras ambientales y acuosas, bajo ruido. Desventajas: muestra se destruye. ECD: detector de captura de electrones: fase móvil N 2. Selectivo para solutos con grupos halógenos o nitro. Insensible para aminas, alcoholes e hidrocarburos. Importante  para detección de contaminantes clorados. Excelente LD pero respuesta lineal abarca solo 2 órdenes de magnitud. NPD: ionización de llama alcalina: responde a compuestos que contienen nitrógeno o fósforo. MSD: espectro de masas. Solutos Que eluyen pasan directamente a la cámara de ionización del espectrómetro de masas. El espectro de masas proporciona información cualitativa que permite identificar el analito. Aplicaciones cuantitativas: la altura o área del pico cromatográfico permiten determinar  su concentración. Altura fácil de medir pero utilidad limitada por la relación inversa ente altura y anchura del pico. Una mejor opción: área bajo el pico, que es directamente  proporcional a la cantidad de analito inyectado. Curvas de calibración suelen hacerse analizando una serie de patrones externos y representando la señal del detector en función de concentraciones conocidas. Mientras volumen inyectado sea igula en  patrones y muestras la curva de calibración proporcionará resultados exactos y precisos. Igual el volumen puede diferir en 5% o más. Para trabajos en los que se require de gran exactitud y precisión se efectúan usando un patrón interno (corrige variaciones entre una inyección y otra).

Aplicaciones cualitativas: cuando se usa como detector un IR-TF o un espectrómetro de masas la información espectral disponible se emplea para identificar solutos individuales. Con los detectores convencionales no espectroscópicos hay que recurrir a oros métodos. Por ejemplo hacer una adición de patrón a la muestra añadiendo una alícuota del  presunto analito y buscando un aumento en la altura del pico. También se pueden usar  tablas con tiempos de retención de patrones pero está limitado porque las condiciones nunca son iguales. Solución: Indice de retención de Kovat: método para normalizar los tiempos de retención de un soluto con los de alcanos normales.

• Índice de retención de Kovats Es una relación lineal-logarítmica entre el volumen de elución y el número de carbonos. El índice de retención para un alcano normal es igual a 100 veces el número de átomos de carbono del compuesto independiente del relleno de la columna, la temperatura, flujos. etc. El índice de retención para los compuestos que no son alcanos normales varía según las condiciones cromatográficas. El índice de Kovats I definido para todos los n-alcanos en cualquier conjunto de condiciones y  para cualquier columna es:

• I C2H2z+2 = 100 z • Los valores del índice para los alcanos son 100, 200, 300, 400, 500 etc. El índice de retención para otros tipos de compuestos se define por la ecuación:

• I = 100z + 100 log (t´Ri/t´Rz),/log(t´Rz+1/t´Rz) • α zi = t´Ri/t´Rz

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN De las técnicas más utilizadas (no tiene la limitación de que las muestras sean térmicamente estables y fáciles de volatilizar como en cromatografía de gases). En HPLC: una muestra líquida o una muestra sólida disuelta en un disolvente adecuado se hacen pasar por una columna cromatográfica junto con una fase móvil líquida. La separación se efectúa gracias a las interacciones de las fases soluble y estacionaria, tales como la adsorción liquido- sólido, el reparto liquido-liquido, el intercambio de iones y la exclusión por tamaño, y las interacciones entre las fases soluto y móvil. Controlador de gradiente

• Columna

Bomba Fases móviles

Detector  Inyector 

Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño de  partícula entre 2 y 10 um se requieren presiones de algunos cientos de kg-fuerza por  centímetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones se requiere un equipo más sofisticado. Requisitos para un sistema de bombeo: 1. Generaciones de presiones por encima de 6.000 psi 2. Flujo libre de pulsaciones 3. Intervalo de caudales de 0,1 a 10 ml/min 4. Control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo 5. componentes resistentes a la corrosión (acero inox o teflón). Bombas recíprocas: son las que se usan en un 90%. Disolvente es impelido por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor de arrastre. Dos válvulas que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia fuera de un cilindro. El disolvente está en contacto directo con el pistón. Desventaja: producen flujo pulsado que debe amortiguarse. Ventajas: pequeño volumen interno, altas presiones de salida, fácil adaptación a la elución con gradiente y sus caudales constantes. Columnas: más utilizadas de acero inoxidable con diametro interno de 2,1-4,6mm y longitudes entre 30-300mm. Se empaquetan con partículas de sílice poroso. 40.00060.000 platos teóricos.

Guarda columna: para proteger columna del matrial que la ocluya o solutos que se forman irreversiblemente a la fase estacionaria. Fases estacionarias: (liq-liq) película líquida que reviste material empaquetado. Se une mediante enlaces covalentes a las partículas de sílice (reacción con organoclorosilano, y las que no hayan reaccionado se cubren con Si(CH 3)Cl. Propiedades de fase estacionaria depende del grupo alquilo R del organosilano. Si R es polar fase estacionaria será polar.

Cromatografía de fase normal: fase estacionaria polar y fase móvil no polar  Cromatografía de fase inversa: fase estacionaria no polar (C 8, C18) fase móvil polar (mas habitual) Sustrato de sílice se hidroliza en soluciones básicas por lo tanto pH de fase móvil debe ser menor a 7,5. Fases móviles: el orden de elución de solutos depende de la polaridad. - en fase normal: soluto menos polar eluye primero. El uso de una fase móvil menos polar alargará los tiempos de retención (mejora separación si una separación es mala pq los solutos eluyen muy rápido) - fase inversa: soluto más polar eluye primero. Si se aumenta polaridad de fase móvil se prolonga el tiempo de retención. Elección de la fase móvil: útil el índice de polaridad. Mezclando 2 o varias fases móviles puede obtenerse una polaridad intermedia. Para mejorar la separación también se puede modificar pH, variar uno o más de los disolventes de la fase móvil también (ejemplo agua, metanol, acetonitrilo, THF se usan en disolventes para cambiar tiempo de elución) Elución isocrática: uso de fase móvil cuya composición permanece constante durante la separación Elución en grandiente: cambio de la composición de la fase móvil a lo largo del tiempo (para esto hay varios depósitos de fase móvil). Hay que desgasificar solventes de fase móvil con bomba de vacío o purga con gas inerte como el He. Partículas capaces de ocluir la columna deben ser filtradas. Disolvente se mueve por las bombas mencionadas antes. Introducción muestra: imposible inyectar la muestra como en GC por las altas  presiones. Se usa un bucle de inyección. En posición de carga el bucle está separado de la fase móvil y abierto a la atmósfera. Se introduce muestra en interior con jeringa (lo que sobra a desagüe). Una vez cargada se gira el inyector, la fase móvil pasa a través del  bucle y arrastra a la muestra a través de la columna. Detectores HPLC:

Detector LD Ultravioleta 0.1 - 1 Indice de refracción 100 - 1000 Electroquímico (amperométrico) 0.01 - 1 Fluorescencia 0.001 - 0.01 Conductividad 0.5 - 1 Espectrofotometría de masa 0.1 - 1 Infrarrojo de transformada de Fourier 1000

¿útil con gradiente? si no no si no si si

Detector UV/VIS: el más utilizado porque muchos solutos absorben dicha radiación. El sistema más simple emplea emisión a 254 nm de una lámpara de mercurio y detección de una sola λ. También se utiliza lámpara de deuterio y un monocromador   para mediciones a λ variable. Cromatorama: absorbancia en función de tiempo de elución. LD: 100pg-1ng de analito inyectado (mejor fluorescencia) Limitación: fase móvil no debe absorber a λ elegida. Detector de arreglo de diodos: registran la totalidad del espectro proporcionando un cromatograma tridimensional que muestra absorbancia en función de λ y tiempo de elución. Detectores de fluorescencia: semejantes a fluorómetros y espectrofluorímetros. La fluorescencia se detecta por detector fotoeléctrico colocado perpendicular respecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos utilizan fuente de excitación de mercurio y 1 o más filtros para la radiación emitida. Los más sofisticados consisten en fuente de radiación de xenón y emplean monocromador en red para aislar la radiación fluorescente. Buena sensibilidad porque no todos los compuestos son fluorescentes. Detectores de índice de refracción: disolvente en su camino hacia columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el eluyente de la columna pasa por la otra mitad. Los dos compartimientos separados por una placa de vidrio montada en ángulo tal que si las 2 disoluciones difieren en índice de refracción se produce una desviación del haz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a superficie fotosensible del detector   provoca señal la cual una vez amplificada y registrada proporciona el cromatograma. Responden a casi todos los solutos (universal), son fiables y no dependen del caudal,  pero son muy sensibles a cambios de temperatura, no son tan sensibles. Detector por espectrometría de masas: problema: enorme contraste entre los volúmenes relativamente grandes de disolvente de cromatografía y los requerimientos de vacío de la espectrometría de masas. Para resolver esto se han desarrollado varias interfases. Proporciona información cualitativa, estructural que puede ayudar a identificar el analito. Aplicaciones cuantitativas: cálculos, más fácil que GC ya que inyección se hace con  bucle de inyección de volumen fijo así las variaciones en cantidad de muestra se reducen al mínimo y se pueden utilizar patrones externos y curva de calibración normal. EVALUACION:

Las diferencias entre cromatografía gaseosa y HPLC son escasas en cuanto a escala de operación, exactitud, precisión, sensibilidad, selectividad, tiempo y costo. - volúmenes de inyección suelen ser significativamente mayores en HPLC que en CG dada la mayor capacidad de las columnas de HPLC - la precisión de HPLC es mejor gracias al bucle de inyección - HPLC no se limita a analitos volátiles, se pueden analizar más compuestos que en GC. - Las columnas capilares de GC tienen más platos teóricos lo que  proporciona mayor poder de resolución para matrices complejas. La GC con columnas capilares proporciona rápidas separaciones con una resolución excelente, pero sólo para analitos volátiles o que puedan hacerse volátiles por  derivación adecuada. La cromatografía líquida puede usarse para una gama mayor de compuestos sin embargo los detectores más utilizados (UV, de fluorescencia y electroquímicos) no son tan universales como los detectores de ionización de llama utilizados en GC. Cromatografía de adsorción líquido-sólido: fase estacionaria es un adsorbente sólido (empaquetado de columna sirve de fase estacionaria, sílice o aluminio, polar). Fase móvil suele ser disolvente no polar o moderadamente polar (hexano, isooctano, cloruro de metileno). Ofrece ventaja (vs cromatografía liq-liq) solo para análisis de isómeros. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO: Fase estacionaria: resina polimerizada mediante enlaces cruzados, habitualmente  poliestireno con enlaces cruzados de divinilbenceno unidos covalentemente a grupos funcionales iónicos. Los contraiones de estas cargas fijas son móviles y pueden ser  reemplazados por iones que compiten por unión. 4 tipos de resinas: - resinas catiónicas (ác. fuerte): grf ác. sulfúrico –SO 3H - resinas catiónicas (ac. débil): grf AC. carboxílico –COOH - resinas aniónicas (base fuerte): grf sal de amonio cuaternaria R 4 N+ - resinas aniónicas (base débil): grf -NH 2, -NHR, NR 2 (1, 2, 3 respectivamente) * resinas quelantes: el gruop funcional es el quelante o complejante. Los átomos más frecuentes son S, N, O, P, que forman en laces de coordinación con los metales. Muestran selectividad por iones metálicos. Son caras y reaccionan lentamente. Regeneración columna: iones unidos a grupos funcionales de fase estacionaria se  pueden eluir por compuestos que compitan (ác o bases que regeneren el H)l Intercambiadores iónicos inorgánicos: - Naturales: aluminosilicatos como zeolitas, arcillas minerales y feldespatos - Sintéticos: óxidos metales hidratados, sales insolubles de metales polivalentes, sales insolubles de heteropoliácidos, sales complejas basadas en hexanofierratos, zeolitas sintéticas Intercambiadores iónicos orgánicos:

- Naturales: celulosa, quitina, quitosano, dextran, agarosa - Sintéticas: matriz polimérica reticulada por la acción de un agente entrecruzante y derivatizada con grupos inorgánicos que actúan como grupos funcionales. Son los más habituales en aplicaciones de intercambio iónico en la industrial. La mayoría basada en la estructura estierno-divinilbenceno por su buena resistencia química, física, estabilidad en todo el rango de pH y temperatura. Las resinas de intercambio iónico se introducen en columnas de HPLC como perlas de  polímero poroso o recubriendo con ellas las partículas de sílice porosa. La selectividad depende en cierta medida de si la resina tiene un lugar de intercambio fuerte o débil y de la magnitud de los enlaces cruzados Fase móvil: suele ser un tampón acuoso cuyo pH y composición iónica determinan el tiempo de retención del soluto. Es posible realizar elusiones en gradiente en que la fuerza iónica o el pH de la fase móvil cambian con el tiempo. En instrumentos de HPLC se puede sustituir columna por una de intercambio iónico. El detector más utilizado mide la conductividad de la fase móvil a medida que eluye de la columna. Sin embargo la elevada concentración de iones de la fase móvil es un  problema porque los iones de esta fase son los dominantes en la conductividad. Para disminuir al mínimo la contribución de la fase móvil a la conductividad, entre la columna analítica y el detector se coloca una columna supresora de iones que elimina selectivamente los iones electrolitos de la fase móvil sin eliminar los iones del soluto. Por ejemplo si la fase móvil es HCl acuoso la columna supresora tiene resina de intercambio aniónico. Si los iones del soluto absorben radiación UV/VIS podrá utilizarse un detector uv-vis. Las que no absorben pueden detectarse indirectamente cuando la fase móvil tiene especies que absorben: se mide la reducción de la absorbancia cuando el soluto pasa por el detector. Util para análisis de: proteínas, aminoácidos, azúcares, nucleótidos, productos farmacéuticos, muestras clínicas, etc. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSION POR TAMAÑO Base de la separación es la capacidad del soluto de penetrar en los poros del empaquetamiento de la columna. Límite de inclusión: soluto más pequeño que puede separarse de otros solutos, todos los solutos de menor tamaño eluyen juntos. Límite de exclusión: soluto más grande que puede separarse de otros solutos, todos los solutos de mayor tamaño eluyen juntos Entre el límite de inclusión y el de exclusión, cada soluto pasa en el espacio poroso en un cierto tiempo, que es proporcional a su tamaño. Se exige que la exclusión por tamaño sea la única interacción entre soluto y fase estacionaria. Para esto se desactivan las partículas de sílice y las resinas de polímeros se sintetizan de forma que no posean lugares de intercambio.

Las mezclas que contienen una amplia gama de PM pueden separarse reuniendo varias columnas en serie. Aplicación en determinación de PM: las curvas de calibración (usando proteínas de PM conocido) del logPM vs volumen de retención se establecen entre el límite de inclusión y el de exclusión. En HPLC se puede sustituir la columna por una de exclusión por tamaño. El detector  más utilizado para obtener cromatograma es el de radiación UV/VIS.

CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS Útil para algunas muestras que no se pueden separar por GC ni HPLC. Fase móvil: es un gas que está a una presión y temperatura que superan su punto crítico. En estas condiciones la fase móvil no es ni gaseosa ni líquida sino que está constituida por un fluido supercrítico de propiedades intermedias entre la de los gases y líquidos.

• Viscosidad: similar a la de los gases: mejor difusión (se mueven por columnas sin necesidad de aplicar presión como en HPLC) • Baja tensión superficial: penetrabilidad • Densidad: similar a líquido: buenas propiedades disolventes • Alta difusividad: mayor transporte de masa Por lo tanto fase móvil se comporta más como fase líquida de HPLC que como la gaseosa de CG. El tiempo de análisis y la resolución, aunque no tan buenos como GC, suelen ser  mejores que los obtenidos con HPLC convencional. Fase móvil más utilizada: CO 2 por: Tc= 31°C Pc= 72,9 atm (1071 psi) Baja toxicidad, baja inflamabilidad, no corrosivo, alta pureza, fácil eliminación desde solutos, baja reactividad, bajo costo, no contamina, no absorbe UV, no tiene olor. Es un buen disolvente para compuestos orgánicos no polares y menos útil para polares. La adición de un modificador orgánico (ej metanol) mejora la fuerza de elución de la fase móvil. Instrumentos: similar a HPLC o CG. La única adición importante ES um limitador de  presión para mantener la presión crítica. Las elusiones en gradiente se logran cambiando la presión a lo largo del tiempo. Presión: tiene un marcado efecto en el factor de capacidad k’. este efecto es una consecuencia del aumento de la densidad de la fase móvil

Fase estacionaria: columnas capilares de sílice fundida y empacadas. Longitud 10-20m, diámetro interno; 0,05-0,1 mm. Fase móvil: CO 2, etano, pentano, dietiléter, amoníaco, THF, diclorofluorometano y óxido nitroso. Detectores: además de todos los detectores para HPLC se puede usar también el FID. Horno termostático: para controlar con precisión la temperatura de la fase móvil. Restrictor: para poder mantener por una parte la presión en el interior de la columna y  por otra parte permitir la bajada de la resión a la salida para que el fluído supercrítico  pase al estado gaseoso y pueda ser detectado correctamente el analito. Es un tubo capilar de 2-10 cm de longitud y díametro interno 1/10 del de la columna, donde a la salida el fluido supercrítico se expande y pasa a estado gaseoso y se puede mantener  simultáneamente la presión al interior de la columna Aumento de la presión aumenta la velocidad de elución ya que aumenta la densidad del disolvente lo que permite mayor interacción analito-fase móvil y disminuye los tiempos de elución. Se puede emplear en las diluciones una primera etapa isobárica para luego aumentar la  presión lineal o asintóticamente hasta el final de la elución. Análisis de polímeros, combustibles fósiles, ceras, fármacos, productos alimenticios. DERIVATIZACIÓN EN CROMATOGRAFÍA (GC, HPLC) se convierte el analito en otro compuesto por reacciones con la fase estacionaria, inestabilidad con la temperatura (GC), para que sea más sensible con un determinado detector. Técnicas precolumna y post columna. Reacciones para mejorar detección (p ej para usar detector de fluorescencia)

Derivatización cromatografía de gases

Los compuestos a analizar deben transformarse en otros que tengan un menor punto de ebullición y puedan transformarse en gases sin someterlos a una temperatura muy alta y causar su descomposición. La reacción de derivatización tiene como objetivo principal modificar la molécula tratada para evitar la formación de puentes de hidrógeno, responsables de uniones intermoleculares. Reacción de alquilación para formar éteres: ROH + Ag2O + MeI DMF> ROMe + 2AgI + H2O Acilación ROH + (CF3CO)2O piridina > ROCOCF 3 Sililación ROH SiMe3 > ROSiMe3

MÉTODOS EXTRACCIÓN Y TRATAMIENTO DE MUESTRAS: • • • • • • • •

Líquido-líquido Soxhlet Extracción en fase sólida Extracción con fluido supercrítico Extracción con solvente acelerada Microondas Baño ultrasónico Mezclador  

EXTRACCIÓN LIQ-LIQ

Embudo de decantación

Se usan 2 solventes inmiscibles para separar un analito desde una fase a otra. La distribución de un analito entre dos fases es una condición de equilibrio descrita por la teoría de partición. En el solvente acuoso se disuelve solutos polares e ionicos.

SOXHLET

• • • • • •

La muestra se coloca envuelta en un papel de filtro y se introduce en la columna de extracción (2) mientras que el solvente a extraer en el balón 1. Arriba se pone un refrigerante para evitar la evaporación del solvente (4) Se calienta el balón y el solvente llega a la base del refrigerante el cual lo condensa y cae al reservorio que contiene la muestra (2) El solvente se empieza a acumular en el reservorio para la muestra y luego que llega al nivel superior cae al balón (1) que contiene el solvente. Este proceso se repite en el tiempo que dura la extracción que normalmente son horas. Es muy adecuado para extraer compuestos orgánicos desde matrices sólidas: extracción de pesticidas en suelo, HPA en sedimentos, etc.

Ventajas: Técnica muy efectiva, normalmente se logra extracciones con 100 % de eficiencia. Desventajas: Solventes caros y tóxicos. Gasto de energía.

Extracción en fase sólida (SPE)

Se utilizan jeringas que contienen una fase estacionaria y se hace pasar  una fase móvil líquida. Se utilizan para limpiar muestras con matrices complejas (clean up), para concentrar, etc. Se puede fijar el analito en la muestra o fijar las impurezas y eluir el analito. Esto depende de la polaridad del solvente que se utilice para eluir.

El liquido es pasado a través de una fase sólida la cual selectivamente remueve el analito (o la matriz); el analito es eluído con un solvente más fuerte. El mecanismo es el mismo que para LC / HPLC. Introducida en los 70s, comercializada desde 1978. Para esta técnica existe, además de la variante en cartuchos, la opción de discos, que  permite mayores flujos, automatizable y que facilita aún más la extracción.

EXTRACCIÓN CON FLUIDO SUPERCRÍTICO El analito se pone en una celda, la cual se introduce en el horno. El solvente es normalmente CO2 y como este es muy apolar se agrega un co-solvente como por ej. Metanol. Se aplica una presión alta (sobre la presión crítica de la muestra y una temperatura temperatura alta (sobre la presión crítica) y este fluido pasa por  la muestra disolviendo los analitos de acuerdo a las polaridades. Al salir del horno en el restrictor ocurre la despresurización y se recibe en un frasco colector (vacío, con solvente o con  baño frío, de acuerdo a la volatitilidad • Ventajas : Las extracciones son mas rápidas que con Soxhlet. Además no se

utiliza solventes orgánicos los cuales son de alto costo y toxicidad. • Desventajas : Muchas veces las extracciones no son del 100 % • Se considera dentro de los métodos de “screening”

ANALISIS CON SOLVENTE DE ACELERADA

Se realiza una extracci poniendo en la matriz con un solvente a una temperatura y presi alta. A mayor presi la temperatura de ebullici de los solventes aumenta y con ello la efectividad de la extracci . 

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



Venta  jas: Rap idez y menor gasto de solventes. (no hay evaporaci de 駸tos) Desventajas: Aveces la efectividad est �bajo el 100 %. (m騁odo de screening) 

Reacci con microondas

Se usa peque s cantidades de muestra y de solvente. Se aplica la radiaci de microondas y los 當idos minerales se calientan r 疳idamente disminuyendo el tiempo de reacci . La temperatura no es muy alta por lo que no hay descomposici de muestra ni del 當 ido necesario para el ataque. 





Ventajas: R 疳 idez y menor cantidad de muestra y de 當idos para el ataque. Desventajas: Al disminuir la cantidad de muestra disminuye la concentraci del analito y se necesita un m 騁odo de cuantificaci m 疽 sensible. 

BAÑO ULTRASÓNICO

  Normalmente el ba ultras ico se emplea para extraer analitos desde muestras de suelos, sedimentos, lodos etc. Es mucho m疽 r 疳ido que la extracci Soxhlet. Por ej. Algunos pesticidas requieren extracci Soxhlet de 4-18 horas, mientras que el ba ultras ico requiere solo de 8 a 10 minutos. La vibraci a alta intensidad (20 kHz rang)   permite la penetraci del solvente en la matriz solubilizando los analitos. El generador ultras ico produce una se l el 馗 trica a una frecuencia determinada. 

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

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EXTRACCIÓN CON SOLVENTES: Convencional:

• • •

Es un proceso por el cual se transfiere uno o más solutos de una fase a otra, generalmente entre dos líquidos inmiscibles entre si. Se emplea una fase acuosa y una fase orgánica no miscible. La fase orgánica puede ser más densa o menos densa que la fase acuosa .

Extractantes: • Es un proceso por el cual se transfiere uno o más solutos de una fase a otra, generalmente entre dos líquidos inmiscibles entre si. • Se emplea una fase acuosa y una fase orgánica no miscible.

•

La fase orgánica puede ser más densa o menos densa que la fase acuosa .

Sistemas de extracción. •I. Sustancias orgánicas: Se extraen sin mayor transformación química. Ej. Aminas, alcoholes, carbonilos, etc. • II. Sustancias inorgánicas: Se debe reemplazar el agua de coordinación por otro ligante que forme una especie neutra, compatible con el solvente orgánico extractante. Métodos para formar especies extractables: 1. Coordinación simple. Por ejemplo GeCl4 2. Heteropoliácidos: El ión central es un complejo monoatómico. Por ejemplo. H3PO4x12MoO3 3. Quelación: Ejemplo. Al(Quinolina) 3, Cu(DDC)2, Cd(morin)2 4. Formación de pares iónicos. Ejemplo. Cs+ (C 6H5)4B-

Relación de distribución: A partir de las expresiones de K y K A [HA] K=

[HA]

KA; =

1

[H +]2 [A-]2 [HA]2

2

Sustituyendo en la expresión de D C [HA] DC =

1 -

=

[HA] 2 + [A ]2 DC =

<[HA] K [HA]

1

+ KA [HA] 1

K [H +]2 [H +]2 + KA

demuestra la influencia del pH en el valor de Dc

K [H +]2

1

Procesos frecuentes de la extracción Liq-Liq Especie a extraer  Compuestos orgánicos poco polares Compuestos orgánicos ionizables Metales (quelatos) Complejos de asociación iónica

Fundamento “Lo similar disuelve a lo similar ” Debe de controlarse el pH Se requiere formar complejos neutros,  poco solubles en agua. Se requiere formar pares iónicos neutros.

Extracción de quelatos

cupferrón

oxina

Extracción de pares iónicos *Se necesita formar iones muy voluminosos (complejos) a los que se debe de asociar un contra-ion. * El disolvente debe de poseer propiedades fuertemente solvatantes.

Ejemplos: HCl (6M)

Fe 3+

Fe Cl4 - (formación del ión)

Especie extraída: HFeCl4

(extracción en metil-isobutil-cetona o éter dietílico) Determinados tipos de nitratos metálicos, pueden ser extraidos de forma parecida ( U(VI), Bi(III) y Fe(III))

Efecto del pH Sea el ácido débil HA cuyo equilibrio de disociación es: HA



A- + H+

Ka = (H+)(A-) / (HA)

El coeficiente de distribución D se define: D = (HA) total en fase 2 / (HA) total en fase 1 El coeficiente de reparto para las formas moleculares es: K = (HA)2 / (HA)1 Se supone que la forma iónica sólo está presente en la fase acuosa y que se reparte la forma molecular. A partir de K: D = (HA)2 / ( (HA)1 + (A-)1 ) K(HA)1 = (HA)2 D = K(HA)1 / ( (HA)1 + (A-)1 ) A partir de Ka:

(A-)1 = Ka(HA)1 / (H+)

y sustituyendo: D = K(H+) / Ka + (H+) Agentes quelantes: Sea un agente quelante HL que se disocia de acuerdo a: HL

H+ + L-

La complejación viene dada por:

Ka = (H+)(L-) / (HL)

Mn+ + nL-

MLn

β = (MLn) / (Mn+)(L-)n

El coeficiente de distribución: D = (metal total) 2 / (metal total) 1 = (MLn)2 / (Mn+)1+)1

MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS DE ANÁLISIS Electrodo de trabajo o indicador: electrodo cuyo potencial es sensible a la concentración del analito Contraelectrodo: segundo electrodo que completa el circuito en una célula de dos electrodos

Electrodo de referencia: electrodo cuyo potencial permaece constante y frente al que  pueden medirse otros electrodos Electrodo auxiliar: tercer electrodo que completa el circuito en una célula de tres electrodos Ley Ohm: declaración según la cual la corriente que pasa a través de un circuito es directamente proporcional al potencial aplicado e inversamente proporcional a la resistencia de ese circuito (E=IR) Potenciómetro: dispositivo para medir el potencial de una célula electroquímica sin  producir una corriente ni alterar la composición de dicha célula Galvanostato: dispositivo que se emplea para controlar la corriente de una célula electroquímica. Potenciostato: dispositivo utilizado para controlar el potencial de una celda electroquímica. 1. Potenciometría: Se mide la diferencia de potencial en función de la concentración del analito (Ec. Nerst) 2. Conductimetría: Se mide la resistencia de la disolución. 3. Amperometría: Se mide la corriente en función de la concentración (i = KC). 4. Voltamperometría: Se mide la corriente en función del potencial aplicado. 5. Coulombimetría: Se mide los coulombs necesarios para electrolizar el analito Q=it=nmF). 6. Electrogravimetría: Se pesa un electrodo sobre el cual se ha depositado electroquímicamente el analito.

POTENCIOMETRÍA Se mide la diferencia de potencial en función de la concentración del analito. Es una técnica electroanalítica con la que se puede determinar la concentración de una especie electroactiva en una disolución empleando un electrodo de referencia (un electrodo con un potencial constante con el tiempo y conocido) y un electrodo de trabajo (un electrodo sensible a la especie electroactiva). Existen electrodos de trabajo de distinto tipo útiles para distintos cationes o aniones.

Fundamento: Se mide el ∆ E que se establece entre dos electrodos (en ausencia de corriente). La respuesta del electrodo indicador es Nerstsiana. Se necesita: a) Un electrodo de Referencia: Potencial conocido y cte → Insensible a la composición de las disoluciones.

 b) Un electrodo Indicador: Potencial dependiente de la composición de analito en la disolución. Potencial de electrodo 1) Definición: Potencial de una celda formada por el electrodo de trabajo, actuando como cátodo y un electrodo de hidrógeno (de referencia) que actúa como ánodo - Potencial normal de electrodo (E0): Potencial de electrodo cuando las actividades de todos sus reactivos y productos son la unidad - Bajo esas condiciones el electrodo de hidrógeno recibe el nombre de electrodo estándar de hidrógeno y se le asigna, por convención, un valor de potencial de 0.000 V 2) El valor numérico del potencial de electrodo viene definido teóricamente por la ecuación de Nernst. Para la reacción: Zn2+ + H2 Zn + 2H+ 0

 E  =  E 

−

0.059 n

0

log  K  =  E 

−

0.059 2

[H ]2 +

log

[Zn 2 ] ⋅ PH 2 +

Electrodos de referencia: • Potencial constante y reproducible • Potencial conocido • Insensible a la composición de la solución • Resistente • Fácil de usar  Ejemplos : • Electrodo normal de hidrógeno • Electrodo de calomelanos • Electrodo de Ag/AgCl

Consiste en un electrodo de Pt sumergido en una disolución en la que la actividad del ión hidrógeno es 1 y en la que se burbujea gas H 2 a una presión de 1 atm. Un puente salino convencional conecta el electrodo de hidrógeno con la semicelda indicadora. El potencial estándar para la reacción es por definición 0V a todas las temperaturas. Pese a su importancia como electrodo de referencia fundamental con el que se miden y

comparan todos los demás potenciales, apenas se utiliza pues es difícil de preparar e incómodo de manejar. (Se reduce el H +) Calomelanos: Hg2Cl2 (s) + 2 e-



2 Hg (l) + 2 Cl-

Par redox formada por Hg 2Cl2 y Hg. El potencial de un electrodo de calomelanos depende de la concentración de Cl-.

Se basa en par redox AgCl y Ag. El potencial también depende de la concentración de Cl- utilizada en su preparación. Ventaja es que puede usarse a temperaturas más altas. Por otro lado tiene mayor tendencia a reacciones con disoluciones para formar  complejos insolubles de plata que pueden bloquear el puente salino entre el electrodo y la disolución. Celdas electroquímicas: Se divide en 2 mitades, cada una de ellas con un electrodo sumergido en una disolución que contiene iones, de cuyas concentraciones depende el potencial del electrodo. Esta separación es necesaria para evitar que se produzca una reacción redox espontánea sobre la superficie de uno de los electrodos, evitando el paso de la corriente por la celda e impidiendo la medición del potencial. Un puente salino que contiene un electrodo inerte (ej KCl) conecta las dos semiceldas. Los extremos del puente salino se fijan con vidrios porosos que permiten el desplazamiento libre de los iones entre las semiceldas y el puente salino, al tiempo que impiden el paso del contenido del puente salino a las semiceldas. Este movimiento de iones en el puente salino es el que completa el circuito eléctrico. Punte salino: comunicación entre 2 disoluciones que permite el movimiento de la corriente en forma de carga iónica. Ánodo: electrodo donde tiene lugar la oxidación (referencia) Cátodo: electrodo donde tiene lugar la reducción (indicador) La celda electroquímica potenciométrica se construye de tal forma que una de las semiceldas proporciona un potencial de referencia conocido y el potencial de la otra semicelda indica la concentración del analito. Se acepta por conveniencia que el electrodo de referencia es el ánodo.

El electrodo de referencia ideal sería el que proporcionara un potencial estable de forma que cualquier cambio de Ecel pudiera atribuirse al electrodo indicador y por tanto a un cambio en la concentración del analito. Ecuación de Nernst: El potencial de una celda electroquímica potenciométrica viene dado por: Ecel= Ecat – Ean (E potenciales de reducción) Estos potenciales dependen de las concentraciones de las especies responsables de los  potenciales del electrodo, según la ecuación de Nernst

Ered = E0red – 0,0592xLog areducida /aoxidada n Actividades se pueden reemplazar por concentraciones molares solo en el caso de soluciones diluidas.

Electrodos indicadores: Respuesta rápida y reproducible a los cambios de concentración de un analito. El  potencial del electrodo indicador es proporcional a la concentración del analito. Electrodos de membrana: -vidrio - membrana líquida - membrana cristalina - gases Electrodos indicadores metálicos: - Metales inertes - Primera especie (electrodos metálicos en los que el metal está en contacto con una disolución que contiene su ión) - Segunda especie electrodo de Ag (indicador de Cl-) (cuando un electrodo responde AL  potencial de otro ión que está en equilibrio. Electrodo de vidrio • Se mide la diferencia de potencial a través de una membrana de vidrio que separa una disolución de concentración desconocida de una disolución de referencia cuya [H+] es conocida

pH-metro

ESC

electrodo de vidro

alambre de plata HCl O,1 M saturado c/ AgCl agitador  magnético

Fina membrana de vidro (responsable dela respuesta del pH)

Electrodos de membrana La generación de potencial es muy diferente al de los electrodos metálicos: los metálicos transfieren electrones y las membranas iones. El diseño es también muy distinto. Se denominan electrodos selectivos de iones (su potencial de membrana es función de la concentración de un ión dado en la solución). Su respuesta se relaciona como función px (pH, PCa..etc). Históricamente el electrodo de pH fue el primero. Potencial de membrana: potencial que se desarrolla a través de una membrana conductora cuyas caras opuestas están en contacto con disoluciones de composición diferente. Si existe diferencia entre las concentraciones de analito a ambos lados de la membrana, la interacción del analito con ésta producirá un potencial de membrana. Uno de los lados de la membrana está en contacto con una disolución interna que contiene una concentración fija del analito, mientras que el otro lado está en contacto con la muestra. La corriente pasa a través de la membrana gracias al movimiento del analito o de un ión que ya se encuentre presente en la matriz de la membrana. El potencial de membrana viene dado por una ecuación tipo nernst: Emem = Easim – RT/zF ln [A]int/[A]mues Z: carga del analito. E mem debe ser 0 cuando la concentración del analito sea igual en ambos lados de la membrana. El término E asim se denomina potencial de asimetría representa el hecho de que el potencial de la membrana no suele ser igual a 0 en estas condiciones (soluciones idénticas a ambos lados y se observa potencial no igual a 0). Los potenciales de membrana se deben a una interacción química entre el analito y los lugares activos de la superficie de la membrana. Por lo que el potencial de membrana será proporcional a la concentración de todos los iones existentes en la disolución de muestra que sean capaces de establecer interacciones con los lugares activos de la membrana.

Clasificación: Las membranas pueden ser cristalinas y no cristalinas. Las no cristalinas pueden ser  de vidrio (electrodo de pH), o líquidas (electrodo de calcio). Electrodo simple de  pH.

Electrodo combinado de pH.

El electrodo de referencia externo se incorpora dentro del dispositivo. Fundamento: Los iones H 3O+ se fijan  parcialmente sobre la pared externa e interna de la membrana de SiO 2 y la diferencia de concentraciones, genera un potencial eléctrico (de membrana EM). La composición del vidrio fija selectivamente el tipo de ión a retener. Típicamente en el caso del electrodo de pH:22% Na 2O, 6% CaO, 72 % SiO2.

Se hidratan aproximadamente los 10nm más externos de la membrana. La hidratación da lugar a la formación de lugares de carga negativa, que forman parte de la estructura de silicio de la membrana de vidrio. Los iones sodio capaces de moverse a través de la capa hidratada actúan como contraiones. Los iones de hidrógeno de la disolución difunden hacia la membrana y, como se unen con mayor fuerza al vidrio que los iones de Na, desplazan a éstos produciendo la selectividad de la membrana para el H +. el transporte de carga a través de la membrana depende de los iones Na+.el potencial de los electrodos de vidrio tipo corning obedecen a la ecuación Ecel= K + 0,059 log [H +] a lo largo de una gama de pH que varía desde alrededor de 0,5 a 9. A valores superiores a 9 la membrana responde mejor a otros cationes como  Na+ y K+. Sustituyendo el Na 2O y CaO por Li2O y Bao se amplían los límites útiles de pH de los electrodos de membrana de vidrio hasta valores de pH superiores a 12. La mayoría de los electrodos de pH de membrana de vidrio suelen presentarse en forma combinada que incluye un electrodo indicador y otro de referencia, lo que simplifica mucho la medida de pH. Los electrodos de vidrio no deben dejarse secar para que no se destruya la capa hidratada de la membrana. También se fabrican electrodos de vidrio para el análisis de Li, K, Rb, Cs, NH4, Ag y Ti (diferente composición de la membrana).

Errores en electrodo de vidrio 1) Tampones de calibración estropeados → pH ≠ al indicado → Recta de calibrado errónea 2) Matriz de tampones de calibración de la muestra → Ej (potencial de unión líquida) → Recta de calibrado errónea 3) Error alcalino - Base: El E de la capa hidratada tb se debe a la [Na+]vidrio (en menor medida) no sólo a [H+] vidrio - A pH<12 (depende del tipo de vidrio) → E(H+)>>E(Na+) pero a pH>12 → E(Na+) no es despreciable → Eind es > de lo que corresponde a la [H+]vidrio → pHmedido<  pHreal → Errores por defecto 4) Error ácido - A pH<1 → pHmedido> pHreal → Errores por  exceso 5) Deshidratación del electrodo → Medidas no reproducibles

Electrodo de membrana líquido: (se incorporan um agente quelante a uma membrana hidrófoba) Ejemplo el de calcio. Consiste en una membrana de plástico poroso saturada con di-(ndecil)-fosfato. La membrana se coloca en el extremo de un tubo cilíndrico no conductor  y en contacto con dos reservorios. El reservorio externo contiene di-(n-decil)fosfato en forma de di-n-octilfenil-fosfonato, que empapa la membrana porosa. El reservorio interno contiene una disolución acuosa patrón de Ca 2+ y el electrodo de referencia Ag/AgCl.

Electrodo de membrana cristalino: Tienen una membrana formada por Sales inorgánicas policristalinas o de un solo cristal. Los electrodos se fabrican construyendo una fina perla de Ag 2S o una mezcla de ésta y una segunda sal de plata u otro sulfuro metálico. La perla de 1-2 mm de espesor, se sella en extremo de un cilindro de plástico no conductor, en el que se introduce una disolución interna que contiene el analito y el electrodo de referencia. Los iones Ag+ transportan la carga a través de la membrana. El potencial de membrana de la perla de Ag2S se desarrolla a causa de la diferencia de la posición de equilibrio de la reacción de solubilidad a ambos lados de la membrana. Electrodo enzimático: corresponde a la concentración de un sustrato al que se hace reaccionar con una enzima inmovilizada para producir un ión que pueda determinarse con un electrodo selectivo de iones.

Titulación potenciométrica Utilización de la medida de potencial de un electrodo indicador para determinar el  punto de equivalencia de una titulación. Es un método más exacto y preciso que la utilización de indicadores visuales. Titulaciones potenciométricas - Definición: Valoraciones en las que el seguimiento de la reacción se hace por medidas potenciométricas. - Medidas de potencial: Tras cada adición hay que esperar a que se alcance el Eeq - Curva de valoración → Logarítmica - Determinación del PE - Tipos de valoraciones: (a) Precipitación, (b) ácido-base, (c) complejación, (d) redox

La determinación potenciométrica de los puntos de equivalencia es factible en las valoraciones ácido base, de complejación, redox y de precipitación y en las valoraciones realizadas con disolventes acusoso y no acusoso. Las valoraciones potenciométrica ácido-base, de complejación y de precipitación suelen controlarse con electrodos de membrana selectivos para el analito, aunque también pueden usarse electrodos selectivos para el agente valorante o para el producto de la reacción. Para las redox se usan electrodos redox del tipo alambre de pt y un electrodo de referencia. Aplicaciones cuantitativas

La medición más habitual quizás sea la medición de pH de una disolución. La ecuación de Nernst relaciona el potencial medido de la celda con la concentración del analito. Pero en realidad esta ecuación involucra actividades, no concentraciones. Por lo tanto una manera correcta de escribir la ecuación es: Ecel= K’ – 0,059/n log 1/[M n+] M ión metálico, K’ comprende el coeficiente de actividad. Para determinar la concentración del analito de una muestra es necesario estandarizar el electrodo. Si la respuesta del electrodo sigue la ecuación de Nernst sólo será necesario determinar la constante K, por lo que podrá lograrse la estandarización con un solo  patrón externo. Como es frecuente observar pequeñas desviaciones de la pendiente “nernstiana” ideal la estandarización suele hacerse utilizando 2 o más patrones externos. En la mayoría de los análisis cuantitativos, lo que interesa es determinar la concentración del analito, no su actividad. Sin embrago la respuesta del electrodo está en función de la actividad. En ausencia de interferentes, la curva de calibración del  potencial en relación con la actividad es una línea recta. Sin embrago, la gráfica del  potencial en relación con la concentración puede ser curva para las concentraciones más altas de analito, debido a los cambios de su coeficiente de actividad. Una curva de calibración con curvatura permitirá determinar la concentración del analito siempre que la matriz del patrón se similar a la de la muestra. Cuando no se conoce la composición exacta de la matriz de la muestra como a menudo sucede, resulta imposible acoplarla a la del patrón. Otra posibilidad, no dependiente del conocimiento de la composición exacta de la matriz de la muestra consiste en añadir una concentración elevada de un electrolito inerte a todas las muestras y patrones. Si la concentración de electrolito que se añade es suficiente, las diferencias entre la matriz de la muestra y la de los patrones  perderá importancia y el coeficiente de actividad permanecerá esencialmente constante. La disolución de un electrolito inerte añadida a la muestra y a los patrones recibe el nombre de tampón de ajuste de fuerza iónica total. Analisis cuantitativo usando el método de adición de patron: debido a la dificultad para mantener una matriz constante en las muestras y patrone, muhos métodos  potenciométricos cuantitativos recurren a la adición de patrón. En la celda de la muestra se pone una muestra de volumen Vx y concentración del analito Cx y se mide el  potencial E celx. Se hace una adición de patrón añadiendo un pequeño volumen, Vp, de un  patrón que contiene una concentración conocida de analito Cp, a la muestra y se vuelve a medir el potencial E cels . Siempre que Vp sea significativamente menor que Vx, podrá ignorarse el cambio de la matriz de la muestra y el coeficiente de actividad del analito  permanecerá constante. Medida del pH: Complicaciones. 1. Significado de pH = -log [H+] Sin embargo el pH de una disolución se define por la respuesta de un electrodo al ión H+ y por tanto es una medida de su actividad: * pH=-log(a H+) Como es lógico la composición de la matriz influye sobre el pH verdadero de una disolución. 2. Incertidumbre de la relación entre potencial y actividad 3. Calibración: se calibran usando un tampón cuya composición se elige de forma que el  pH establecido se encuentre lo más cerca posible del obtenido mediante la ecuación de actividad *. Habitualmente los electrodos de pH se estandarizan usando dos tampones, uno de pH cercano a 7 y otro mucho más ácido o básico, dependiendo del pH previsto

de la muestra. El electrodo de pH se sumerge en el primer tampón y se ajusta el control de estadarización o calibración hasta que el equipo de medida lee el pH correcto. A continuación, se introduce el electrodo en el segundo tampón y se ajusta el control  pendiente o temperatura al pH del tampón.

COULOMBIMETRÍA Los métodos de análisis columbimétricos se basan en la electrolisis (separación de los elementos de un compuesto mediante electricidad) exhaustiva del analito. Es un método electroquímico basado en la oxidación o reducción cuantitativa de un analito. Se determina la cantidad de analito midiendo la corriente durante el tiempo necesario para que la reacción se complete. Q = it Ejemplo: Titulación coulombimétrica de cloruros usando un electrodo de plata Reacción electroquímica: Ag (s) => Ag+ + eReacción química: Ag+ + Cl- =>AgCl (s) ¿Cómo sabemos cuando la reacción química se ha completado? - Se puede medir la concentración de Ag+ con un segundo electrodo. -Se puede usar un indicador 

Q = It Q = carga requerida (coulombs = amp . sec) I = corriente (amp.) t = tiempo (sec La relación entre carga y moles está dado por la constante de Faraday Faraday (F) = 96,485 Coulombs (C)/mole e O de otra forma Q = it = nmF

n: número electrones transferidos por mol de analito M: moles de analito

Ag (s) => Ag+ + e-

(1:1 Ag+/e-)

Con lo cual se obtiene el número de moles de analito generado, consumido, etc. Ley de Faraday: corriente o carga que pasa en una reacción redox es proporcional a los moles de los reactivos y productos de esa reacción. Se aplica una corriente constante de 0,8 A para depositar cobre en el cátodo y O 2 en el ánodo. Si la reacción duró 15,2 minutos. ¿Qué cantidad de gramos se forma de cada producto? reacciones: Cu2+ + 2e- => Cu (s) 2H2O =>4e- + O2 + 4H+

 Ejemplo:

Q = i.t Q = (0.800 A)(15.2min) (60 sec/min) Q = 729.6 C (amp .sec)

 Resolución.

Cantidad de cobre: =(729.6 C)(1 mol e-/96,485 C)(1 mol Cu/2 mol e -)(63.5g Cu/mol Cu) = 0.240 g Cu Cantidad de O2 : =(729.6 C)(1 mol e-/96,485 C)(1 mol O 2/4 mol e-)(32.0g O2/mol O2) = 0.0605 g O 2

Tipos de métodos

a) Amperostático (titulación coulombimétrica)  b) Potenciostática

Requisito fundamental 100% de eficiencia en corriente Titulaciones coulombimétricas Se titula el analito aplicando una corriente constante para generar el titulante electroquímicamente.

Comparación con la volumetría tradicional. Aplicaciones a) Tienen un pto de equivalencia observable a) Titulaciones ácidocon baseel estándar  - Corriente Similitud - Titulación de un ácido - Time Similitud con agregado - el volumne 2H El OH- es el titulante generado electroq. 2O + 2e =>2OH + H2 - Se - debe conocer estquiometría de la reacción. unaserbase - LaTitulación reacción de debe rápida, cuantitativa y sin reacciones laterales. H2O => 2H+ + ½ O2 + 2e- El H+ es el titulante generado electroq.  b) Ventajas de la coulombimetría Titulaciones de complejación -  b.) Tiempo y corriente son fácil de medir con exactitud. - Se utiliza para titulantes inestables. 2+ 3HgNH 3Y + NH4 + 2e- => Hg + 2NH3 + HY - Fácil de dosificar pequeñas cantidades de reactivo y mayor exactitud y precisión, que al medir 3-pequeños + volúmenes. 4HY => H + Y - utilización en reacciones ácido-base, precipitación, redox y complejacíón. - se puede automatizar completamente. c.) Titulaciones redox c) Fuentes de3+ error 4+ Ce + edurante la electrólisis - variaciónCede la=>corriente - reacciones4+secundarias (100 de corriente) 2+ 3+ % eficiencia 3+ Ce + Fe => Ce + Fe - error en la medida de la corriente - error en la medida del tiempo - error de titulación. (diferencia entre punto de equivalencia y punto final de titulación

d) Cambio en el potencial durante la medición. a) En los sistemas de corriente constante, el potencial de la celda cambia cuando el analito es consumido. Cu2+ + 2e- => Cu (s) reacción inicial Cuando todo el Cu2+ es consumido ocurre otra reacción electroquímica. Por ejemplo generación de H 2 2H+ + 2e- => H2 (g)

Coulombimétria potenciostática 1.) Se aplica un potencial constante para convertir por  completo el analito en algún producto.

2) Ventajas: - Es más específica que la amperostática (evita reacciones redox que pueden interferir) - Puede ser utilizada para mas de 55 elementos 3) Desventajas

- Es mas larga que la amperostática. La corriente decrece con el tiempo

It = Ioe-kt k = 25.8 DA/Vδ D = Coeficiente de difusión A = Area del electrodo V = volumen δ = espesor del film de la capa de difusion donde hay un gradiente de difusion

VOLTAMPEROMETRÍA Y POLAROGRAFÍA Se aplica un potencial dependiente del tiempo a una celda electroquímica y se mide la corriente que pasa a través de ella como función de dicho potencial. • Se aplica una diferencia de potencial entre un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia y se mide la corriente que circula. •

La voltamperometría difiere de otras técnicas, como la coulombimetría, en que se caracteriza por tener un consumo mínimo del analito mientras que la coulombimetría prácticamente todo el analito pasa a otro estado (el área de la superficie del electrodo de trabajo es significativamente menor que el de los utilizados en coulombimetría, por lo tanto la cantidad de analito que sufre electrolisis es muy pequeña y laconcentración del analito en el seno de la disolución prácticamente no se modifica).

Voltamperograma: equivalente del espectro en espectroscopía y proporciona información cuantitativa y cualitativa sobre las especies que intervienen en la reacción de oxidación o reducción. La voltamperometría moderna utiliza un potenciostato de 3 electrodos. En el electrodo de trabajo se aplica una señal de excitación que es un potencial dependiente del tiempo, otencial que cambia en relación con el potencial fijo aplicado al electrodo de referencia. La corriente medida es la que se establece entre los electrodos de trabajo y auxiliar. Este último suele ser un alambre de platino, mientras que los de referencia habituales son ECS o uno de Ag/AgCl. Electrodos de trabajo • Mercurio: Goteante-Colgante-Film. • Electrodos sólidos: Pt, C vítreo, Au, Rh, Ru, Cu etc. • Ventana electroquímica

Tipico polarograma

Cuando un analito se oxida en el electrodo de trabajo, se produce una corriente de electrones que atraviesa el circuito eléctrico externo hasta el electrodo auxiliar, donde tiene lugar la reducción del disolvente o de otros componentes de la matriz de la disolución. La reducción de un analito en el electrodo de trabajo requiere una fuente de electrones capaz de generar una corriente que fluya desde el electrodo auxiliar hasta el cátodo. En cualquier caso, las reacciones redox producen una corriente entre los electrodos de trabajo y auxiliar a la que se denomina corriente faradaica. La corriente producida por la reducción del analito se llama corriente catódia y por  convención se considera positiva. Las corrientes anódicas se deben a reacciones de oxidación y tienen carga negativa. Aunque el flujo de la corriente faradaica depende del potencial aplicado en el electrodo de trabajo, su magnitud depende de la velocidad de la reacción de oxidación o reducción que tiene lugar en la superficie del electrodo. Existen 2 factores que determinan la velocidad de la reacción electroquímica: la velocidad a la que los reactantes y productos son transportados desde y hasta la superficie del electrodo y la velocidad a la que los electrones se desplazan entre el electrodo y los reactantes y productos existentes en la disolución. Existen3 métodos de transporten que influyen en la velocidad con que los reactantes y productos son transportados desde y hacia la superficie del electrodo: difusión, migración y convección Difusión: movimiento de un material como respuesta a un gradiente de concentración Convección: movimiento del material en respuesta a una fuerza mecánica, como la agitación de una disolución

Migración: movimiento de un catión o anión en respuesta al potencial aplicado. La polarografía es una medida voltamperométrica cuya respuesta está determinada por  el transporte combinado de masa difusión/convección. La polarografía es un tipo específico de medida que cae en la categoría general de voltamperometría de barrido lineal, donde el potencial de electrodo se encuentra alterado en forma lineal desde el  potencial inicial hasta el potencial final. Como método de barrido lineal controlado por  el transporte de masa por difusión/convección, la respuesta corriente vs. potencial de un experimento polarográfico tiene la típica forma sigmoidal. Lo que hace a la polarografía diferente de otras medidas de voltamperometría lineal de barrido es que polarografía hace uso delelectrodo de gota de mercurio (DME). Una gráfica de la corriente vs. potencial en un experimento de polarografía muestra las oscilaciones de corriente correspondientes a las gotas de mercurio que caen desde el capilar. Si se conecta el máximo de corriente de cada gota resultaría una forma sigmoidea. La corriente limitante (la meseta en el sigmoide), llamada corriente de difusión porque la difusión es la principal contribución al flujo de material electroactivo en este momento de la vida gota de Hg, se relaciona con la concentración del analito mediante la ecuación de Ilkovic: Donde D es el coeficiente de difusión del analito en el medio (cm 2/s), N es el número de electrones transferidos por mol de analito, mes el flujo másico de Hg a través del capilar (mg/s), y t es el tiempo de vida de la gota en segundos, y C es la concentración del analito en mol/cm 3. Ecuación de Ilkovic. Relación ente i y C • • • •

• •

Id(promedio) = 607 n D1/2 m2/3 t1/6 C Id(máxima) = 706 n D1/2 m2/3 t1/6 C t es el tiempo de goteo (segundos), m es la velocidad del flujo de mercurio a través del capilar  (miligramos/segundos), • D es el coeficiente de difusión (cm2/s), • C es la concentración del analito (Moles/mL) • I es la intensidad en Amperes. • Id = K x  C El oxígeno interfiere porque es electroactivo Solución saturada en aire es ≈ 4 mM  y se obtiene una corriente de difusión de ≈ 5 A O2 + 4 H+ + 4 e – ¾ 2 H2O  E ° = +1.23 V Polarografía + clásica  –  en electrodo de goteo de mercurio: se efectúa en una disolución no O2 + 2 H + 2 e ¾ H2O2  E ° = +0.70 V agitada, la caída de las gotas de Hg que se mezclan con la disolución hace que la corriente obtenida Por tanto, cada nueva gota de Hg que cae crece en una Se desgaza con N 2sea u Arlimitante. de alta pureza disolución composición es idéntica a la de la disolución total inicial. Las oscilaciones de la corriente se deben al crecimiento de la gota de Hg, que causa un cambio proporcional al tiempo del área del electrodo de trabajo. 

Máximos polarográficos • Fenómeno de adsorción entre el electrodo cargado y el analito

•

Se elimina agregando un agente surfactante como Tritón X-100

Celda con electrodos

Analisis cuantitativo • iD ∝ c • Curva de calibrado. • Adición de estándar  • Estándar interno o ión piloto. • Límite de detección 10-4-10-5 M • Precisión 2-5% aprox Especies electroactivas: • Iones metálicos de transición: Cu, Tl, Pb, Cd, Zn, Fe, Ni, etc. • Complejos • Oxyaniones, e.g. BrO3–, IO4–, SO32–, etc. • Moléculas inorgánicas e.g. O2, H2O2, SOx, NOx etc. • Compuestos orgánicos con grupos nitro-, Carbonilos, C=N, etc. Desventajas polarografía clásica • Límite de detección 10-4 a 10-5 M aprox.

Polarografía de Tast

•

La medición de la intensidad se realiza durante un período cercano al final de la vida de cada gota. Para ello se utiliza un martillo mecánico que despega la gota después de un intervalo de tiempo. Se mejora sensibilidad y resolución

Polarografía de pulso • Durante un tiempo muy corto se aplica un pulso de potencial durante el ultimo 1/4 de tiempo de vida de la gota. La corriente de carga decae durante los ultimos 20 ms. • Corriente de difusión medida durante los últimos 20 ms. • Pulsos sucesivos con incremento de E en función del tiempo. • Mas sensible que la polarografía convencional DC y la de Tast. Polarografía diferencial de pulso • Pulsos de 5-100 mV se superponen con la aplicación linear de potencial. • La corriente se muestrea antes y cerca del final del pulso. • Mayor sensibilidad • Mayor resolución Polarografía clásica vs de pulso

De acuerdo al programa de potencial aplicado se ha dado origen a las siguientes técnicas: Técnicas de barrido: Polarografía clásica Voltamperometría de barrido lineal (LSV). Voltamperometría cíclica (CV). Técnicas de pulso: Voltamperometría y polarografía de pulso diferencial (DPV–DPP). Voltamperometría y polarografía de pulso normal (NPV-NPP). Técnicas de onda cuadrada: Voltamperometría de onda cuadrada (SWV). Técnicas de redisolución: Voltamperometría de redisolución de pulso diferencial (DPSV).

Voltamperometría de redisolución de barrido lineal (LSSV). Voltamperometría de onda cuadrada de redisolución anódica (SWASV) y catódica (SWCSV).

Forma de la señal Pulso diferencial La i se muestrea 2 veces. Polarografía o voltamperometría diferencial de pulso. LD aprox. 1x10-7M Onda cuadrada Voltamperometría o Polarografía de onda cuadrada

E

LD aprox. 1x10-8M

T ie m p o

Onda triangular Voltamperometría cíclica E

Tiempo

Curva i-E

Resumen técnicas polarográficas

Técnicas de stripping • • •

Técnicas en 2 etapas: a) acumulación. Depósito, adsorción b) barrido. SWSV, SWAdV, PDV, CV, etc.

•

Sensibilidad: bajo ppb

Redisolución anódica

Aplicaciones • Metales traza en matrices biológicas, ambientales y alimentos: Principalmente: Cu, Pb, Cd, Zn, Cr(III) y Cr(VI), Mo(VI), Ni(II), etc. • Determinación de constantes de equilibrio. • Capacidad complejante. Voltamperometría cíclica

ELECTROFORESIS Técnica de separación que se basa en la capacidad de un soluto para desplazarse en un medio conductor por influencia de un campo eléctrico. La separación es posible debido a que iones con diferente relación q/R migran a diferentes velocidades.

Voltaje aplicado por unidad de longitud del medio de separación

Medio de separación medio tamponado

E ↑ v↑ conductor de la corriente eléctrica controla la carga eléctrica

En la electroforésis capilar, la muestra se inyecta en una disolución tamponada retenida en el interior de un tubo capilar. Cuando se aplica un campo eléctrico a este tubo, los componentes de la muestra migran debido a 2 tipos de movilidades; Movilidad electroforética y Movilidad electroosmótica. La movilidad electroforética es la respuesta del analito al campo eléctrico aplicado (cationes al cátodo, aniones al ánodo y las neutras permanecen estacionarias). Vef : µ efdelsoluto  x E µ ef = q/6 Π η r (q es la carga del analito, η es la viscosidad del solvente tampón y r es el radio del analito). Flujo electroosmótico se produce cuando la disolución tampón se mueve por el capilar en respuesta al campo eléctrico. En general el tampón se mueve hacia el cátodo arrastrando a los analitos

•

La electroosmosis se produce porque las paredes del tubo capilar poseen carga eléctrica. A pH superior a 2 o 3 los grupos silanol (Si-OH) se ionizan formando silanatos atrayendo a los cationes del tampón en forma mas fuerte y más débil, formando una doble capa. Los cationes de la doble capa migran hacia el cátodo y como están solvatados arrastran disolución, produciendo flujo electroosmótico.

Al aplicar campo eléctrico El resto de las cargas (+) se mueven hacia el polo (-) Se genera un flujo de tampón que arrastra todo lo que hay en el interior del capilar 

VENTAJAS electroforesis capilar

electroforesis convencional

MEJOR DISIPACIÓN DE CALOR ( ↑S /V) POTENCIALES DE VARIAS DECENAS DEextkV (Eint↑) TIEMPOS DE ANÁLISIS CORTOS DETECCIÓN EN CONTINUO AUTOMATIZACIÓN (sencillez, rapidez) Características electroforesis capilar  RAPIDEZ ALTAS EFICACIAS PEQUEÑOS VOLÚMENES DE MUESTRA (nanolitros) AMPLIO RANGO DE APLICACIONES (Modos de EC) AUTOMATIZACIÓN DETECCIÓN EN LÍNEA (“on column”= en el propio capilar)

DETECCIÓN EN LÍNEA (“on column”)

Monocromador Rendija Fuente de luz

Haz de luz UV

Capilar

Fotodiodo

Lente

Absorción UV-Vis Fluorescencia (no todos los compuestos fluorescen) Amperométrica (no se disipa la corriente residual) MS (problemas de interfase)

ELECTROFORESIS CAPILAR ⇔ HPLC PROPIEDADES ELECTRICAS DEL ANALITO DIFERENTE DISTRIBUCION ENTRE FASES

t

t Flujo

-

Perfil de flujo plano (mayor eficacia) Diferentes mecanismos de separación Mayor rapidez Menor requerimiento de muestra Peor reproducibilidad en analisis cuantitativo Problemas a escala micropreparativa

Flujo

-

• Análisis Farmacéutico: Moléculas de baja masa molar, compuestos cargados y • • • •

neutros. Reacciones quirales. Determinación de pureza, estabilidad, chequeo de  productos finales. Biociencia : Péptidos, proteínas, DNA, carbohidratos. Alimentos : Cationes y aniones inorgánicos, ácidos orgánicos, aminoácidos, carbohidratos. Química Ambiental: pesticidas, iones inorgánicos, metales de transición, surfactantes, colorantes, etc. Estudios de especiación .

BIOSENSORES “Instrumentos analíticos que transforman procesos biológicos en señales eléctricas u ópticas y permiten su cuantificación” Utilizan la especificidad de los procesos biológicos: - Enzimas x Sustratos - Anticuerpos x Antígenos - Lectinas x Carbohidratos - Complementariedad de ácidos nucleicos. Ventajas: - Reutilización - Menor manipulación - Menor tiempo de ensayo - Repetitividad Tipos y usos mas comercializados: 1. Tiras colorimétricas 2. Electroquímicos: - Potenciométricos: Glucosa, Lactato, Glicerol, Alcohol, Lactosa, Laminoácidos, Colesterol - Amperométricos: Glucosa, Sacarosa, Alcohol 3.Ópticos: BIAcore: Ag proteicos.

1. Control de metabolitos críticos durante las operaciones quirúrgicas. 2. Consultas y Urgencias Hospitalarias: – Obvia análisis caros y lentos en laboratorios centrales – Acelera la diagnosis y el comienzo del tratamiento – Menor riesgo de deterioro de la muestra 3. Diagnóstico Doméstico: – Ensayos de Embarazos – Control de Glucosa en diabéticos 4. Aplicaciones in vivo: – Páncreas artificial – Corrección de niveles de metabolitos – Problemas : Miniaturización y Biocompatibilidad 5. Aplicaciones Industriales, militares y medio ambientales: – Alimentación – Cosmética – Control de Fermentaciones – Controles de Calidad – Detección de Explosivos – Detección de gases nerviosos y/o toxinas  biológicas – Control de polución.

Tipos de biosensores 1. Biosensores electroquímicos – Amperométricos: Determinan corrientes eléctricas asociadas con los electrones involucrados en procesos redox