ALTERNATIVAS DE REACTIVOS DEL ÁREA DE PROCESAMIENTO DE TEJIDOS FIJACIÓN Fijadores simples
Etanol: CH3-CH2-OH
Etaol! Etaol! metaol! metaol! a"etoa a"etoa. Fijan Fijan por por deshid deshidrat rataci ación ón y coagul coagulac ación ión de las proteínas, sore todo las citosólicas. E!traen los lípidos de los tejidos, pero no a"ectan a los carohidratos. El #etanol es #ejor "ijador $ue el etanol puesto $ue no causa tanto endureci#iento del tejido y aporta una #ejor preser%ación. En general, son uenos "ijadores de #uestras de pe$ue&o ta#a&o, y para pres preser er%a %arr prot proteí eína nas, s, co#o co#o en'i en'i#a #as, s, gluc glucóg ógen eno, o, y pig# pig#en ento tos. s. (e usan usan "recue "recuente nte#en #ente te para para para para "ijar "ijar las e!tens e!tension iones es citoló citológic gicas as o seccio secciones nes de criostato otenidas de tejido no "ijado. )eido a $ue deshidratan, a la %e' $ue "ijan, se pueden usar ta#i*n co#o un conser%ante de las #uestras. +ienen algunos incon%enientes co#o producir endureci#iento y la retracción de los tejidos, #uy e%identes en lo$ues de tejido #uy grandes. Carecen de e"ecto #ordiente.
cido ac*tico: CH3COOH
Á"ido a"#ti"o. o "ija directa#ente a las proteínas sino $ue su proceso de "ijación consiste en ca#iar el estado coloidal de las proteínas. (e utili'a a una concentración $ue %aría entre el y el / 0. Es el "ijador ideal para 1cidos nucleicos y nucleoproteínas. Co#o incon%enientes cae destacar la destrucción de las #itocondrias y #ala "ijación de #e#ranas y citoplas#a. (e suele usar en co#inación con otros "ijadores. Eje#plos: O4 , FF5 . En ☆
☆
las #e'clas de "ijadores ta#i*n es capa' de contrarrestar los arte"actos $ue pueden introducir el etanol o el 1cido pícrico.
Clor$ro o s$l%ato de &i" . El cloruro de 'inc se utili'ó inicial#ente co#o "ijador pero #1s tarde pasó a ser un co#ponente de #e'clas "ijadoras. (e e#plea nor#al#ente en co#inación con el para"or#aldehído. El cloruro de 'inc ayuda a la "ijación y preser%a la antigenicidad si se necesita el tejido para prueas in#unocito$uí#icas, ya $ue contrarresta el en#ascara#iento de antígenos $ue se atriuye al para"or#aldehído. 6as sales de 'inc han sustituido progresi%a#ente a las sales de #ercurio usadas tradicional#ente en las #e'clas "ijadoras. Es i#portante se&alar $ue el "ijador no se prepara en sales de "ostato, co#o es haitual, y tras la "ijación ha de eli#inarse el 'inc #ediante la%ados en agua destilada.
cido pícrico: C7H2OH8O293
Á"ido p'"ri"o. 6a "ijación la produce gracias a $ue las sales del tipo picrato coagulan las proteínas de los tejidos. (e suele usar del 2 al / 0 de una solución saturada de 1cido pícrico. reser%a ien la estructura celular, no produce retracciones cuando el tie#po de "ijación es ópti#o, preser%a ien glucógeno y lípidos. Es un uen "ijador para tinciones generales puesto $ue tiene e"ecto #ordiente y "a%orece la unión de los colorantes. Hay $ue eli#inarlo co#pleta#ente antes de proceder a la inclusión en ceras co#o la para"ina puesto $ue di"iculta la penetración de la para"ina. (e suele usar co#inado con otros "ijadores. Eje#plos: O4
☆
Formalde('do. Es un "ijador a#plia#ente usado por la uena preser%ación del tejido, act;a co#o conser%ante, produce poca retracción tisular, es co#patile con la #ayoría de las t*cnicas y tinciones histológicas, incluidas las de in#unocito$uí#ica e hiridación de 1cidos rionucleicos. El "or#aldehído se une a grupos "uncionales de las proteínas "or#ando grupos he#iacetales. Esta unión hace $ue #uchos en'i#as $ueden inacti%as, lo $ue ayuda a e%itar la degradación del tejido por las en'i#as hidrolíticas. 6os grupos a los $ue se une son a#ino, sul"idrilos, guanidilos, grupos hidro!ilos ali"1ticos, etc*tera. 6a unión a uno de estos grupos produce un grupo hidro!i#etileno. Es el hidro!i#etileno el $ue reacciona con grupos de otra, o de la #is#a, proteína para la "or#ación de puentes. El "or#aldehído preser%a ien los lípidos, sore todo si se a&ade a la solución "ijadora iones de calcio 8reducen la soluilidad de los "os"olípidos9, y no reacciona con los carohidratos.
6a "ijación nor#al#ente es de 2< a /= h, aun$ue puede ser de a 2 se#anas. (i el tejido %a destinado a in#unohisto$uí#ica es su"iciente con 2-2< h a <>C. Fijaciones #uy prolongadas endurecen el tejido y pueden pro%ocar inestailidad de los 1cidos nucleicos. arte del "ijador del tejido se puede eli#inar #ediante la%ados prolongados. or#al#ente se usa en solución ta#ponada e isotónica. (e utili'a a concentraciones pró!i#as al < 0. 5ctual#ente se prepara a partir de para"or#aldehído, sustancia sólida. Eje#plos: "or#aldehído ta#ponados , O4 , FF5 , 6 ☆
☆
☆
For#aldehído: CH2?O
Enlaces entre proteínas "or#adas por el "or#aldehído.
☆.
@lutaraldehído
)l$taralde('do. Es uno de los "ijadores #1s usados. En solución poli#eri'a "or#ando dí#eros y trí#eros. 6os grupos aldehídos $ue $uedan dentro en la #ol*cula poli#eri'ada reaccionan con los grupos a#inos de los a#ino1cidos de las proteínas, "or#ando puentes entre las #ol*culas de los tejidos. 6os grupos aldehídos de los e!tre#os, sin e#argo, $uedan lires, y es i#portante anularlos para e%itar "alsos positi%os 8por eje#plo, e%itando $ue se unan los anticuerpos durante la in#unocito$uí#ica o $ue se unan los aldheídos del reacti%o de (chi""9. or tanto, es una uena pr1ctica eli#inarlos, lo $ue se puede hacer #ediante la incuación en orohidruro de sodio al 0. El glutaraldehído tiene poca %elocidad de penetración, por lo $ue la "ijación por per"usión %ascular es reco#endada. (e usa a una proporción de entre el =,/ y el 3 0. +iene una alta capacidad para preser%ar la estructura celular puesto $ue es capa' de entrela'ar el tejido #1s "uerte#ente $ue otros aldehídos, por lo $ue es el "ijador de re"erencia para oser%ación de ultraestructuras celulares con el #icroscopio electrónico. (in e#argo, no se reco#ienda para inclusiones en para"ina puesto $ue di"iculta la otención de secciones. Hay $ue tener cuidado con su aja penetración tisular y puede producir retracciones. (e usa en soluciones ta#ponadas isotónicas y nor#al#ente en co#inación con el "or#aldehído.
+etró!ido de os#io. OsO <.
Enlaces producidos por el OsO < en los enlaces insaturados de los 1cidos grasos. 5 lo largo de la historia de la histología se han usado di%ersos tipos de aldehídos co#o "ijadores, #uchos de los cuales han dejado de usarse. or eje#plo, el hidrato de cloral para el siste#a ner%ioso, la acroleína, #uy tó!ico y usado para #icroscopía electrónica, o el glio!al.
Tetr*+ido de osmio. Es uno de los "ijadores #1s antiguos, se usa desde al #enos A7/. En solución penetra poco en los lo$ues de tejido, y se reco#iendan ta#a&os no #ayores de =./ o ##. (e puede usar tanto en solución co#o en %apor. o produce arte"actos pero hace a las #uestras de tejido "r1giles. For#a puentes entre los enlaces insaturados de las cadenas de 1cidos grasos de los lípidos de las #e#ranas celulares. 6as hace insolules, oscuras y opaca a los electrones. or eso se e#plea haitual#ente para las oser%aciones con el #icroscopio electrónico, ya $ue preser%a y oscurece las #e#ranas celulares. ero ta#i*n en #icroscopía óptico se usa para estudiar
las grasas insaturadas, para oser%ar los tractos de #ielina, y es necesario para las i#pregnaciones arg*nticas co#o el #*todo de @olgi. or su "uerte car1cter o!idante no se usa para tinciones con%encionales puesto $ue i#pide la unión al tejido de los colorantes aniónicos. 5ctual#ente se usa #ucho tras la "ijación de las #uestras con "or#aldehído o glutaraldehído, y antes de deshidratar dichas #uestras para su oser%ación al #icroscopio electrónico.
Me&"las %ijadoras 6a #ayor parte de los procesos de "ijación usan %arias sustancias "ijadoras, ien #e'cladas en la solución acuosa inicial o utili'adas sucesi%a#ente en el tie#po. Con ello se apro%echan las %entajas de cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus des%entajas. Hay #ultitud de "or#as de usar los di"erentes "ijadores, tanto en sus co#ponentes co#o en las proporciones de *stos, dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, $u* tipo de tejido $uere#os "ijar y $u* $uere#os %er de dicho tejido. Bunto con las sustancias "ijadoras ta#i*n se a&aden a las #e'clas otros co#ponentes $ue a"ectan a otros par1#etros co#o la os#olaridad o el pH de la solución. or eje#plo, en la #ayoría de los casos las sustancias "ijadoras se disuel%en en soluciones ta#ponadas para controlar os#olaridad y pH, de #anera $ue no se a"ecte a la estructura del tejido. ero ta#i*n con otros propósitos, co#o por eje#plo el etil*n glicol $ue se a&ade a los "ijadores para otener secciones por congelación y ade#1s e%ita la di"usión de las en'i#as. 5 continuación %a#os a #encionar algunas co#inaciones usadas "recuente#ente por$ue tienen unas propiedades de "ijación $ue las hace apropiadas para las oser%ación de una gran %ariedad de tejidos y para el uso di%ersas de t*cnicas de tinción.
L',$ido de -o$i . Est1 "or#ado por 1cido pícrico, "or#aldehído y 1cido ☆
ac*tico glacial. Es una solución #uy utili'ada para el procesa#iento de tejidos $ue se incluir1n en para"ina 8%er capítulo de inclusión9 y a cuyas secciones se le pueden aplicar un a#plio espectro de tinciones. Es #uy ;til para tejidos landos y e#riones, y preser%a ien el n;cleo y el glucógeno. Hay $ue tener cuidado con el tie#po de "ijación, $ue no dee e!ceder de
"ijaciones por in#ersión. +ras la "ijación las #uestras de tejido se pueden conser%ar en alcohol de =D. o est1 reco#endado para el ri&ón ni para el estudio de #itocondrias. 5ntes de la inclusión en para"ina es con%eniente eli#inar el 1cido pícrico #ediante la%ados en alcohol de =D por$ue i#pide una uena inclusión y $ue las tinciones no sean ópti#as.
Sol$"i* de Clar.e. Est1 "or#ada por etanol y 1cido ac*tico glacial 83:9. Es uno de los pri#eros "ijadores usados, ueno para #uestras $ue se incluir1n en para"ina.
Caro/ . Es un uen "ijador para el glucógeno, para los hidratos de carono ☆
si#ples y para las proteínas "irosas. Es ueno para %isuali'ar los 1cidos nucleicos, aun$ue no la #or"ología nuclear, y para los gru#os de issl del siste#a ner%ioso. uede producir retracciones tisulares. Est1 "or#ado por etanol asoluto, cloro"or#o y 1cido ac*tico glacial.
Me&"las "o %ormalde('do. El "or#aldehído es $ui'1 el "ijador #1s usado hoy en día, tanto para t*cnicas histológicas co#unes co#o para otras co#o la in#unocito$uí#ica o la hiridación de 1cidos nucleicos. 6o #1s "recuente es utili'arlo en solución al < 0 junto con otros "ijadores. (e suele disol%er en soluciones ta#ponadas $ue tienen una os#olaridad si#ilar a la del tejido $ue se pretende "ijar. ara "ijaciones de tejidos destinados a #icroscopía electrónica se suelen utili'ar soluciones "ijadoras $ue contienen "or#aldehído y glutaraldehído. 6a "unción del "or#aldehído es iniciar una "ijación r1pida, por su #ayor capacidad de penetración, #ientras $ue el glutaraldehído reali'ar1 una "ijación #1s poderosa, pero #1s lenta $ue no a"ectar1 a la estructura tisular puesto $ue el "or#aldehído ya ha reali'ado una "ijación pre%ia. Eje#plos: "or#aldehído ta#ponado, O4, FF5 , 6
)l$taralde('do0tetr*+ido de osmio. 6os "ijadores en co#inación no tienen necesaria#ente $ue usarse al #is#o tie#po. Es haitual $ue los tejidos destinados
a
#icroscopía
electrónica
sean
inicial#ente
"ijados
en
glutaraldehído 8 al 3 09 y para"or#aldehído 82 al < 09, para posterior#ente ser post"ijados en tetró!ido de os#io al 0 en solución ta#ponada. Este ;lti#o es un uen preser%ador de la ultraestructura celular, sore todo
#e#ranas, en cooperación con los aldheídos. Esto es i#portante por$ue el proceso para #icroscopía electrónica supone incuar el tejido en sol%entes org1nicos y poli#eri'ación de resinas a 7= DC, durante las cuales el tejido dee ser preser%ado.
DES1IDRATACIÓN Al"o(oles El
alcohol
asoluto
tiene
a
lo
#1s
0
o
20
de
agua.
(i se agrega unos #l de OH ==0 al ilol y se oser%a turide' es por la presencia de agua en un porcentaje #ayor al 20 lo $ue produce una acción inadecuada
e
i#co#pleta
2Al"o(ol
del
agente
et'li"o
Es
hidro"ílico
6a
aclarante.
3
y
de
graduación
Etaol acción
produce
r1pida.
la
retracción.
El uso por periodos de tie#po e!tendidos produce gran retracción y endureci#iento. Etanol junto con otros alcoholes #e'clados dis#inuye la coloración.
2Isopropaol 6a
eosina
es
o
sir%e
para
Endurece (e
utili'a
insolule la
en inclusión
y principal#ente
este
alcohol.
en
Celoidina.
retrae en
procesos
para
poco. plantas
y
ani#ales.
A"etoa 5ct;a
r1pido,
produce
e!cesi%a
retracción
y
es
#uy
Sol4etes )eshidratan )io!ano,
2Dio+ao
in"la#ale.
$i4ersales y utanol
aclaran terciario
al
#is#o y
tie#po.
+etrahidro"urano.
roduce
#enos
5ct;a
retracción
durante
r1pido
$ue
#1s
(e
dee
usar
En
e!posición
larga
grandes no
la el
cantidades
produce
deshidratación.
grandes
etanol.
de
%olu#en.
ca#ios
indeseales.
2-$taol
ter"iario
(e usa en proporción /=G/= con la para"ina en la pri#era in"iltración.
2Tetra(idro%$rao Es
#iscile
con
todo
5ct;a r1pido sin causar "uerte retracción y endureci#iento. )eshidratante
iopur
)eshidratante iopur es un agente desarrollado especí"ica#ente para el procesa#iento
de
#uestras
en
citología
e
histología.
(e trata de una co#inación de alcoholes de %ariado peso #olecular $ue act;a co#o sustituto del inestale alcohol asoluto en las t*cnicas an1to#opatológicas. or su aja e%aporación resulta #1s con%eniente $ue el etanol y la acetona. (ustituto
)eshidrata del
alcohol
sin asoluto
endurecer para
usar
los en
el
tejidos. proceso
de
deshidrataciónGhidratación en t*cnicas an1to#o-patológicas y citológicas. uede usarse en todos los procedi#ientos $ue re$uieran deshidratación inclusi%e in#unohisto$uí#icos $ue utilicen procesos de deshidratación alcohólicos. ejora los resultados de las tinciones He#ato!ilina-Eosina respecto de los otenidos #ediante el uso de 5lcohol 5soluto, rindando e!celentes detalles nucleares. Es el producto ideal para procesadores. uede utili'arse en cual$uier tipo de procesador, inclusi%e los aiertos.
ACLARAMIENTO En este paso del proceso se eli#ina el alcohol de los tejidos para $ue sea re#pla'ado por un lí$uido $ue disuel%a la para"ina en el tejido $ue despu*s ser1 i#pregnado y %ol%er1 transparentes los tejidos #ediante la aplicación de agentes
aclarantes.
Entre los #ejores tene#os al enceno, !ileno, tolueno, *ter de petróleo, cloro"or#o, disul"ato de carono, esencia de cedro, tetracloruro de carono y
aceite de anilina. Otros #1s son la esencia de cla%o, de erga#ota, de terpineol, el "enol en alcohol, la creosota, el caro!ilol y el dio!ano.
5ileo
8!ilol9
Es un e!celente aclarante pero tiende a hacer los tejidos e!cesi%a#ente duros y $ueradi'os. Es i#portante recordar no dejarlo #1s de tres días ya $ue ser1 di"ícil el hacer cortes. 5l no haer un uena deshidratación posterior#ente a el aclara#iento el !ileno to#ara un aspecto lechoso y se tendr1 $ue pasar de nue%o por la ulti#a graduación de alcohol. Es arato pero tiende a causar de#asiado encogi#iento de tejidos. I por ulti#o no es #uy reco#endado para tejidos
de
enc*"alo
y
ganglios.
Tol$eo +iene las #is#as propiedades generales $ue las del !ilol, pero endurece #enos los tejidos. (in e#argo re$uiere de poco #1s tie#po $ue el !ileno o el enceno.
Cloro%ormo Es un e!celente aclarante de tejido ner%ioso, ganglios lin"1ticos y e#riones, produce poco encogi#iento y no es in"la#ale. Con una uena %entilación y precauciones no hay peligro de into!icación. 5un$ue la inclusión en para"ina es lenta siendo tratado con cloro"or#o no hay prole#a en un #*todo auto#1tico. (in duda es el aclarante #as utili'ado. (in e#argo es caro.
-e"eo Es un uen aclarante, act;a r1pida#ente, produce poco encogi#iento no endurece de#asiado los tejidos, ni los %uel%e $ueradi'os y se e%apora r1pida#ente del a&o de para"ina. (in e#argo E( +O4CO e in"la#ale. 5ceite
de
cedro
5clara despu*s del alcohol de J/ y encoge #uy poco los tejidos, no disuel%e los colorantes de anilina y es #uy penetrante incluso en tejido puede estar por tie#pos prolongados sin riesgo de da&os. (in e#rago su la inclusión en para"ina es #uy lenta y necesita tres ca#ios de para"ina. Es e!celente para piel
y
Esencia
#usculo
liso
pero
su
cantidad de
no
sie#pre
es
uni"or#e. cla%o
+iende a hacer $ue los tejidos $ueradi'os pero puede ser e%itado al co#inarse con esencia de erga#ota. Causa #uy poco encogi#iento, pero la inclusión en para"ina es lenta y di"ícil, ade#1s $ue eli#ina los colorantes de
anilina, disuel%e la coloidina y es cara. or lo tanto no es tan reco#endad. Esencia
de
erga#ota
5clara despu*s del alcohol al J/K no e!trae los colorantes de anilina y puede ser
e#pleada
en
preparación
Esencia
de
celoidina.
de
or*gano
5clara despu*s del alcohol al J/ no disuel%e la celoidina pero si a los colorante de
anilina
y
es
cara.
5l
igual
Sali"ilato
$ue
la
esencia
de
s1ndalo.
de
8Esencia
metilo
de
gualteria9
Con%iene para los tejidos delicados, ya $ue e%ita el e"ecto endurecedor del alcohol. (in e#argo no se #e'cla ien con la para"ina por eso es #ejor colocar el tejido en cloro"or#o enceno. Es un #al deshidratante y resulta destruido "1cil#ente por el agua. Es con%eniente para tornar transparentes los "rag#entos
de
Dis$l%$ro
tejidos.
de
carono
Causa poco encogi#iento, pero tiene un olor desagradale y es #uy in"la#ale sin
decir
$ue
su
inclusión
en
para"ina
es
lenta
y
di"ícil.
Car6o+ileo (e prepara a&adiendo cristales anhídridos de "enol al !ileno, hasta $ue cesa la disolución.
Es
#1s
;til
en
cli#as
h;#edos.
Terpieol 5clara despu*s del alcohol al J= y no se dee con"undir con el terpinol. Con una cuarta parte de !ileno y el resto de +erpineol se logra una solución e!celente
para
tejidos
delicados
por
eje#plo
el
ojo.
Feol Es una solución concentrada de alcoholes adecuada para traajar con para"ina y celoidina. 6a creosota tiene propiedades #uy parecidas a esta.
INCR7SIÓN 4CL(4M E 5L5F45
6a t*cnica de incrusión en para"ina es una per"usión de la #is#a en los tejidos para crear un #edio ho#og*neo, $ue per#ita la reali'ación de los cortes de #enor grosor con gran "acilidad y una precisión #ayor $ue cuando los #is#os se reali'an por congelación. Co#o toda t*cnica, presenta %entajas e incon%enientesK sore todo es en la #odalidad de inclusión donde se pueden discutir ciertos procesos $ue son %1lidos en histología ani#al pero $ue al aplicarlos a los tejidos %egetales pueden originar alteraciones a %eces pro"undas, en las estructuras anató#icas e histológicasK el pri#er prole#a $ue nos encontra#os al incluir en para"ina un tejido es la apolaridad de la #is#aK para poder incluir el tejido se han descrito %arios #*todos de deshidratación, pero en general se sigue, co#o en histología ani#al, la deshidratación por alcohol etílico en graduaciones crecientes hasta llegar a alcohol asoluto.
4CL(4M E LE(45 ara la oser%ación de la ultraestructura celular es necesario hacer secciones de tejido #uy delgadas, del orden de nano#etros, deno#inadas ultra"inas, y usar un #icroscopio electrónico de trans#isión. 6a otención de secciones ultra"inas i#plica $ue tene#os $ue endurecer enor#e#ente el tejido. Esto se puede conseguir #ediante congelación, oteniendo entonces la secciones con un ultracrioto#o. (in e#argo, lo #1s "recuente es incluir el tejido en un #aterial de alta dure'a co#o son las resinas de tipo epo!y, y en #enor #edida las resinas acrílicas co#o el #etacrilato. 5#as se in"iltran en el tejido en "or#a lí$uida y posterior#ente poli#eri'an sin a"ectar a la ultraestructura celular.
