PENDAHULUAN Spektroskopi massa adalah metode analitik yang sangat ‘ powerfull powerfull ’ bagi para kimiawan karena dapat menjawab banyak sekali kebutuhan dan interest orang orang kimia. Spektroskopi massa dapat memberikan analisis sampai ke tingkat struktur molekul, bahkan sampai pada tingkat memetakan mekanisme reaksi secara tidak langsung. Karena itu spektroskopi massa merupakan metode analisis yang dapat diandalkan oleh para peneliti kimia. Metode spektroskopi massa secara umum adalah cara analisis senyawa kimia yang diteliti dengan memecahkan molekulnya menjadi ion-ion besar maupun kecil, dan dari pola-pola ionisasi ini nantinya akan didapat informasi mengenai molekul utuhnya. Molekul yang masuk dalam spectrometer massa harus senyawa murni, bukan campuran. Karena itu beberapa langkah pemisahan kimia sudah harus selesai dilakukan. Spektroskopi massa sering digabung dengan kromatografi, karena sampai saat ini pemisahan senyawa kimia dengan kromatografi sudah sangat sempurna sehingga analisis senyawa-senyawa yang terpisah ini dapat dilakukan langsung. GC-MS atau LC-MS merupakan paduan yang sering digunakan pengguna kimia analisis pada umumnya. Spektroskopi massa memberikan informasi berdasarkan perbandingan massa per muatannya (m/z). sampel senyawa kimia yang dianalisis dalam jumlah relative sangat kecil, yakni orde microgram (µg) dan biasanya mencapai 5µg. Senyawa kimia akan diubah fasanya menjadi gas dan dipecah-pecah menjadi ion-ion dengan massa relative lebih rendah. Pemecahan senyawa-senyawa kimia ini dilakukan dengan menembak senyawa-senyawa kimia tersebut dengan electron yang benenergi cukup tinggi ( sedikitnya 70 eV, setara dengan 1610 kkal/mol atau 6720 kJ/mol). Ion-ion ini akan bergerak dalam medan listrik dan medan magnet dengan kecepatan sesuai dengan massanya sebelum mencapai detector.. Dari pola pola-pola pecahan senyawa serta ion-ion ini struktur senyawa sampel dapat diprediksi.
Hasil analisis analisis dengan
spektroskopi massa dikenal dengan spektrum massa disingkat dengan MS (mass (mass spectrum) spectrum) dan bila jamak disebut dengan spektra massa. Sejak awal mula ditemukan bahwa ion-ion dapat dibelokkan oleh medan magnet oleh wien pada tahun 1898, maka dimulai penyelidikan mengenai pemisahan ion-ion yang berasal dari senyawa. Ternyata ion-ion dapat dipisahkan menurut massanya dari sifatnya yang bisa
dibelokkan oleh medan magnet. Kemudian spektroskopi massa pertama diarahkan pada pembuktian adanya isotop dari beberapa unsur seperti karbon, hidrogen, klor dan oksigen serta perhitungan kelimpahannya di alam. Metode-metode ionisasi juga mengalamipwerkembangan menjadi lebih sempurna dari waktu ke waktu. Metode spektroskopi massa berkembang dengan komponen-komponen yang memberikan kinerja baik, pemisahan ion semakin sempurna dalam analisis/pemisahan ion, sampai pada metode pembuatan ion spesifik untuk senyawa-senyawa baru. Teknik spektrometri tandem (MS digabung dengan MS lagi untuk mencari informasi lebih detil dalam banyak aspek) yang diawali pada tahun 1970-an membuat analisis campuran kompleks dimungkinkan dengan akurasi yang memadai. Terutama ketika transformasi fourier diterapkan pada metode ini, hasil yang didapat menjadi lebih mudah dibaca dan waktu yang dibutuhkan menjadi lebih efisien. Di era 80-an sumber ionisasi untuk senyawa berberat molekul besar ditemukan, dan memungkinkan metode ini digunakan untuk analisis senyawa-senyawa biokimia yang berberat molekul besar.
Instrumentasi
Spektroskopi massa merupakan instrumentasi modern yang dapat digunakan untuk memberikan informasi berdasarkan perbandingan massa per muatannya. Spetroskopi massa setidaknya memiliki 4 komponen yang paling utama yaitu inlet, ruang pengion, analis massa, dan detektor.
1. Inlet
Inlet merupakan bagian dari spektrometer massa yang membantu aplikasi sampel ke dalam ruang pengion. Biasanya spektometer massa yang baik dilengkapi dengan paling sedikit tiga tipe sistem inlet yang bisa membantu memasukkan sampel ke ruang pengion. Ketiga jenis inlett ini adalah inlet
“batch”
yang memasukkan sampel dengan cara biasa, inlet
langsung (direct probe inlet ), dan yang paling modern adalah inlet kromatografi. Metode memasukkan sampel dipilih berdasarkan sifat kimia dan fisika dari sampel dan juga bergantung pada metode ionisasi yang dipilih. Dalam sistem inlet
“batch”
sampel dipanaskan diluar kemudian dialirkan masuk ke
ruang pengion. Sistem ini dapat dijalankan sampai temperatur ratusan derajat celcius untuk sampel-sampel cait
Inlet langsung (direct probe inlet ) digunakan untuk memasukkan sampel padatan atau sampel yang tidak mudah menguap seperti karbohidrat, steroid, senyawa organologam , juga bahan-bahan polimerik yang berberat molekul rendah. Sampel dibawa masuk ke dalam ruang pengion dengan sebuah holder yang dapat dimasukkan ke dalam ruang pengion melewati daerah vakum. Sistem vakum dirancang juga untuk membatasi masuknya udara yang tersedot kedalam pada saat dimasukkan. Dalam spektrometer modern, kromatografi kerja tinggi (biassanya HPLC atau GC) digunakan sebagai sistem inlet. Penggabungan ini sangat menguntungkan karena pemisahan dan penentuan sampel telah dilakukan sebelum analisis dengan spektroskopi massa. Dengan demikian campuran yang kompleks dapat diketahui dan hasil spektrum massa lebih jelas lagi. Walaupun demikian untuk menggabungkan sistem kromatografi dengan spektroskopi massa memerlukan beberapa peralatan yang menjembatani kedua instrumentasi. Kolom kapiler dari kromatografi dapat dimasukkan langsung ke kamar ionisasi dari spektrometer massa, namun gas pembawa harus dipompa keluar ahulu dan molekul analit dibiarkan masuk.
2. Ruang Pengion
Sampel yang akan dianalisis dimasukkan pada tempat pengionan dalam alat spektroskopi massa. Sampel dapat berupa gas, padatan, dan larutan sesuai dengan wujud sampel dan teknik ionisasi yang dipilih. Beberapa teknik ionisasi yang lazim dilakukan akan dibahas berikut ini. 1. Tumbukan Elektron (Electron Impact/EI) Dalam ruang pengionan, uap sampel ditumbuk dengan elektron berenergi tinggi (70 ev). Energi yang diserap molekul sampel akan mendorong pelepasan/ pengionan elektron dari orbital ikatan dan orbital anti-ikatan. Energi ditransfer kearah pembentukan ion melalui proses tumbukan seperti terlihat pada persamaan reaksi berikut : A-B-C
+
-
e
→
A-B-C
+
-
+ 2e
Metode ini banyak digunakan untuk sampel yang volatil dan stabil pada temperatur tinggi. Sacara umum, spektroskopi massa dengan metode tumbukan elektron yang
menghasilkan ion positif (kation) lebih disukai dibandingkan yang menghasilkan ion negatif (anion). Selain itu, literatur dengan pola-pola fragmentasi ion positif sebagai referensi telah banyak dipublikasikan.
2. Electrospray Ionisation (ESI) Suatu larutan disemprotkan melalui pipa berdiameter sangat kecil kedalam ruang vakum dengan medan listrik bergradient beberapa ratus hingga ribuan volt per centimeter, menghasilkan ion gas dari solut. ESI merupakan tehnik MS yang mampu menghasilkan fraksi besar dari fragmen-fragmen molekul organik atau analit biologis. Karena MS mengukur rasio massa terhadap muatan ion, metode ini memberikan keuntungan dalam menganalisa massa yang sangat tinggi tanpa perlu instrument analisis massa yang khusus. Sebagai contoh, suatu ion dengan massa 120.000 dalton membawa 60 muatan positif muncul pada 2000 massa per muatan. Metode ini telah digunakan untuk mengukur massa ion dari molekul hingga 200.000 dalton, seperti protein. 3. Chemical Ionization (CI) +
-
Ion yang akan dianalisa diproduksi melalui transfer suatu partikel (H , H , dan lebih berat) hasil pengionan suatu reaktan berupa gas yang lebih berat ke dalam sampel. Umumnya reaktan yang digunakan adalah gas metana pada tekanan 0,2-2,0 torr (27270 pascal). Mula-mula metana (CH4) diionkan melalui proses tumbukan elektron +
menghasilkan ion CH4 . Selanjutnya ion tersebut bereaksi dengan molekul netral metana yang lain menghasilkan asam Bronsted yang kuat untuk bereaksi dengan molekul sampel melalui transfer proton. CH4
+
e
-
→
CH4
+
+
2e
+
+
CH3
+
H2
CH4
+
+
CH4
→
CH5
CH3
+
+
CH4
→
C2H5
+
-
CH5
+
C2H5
+
+
+
CH4
+
+
C2H4
+
A-B-C →
HABC
+
A-B-C →
HABC
Gas lain yang juga sering digunakan adalah hidrogen (H2), uap air (H2O), ammonia +
+
(NH3), dan isobutana (C4H10). Dalam gas-gas ini, ion yang reaktif adalah H3 , H 2O , +
+
NH3 dan C4H10 . Energi yang ditransfer pada proses ionisasi dengan metode ini berkisar 10-50 kkal/mol atau 40-200 kJ/mol, jumlah energi yang cukup kuat untuk proses fragmentasi, namun fragmentasi yang terjadi lebih sedikit dari metode tumbukan elektron. 4. Fast Atom Bombardment (FAB) FAB merupakan suatu tehnik ionisasi yang popular untuk molekul non-volatil dan atau labil terhadap temperatur tinggi. Baik digunakan untuk molekul polar dan molekul dengan berat molekul tinggi. Umumnya FAB menggunakan uap atom netral berkecepatan tinggi seperti Argon dan Xenon pada 8 kV. Sampel yang dianalisa dapat berupa padatan atau sampel yang dilarutkan dalam pelarut kental seperti +
gliserol. Biasanya ion pseudo molekuler [M+H] terbentuk bersama sedikit ion fragmen dengan massa yang lebih rendah. 5. Field Desorption (FD) Untuk material yang kurang volatil, ionisasi biasanya dilakukan dekat permukaan elektroda melalui gradient medan listrik yang sangat tinggi (beberapa volt per angstrom). Awan elektron dalam molekul didistorsi dan bagian molekul yang mengandung kelebihan elektron berperan sebagai anoda. Ion yang terbentuk akan ditolak oleh anoda. Lifetime dari ion ini sangat singkat dibandingkan dengan ion hasil tumbukan electron. Karena sedikit energi yang ditransfer berupa energi dalam dan ion bergerak sangat cepat, dan fragmentasinya sangat sedikit, maka berat molekul sangat mudah dideteksi. 6. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
Metode ini baik digunakan untuk sampel dengan berat molekul lebih besar dari 700.000, dan tehnik ini telah digunakan untuk menentukan berat molekul dari molekul biologi besar yang bersifat polar, seperti enzim, analisa interaksi antibodi. Sampel berupa matriks organik atau dibuat dalam matrik organic (asam sinapinat biasanya untuk sampel protein), dioleskan pada permukaan suatu lempeng, selanjutnya diradiasi dengan sinar laser (N2
337
nm) . MALDI adalah metode
ionisasi yang lemah dan fragmentasi ion sampel jarang terjadi. Ion yang dihasilkan biasanya berupa ion molekuler sehingga spektra yang dihasilkan sangat sederhana. 3. Penganalisa massa
Analis massa (mass analyzer ) adalah bagian dari spektrometer massa yang bertugas memisahkan ion-ion dengan rasio massa per muatan (m/z) yang berbeda-beda dengan sangat teliti. Analis massa biasa juga disebut sebagai pemisah ion ion separator ). Alat ini harus sangat sensitif dan sangguo untuk untuk membedakan massa yang berbeda sangat kecil. Ada beberapa tipe analis massa. Beberapa menggunakan medan magnet untuk membelokkan ion yang dihasilkan dari kamar ionisasi. Ion/radikal yang berasal dari ruang pengion dipercepat menggunakan medan listrik memasuki tabung penganalisis dan dilalukan dalam medan magnet. Dalam kekuatan medan magnet yang diberikan, hanya ion-ion positif dan radikal positif akan difokuskan ke detector, sedang ion-ion yang lain (radikal netral) akan dibelokkan ke dinding tabung. Ion dengan m/z lebih besar akan mencapai detektor lebih dulu diikuti m/z yang lebih kecil.
4. Detektor
Detektor dalam instrumentasi modern sangat penting untuk menghasilkan spektrum yang baik. detektor yang bagus mendeteksi kerja dari semua komponen lain dengan sangat detail. Dalam spektroskopi massa, detektor disebut juga kolektor ion atau pengumpul ion, yang mengumpulkan ion-ion selepas proses dalam pemisah ion. Ada beberapa jenis detektor yang tersedia dalam spektrometer massa. Ada dua jenis ion collector yang selalu digunakan dalam instrumentasi modern, yaitu jenis elektronis yang bergantung pada sinyal yang berasal dari eksperimen yang diubah serta diolah lebih lanjut, dan jenis fofotografis yang mengandalkan plat foto yang peka terhadap sinyal yang dihasilkan. Dalam pengumpul ion elektronik dikumpulkan oleh elektron multiplier, dimana sinyal diamplifikasi dahulu sebelum dicatat
oleh macam-macam pencatat seperti plat foto atau komputer kecil. Dilain pihak pada pengumpul ion fototgrafis , palt foto berisi lapisan film yang peka, kemudian dibiarkan dalam kontak dengan berkas ion interval yang telah ditentukan. Hasil akhir dari spektrum massa berupa rangkaian puncak. Puncak pada ratio m/z yang sesuai untuk masing-masing ion.
Interpretasi Spektrum Massa
Beberapa aturan yang dapat digunakan dalam Interprestasi Spektra Massa
1.Hukum nitrogen
Dalam identifikasi suatu rumus molekul maka hukum nitrogen sangat banyak memberikan bantuan. Hukum nitrogen menyatakan bahwa suatu molekul yang berat molekulnya genap, tidak mungkin mengandung nitrogen, kalaupun mengandung nitrogen maka jumlah nitrogennya harus genap. Dari sini dapat kita simpulkan bahwa , pecahan kolekul-molekul biasanya bermasa ganjil kecuali kalau terjadi rearrangement (penataan ulang).
2.Aturan elektron genap
Aturan elektron genap menyatakan bahwa species-species elektron genap biasanya tidak akan pecah menjadi dua species yang mengandu ng elektron ganjil, ia tidak akan pecah menjadi radikal dan ion radikal, karena tenaga total dari campuran ini akan sangat tinggi.
3.Jumlah ketidakjenuhan
Jumlah ketidakjenuhan dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : Jumlah ketidakjenuhan = Karbon + (hidrogen /2) - (halogen /2) + (nitrogen trivalent /2)
Aturan umum dalam memprediksikan puncak-puncak menonjol dalam spectra EI didasarkan pada kaidah dasar sebagai berikut: 1. Tinggi relative puncak ion molekul yang terbesar terdapat pada senyawa rantai lurus dan
makin kecil jika cabang makin banyak 2. Tinggi relative puncak ion molekul biasanya makin kecil dengan bertambahnya bobot
molekul dalam suatu deret homolog, kecuali untuk asam lemak 3. Pemutusan cenderung terjadi pada atom karbon tersubstitusi alkil, makin banyak
substituent makin mudah mengalami pemutusan. Hal ini sebagai konsekuensi dari kestabilan relative kerboktion tersier lebih besar dibanding kerbokation sekunder, dan disbanding karbokation primer. Derajat kestabilan karbokation mempunyai urutan sebagai berikut: +
+
+
+
CH3
menstabilkan ion molekul, sehingga meningkatkan kebolehjadian pembentukan ion molekulnya. 5. Ikatan rangkap mendorong terjadinya pemutusan alilik dan menghasilkan karbokation
alilik yang distabilkan oleh resonansi. Aturan ini berlaku untuk alkena, tetapi tidak berlaku untuk sikloalkena sederhana sebab dapat terjadi migrasi (pergeseran) ikatan tangkap. +
+
+
CH2 :CH-CH-CH2-R→ -R + CH2-CH=CH2 ↔ CH2=CH- CH2 6. Cincin jenuh cenderung kehilangan alkil rantai samping pada ikatan alfa. Hal ini
merupakan kejadian khusus untuk percabangan. Muatan positif cenderung berada pada fragmen cincin.
Cincin tidak jenuh dapat menjalani reaksi retro diels-alder:
7. Pada senyawa aromatic tersubstitusi alkil, pemecahan sering terjadi pada ikatan beta
terhadap cincin menghasilkan ion benzyl. Ion benzyl hasil fragmentasi ini distabilkan oleh resonansi membentuk ion tropillium:
8.
Ikatan C-C yang bersebelahan dengan heteroatom cenderung terputus, dengan meninggalkan muatan pada fragmen yang mengandung heteroatom, dimana electron nonikatannya menciptakan stabilisasi resonansi. .+
+
+
:
CH3-CH2-Y -R → CH2=Y -R ↔ CH2-Y -R 9. Pemutusan seringkali disertai dengan eliminasi molekul netral yang stabil misalnya CO,
olefin, air, ammonia, hydrogen Sulfida, Hidrogen sianida, merkaptan, ketene atau alcohol, dan seringkali melalui penataan ulang.
Penataan Ulang (rearrangement)
Penataan ulang terhadap ion adalah fragmen yang asal-usulnya tidak dapat diuraikan melalui pemutusan ikatan dalam ion molekulnya, tetapi sebagai hasil penataulangan atom atom
secara intramolekular hidrogen dari suatu molekul yang mengandung suatu heteroatom. Penataan ulang yang paling popular yaitu penata ulangan Mc Lafferty. Ikhtisar penata ulangan Mc Lafferty dapat dilihat pada gambar berikut:
Penataan ulang Mc Lafferty dapat berlangsung jika suatu molekul memiliki heteroatom yang berlokasi terhadap suatu atom tertentu (misalnya O), suatu sistem ikatan rangkap dan hydrogen gamma yang dapat diabstraksi oleh sistem C=O. adanya penataan ulang seringkali menyebabkan menonjolnya puncak khas sehingga amat bermanfaat untuk menetapkan struktur. Penataan ulang terjadi karena rendahnya energy (kestabilan bertambah) hasil yang dibentuk. Penataan ulang umumnya mengakibatkan eliminasi molekul netral yang stabil (misalnya dilepaskan suatu alkena). Fragmen yang biasa terbentuk dan massanya
fragmen
massa
fragmen
massa
fragmen
massa
CH3-
15
CH3CH2-
29
HCO-
29
NO
30
-CH2OH
31
CH2=CH-CH2-
41
CH3CO-
43
HO-CO-
45
-NO2
46
C4H7
55
C4H9
57
CH3CH2CO-
57
CH2=C(OH)2
60
C5H5
65
C6H5-
77
C6H5CH2-
91
C6H5CO-
92
CH3-C6H4-CO-
119
Spectra massa C9H11Br
Interpretasi spectra massa C 9H11Br a. M+. merupakan ion molekul radikal dan diduga merupakan bobot molekul dari senyawa. Pucak yang berhimpit pada 198/200 kemungkinan adalah isotope dari atom penyusun 79
senyawa ( Br dan
81
Br).
b. Adanya puncak dengan m/z 91 adalah puncak khas adanya fragmen benzyl C6H5CH2. Hal ini juga diperkuat oleh adanya puncak dengan m/z 65. c. m/z 198 – (m/z 91 + m/z 79) = m/z 28 → -CH2-CH2-
jadi strukturnya yaitu C6H5CH2CH2CH2Br dengan nama senyawa yaitu 1-bromo-3-fenil propana
