MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL Elaborado por:
JAIRO ALBERTO VILLAMIZAR GELVEZ Estudiante de Tecnología Química Código: 1930022 Directora:
DORA CECILIA RODRIGUEZ ORDOÑEZ Química, M. Sc.
UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER FACULTAD DE INGENIERÍAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PLAN DE ESTUDIOS DE TECNOLOGÍA QUÍMICA 2013
AGRADECIMIENTOS El autor del trabajo expresa sus agradecimientos a la Universidad Francisco de Paula Santander y a las siguientes personas, cuyos aportes fueron valiosos para llevar a cabo el desarrollo de este manual: al Ingeniero Juan María Torres Caicedo, director del Departamento de Química, a la profesora y directora del presente manual Dora Cecilia Rodríguez Ordoñez por su valiosa colaboración en el desarrollo de cada práctica propuesta, a María Ascensión Acevedo, María Eugenia Moreno, Guillermo Niño, Gloria Cecilia Medina, Mirian Carvajal Valderrama y Yolanda Mejía Toro, docentes y auxiliares del Laboratorio de Química, por su colaboración, y a todas aquellas personas que de una u otra forma brindaron su colaboración.
AGRADECIMIENTOS El autor del trabajo expresa sus agradecimientos a la Universidad Francisco de Paula Santander y a las siguientes personas, cuyos aportes fueron valiosos para llevar a cabo el desarrollo de este manual: al Ingeniero Juan María Torres Caicedo, director del Departamento de Química, a la profesora y directora del presente manual Dora Cecilia Rodríguez Ordoñez por su valiosa colaboración en el desarrollo de cada práctica propuesta, a María Ascensión Acevedo, María Eugenia Moreno, Guillermo Niño, Gloria Cecilia Medina, Mirian Carvajal Valderrama y Yolanda Mejía Toro, docentes y auxiliares del Laboratorio de Química, por su colaboración, y a todas aquellas personas que de una u otra forma brindaron su colaboración.
TABLA DE CONTENIDO Pág. LISTADO DE TABLAS LISTADO DE FIGURAS INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA N° 1 NORMAS DE SEGURIDAD, ORGANIZACIÓN DE TRABAJOS DENTRO DEL LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL………………………………………………………
5 6 8
9
PRÁCTICA N° 2 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE DATOS………………
19
PRÁCTICA N° 3 DETERMINACIÓN POTENCIOMÉTRICA DE LA ACIDEZ DEL VINAGRE………………………………………………………………………
26
PRÁCTICA N° 4 DETRMINACIÓN DE ALCOHOL ETÍLICO POR REFRACTOMETRÍA………………………………………………………………..
33
PRÁCTICA N° 5 POLARIMETRÍA (ROTACIÓN ESPECÍFICA DE SUSTANCIAS ÓPTICAMENTE ACTIVAS)…………………………… ACTIVAS)………………………………………. ………….
38
PRÁCTICA N° 6 DETRMINACIÓN DE HIERRO (Fe), POR EL MÉTODO COLORIMÉTRICO DE LA FENANTROLINA…………………………………….
44
PRÁCTICA N° 7 DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE FÓSFORO DISPONIBLE EN SUELOS AGRÍCOLAS……………………………..
49
DETERMINACIÓN PRÁCTICA N° 8 ADITIVIDAD DE ABSORBANCIAS, DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA SIMULTANEA DE CROMO Y MANGANESO…...
56
PRÁCTICA N° 9 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN UNA BEBIDA ENERGIZANTE, MÉTODO DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN
62
PRÁCTICA N° 10 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN UNA BEBIDA ENERGIZANTE, MÉTODO ADICIÓN DE UN ESTÁNDAR…….
67
PRÁCTICA N° 11 ESPECTROSCOPIA INFRARROJA, APLICACIÓN DEL TUTOR IR PARA LA IMPLEMENTACIÓN DE CONCEPTOS TEÓRICOS……..
72
PRÁCTICA N° 12 ANÁLISIS INFRARROJO, PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS……………………………………………………………………
76
PRÁCTICA N° 13 DETERMINACIÓN DE HIERRO Y MAGNESIO POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA………………………………..
86
PRÁCTICA N° 14 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC), DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN BEBIDA REFRESCANTE……………………………………………………………………... 101 PRÁCTICA N° 15 CROMATOGRAFÍA DE GASES, ANÁLISIS DE UNA MEZCLA DE HIDROCARBUROS…………………………………………………. 116
LISTADO DE TABLAS Pág. Tabla 1. Resultados obtenidos de la titulación del Biftalato de potasio (KHP)
24
Tabla 2. Preparación de los patrones de Fe+2 para el análisis.
46
Tabla 3. Preparación de patrones para el análisis de fósforo en suelos agrícolas
53
Tabla 4. Preparación de los patrones de cafeína para realizar la curva de calibración
64
Tabla 5. Preparación de los patrones para la adición de un estándar
69
Tabla 6. Propiedades de la llama en Absorción Atómica.
92
Tabla 7. Preparación de los patrones para el análisis por absorción atómica
96
Tabla 8. Preparación de los patrones de cafeína (HPLC) para realizar la curva de calibración
5
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LISTADO DE FIGURAS Pág. Figura 1. Representación de los errores sistemáticos y aleatorios
21
Figura 2. Montaje utilizado para realizar una valoración o titulación química.
23
Figura 3. Valoración potenciométrica de una solución de ácido acético vs NaOH
28
Figura 4. Gráficas representativas de la determinación potenciométrica de una solución
29
Figura 5. Principio de refracción, incidencia de un haz de luz
34
Figura 6. Región Infrarroja del Espectro Electromagnético
77
Figura 7. Representación de los picos y bandas de absorción en un espectro IR
77
Figura 8. Celda desmontable (1-ventanas; 2-anillo espaciador; 3-anillos intermedios; 4-soporte).
78
Figura 9. Celda para análisis IR cuantitativo de líquidos
79
Figura 10. Celda para el análisis IR de gases
80
Figura 11. Troquel utilizado para fabricar los discos de KBr
81
Figura 12. Componentes de un Espectrofotómetro de Absorción Atómica
88
Figura 13. Lámpara de cátodo hueco.
89
Figura 14. Quemador-Nebulizador de premezclado o flujo laminar
90
Figura 15. Regiones de la llama en un quemador de premezclado o flujo laminar
93
Figura 16. Diagrama esquemático de un espectrofotómetro de absorción atómica de doble haz.
94
Figura 17. Diagrama de flujo para un análisis por Absorción Atómica
97
Figura 18. Comportamiento de las partículas en la cromatografía de intercambio iónico
6
103
Figura 19. Comportamiento de las moléculas en la cromatografía de exclusión por tamaño
104
Figura 20. Estructura interna de la Bomba Recíproca para (HPLC)
106
Figura 21. Estructura interna de la Bomba de desplazamiento para (HPLC)
107
Figura 22. Estructura de un bucle utilizado en cromatografía (HPLC).
108
Figura 23. Partes de la columna para cromatografía (HPLC)
110
Figura 24. Estructura de la celda del detector ultravioleta en cromatografía (HPLC).
111
Figura 25. Estructura interna del equipo para cromatografía de gases (gas portador, sistema de inyección, columna y detector)
118
Figura 26. Sección transversal de un inyector de vaporización instantánea
119
Figura 27. Columnas utilizadas en cromatografía de gases (GC)
120
Figura 28. Representación estructural de un detector de ionización de llama (FID)
122
Figura 29. Representación estructural del detector de conductividad térmica (TCD).
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INTRODUCCIÓN
La ciencia encargada de la separación y determinación de especies químicas (analitos), con base en sus propiedades físicas tales como la conductividad, el potencial del electrodo, la absorción o emisión de la luz, la relación masa/carga, la fluorescencia ,entre otras, además de utilizar correctamente los instrumentos analíticos modernos recibe el nombre de Análisis Instrumental. El Análisis Instrumental es una asignatura fundamental en la formación de los estudiantes de Tecnología Química, Química, Química industrial y demás profesiones afines; debido a que en los últimos años se han producido diversos instrumentos sensibles que han incrementado considerablemente la capacidad de conocer, cuantificar y controlar los analitos, cuya complejidad va en aumento.
Debido a que los laboratorios de química de la Universidad Francisco de Paula Santander no cuentan con un manual de prácticas de laboratorio definido para la asignatura; se desarrolló un manual de prácticas de laboratorio de análisis instrumental, que se convertirá en una herramienta de enseñanza útil y práctica, que le permite al estudiante comprender los fenómenos estudiados en la asignatura y su preparación para el futuro.
Cada práctica incluida en el manual, fue elegida cuidadosamente, además fue probada y estructurada por el autor, con la finalidad de que se ajuste al actual contenido programático y a los recursos disponibles en los laboratorios de química de la UFPS. Al realizar cada experiencia el estudiante complementará su formación, y se podrá preparar para desempeñarse a nivel profesional.
El manual de prácticas de laboratorio fue estructurado bajo ciertos parámetros que permiten que la información sea ordenada y asimilada fácilmente por los estudiantes, describiendo paso a paso las acciones que se deben seguir. Esta información en cada práctica, se presenta de la siguiente forma: objetivos, que el estudiante debe cumplir al realizar cada práctica; un marco teórico, en el cual se menciona los fundamentos que rigen la práctica; el procedimiento, pasos que debe seguir el estudiante para realizar el análisis; cuestionario, le permite al estudiante afianzar los conocimiento; las referencias bibliográficas que le permite al estudiante ampliar conocimientos sobre el tema tratado.
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PRÁCTICA N° 1 NORMAS DE SEGURIDAD, ORGANIZACIÓN DE TRABAJOS DENTRO DEL LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL
1.1 OBJETIVOS
Conocer las normas de seguridad y comportamiento en el laboratorio de Análisis Instrumental. Conocer los riesgos físico-químicos y biológicos de las diferentes sustancias que se utilizarán en las prácticas de laboratorio de análisis instrumental. Comprender la importancia de contar con el botiquín de emergencias e identificar sus componentes básicos. Conocer las normas para la presentación de los informes de laboratorio de análisis instrumental.
1.2 INTRODUCCIÓN Para trabajar en el laboratorio de análisis instrumental, es necesario el entendimiento de las normas que rigen la seguridad y el comportamiento de los estudiantes, con su cumplimiento se podrán prevenir distintos incidentes, como incendios y explosiones, entre otros. Los estudiantes deben conocer los riesgos físico-químicos y biológicos de las sustancias que se utilizan en las diferentes prácticas; así como identificar los distintos componentes que deben conformar el botiquín de emergencias. Para la presentación de los informes de las prácticas de laboratorio, el estudiante deberá cumplir con las normas expuestas por el docente al inicio del curso.
1.3 FUNDAMENTO TEÓRICO
1.3.1 NORMAS GENERALES PARA EL LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL
Para realizar las prácticas es indispensable vestir la bata de laboratorio y la indumentaria apropiada. La puntualidad es indispensable para el inicio y desarrollo de la práctica.
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Para la ejecución de las prácticas se deben conformar grupos de trabajo organizados al inicio del semestre. Dentro del laboratorio está prohibido fumar, comer y realizar acciones que puedan generar accidentes. Cada alumno debe traer preparada la práctica mediante la presentación del preinforme de laboratorio, para ello debe leer con anterioridad y cuidadosamente el contenido de la práctica y la bibliografía correspondiente. Utilizar siempre que sea necesario los implementos de seguridad, tales como tapabocas, guantes, gafas de protección, careta de gases, entre otros. No colocar sobre los mesones de trabajo maletas, prendas personales o libros, esto quita espacio para trabajar y pueden estropearse con los reactivos. Sólo deben estar sobre los mesones los materiales de trabajo que se están utilizando. Al inicio y finalización de cada práctica se debe lavar el material de vidrio y enjuagarlo con agua destilada. Identificar los riesgos físico-químicos y biológicos de cada reactivo a utilizar en la práctica para prevenir cualquier accidente. No use nunca una sustancia sin estar seguro que es la indicada en la práctica, evite accidentes. Los materiales sólidos inservibles como fósforos, papel y desechos deben depositarse en un recipiente adecuado. Depositar los residuos de reactivos en los respectivos recipientes para su posterior disposición. Al finalizar cada práctica, limpiar su sitio de trabajo y dejarlo en perfecto estado.
1.3.2 NORMAS DE SEGURIDAD PARA EL LABORATORIO DE ANÁLISIS INSTRUMENTAL
Antes de utilizar un reactivo, verificar los datos anotados en la etiqueta, revisar sus propiedades físicas, químicas y toxicológicas para ser manejadas adecuadamente. Para manejar sustancias volátiles, inflamables y explosivas se deben llevar a la campana de extracción o en su defecto a un lugar ventilado. No pipetear con la boca ningún líquido. Para la dilución de los ácidos, añadir lentamente el ácido al agua contenida en un recipiente agitando constantemente y enfriando. Al calentar tubos de ensayo evitar el contacto de la boca del tubo con alguna parte de nuestro cuerpo. Nunca se debe llevar a la boca ningún material ni reactivo.
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Nunca devuelva al recipiente original una sustancia que se haya sacado del mismo, pues podría contaminarla. Si se derrama algún ácido sobre la mesa, se debe recoger inmediatamente y lavar la superficie con agua varias veces.
1.3.3 IDENTIFICACIÓN DE SUSTANCIAS PELIGROSAS Para cualquier producto químico utilizado en el laboratorio se debe tener la información sobre el riesgo inherente a su uso. Esta información aparece en las etiquetas o en las fichas de seguridad, en la que aparecerá el nombre de la sustancia o preparado e identificaciones de peligro. En la ficha de datos de seguridad aparecerá información precisa, tal como:
La identificación de la sustancia: El término empleado para la identificación de la sustancia deberá ser idéntico al que figure en la etiqueta.
Composición: La información aportada debe permitir a la persona conocer sin dificultad los peligros que puedan presentar los componentes de la sustancia. No es necesario indicar la composición completa (naturaleza de la sustancia y su concentración) aunque puede ser útil la descripción general de la sustancia y su concentración.
Identificación de los peligros: Se proporciona la clasificación de la sustancia. Se deben indicar clara y brevemente los peligros que representa la sustancia para el estudiante y el medio ambiente. Se distingue claramente de las sustancias clasificadas como peligrosas o no peligrosas y se describen los principales efectos adversos tanto físico-químicos como para la salud y el medio ambiente. Algunos peligros dentro del laboratorio son: - Riesgo de inflamabilidad: Un riesgo común dentro de un laboratorio es un incendio, que puede ocurrir debido a diversos combustibles, comburentes y fuentes de ignición que se encuentran en el laboratorio. Si se produce un incendio, se debe informar inmediatamente a los demás y pedir ayuda. Si el incendio es pequeño se puede intentar apagarlo utilizando medios apropiados como el extintor, en caso de no conseguirlo trate de evacuar lo más rápido posible el lugar.
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- Riesgo de explosión: Las explosiones pueden ocurrir fácilmente en un laboratorio si no se conocen las propiedades de las sustancias. Algunos riesgos de explosión se pueden presentar por: reacciones exotérmicas no controladas en las que se liberen grandes cantidades de energía, exposición al fuego de sustancias altamente inflamables y mal manejo de sustancias incompatibles, entre otras.
Primeros auxilios: Debe especificarse en primer lugar si se precisa asistencia médica inmediata. La información sobre primeros auxilios debe ser breve y fácil de entender por parte del afectado, los allí presentes y los servicios de emergencia. Deben describirse brevemente los síntomas y los efectos, además es importante indicar si se requiere o es aconsejable consultar a un médico.
Manipulación y almacenamiento: Especificar las precauciones necesarias para garantizar una manipulación sin peligro, incluyendo recomendaciones sobre medidas de orden técnico tales como las de contención, de ventilación local y general, las destinadas a impedir la formación de aerosoles y polvo, o para prevenir incendios, así como las medidas de protección del medio ambiente. Para el almacenamiento se debe especificar las condiciones necesarias para un almacenamiento seguro como lugares ventilados y protegidos contra variables de temperatura, humedad, luz, entre otras.
Propiedades físicas y químicas: Para permitir la adopción de las medidas adecuadas de control. Proporcionar toda la información pertinente sobre la sustancia como: -
Aspecto: Indicar el estado físico (solido, líquido, gas) y el color de la sustancia tal y como se suministra. Si el olor es perceptible, describirlo brevemente. Indicar el pH de la sustancia tal y como se suministra, en caso de solución acuosa indicar la concentración.
- Otros datos: Indicar otros parámetros importantes para la seguridad, tales como la miscibilidad, conductividad y punto de ebullición o de fusión, entre otros.
Información toxicológica: Las sustancias o algunos preparados que por algún efecto como inhalación, ingestión o penetración cutánea, puede producir efectos nocivos no hereditarios en la descendencia, o aumentar la frecuencia de éstos, así como afectar de forma negativa a la función o a la capacidad reproductora masculina o femenina, se consideran como sustancias toxicas. A estas sustancias se les debe prestar total cuidado con la finalidad de evitar accidentes graves.
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1.3.4 PRIMEROS AUXILIOS EN EL LABORATORIO Cuando se trabaja en un laboratorio los estudiantes se encuentran expuestos a diversos accidentes que pueden afectar su integridad física, por tal razón se deben exponer las pautas que se deben cumplir como parte de prevención en caso de algún accidente. Los accidentes más comunes en los laboratorios son: cortes y heridas, quemaduras o corrosiones, salpicaduras en los ojos e ingestión de productos químicos. Los primeros auxilios que se deben prestar en caso de alguno de los anteriores accidentes se describen a continuación:
Cortes y heridas: Lavar la parte del cuerpo afectada con agua y jabón. No importa dejar sangrar algo la herida, pues ello contribuye a evitar la infección. Aplicar después agua oxigenada y cubrir con gasa esterilizada y algodón. Si persiste la hemorragia o han quedado restos de objetos extraños acudir inmediatamente a un centro de salud.
Quemaduras o corrosiones: Por fuego u objetos calientes, no lavar la lesión con agua, tratarla con disolución acuosa o pomada especial para quemaduras, posteriormente cubrir la herida con una venda. Por ácidos en la piel, identificar la zona afectada y aplicar abundante agua. Aplicar crema especial para quemaduras, posteriormente cubrir la herida con una venda.
Salpicaduras en los ojos: Lavar inmediatamente con agua la zona afectada, aunque se sienta dolor o irritación, la persona afectada debe tratar de mantener los ojos abiertos, de tal modo que el agua penetre debajo de los parpados. Cuando se tenga al paciente estabilizado buscar atención medica inmediatamente.
Inhalación de sustancias químicas: llevar al paciente al aire fresco inmediatamente, prestarle atención médica tan pronto como sea posible. Al primer síntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiración artificial boca a boca. El oxígeno debe ser administrado solamente por personal entrenado. Continuar la respiración artificial boca a boca hasta que el médico lo aconseje. Tratar de identificar el humo o vapor causante de la dificultad respiratoria.
Ingestión de sustancias químicas: Cuando se produce un accidente en el cual se ingiere una sustancia química se debe tener en cuenta las siguientes recomendaciones antes de llevar al paciente a una entidad promotora de salud:
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-
Ácidos corrosivos, no inducir jamás al vómito, de lo contrario puede ocasionar lesiones en el tracto digestivo. Administrar lechada de magnesia (óxido de magnesio + agua) en grandes cantidades.
-
Álcalis corrosivos, no inducir jamás al vómito, de lo contrario puede ocasionar lesiones en el tracto digestivo. Administrar abundantes tragos de disolución de ácido acético al 1%; administrar grandes cantidades de leche o algunas claras de huevo batidas en agua.
-
Sustancias toxicas, cuando se haya ingerido una sustancia toxica o venenosa, tratar al paciente con antídoto universal, el cual se prepara con 2 partes de carbón activado, 1 parte de óxido de magnesio y 1 parte de ácido tánico. Se homogeniza totalmente y se guarda en seco. Para administrarlo se disuelven 15 gramos en medio vaso de agua caliente. Si el paciente no mejora, se debe llevar rápidamente a un centro de salud en el cual se le realice un lavado estomacal.
1.3.5 EL BOTIQUÍN DE PRIMEROS AUXILIOS En cada laboratorio se debe contar un botiquín de primeros auxilios, que proporcione diferentes herramientas que permitan controlar un accidente u otro riesgo. Un botiquín debe contener materiales de limpieza y algunos productos o preparados químicos que permitan la atención inmediata y adecuada del paciente, algunos de estos son:
MATERIALES
PRODUCTOS
Algodón Gasas esterilizadas Bandas adhesivas Esparadrapo Hisopos Vendas Cinta adhesiva Tijeras Pinzas Cinta Microporo
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Alcohol antiséptico Agua destilada Solución ácido acético al 1 % Antídoto universal Pomada de ácido tánico Crema sulfadiazina de plata. Lechada de magnesio Bicarbonato de sodio Agua oxigenada Carbón activado en polvo Cloruro de sodio
1.3.6 ORGANIZACIÓN INSTRUMENTAL
EN
EL
LABORATORIO
DE
ANÁLISIS
La organización en el laboratorio debe estar debidamente respaldada por una serie de responsabilidades claramente definidas al inicio del semestre. Los deberes que se deben cumplir dentro del laboratorio de análisis instrumental son los siguientes:
Preparación de la práctica: Se debe preparar la práctica acordada antes de realizarla en el laboratorio, para lo cual se debe conocer la guía, leerla completamente e identificar los objetivos y el fundamento teórico de la práctica, así como el procedimiento a seguir e identificar si se deben realizar cálculos previos.
Puntualidad: La permanencia en el laboratorio es necesaria para reforzar los conocimientos adquiridos en clase, además de ser muy limitado el tiempo en el cual se desarrolla cada práctica, se debe aprovechar al máximo el tiempo y se deben cumplir con los horarios acordados al inicio de clases con el correspondiente docente de la asignatura.
Limpieza: Al inicio de cada práctica de laboratorio se debe contar con materiales y herramientas de imprescindible uso, las cuales deben estar completamente limpias y libres de interferencias que puedan alterar un resultado. Para preservar las pautas de higiene se deben cumplir las normas generales y de seguridad en el laboratorio, esta serie de recomendaciones permiten trabajar de forma segura y confiable.
1.3.7 LA BITÁCORA O CUADERNO DE LABORATORIO Durante el desarrollo de las prácticas de laboratorio se obtienen diversos resultados que se deben reportar al docente de clase, para dichos reportes es fundamental contar con la utilización de una bitácora o cuaderno de laboratorio. En éste se reportan los datos obtenidos de cada práctica, así como las diferentes conclusiones y ejercicios que se desglosen del desarrollo de cada tema. Para llevar la bitácora o cuaderno de laboratorio ordenadamente se deben cumplir algunas normas como:
Es aconsejable el uso de un cuaderno cuadriculado, ya que la cuadrícula facilita la escritura y lectura de tablas de datos, gráficas y diagramas de flujo. Se debe utilizar letra legible y clara, que le permita al docente la evaluación. Todos los resultados obtenidos de cada práctica se deben consignar en la bitácora.
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En la bitácora no se debe borrar; los posibles errores deben tacharse por medio de una raya la cual debe ir encima de lo que se desea eliminar. Las operaciones correspondientes a los cálculos deben indicarse mediante un solo ejemplo, sin incluir detalles aritméticos innecesarios Una buena bitácora de laboratorio debe contener una descripción completa y autentica del trabajo realizado, incluyendo resultados positivos o negativos, el experimento deberá contener la fecha de realización, el nombre de la práctica, las conclusiones obtenidas y las preguntas propuestas. Las páginas de la bitácora o cuaderno de laboratorio deberán estar enumeradas y bajo ningún contexto se deben arrancar hojas. La bitácora o cuaderno de laboratorio debe sin ninguna excepción llevarse a cada práctica de laboratorio.
1.3.8 EL INFORME DE LABORATORIO Al finalizar cada práctica de laboratorio, el estudiante deberá presentar ante su docente un informe correspondiente a la práctica realizada, en el cual plasme los resultados y conclusiones obtenidas, además de ser un escrito serio, claro y que precise el contenido de la práctica. El informe de laboratorio se debe conformar de la siguiente manera:
Título de la práctica: En él se coloca el nombre completo de la práctica realizada.
Integrantes de grupo: En este apartado se deben plasmar los nombres completos y apellidos de los diferentes integrantes que conforman el grupo de trabajo.
Objetivos: En este apartado se describen los objetivos que se buscan con la realización de la práctica.
Marco teórico: En este apartado se debe realizar una breve reseña sobre los fundamentos de la práctica realizada.
Procedimiento: En este apartado se debe plasmar un diagrama de flujo, que permita conocer los pasos que se deben realizar para el desarrollo de la práctica.
Los anteriores ítems deben ser incluidos en el pre-informe de laboratorio, el cual deberá estar consignado en la bitácora de trabajo al inicio de la práctica.
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Recolección de datos y resultados: En este apartado se deben plasmar todos los datos obtenidos con el desarrollo de la práctica. Los datos pueden representarse por medio de tablas, diagramas de flujo, ejercicios, gráficas, entre otros, que permitan desglosar de buena manera el contenido temático de cada práctica.
Análisis de resultados: En este apartado se discuten y analizan de manera detallada cada una de las observaciones y resultados obtenidos, con la finalidad de comprender claramente cada una de las actividades desarrolladas en el trascurso de la práctica.
Conclusiones: En este apartado se deben estructurar las conclusiones de cada práctica, las cuales deberán ser acordes con los objetivos, es decir en qué medida se cumplen los objetivos propuestos.
Bibliografía: En este apartado se deben relacionar los medios de consulta utilizados para la elaboración del informe es decir textos, revistas científicas, monografías, direcciones electrónicas (internet), entre otras fuentes de información, que permitan soportar el análisis de resultados y las conclusiones aportadas por el estudiante.
1.4 PROCEDIMIENTO
Teniendo en cuenta el fundamento de la práctica, socializar en grupo cada uno de los aspectos allí contenidos. Discutir y pactar con el docente, las normas y el plan de trabajo que se utilizará para comprender la asignatura análisis instrumental y laboratorio.
1.5 CUESTIONARIO 1. Antes de manipular una sustancia química ¿Qué se debe conocer de ella? 2. ¿Qué se entiende por ficha de seguridad de una sustancia química? 3. Teniendo en cuenta la importancia de las fichas de seguridad en las sustancias químicas, estructurar la ficha de seguridad para el Etanol. 4. ¿Qué se entiende por emético, antídoto y cómo se debe preparar el antídoto universal?
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5. ¿Cómo se deben almacenar las distintas sustancias químicas según sus propiedades y riesgos físico-químicos y biológicos?
1.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
MENCIAS Rodríguez E., MAYERO Franco, L. M., “Manual de Toxicología Básica”. Ediciones Díaz de Santos S.A, España, 1a edición, 2000.
VALCARCEL, M., RÍOS, A., “La Calidad en los Laboratorios Analíticos”. 1a ed. Editorial Reverté, S.A., Barcelona, 2002.
VERDE Calvo J., ESCANILLA Hurtado M., REYES Dorantes A., y MALPICA Sánchez F. Manual de Prácticas de Química Analítica ɪɪ; Universidad Autónoma Metropolitana, Iztapalapa, 1a edición, México D.F, 1999.
Servicio de Prevención de Riesgos Laborales del CSIC en Sevilla, Ministerio de Educación y Ciencias. “Manual de Buenas Prácticas de Laboratorio”. Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Sevilla, 2007.
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PRÁCTICA N° 2 TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE DATOS 2.1 OBJETIVOS
Reconocer la importancia del tratamiento estadístico de los datos obtenidos durante la experimentación química mediante una práctica sencilla de valoración de soluciones. Adquirir destrezas en el manejo de errores sistemáticos y aleatorios durante la estandarización de una solución de NaOH. Aplicar la desviación estándar, varianza y el coeficiente de variación en una serie de datos para conocer la precisión del método utilizado.
2.2 MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES
REACTIVOS
3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL Probeta de 100 mL Bureta de 50,00 mL
Solución de hidróxido de sodio (NaOH) Biftalato de potasio (KHP) Agua destilada
1 Vaso de precipitado de 50 mL Balanza analítica Espátula, varilla de vidrio Frasco lavador Calculadora
2.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS Las valoraciones o titulaciones químicas son todos aquellos métodos de análisis cuantitativo en los cuales la sustancia a determinar se estudia en forma indirecta, por medio de la medición del volumen de una solución apropiada, de concentración conocida, que reacciona completamente con la sustancia analizada o analito.
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Las medidas experimentales están sujetas a errores o incertidumbres en sus valores, debido a factores como las imperfecciones del instrumento de medida o a las limitaciones de nuestros sentidos en el caso de que ellos sean los que registren la información, entre otros. El valor de las magnitudes físicas se obtienen experimentalmente efectuando una medida; está puede ser directa o indirecta, donde se pueden generar imprecisiones inevitables. El error es un factor inevitable en cualquier proceso de medida; nada puede ser medido con toda precisión. Este hecho es tan relevante, al punto que un resultado experimental sin una estimación del error no tienen ningún significado práctico, ya que desconocer el error significa desconocer el grado de confiabilidad de un resultado. El error experimental está determinado por la precisión y exactitud de las medidas. La relación entre precisión y exactitud se relaciona en los errores sistemáticos y errores aleatorios.
Errores aleatorios o indeterminados: Son errores que causan la dispersión de los resultados de una medida experimental en una serie de réplicas. Si las medidas son altamente reproducibles o si por el contrario, resultaron muy dispersas, significa que los errores aleatorios fueron pequeños o grandes, respectivamente. Generalmente los errores aleatorios son de pequeña magnitud, y dan origen a desviaciones positivas y negativas, las cuales fluctúan alrededor del valor medio. Siempre están presentes y no pueden ser corregidas, por lo tanto son los principales determinantes del error experimental.
Error sistemático: Los errores sistemáticos son demasiado grandes y no siempre están presentes, puesto que se pueden corregir si se detecta la fuente que los origina. El error sistemático es reproducible de una medición a otra a lo largo de un experimento, ocasionando que los resultados de una serie de medidas sean erróneos en una misma dirección, esto significa que todos los datos están por encima, o por debajo del valor verdadero o teórico. Existen tres tipos de errores sistemáticos: -
Errores Instrumentales: Están relacionados con alguna perturbación o alteración en el correcto funcionamiento de los instrumentos de medida, estos errores se corrigen mediante la calibración de los instrumentos de medida.
-
Errores Personales: Se presentan como consecuencia de las limitaciones propias del analista, estos errores se logran corregir mediante el cuidado y autodisciplina en el trabajo por parte del analista.
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-
Errores de Método: Ocurren cuando se presentan condiciones experimentales inadecuadas o inesperadas (inestabilidad de reactivos, interferencias químicas, perdidas por volatilidad, entre otros), son difíciles de detectar y corregir.
Figura 1. Representación de los errores sistemáticos y aleatorios.
Para establecer el tipo de error en los análisis experimentales se dispone de algunos parámetros estadísticos importantes entre los cuales se encuentran las “medidas de posición”, parámetro estadístico que demuestra la tendencia que tiene un conjunto de medidas repetidas de agruparse alrededor de un punto definido; esta característica permite seleccionar un valor representativo que describe o resume todo el conjunto de datos. Las “medidas de variabilidad o dispersión”, describen el grado en que los valores de una serie de medidas repetidas varían o se diferencian entre sí. Los parámetros estadísticos más utilizados en los análisis experimentales son: la media aritmética o promedio, la desviación estándar, la varianza y el coeficiente de variación.
La Media Aritmética: También conocida como promedio, o simplemente media, se define como la suma de todos los valores medidos (Xi) dividido entre el número de determinaciones realizadas (n). Está definición cuyo resultado se expresa en las mismas unidades en que se hicieron las mediciones, es la más utilizada para establecer la centralidad de una serie de datos.
La Desviación Estándar: Evalúa la precisión en términos del grado de proximidad de los datos (Xi) al valor de la media (X). El cálculo de la desviación estándar tiene una pequeña variación de acuerdo con el número de determinaciones (n). 21
Si el número de medidas es grande, n ≥ 30, se calcula la desviación estándar de la población y se representa por la letra griega sigma (σ), y viene dada por la expresión:
Por otro lado, cuando el número de medidas es pequeño, como normalmente ocurre en las prácticas de laboratorio, se determina la desviación estándar de la muestra, (S), se define como:
La Varianza: Es el promedio aritmético del cuadrado de la diferencia de los datos observados (Xi) y la media (X). En otras palabras, la varianza equivale al cuadrado de la desviación estándar, S = s2
Coeficiente de Variación: También conocida como desviación estándar relativa, es una medida de la variabilidad relativa que expresa la magnitud de la desviación estándar como un porcentaje de la media. Se utiliza para estandarizar la variabilidad de dos o más conjuntos de datos obtenidos en escalas de medición diferentes, o que tienen media muy diferente, y así poderlos comparar.
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2.4 PROCEDIMIENTO
2.4.1 Preparación de las Soluciones: a) Biftalato de potasio (KHP “estándar primario”): Pesar en la balanza analítica una cantidad exacta alrededor de 0,2500 g de KHP y disolver en 25 mL de agua destilada. Repetir el procedimiento para preparar 10 soluciones de KHP. b) Solución de hidróxido de sodio (NaOH 1,00 M): Esta solución se entregará al inicio de la práctica por el asistente de laboratorio, la concentración real de la solución se determinará por medio de la valoración química.
2.4.2 Determinación: Pesar la muestra de KHP en la balanza analítica y transferirla cuantitativamente a un Erlenmeyer de 250 mL, disolver en 25 mL de agua destilada, agitando hasta disolución completa y adicionar 3 gotas de indicador de fenolftaleína.
Figura 2. Montaje utilizado para realizar una valoración o titulación química. Preparar el montaje para realizar la valoración química. Lavar con abundante agua la bureta y purgarla con la solución de NaOH. Llenar la bureta hasta el aforo con la solución de NaOH. Colocar el Erlenmeyer con la solución de (KHP), debajo de la bureta y abrir la llave, añadir lentamente la solución de NaOH hasta que la solución trate de tornarse rosada (cuando se encuentra en el punto de equivalencia); cerrar la llave y luego adicionar cuidadosamente gota a gota la solución de NaOH. El color rosado claro persiste más tiempo cuando se está cerca del punto final de la valoración.
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Valorar las diez soluciones de KHP y registrar el volumen de NaOH (consumido en la valoración) en la Tabla 1:
Tabla 1. Resultados obtenidos de la titulación del Biftalato de potasio (KHP). Masa KHP (gramos)
V Consumido NaOH (mL)
Concentración NaOH (mol/L)
Calcular la concentración de NaOH en cada muestra e identificar la media aritmética, desviación estándar, varianza y coeficiente de variación de los datos obtenidos. Nota: Recolectar los datos obtenidos por los diferentes grupos de trabajo, para realizar el tratamiento estadístico.
2.5 CUESTIONARIO 1. Calcular la media aritmética, desviación estándar, varianza, y coeficiente de variación, de los datos reportados tras la valoración del NaOH. 2. ¿Qué opinión le genera el tratamiento estadístico de datos en un análisis químico? 3. ¿Qué tipos de errores afectan la precisión de un método instrumental? 4. Se realizaron 14 determinaciones de la concentración del ion nitrato (μg/mL) en una muestra de agua. Calcular la media aritmética, desviación estándar, varianza y coeficiente de variación. Ion Nitrato (μg/mL) Ion Nitrato (μg/mL) Muestra Muestra 1 0,5114 8 0,4921 2 0,4956 9 0,5134 3 0,4834 10 0,5265 4 0,5056 11 0,5189 5 0,4702 12 0,4856 6 0,5113 13 0,5345 7 0,5234 14 0,4934
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5. ¿Cuáles son los indicadores utilizados para determinar el punto de equivalencia?
2.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG Douglas A., WEST D. M., HOLLER James, CROUCH Stanley R. “Fundamentos de Química Analítica”. 8a ed. Editorial Reverté, 1997.
MILLER J. C., MILLER J. N. “Estadística para Química Analítica”. 2ª ed. Addison-Wesley Iberoamericana S.A., 1993.
BLANCO Tirado Cristian, VILLABONA Estupiñán Santiago. “Manual, Introducción a las Prácticas de Laboratorio del Programa de Pregrado de Química”. Universidad Industrial de Santander (UIS).
HARRIS Daniel C., Análisis Químico Cuantitativo. Capítulo 7, “Valoraciones” Editorial Reverté, S. A., Barcelona España, 2007.
CABRERA Riaño Néstor. “Fundamentos de química analítica básica, Análisis Cuantitativo”. Capítulo 7, Volumetría. 2a ed. Universidad de Caldas, 2007.
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PRÁCTICA N° 3 DETERMINACIÓN POTENCIOMÉTRICA DE LA ÁCIDEZ DEL VINAGRE
3.1 OBJETIVOS
Identificar los componentes del equipo utilizado para registrar una valoración potenciométrica ácido-base. Adquirir destreza en la calibración del medidor de pH. Conocer la importancia de los indicadores químicos utilizados en las valoraciones ácido-base. Determinar la acidez total de una solución de ácido acético (vinagre) mediante la detección potenciométrica del punto final. Elaborar las gráficas de los resultados potenciométricos, para la detección del punto final.
3.2 MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES
REACTIVOS
Bureta de 50,00 mL Pipeta graduada de 1, 5, 10 mL Pipeta aforada de 50,00 mL 3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL Balón aforado de 100,0 mL Balón aforado de 250,0 mL Vasos de precipitado de 100, 250, 500 mL Espátula Agitador de vidrio Soporte para bureta con pinzas Medidor de pH
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Hidróxido de sodio (NaOH) Ácido acético (vinagre) Biftalato de potasio Fenolftaleína Solución Buffer de pH 7 Solución Buffer de pH 4 Agua destilada
3.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS Los métodos volumétricos se basan en el hecho de que la concentración del reactivo valorante debe ser conocida dentro del grado de precisión requerido. El problema crítico en una valoración potenciométrica es el de reconocer el punto en el cual las cantidades de especies reactantes se encuentran presentes en cantidades equivalentes, “el punto de equivalencia”. La curva de valoración puede seguirse punto por punto, proyectando valores sucesivos de pH contra el volumen de valorante añadido. Las adiciones de valorante deben ser cantidades muy pequeñas, exactamente medidas, a través del margen de pH. En la mayor parte del margen de la valoración, el pH varía gradualmente, pero cerca del punto de equivalencia el pH sufre una rápida variación. El problema, en general, es el de detectar este agudo cambio en el pH que tiene lugar en las proximidades del punto de equivalencia. En las valoraciones potenciométricas de un ácido débil - base fuerte, se pueden considerar cuatro etapas, como se puede observar en la figura 3, la cual representa el cambio del pH de una disolución de ácido acético valorada con NaOH:
En el punto inicial hay una disolución de un ácido débil, cuyo pH se puede calcular a través de la ecuación de su constante de equilibrio (K a). En la gráfica corresponde a la ordenada en el origen.
Entre el punto inicial y el punto de equivalencia, la disolución valorada contiene el ácido débil y la sal de su base conjugada, que se va formando al añadir la base fuerte. Por tanto, es una disolución reguladora, cuyo pH puede calcularse mediante la ecuación de Hendersson y Hasselbach, comprobándose que se mantiene prácticamente constante. Corresponde aproximadamente al tramo comprendido entre el origen y el pH de 6,00.
En el punto de equivalencia todo el ácido se ha neutralizado, encontrándose como la sal de su base conjugada. En consecuencia, el pH será básico, y la elección del indicador está condicionado a que el pH final, se encuentre en el rango del cambio de cada indicador. En la gráfica corresponde al punto de inflexión.
Una vez que se haya alcanzado el punto de equivalencia, si se sigue añadiendo la base fuerte, el pH se hará más básico con rapidez. Corresponde al tramo final de la gráfica.
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Figura 3. Valoración potenciométrica de una solución de ácido acético vs NaOH.
La cantidad total de ácidos presentes en una muestra de vinagre (expresada como gramos de ácido acético por 100 mL de vinagre), puede determinarse fácilmente por valoración con una disolución de NaOH previamente estandarizada, el NaOH reacciona con el ácido acético del vinagre mediante la siguiente reacción:
CH3COOH + NaOH
CH3COONa + H2O
Puesto que la estequiometria de la reacción es (1:1), en el punto de equivalencia se cumplirá que: N° de moles de ácido = N° de moles de base
MácidoVácido = MbaseVbase En el punto de equivalencia de esta valoración el pH de la disolución será básico (debido a la presencia del ion acetato) y por tanto, para detectar el punto final de esta valoración hay que elegir un indicador que cambie de color al pH adecuado. En este caso, se utiliza indicador de fenolftaleína, que en soluciones ácidas es incolora, mientras que en medio básico toma una coloración rosa. La valoración también puede realizarse por potenciometría, con ayuda de un medidor de pH. En este caso, el punto de equivalencia corresponde al momento en el cual se produce la variación más rápida del pH. La mejor forma de determinar el punto de equivalencia es calcular la primera y segunda derivada de la curva de valoración, que mide la velocidad de cambio del pH, y que presentará un máximo en el punto de equivalencia, cuyas gráficas se pueden observar en la figura 4. Así puede determinarse con exactitud el punto de equivalencia, y por lo tanto la concentración de la solución de ácido acético.
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Figura 4. Gráficas representativas de la determinación potenciométrica de una solución Método directo: consiste en graficar los datos de potencial en función del volumen de reactivo. El punto de inflexión en la parte ascendente de la curva se estima visualmente y se toma como punto final.
Método de la primera derivada: implica calcular el cambio de potencial por unidad de volumen de valorante (∆E/∆V). El gráfico de estos datos en función del volumen promedio V produce una curva con un máximo que corresponde al punto de inflexión. Si la curva es simétrica, el punto máximo de la pendiente coincide con el punto de equivalencia. Las curvas asimétricas dan un pequeño error de titulación si el punto máximo se toma como el final. Estas curvas son comunes cuando el número de electrones transferidos es diferente en las semi-reacciones del analito y valorante.
Método de la segunda derivada: En este caso se grafica ∆2E/∆2 V, en la figura puede verse que la segunda derivada de los datos cambia de signo en el punto de inflexión. Este cambio de signo es tomado en algunos casos como punto final. El punto final de la valoración se toma en el punto de intersección de la segunda derivada con cero. Este punto puede ser ubicado con mucha precisión.
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3.4 PROCEDIMIENTO 3.4.1 Preparación de la Solución de NaOH : Pesar en un vaso de precipitado la cantidad de NaOH necesaria para preparar 250,0 mL, de una disolución 0,1000 M. Pesar el NaOH en la balanza analítica y añadir un poco de agua destilada, agitar vigorosamente con la varilla hasta su completa disolución. Transferir el contenido del vaso de precipitado a un balón de 250,0 mL y llevar hasta aforo con agua destilada. Nota: En caso de preparar la solución con anterioridad a la práctica, se recomienda envasar la solución en un recipiente de plástico, para así evitar la reacción del NaOH con el recipiente de vidrio.
3.4.2 Estandarización de la solución de Hidróxido de sodio (NaOH): Desecar una cantidad de biftalato de potasio (patrón primario) durante 2 horas a 110 º C, y dejar reposar por 15 minutos en el desecador. Pesar en la balanza analítica alrededor de 0,2500 g de KHP (anotando el valor de la pesada con cuatro cifras decimales). Posteriormente disolver en 25 mL de agua destilada, agitar vigorosamente durante unos minutos y transferir la solución a un Erlenmeyer de 250 mL, adicionando 3 gotas de indicador de fenolftaleína. Preparar tres soluciones de biftalato y estandarizar la solución de NaOH, reportando el volumen de base consumida en la estandarización. Calcular la concentración del NaOH.
3.4.3 Calibración del medidor de pH: Para la calibración del equipo se realizan los siguientes pasos:
Encender el equipo. Lavar los electrodos con agua destilada y secarlos. Colocar debajo de los electrodos en un vaso de precipitado la solución buffer de pH 7,00. Introducir los electrodos en la solución. Verificar que el botón de temperatura del equipo se encuentre a 25 ° C. Colocar el medidor de pH en la posición de leer [pH]. Calibrar el pH al valor de 7,00. Repetir el mismo procedimiento con la solución buffer de pH 4,00 Sacar los electrodos del vaso, y fijarlos en una posición que permita quitar fácilmente el vaso con la solución buffer. 30
3.4.4 Determinación: Tomar una alícuota de 50,00 mL de la muestra problema (vinagre), en un vaso de precipitado de 500 mL y añadir 2 o 3 gotas de indicador de fenolftaleína (no es necesario, solo se adiciona para ir viendo los cambios), luego se coloca la solución sobre el agitador magnético. Instalar una bureta de tal manera que se pueda agregar la solución de NaOH sin que se produzcan salpicaduras; introducir los electrodos del medidor de pH en la solución que se va a valorar, luego procedemos a colocar en marcha el motor del agitador, colocar el botón del equipo en la posición para leer pH; Leer y anotar el pH inicial. Medir y anotar el pH después de cada adición de NaOH 0,1 M. Al principio, agregar volúmenes grandes de esta solución (de 1 a 5,00 mL), no agregar más reactivo hasta que el pH se mantenga constante durante unos 30 segundos. En ocasiones el motor del agitador da lugar a lecturas erróneas de pH, es aconsejable detener el motor durante la toma de cada lectura. Disminuir el volumen de NaOH que se agrega a la muestra, según vaya aumentando el valor de pH/mL, que se calcula para cada adición. En la proximidad del punto de equivalencia, agregar NaOH en incrementos de 0,1 mL. Continuar la valoración hasta 5 mL después del punto de equivalencia, aumentando los volúmenes aditivos a medida que el pH/mL vuelva a disminuir.
3.5 CUESTIONARIO 1. Representar las siguientes graficas de los resultados potenciométricos:
pH vs. V en mL de NaOH agregado. Δ pH / ΔV vs. V promedio de NaOH agregado. Δ pH2 / ΔV2 vs. V en mL de NaOH agregado.
2. Calcular el porcentaje de ácido acético [% Ácido acético (p/v)] de la muestra problema. 3. ¿Cuál es la importancia del ácido acético en la Industria Química? 4.
¿Cuáles son los requisitos sanitarios que deben cumplir las fábricas que comercialicen vinagre para consumo humano?
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3.7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG Douglas A., WEST D. M., HOLLER James, CROUCH Stanley R. “Fundamentos de Química Analítica”. 8a ed. Editorial Reverté, 1997.
HOBART Willard H., MERRITT Lynne L., DEAN John A. “Métodos Instrumentales de Análisis”. 4a ed. Editorial Continental S.A., 1972.
WALTON Harold F., REYES Jorge. “Análisis Químico e Instrumental Moderno”. Capítulo 1, Potenciometría. El Medidor de pH. 1a ed. Editorial Reverté, S.A., España, 1983.
Ministerio de la Protección social, resolución N° 0775 del 3 de marzo del año 2008, “por la cual se establece el reglamento técnico sobre los requisitos sanitarios que deben cumplir las fábricas que procesen, envasen, transporten, expendan, almacenen, importen, exporten y comercialicen vinagre para consumo humano”. [Pdf en línea] disponible en URL: http://www.puntofocal.gov.ar/notific _otros_miembros/col87a1_t.pdf.
Wikipedia: La Enciclopedia Libre. Artículo, Ácido acético, composición y producción. [En línea], Wikipedia Foundation, Inc. Última modificación: 17 octubre de 2011, a las 10:13. [citada 20 octubre 2011], disponible en .
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PRÁCTICA N° 4 DETERMINACIÓN DE ALCOHOL ETÍLICO POR REFRACTOMETRÍA
4.1 OBJETIVOS
Determinar la concentración de etanol por refractometría. Construir la gráfica del índice de refracción vs concentración para el sistema de alcohol-agua. Cuantificar el alcohol etílico presente en un licor comercial. Conocer la importancia del etanol en la industria química. Desarrollar habilidades en el manejo del refractómetro.
4.2 MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES Y EQUIPOS
REACTIVOS
Balones aforados de 50,0 mL Pipeta aforada de 1,0 mL y 10 mL Pipeta aforada de 20,0 mL Pipeta graduada de 10 mL Pera de succión Gotero Refractómetro
Alcohol etílico puro 20 mL de licor comercial sin color Licor incoloro: vodka, aguardiente
4.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS El fenómeno de la refracción está basado en el cambio de velocidad que experimenta la radiación electromagnética al pasar de un medio a otro, como consecuencia de su interacción con los átomos y moléculas del otro medio. Dicho cambio de velocidad se manifiesta en una variación en la dirección de propagación. La medida relativa de la variación entre dos medios tomando uno fijo como referencia se le conoce como índice de refracción (n) y en general esta expresado con respecto al aire.
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El índice de refracción está relacionado con el número, la carga y la masa de las partículas vibrantes de la sustancia a través de la cual se transmite la radiación. Así, se ha comprobado que para grupos de compuestos análogos el índice de refracción varia con la densidad y el peso molecular de la muestra. En consecuencia, el índice de refracción, al igual que el punto de fusión, ebullición y la densidad, se puede utilizar para la caracterización e identificación de especies líquidas. En muchos casos, el índice de refracción de las mezclas binarias varía linealmente con la composición de las mismas, aunque siempre será conveniente comprobar esta aditividad mediante la construcción de curvas de calibración. Para mezclas más complejas, es necesario acudir previamente a separaciones en fracciones simples o binarias, antes de realizar las mediciones. El instrumento para medir el índice de refracción (n), es básicamente un sistema óptico que busca medir el ángulo que se ha desviado la radiación, utilizando para ello dos prismas: uno fijo de iluminación sobre el cual se deposita la muestra y uno móvil de refracción. Los prismas están rodeados de una corriente de agua termostatizada, ya que la temperatura es una de las variables que afecta a la medida. Cuando la radiación electromagnética atraviesa un límite entre dos medios, cambia su velocidad de propagación. Si la radiación incidente no es perpendicular al límite, también cambia su dirección. El cociente entre la velocidad de propagación en el espacio libre (vacío) y la velocidad de propagación dentro de un medio se llama índice de refracción del medio. El principio de funcionamiento de un refractómetro se basa en la velocidad de la luz que depende del medio en el que viaja. Si un rayo de luz atraviesa sesgadamente desde un medio hacía otro de diferente densidad, cambia su dirección cuando traspasa la superficie. Este cambio en la dirección se denomina refracción; por lo tanto, cuando la luz atraviesa hacía un medio más denso, el haz se aproximará a la perpendicularidad trazada sobre la superficie divisoria en el punto de incidencia. Este fenómeno se debe fundamentalmente a que la velocidad de la luz cambia; Es decir, se hace más lenta cuanto más denso sea el medio que traspasa.
Figura 5. Principio de refracción, incidencia de un haz de luz.
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Se denomina ángulo de incidencia (i) al ángulo formado entre el rayo en el primer medio y la perpendicular, mientras que el correspondiente ángulo en el segundo medio se denomina ángulo de refracción (r). Existen diversas leyes, que son capaces de determinar el índice de refracción de diversas sustancias, como se mencionó anteriormente la velocidad de la luz depende del medio que atraviesa; la relación de velocidades de la luz en el vacío y en cualquier otra sustancia se conoce como índice de refracción absoluto. Sin embargo, para fines prácticos esta relación se sustituye por:
Dónde: n = Índice de refracción a una longitud de onda ( ) determinada.
V aire = Velocidad de la luz en el aire V M = Velocidad de la luz en un medio M. La ley de Snell plantea también que es posible demostrar que el índice de refracción podría determinarse en función de la siguiente relación:
Dónde: n = Índice de refracción a una longitud de onda ( ) determinada.
(i) aire = Ángulo de incidencia de la luz en el aire. (r) M = Ángulo de refracción de la luz en un medio M. El refractómetro corresponde al grupo de los que miden el ángulo crítico (ó límite), como medio para la determinación del índice de refracción. Estando calibrado a 20 °C y utilizando luz blanca para su iluminación, nos da directamente el índice de refracción para la línea D del sodio ( = 5.893 A).
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La determinación del índice de refracción (una propiedad física fundamental de cualquier sustancia) se usa, por ejemplo para, conocer la composición o pureza de una muestra, a través de un instrumento llamado refractómetro. Por esto, el uso de los refractómetros ha cobrado gran interés en el área de la fabricación de bebidas alcohólicas y un claro ejemplo está relacionado a la elaboración de vinos. La presencia de azucares es uno de los parámetros fundamentales de la enología [Arte de producir vino], debido a que esta familia de compuestos interviene prácticamente en todo el proceso de elaboración que conduce desde el cultivo de la uva hasta la producción del vino, determinando la calidad del producto final.
4.4 PROCEDIMIENTO
4.4.1 Preparación de los patrones de alcohol etílico: A partir de alcohol etílico puro y agua destilada, preparar una serie de soluciones tipo con las siguientes concentraciones (porcentaje en volumen % V/V): 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 %. Preparar 50,00 mL de cada solución en balones aforados de 50,00 mL.
4.4.2 Determinación: Agitar cada solución preparada para homogenizar y con la ayuda del gotero tomar una muestra para llevar al refractómetro. Determinar el índice de refracción de cada solución y registrar los valores en una tabla. Realizar la gráfica entre el índice de refracción vs concentración de alcohol etílico (% de etanol).
Medir el índice de refracción de la muestra problema (licor preferiblemente incoloro), y con la ayuda de la gráfica determinar la concentración alcohólica del licor. Nota: Para que el método sea aplicable a todos los licores debe realizarse una destilación previa de la muestra.
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4.5 CUESTIONARIO 1. Determinar el índice de refracción de cada solución de alcohol etílico y de la muestra problema. 2. Graficar los valores del índice de refracción vs Concentración de alcohol etílico (% de etanol). ¿Cuál es el porcentaje de etanol presente en el licor? 3. ¿Aparte del índice de refracción qué otros parámetros se pueden medir con el refractómetro? 4. ¿Cuál es la importancia de la determinación del % de alcohol etílico en la Industria de las bebidas alcohólicas? 5. ¿Cuáles son las aplicaciones del etanol en la Industria Química?
6. ¿Consulta el diagrama de flujo para la obtención del alcohol etílico? 4.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001.
PICKERING William F. Química analítica moderna”. 2a ed. Editorial Reverté S.A, 1980.
MILLÁN Sagrario María, ESCOFET Jaume, PÉREZ Elisabeth. Geométrica”. Capítulo 14, 1a ed. Editorial Ariel S.A., 2003.
HAVEN Mary, TETRAULT Gregory, SCHENKEN Jeral. “Laboratory Instrumentation”. Fourth Edition, Capítulo 5, Refractometry, Canadá 1995.
Wikipedia: La Enciclopedia Libre. Artículo Etanol, síntesis y aplicaciones. [En línea], Wikipedia Foundation, Inc. Última modificación: 10 de noviembre de 2011, a las 22:37. [citada 29 octubre 2011], disponible en
“
“Óptica
http://es.wikipedia.org/wiki/Etanol >.
Diagrama proceso de obtención de etanol, CENICAÑA 2008, disponible en
PRÁCTICA N° 5 POLARIMETRÍA (ROTACIÓN ESPECÍFICA DE SUSTANCIAS ÓPTICAMENTE ACTIVAS)
5.1 OBJETIVOS
Identificar los componentes del polarímetro, equipo utilizado para detectar la rotación especifica de sustancias ópticamente activas. Adquirir destreza en la calibración del polarímetro, para la posterior eficacia en la toma de lecturas. Determinar el valor de la rotación especifica de sustancias ópticamente activas. Estudiar el efecto que tienen ciertas sustancias sobre la luz polarizada.
5.2 MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES
REACTIVOS
Polarímetro POLAX-2L Balón aforado de 100,0 mL Vaso de precipitado de 500 mL Espátula Balanza analítica Papel absorbente
Soluciones de glucosa al 10 % (g/mL). Solución de sacarosa y maltosa (g/mL). Agua destilada
5.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS La polarimetría, en su acepción más amplia, comprende todas las investigaciones de los fenómenos ópticos en que interviene la luz polarizada. Para los fines de este estudio el tema se limita a la medida de la rotación del plano de polarización de la luz cuando esta atraviesa una capa de una sustancia ópticamente activa. La estereoquímica, es el estudio de la estructura tridimensional de las moléculas. El descubrimiento de la etereoisomería fue uno de los hitos más importantes de la teoría estructural de la química orgánica.
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Se podría definir a los estereoisomeros, como aquellos que difieren sólo en la orientación espacial de sus átomos, manteniéndose unidos entre sí. Existen dos tipos principales de isomería: la isomería geométrica o cis - trans, que se produce cuando la rotación de un carbono respecto a otro se encuentra impedida por la presencia de un enlace doble o en estructuras cíclicas, y la isomería óptica. Los isómeros ópticos, tienen las mismas propiedades químicas y físicas, excepto en la dirección en que hacen rotar el plano de una luz polarizada. El valor de la rotación específica es el mismo, pero en sentido opuesto; estos compuestos se llaman enantiómeros. Para que un compuesto sea ópticamente activo, sus moléculas deben ser quirales (quiros = manos), es decir que una molécula y su imagen especular no deben ser superponibles, además tampoco deben tener un elemento de simetría (plano de simetría). El instrumento utilizado para medir la rotación específica de las sustancias ópticamente activas es el polarímetro. El polarímetro consta básicamente de dos elementos polarizantes, uno de los cuales es fijo y el otro gira montado en una escala graduada que permite medir su orientación respecto al primero; la luz monocromática de la lámpara de sodio esta paralela al eje del aparato a través de un colimador y es polarizada por un prisma de Nícol. Existe un prisma auxiliar dispuesto de tal forma que intercepta la mitad del rayo de luz. La radiación pasa después a través de la muestra contenida en un tubo de vidrio de 20 cm de longitud; posteriormente atraviesa el otro prisma de Nícol (analizador) y va al ocular. El primer auxiliar divide el campo en dos porciones semicirculares iguales, la posición de equilibrio se alcanza girando la escala; entonces una mitad reduce su intensidad luminosa y la otra la aumenta hasta que se consigue que las dos mitades tengan la misma intensidad de luz. Al introducir una sustancia ópticamente activa entre los dos prismas de Nícol (polarizador y analizador) se deshace el equilibrio y es necesario mover la escala para restablecerlo. El movimiento de la escala nos da una medida directa de la actividad óptica de la sustancia. Para eliminar posibles errores, es preferible hacer primero una medida con el tubo lleno de disolvente (agua, en el caso de disoluciones acuosas). Es preciso asegurarse de que no haya burbujas de aire en el tubo del polarímetro estas burbujas significarían interferencias en el paso del haz de luz, y por tal razón una medida errónea. Para obtener medidas exactas es preciso tener cuidado en llenar el tubo y asegurarse de que no hay filtraciones de luz por ninguna rendija. Las dos tapas del tubo deben estar cuidadosamente limpias y secas. Antes de realizar medida alguna deberá mantenerse encendida la lámpara de vapor de sodio durante 10 a 15 minutos para que, una vez caliente, de su luz característica.
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5.4 PROCEDIMIENTO
5.4.1 Calibración del Polarímetro “POLAX-2L”: Para comenzar a desarrollar la práctica es esencial la calibración del equipo, debido a la importancia de los resultados que se desean obtener, para lo cual se procede de la siguiente manera:
Encender el Polarímetro POLAX-2L, para el cual se enchufa a un toma de corriente de 110 V y se acciona el botón que se encuentra al lado del cable ubicado en la parte posterior del equipo. Tomar el tubo polarimétrico de 200 mm el cual es el indicado para los líquidos claros, llenarlo con agua destilada hasta rebosar y deslizar el lente de vidrio que trae la tapa del tubo de manera horizontal evitando que queden burbujas de aire dentro del tubo y finalmente colocar la tapa del tubo polarimétrico. Abrir la cubierta del polarímetro y colocar el tubo polarimétrico en el porta tubo del equipo. Cerrar la cubierta del polarímetro. Descripción del teclado: a) La tecla R de color azul indica el primer campo. b) La tecla L de color azul indica el segundo campo. c) La tecla de color rojo indica la velocidad para ubicar cualquiera de los dos campos. Proceder a buscar los campos a través de las teclas anteriormente descritas teniendo en cuenta que la tecla roja debe mantenerse oprimida al mismo tiempo en que se manejan ya sean la tecla R o L para una mayor velocidad, visualizándolos de la siguiente forma:
Rotación Derecha (Primer Campo).
Rotación Izquierda (Segundo Campo).
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Después de ubicar el primer y segundo campo se procede a ubicar el tercer campo devolviéndose con una leve rotación de tal manera que quede ubicado en la mitad de R yL
Después de ubicar el tercer campo, oprimir inmediatamente la tecla ZERO. En la pantalla del polarímetro debe aparecer la lectura 0,00 indicando que el equipo ya se encuentra calibrado.
Nota: Después de calibrar el equipo es indispensable retirar el tubo polarimétrico, desocuparlo y lavarlo con agua destilada para continuar con el análisis de la muestra.
5.4.2 Determinación de la rotación específica:
Colocar en el tubo polarimétrico una solución de glucosa al 10 % (g/mL); deslizar el lente de vidrio que trae la tapa del tubo de manera horizontal evitando que queden burbujas de aire dentro del tubo y finalmente cerrar el tubo polarimétrico. Nota: La presencia de burbujas de aire en el tubo polarimétrico ocasionan interferencias. Abrir la cubierta del polarímetro y colocar el tubo polarimétrico en el porta tubo del equipo. Cerrar la cubierta del polarímetro. Ubicar los campos polarimétricos, utilizando las teclas R y L manteniendo la tecla roja oprimida para una mayor velocidad de ubicación.
Campo uno
Campo dos
Después de ubicar el primer y segundo campo se procede a ubicar el tercer campo devolviéndose con una leve rotación. En este campo se identifica si la muestra es dextrógira o levógira, dependiendo de la tecla que se haya utilizado para ubicar este campo: si utilizó la tecla R la sustancia es dextrógira, si utilizó la tecla L la sustancia es levógira.
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Determinar la rotación específica de la solución de glucosa al 10 %. Retirar el tubo polarimétrico con la solución de glucosa y lavar con abundante agua destilada, purgar el tubo con la próxima muestra que se desea analizar. Repetir el procedimiento para determinar la rotación específica de la solución de sacarosa y maltosa (soluciones problema). Nota: Las soluciones problema serán entregadas por el asistente de laboratorio.
5.4.3 CÁLCULOS:
5.5 CUESTIONARIO
1. ¿En qué consiste la polarimetría? 2. ¿Qué se entiende por una sustancia ópticamente activa? 3. ¿A qué se le llama sustancias dextrógiras y a cuáles levógiras? 4. ¿Qué es un sacarímetro? 5. Una solución de 2 g de (+) - gliceraldehido HOCH2-CHOH-CHO en 10 mL de agua, se coloca en un tubo polarimétrico de 100 mm, con el polarímetro se encontró una rotación de (+) 1,74 a 25°C. ¿Calcular la rotación especifica del (+) – gliceraldehido?
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6. Una solución de 0,5 gramos de (-) epinefrina disueltos en 10 mL de HCL diluido se colocó en un tubo polarimétrico de 20 cm. Con el polarímetro, se encontró que la rotación era de - 5,0° a 25°C. ¿Calcular la rotación especifica de la epinefrina?
5.7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
HOBART Willard H., MERRITT Lynne L., DEAN John A. Instrumentales de Análisis”. 4a ed. Editorial Continental S.A., 1972.
“Métodos
PICKERING William F. Química analítica moderna”. 2a ed. Editorial Reverté S.A, 1980.
ORIA Solano E., PARDO Pérez E., ALONSO Tomás F. “Prácticas de Laboratorio de Química Orgánica”. Práctica # 7 Polarimetría, Universidad de Murcia, Secretariado de publicaciones e intercambio científico 1991.
WADE L. G. “Química Orgánica”. 5a ed. Editorial Pearson Prentice Hall., Capítulo 5, Actividad Óptica. Madrid, 2004.
“
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PRÁCTICA N° 6 DETERMINACIÓN DE HIERRO (Fe), POR EL MÉTODO COLORIMÉTRICO DE LA FENANTROLINA
6.1 OBJETIVOS
Conocer los términos y conceptos sobre la absorción de radiación en la región visible del espectro electromagnético. Aplicar la Ley de Beer en el análisis de muestras de concentración desconocidas. Adquirir destrezas en el manejo del espectrofotómetro UV/Visible. Determinar la cantidad de hierro total presente en una muestra de agua por el método colorimétrico de la fenantrolina.
6.2 MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES
REACTIVOS
7 Balones aforados de 100,0 mL Balones aforados de 50, 250,0 y 500,0 mL Probeta de 250 mL Vaso de precipitado 250 y 500 mL Pipetas aforadas de 5, 10 y 25,0 mL Pipeta graduada de 10 mL Frasco lavador Pera de succión Espectrofotómetro UV/Visible
Solución estándar de hierro 10 ppm Solución acuosa de clorhidrato de hidroxilamina al 10 % P/V Solución acuosa de 1,10fenantrolina al 0,10 % P/V Solución acuosa de acetato de sodio 1,20 M
6.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS Cuando un haz de radiación electromagnética pasa a través de una muestra (solida, liquida o gaseosa), ciertas frecuencias pueden eliminarse selectivamente por absorción. La absorción es un proceso en el que la energía electromagnética, se transfiere a los átomos, iones o moléculas que componen la muestra. La absorción provoca que estas partículas pasen de su estado normal a la temperatura ambiente (estado fundamental), a uno o más estados excitados de energía superior.
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La espectroscopia de absorción molecular UV/Visible comprende la absorción de la radiación entre 160 nm a 780 nm (aproximadamente). La espectroscopia de absorción molecular se basa en la medida de la transmitancia (T), o de la Absorbancia (A), de disoluciones que se encuentran en cubetas transparentes que tienen un camino óptico de b cm. Normalmente la concentración (C) de un analito absorbente está relacionada linealmente con la absorbancia. En solución, el hierro se encuentra como Fe+3 por lo tanto es reducido al estado ferroso (Fe+2) con hidroxilamina, en medio ácido y luego se trata con 1,10 – fenantrolina (C12H8 N2) a pH de 3,2 a 3,3 (mantenido así por el acetato de sodio). Tres moléculas de 1,10 – fenantrolina acomplejan cada ion ferroso para formar un complejo rojo-naranjado.
Para asegurarse de que todo el hierro presente en la muestra se encuentra en forma de Fe+2 se añade, antes de la formación del complejo, un agente reductor como es el clorhidrato de hidroxilamina, el cual reduce el Fe+3 a Fe+2 según la reacción:
Fe+3 + 2NH2OH ---------------- Fe+2 + N2O + H+ + H2O Fe+2 + 3FenH+
================
Fe (Fen)3+2 + 3H+
La solución coloreada cumple con la ley de Beer; su intensidad es independiente del pH desde 3,00 a 9,00; un pH entre 2,90 y 3,50 asegura el rápido desarrollo del color en presencia de un exceso de fanantrolina y evita la formación de sales de hierro, por ejemplo, de fosfatos. El análisis de hierro por éste método se puede llevar a cabo con un espectrofotómetro ajustado a 508 nm, que es la longitud de onda máxima a la que absorbe el complejo coloreado.
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6.4 PROCEDIMIENTO 6.4.1 Preparación de las Soluciones: a) Solución estándar de hierro 0,01 mg/mL (10 ppm) b) Solución acuosa de clorhidrato de hidroxilamina al 10 % P/V, disolver 5,000 gramos de H2 NOH-HCL en 50,0 mL de agua destilada. c) Solución acuosa de 1,10 – fenantrolina al 0,10 % P/V, disolver 0,5000 gramos de monohidrato de 1,10 – fenantrolina en 500,0 mL de agua destilada. Calentar ligeramente si es necesario. Cada mL es suficiente para no más de 0,90 mg de Fe. No preparar más reactivo que el necesario; se oscurece por reposo y debe desecharse. d) Solución acuosa de acetato de sodio 1,200 M, disolver 41,50 gramos de CH3COONa.3H2O en 250,0 mL de agua destilada.
6.4.2 Preparación de patrones: Preparar las soluciones patrón para la calibración de Fe+2, de 0 (blanco), 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 ppm a partir de la solución estándar de Fe 10 ppm. Teniendo en cuenta las indicaciones de la Tabla 2:
Tabla 2. Preparación de los patrones de Fe+2 para el análisis. No. Patrón 0 1 2 3 4 5
V solución V solución V sln. V solución patrón hidroxilamina acetato de 1,10(mL) (mL) sodio (mL) fenantrolina (mL) 0,0 1,0 10,0 10,0 5,0 1,0 10,0 10,0 10,0 1,0 10,0 10,0 15,0 1,0 10,0 10,0 20,0 1,0 10,0 10,0 25,0 1,0 10,0 10,0
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Vol. final (mL)
Concentración final (ppm)
100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
6.4.3 Determinación: A cada balón aforado de 100,0 mL se transfiere en su orden el volumen de solución patrón de hierro (en el del blanco se adiciona agua destilada) ver tabla 8. Luego la hidroxilamina (reductor), seguido por el acetato de sodio y finalmente la 1,10 – fenantrolina, se deja que las mezclas reposen durante 15 minutos, luego se aforan con agua destilada y se mezclan bien. Para preparar la muestra problema, se transfieren 10 mL del problema (o el volumen que sea necesario para que la muestra esté en el intervalo de concentraciones de la curva de calibración) a un balón aforado de 100,0 mL y se trata en la misma forma que los patrones de calibración. Nota: Al reportar la concentración de la muestra problema se tiene que tener en cuenta el factor de dilución aplicado. Cuando se tengan preparadas las muestras se realizan las siguientes mediciones:
Realizar un barrido espectral entre 400 – 750 nm sobre una de las soluciones patrón, para obtener el espectro de absorción y determinar la longitud de onda ( ) de máxima absorción ( máxima).
Fijar la máxima en el equipo y cuadrar el cero de absorbancia con el blanco.
Medir la absorbancia de los patrones a la máxima y hacer una curva de calibración entre ABS vs concentración. Verificar la regresión lineal de los datos (r ≥ 0,999) y asegurarse que el intervalo lineal esté conformado por cinco patrones.
Medir la absorbancia de la muestra problema a la máxima y verificar que está en el intervalo lineal de la curva de calibración. Si no lo está, hacer las diluciones necesarias y los cálculos respectivos.
Determinar la concentración de hierro en la muestra problema y reportarla en ppm.
Nota: Cada vez que se va a hacer una medición, la celda que contiene la muestra se debe purgar con cada solución, con al menos tres porciones de la solución que va a contener.
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6.5 CUESTIONARIO 1. Realizar la curva de calibración entre ABS vs concentración de los patrones. 2. Determinar el valor de la absortividad y la absortividad molar de la muestra problema. 3. Una solución cuya concentración es 5,0x10-4 M en un analito X, se introduce en una celda de muestra cuya longitud de paso es de 1 cm, cuando se mide a una = 490 nm, la absorbancia fue de A= 0,388, Cuál es la absortividad molar. Si la misma solución se mide a = 520 nm y su absorbancia es de A= 0,495. ¿Cuál es la absortividad molar (Ɛ)?
6.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001.
RUBINSON Kenneth A., RUBINSON Judith F. “Análisis Instrumental”. Editorial Prentice Hall, 2000.
PÉREZ Pino F., PÉREZ D. Bendito. “Análisis de elementos-traza por espectrofotometría de absorción molecular UV/Visible”. Capítulo 6 Espectrofotometría UV/Visible, Instrumentación, publicaciones de la Universidad de Sevilla.
SMITH Brian C. “Quantitative Spectroscopy, Theory and practice”. Unit 1, Fundamentals of Molecular Absorption Spectroscopy. Elsevier Science USA Academic Press, 2002.
KENKEL John, “Analytical Chemistry for Technicians, Visible and Ultraviolet Spectroscopy”. Lewis Publishers US, 1994.
Artículo en Pdf. ”Basic UV-Vis Theory, Concepts and Applications”, Thermo Spectronic. [En línea], Citada (25 junio de 2012), disponible en
PRÁCTICA N° 7 DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE FÓSFORO DISPONIBLE EN SUELOS AGRÍCOLAS
7.1 OBJETIVOS
Diferenciar los requerimientos esenciales de los diferentes tipos de suelos agrícolas (monte, césped y jardín). Comprender los rangos de pH estipulados, para cada tipo de suelo. Identificar que elementos químicos (nutrientes), son importantes para el crecimiento vegetal en los suelos agrícolas. Determinar la cantidad de fósforo disponible en una muestra de suelo agrícola por el método espectrofotométrico.
7.2 MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES
REACTIVOS
6 Balones aforados de 50,0 mL 2 Balones aforados de 100,0 mL Balón aforado de 1 litro, varilla agitadora Vaso de precipitado de 100 mL Pipetas aforadas de 1, 5, 25,0 mL Pipeta graduada de 10, 25 mL Frasco lavador, pera de succión Medidor de pH Espectrofotómetro UV/Visible.
HCL 1,000 M Solución estándar de fosforo (50 ppm) Solución extractora Solución coloreadora
7.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS El suelo es un sistema muy complejo que sirve como soporte de las plantas, además de servir de despensa de agua y de otros elementos necesarios para el desarrollo de los vegetales.
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El suelo es conocido como un ente vivo en el que habitan gran cantidad de seres vivos como pequeños animales, insectos, microrganismos (hongos y bacterias) que influyen en la vida y desarrollo de las plantas de una forma u otra. Las propiedades físicas de un suelo dependen fundamentalmente de su textura y de su estructura. La importancia de estas propiedades es muy grande, ya que de ellas depende el comportamiento del aire y del agua en el suelo, y por lo tanto condicionan los fenómenos de aireación y permeabilidad. Las propiedades físicas son más difíciles de corregir que las propiedades químicas. La composición química del suelo incluye la medida de (pH) y de los elementos químicos presentes en el suelo (nutrientes). Su análisis es necesario para mejorar la productividad del cultivo, además de elegir las plantas más adecuadas para obtener los mejores rendimientos de cosecha.
La medición del pH, permite referenciar el grado de acidez o basicidad que presenta el suelo y generalmente se expresa por medio de un valor de pH del sistema suelo-agua. Según este valor un suelo puede presentar acidez, neutralización o alcalinidad, por medio de estas propiedades se puede condicionar el suelo para el uso agronómico. En los suelos agrícolas la mayoría de las plantas prefieren rangos de pH de 5,5 a 7,5 pero algunas especies prefieren suelos ácidos o alcalinos. Sin embargo, cada planta necesita un rango específico de pH, en el que pueda expresar mejor su potencialidad de crecimiento.
El fósforo es un elemento de gran importancia para la planta ya que forma parte en la composición de ácidos nucleicos, así como las sustancias de reserva en semillas y bulbos. Contribuyen a la formación de yemas, raíces y a la floración. Una falta de fósforo provoca un ahogo de la planta, crecimiento lento, una reducción de la producción, frutos más pequeños y una menor expansión de las raíces. Por tanto el correcto desarrollo de una planta o cultivo dependerá del contenido nutricional de este elemento en el suelo.
Para determinar el fósforo disponible se utiliza la solución extractora, la cual remueve las distintas formas de fósforo presentes en la muestra (fosfatos de calcio, hierro y aluminio). Los iones fosfatos al reaccionar con una solución acida que contiene iones molibdato y antimonio forman una molécula compleja acida de fosfato-molibdato-antimonio, que en presencia de ácido ascórbico se reduce y desarrolla un color azul de intensidad proporcional a la concentración de iones fosfato.
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7.4 PROCEDIMIENTO 7.4.1 Preparación de soluciones a) Solución estándar de fósforo 0,05 mg/mL (50 ppm) b) Solución extractora: Disolver en 100,0 mL de agua destilada 1,111 gramos de fluoruro de amonio, añadir 25,0 mL de HCL 1,000 M previamente estandarizado, transferir la solución a un balón de 1 litro y llevar hasta aforo con agua destilada mezclar la solución y etiquetar bien. El pH de la solución debe ser de 2,6. Los ajustes de pH se realizan utilizando HCL. c) Solución coloreadora: Agregar 2,50 mL de la solución A y llevar a un balón de 100,0 mL con 25,0 mL de agua destilada. Posteriormente añadir 1,0 mL de la solución B y llevar hasta aforo con agua destilada. -
Solución A: Pesar 0,430 gramos de molibdato de amonio y agregar en un balón de 100,0 mL, con 50,0 mL de agua destilada, posteriormente se agregó 0,010 gramos de tartrato de antimonio y potasio, y adicionar 4,80 mL de ácido sulfúrico, aforar con agua destilada.
-
Solución B: Pesar 0,100 gramos de ácido ascórbico en 50,0 mL de agua destilada y adicionar 25,0 mL de la solución A, posteriormente se llevó hasta aforo con agua destilada en un balón de 100,0 mL.
7.4.2 Preparación de la muestra Tomar una muestra de suelo agrícola (Jardín, Monte o Césped), tamizar la muestra para eliminar interferencias y dejar reposar por 10 minutos.
7.4.3 Determinación de pH en Suelos Agrícolas Para determinar el pH del suelo, se pesan 25,00 gramos de suelo (seco y preparado) en un vaso de precipitado de 100 mL, luego adicionar 25,0 mL de agua destilada y agitar con la ayuda de la varilla, aproximadamente cada 15 minutos durante una ½ hora. Para la calibración del equipo se realizan los siguientes pasos:
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Encender el equipo. Lavar los electrodos con agua destilada y secarlos. Colocar debajo de los electrodos en un vaso de precipitado la solución buffer de pH 7,00. Introducir los electrodos en la solución. Verificar que el botón de temperatura del equipo se encuentre a 25 ° C. Colocar el medidor de pH en la posición de leer [pH]. Calibrar el pH al valor de 7,00. Repetir el mismo procedimiento con la solución buffer de pH 4,00
Al paso de ½ hora de preparada la solución (suelo-agua) y de haber calibrado el medidor de pH, leer el pH de la muestra y reportar los datos para realizar las diferentes conclusiones.
7.4.4 Determinación de Fósforo Disponible en Suelos Agrícolas Para determinar el fósforo disponible en suelos agrícolas se utiliza el método de Bray y Kurtz, la muestra se debe preparar así:
Pesar 1,425 gramos de suelo seco y transferir a un tubo de ensayo. Adicionar lentamente 10,0 mL de solución extractora y agitar vigorosamente durante 1 minuto. Filtrar la suspensión inmediatamente y recibir el filtrado en un frasco de plástico de 50,0 mL (el frasco de plástico evita interferencias). Se deja reposar el filtrado por 10 minutos. Extraer con una micropipeta 1,0 mL del filtrado y transferirlo a un balón aforado de 50,0 mL, Añadir 9,0 mL de solución coloreadora y llevar hasta aforo con agua destilada, dejar reposar por 15 minutos. Determinar la absorbancia a la máxima.
7.4.4.1 Medida de la Absorbancia Preparar los patrones de fósforo a partir de la solución estándar de 50 ppm, siguiendo las indicaciones de la Tabla 3:
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Tabla 3. Preparación de patrones para el análisis de fósforo en suelos agrícolas. N° V estándar de P Patrón 50 ppm (mL) 1 0 (blanco) 2 5 3 10 4 15 5 20 6 25
V solución extractora 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
V solución coloreadora 9,0 mL 9,0 mL 9,0 mL 9,0 mL 9,0 mL 9,0 mL
Volumen final (mL) 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0
Concentración (ppm) 0 5 10 15 20 25
Cuando se tienen preparados los patrones y la muestra de suelo se realizan las siguientes mediciones:
Realizar un barrido espectral entre 400 – 750 nm sobre el patrón de 10 ppm, para obtener el espectro de absorción y determinar la longitud de onda de máxima absorción ( máxima).
Fijar la máxima en el equipo y cuadrar el cero de absorbancia con el blanco. Introducir la muestra en las dos celdas y oprimir Auto Zero
Medir la absorbancia de los patrones a la máxima y realizar la curva de calibración entre ABS vs concentración. Verificar la regresión lineal de los datos (r ≥ 0,999) y asegurarse que el intervalo lineal esté conformado por seis patrones.
Medir la absorbancia de la muestra problema a la máxima y verificar que se encuentre en el intervalo lineal de la curva de calibración. Si no lo está, realizar las diluciones necesarias y los cálculos respectivos.
Nota: Cada vez que se va a hacer una medición, la celda que contiene la muestra se debe purgar con cada solución, con al menos tres porciones de la solución que va a contener.
Determinar la concentración de fósforo disponible en la muestra de suelo aplicando la siguiente fórmula:
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ppm de P disponible en suelo = CP x VC x VE AxP Dónde CP = Concentración de P obtenida en la curva de calibración VC = Volumen solución coloreada VE = Volumen del extracto añadido A = Alícuota del extracto P = Peso de la muestra de suelo
7.5 CUESTIONARIO
1. Realizar la curva de calibración entre absorbancia vs concentración de P. 2. Determinar la concentración de fósforo disponible (P) en la muestra de suelo y reportarla en ppm. 3. Teniendo en cuenta los rangos de pH, ¿Qué se debe hacer cuando se tienen suelos ácidos o suelos básicos? 4. ¿Cuáles son las funciones de los principales nutrientes en las plantas y cuáles son los síntomas de deficiencia?
7.7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001.
RUBINSON Kenneth A., RUBINSON Judith F. “Análisis Instrumental”. Editorial Prentice Hall, 2000.
LABRADOR Moreno Juana. “La Materia Orgánica en los Agrosistemas”. 1a ed. Ediciones Mundi-Prensa. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación de Madrid, 1996.
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MARÍN Luisa María, ARAGÓN Pilar, BENITO Gómez Carmen. “Manual de laboratorio”. Editorial Universidad Politécnica de Valencia, 2002.
GARCÍA CANO Adan. “Manual de prácticas de la materia de edafología”. Practica N° 9, Determinación de Fósforo Disponible. Pdf
Artículo en línea. ”Soil and Plant Analysis Laboratory Manual”, Capitulo 5 (Soil Chemical Analysis) [En línea], Citada (3 marzo de 2012), disponible en
Artículo en Pdf. ”Soil Analysis Method 1 (SA 01)”, Pre-treatment of samples. [En línea], Citada (10 marzo de 2012), disponible en
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PRÁCTICA N° 8 ADITIVIDAD DE ABSORBANCIAS, DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA SIMULTÁNEA DE CROMO Y MANGANESO
8.1 OBJETIVOS
Conocer los términos y conceptos sobre la aditividad de absorbancias y la absorción de radiación en la región visible del espectro electromagnético. Aplicar la Ley de Beer, en la determinación de un análisis multicomponente. Adquirir destrezas en el manejo del espectrofotómetro UV/Visible. Identificar los picos de máxima absorción para el Cr y Mn. Determinar la concentración de Cr y Mn en una mezcla de sustancias absorbentes.
8.2 MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES
REACTIVOS
Balones aforados de 100,0 y 500,0 mL Vaso de precipitado de 250, 500 mL Pipetas aforadas de 5, 10 y 25,0 mL Pipeta graduada de 10 mL Espátula, varilla de vidrio Frasco lavador, pera de succión Balanza analítica Espectrofotómetro UV/Visible
H2SO4 [concentrado] Solución de KMnO4 (1 x 10-3 N) Solución de K 2Cr 2O7 (2,5 x 10-3 N) Solución de H2SO4 [1:9] Agua destilada
8.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS Desde hace muchos años se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias químicas; al remplazar el ojo humano por otros detectores de radiación, se puede estudiar la absorción de sustancias, no solamente en el rango del espectro visible, sino también en el rango ultravioleta e infrarrojo del espectro electromagnético. La espectrometría de absorción molecular consiste en la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe n sistema químico en función de la longitud de onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de onda.
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Las medidas espectrométricas se basan en la ley de Lambert-Beer, que es una de las ecuaciones que más se utilizan en los análisis instrumentales, ya que relaciona la absorción de la radiación con la concentración de un compuesto en disolución. La espectroscopia de absorción molecular se basa en la medida de la transmitancia (T), o de la Absorbancia (A), de disoluciones que se encuentran en cubetas transparentes que tienen un camino óptico de b cm. Normalmente la concentración (C) de un analito absorbente está relacionada linealmente con la absorbancia. Es posible analizar varias especies absorbentes presentes en una muestra sin llevar a cabo separaciones previas de cada uno de los analitos, aprovechando que cada sustancia posee características espectrales diferentes. En el análisis simultáneo o multicomponente se aplica el principio de aditividad de las absorbancias o propiedad aditiva de la absorbancia:
En la anterior ecuación, se indica que la absorbancia total medida a una longitud de onda, es igual a la suma de las absorbancias de los componentes individuales y que el aporte de cada componente a la absorbancia total es función del valor del coeficiente de absortividad molar de cada especie absorbente (y de la concentración) para una longitud de onda dada. Es decir, en un sistema con varias especies absorbentes de la misma concentración si se mide la absorbancia a una longitud de onda determinada, la especie que presentara una mayor contribución a la absorbancia total será la que presente mayor valor del coeficiente de absortividad molar (Ɛ). Para una mezcla con ɳ componentes absorbentes es posible establecer la concentración de ellos si se plantean, mínimo ɳ ecuaciones de aditividad para ɳ longitudes de onda. Para el caso de una solución que contiene dos especies absorbentes a y b, se escogerán como mínimo dos longitudes de onda 1 y 2, para la medida de la absorbancia total de la mezcla y se plantearan las ecuaciones:
Nota: La selección de las longitudes de onda deben hacerse de manera que a una de ellas el componente (a), absorba claramente más que el otro, mientras que en la otra longitud de onda ocurra lo contrario.
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Cuando se lleva a cabo un análisis multicomponente o simultáneo se deben tener en cuenta algunas condiciones como:
Los componentes no deben presentar interacciones químicas entre sí ni con el solvente, es decir, las absorbancias deben ser aditivas si cada especie en la mezcla se comporta en forma independiente.
Si los espectros de los componentes tienen una gran similitud, el análisis será más difícil e inexacto.
La selección de las longitudes de onda analíticas óptimas es el parámetro crítico para obtener buenos resultados. Generalmente se escogen longitudes de onda donde un componente presente absorción alta, mientras el otro componente, a dicha longitud de onda, presente una absorción mínima o no presente absorción.
El análisis multicomponente o simultáneo se puede resolver por medio de la determinación de las absortividades molares (Ɛ) de los componentes absorbentes, a las diferentes longitudes de onda y resolviendo el sistema de ecuaciones podemos identificar las concentraciones de los componentes absorbentes contenidos en la muestra problema.
8.4 PROCEDIMIENTO a) Solución patrón de KMnO4 (1 x 10-3 N): Pesar 0,0032 gramos de KMnO4 en un vaso de precipitado, disolver con un poco de agua destilada, transferir a un balón de 100,0 mL y aforar con H2SO4 diluido [1:9]. b) Solución patrón de K 2Cr2O7 (2,998 x 10-3 N): Pesar 0,0147 gramos de K 2Cr 2O7 en un vaso de precipitado, disolver con un poco de agua destilada, transferir a un balón de 100,0 mL y aforar con H2SO4 diluido [1:9]. c) Solución diluida de H2SO4 [1:9]: Transferir 50,0 mL de H2SO4 concentrado a un balón aforado de 500,0 mL que contiene agua destilada y aforar. d) Muestra problema: Será una mezcla de las soluciones a y b, se le entregara a cada grupo al inicio de la práctica por el docente.
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8.4.1 Determinación: Cuando se tengan las soluciones y la muestra problema ya preparadas se deben realizar las siguientes mediciones espectrofotométricas:
Realizar un barrido espectral entre 400 – 750 nm sobre la muestra de KMnO4, utilizando como blanco H2SO4 diluido [1:9], para obtener el espectro de absorción y determinar la longitud de onda de máxima absorción ( máxima KMnO4).
Realizar un barrido espectral entre 400 – 750 nm sobre la muestra de K 2Cr 2O7, utilizando como blanco H2SO4 diluido [1:9], para obtener el espectro de absorción y determinar la longitud de onda de máxima absorción ( máxima K 2Cr 2O7).
Fijar la máxima KMnO4 en el equipo y cuadrar el cero de absorbancia con el blanco (H2SO4 1:9). Para cuadrar el cero de absorbancia se introduce en las dos celdas la solución diluida de H2SO4 y se oprime la opción Auto Zero.
Medir la absorbancia de los patrones de KMnO4 y K 2Cr 2O7 a la máxima del KMnO4 y determinar la absortividades molar (Ɛ) para cada compuesto.
Fijar la máxima K 2Cr 2O7 en el espectrofotómetro y cuadrar el cero de absorbancia con el blanco (H2SO4 diluido 1:9).
Medir la absorbancia de los patrones de KMnO4 y K 2Cr 2O7 a la máxima del K 2Cr 2O7 y determinar la absortividades molar (Ɛ) para cada compuesto.
Medir la absorbancia de la muestra problema a las dos longitudes de onda de máxima absorción ( máxima KMnO4 y máxima K 2Cr 2O7).
Determinar la concentración de Cr y Mn en la muestra problema.
Nota: Cada vez que se va a hacer una medición, la celda que contiene la muestra se debe purgar con cada solución, con al menos tres porciones de la solución que va a contener.
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8.5 CUESTIONARIO
1. Determinar las absortividades molares (Ɛ), de los patrones de KMnO4 y K 2Cr 2O7 a las longitudes de onda de máxima absorción. 2. Determinar la concentración (N), de Cr +3 y Mn+2 en la muestra problema. 3. Se realizó un análisis de aditividad de absorbancias sobre dos complejos químicos que contienen Co y Ni. El análisis arrojo los siguientes datos: Muestra Co Ni
Absortividad molar (Ɛ) a 365 nm Absortividad molar (Ɛ) a 700 nm 3529 L/mol.cm 428,9 L/mol.cm 3228 L/mol.cm 10,2 L/mol.cm
Posteriormente se analizaron dos soluciones a y b, para las cuales se obtuvieron las siguientes absorbancias a las diferentes longitudes de onda de máxima absorción: Solución a b
Absorbancia a 365 nm 0,598 0,902
Absorbancia a 700 nm 0,039 0,072
¿Cuál es la concentración de Co y Ni en cada una de las anteriores soluciones? Nota: para realizar el análisis se utilizaron cubetas de plástico de paso óptico de 1 cm.
4. ¿Qué interferencias se pueden presentar en el desarrollo del análisis por aditividad de absorbancias?
8.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001.
RUBINSON Kenneth A., RUBINSON Judith F. “Análisis Instrumental”. Editorial Prentice Hall, 2000.
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ALONSO Sierra I., QUINTANILLA Damián, RUIZ Santiago, ZARCERO Morante Sonia. “Análisis Instrumental”, Capítulo 2, Ley de Lambert-Beer, Aplicaciones Cuantitativas. Editorial Netbiblo, España, 2010.
VÁZQUEZ Salas Pedro. “Laboratorio de Análisis Instrumental”, Práctica N° 8 Aditividad de la ley de Beer. Morelia, noviembre de 2008.
DINKO Instruments, “Manual de Instrucciones UV- VIS Espectrofotómetro UV 2300 II”. Departamento de Química, UFPS. DINTER S.A. 1a edición 2011.
UNAL, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Dirección Nacional de Servicios Académicos Virtuales. Contenidos en línea, Química Analítica II, Determinaciones Simultáneas o Análisis Multicomponente, disponible en
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PRÁCTICA N° 9 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN UNA BEBIDA ENERGIZANTE, MÉTODO DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN
9.1 OBJETIVOS
Conocer la importancia de la absorción de radiación en la región ultravioleta del espectro electromagnético. Adquirir destreza en el manejo del espectrofotómetro UV/Visible. Aplicar el método de la curva de calibración para determinar la concentración de una muestra desconocida. Determinar la cantidad de cafeína en una bebida energizante.
9.2 MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES
REACTIVOS
6 Balones aforados de 50,00 mL 2 Balones aforados de 250,0 mL Balón aforado de 100,0 mL Vasos de precipitado de 50 , 100 mL Pipetas aforadas de 1, 5, 10,0 mL Pipeta graduada de 10, 25 mL Frasco lavador Pera de succión, varilla agitadora Espectrofotómetro UV/Visible
Solución acuosa de cafeína 100 ppm Bebida Energizante (RED BULL, PEAK, entre otra bebida de gusto del alumno)
9.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS La cafeína es un alcaloide natural que se encuentra en las hojas, semillas o frutos de más de 63 especies de plantas en todo el mundo. La mayor fuente de cafeína y las más comunes son el café, cacao en grano, las nueces y hojas de té.
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Ficha técnica 1,3,7 trimetilxantina Cafeína: sólido Estado: 1,230 g/mL Densidad: Masa Molar: 194,19 g/mol Punto de fusión: 510 K (237 °C) Alrededor del mundo el consumo de productos derivados de estas especies suministra una alta tasa de cafeína, por tal razón se conoce como la droga más común consumida por miles de personas alrededor de todo el mundo. La popularidad de la cafeína se deriva principalmente del hecho que es una sustancia farmacológicamente activa y estimula levemente el sistema nervioso central. En general se acepta que hay poco riesgo de daño si una persona consume menos de 300 mg de cafeína al día o dos. Sin embargo, a veces si se consume cafeína por parte de mujeres en estado de embarazo puede ocasionar ansiedad o estrés, por lo tanto se recomienda reducir el consumo en menos de 200 mg de cafeína al día. Si bien no hay una reglamentación clara o requisitos para controlar la cantidad de cafeína en los productos alimenticios, en especial las bebidas energizantes, se debe implementar técnicas de análisis que permitan identificar la cantidad de cafeína presente en los diferentes productos alimenticios. La técnica analítica más utilizada por los grandes laboratorios de todo el mundo para identificar la cantidad de cafeína es la cromatografía liquida o (HPLC), esta técnica representa para los laboratorios una herramienta confiable, debido a que se elimina considerablemente los errores representados por interferencias que pueden afectar el desarrollo de un análisis, por tal razón esta técnica instrumental es más confiable en comparación con otros métodos. El HPLC es un recurso costoso y altamente técnico que no se encuentra típicamente en laboratorios pequeños y de enseñanza de las universidades, por tanto, este problema debe ser solucionado por dichos laboratorios implementando la utilización de otra técnica de análisis instrumental. El método de análisis alternativo al HPLC para identificar la cantidad de cafeína en un producto alimenticio es por medio de la espectroscopia ultravioleta, por la cual se puede cuantificar el contenido de cafeína principalmente en bebidas gaseosas y bebidas energizantes. La cafeína puede ser extraída por disolventes clorados tales como el diclorometano y cloroformo, técnicas comúnmente empleadas por diferentes industrias. Después de que la cafeína es extraída puede ser analizada directamente por disolución y medición de la absorbancia de patrones a la longitud de onda de 270 nm.
63
9.4 PROCEDIMIENTO 9.4.1 Preparación de las Soluciones:
a) Solución acuosa de cafeína (100 ppm): Pesar 0,0251 gramos de cafeína y adicionarlo en un vaso de precipitado con 50 mL de agua destilada, agitar vigorosamente hasta disolución, posteriormente transferir la solución a un balón de 250,0 mL y llevar hasta aforo con agua destilada.
b) Preparación de la Bebida Energizante: Tomar 50,0 mL de la bebida y transferir a un vaso de precipitado, agitar consistentemente hasta eliminar las burbujas y dejar reposar por 15 minutos. Preparar una muestra diluida de la bebida, de modo que la concentración de cafeína en ella, se encuentre en el intervalo lineal de la curva de calibración.
9.4.2 Preparación de patrones para la curva de calibración: Preparar las soluciones patrón de cafeína 0, 4, 8, 12, 16, 20 ppma partir de la solución acuosa de 100 ppm (ver Tabla 4).
Tabla 4. Preparación de los patrones de cafeína para realizar la curva de calibración. N° Patrón
V solución patrón de cafeína 100 ppm (mL)
Volumen final en mL
Concentración final (ppm)
1 2 3 4 5 6
0 (blanco) 2 4 6 8 10
50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0
0 4 8 12 16 20
64
9.4.3 Determinación: Cuando se tengan preparados los patrones de cafeína y la muestra problema, realizar las siguientes mediciones en el espectrofotómetro:
Antes de comenzar las mediciones se debe leer el manual de funcionamiento del espectrofotómetro, para tener una idea clara de los procedimientos a realizar.
Realizar un barrido espectral entre 200 – 400 nm sobre el patrón de 8 ppm de cafeína, para obtener el espectro de absorción y determinar la longitud de onda ( ) de máxima absorción ( máxima).
Fijar la de máxima absorción en el equipo y cuadrar el cero de absorbancia con el blanco.
Introducir en la celda el patrón N° 1 de cafeína y medir la absorbancia a la máxima, repetir este procedimiento con los demás patrones.
Realizar una curva de calibración entre ABS vs concentración de cafeína. Verificar la regresión lineal de los datos (r ≥ 0,999) y asegurarse que el intervalo lineal esté conformado por seis patrones.
Medir la absorbancia de la muestra problema (bebida energizante) a la máxima y verificar que se encuentre en el intervalo lineal de la curva de calibración. Si no lo está, realizar las diluciones necesarias y los cálculos respectivos.
Determinar la concentración de cafeína en la bebida energizante y reportarla en ppm.
Nota: Cada vez que se va a hacer una medición, la celda que contiene la muestra se debe purgar con cada solución, con al menos tres porciones de la solución que va a contener.
9.5 CUESTIONARIO: 1. Realizar la curva de calibración entre ABS vs concentración de los patrones de cafeína. 2. ¿Cuál es la concentración de cafeína en la muestra problema (bebida energizante)?
65
3. Se realizó un análisis de cafeína en el espectrofotómetro, donde se prepararon patrones de 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 ppm de cafeína, para las cuales se obtuvieron absorbancias respectivamente de (ABS: 0 [Blanco]/ 0,234/ 0,276/ 0,312/ 0,346/ 0,396/ 0,432). Posteriormente se analizó una muestra desconocida de cafeína y su absorbancia fue de 0,372. ¿Cuál es la concentración de la muestra desconocida de cafeína? ¿Cuál es la absortividad y la absortividad molar de la muestra?
9.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001.
PREEDY Victor R., Caffeine “Chemistry, Analysis, Function and Effects”, RSC Publishing, the Royal Society of Chemistry, 2012.
SMITH Brian C., “Quantitative Spectroscopy, Theory and practice”. Unit 1, Fundamentals of Molecular Absorption Spectroscopy. Elsevier Science USA Academic Press, 2002.
KENKEL John. “Analytical Chemistry for Technicians, Visible and Ultraviolet Spectroscopy”. Lewis Publishers US, 1994.
PASTO Daniel J., JOHNSON Carl R. “Determinación de Estructuras Orgánicas”. Editorial Reverte S.A 1981. Reimpreso España, 2003.
JENWAY, Bibby Scientific, the quantitative determination of caffeine in beverages and soft drinks using UV wavelength spectroscopy. [En línea], Citada (14 junio de 2012), disponible en
66
PRÁCTICA N° 10 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN UNA BEBIDA ENERGIZANTE, MÉTODO ADICIÓN DE UN ESTÁNDAR
10.1 OBJETIVOS
Conocer los términos y conceptos sobre la adición de un estándar en muestras de análisis. Adquirir destrezas en el manejo del espectrofotómetro UV/Visible. Aplicar el método de la adición de un estándar para determinar la concentración de una muestra desconocida. Determinar la cantidad de cafeína en una bebida energizante.
10.2 MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES
REACTIVOS
6 Balones aforados de 50,00 mL Balón aforados de 250,0 mL Vasos de precipitado de 50 y 100 mL Pipetas aforadas de 1, 5,0 mL Pipeta graduada de 10 y 25 mL Frasco lavador Pera de succión, varilla agitadora Espectrofotómetro UV/Visible
Solución acuosa de cafeína 50 ppm Bebida Energizante (RED BULL, PEAK, Vive 100, u otra)
10.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS El método de la adición estándar es útil para analizar muestras complejas en las que la probabilidad de que ocurran efectos adversos debido a la matriz es considerable. Este método puede aplicarse de diferentes formas; una de las más habituales implica la adición de volúmenes diferentes de una solución patrón a varias alícuotas de la muestra del mismo tamaño; este proceso es conocido como adición de muestra. 1
El término matriz, hace referencia al conjunto de los distintos componentes que constituyen una muestra analítica. 1
67
Después, cada disolución se lleva a un volumen fijo, antes de ejecutar la medida hay que tener en cuenta que cuando la cantidad de muestra es limitada, las adiciones estándar se pueden llevar a cabo por adiciones sucesivas de volúmenes del patrón a un único volumen del problema exactamente medido. Las medidas se van haciendo en la muestra original y después de cada adición del patrón en la muestra. En la mayoría de las versiones del método de la adición estándar, se espera que, después de la adición de un patrón del analito, solo cambie su concentración y que la matriz se conserve casi idéntica. En este método varias alícuotas idénticas Vx de la disolución problema con una concentración Cx, se transfieren a balones aforados de volumen Vs. A cada balón se le añade un volumen variable (Vs mL) de una disolución patrón del analito que tiene una concentración conocida Cs, se añaden entonces los reactivos adecuados y cada disolución se diluye hasta un volumen determinado. Cuando se realizan las mediciones espectrométricas en cada una de esas disoluciones, la respuesta del instrumento es proporcional a la concentración. La representación de A, en función de Vs, es una línea recta de la forma A = mVs + b. Donde la pendiente m y la ordenada en el origen b vienen dadas por: b = Vx Cx m Cs
dónde
Cx = b Cs m Vx
También se puede dibujar manualmente una gráfica de los datos, y la parte recta de la misma se extrapola hasta el origen. La diferencia entre el volumen añadido de patrón en el origen y el valor del volumen en el punto de intersección de la línea recta con el eje de las x (Vx)0, es el volumen de patrón que equivale a la cantidad de analito en la muestra. Se puede considerar: Cx = (Vs)0 Cs Vx Las bebidas energizantes, son bebidas a base de agua sin alcohol y con algunas virtudes estimulantes, que le ofrecen al consumidor virtudes regeneradoras de la fatiga y el agotamiento, además de aumentar la habilidad mental y desintoxicar el cuerpo. Las bebidas enrgizantes están compuestas principalmente por cafeína, vitaminas, carbohidratos y sustancias naturales orgánicas, que eliminan la sensación de agotamiento por parte de la persona que las consume. Se puede determinar la cantidad de cafeína presente en una bebida energizante, por medio de la adición de volúmenes de bebida a patrones preparados de cafeína y la lectura de absorbancia de las disoluciones a una longitud de onda de 270 nm.
68
10.4 PROCEDIMIENTO 10.4.1 Preparación de las Soluciones: a) Solución acuosa de cafeína (50 ppm): Pesar 0,01251 gramos de cafeína y adicionarlo en un vaso de precipitado con 50 mL de agua destilada, agitar vigorosamente hasta disolución, posteriormente transferir la solución en un balón de 250,0 mL y llevar hasta aforo con agua destilada. b) Preparación de la Bebida Energizante: Tomar 50,0 mL de la bebida y transferir a un vaso de precipitado, agitar consistentemente hasta eliminar las burbujas y dejar reposar por 15 minutos. Añadir 2,0 mL de la bebida a cada patrón de cafeína
10.4.2 Preparación de patrones: Preparar las soluciones patrón de cafeína 0, 2, 4, 6, 8, 10 ppma partir de la solución acuosa de cafeína (50 ppm) y añadir la cantidad necesaria de estándar; teniendo en cuenta las indicaciones de la Tabla 5:
Tabla 5. Preparación de los patrones para la adición de un estándar N° Patrón 1 2 3 4 5 6
V Bebida Energizante en mL 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0
V de estándar de cafeína 50 ppm (mL) 0 (blanco) 2 4 6 8 10
Volumen final mL 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0
10.4.3 Determinación: Cuando se tengan los patrones preparados se realizan las siguientes mediciones:
Antes de comenzar las mediciones se debe leer el manual de funcionamiento del espectrofotómetro, para tener una idea clara de los procedimientos a realizar.
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Realizar un barrido espectral entre 200 – 400 nm sobre el patrón de 8 ppm de cafeína, para obtener el espectro de absorción y determinar la longitud de onda ( ) de máxima absorción ( máxima).
Fijar la de máxima absorción en el equipo y cuadrar el cero de absorbancia con el blanco.
Introducir en la celda el patrón N° 1 de cafeína y medir la absorbancia a la máxima, repetir este procedimiento con los demás patrones.
Realizar una curva de calibración entre ABS vs Volumen de estándar. Verificar la regresión lineal de los datos (r ≥ 0,999) y asegurarse que el intervalo lineal esté conformado por seis patrones.
Medir la absorbancia de la muestra problema (bebida energizante) a la máxima y verificar que se encuentre en el intervalo lineal de la curva de calibración. Si no lo está, realizar las diluciones necesarias y los cálculos respectivos.
Determinar la concentración de cafeína en la bebida energizante y reportarla en ppm.
Nota: Cada vez que se va a hacer una medición, la celda que contiene la muestra se debe purgar con cada solución, con al menos tres porciones de la solución que va a contener
10.5 CUESTIONARIO
1. Realizar la curva entre ABS vs Volumen de estándar de los patrones de adición de un estándar. 2. ¿Cuál es la concentración de cafeína en la bebida energizante? 3. ¿Qué diferencias existen entre la utilización del método de la curva de calibración y el método de la adición de un estándar?
70
4. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la anterior práctica (PRÁCTICA N° 9), ¿Cuál fue el resultado más acertado sobre la concentración de cafeína en la bebida energizante, al realizarse el análisis por los métodos de la curva de calibración y la adición de un estándar?
10.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001.
SMITH Brian C. “Quantitative Spectroscopy, Theory and practice”. Unit 1, Fundamentals of Molecular Absorption Spectroscopy. Elsevier Science USA Academic Press, 2002.
KENKEL John. “Analytical Chemistry for Technicians, Visible and Ultraviolet Spectroscopy”. Lewis Publishers US, 1994.
MOLINA V. Daniel Ricardo. “Laboratorio de Instrumentación Química ɪ”. Universidad Industrial De Santander (UIS). Prácticas de laboratorio 2008.
RODRÍGUEZ Rivera Víctor Manuel, MAGRO Edurne Simón. Alimentación Humana”. 1a ed. Editorial Netbiblo, España, 2008.
DINKO Instruments, “Manual de Instrucciones UV- VIS Espectrofotómetro UV 2300 II”. Departamento de Química, UFPS. DINTER S.A. 1a edición 2011.
71
“Bases de la
PRÁCTICA N° 11 ESPECTROSCOPIA INFRARROJA, APLICACIÓN DEL TUTOR IR PARA LA IMPLEMENTACIÓN DE CONCEPTOS TEÓRICOS
11.1 OBJETIVOS
Comprender los conceptos básicos de la espectroscopia infrarroja. Conocer el funcionamiento, la aplicación e importancia de los equipos utilizados en el análisis infrarrojo. Facilitar el estudio de los análisis espectrales en la espectroscopia infrarroja mediante la aplicación del Tutor IR.
11.2 MATERIALES El material utilizado para el desarrollo de la práctica será entregado por el docente y constara de un programa conocido como TUTOR IR ( software libre) y donde se encontrará la información referente a la espectroscopia infrarroja. El programa de instalación Tutor IR, es muy fácil de utilizar, solo se debe instalar el programa en el computador y traducir en totalidad el contenido para desarrollar cada pregunta.
11.3 PROCEDIMIENTO: Las preguntas que se presentan a continuación tienen como objetivo hacer más fructífero el estudio de la espectroscopia infrarroja mediante el trabajo con el Tutor IR.
11.3.1 Introducción a la Espectroscopia: 1. ¿De dónde nace la idea de Espectroscopia Infrarroja? 2. ¿Quién es Frederic William Herschel, cuál fue su experimento y como demostró la absorción de la luz IR? 3. ¿Qué descubrió Isaac Newton de la luz y quien comprobó su teoría? 4. ¿Cuál es el orden de las bandas en el espectro electromagnético? 5. ¿A qué se le llama luz polarizada? 72
Defina los siguientes conceptos: Longitud de onda, Frecuencia, Numero de onda Que significa la fórmula C= v ¿A qué es igual la energía según la longitud de onda y el número de onda? Si el número de onda de una radiación es de 20 cm-1. ¿A qué es igual la longitud de onda y la energía? 10. ¿Qué explica la teoría de la vibración molecular y en que numero de onda se encuentra el infrarrojo medio?
6. 7. 8. 9.
11.3.2 Equipos para Análisis Infrarrojo: Nombre dos tipos de espectrofotómetros IR diferentes en su sistema óptico. ¿Cuál es la fuente de IR en un espectrofotómetro clásico y en que rango trabaja? ¿Cómo llega la radiación IR a la muestra, por qué utiliza espejos y no otro material? ¿Por qué es importante del espejo divisor (Choppin Mirror)? ¿Cuál es la función de la rejilla de difracción? ¿Por qué se conoce el espectrómetro clásico como dispersivo? ¿Qué elemento constituye un detector de radiación IR, que señal mide y como la transforma en medida de absorción? 8. ¿Qué es un espectro IR? 9. ¿De qué partes consta un interferómetro de Michelson? 10. ¿Cuál es la función de la transformada de Fourier en el espectrómetro? 11. ¿Qué ventajas presenta un espectrofotómetro con interferómetro y transformada de Fourier sobre un equipo dispersivo?
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
11.3.3 Teoría sobre el Análisis Infrarroja: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
¿Qué es un oscilador armónico clásico? ¿Cómo se presenta una curva de potencial armónico? ¿Cómo varia la energía potencial en un oscilador armónico? ¿Cómo se relacionan la frecuencia de vibración v con la constante de fuerza y la masa en un oscilador armónico? Escriba una expresión matemática que exprese la relación entre la energía total de un oscilador y el desplazamiento X de las masas ¿Por qué la relación anterior que es correcta para un oscilador armónico no se puede aplicar a las moléculas? ¿Que predice la mecánica cuántica sobre la energía de vibración de las moléculas? ¿Por qué se dice que la energía está cuantizada?
73
9. ¿Que indica la regla de selección? 10. ¿Qué radiación puede absorber una molécula según la regla de selección, como se aprecia en el espectro IR? 11. ¿Qué es un modelo anarmónico? 12. ¿Qué es un sobretono? ¿cómo es su frecuencia comparada con la de la banda fundamental? 13. ¿Cómo aparece el sobretono en el espectro IR? 14. ¿Por qué una molécula de H2 no absorbe radiación IR? 15. ¿Con cuál de los campos que constituye la radiación se debe alinear el dipolo molecular para que se produzca la radiación IR? ¿Qué es un dipolo oscilante?
11.3.4 Análisis Espectral IR: 1. 2. 3. 4. 5.
¿Qué tipos de vibraciones se presentan en las moléculas de agua? ¿Qué significan modos normales de vibración? ¿Cuántos modos de vibración presenta una molécula no lineal de N átomos? ¿Por qué aparecen tres picos de absorción en la molécula en el espectro IR? ¿Cuántos modos de vibración presenta el CO2, y por qué presenta solo 2 picos de absorción en el IR? 6. ¿Cuántos modos de vibración presenta el pentano C5H12? 7. ¿Cuántos modos de vibración presenta el grupo metilo CH3? 8. ¿Cuántos modos de vibración presenta el metileno CH2? 9. ¿Qué significa la región de las huellas digitales? 10. Indique el número de onda correspondiente a dos picos característicos de los espectros IR de los siguientes compuestos: Hexano; 2,3-dimetilbutano; 1-hexino; 1heptino, cianuro de heptilo, tolueno, hexanol, hexilamina.
11.4 CUESTIONARIO
1. Adquirir e instalar el programa Tutor IR en su computador o equipo de trabajo. 2. Desarrollar las anteriores preguntas con la ayuda del Tutor IR, anexar las respuestas en una carpeta y presentarlas al docente del curso.
74
11.5 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001.
RUBINSON Kenneth A., RUBINSON Judith F. “Análisis Instrumental”. Editorial Prentice Hall, 2000.
SIERRA Isabel, PÉREZ Damián, GÓMEZ Santiago, MORANTE Sonia. “Análisis Instrumental, Algunas herramientas de enseñanza-aprendizaje adaptadas al Espacio Europeo de Educación Superior”. Editorial Netbiblo, S. L., 2010.
University of Colorado, Boulder, Chemistry and Biochemistry Department, (2011). CU Boulder Organic Chemistry Undergraduate Courses, “IR Spectroscopy Tutorial”.
75
PRÁCTICA N° 12 ESPECTROSCOPIA INFRARROJA, PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS
12.1 OBJETIVOS
Conocer el funcionamiento del espectrofotómetro IR. Adquirir destrezas en la preparación de muestras para el análisis IR. Obtener los espectros IR de las muestras problema. Identificar cualitativamente los grupos funcionales que se encuentran en los compuestos químicos analizados. Conocer la importancia del análisis IR.
12.2 MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES
REACTIVOS
Mortero de Ágata Pastillero con tornillos y troquel Accesorios de laboratorio Espectrofotómetro IR con transformada de Fourier.
KBr espectroscópico Ácido salicílico Lámina de poliestireno Guayacol HCl 37 % Acrilonitrilo Urea
12.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS La región infrarroja del espectro electromagnético se extiende entre la zona del visible y la del microondas, ver figura 47. La sección de mayor utilidad práctica de la extensa región IR es la que se extiende entre 4000 y 650 cm-1 denominada región infrarroja media. La utilización de la región IR lejana, entre 650 y 200 cm -1, se ha ampliado considerablemente en los últimos años, sobre todo para el estudio de compuestos órgano-metálicos o inorgánicos.
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La región IR cercana comprendida entre 12500 y 4000 cm-1, accesible a la óptica de cuarzo, donde se presentan las bandas armónicas, ha sido utilizada para determinaciones cuantitativas.
Figura 6. Región Infrarroja del Espectro Electromagnético.
La espectrometría de absorción y reflexión en el infrarrojo medio, es una técnica analítica instrumental que permite conocer los principales grupos funcionales de la estructura molecular de un compuesto. Esta información se obtiene a partir del espectro de absorción de dicho compuesto, al ser expuesto a la radiación infrarroja en el espectrofotómetro. Los espectros infrarrojos de un compuesto se representan por medio de una gráfica con valores de número de onda (cm-1), ante los valores de Transmitancia en porcentaje (%T). La absorción de radiación IR que recibe un compuesto a una longitud de onda dada, origina un descenso en el (%T) y se manifiesta en el espectro en forma de un pico o banda de absorción.
Figura 7. Representación de los picos y bandas de absorción en un espectro IR.
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La espectroscopia IR es una técnica versátil que permite obtener espectros de sustancias sólidas, líquidas y gaseosas utilizando en cada caso las celdas o soportes adecuados. Las celdas son contenedores especiales con un camino óptico definido, apropiados para situar muestras liquidas o gaseosas en el paso del haz de radiación, las celdas deben cumplir con requisitos como:
Las ventanas de las celdas deben ser permeables al paso de la radiación a las longitudes de onda en uso y de ser posible no deben provocar pérdidas por reflexión o dispersión. El material de la celda debe ser resistente a la muestra. El camino óptico de la celda debe estar perfectamente definido para análisis cuantitativo y permitir variaciones en el análisis cualitativo. En la medida de lo posible la celda debe permitir recuperar la muestra.
CELDAS PARA ANÁLISIS IR Existen diferentes tipos de celdas para el análisis infrarrojo, las más utilizadas son:
Celdas desmontables: Consta de dos ventanas circulares de 25 mm de diámetro, separadas por un espaciador de aluminio o teflón con un grosor variable entre 10 y 500 μm dependiendo de la intensidad y concentración del espectro a medir. El camino óptico que dicta el espaciador no se define de forma precisa, ya que está influenciado por la cantidad y viscosidad de la muestra que quede entre el mismo y la ventana. Por este motivo las celdas desmontables sólo se utilizan en medidas cualitativas.
Figura 8. Celda desmontable (1-ventanas; 2-anillo espaciador; 3-anillos intermedios; 4soporte)
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Celdas con camino óptico definido: Cuentan con dos ventanas con un espaciador del grosor adecuado, aunque en una de las ventanas presenta dos orificios para el llenado de la celda. Estos orificios continúan en el anillo intermedio y el soporte para acabar en un cuello que se cierra con un tapón de teflón. Una vez cerradas pueden contener disolventes con puntos de ebullición por encima de 60°C, hay que tener en cuenta que la muestra se calienta con el paso de la radiación y que el consiguiente aumento de presión pude traducirse en la evaporación parcial o completa de la muestra por fugas entre las ventanas y el espaciador. Actualmente se encuentran celdas comerciales selladas que permiten utilizar disolventes con puntos de ebullición más bajos; estas celdas se emplean en medidas cuantitativas en las que es necesario conocer con exactitud el camino óptico y mantenerlo constante, al menos durante la serie de medidas de calibración y de la muestra de estudio.
Figura 9. Celda para análisis IR cuantitativo de líquidos.
Celdas para gases: De acuerdo con la menor densidad de los gases se necesita un camino óptico mayor que puede estar entre 5 y 10 cm. La celda consiste en un cilindro de unos 45 mm de diámetro con dos orificios que se puedan cerrar y resistentes al vacío, terminada en dos ventanas paralelas en torno a 50 mm de diámetro. Cuando hay que determinar trazas de gases poco absorbentes se usan celdas de multi-reflexión, que mediante un sistema de espejos permite alcanzar caminos ópticos incluso de 40 m.
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Figura 10. Celda para el análisis IR de gases.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS IR Durante un análisis por espectroscopia de absorción infrarroja, la muestra que se desea analizar debe ser tratada de acuerdo a su estado (sólido, líquido, gas). Los métodos para preparar las muestras se describen a continuación:
Preparación de muestras líquidas
Cuando la cantidad de muestra es pequeña o cuando no se dispone del disolvente apropiado, es habitual obtener los espectros del líquido puro. En este caso, sólo una película muy delgada tiene un camino óptico lo suficientemente corto como para producir espectros satisfactorios. En los análisis cualitativos una gota del líquido puro se presiona entre las dos ventanas de una celda desmontable conformando un (sandwich), donde las ventanas son básicamente de NaCl, la celda se debe cerrar con cuidado, evitando atrapar burbujas de aire y apretando los tornillos lo suficiente sin romper las ventanas. La celda se coloca en la trayectoria del haz de radiación infrarroja y se obtiene el espectro de la muestra. Las muestras de líquidos puros pueden contener el agua suficiente para destruir las ventanas (NaCl) de la celda, por lo cual es necesario el pulido periódico de las mismas.
Preparación de muestras sólidas
En los análisis infrarrojos de muestras sólidas, se obtienen los espectros de dispersiones del sólido en una matriz líquida o sólida. Generalmente en esta técnica, la muestra sólida se debe pulverizar hasta que el tamaño de sus partículas sea menor que la longitud de onda de la radiación para evitar los efectos de dispersión de la radiación. Las dos técnicas utilizadas para preparar las muestras sólidas son: 80
-
La Pastilla de KBr: La técnica más utilizada en la preparación de muestras sólidas para análisis IR es la formación de la pastilla de KBr (también se han utilizado otros haluros de metales alcalinos). Las sales de haluros tienen la propiedad de flujo en frío por lo cual cuando se presiona suficientemente este material finamente pulverizado presenta propiedades transparentes o translúcidas como el vidrio. Para preparar la muestra se deben mezclar a fondo un miligramo o menos de dicha muestra, finamente pulverizada, con aproximadamente 100 mg de polvo de KBr desecado. La mezcla se realiza utilizando un mortero de ágata con su pistilo. Posteriormente se presiona la mezcla en un troquel especial entre 700 y 1000 kg/cm2 hasta obtener un disco transparente. A continuación, el disco se coloca en la trayectoria del haz de radiación emitido por el espectrofotómetro FT-IR para obtener el espectro infrarrojo.
Figura 11. Troquel utilizado para fabricar los discos de KBr.
-
Preparación de Suspensiones: Cuando los sólidos no son solubles en un disolvente transparente en la región del infrarrojo ni es conveniente prepararlos en forma de pastillas de KBr, sus espectros de infrarrojo se obtienen por dispersión del analito en una suspensión de un aceite mineral o un hidrocarburo fluorado. Las suspensiones se preparan moliendo de 2 a 5 mg de la muestra finamente pulverizada (el tamaño de partícula debe ser menor a 2 μm) en presencia de una o dos gotas de un aceite hidrocarbonado pesado (Nujol). Si es probable que interfieran las bandas del hidrocarburo se pueden sustituir por 1,3 hexaclorobutadieno. En cualquiera de los casos, la suspensión resultante se examina como una delgada película entre celdas con ventanas de NaCl. 81
-
Láminas Delgadas de Polímeros: Se pueden obtener, con ayuda de un par de placas calientes y una prensa, láminas delgadas de polímeros con un espesor altamente reproducible, desde 15 hasta 500 μm. Si la forma del polímero lo permite la muestra se coloca directamente en el porta-muestra y se coloca en la trayectoria del haz de radiación infrarroja para obtener el espectro de absorción.
Preparación de Muestras Gaseosas
El espectro de un líquido de bajo punto de ebullición o de un gas, se puede obtener permitiendo a la muestra que se expanda en una celda cilíndrica en la que se ha hecho el vacío, equipada con las ventanas adecuadas. Para este fin se dispone de una variedad de celdas cilíndricas con caminos ópticos que oscilan entre pocos centímetros y 10 o más metros. Los caminos ópticos más largos se obtienen en celdas compactas provistas de superficies internas reflectantes, de modo que el haz pasa numerosas veces por la muestra antes de salir de la cubeta. Para preparar las muestras gaseosas se necesitan de: -
Disoluciones: Siempre que sea posible, es conveniente obtener el espectro infrarrojo de disoluciones preparadas de forma que contengan una cantidad conocida de muestra, como se hace normalmente en espectrometría UV/Visible. Sin embargo, esta técnica tiene ciertas limitaciones en cuanto a sus aplicaciones, por la disponibilidad de disolventes que sean transparentes en las regiones del infrarrojo.
-
Disolventes: Ninguno de los disolventes utilizados en la espectroscopia IR son transparentes en la región del infrarrojo medio. El agua y los alcoholes rara vez se utilizan como disolventes, no sólo porque absorben intensamente, sino también porque ataca a los haluros de metales alcalinos, que son los materiales utilizados en las ventanas de las celdas.
Básicamente las muestras gaseosas suelen distribuirse y almacenarse en cilindros metálicos o de vidrio, desde los que se transfiere la muestra a la celda, normalmente utilizando un aparato de vacío que tras la evaluación del sistema permite una medida exacta de la presión parcial. Las cubetas de camino óptico fijo se pueden llenar o vaciar con una jeringa hipodérmica. Las ventanas de NaCl son las más utilizadas actualmente, y aun teniendo cuidado, finalmente se dañan debido a la absorción de humedad que genera los disolventes.
82
12.4 PROCEDIMIENTO Teniendo en cuenta los fundamentos teóricos de la práctica, preparar las muestras que se desean analizar teniendo en cuenta su estado físico (solido, líquido, gas), cuando se tengan preparadas las muestras, obtener y analizar los espectros IR de cada sustancia.
12.4.1 Calibración del Espectrofotómetro IR con Transformada de Fourier (FT-IR): Para preparar el espectrómetro (FT-IR) se cuenta con un manual de funcionamiento del equipo, en el cual se especifican los datos que se deben ingresar en el computador, teniendo en cuenta que los equipos de análisis IR modernos trabajan con un sistema operativo (Software), que le permite al analista facilitar el estudio del compuesto que desea analizar. Calibrar el equipo y ajustarlo para realizar el análisis cualitativo de los diferentes compuestos entre el rango de 4000 a 400 cm-1.
12.4.2 Obtención del espectro IR del poliestireno: Determinar directamente el espectro de absorción IR de una película delgada de poliestireno, utilizando el (FT-IR) en el rango de 4000 a 400 cm-1.
12.4.3 Identificación Cualitativa: Preparar las muestras para análisis y obtener el espectro de absorción IR de los diferentes compuestos, sólidos y líquidos, en el rango de 4000 a 400 cm-1. Analizar los espectros obtenidos y establecer las conclusiones de la técnica aplicada. Nota: Tener en cuenta el manual de funcionamiento des espectrofotómetro IR utilizado en el análisis.
12.5 CUESTIONARIO 1. Identificar los espectros de absorción de las sustancias utilizadas y analizar los diferentes tipos de picos que presentan los espectros. 2. ¿Cuál es la importancia de la espectroscopia de absorción IR en los diferentes campos de la química?
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3. ¿Qué ventajas presenta un espectrofotómetro con interferómetro y transformada de Fourier sobre un equipo dispersivo? 4. ¿Por qué es tan eficiente trabajar con un espectrómetro IR con transformada de Fourier? 5. ¿Por qué los métodos analíticos cuantitativos que utilizan radiación del infrarrojo cercano parecen ser más precisos y exactos que los que utilizan radiación del infrarrojo medio? 6. Analizar el siguiente espectro de absorción IR de la N, N dimetilformamida
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12.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001. P 219.
SIERRA Isabel, PÉREZ Damián, GÓMEZ Santiago, MORANTE Sonia. “Análisis Instrumental, Algunas herramientas de enseñanza-aprendizaje adaptadas al Espacio Europeo de Educación Superior”. Fundamentos e Instrumentación en Espectrometría de Absorción en el Infrarrojo. Editorial Netbiblo, S. L. 2010. P 65
RUBINSON Kenneth A., RUBINSON Judith F. Editorial Prentice Hall, 2000. P 506.
STUART Barbara. “Infrared Spectroscopy, Fundamentals and Applications”. Editorial WILEY, 2004. P 18.
PRUSHAN M. J. “Instrumental Analysis Manual”, LA SALLE UNIVERSITY. Atomic Absorption Analysis of Calcium in Milk. P 45
ROUESSAC Francis, ROUESSAC Annick. “CHEMICAL ANALYSIS, Modern Instrumentation Methods and Techniques”. Second Edition, Editorial WILEY 2007
LINDE, the Linde Group, Infrared Spectrometry Instrumentation. Contenido en línea, disponible en http://hiq.linde-gas.com/international/web/lg/spg/like35lgspg.ns f/docbyalias/anal_infra.
UNAL, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Dirección Nacional de Servicios Académicos Virtuales. Contenidos en línea, Química Analítica II, Espectrofotometría Infrarroja Transformada de Fourier, disponible en
Universidad de Granada, España, Departamento de Química y Física, Facultad de Farmacia. Práctica de Laboratorio N° 4 “Obtención del Espectro IR del Ácido Acetil Salicílico”. Disponible en
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“Análisis Instrumental”.
PRÁCTICA N° 13 DETERMINACIÓN DE HIERRO Y MAGNESIO POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA
13.1 OBJETIVOS
Entender el funcionamiento del espectrofotómetro de absorción atómica. Evaluar la importancia de la selección del ancho de banda y la longitud de onda en un análisis por espectroscopia de absorción atómica. Adquirir destrezas en el manejo del espectrómetro de absorción atómica. Hacer las curvas de calibración para la determinación de Fe y Mg. Determinar la concentración de Fe y Mg en dos muestras problema.
13.2 MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES
REACTIVOS
Matraces aforados de 1L y 250,0 mL Vaso de precipitado de 250 mL Pipetas aforadas de 10 y 25,0 mL Micro-pipeta de 1000 y 100 μL Lámpara de cátodo hueco para Fe Lámpara de cátodo hueco para Mg Espátula, varilla de vidrio Matraces aforado de 50,0 mL Frasco lavador, pera de succión Balanza analítica Espectrofotómetro de absorción atómica.
Solución madre de Fe (200 ppm) Solución madre de Mg (1000 ppm) Solución patrón de Fe (100 ppm) Solución patrón de Mg (100 ppm) HCL (diluido) Agua destilada
13.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS La espectroscopia de absorción atómica es un método para la detección y la determinación de elementos químicos, particularmente de elementos metálicos. metálicos. Uno de los los pioneros en la espectroscopia fue Isaac Newton, quien a principios de 1600 observó y estudió el comportamiento de la luz solar cuando esta atraviesa por un prisma.
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En 1831, J.F. Herschel demostró, que las sales de diferentes metales producen distintas coloraciones a la flama cuando las sales disueltas o en forma directa son puestas en contacto con ésta. Así por ejemplo las sales de calcio dan al contacto con la flama un color naranja, las de sodio un color amarillo, amarillo, las de potasio violeta, etc. Estas observaciones fueron corroboradas posteriormente por otros científicos sugiriendo que de esta forma podría identificarse el metal formador de la sal en un compuesto químico específico. En 1859 los científicos Kirschoff y Bunsen en 1859 ampliaron el conocimiento de la naturaleza de este fenómeno, cuando la luz colorida emitida por el metal en la flama la hicieron incidir en un depósito óptico que separa la radiación emitida por el metal, de la luz solar. En este instrumento denominado espectroscopio (observación del espectro) se observa que cada metal que emite radiación de diferente color, presenta líneas que aparecen en diferentes posiciones en la pantalla o campo de observación, y esto es independientemente de las condiciones en que se realiza el experimento así como de la naturaleza de la sal metálica y únicamente depende del metal. Adicionalmente, la intensidad de la línea está directamente relacionada a la concentración del elemento en solución. De esta manera se tiene una forma de identificar el elemento (por la posición de sus líneas), así como de una manera de identificar éste (por la intensidad de las líneas producidas). La espectroscopia de absorción atómica (EAA), se fundamenta en la absorción de radiación de una determinada longitud de onda. Esta radiación es absorbida selectivamente selectivamente por átomos que tienen niveles energéticos cuya diferencia en energía corresponde al valor de la energía de los fotones incidentes. La cantidad de fotones absorbidos, se determina por medio de la ley de Beer, que relaciona la pérdida de poder radiante, con la concentración de la especie absorbente y con el espesor de la celda o recipiente que contiene los átomos absorbentes. Los componentes de un espectrofotómetro de absorción atómica son:
1) Una fuente de radiación que emita una línea específica correspondiente a la necesaria para efectuar una transición en los átomos del elemento analizado. 2) Un nebulizador, que por aspiración de la muestra liquida, transforma la muestra en pequeñas gotas para una atomización más eficiente. ef iciente. 3) Un quemador, en el cual por efecto de la temperatura alcanzada en la combustión y por la reacción de combustión misma, se favorezca la formación de átomos a partir de componentes en solución.
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4) Un sistema óptico que separe la radiación de longitud de onda de interés, de todas las demás radiaciones que entran en el sistema. 5) Un detector o transductor, que sea capaz de transformar en relación proporcional, las señales de intensidad de radiación electromagnética, en señales eléctricas o de intensidad de corrientes. 6) Un amplificador o sistema electrónico, que amplifica la señal eléctrica producida, para que pueda ser procesada proces ada con circuitos y sistemas electrónicos comunes. 7) Un sistema de lectura en el cual la señal de intensidad de corriente, sea convertida a una señal que el operario pueda interpretar. Este sistema de lectura puede ser una escala de aguja, una escala de dígitos, un graficador, una serie de datos que pueden ser procesados a su vez por una computadora, entre otros. Figura 12. Componentes de un Espectrofotómetro de Absorción Atómica
FUENTES DE RADIACIÓN Una vez que han sido formados los átomos, absorben radiación de acuerdo a la ley de Beer si esta corresponde a la diferencia en energía entre los niveles energéticos de algunos de los átomos presentes, de lo contrario, la radiación pasa por la flama sin disminuir la potencia de haz como efecto de los átomos contenidos en ella. Los átomos de los diferentes elementos tienen líneas bien definidas que corresponden a transiciones entre diferentes niveles atómicos. Estas transiciones tienen anchos espectrales de decimas o hasta centésimas de nanómetro.
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Cada elemento va a responder a la excitación de una radiación de longitud de onda muy específica ya que solo este elemento absorbe o emite tal tipo de radiación, porque esta corresponde a la diferencia diferencia entre dos niveles particulares de ese átomo. La idea de Alan Walsh en la cual los átomos absorben y emiten radiación al pasar del estado basal a un estado excitado y teóricamente emiten la misma frecuencia de radiación en el proceso inverso; por lo tanto si se tiene una fuente de excitación en donde el elemento excitado es el mismo que se va analizar, la radiación emitida va a ser captada únicamente por el elemento que es idéntico al de la fuente luminosa. Las fuentes de excitación utilizadas en los análisis por (EAA), son las lámparas de cátodo hueco. hue co. Las lámpara des cátodo hueco (LCH o HCL [ Hollow Hollow Cathode Lamp]) consisten de un cilindro de vidrio sellado al vacío y con un gas inerte en su interior, en el extremo terminal esta soldada una ventana de cuarzo fundido; esta ventana tiene que ser de cuarzo debido a que casi todas las líneas espectrales útiles se hallan en el ultravioleta. ultravioleta. Dentro de este mismo cilindro se encuentran dos filamentos; uno de ellos es el cátodo y el otro el ánodo. El ánodo generalmente es un alambre grueso hecho de níquel o tungsteno, el cátodo es en forma de un cilindro hueco, en el interior del cual se encuentra depositado en forma de una capa el elemento metálico que se va a excitar.
Figura 13. Lámpara de cátodo hueco.
NEBULIZADOR Cuando una solución acuosa de sales inorgánicas disueltas es aspirada y dirigida hacia una flama, en esta ocurre una serie de eventos que conducen a la formación de átomos en la misma. El quemador-nebulizador de premezclado o de flujo laminar tiene tiene la siguiente secuencia de pasos en su operación: inicialmente la muestra liquida (en la cual están disueltos los componentes en forma de iones positivos y negativos) debe ser conducidas al nebulizador.
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Para esto se hace uso del efecto Venturi, este efecto se crea cuando el oxidante se introduce a través de un tubo diseñado de manera tal que se genera un vacío lo cual produce la succión de la muestra liquida a través del tubo capilar. Este mismo efecto Venturi favorece la formación de pequeñas gotas en forma de rocío, cuando la solución se hace impactar sobre un cuerpo sólido de diseño y geometría adecuada. El combustible necesario, (generalmente acetileno) se introduce directamente a la cámara del nebulizador por medio de un conducto adicional. Debido a que el oxidante que se introduce a través del nebulizador para el efecto Venturi no es suficiente para una adecuada combustión, el resto requerido se introduce también a la cámara del nebulizador por medio de un conducto adicional. El resultado es que el quemador lleva finalmente una mezcla oxidante (aire) y combustible (acetileno) que transportan pequeñas gotas de rocío de la muestra aspirada. Las pequeñas gotas formadas, son arrastradas por el flujo de gases (oxidante y combustible) que también entran a la cámara de mezclado del nebulizador que sustentan la reacción de combustión en el quemador. Únicamente las partículas que tienen tamaños menores de 10 mm, lo que representa solo una pequeña fracción del volumen de muestra aspirada llegan finalmente al quemador, más del 90 % de la solución es desechada a través de un tubo de drenaje que el nebulizador tiene para este fin. La intención del drenaje es la de evitar que partículas demasiado grandes alcancen el quemador. Cuando esto ocurre, debido a que el tiempo de residencia de la gota en la parte más caliente de la flama es de únicamente milésimas de segundo, si la gota es demasiado grande, no se alcanzan a formar átomos a partir de esta, y es muy probable que se originen falsas absorbancias.
Figura 14. Quemador-Nebulizador de premezclado o flujo laminar.
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QUEMADOR Cuando la muestra pasa por el nebulizador y se forman las gotas de muestra, estas llegan al quemador donde ocurren los siguientes eventos:
El solvente es vaporizado y se forman los cristales de las sales metálicas que originalmente se encontraban en solución como iones positivos y negativos. La naturaleza de las sales formadas dependen principalmente de la constante del producto de la solubilidad del compuesto que cristaliza. Una vez formadas las sales, estas son descompuestas por efecto de la temperatura, y el elemento es reducido al estado metálico sólido. Posteriormente el metal pasa del estado líquido al estado gaseoso y finalmente se tiene en un vapor atómico que es capaz de absorber radiación de longitudes de onda bien definidas. Si la temperatura es lo suficientemente alta y el elemento metálico es de bajo potencial de ionización, parte de los átomos del elemento pierden uno o más de sus electrones y se ioniza parcialmente. Cuando el vapor atómico absorbe la radiación de la longitud de onda definida para dicho vapor, se obtiene una medida gracias al detector, que transforma en relación proporcional las señales de intensidad de radiación electromagnética y las envía al sistema de lectura, pasando primeramente por un amplificador. Cuando la señal del detector pasa por el amplificador llega al sistema de lectura donde la señal se convierte de tal manera que el analista la pueda interpretar (ejemplo: transmitancia o absorbancia).
La temperatura de la llama es un factor importante para la determinación de una muestra, y se utilizan varias mezclas para poder manejar el poder calorífico de la llama a la necesidad de la muestra. Hay que destacar que cuando se utiliza el aire como oxidante se obtienen temperaturas de 1700 a 2400 °C con varios combustibles. A estas temperaturas sólo las muestras que se descomponen fácilmente, se atomizan; para la mayoría de las muestras refractarias, se debe emplear oxigeno u óxido nitroso como oxidante. Estos oxidantes producen temperaturas de 2500 a 3100 °C con los combustibles habituales.
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Las velocidades de combustión son de considerable importancia, porque las llamas sólo son estables en ciertos intervalos de caudal. Si el caudal no sobrepasa la velocidad de combustión, la llama se propaga hacia el interior del quemador dando un fogonazo. Cuando el caudal aumenta, la llama sube hasta alcanzar un punto por encima del quemador donde el caudal y la velocidad de combustión son iguales; en esta región es donde la llama es estable. A caudales más elevados, la llama sube y al final alcanza un punto donde se aparta del mechero y se apaga. Estas consideraciones demuestran la importancia de controlar el caudal de la mezcla combustible-oxidante. Las propiedades de los combustibles y oxidantes utilizados en los análisis por EAA son:
Tabla 6. Propiedades de la llama en Absorción Atómica. COMBUSTIBLE
OXIDANTE
Gas natural Gas natural Hidrogeno Hidrogeno Acetileno Acetileno Acetileno
Aire Oxigeno Aire Oxigeno Aire Oxigeno Óxido nitroso
TEMPERATURAS (°C) 1700 - 1900 2700 - 2800 2000 - 2100 2550 - 2700 2100 – 2400 3050 – 3150 2600 – 2800
VEL. COMBUSTIÓN (CM/S) 39 – 43 370 – 390 300 – 440 900 – 1400 158 – 266 1100 – 2480 285
En los análisis por EAA se utilizan diferentes combinaciones de gases para producir la reacción de combustión en el quemador, la llama producida por el mechero presenta una estructura en la cual se pueden identificar diferentes zonas (zona de combustión primaria, la región interconal y la zona de combustión secundaria). El aspecto y el tamaño de estas regiones varían considerablemente con la relación combustible-oxidante, así como con el tipo de combustible y oxidante. La zona de combustión primaria en una llama de hidrocarburos se reconoce por su coloración azul que proviene de los espectros de bandas de C 2, CH y otros radicales. En general, en esta zona no se alcanza el equilibrio térmico y por ello, esta zona rara vez se utiliza en la espectroscopia de llama. La región interconal, que es relativamente estrecha en llamas de hidrocarburo estequiométricas, puede alcanzar varios centímetros de altura con fuentes ricas en combustible de acetileno/oxigeno o acetileno/óxido nitroso. La zona es fuertemente rica en átomos libres y es la parte de la llama más ampliamente utilizada en espectroscopia. En la zona de combustión secundaria, los productos formados en la región interior se convierten en óxidos moleculares estables que se dispersan por los alrededores.
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Figura 15. Regiones de la llama en un quemador de premezclado o flujo laminar.
INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATÓMICA El equipo utilizado para realizar el análisis por espectroscopia por absorción atómica es el Espectrofotómetro de Absorción Atómica. Existen equipos de un solo haz y otros de doble haz. Los equipos más utilizados actualmente son los de doble haz que logran aumentar la estabilidad en el análisis. En este equipo de doble haz, la radiación emitida por una fuente es dividida por un modulador con espejos; este consiste de una pieza circular con secciones alternadas de espejo y partes huecas; esta pieza está girando, de manera que el haz de la fuente pasa alternadamente por el hueco del modulador y llega a la flama o choca con una sección del espejo del mismo y es reflejado. Estos dos haces son recombinados en un espejo especial (half-silvered mirror ) pasan a través de un monocromador y finalmente la señal es enviada por medio de un fotomultiplicador. Esta señal recibida por el sistema de lectura es la relación entre la señal de referencia y la señal de la muestra misma.
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Figura 16. Diagrama esquemático de un espectrofotómetro de absorción atómica de doble haz.
ANALISIS CUANTITATIVO POR (EAA) Los análisis cuantitativos realizados en espectroscopia de absorción atómica son muy semejantes a los realizados por espectroscopia UV/Visible. Para esto se prepara una serie de estándares y se hace una curva de calibración, con base a esta gráfica se determina la concentración de las soluciones problema. Otras técnicas aplicadas son:
Técnica de Adición de Estándar. Las propiedades físicas de la solución que se aspira al quemador-nebulizador deberán ser similares entre muestras problema y soluciones estándar, ya que de lo contrario la eficiencia en atomización de la solución será diferente y esto conducirá a resultados erróneos. Para evitar este posible efecto se utiliza la técnica de adición de estándar la cual consiste en agregar volúmenes iguales de solución problema a muestras estándar de concentración conocida, pero de diferente concentración al elemento a determinar.
Aplicaciones Típicas. La espectroscopia de absorción atómica es muy útil en la identificación de más de 70 elementos. También se pueden identificar metales en petróleos, fluidos biológicos, en el agua y en el aire.
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INTERFERENCIAS En los análisis por espectroscopia de absorción atómica se presentan interferencias espectrales como no espectrales, las más conocidas son:
Interferencia por dispersión de partículas. Cuando la solución aspirada hacia el quemador tiene un gran número de sólidos disueltos, es probable que se tenga interferencia por dispersión de partículas. Interferencia por traslapamiento de bandas moleculares. Ocurre cuando la matriz tiene cantidades grandes de compuestos moleculares sumamente complejos. Interferencia por Ionización. Cuando la temperatura de la flama es muy alta y el elemento pierde fácilmente uno o más de sus electrones más exteriores ocurre la ionización. Interferencias por volatilización del soluto. Cuando las sales formadas en el quemador son de carácter refractario, estas resisten la descomposición a átomos y entidades más simples si la temperatura no es lo suficientemente alta. La formación de entidades químicas de resistencia a la volatilización en flamas comunes originan interferencias, ya que no permiten que el analito sea atomizado eficientemente.
13.4 PROCEDIMIENTO
13.4.1 Preparación de las Soluciones: a) Solución patrón de Fe (200 ppm): Pesar 1,494 gramos de sulfato ferroso amónico hexa-hidratado (Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O). Adicionar en un vaso de precipitado con 50 mL de agua destilada, adicionar lentamente 20,0 ml de ácido sulfúrico concentrado (98%). Adicionar solución de permanganato de potasio (KMnO4) gota a gota hasta que persistió un color rosado pálido. Se transfirió cuantitativamente a un balón aforado de un litro y se enraso con agua destilada, se etiquetó y almacenó. b) Solución patrón de Mg (1000 ppm): Pesar 1,000 gramo de magnesio en cinta (que no esté oxidada en la superficie), adicionar en un vaso de precipitado con 50 mL de agua destilada, adicionar 1,0 mL de HCL [1:1], y transferir la solución a un matraz aforado de 1 litro, llevar hasta aforo con agua destilada, enrasar y etiquetar.
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c) Solución patrón de Fe (100 ppm): Transferir 125,0 mL de la solución madre de Fe (200 ppm) a un matraz de 250 mL, llevar hasta aforo con agua destilada, enrasar y etiquetar. d) Solución patrón de Mg (100 ppm): Transferir 25,0 mL de la solución madre de Mg (1000 ppm) a un matraz de 250 mL, llevar hasta aforo con agua destilada, enrasar y etiquetar.
13.4.2 Preparación de Patrones: Para el análisis de muestras por absorción atómica, se deben preparar los patrones para realizar la curva de calibración teniendo en cuenta el rango de trabajo para cada elemento. Para el análisis de Fe y Mg se trabaja con los siguientes rangos:
Muestra Fe Mg
Rango de trabajo 0,5 a 5 ppm 0,1 a 0,5 ppm
Teniendo en cuenta el rango de trabajo, preparar cinco patrones a partir de la solución patrón (100 ppm) de cada muestra Fe y Mg, en matraces aforados de 50,0 mL, utilizando las indicaciones de la Tabla 7:
Tabla 7. Preparación de los patrones para el análisis por absorción atómica. Patrones de hierro (Fe) Patrón (ppm) Sol. Patrón de Fe Sol. Patrón de Fe Volumen final (mL) 100 ppm (mL) 100 ppm (μL) 0,0 0,0 0,0 50,0 0,5 0,25 250 50,0 1,5 0,75 750 50,0 2,5 1,25 1250 50,0 3,5 1,75 1750 50,0 5,0 2,5 2500 50,0 Patrón (ppm) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Patrones de magnesio (Mg) Sol. Patrón de Mg Sol. Patrón de Mg 100 ppm (mL) 100 ppm (μL) 0,0 0,0 0,05 50 0,10 100 0,15 150 0,20 200 0,25 250 96
Volumen final (mL) 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0
13.4.3 Determinación: Nota: Antes de iniciar las determinaciones, se debe consultar el manual de funcionamiento del Espectrofotómetro de Absorción Atómica utilizado en el análisis. El manual contiene las especificaciones de los parámetros que le permiten al analista ajustar el equipo de acuerdo a las necesidades requeridas para el análisis de cada elemento.
Teniendo en cuenta las instrucciones del manual de funcionamiento del Espectrofotómetro de Absorción Atómica, se cuadra en el equipo, la lámpara de cátodo hueco que se debe utilizar, la longitud de onda de trabajo, el ancho de banda, la llama utilizada, entre otros ajustes, para las muestras de Fe y Mg, respectivamente.
Figura 17. Diagrama de flujo para un análisis por Absorción Atómica.
Ajustes del espectrómetro de Absorción Atómica para la muestra de Fe: Lámpara de cátodo hueco: lámpara de Fe Longitud de onda de trabajo ( ): 248,3 nm Ancho de banda: 0,2 nm Llama utilizada: Aire / Acetileno Llama oxidante Unidades de concentración: mg/L (ppm Fe) Reporte de los Datos: Absorbancia 97
Ajustes del espectrómetro de Absorción Atómica para la muestra de Mg:
Lámpara de cátodo hueco: lámpara de Mg Longitud de onda de trabajo ( ): 285,2 nm Ancho de banda: 0,2 nm Llama utilizada: Aire / Acetileno Llama oxidante Unidades de concentración: mg/L (ppm Mg) Reporte de los Datos: Absorbancia
Cuando se tengan preparados los patrones de Fe y Mg, y cuando el espectrómetro de Absorción Atómica se encuentre ajustado de acuerdo a las necesidades de cada metal, se miden las absorbancias de cada patrón y se construye la curva de calibración para cada metal. Se determina el coeficiente de correlación y se hace la curva de calibración entre la concentración de los patrones y la absorbancia medida por el equipo. Con los resultados obtenidos, se calcula la concentración de Fe y Mg en las muestras desconocidas.
13.5 CUESTIONARIO 1. Realizar la curva de calibración entre la Absorbancia vs Concentración de los patrones. 2. Determinar la concentración de hierro (Fe) en la muestra problema y expresar el resultado en ppm. 3. Determinar la concentración de Magnesio (Mg) en la muestra problema y expresar el resultado en ppm. 4. ¿Cuál es la importancia de la espectroscopia de absorción atómica en los diferentes campos de la química? 5. ¿Qué entiende por Nebulizador?
6. ¿Qué interferencias se pueden presentar en un análisis por espectroscopia de absorción atómica?
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7. El cobre se aísla de las muestras de tejido mediante digestión, tras la extracción de todo el tejido. La concentración de Cu en el sobrenadante se determina por EAA, utilizando una llama aire – acetileno. Una muestra de tejido seco y sin grasa, se digiere a 68 °C, durante 24 horas con 2 mL de HNO3 (0,75 M). El sobrenadante se pasa a un balón de 5 mL y se lleva hasta aforo con HNO3 (0,75 M), el cobre se analizó en un EAA a una = 324,8 nm. ¿Calcular la concentración de Cu expresada en μg Cu/g de tssg (tejido seco sin grasa), si se analiza una muestra de 0,01123 g de tssg cuya absorbancia es de A= 0,023? Concentración ppm de Cu
Absorbancia
0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500 0,600 0,700 1,000
0,000 0,006 0,013 0,020 0,026 0,033 0,039 0,046 0,066
13.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001. P 219
WALTON Harold F., REYES Jorge. “Análisis Químico e Instrumental Moderno”. Capítulo 8, Espectroscopia de Absorción Atómica. 1a ed. Editorial Reverté, S. A., España 1983. P 243
ROCHA Castro E. “Principios Básicos de Espectroscopia”. 1ª ed. Editorial UACh, México, 2000. P 140
RUBINSON Kenneth A., RUBINSON Judith F. “Análisis Instrumental”. Editorial Prentice Hall, 2000. P 303
99
SKOOG Douglas A., WEST D. M., HOLLER James, CROUCH Stanley R. “Fundamentos de Química Analítica”. 8a ed. Editorial Reverté, 1997. P 853
ROUESSAC Francis, ROUESSAC Annick. “CHEMICAL ANALYSIS, Modern Instrumentation Methods and Techniques”. Second Edition, Editorial WILEY 2007
PRUSHAN M. J. “Instrumental Analysis Manual”, LA SALLE UNIVERSITY. Atomic Absorption Analysis of Calcium in Milk. P 45
Universidad de Alicante, Servicios Técnicos de Investigación, “Espectroscopía de Absorción Atómica”, disponible en
UNAL, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Dirección Nacional de Servicios Académicos Virtuales. Contenidos en línea, Química Analítica II, Funcionamiento de un Espectrofotómetro de Absorción Atómica, disponible en
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PRÁCTICA N° 14 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC), DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CAFEÍNA EN BEBIDA GASEOSA
14.1 OBJETIVOS
Establecer los principios que rigen la cromatografía (HPLC). Comprender el manejo del equipo de cromatografía (HPLC) para analizar correctamente la muestra. Determinar el tiempo de retención para la cafeína bajo las condiciones de análisis. Hacer la curva de calibración para los patrones de cafeína. Determinar el contenido de cafeína en la muestra problema. Evaluar la importancia de la cromatografía (HPLC) en la actualidad.
14.2 MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES
REACTIVOS
5 Balones aforados de 50,00 mL 1 Balón aforados de 250,0 mL Vaso de precipitado de 50 mL Pipetas aforadas de 1, 10 y 20,0 mL Frasco lavador Pera de succión, varilla agitadora Micropipeta Equipo para (HPLC) y accesorios
Solución acuosa de cafeína 100 ppm Bebida gaseosa (Coca-Cola, Pepsi, u otra).
14.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS La cromatografía líquida de alta eficiencia es la técnica analítica e instrumental más utilizada en la actualidad para realizar separaciones químicas. La razón de la eficiencia de la técnica cromatografica resulta de la sensibilidad y cómoda adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles y, sobre todo, la aplicabilidad de la técnica a sustancias de gran interés para la industria.
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La cromatografía (HPLC) se encuadra dentro de la cromatografía de elución. En ésta, un líquido (fase móvil) circula íntimamente en contacto con un sólido u otro líquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir una mezcla de analitos en la corriente de la fase móvil, cada analito avanzara a lo largo del sistema con una velocidad diferente que dependerá de su afinidad por cada una de las fases. Cuando la mezcla termina su recorrido por la columna, cada uno de los analitos introducidos en el sistema eluirá con un tiempo diferente, es decir, los analitos estarán separados.
CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA Los diferentes tipos de cromatografía líquida se pueden clasificar en base a la naturaleza de la fase estacionaria, debido a que es ésta la que impone fundamentalmente el mecanismo de separación. Teniendo en cuenta la fase estacionaria, la cromatografía líquida se clasifica así:
Cromatografía de Adsorción (Líquido-Sólido):
La separación depende de la afinidad de la muestra hacia la fase sólida o líquida. Si la muestra es muy afín a la fase estacionaria (compuesta por partículas sólidas pequeñas) el tiempo de retención será mayor. El solvente utilizado se conoce como eluyente y también influye de manera importante en la separación; si la muestra es más afín a la fase líquida, los tiempos de retención serán más cortos. La selección de la fase móvil influye directamente en la separación de las muestras. Los solventes pueden ser de naturaleza orgánica o acuosa. La fase móvil debe tener algunas características como: - No debe alterar la naturaleza de la columna. - Debe disolver la muestra. - Debe ser de baja viscosidad. - Terminada la separación, debe permitir la recuperación del soluto de manera simple.
Cromatografía de Fase Normal:
Esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar que se utiliza cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorción aumenta con la polaridad del analito y la interacción entre en analito y fase estacionaria; esto incrementa el tiempo de elución. La fuerza de interacción depende no solo de los grupos funcionales, sino también de factores estéricos e isómeros estructurales. El uso de disolventes polares disminuye el tiempo de retención, mientras que disolventes hidrófobicos aumentan el tiempo de retención.
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Cromatografía de Fase Inversa:
Esta técnica es la más común, en la cual se utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil moderadamente polar. El principio básico de esta técnica está basado en las interacciones del disolvente polar, el analito no polar y la fase estacionaria no polar. Las características del analito son importantes para sus propiedades de retención. La adición de disolventes polares incrementan el tiempo de retención y añadir disolventes hidrofóbicos lo disminuyen.
Cromatografía de Intercambio Iónico:
Esta técnica se da cuando la fase estacionaria presenta en su superficie grupos ionizados capaces de retener selectivamente a iones del signo contrario que circulan en la fase móvil.
Figura 18. Comportamiento de las partículas en la cromatografía de intercambio iónico.
Cromatografía de Exclusión por Tamaño:
También conocida como cromatografía de gel permanente o cromatografía de gel filtrante. Esta técnica separa las partículas en función del tamaño. En una cromatografía de baja resolución y sirve para determinar estructuras terciarias y cuaternaria de proteínas, además permite averiguar el peso molecular de polímeros sintéticos y naturales.
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Figura 19. Comportamiento de las moléculas en la cromatografía de exclusión por tamaño.
INSTRUMENTACIÓN PARA CROMATOGRAFÍA (HPLC) Para realizar un análisis por cromatografía (HPLC), se necesita disponer de un equipo que le permita al analista obtener datos confiables que avalen la calidad del procedimiento. En la actualidad se dispone de equipos para (HPLC) modernos muy sensibles que generan resultados confiables. El equipo (HPLC) moderno se compone de cinco partes: un sistema de recipientes especiales para la fase móvil; un sistema de bombas encargado de mantener constante el flujo de la fase móvil; el sistema de inyección que permite introducir la muestra a trabajar; la columna que tiene la función de separar los componentes de la muestra y el sistema de detección de los solutos eluidos, el cual emite una señal que es transformada para que el analista la pueda comprender.
RECIPIENTES PARA LA FASE MÓVIL Los equipos para (HPLC) modernos se encuentran equipados con uno o más recipientes especiales de vidrio o de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene entre 200 y 1000 mL de un disolvente. Los recipientes son equipados con un sistema para eliminar los gases disueltos como oxígeno y nitrógeno, que interfieren considerablemente generando burbujas en las columnas y en los sistemas de detección.
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Las burbujas generadas provocan ensanchamientos de banda que interfieren en el funcionamiento del detector. Los desgasificadores son sistemas de purga que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Con frecuencia el equipo (HPLC) contiene un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en suspensión en los disolventes, para evitar que estas partículas dañen la bomba o los sistemas de inyección u obturen la columna. No todos los equipos (HPLC) cuentan con los desgasificadores, razón por la cual es conveniente tratar los disolventes antes de introducirlos en los recipientes especiales, la técnica utilizada se basa en filtrar al vacío a través de un filtro ( millipore) de tamaño de poro muy pequeño; este tratamiento elimina los gases, así como la materia en e n suspensión.
SISTEMA DE BOMBAS Los sistemas de bombeo en la cromatografía (HPLC) deben cumplir algunos requisitos muy rigurosos que se describen a continuación: -
Debe generar presiones por encima de 6.000 psi. Debe tener un flujo libre de pulsaciones. Debe generar un intervalo de caudales de 0,1 a 10 mL/minuto. El control y la reproducibilidad del caudal debe ser mejor del 0,5% relativo. Los componentes deben ser resistentes a la corrosión (juntas de acero inoxidable o teflón).
Las altas presiones que generan las bombas de (HPLC) no constituyen un riesgo de explosión, debido a que los líquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema sólo genera genera una pérdida de disolvente. Se utilizan tres tipos tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recíprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumáticas o de presión constante.
Bombas Recíprocas:
Las bombas recíprocas, se utilizan en aproximadamente el 90% de los equipos (HPLC) modernos. Tienen una pequeña cámara en la que el disolvente es empujado por el movimiento de vaivén de un pistón accionado accionado por un motor de arrastre. Dos válvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro.
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El disolvente está en contacto directo con el pistón; también se puede comunicar la presión al disolvente mediante un diafragma flexible, el cual a su vez se bombea hidráulicamente por un pistón de vaivén. Las bombas recíprocas presentan la desventaja de producir un flujo pulsado, que se ha de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la línea base del cromatograma. Entre las ventajas de las bombas recíprocas se puede mencionar su pequeño volumen interno (35 a 400 μL), sus altas presiones de salida, su su fácil adaptación a elución con gradiente, y sus caudales constantes, los cuales son independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad del disolvente.
Figura 20. Estructura interna de la Bomba Recíproca para (HPLC).
Bombas de Desplazamiento:
Las bombas de jeringa o desplazamiento consisten generalmente en unas grandes cámaras como una jeringa, equipadas con un émbolo que se activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante un motor paso a paso. Las bombas de desplazamiento también producen un flujo que tiende a ser independiente de d e la viscosidad y de la contrapresión. Además, el flujo que resulta está libre de pulsaciones. Esta bomba presenta desventajas que incluyen una capacidad limitada de disolvente (= 250 mL) y una notable incomodidad para el cambio de disolventes.
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Figura 21. Estructura interna de la Bomba de desplazamiento para (HPLC).
Bombas Neumáticas:
En las bombas neumáticas más simples, la fase móvil se encuentra en un recipiente plegable colocado en una vasija que puede presurizarse mediante gas comprimido. Las bombas de este tipo son económicas y están exentas de impulsos, aunque tienen una limitada capacidad y presión de salida, y además el caudal depende de la viscosidad del disolvente y de la contrapresión de la columna. Estas bombas no se pueden utilizar utilizar en la elución con gradiente y están limitadas a presiones menores de unos 2.000 psi.
SISTEMAS DE INYECCIÓN DE MUESTRA El análisis por cromatografía (HPLC) presenta limitaciones que afectan considerablemente la precisión de los resultados, el factor limitante en la precisión de las medidas es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se acentúa en el ensanchamiento de banda que acompaña a la la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños (de unas pocas décimas de microlitro a tal vez 500 μL). Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema. Actualmente el método utilizado para introducir la muestra en cromatografía (HPLC) es la utilización de bucles de muestra. Estos dispositivos son parte integrada del equipo cromatográfico y existen bucles intercambiables que permiten la elección de tamaños de muestra desde 5 a 500 μL. Con bucles bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 7.000 psi ps i con una precisión relativa de unas décimas por ciento.
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También existen válvulas de inyección de micromuestras, con bucles con volúmenes de 0,5 a 500 μL. Se observa como la jeringa llena el bucle y la fase móvil pasa de la bomba a la columna arrastrando la muestra para su posterior análisis.
Figura 22. Estructura de un bucle utilizado en cromatografía (HPLC).
COLUMNAS PARA CROMATOGRAFÍA (HPLC) Las columnas para cromatografía (HPLC), se construyen con tubos de acero inoxidable de diámetro interno uniforme, aunque en algunos equipos se encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. La mayoría de las columnas para cromatografía (HPLC) tienen una longitud entre 10 y 30 cm. El diámetro interno de las columnas (4 a 10 mm), y los tamaños de las partículas de los rellenos son de 5 o 10 μm. En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca delante de esta una pre-columna que elimina no sólo la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes sino también componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. La composición del relleno de la pre-columna debería ser semejante a la columna analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es mayor para minimizar la caída de presión. Cuando la pre-columna se contamina se vacía y se rellena de nuevo o se remplaza por otra nueva del mismo tipo; así la pre-columna se sacrifica para proteger a la columna analítica.
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En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, cuando se controla la temperatura de la columna en unas pocas décimas de grado centígrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayoría de los equipos (HPLC) actualmente contienen hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las décimas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 100 o 150 °C. Para controlar con precisión la temperatura, las columnas también se pueden colocar en camisas con agua que provengan de un baño a temperatura constante.
TIPOS DE RELLENOS PARA LA COLUMNA En la cromatografía (HPLC) se utilizan dos tipos básicos de rellenos para columnas, pelicular y de partícula porosa. El relleno pelicular consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos diámetros entre 30 y 40 μm. En la superficie de las bolas se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina, de una resina sintética de poliestireno-divinilbenceno o de una resina de intercambio iónico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria líquida que se mantiene fija por adsorción. Los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las pre-columnas y no en las columnas analíticas. Además de los rellenos peliculares, los rellenos de partículas porosas están conformados por micropartículas porosas con diámetros entre 3 y 10 μm y con la menor dispersión posible con respecto a un tamaño determinado. Las partículas son de sílice, alúmina, de una resina sintética de poliestireno-divinilbenceno o de una resina de intercambio iónico, aunque la sílice es el material de relleno más común en las columnas del equipo (HPLC), las partículas de sílice se preparan aglomerando partículas de sílice de tamaños inferiores al micrómetro en unas condiciones tales que se formen partículas mayores con diámetros muy uniformes. Las partículas que resultan se recubren con películas orgánicas, que se unen química o físicamente a la superficie.
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Figura 23. Partes de la columna para cromatografía (HPLC)
DETECTORES PARA CROMATOGRAFÍA (HPLC) Los detectores para cromatografía (HPLC) son de dos tipos básicos. Los detectores que se basan en la medida de una propiedad de la disolución responden a una propiedad del efluente, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por lo contrario, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia en el UV, fluorescencia o corriente límite, que no son inherentes a la fase móvil.
DETECTORES DE ABSORBANCIA Los detectores de absorbancia son muy utilizados en los análisis de compuestos orgánicos, debido a la sensibilidad y precisión de los resultados. La mayoría de detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su intensidad; para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoeléctricos contrastados. El detector genera un cromatograma, que consiste en una representación del logaritmo del cociente de las dos señales detectadas en función del tiempo. Algunos tipos de detectores de absorbancia son:
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Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros: Los detectores de absorción UV más simples son los fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio como fuente. Lo más común en estos casos es aislar la línea intensa a 254 nm por medio de filtros; por otra parte las fuentes de deuterio o de filamento de wolframio con filtros de interferencia también proporcionan una forma sencilla de detectar las especies absorbentes que eluyen de una columna. Algunos equipos modernos se equipan con discos porta-filtros que contienen varios filtros que pueden intercambiarse rápidamente para la detección de distintas especies a medida que eluyen. Estos dispositivos son utilizados en la repetición de los análisis cuantitativos cuando se conoce la composición cualitativa de la muestra, de tal forma que se puede elegir una secuencia de filtros apropiados.
Detectores de absorbancia ultravioleta con monocromadores: La mayoría de los fabricantes de equipos (HPLC) ofrecen detectores que consisten en un espectrofotómetro de barrido con una red entre sus componentes ópticos. Algunos se limitan a la radiación ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiación ultravioleta y la visible. Se pueden elegir varios modos operacionales, donde se puede obtener el cromatograma completo a una sola longitud de onda o alternativamente, cuando los picos que eluyen están suficientemente separados en el tiempo, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico. Cuando se desean los espectros completos con fines de identificación, se puede parar el flujo del eluyente durante un tiempo suficiente que permita el barrido de longitudes de onda de la región de interés.
Figura 24. Estructura de la celda del detector ultravioleta en cromatografía (HPLC).
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Las bebidas refrescantes como las gaseosas son refrescos saborizados, efervescentes sin alcohol, que son consumidas por miles de personas alrededor del mundo. La gaseosas presentan entre su composición agua, azúcar, edulcorantes, ácidos (fosfórico, cítrico, málico, tartárico), colorantes, saborizantes, CO2, conservantes y cafeína. La cafeína es un estimulante del sistema nervioso central relativamente débil, tiene efecto diurético y estimulante del miocardio. El consumo de cafeína relaja los músculos lisos, favorece la vasodilatación, contrae las arterias cerebrales, aumenta la secreción acida del estómago y potencia la contracción del musculo esquelético. La ingesta oral de cafeína en el cuerpo puede ocasionar daños si no se controla la cantidad ingerida; si se ingieren 200 mg de cafeína al día, se puede elevar el humor, causar insomnio, aumentar la irritabilidad, inducir ansiedad y disminuir el cansancio. Por otra parte si se ingieren cantidades superiores a 200 mg, puede causar intoxicación en el cuerpo, que se manifiesta con nerviosismo, insomnio, hiperacidez gástrica, contracciones musculares, confusión y arritmia cardiaca. Debido a los problemas que puede llegar a ocasionar el consumo de cantidades elevadas de cafeína en el cuerpo humano, el análisis de cafeína en las diferentes bebidas refrescantes ofrecidas por las grandes empresas, permiten a los consumidores conocer si el producto es seguro y se encuentra enmarcado dentro de los estándares de calidad que rigen los entes de salud del estado, que controlan la calidad de los productos de consumo humano. La técnica analítica e instrumental más utilizada por los grandes laboratorios de todo el mundo para determinar la cantidad de cafeína es la cromatografía (HPLC), esta técnica representa para los laboratorios una herramienta confiable y precisa, que le permite al analista tener criterio sobre la muestra analizada.
14.4 PROCEDIMIENTO 14.4.1 Preparación de las Soluciones: a) Solución acuosa de cafeína (100 ppm): Pesar 0,0250 g de cafeína y adicionarlo en un vaso de precipitado con 50 mL de agua grado HPLC, agitar vigorosamente hasta disolución, posteriormente transferir la solución en un balón de 250 mL y llevar hasta aforo con agua grado HPLC. b) Preparación de la Bebida Refrescante: Tomar 50 mL de la bebida y transferir a un vaso de precipitado, agitar vigorosamente hasta eliminar las burbujas y dejar reposar por 15 minutos. Nota: La muestra diluida será preparada con solventes grado HPLC y filtrada antes del análisis.
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14.4.2 Preparación de patrones para el análisis: Preparar las soluciones patrón de cafeína de 1, 10, 20, 30, 40 ppm a partir de la solución acuosa de 100 ppm
Tabla 8. Preparación de los patrones de cafeína (HPLC) para realizar la curva de calibración. N° Patrón
V solución patrón de cafeína 100 ppm
Volumen final en mL
Concentración final (ppm)
1 2 3 4 5
0,5 mL 5 mL 10 mL 15 mL 20 mL
50,0 50,0 50,0 50,0 50,0
1 10 20 30 40
14.4.3 Determinación: Cuando se tienen preparados los patrones de cafeína y la muestra problema, se realizan los ajustes respectivos del equipo (HPLC) para el análisis:
Antes de operar el equipo de HPLC se debe leer el manual de funcionamiento y tener la instrucción por el encargado del equipo, para tener una idea clara de los procedimientos a realizar. Si se tiene conocimiento de la muestra que se desea analizar, ajustar la longitud de onda de detección, de lo contrario analizar un patrón para identificarla.
Ajustes del equipo (HPLC) para el análisis de cafeína:
Longitud de onda de detección: 273 nm Detector (absorción) Columna Disolvente: H2O grado HPLC Fase móvil: 70% H2O, 30% CH3OH Flujo: 1 mL/minuto Volumen inyección de la muestra: 5 μL Tiempo de retención: 4,090 minutos.
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Cuando se termine de ajustar el equipo (HPLC), se inyectan los patrones de cafeína preparados y se procede a elaborar la curva de calibración entre la concentración del patrón y el área del pico de absorción generado por el equipo. La muestra problema se trata de igual forma, inyectando la muestra en el equipo y realizando el análisis, con base en la información del área y altura del pico de máxima absorción generado, determinar la concentración de cafeína en la muestra problema.
14.5 CUESTIONARIO 1. Realizar la curva de calibración entre el área del pico de máxima absorción vs Concentración de los patrones de cafeína. 2. Determinar la concentración de cafeína en la muestra problema y expresar el resultado en ppm. 3. Obtener el cromatograma de la muestra de cafeína en bebida refrescante y explicar el pico obtenido. 4. ¿Cuál es la importancia de la cromatografía (HPLC) en los diferentes campos de la química? 5. ¿Qué se entiende por Cromatograma? 6. ¿Qué interferencias se pueden presentar en un análisis por cromatografía (HPLC)?
14.6EFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001. P 786
WALTON Harold F., REYES Jorge. “Análisis Químico e Instrumental Moderno”. Capítulo 9, Cromatografía. 1a ed. Editorial Reverté, S. A., España 1983. P 270
RUBINSON Kenneth A., RUBINSON Judith F. “Análisis Instrumental”. Capítulo 14, Cromatografía Líquida. Editorial Prentice Hall, 2000. P 636
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SKOOG Douglas A., WEST D. M., HOLLER James, CROUCH Stanley R. “Fundamentos de Química Analítica”. 8a Edición. Editorial Reverté, 1997. P 985
PRUSHAN M. J. “Instrumental Analysis Manual”, LA SALLE UNIVERSITY. Atomic Absorption Analysis of Calcium in Milk. P 45
FLORIDA INTERNATIONAL UNIVERSITY, Laboratory Manual “Instrumental Analysis Laboratory”. Department of Chemistry and Biochemistry, Spring 2007.
PRYDE A. and GILBERT M. T. “Applications of High Performance Liquid Chromatography”. Kluwer, the language of science. London, 1979.
ROUESSAC Francis, ROUESSAC Annick. “CHEMICAL ANALYSIS, Modern Instrumentation Methods and Techniques”. Second Edition, Editorial WILEY 2007
Cromatografía Líquida de alta eficiencia, Equipos para análisis (HPLC), Agilent Technologies. disponible en
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PRÁCTICA N° 15 CROMATOGRAFÍA DE GASES, ANÁLISIS DE UNA MEZCLA DE HIDROCARBUROS
15.1 OBJETIVOS
Establecer los principios que rigen la cromatografía de gases. Conocer los componentes de un equipo para cromatografía de gases. Comprender el manejo del equipo de cromatografía de gases para analizar mezclas. Obtener el cromatograma de la mezcla de sustancias. Analizar el cromatograma de la mezcla e identificar sus componentes mediante los tiempos de retención. (HICE CAMBIOS)
15.2 MATERIALES Y REACTIVOS MATERIALES
REACTIVOS
Matraces aforados de 100 y 50,00 mL Vaso de precipitado de 250 mL Pipetas aforadas y graduadas Micro-pipeta (μL) Equipo para cromatografía de gases con detector de ionización de llama (FID), y software Clarity Lite
Solución patrón de Tolueno Solución patrón de Isooctano Solución patrón de Ciclohexano Solución patrón de n-heptano Solución patrón de Acetato de etilo Mezcla problema Diclorometano
15.3 FUNDAMENTOS TEÓRICOS En cromatografía de gases (GC), la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte. La fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna cromatográfica. Existen dos tipos de cromatografía de gases:
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La cromatografía gas-sólido (GSC): Se produce la retención de los analitos en una fase estacionaria sólida como consecuencia de la adsorción física. La cromatografía gas-sólido ha tenido una aplicación limitada debido a la retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos de elución con colas muy significativas (como consecuencia del carácter no lineal del proceso de adsorción), de modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular.
La cromatografía gas-líquido (GC): Se basa en el efecto de separación cuando una mezcla gaseosa en un gas portador, pasa a ritmo uniforme sobre o a través de una fase liquida que está extendida sobre un sólido, en forma tal, que ofrece una superficie líquida muy elevada en un volumen pequeño. Como resultado de la solubilidad selectiva en la fase líquida estacionaria, los constituyentes de la mezcla se mueven a través de la columna por medio del gas portador, a diferentes velocidades y tienden a separarse en bandas distintas. El gas seleccionado como portador es siempre una substancia como el helio o el nitrógeno, que no puede ser retenido apreciablemente por el líquido.
INSTRUMENACIÓN PARA CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC) La cromatografía de gases (GC), se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases, el cual consta de diversos componentes como el gas portador, el sistema de inyección de la muestra, la columna (generalmente dentro de un horno) y el detector. Este equipo básicamente presenta módulos ensamblados que deben: Proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase móvil). Permitir la introducción de los vapores de la muestra en la corriente del gas que fluye. Contener la longitud apropiada de fase estacionaria. Mantener la columna a la temperatura apropiada. Detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna Proveer una señal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente.
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Figura 25. Estructura interna del equipo para cromatografía de gases (gas portador, sistema de inyección, columna y detector).
GAS PORTADOR Entre los gases portadores, que deben ser químicamente inertes, para prevenir su reacción con el analito o la columna. Generalmente se emplean gases como el helio, el nitrógeno, hidrogeno, argón y dióxido de carbono, y la elección de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado. Con el suministro del gas se encuentran asociados los reguladores de presión, manómetros y medidores de caudal. Además, el sistema de gas portador contiene un tamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmente mediante un regulador de presión de dos niveles colocados en el cilindro del gas, y algún tipo de regulador de presión o regulador de flujo instalado en el cromatógrafo (GC). Las presiones de entrada varían entre 10 y 25 psi, lo que da lugar a caudales de 25 a 150 mL/minuto (en columnas de relleno) y de 1 a 25 mL/minuto (en columnas capilares). Para comprobar el caudal se puede utilizar un rotámetro o un simple medidor de pompas de jabón, el cual da una medida exacta del caudal volumétrico que entra a la columna.
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SISTEMA DE INYECCIÓN DE MUESTRA La inyección de la muestra en cromatografía de gases es un apartado crítico, ya que se debe inyectar una cantidad adecuada y debe introducirse de tal forma (como un “tapón de vapor”) que sea rápida para evitar el ensanchamiento de las bandas de salida; este efecto se da con cantidades elevadas de analito. El método más utilizado actualmente emplea una microjeringa (de varios microlitros de capacidad) para introducir el analito en una cámara de vaporización instantánea. Esta cámara debe estar a 50 °C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil, y está sellada por una junta de goma o de silicona ( septa o septum). Para las columnas analíticas ordinarias, el tamaño de la muestra varía desde unas pocas décimas de microlitro a 20 μL. Las columnas capilares exigen muestras mucho menores; en estos casos se emplea un sistema divisor de la muestra que permite pasar a la cabeza de la columna solamente una pequeña fracción de muestra, desechándose el resto.
Figura 26. Sección transversal de un inyector de vaporización instantánea.
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CONFIGURACION DE LA COLUMNA Y DEL HORNO PARA LA COLUMNA En la cromatografía de gases (GC) se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno y la tabulares abiertas o capilares. Las columnas capilares son las más utilizadas debido a su mayor rapidez y eficiencia. Las columnas capilares, son de dos tipos básicos, denominados columna abierta de pared recubierta (WCOT ) y columna abierta recubierta con soporte (SCOT ). Las columnas abiertas de pared recubierta son simplemente capilares con la pared interna recubierta de una fina capa de fase estacionaria. En las columnas abiertas de soporte recubierto, la superficie interna del capilar esta revestida de una capa delgada de un material de soporte, tal como tierra de diatomeas. La longitud de estas columnas es variables, de 2 a 50 metros, y están construidas en acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón. Debido a su longitud y a la necesidad de ser introducidas en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma helicoidal con diámetros de 10 a 30 cm, dependiendo del tamaño del horno. La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separación de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisión de décimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de ebullición del analito o analitos, y por lo general se ajusta un valor igual o ligeramente superior para él. Para estos valores, el tiempo de elución va a oscilar entre 2 y 40 minutos. Si se tienen varios componentes con diferentes puntos de ebullición, se ajusta la llamada rampa de temperaturas con lo cual ésta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas; en muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la elución, pero conforme la temperatura es mayor la elución es más rápida, pero corriendo el riesgo de descomponer el analito.
Figura 27. Columnas utilizadas en cromatografía de gases (GC).
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SISTEMA DE DETECCIÓN (DETECTOR) El detector es la parte del cromatógrafo que se encarga de determinar cuándo ha salido el analito por el final de la columna. Las características de un detector ideal son:
Adecuada sensibilidad, es necesario que pueda determinar con precisión cuándo sale analito o cuando sale sólo el gas portador. Tienen sensibilidades entre 10-8 y 10-15 g/s de analito. Buena estabilidad y reproducibilidad. Respuesta lineal para los solutos que se extiende a varias órdenes de magnitud. Intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta 400 °C. Tiempo de respuesta corto que sea independiente del caudal. Alta fiabilidad y manejo sencillo, o a prueba de operadores inexpertos. Respuesta semejante para todos los analitos, o respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido número de analitos. No debe destruir la muestra.
DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA (FID) El detector de ionización de llama (FID) es uno de los detectores más versátiles y utilizados en cromatografía de gases. Se compone de un quemador de hidrogeno/oxígeno, donde se mezcla el efluente de la columna (gas portador y analito) con hidrogeno. Inmediatamente, este gas mezclado se enciende mediante una chispa eléctrica, produciéndose una llama de alta temperatura. La mayoría de compuestos orgánicos al someterse a altas temperaturas pirolizan y se producen iones y electrones, que pueden conducir la electricidad a través de la llama. Este hecho se aprovecha estableciendo una diferencia de potencial de unos cientos de voltios entre la parte inferior del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama. La corriente generada es baja (del orden de los 10-12 A), por lo cual debe ser amplificada por medio de un amplificador de alta impedancia. El proceso de ionización que se da en la llama es complejo, pero se puede aproximar el número de iones producidos al número de átomos de carbono reducidos en la llama. El detector de ionización de llama responde al número de átomos de carbono que entra en el detector por unidad de tiempo, por ello, es más un detector sensible a la masa, que un sistema sensible a la concentración.
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Existen algunos grupos funcionales, tales como carbonilo, alcohol, halógeno y amina, originan en la llama pocos iones o prácticamente ninguno. Además, el detector es insensible a los gases no combustibles como H2O, CO2, SO 2. Estas propiedades hacen del FID uno de los detectores más utilizados para el análisis de la mayoría de compuestos orgánicos, incluyendo aquellos que están contaminados con agua y con óxidos de nitrógeno y de azufre. La insensibilidad del FID hacia el agua le permite ser muy útil en la detección de contaminantes en muestras naturales de agua.
Figura 28. Representación estructural de un detector de ionización de llama (FID).
DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD TÉRMICA (TCD) Se basa en los cambios en la conductividad térmica de la corriente de gas ocasionados por la presencia de las moléculas del analito. Este dispositivo se denomina, a veces, catarómetro, el cual presenta un sensor que consiste en un elemento calentado eléctricamente cuya temperatura, a una potencia eléctrica constante, depende de la conductividad térmica del gas circundante.
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El elemento calentado puede ser un hilo fino de platino, oro, wolframio o también, un termistor [ ] semiconductor. La resistencia del hilo o del termistor tiene un coeficiente de temperatura negativo. Para la configuración de los componentes del detector se emplean dos pares de elementos, uno de los pares se coloca en el flujo del efluente de la columna, y el otro en la corriente de gas previo a la cámara de inyección de la muestra. 2
Figura 29. Representación estructural del detector de conductividad térmica (TCD).
OTROS DETECTORES UTILIZADOS EN CROMATOGRAFÍA DE GASES Además de los detectores de ionización de llama (FID) y el detector de conductividad térmica, que son ampliamente utilizados en la actualidad, existen otros detectores como:
Detectores de quimioluminiscencia del azufre (SCD): Se basa en la reacción entre ciertos compuestos azufrados y el ozono. La intensidad de fluorescencia resultante es proporcional a la concentración de azufre. En este detector el eluyente se mezcla con hidrogeno y aire, para luego mezclarse con el ozono y medir la intensidad de emisión resultante.
Un termistor es un sensor resistivo de temperatura; su funcionamiento se basa en la variación de resistencia eléctrica que presenta un semiconductor con la temperatura. 2
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Detector de captura de electrones (ECD): El efluente de la columna pasa sobre un emisor (níquel-63), un electrón del emisor provoca la ionización del gas portador (con frecuencia nitrógeno) y la producción de una ráfaga de electrones. De este proceso de ionización, en ausencia de especies orgánicas, resulta una corriente constante entre un par de electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye significativamente en presencia de moléculas orgánicas que tienden a capturar electrones. El detector de captura de electrones es de respuesta selectiva, siendo muy sensible a las moléculas que contienen grupos funcionales electronegativos tales como halógenos, peróxidos, quinonas y grupos nitro. El detector de captura de electrones es ampliamente utilizado para el análisis de muestras medioambientales, como el caso de los pesticidas y herbicidas.
Detector de emisión atómica (AED): El efluente se introduce en un plasma de helio obtenido con microondas, que se acopla a un espectrómetro óptico de emisión de diodos en serie. El plasma es suficientemente energético como para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarles, y así obtener sus espectros de emisión atómica característicos.
LA FASE ESTACIONARIA Las propiedades deseables para una fase líquida inmovilizada en una columna para cromatografía de gases comprenden: -
Baja volatilidad, el punto de ebullición de la fase estacionaria debe ser al menos 100°C mayor que la máxima temperatura alcanzada en el horno. Estabilidad térmica, para evitar su descomposición durante la elución. Baja reactividad. Características de disolventes.
Existen diferentes disolventes con características ideales, para elegir uno, se debe tener en cuenta la polaridad del analito, ya que a mayor polaridad del analito, mayor polaridad deberá tener la fase estacionaria. Algunas fases estacionarias utilizadas actualmente son: Polidimetilsiloxano, fase no polar de uso general para hidrocarburos, aromáticos, drogas, esteroides, entre otras. Poli (fenilmetidifenil) siloxano (10% fenilo), para esteres metílicos de ácidos grasos, alcaloides, drogas y compuestos halogenados. Poli (fenilmetil) siloxano (50% fenilo), para drogas, esteroides, pesticidas y glicoles.
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Poli (trifluoropropildimetil) siloxano, para aromáticos clorados, nitroaromáticos, bencenos alquilsustituidos. Polietilenglicol, para compuestos como glicoles, alcoholes, éteres, aceites esenciales. Poli (dicianoalildimetil) siloxano, para ácidos graos poliinsaturados, ácidos libres y alcoholes.
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC) La cromatografía de gases es una de las técnicas instrumentales de separación más eficaces que se conocen actualmente; cada componente de una muestra suministra tres unidades de información: posición, altura y anchura de los picos en el cromatograma. La posición, un solo parámetro expresado como dato de retención, suministra la información cualitativa y los otros proporcionan la información cuantitativa.
Análisis Cualitativo: Se basa en los tiempos de retención generados en el cromatograma por las sustancias contenidas en una muestra. Es un medio excelente para confirmar la presencia o ausencia de un supuesto componente en una mezcla, siempre que se disponga de un patrón. Tras la adición del compuesto conocido a la muestra, el cromatograma no debe presentar ningún pico nuevo, y debe observarse el aumento de alguno de los picos ya existentes.
Análisis Cuantitativo: Se basa en la comparación del área o altura del pico del componente de interés con la de estándares de esta sustancia de concentración conocida. En los análisis basados en altura de pico se requiere que la anchura de los picos no sufra modificaciones durante el tiempo necesario para obtener los cromatogramas de la muestra y los estándares para obtener resultados exactos. Por ello es mejor el análisis basado en el área del pico, parámetro independiente de los efectos de ensanchamiento.
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15.4 PROCEDIMIENTO 15.4.1 Preparación de las Soluciones Patrón: Realizar los cálculos necesarios para preparar las soluciones patrón de (tolueno, isooctano, n-heptano, acetato de etilo y ciclohexano) componentes de la mezcla problema, para identificar cada componente en el cromatograma teniendo en cuenta el tiempo de retención para cada sustancia.
15.4.2 Determinación: Cuando se tengan preparadas las soluciones patrón y la muestra problema, se realizan los ajustes respectivos del equipo para cromatografía de gases (GC):
Antes de operar el equipo de cromatografía de gases (GC) se debe leer el manual de funcionamiento y recibir la instrucción por parte del encargado de su uso y mantenimiento. La mezcla problema se encuentra disuelta en diclorometano. Inyectar la muestra problema (mezcla de hidrocarburos), en el equipo de cromatografía de gases y obtener el cromatograma de la muestra. Inyectar cada solución patrón en el equipo de cromatografía de gases y obtener el cromatograma de cada uno. Basándose en los tiempos de retención obtenidos en los cromatogramas de las soluciones patrón, identificar los picos generados por el cromatograma de la muestra problema (mezcla de hidrocarburos).
Ajustes del equipo de Cromatografía de gases (GC) para el análisis:
Equipo de cromatografía de gases Gas portador: Argón Columna: Polar Fase estacionaria: 5% Fenilmetilcilicona o Poli (fenilmetil) siloxano Detector: ionización de llama (FID) Temperatura Horno: 1 min 30°C; 3 min 40°C; 5 - 15 min 90°C. Solvente: Diclorometano Volumen inyección de la muestra: 1 μL
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15.5 CUESTIONARIO
1. Analizar el cromatograma de la muestra problema (mezcla de hidrocarburos) y evaluar los tiempos de retención de los componentes de la mezcla. 2. Analizar los cromatogramas generados por los patrones individuales e identificar los componentes de la muestra problema basándose en los tiempos de retención. 3. ¿Cuál es la importancia de la cromatografía de gases (GC) en la industria? 4. ¿Qué entiende por adsorción y absorción? 5. ¿Qué interferencias se pueden presentar en un análisis por cromatografía de gases (GC)? 6. Las columnas para cromatografía de gases están revestidas por una delgada capa con un material de soporte conocido como tierra de diatomeas. ¿Qué materiales de soporte son conocidos actualmente?
15.6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG, Douglas A., HOLLER James, NIEMAN T. A. “Principios del Análisis Instrumental”. 5ª ed. Editorial McGraw Hill, 2001. P 219
WALTON Harold F., REYES Jorge. “Análisis Químico e Instrumental Moderno”. Capítulo 12, Cromatografía de gases. 1a ed. Editorial Reverté, S. A., España, 1983. P 348
RUBINSON Kenneth A., RUBINSON Judith F. “Análisis Instrumental”. Editorial Prentice Hall, 2000. P 680
VALCÁRCEL Cases M., GÓMEZ Hens A. “Técnicas Analíticas de Separación”. Capítulo 19, Cromatografía de gases. 1a ed. Editorial Reverté, S. A., Barcelona, 1988.
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