1 “OBTENCIÓN DE ALCOHOL APARTIR DEL ALMIDÓN DE LA PAPA” I.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. Hoy en día existe un grave problema ambiental “el smoke y la contaminación”, han producido daños a la capa de ozono Debido principalmente al uso intensivo (80%) de combustibles fósiles (carbón, petróleo, gas natural) en actividades industriales y el transporte se ha producido un excesivo aumento en las cantidades de óxidos de nitrógeno y dióxido de carbono emitidas a la atmósfera Además del incremento de las emisiones existen otros problemas como la deforestación (20%), que han limitado la capacidad regenerativa de la atmósfera para eliminar el dióxido de carbono, principal responsable del “Efecto Invernadero”.Por lo tanto se busca la utilización de otras fuentes de energía renovables como los Biocombustibles hacen parte de la solución para disminuir las emisiones de gases contaminantes, actualmente se esta produciendo alcohol de la caña de azúcar pero recientes estudios han determinado que el bagazo de la caña de azúcar tiene alto contenido de contaminantes entre ellos tenemos al “bagazosis” que es una enfermedad que se presenta en trabajadores expuestos a la inhalación de polvos de bagazo de caña enmohecido que forma parte de un conjunto de enfermedades de características clínicas, inmunológicas e histopatológicas semejantes, denominado alveolitis alérgica extrínseca, pero el término correcto es el de neumonitis por hipersensibilidad ya que la respuesta inmunopatológica se localiza en la porción distal del árbol respiratorio y abarca desde el bronquiolo terminal respiratorio, hasta los alvéolos y los capilares pulmonares, también afecta a los ojos ya que las partículas de hollín de tamaño igual o menor a 10 micrones, se incrustan en las corneas .Recientemente la OMS, anuncio que el 40% de pobladores mueren por causa del bagazosis y que el otro 60 % sufren de afecciones respiratorias los mas afectados son los niños debido que están el mayor tiempo en contacto con la naturaleza, no solo esto en cada inicio de zafra para los pobladores se hace insoportable convivir con la gran cantidad de hollín y humo que emanan las chimeneas de caña de azúcar dañando el patrimonio natural y cultural. Ante es problemática existe como alternativa la obtención de alcohol a partir de otra materia prima que no sea tan perjudicial
2 como es el almidón de la papa para producir alcohol anhidro para aditivo de combustible y para carburantes; también se puede producir en gran escala alcohol para el consumo humano (vodka). I.1. Interrogantes De La Investigación: I.1.1 ¿Cuál es el proceso de obtención de alcohol apartir del almidón de la papa? I.1.2. ¿Qué parámetros fisicoquímicos se controlara en la obtención de alcohol del almidón de la papa? I.1.3. ¿Cuál será el rendimiento de alcohol que se obtendrá del almidón de la papa? I.1.4 ¿Cuál es el grado alcohólico del alcohol obtenido del almidón de la papa? II. ANTECEDENTES: GULATI et al., (1996), Investigarón sobre “Maíz como materia prima en una planta productora de alcohol etílico”, Par la hidrólisis del almidón se usa la
α -amilasa obtenida de bacterias termo resistentes Bacillus licheniformis tiene que ser llevada a altas temperaturas (90-100ºC) para el rompimiento de los gránulos del almidón, el almidón licuado se somete a sacarificación a menores temperaturas (60-70ºC) con glucoamilasa con Aspergillus Níger la cual hidroliza las dextrinas hasta glucosa. NETWORK, W. (2002), Investigo sobre “La producción de etanol usando mezclas de jugo de sorgo dulce”, granos de alto contenido de almidón, tallos con alto contenido de sacarosa y hojas y bagazo con alto contenido de lignocelulosa bajo condiciones normales y de muy alta concentración de sólidos (VHG), usando cepas de Saccharomyces cerevisiae a 30°C obteniendo concentraciones de etanol de hasta 16,8%v/v El objetivo de este trabajo fue determinar las condiciones para obtener
el mejor grado de
hidrólisis del almidón del grano, usando las propias enzimas que se generan durante la germinación.
3 AFANADOR, A. (2005) Investigo sobre “El Banano verde en la producción de etanol” el banano verde con cáscara tiene alto contenido de almidón y celulosa, se le considera como una materia prima potencial para la industria del bioetanol., la producción de alcohol a partir de almidones y celulosa con procesos químicos o biológicos (hidrólisis) para su conversión a jarabes azucarados, que una vez acondicionados se someten a la acción de levaduras que efectúan la fermentación alcohólica. El etanol resultante se lleva a procesos de destilación y deshidratación hasta obtener alcohol anhidro (99,5% v/v). LOZANO U. Á. (2003) Investigo sobre “Producción de etanol a partir de yuca mediante bioreactor de tanque agitado con control de variables” Se obtiene del almidón aislado de la yuca raíz sin cáscara, dicho almidón (polisacárido de glucosa) se somete a hidrólisis química, de tal forma que se produzcan azúcares fermentables, que son sometidos a una fermentación anaeróbica por la levadura Saccharomyces cerevisiae obteniendo una solución etanólica. Ambas etapas, hidrólisis y fermentación anaeróbica son realizadas en el Bioreactor de Tanque Agitado controlando variables de pH, Temperatura, Agitación, Tiempos de hidrólisis y de fermentación y Concentración de sustratos. SUNG Y CHENG J, (2002) Investigarón sobre, “Producción de alcohol a partir del trigo”. La que usualmente se utiliza en la producción de alcohol, llamada Zymomonas mobilis, obtiene excelentes resultados pero sólo a partir de la celulosa de los palos de trigo se podría hacer alcohol donde se logra rendimientos que alcanzan0.357 Etanol/kg de trigo mediante el proceso Biostill. CHAVES, S. M. (2004), Investigo sobre “Alcohol apartir de la caña de azúcar”, para la producción de etanol la principal materia prima es el jugo de caña o las melazas (subproducto de la industria azucarera) .Se puede obtener cerca de 70L EtOH/ton de caña y 9L EtOH/ton de melazas .El microorganismo mas utilizado es el Saccharomyces cerevisiae por su capacidad de hidrolizar la sacarosa de la caña de azúcar para su conversión
4 hasta glucosa y fructuosa se puede dar en condiciones anaeróbicas en pequeñas cantidades de O2. LYND,
LR
(2002),
Investigo
sobre
“Alcohol
apartir
de
Biomasa
Lignocelulósica”, los materiales que mas se han investigado son residuos forestales, de la industria papelera y residuos de sólidos urbanos. El complejo Lignocelulósico esta compuesto de una matriz de carbohidratos de celulosa y lignina enlazada por cadenas de hemicelulosa el pretratamiento tiene que desintegrar esta matriz par que la celulosa redusca su grado de cristalinidad y aumente la célula amorfa que es la que se requiere para el posterior ataque enzimático con células hexogenas la cual hace que se de una solución de glucosa que después hará que se convierta en EtOH mediante microorganismos. III. JUSTIFICACIÓN: III.1. JUSTIFICACIÓN TEORICA: El Etanol en mezcla con la Gasolina reduce las Emisiones de Monóxido de carbono (CO), sin incrementar la de Óxidos Nitrosos (N0x) ya que de acuerdo con la Asociación de Recursos Renovables de Canadá, el agregado de un 10% de etanol al combustible trae los siguientes beneficios: reducción de un 30% de las emisiones de monóxido de carbono y disminución entre un 6% y un 10% de reducción de las emisiones de dióxido de carbono a la atmósfera. III.2. JUSTIFICACIÓN TECNICA: En nuestro país la producción de papa se realiza en 6 meses con un promedio de 176.200 Ha, si consideramos el porcentaje de desperdicios del 3% por falta de transporte, almacenamiento y conservación tendríamos alrededor de 79.800 Toneladas de papa residual al año que podría ser utilizada en la producción de almidón, que sería de aproximadamente 15.960 Toneladas, que por hidrólisis enzimática se obtendría 15.162 Toneladas de azúcares fermentables y que por fermentación es posible producir alrededor de 50 millones de litros de alcohol. Una temprana experiencia de producción de vodka, con la cooperación de la República de Polonia, en el sur chico peruano, no prosperó por que la variedad de papa
5 utilizada tenía un alto contenido de agua, solo 18 % de materia seca. Esta papa "aguachenta" es típica de la producción costera. Pero en nuestros andes tenemos variedades de papas con más del 30% de materia seca, y la variedad requerida para la producción de papa exige sólo un 25% de materia seca. III.3. JUSTIFICACIÓN SOCIAL: Dentro de éste contexto se sitúa la presente investigación que se inclina al aprovechamiento del recurso agrícola, almidón de papa, como fuente energética en la producción de etanol y el aprovechamiento de los productos intermedios del bioproceso como son la proteína unicelular, la glucosa y los preparados crudos de amilasas como resultado los mayores beneficiarios serian los pequeños productores de papa, también se indicó que de los sobrantes de papa generados en el proceso de extracción de etanol carburante se podrían obtener subproductos de ágil comercialización como alimentos para ganadería y abonos orgánicos, dando cuenta que este proceso no sólo ampliaría la producción industrial del energético sino que propone la exploración de otros mercados y la dinamización de la economía nacional. IV. MARCO TEORICO: IV.1. PAPA. IV.1.1. Aspectos Generales. Requejo y Ortega (1996). En el Perú se encuentran alrededor de 2000. variedades de mayor calidad se producen sobre los 3,000 m.s.n.m. Actualmente contamos con variedades nativas y modernas por su origen. Por su color son blancas y de color y por el uso son amargas, amarillas e industriales. Los tubérculos de papa tienen diversos usos, así en la alimentación humana el producto se consume fresco o procesado. Dentro de los componentes nutritivos el que se encuentra en mayoría es el agua que constituye en torno al 80% del total. Le siguen los carbohidratos que constituyen el 16-20% entre los que hay que destacar el grupo de los almidones que son polisacáridos complejos que se absorben como glucosa previa hidrólisis enzimática. La fibra alimentaría representa 1-2% del total de
6 la papa y se encuentra preferentemente en la piel, siendo los más importantes la glucosa, fructosa y sacarosa. IV.1.2. Ubicación Taxonómica. Género: Solanum Especie: Solanum tuberosum Familia: Solanáceas. Origen: Nativa de los Andes y cultivada desde la época prehispánica. Distribución: Costa y sierra peruanas. Extendida a todo el mundo (Requejo y Ortega, 1996) IV.1.3. Composición química de la papa. Cuadro 1: Principales componentes de la papa, rango y media. Componentes
Rango %
Media
Agua
63.2 - 86.9
75.05
Sólidos totales
13.1 - 36.8
23.7
Proteína (Nitrógeno total + 6.25)
0.7 - 4.6
2
Glicoalcaloides (Solanina)
0.2 – 41
3-10(mg/100gr)
Grasa
0.02 - 0.20
0.12
Azúcares reductores
0.0 - 5.0
0.3
Total Carbohidratos
13.3 - 30.53
21.9
Fibra Cruda
0.17 - 3.48
0.71
Ácidos Orgánicos
0.4 - 1.0
0.6
Ceniza
0.44 - 1.9
1.1
Vitamina C
1 - 54 mg/100gr
10-25(mg/100gr)
Fuente: Mataix, (1997) IV.2. ALMIDÓN, (materia prima).
7 Espinosa (2004), Probablemente no existe otro compuesto orgánico tan ampliamente distribuido en los vegetales como el almidón. Es el producto de asimilación más importante de la fotosíntesis y constituye la principal sustancia de reserva de los vegetales. El almidón se encuentra en abundancia en: Graminneas (cereales): trigo (Triticum sativum); arroz (Oryza sativa); maíz (Sea mays); avena (Avena sativa); centeno (Secale cereale); cebada (Hordeum vulgare) Leguminosas
(legumbres):
porotos
(Phaseolusvulgaris);
arvejas
(Pisum sativum); lentejas (Lens sculenta), etc. Solanáceas: papas (Solanum tuberosum). Industrialmente se le obtiene por vía húmeda a partir de ellos. IV.2.1. CARACTERÍSTICA Y PROPIEDADES. Espinosa (2004), la diferencia entre harina y almidón de papa es la papa entera que se le ha quitado el agua y se ha molido para obtener la harina. El almidón se obtiene después de romper el tejido, por ejemplo al pasar la papa por un extractor de jugos sale un jugo con un residuo lechoso ese residido lechoso es el almidón el cual debe sufrir varios lavados para eliminar los contaminantes y obtener un almidón blanco. Se presenta como polvo blanco fino, insípido, constituido por granos característicos microscópicamente para cada especie. Para su caracterización se toma en cuenta: tamaño (aprox. 2150 u), forma, hilio o núcleo, estratificaciones; granos simples o compuestos y aspectos a la luz polarizada. El almidón es insoluble en agua fría; en agua caliente se hincha formando engrudo; se torna de azul a azul violeta con sol; da glucosa como producto final de la hidrolisis total. IV.2.2. ESTRUCTURA DEL ALMIDÓN. Martínez, (2006), Químicamente el almidón o fécula es un polisacárido homogéneo que esta formado por una mezcla de dos polisacáridos estructuralmente diferentes: amilosa y amilo pectina.
8 Como primera aproximación, se puede decir que el almidón está constituido por unidades de D(+)-glucosa enlazadas α-1.4. Nuestras enzimas hidrolizan los almidones hasta sus unidades constituyentes de glucosa, la cual, como ya hemos expresado, sirve a nuestro organismo de nutriente y es utilizada para diferentes transformaciones metabólicas. Al tratar el almidón con agua caliente, este se separa en dos fracciones: una dispersable, que se conoce como amilosa y otra no dispersable, que es la mayoritaria, que se conoce como amilopectina.
Almidón
H2O
Amilosa 20 %
Δ
Amilopectina 80 %
Los dos constituyentes del almidón difieren en diversos aspectos y por tanto los consideramos por separado. o Amilosa. Amilosa es una molécula lineal compuesta por 250 a 300 unidades de  a -D-glucopiranosa enlazadas por uniones 1-4 (Martínez, 2006) Figura 1: Estructura de la amilosa
CH2OH O HO
O
OH
CH2OH O HO
O
OH
CH2OH
O HO
O
OH O
o Amilopectina. Está también constituido por unidades de D (+)-glucosa, con enlaces
9 α-1.4, pero las cadenas son de 1000 unidades o más y presentan ramificaciones cada 25 unidades α-1.6 en los puntos de ramificación. La hidrólisis de la amilopectina van produciendo mezclas de Oligosacáridos, de masa moleculares gradualmente menores, que se conocen como “Dextrinas” que se utilizan en el acabado de tejidos y en la fabricación de pegamentos, etc. (Martínez, 2006) Figura.2 Estructura de la amilopectina.
CH2OH
O HO CH2OH O
O
O
OH O
HO OH O
H2C
O
HO OH
CH2OH O
O
HO OH O
IV.2.3. Composición del almidón de papa. Cuadro 2. Componentes
Análisis típico
Almidón
el 80%
Agua
el 20%
Ceniza
0,30%
Arena
0,02%
Proteína
0,09%
Fósforo, P
0,07%
FUENTE: Martínez, (2006)
10 IV.3. Etanol (Producto). Se le denomina también Alcohol etílico cuya molécula tiene dos átomos de carbono. Es un líquido incoloro, de sabor urente y olor fuerte, que arde fácilmente dando llama azulada y poco luminosa. Se obtiene por destilación de productos de fermentación de sustancias azucaradas o feculentas, como uva, melaza, remolacha, papa. Forma parte de muchas bebidas, como vino, aguardiente, cerveza, etc., y tiene muchas aplicaciones industriales. Su fórmula química es CH3-CH20H. Para bebidas alcohólicas, prácticamente todo el alcohol etílico que se consume es una mezcla de 95% de alcohol y 5% de agua. Cualquiera que sea su método de preparación, primero se obtiene alcohol etílico mezclado con agua, y luego se concentra esta mezcla por destilación fraccionada. (Ward, 1991). IV.3.1. CARACTERISTICAS DEL ALCOHOL ETILICO. El alcohol etílico rectificado deberá tener las siguientes características: CUADRO 3. Grado alcolhólico volumétrico
96° GL a 20°C
Densidad relativa máxima
0,8120 a 20ºC
Residuo no volátil máximo
1 mg/100 alcohol a 1000 ºGL
Acidez para 100 ml de alcohol a 100 ºGL
Máximo 1 ,8 mg de ácido acético
Esteres por 100 ml de alcohol a 100 ºGL
Máximo 6,5 mg de acetato de etilo
Aldehídos por 100 ml de alcohol a 100 ºGL
Máximo 1 mg
Fuente: Normas y Tecnología (Ward, 1991). IV.3.2. APLICACIONES Y USOS. El alcohol etílico es uno de los compuestos orgánicos usados en la industria, en laboratorios y en el hogar. Actualmente tiene una extraordinaria importancia comercial e industrial, ya que se utiliza como combustible, disolvente, agente extractivo, anticongelante y como producto químico. Se
11 utiliza en las industrias de perfume, barnices, lacas, pinturas, jabones, productos medicinales, películas fotograficas, licores, cosméticos, azúcares fermentables. (Ward, 1991). •
Uso Industrial: Es ampliamente utilizado para la elaboración de licores, como productos de uso doméstico, como combustible, etc.
•
Uso Comercial: El alcohol es actualmente un producto en potencia como energía convencional y de aceptación en el uso de combustible para automóviles.
•
Uso Domestico: Es ampliamente utilizado por los pobladores como desinfectante, en curaciones y como fuente de energía calorífica.
IV.4. PROCESOS DE OBTENCIÓN DE ALCOHOL. IV.4.1. PROCESOS FERMENTATIVOS. Es un proceso bioquímico mediante el cual ciertos microorganismos metabolizan las moléculas de azúcar produciendo etanol y CO2. También se producen glicerol y ácido succínico, lo que muestra que la fermentación incluye otras reacciones secundarías. La fermentación es llevada a cabo generalmente por levaduras del género Saccharomyces realizándose por acción de un complejo enzimático llamado enzimático que permite transformar las hexosas en alcohol y C02. Otros complejos enzimáticos intervienen cuando se degradan otros tipos de azucares: •
Pentosas como la xilosa y arabinosa, que producen alcohol por acción de algunas levaduras del género Torula.
•
Disacáridos como la sacarosa y maltosa que son fermentadas por Saccharomyces.
•
Polisacáridos como el almidón, dextrina, celulosa y otros, podrán ser fermentados siempre que se hidrolice previamente en mono, di o tri Sacáridos.
La industria de las fermentaciones utiliza como fuente de origen para el proceso a casi todas las materias primas que poseen carbohidratos en su constitución (Silva, 2000)
12 Una de las formas de obtener alcohol etílico es mediante la fermentación de mostos azucarados de acuerdo a 1a ecuación establecida primero por Lavoisier1787, luego Gay-Lussac en 1820 y corregida por Dumas en 1840, que establecieron el desdoblamiento de los azucares por la ecuación química siguiente: C12H22011 + H2O
2 (C6H12O6) x
C6H12O6 + 6 O2
6 CO2 + 6 H2O
Metabolismo oxidativo (formación de Biomasa) C6H12O6
6 C2 H5OH + 2 CO2
Metabolismo fermentativo (formación del alcohol) C2 H5OH + 3 O2
2 CO2 + 3 H2O
Metabolismo oxidativo del etanol (formación de biomasa) En la práctica se comprueba que el metabolismo de la glucosa es mucho más compleja, ya que según las cantidades ambientales, el metabolismo puede ser parcialmente fermentativo o parcialmente oxidativo (BRUSHMAN, 1980). IV.4.2. Clasificación de acuerdo al medio donde se desarrollan. a) . La fermentación Aeróbica. Es el proceso donde se suministra oxígeno al sistema y se desprende CO2. En general las fermentaciones aeróbicas pueden representar de la siguiente manera: m. o + Elementos Nutrientes + O2
C02 + Productos + m.o
- Los microorganismos son: Bacterias, levaduras, hongos, tejido celular. - Los nutrientes son: Carbono, hidrógeno azufre, fósforo, magnesia, sodio. - Las condiciones adecuadas para su desarrollo son: pH, temperatura, viscosidad, oxigeno disuelto y la segunda es un proceso en el cual no necesita oxígeno. (Jorgensen, 1995).
13 b) La fermentación Anaeróbica. Es un proceso en el cual no se necesita oxígeno, Cuando no hay oxígeno, en muchas formas de vida se detiene el mecanismo celular de respiración aeróbica, provocando su muerte; pero en otras, como en ciertas bacterias, el proceso se realiza por medio de un mecanismo al que los científicos bautizaron como respiración anaeróbica. A diferencia de la respiración aeróbica, en la anaeróbica no existe un solo grupo de reacciones químicas que la describan, ni siempre se obtienen los mismos productos finales. En ella, el lugar que ocupa el oxigeno atmosférico es reemplazado por sustancias inorgánicas oxigenadas, como los sulfatos y nitratos, en tanto que los productos formados, además del dióxido de carbono, suelen ser sustancias inorgánicas, en vez de agua. (Jorgensen, 1995) IV.4.3. Alcohol A Partir Del Almidón De La Papa. Para obtener etanol a partir de almidón es necesario romper las cadenas de este polisacárido para obtener jarabe de glucosa, el cual se puede convertir en EtOH mediante las levaduras. Por ello, se debe incluir una etapa adicional de hidrólisis (rompimiento, degradación) de este biopolímero. De cada 100g de almidón se pueden obtener teóricamente 111g de glucosa, lo que implica una relación estequiométrica de 9:10. El almidón fue tradicionalmente hidrolizado mediante ácidos, pero la especificidad de las enzimas, sus condiciones suaves de reacción y la ausencia de reacciones secundarias han hecho que las amilasas sean los catalizadores usados para esta tarea. Para la primera etapa de la hidrólisis de las suspensiones de almidón que tienen que ser llevadas a altas temperaturas (90-110 ºC) para el rompimiento de los gránulos de almidón, condición necesaria para el tratamiento enzimático. El producto de esta etapa o licuefacción es una solución de almidón que contiene dextrinas (oligosacáridos compuestos por varias unidades de glucosa) y pequeñas cantidades de glucosa. El almidón licuado se somete a sacarificación a menores temperaturas (60-70 ºC) con glucoamilasa obtenida de Aspergillus niger o de especies de Rhizopus la cual hidroliza las dextrinas hasta glucosa. (Nigam y Singh, 1995),
14
Se ha reportado la producción de EtOH a partir del almidón como papa, papa dulce. Se ha propuesto la hidrólisis del almidón de la papa para obtener soluciones de glucosa mediante un reactor enzimático de membrana de fibra hueca con conversiones de 97,3%. (Nigam y Singh, 1995). IV.4.4. Fermentación Alcohólica A Partir De La Papa. Se corta en lonjas un kilo de papas, los cuales se cuecen con 1.5 litros de agua y se pasan por un tamiz. Se forma una pasta el cual se vuelve a cocer añadiendo agua durante 1/2 a 1 hora agitando para que todo el almidón o fécula, cuyo proceso se sigue mediante Ia reacción que da con el yodo (la coloración al principio azul cambia después a roja y al final del proceso ya no se observa coloración alguna), a medida que progresa la sacarificación, el producto se hace cada vez claro. Una vez terminada la transformación de la fécula, se enfría a 30 ºC y se procede a introducir en un frasco o recipiente de 3 litros, añadiendo unos 10 gr. de levadura (preparar una pasta) se deja fermentar por espacio de 3 días. El producto resultante de la fermentación se procede a destilar (TELLO, 2004). IV.5. REGULACIÓN DE FACTORES DURANTE LA FERMENTACIÓN. IV.5.1. Nutrientes. Las Levaduras necesitan una fuente de carbono, otra de nitrógeno, minerales y vitaminas. Entre los minerales se tiene al: fósforo, potasio, azufre, magnesio, hierro, zinc, manganeso, cobre, etc. Se requieren también de oligo elementos o activadores de enzima. Como constituyentes de las otras fuentes tenemos los azucares, aldehídos, ácidos grasos, peptonas, aminoácidos, amoniaco, sulfato de amonio, cloruro de amonio e inositol. Se debe hacer notar que para el caso de las levaduras el fósforo es esencial para su metabolismo. Existen tres tipos de levaduras: (KRYACHKOV, 1980).
15 A. Levaduras altas. Son aquellas que se desarrollan ascendiendo durante la fermentación hasta la superficie del líquido en fermentación, en donde permanecen bien como cepa uniformemente distribuida o bien corno anillo en la pared del recipiente o cuba de fermentación. (KRYACHKOV, 1980). B. Levaduras bajas. Son aquellas que se desarrollan exclusivamente en el fondo del recipiente o cuba de fermentación. Pero durante la fermentación es lanzada hacia las partes superiores del líquido como consecuencia de la formación de anhidrido carbónico. (KRYACHKOV, 1980). C. Levaduras de Destilería. Es una variedad de la Saccharomyces cerevisiae que tiene la caracteristica de ser bastante estable y tolerar altas concentraciones de alcohol etílico (12%), sin perjudicar su calidad fermentativa. Hay levaduras que soportan hasta el 11 % del alcohol etílico pero tiene el inconveniente que no fermenta todo el azúcar presente en el mosto a fermentar. La saccharomyces cerevisiae tiene dos enzimas: C.1. La Invertasa, que da lugar a que la sacarosa se hidrolize, formando una molécula de glucosa y una molécula de fructuosa. C.2. La Zimasa que transforme la glucosa y fructuosa formados, en alcohol etílico y anhidrido carbónico. En realidad ésta zimasa está constituida por varias enzimas y co-enzimas, las cuales originan la fermentación alcohólica. (KRYACHKOV, 1980). D. COMPOSICIÓN QUIMICA DE LAS LEVADURAS. Las levaduras contienen aproximadamente de 68-83% de humedad las mismas que están constituidas de sustancias nitrogenadas, carbohidratos, lípido, vitaminas, minerales y otras sustancias, normalmente el contenido de nitrógeno varia entre 7 y 9 %, aun puede descender hasta 2.5 y ascender hasta un 14%. Un elevado porcentaje que esta entre 64-76%, lo constituyen las proteínas puras alrededor del 10% se presentan en las bases puricas. El
16 4% en las pirimidinas y cerca del 15% de nitrógeno total se presenta en forma de aminoácidos, nucleótidos y otros productos. (Salinas, 1998). IV.5.2. pH. Los microorganismos tienden a crecer en un intervalo limitado de pH y, aún dentro de éste intervalo frecuéntemente cambian su metabolismo como resultado de un cambio de incluso 1-1.5 unidades de pH. En general, las levaduras crecen en un intervalo de 3 a 6. Esto solamente es una generalización, puesto que ciertas bacterias y levaduras crecerán aunque con menor rapidez a valores de pH tan bajos como 2. Estos diferentes intervalos de pH para el crecimiento, se pueden usar durante las fermentaciones para reducir la posibilidad de contaminación. Así las fermentaciones de levaduras con frecuencia operan a un pH tan bajo como económicamente sea posible para evitar la contaminación bacteriana, con una consecuente reducción de los costos de esterilización. Durante las fermentaciones por lo general es necesario controlar el pH, cuando se forman productos ácidos como el ácido láctico, acético y cítrico o cuando los mismos sustratos de crecimiento son ácidos o bases, de modo que al consumirse el pH del medio cambiará de manera importante. (Scragg, 1997). IV.5.3. Temperatura. La temperatura afecta el crecimiento de manera notable, principalmente porque los microorganismos de una especie dada solo pueden crecer en un rango restringido de temperatura. Los psicrófilos presentan un rango de temperatura de 5 a 15°C, los mesófilos de 25 a 40 ºC y los termófitos de 45 a 60ºC. Además, debemos mencionar que la temperatura también afecta el rendimiento durante la fermentación. Las levaduras se desarrollan entre 25 a 45°C, su temperatura óptima es de 30 a 40ºC, pueden vivir en forma latente fuera de estos rangos, mientras no se inactiven sus enzimas. (Quintero, 1981)
17 Cuadro 4.Temperatura máxima, mínima y optima para la esporulación de algunas levaduras. LEVADURA Saccharomyces cerviciae S. pastorianus S. intermedius S. validus S. turbidaus
T max. ºC 35-37 29-32 27-29 31-33 33-35
Tmin. ºC 9-11 0.5-4 0.5-4 4.7-5 4-8
Topt. ºC 30 27.5 25 25 29
FUENTE: Prescot (2000) “Microbiología Industrial” Ed. Aguilar. IV.5.4. Oxigeno. Las levaduras pueden desarrollarse tanto en condiciones anaeróbicas como aeróbicas, lógicamente las rutas metabólicas serán diferentes. El oxígeno merece mención especial, pues su ausencia o abundancia permite una selección tanto de microorganismos como de productos del metabolismo. El crecimiento microbiano es función de muchas variables y todavía no se establecen relaciones matemáticas que cubran esos rangos de operación o interrelaciones con ellas. Sin embargo, con el conocimiento actual es posible iniciar una fermentación y poco a poco a través de la experimentación ira mejorando y dirigiendo el crecimiento y el metabolismo microbiano en el sentido que se desee: aumentando el rendimiento, disminuyendo el consumo de nutrientes o excluyendo selectivamente ciertos productos. (Quintero, 1981). IV.5.5. CONTENIDO DE AZUCAR: Se
puede
hacer
muchas
variaciones
en
los
procedimientos
de
fermentación, pero la mas recomendable deacuerdo a las experiencias en las destilerías sugieren el empleo de la concentración de azúcar en el empleo del mosto para la fermentación sea del 12 5 en peso. Si el mosto es demasiado concentrado el alcohol que se produce puede inhibir la acción de la levadura, lo que traería como consecuencia la prolongación del tiempo de fermentación y que no se convierte la parte del azúcar. La dilución execiva del mosto a fermentar es antieconómica, pues la extraña perdida de un valioso espacio de fermentación, como consecuencia de ello
18 aumenta el volumen del mosto a destilar trayendo consigo un mayor costo de producción en la destilería. (Charley, 2001) IV.5.6. TIEMPO DE LA FERMENTACIÓN. La duración de los periodos de fermentación es muy variada según el método que se emplee. Cuando se prepara la levadura madre se observo que la fermentación es alta o tumultuosa con un gran desprendimiento de anhídrido carbónico iniciado al cabo de las ocho horas en vista de que la reproducción de las levaduras ha sido lo suficientemente para la conversión de azucares fermentecibles en alcohol: mientras que si se añade la levadura directamente a la cuba de fermentación tarda en reproducirse, por lo tanto la fermentación tumultuosa se inicia a partir de las dieciocho horas. Concluye la fermentación a las 72 horas, mientras que en el caso anterior la finalización de la femetación es antes de las dieciocho horas. (Charley, 2001) IV.6. OPERACIONES DE DESTILACIÓN Y RECTIFICACIÓN. IV.6.1. Destilación. Es una operación de separación basada en las diferencias de volatilidad relativa en una mezcla, esto es, diferencia entre los puntos de ebullición de los componentes de la mezcla. La alimentación del mosto previamente filtrada se efectúa mediante una bomba de tornillo rodante. accionada por un mecanismo de Transmisión que permite la regulación continua de la velocidad en litros por hora. La destilación se puede efectuar en dos columnas de funcionamiento continuo; el mosto se precalienta en los tubos de un deflegmador (es una operación en la cual alguna mezcla de vapor generalmente saturado se someto a condensación parcial por medio de' enfriamiento por lo cual el vapor saliente se enriquece en el componente más volátil; es un intercambiador de tubos vertical y cilíndrico) para posteriormente alimentarse en la parto superior de lo primera columna do destilación. Los vapores do esta columna pasan a la segunda columna de destilación del cual se obtienen vapores con contenido de 60% vlv en promedio de alcohol el cual es condensado totalmente utilizando un condensador total vertical y un condensador de fases. (Márquez, 1998)
19 IV.6.2. Rectificación. Es también una operación de separación basada en diferencias de volatilidad relativa y tiene por objeto eliminar el contenido de impurezas de la mezcla a niveles permisibles y al mismo tiempo elevar el contenido de alcohol de Ia mezcla hasta el punto Azeotropico (En la mezcla alcohol agua se forma un azeótropo y no es posible superar este punto por destilación ordinaria a presión atmosférica) teóricamente. La operación en la columna de rectificación se inicia con reflujo total a efecto do conseguir 01 perfil de temperaturas adecuado para obtener el producto. A propósito, existen dos; formas de operar una columna intermitente: 1.- Rectificación a producto constante. Para cuyo efecto se debe cambiar la relación de reflujo en forma continua hasta alcanzar un valor máximo límite al funcionamiento de la columna de reflujo total. 2.- Rectificación a reflujo constante: Es en que la composición del destilado varía a mediada que se modifica la composición de la mezcla contenida en el calderin. (Márquez, 1998)
IV.7. FERMENTADOR. El fermentador o bioreactor es un recipiente en donde se desarrolla procesos bioquimicos, al cual se deberá proporcionar de un medio ambiente aséptico en el que únicamente se encuentran los microorganismos deseados. Para el funcionamiento de cualquier bio-reactor, se deben tener las condiciones necesarias para su esterilización y mantener la asépsia, debe contar con dispositivos que permitan el suministro de substratos o de nitratos, un control adecuado de temperatura y pH adecuado, niveles apropiados de oxigeno disuelto, evacuando los productos y sub productos, y una buena agitación que permita mantener las condiciones uniformes en todo el reactor. El diseño de un bio-reactor es específico para cada proceso biológico y su complejidad depende de los experimentos de proceso, por tanto un sistema no debe ser más complicado de lo que resulta ser necesario. (Vargas y Condori 2000). IV.7.1. TIPOS DE FERMENTADORES.
20 Por su funcionamiento, se tienen de dos tipos y son: a) Fermentadores Por Lotes Discontinuos. Se operan cargando inicialmente el sustrato y la cantidad total de reactivos, luego se procesa y después de, se descargan los productos, quedando nuevamente el reactor disponible para iniciar otro ciclo, dentro de ellos tenemos:
Tanque agitado
Estacionarios
b) Fermentadores Por Lotes Continuos. El equipo se mantiene operando en estado estable con una alimentación de reactivos y una descarga de productos constantes. (Vargas y condori 2000). De este tipo tenemos los siguientes:
Tanque Agitado.
Columnas empacadas con enzima inmovilizada.
Torres de lecho fluidizado donde el flujo del medio mantiene suspendidos los microorganismos.
Además tomando encuenta el estado físico de la mezcla reaccionante, los fermentadores se pueden dividir en: Homogéneos.-En los cuales las reacciones ocurren en una solo fase. Heterogéneos.- Donde se presentan en dos o mas fases.
IV.7.2. Descripción del Bioreactor Tipo Tanque con Agitación. Los fermentadores de tanque agitados mantienen un sistema homogéneo Mediante agitación mecánica que provoca una adecuada dispersión y mezclado
de
los
materiales
inyectados
consiguiéndose
una
mejor
transferencia de calor para mantener la uniformidad de la temperatura, y una rápida disolución de los gases burbujeados como el oxigeno en el aire. (Vargas y Condori 2000). IV.8. Diseño Y Puesta En Marcha De Un “Sistema Semicontinuo En Dos Etapas: Hidrólisis –Fermentación” Para La Producción De Etanol A Partir De Almidón De Papa Usando Simultáneamente Aspergillus Niger Y Saccharomyces Cerevisiae. ALONZO, (2006) Describe el diseño y evaluación de las variables que gobiernan el sistema semicontinuo en dos etapas: hidrólisis - fermentación para la producción de etanol a partir de almidón de papa usando
21 simultáneamente Aspergillus niger y Saccharomyces cerevisiae, con resultados comparables a los del método clásico de monocultivo pero con tiempos de bioproducción inferiores. La hidrólisis del almidón y posterior fermentación produjo cantidades significativas de biomasa, azúcares simples,
y
enzimas
como
productos
colaterales
al
etanol.
Los
microorganismos tipo nativo del Aspergillus niger y Saccharomyce cerevisiae utilizadas en este estudio fue suministrada por el Laboratorio de Investigaciones Microbiológicas de la Universidad Industrial de Santander. ALONZO, (2006), describe el Bioreactor semicontinuo que consta de un reactor por cada etapa del proceso. Cada reactor tiene una capacidad de 2 litros construido en vidrio con tapas esmeriladas con cuatro accesos; dos para la entrada y salida de gases, una para suministro de inoculo y de medio nuevo y otra para monitoreo de muestras y control de temperatura. Entre los reactores se encuentra el Biofiltro, de 1 litro de capacidad en vidrio con tapa esmerilada y unido con los reactores por medio de conectores en vidrio provistos de válvulas de paso tipo bureta. indica que dentro del biofiltro se encuentra primero el prefiltro que es una malla circular en alambre que soporta una capa de lana de vidrio de 3mm de espesor con el fin de retener las partículas más grandes como las dextrinas y el micelio de Aspergillus niger a 4 cm del prefiltro se encuentra el filtro de membrana de 0.2 micras el cual retiene las unidades reproductoras de Aspergillus niger, garantizando la esterilidad del los hidrolizados de almidón que van al reactor de fermentación con la Saccharomyces cerevisiae. Para disminuir el tiempo de filtración y aumentar su eficiencia el biofiltro posee un desprendimiento lateral para la conexión a la bomba de vacío con su respectiva trampa. ALONZO, (2006).Señala las variables objeto de estudio fueron: Velocidad de crecimiento, tiempo de generación, sustrato limitante, concentración del producto, concentración celular, flujo volumétrico, tasa de dilución como base para la determinación de la µmax , Ks , Productividad, Concentraciones de biomasa y sustrato en el equilibrio. Determinando lo anterior se puede decir que se tiene la descripción experimental del cultivo continuo de acuerdo a la Teoría del Quimiostato para cada etapa del proceso. Se
22 realizaron 3 experimentos completos para concentraciones de almidón iniciales de 2, 4, y 8 g/100mL respectivamente. En cada experimento se realizaron los siguientes pasos: Primero hidrólisis del almidón de papa por Aspergillus niger a la concentración inicial de almidón indicada, para un volumen de 1 litro de cultivo y un tiempo de hidrólisis de 60 horas en la primera etapa y 48 horas después de cada suministro de medio nuevo. El segundo paso, una vez trascurrido el tiempo de la hidrólisis es la Filtración de 500mL de hidrolizados eliminando Aspergillus niger y la dextrina limite con el fin de "esterilizar" el futuro medio para la fermentación de los azúcares en el tercer paso. En este ultimo paso el filtrado es recibido en el bioreactor de fermentación que contiene el inoculo de Saccharomyces cerevisiae en un medio de hidrolizado de almidón con el fin de eliminar la etapa de adaptación y arrancar en etapa de crecimiento exponencial para la producción de etanol. El tiempo de fermentación alcohólica fue de 48 horas a condiciones anaeróbicas. El suministro de medio e inoculo nuevo, 500mL, para el bioreactor de hidrólisis se realiza una vez se hayan evacuado los 500mL de hidrolizado hacia el biofiltro transcurridas las 60 horas iniciales de hidrólisis, después el periodo de suministro se realiza cada 48 horas para un flujo volumétrico de 500mL/48 horas en las dos etapas. Se consideraron tres suministros para cada experimento a intervalos de 48 horas. ALONZO, (2006), hidrólisis.
Para
indica las condiciones de cultivo para la etapa de todos
los
experimentos
la
inoculación
fue
de
aproximadamente 105 conidiosporas, conteo realizado mediante cámara de Neubahuer, las concentraciones de las sales del medio de cultivo corresponden al medio mineral Czapek (composición, g/litro de NaNO3, 3; K2HPO4, 1; MgSO4. 7H2O, 0.5; KCl, 0.5; FeSO4 . 7H2O, 0.01) y almidón de papa como fuente de carbono. El volumen total del medio fue de 1000 mL, se suministró oxígeno al medio durante todo el proceso mediante bomba de acuario (Power 500, Aquarium Air Pump) con una tasa de volumen de aire aproximadamente
de
90
litros
por
hora.
ALONZO, (2006), indica las Condiciones para la etapa de fermentación. Para todos los experimentos la inoculación fue de aproximadamente 106 levaduras,
conteo
realizado
mediante
cámara
de
Neubahuer,
las
23 concentraciones de las sales del medio de cultivo corresponden al medio mineral proveniente del cultivo de la hidrólisis una vez retirado el Aspergillus niger, la fuente de carbono corresponde a los azúcares producto de la hidrólisis del almidón. El volumen total del medio fue de 1000 mL. Las concentraciones de azúcares están indicadas para cada experimento al igual que los intervalos de muestreo. Cada muestra tomada fue filtrada con el fin de separar la levadura a través de dos capas de papel filtro cualitativo Whatman. La masa celular fue secada a 110°C con pesos constantes para evaluar la proteína unicelular. Los filtrados fueron utilizados para la cuantificación del alcohol los azúcares reductores y la glucosa. IV.8.1.Determinación de nitrógeno y proteína en la biomasa.- La determinación de nitrógeno total se realizó por el método de Kjeldalh. (William, 1984) IV.8.2. Determinación de Carbohidratos Totales.- Los Azúcares Totales son determinadas en muestras duplicadas de filtrados fungales con el Método de Fenol - Acido Sulfúrico. (Wistler, 1964.). IV.8.3. Determinación de los Azúcares Reductores. Los Azúcares Reductores son determinadas en muestras duplicadas de filtrados fungales con el Método de Bernfeld, utilizando el Acido 3,5-dinitrosalicílico. IV.8.4. Determinación del Almidón en el medio. La determinación de almidón se realiza mediante lecturas de absorbancias del complejo coloreado de yoduro-yodato más almidón a 640 nm contra una curva de calibración. (Nielson, 1963). IV.8.5.
Determinación de Glucosa. La Glucosa es determinada por el
Método de Glucosa Oxidasa y peroxidasa utilizando el Kit de Sera - Pak.
IV.8.6.
Determinación
de
las
concentraciones
de
Etanol.
La
concentración del etanol fue determinada mediante el método de gravedad específica por picnómetro, de acuerdo a la metodología de la A.O.A.C 9.012/80. (Abouzied, 2002).
24
Estudio De Los Factores Que Afectan La Hidrólisis Enzimática Y El Proceso Fermentativo Para La Producción De Alcohol A Partir De Papa (Solanum tuberosum). IV.9.
González y Córdoba (2006), estudiaron a nivel de laboratorio, la hidrólisis enzimática y la fermentación de la papa (Solanum tuberosum), a fin de determinar las mejores condiciones para producir alcohol. En la primera etapa experimental se analizó el efecto sobre la conversión a azúcares reductores,
de
la
concentración
de
las
enzimas
α-amilasa
y
amiloglucosidasa, la concentración de sustrato y el tiempo de sacarificación. Se determinó que el efecto combinado entre las concentraciones de la enzima α-amilasa y el sustrato presentó significancia estadística; la conversión a azúcares reductores se ve favorecida al utilizar los valores de 0,8 mL/kgsustrato y 20 % respectivamente. La concentración de la enzima amiloglucosidasa y el tiempo de sacarificación no presentaron significancia estadística, por lo que se recomienda utilizar 0,8 mL/kgsustrato y un tiempo de 14 h. En la segunda etapa experimental realizaron el seguimiento cinético de la hidrólisis y se sugiere disminuir el tiempo de acción de la enzima αamilasa a 0,5 h y para la sacarificación utilizar un período de 15 h. Además, se encontró que el valor máximo de torque requerido para la agitación en el proceso de gelatinización fue de 11 N·cm y de 1 N·cm para la dextrinización y la sacarificación, respectivamente. (González y Córdoba, 2006). En la fermentación alcohólica del sustrato hidrolizado, estudiaron el efecto de la concentración de células y la presencia de biotina como promotor de la fermentación. Se encontró que la concentración de células no es significativa y se recomienda utilizar una concentración de 50 millones células/mL. La presencia del promotor presentó significancia estadística entre los niveles utilizados. Al evaluar el efecto de cuatro concentraciones del promotor, se observó que la concentración de 0,2 mg/kg favorece la producción de alcohol. En la etapa del seguimiento cinético de la fermentación, se obtuvo un consumo de azúcares reductores de 91 %, una concentración máxima de alcohol de 10,33 % v/v, un rendimiento de etanol con respecto al ideal de 0,98 y una eficiencia de la fermentación de 0,91. El rendimiento de etanol para el proceso global fue de 0,0746 kgetanol/kgpapa.
25 IV.9.1. Evaluación de las condiciones para la hidrólisis enzimática de la papa. El objetivo de esta evaluación fue encontrar aquella combinación de concentraciones de las enzimas a-amilasa (0,6 mL/kg papa seca y 0,8mL/kg papa seca) y amiloglucosidasa (0,8 mL/kgpapa seca y 1,0 mL/kg papa seca), concentración de sustrato (razón de sustrato seco y agua, 15% y 20 %) y tiempo de reacción con la enzima amiloglucosidasa (14 h y 18 h). Se utilizó un diseño factorial completo de 24 a dos niveles, la variable de respuesta fue el rendimiento de azúcares reductores, expresado como masa de azúcares reductores producidos por unidad de masa de sustrato. Se compararon los valores de la variable de respuesta con el fin de encontrar las condiciones que maximizan la conversión del almidón en azúcares reductores, mediante un análisis de efectos. (González y Córdoba, 2006). Para lograr esto, se colocó una masa conocida del sustrato en el recipiente destinado para la hidrólisis, según la corrida aleatorizada del diseño experimental, se le adicionó cloruro de calcio (40 ppm) y se llevó a un pH de 6,5. Con un baño térmico se elevó la temperatura de la mezcla hasta 95 ºC y se llevó a cabo el proceso de dextrinización por un período de 2,5 h con una agitación constante de 225 r/min. Al final de esta etapa se debió enfriar la mezcla hasta 60 ºC y agregar HCl hasta alcanzar un pH de 4,5 para desactivar la enzima. Se agregó la cantidad de amiloglucosidasa (AMG) que correspondiera según el diseño para continuar con la etapa de la sacarificación por el tiempo determinado, con una agitación de 150 r/min. Terminada esta etapa, se inactivó la enzima y se analizaron las muestras para determinar la cantidad de azúcares reductores. (González y Córdoba, 2006).
IV.9.2. Cinética de las enzimas α-amilasa y amiloglucosidasa (AMG) en la hidrólisis enzimática de la papa.
26 El objetivo de esta etapa fue realizar un seguimiento de la cinética de las dos enzimas utilizadas durante la hidrólisis de la materia prima. Se tomaron muestras cada 30 min para la primera enzima y cada hora durante la sacarificación para determinar el comportamiento de la cantidad producida de azúcares. Para este estudio se realizó la hidrólisis enzimática de la papa, en un volumen de 3 L. Se utilizaron las mejores condiciones obtenidas de la fase experimental de la hidrólisis enzimática. Para el seguimiento de la cinética de las enzimas
a-amilasa y AMG, se utilizó una concentración de
sustrato de 20 %, una concentración de la enzima de α-amilasa de 0,8 mL/kgsustrato seco, una concentración de la enzima de AMG de 0,8 mL/kgsustrato seco, un tiempo de sacarificación de 20 h y las mismas condiciones de pH, concentración de cloruro de calcio, temperatura, agitación
y
tiempo
utilizadas
previamente
en
la
dextrinización
y
sacarificación. Además se utilizaron los mismos métodos para la desactivación de cada una de las enzimas. (González y Córdoba, 2006). IV.9.3. Estudio del requerimiento de torque en la hidrólisis enzimática de la papa. El estudio consistió en hacer un seguimiento del requerimiento de torque durante la hidrólisis de la papa, para determinar el valor máximo y poder posteriormente utilizar esta información para el cálculo de potencia para efectos de cambio de escala. Para poder realizar esto, se fija la velocidad de agitación a 225 r/min., utilizando un agitador de hélice y se fija una relación de diámetro de agitador a diámetro de recipiente de 0,39, una relación de altura de agitador a diámetro de agitador de 0,16 y una relación de altura de líquido a diámetro de recipiente de 1. El análisis consiste en varias etapas, una primer etapa que inicia en el momento en que el recipiente se coloca en el baño de agua a una temperatura de 95 ºC hasta 10 min después de la adición de la enzima α-amilasa; la segunda es inmediata y transcurre hasta finalizar la dextrinización y la última etapa, en la que ocurre el proceso de sacarificación. El requerimiento de torque en la etapa de dextrinización se tomó cada 10 s, en la etapa de sacarificación cada minuto; además se realizaron mediciones de temperatura y pH. (González y Córdoba, 2006).
27 IV.9.4. Evaluación de las condiciones para la fermentación del sustrato hidrolizado. El objetivo fue encontrar aquella combinación de concentración del microorganismo S. cerevisiae (50 millones de células/mL sustrato hidrolizado y 100 millones de células/mLsustrato hidrolizado) y la ausencia o presencia de un promotor (0,2 mg/kgsustrato hidrolizado) de la fermentación, según un diseño factorial completo 22, duplicado, que permita obtener el máximo rendimiento de etanol, expresado como la concentración de etanol (% v/v). El conteo de células se realizó con un microscopio y una cámara de Neubauer. El sustrato se preparó hidrolizando la harina de papa de la misma manera como se preparó en el estudio de la cinética de las enzimas, pero utilizando recipientes de 3,5 L para hidrolizar una masa de disolución de 3000 g. Al final de la sacarificación, se filtró el hidrolizado obtenido, se reguló el pH a un valor de 4,5 y se agregaron nutrientes a las concentraciones, utilizando cantidades semejantes a las reportadas. Este jarabe se distribuyó en erlenmeyers de 250 mL, con una cantidad de jarabe de 200 g, cerrados, que funciona como una válvula reguladora de presión. (Araya, 1998). Cuadro 5.Concentraciones de los nutrientes a utilizar en la fermentación.
NUTRIENTE
CONCENTRACIÓN(g/L)
Nitrato de amonio
2,00
Sulfato de Magnesio
1,00
Fosfato monoacido de potasio
1,00
Extracto de levadura
2,00
Fuente: (González y Córdoba, 2006) La fermentación se realizó a una temperatura de 31ºC en un baño con agitación a 150 r/min. Al finalizar la fermentación se inactiva el microorganismo, se centrifugó y se realizó la determinación del índice de refracción del destilado, previa realización de una curva de calibración, con
28 la que se interpoló de ella la concentración de etanol en porcentaje en volumen. IV.9.5. Evaluación de la concentración del promotor en la fermentación de la papa hidrolizada. González y Córdoba, (2006). Para evaluar el efecto únicamente de la concentración del promotor sobre la conversión de etanol, se realizaron experimentos adicionales, a cuatro concentraciones de promotor (0, 0.1,0.2 y 0.3) mg/kgsustrato hidrolizado. Se utilizaron las mismas variables fijas mencionadas
en
la
sección
anterior
y
se
utilizaron
50
millones
células/mLsustrato hidrolizado. (González y Córdoba, 2006) IV.9.6. Seguimiento cinético de la fermentación en un reactor de 5 litros. El objetivo del seguimiento a mayor escala, es determinar los diferentes parámetros cinéticos del período de fermentación. Para esta etapa, se preparó una suspensión de harina de 6 L de sustrato, la cual se hidrolizó, obteniéndose un volumen de filtrado aproximado de 4,5 L y se dividió en dos porciones para realizar por duplicado la fermentación. Se utilizaron las mismas condiciones en la primera evaluación de la fermentación. Al hidrolizado se le agregaron los nutrientes, que se inoculó con una cantidad de microorganismos de 50 millones células/mLsustrato hidrolizado y una concentración
de
promotor
de
0,2
mg/kgsustrato
hidrolizado.
La
fermentación se llevó a cabo en un reactor de 5 L, el cual tiene un sistema de agitación, calentamiento y/o enfriamiento y un puerto para toma de muestras. Para el seguimiento cinético se midió la concentración de etanol de azúcares reductores y la concentración de microorganismos; el tiempo de fermentación es de 30 h y se tomaron periódicamente muestras para los análisis. Al finalizar la fermentación se tomó una muestra y se analizó en el Laboratorio de Control de Calidad de la Fábrica Nacional de Licores para determinar los congenéricos mediante HPLC, según el método IT-008. (González y Córdoba, 2006). Figura 3: Variación de la concentración de alcohol con el tiempo.
29
FUENTE: González y Córdoba, (2006)
IV.10. DISEÑO DE EXPERIMENTOS PARA LA HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN DE PAPA POR VÍA QUÍMICA Y PARA LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA. IV.10.1. Diseño Factorial Completo.- Se utiliza en la planeación de experimentos que produzcan una información confiable en el menor número de ensayos. El número de experimentos que se deben efectuar es 2n donde n es el número de variables independientes de dicho proceso. (Grosz, 1999). IV.10.2. Determinación de las variables y sus niveles.- El primer paso a seguir es la escogencia de las variables que puedan ser controladas durante el proceso y sus niveles mas adecuados. Después de una búsqueda bibliográfica y ensayos preliminares se consideran las variables más influyentes como independientes. Los demás valores de las variables del proceso se mantienen constantes. (Grosz, 1999). Los valores mas apropiados de las variables del proceso, se dan como un rango dentro del cual se determinan los niveles apropiados para el diseño. El nivel máximo se simboliza como (+) y el nivel mínimo como (-). La variable dependiente o respuesta se simboliza como Y. En el caso de que cada
30 experimento se realice como replica, la respuesta Y es el promedio de las dos respuestas, como se expone a continuación:
Y1 =
( Y11 + Y12 )
2
Y11, Y12 = Respuesta del experimento y su replica. Y1 = Promedio de la respuesta. Para poder determinar la precisión de la experimentación se hace un análisis estadístico utilizando experimentos de control. Con los datos del análisis estadístico se plantea el modelo matemático que describe la significación de las variables en el proceso. Obtenidos los anteriores resultados se calcula los efectos simples, dobles y triples de las variables. De acuerdo a los ensayos preliminares las variables seleccionadas (n) y sus niveles máximos (+) y mínimos (-) para la hidrólisis del almidón (Grosz, 1999). V. OBJETIVOS DEL ESTUDIO. V.1. Objetivo General. “Obtener alcohol a partir del almidón de la papa” V.2. Objetivo especifico. •
Determinar el % de rendimiento para la hidrólisis del almidón de la papa mediante una ecuación
•
Determinar el % de rendimiento para la fermentación alcohólica mediante un modelo matemático.
•
Determinar las características físico-químicas del alcohol proveniente de la fermentación del almidón de la papa.
VI.
HIPÓTESIS. VI.1. Hipótesis General.,
31 La obtención de alcohol por el proceso semicontinuo hidrólisisfermentación depende del almidón de la papa para la hidrólisis y del tipo de microorganismo para la fermentación (Saccharomyces cerevisiae) y de las condiciones de operación del bioreactor. VI.2. Hipótesis especifico. •
El % del rendimiento de la hidrólisis del almidón de la papa esta en función de la Concentración de [HCl], la Concentración de Almidón y Tiempo de hidrólisis con estas variables y con los resultados en el laboratorio se pueden hallar dicha ecuación.
•
El % de rendimiento para la fermentación alcohólica depende de la temperatura, concentración de azucares totales y pH con estas variables y con los resultados en el laboratorio se puede hallar un modelo matemático.
•
La
determinación
de
las
características
físico-químicas
depende del etanol convertido en producto de la fermentación alcohólica del almidón de la papa. VII. Identificación de variables: VII.1. Variable Independiente. Almidón de la papa (materia prima) VII.2. Variable dependiente. Alcohol del almidón de la papa (producto)
VII.3. Variables Intervinientes. -Tiempo de hidrólisis,
32 -Temperatura -Concentración de azucares totales -El pH. Cuadro 6: Operacionalización De Variables. VARIABLES Variable Independiente (Vi) Almidón de la papa
INDICADORES
ÍNDICES
VALORACIÓN
1. Recurso Agrícola
1.1. Papas andinas
Kg
2.Caracterización Química del almidón de la papa
2.1.Contenido Humedad, proteína, grasa, cenizas, fibra y carbohidratos
2.2 Rendimiento de la
% %
hidrólisis del almidón Variables dependientes (vd) Alcohol Etílico
Variables Intervinientes (Vit) Tiempo
1.Caracterización Físico y química del alcohol obtenido
1.1. Grado Alcohólico. 1.2. pH.
1.3. Densidad 1.4. Rendimiento de la fermentación alcohólica
-ºGL. -pH. g/ml. %
1.Cantidad de tiempo para la hidrólisis
1.1. Tiempo
- Horas
(Vit) Temperatura
2.Cantidad de calor en la fermentación alcohólica
1.2.Temperatura
- ºC
(Vit) Concentración de azucares totales
3.Cantidad de azucares totales
1.3. Concentración
- ºBrix
(Vit) pH
Acidez del fermento
1.4. pH
- % acidez
VIII.
UTILIDAD DE LOS RESULTADOS DE ESTUDIO.
33 -Los resultados del trabajo de investigación sirven para que tenga como referencia para la potencial industrialización del almidón de la papa y sobre la obtención de nuevas fuentes de energía. -Además el alcohol obtenido apartir de la fermentación del almidón de la papa se podrá utilizar como disolventes y/o como insumo Alcohol Etílico para la industria ya que el alcohol etílico es menos dañino para la salud, en su consumo, menos contaminante para el medio ambiente y traerá beneficios en el comercio. IX. METODOLOGIA. IX.1.Tipo de estudio. Investigación aplicada basada en principios científicos tecnógicos. Durante el proceso de obtención del alcohol. IX.2. Material Experimental Y Equipos. a. Materia prima En esta investigación se utilizara el almidón de la papa (solanum tuberosum) como materia prima la cual será adquirida en el
mercado de puno. b. iniciador.
La levadura para iniciar la fermentación alcohólica es el Saccharomyces cerevisiae. c. Material de laboratorio. •
Vaso de precipitados de 500ml.
•
Pipetas
•
Termómetro
•
Papel filtro.
•
Matraz de erlenmeyer,
•
Tamiz de 0.1mm.
•
Recipientes.
34 d. Instrumentos y equipos de laboratorio • Autoclave, temperatura 120°C y a una presión de 15 psi. • Fermentador
de
10
litros
de
capacidad
semi-industrial
(construido de acero inoxidable) de la FIQ-UNA Puno. • Destilador. • Estufa (0-60ºC). • Refractómetro (0-32ºBrix). • Balanza Analítica. • Potenciometro (pH) • Alcoholímetro de laboratorio de 0-35 ºGL. e. REACTIVOS QUIMICOS: •
Acido clorhídrico.
•
Agua destilada.
IX.3. PROCEDIMIENTO. IX.3.1. AISLAMIENTO DEL ALMIDÓN DE LA PAPA. La extracción del almidón de la papa se realizó de acuerdo a los siguientes pasos: A.1. Primero: Lavado; con el fin de retirar tierra y otras impurezas que trae la papa. A.2. Segundo: pelado; se realiza a mano, teniendo el cuidado de no retirar también parte del tubérculo con la cáscara. A.3. Tercero: licuado. Se hace pasar la papa sin cáscara por un extractor de jugos, con el fin de extraerle todo el jugo que tiene la biomasa de la papa A.4. Cuarto: sedimentado; consistió en decantar la lechada que sale del tamiz para separar los gránulos del agua A.5. Quinto: el Secado; Tanto el almidón como la fibra se secan en una estufa a 60ºC de temperatura y durante 24 horas. (LEON, 2005).
35 IX.3.2. HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN DE PAPA. Se realizó Hidrólisis Acida, controlando la temperatura de reacción, presión de reacción, concentración del ácido y del almidón. Con el almidón hidrolizado se obtienen azúcares fermentables mediante rompimiento de las cadenas de glucosa. Los pasos que se siguen en la Hidrólisis de almidón por vía química son los siguientes: Se pesa una cantidad de almidón para un volumen de 800mL y para una concentración dada de ácido en un erlenmeyer de 1L que fue llevado al autoclave x , condiciones de 15 psi, durante 30 minutos a una temperatura de 120°C, terminada la hidrólisis se filtra al vacío y luego se determina la cantidad de azúcar obtenida. (LEON, 2005). IX.3.3. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA. Ambas etapas, hidrólisis y fermentación anaeróbica son realizadas en el Bioreactor de Tanque Agitado controlando las variables de pH, Temperatura, Agitación, Tiempos de hidrólisis y de fermentación y Concentración de sustratos. Los experimentos de producción de etanol en el Bioreactor están planteados de acuerdo a un diseño factorial de experimentos que permite el análisis estadístico de los resultados (LEON, 2005). Figura 4: Reactor De Tanque Agitado.
FUENTE: Vargas Y Condori, (2000)
36 Figura 5: Diagrama de flujo en la obtención de alcohol del almidón de la papa.
Materia prima papa. Licuefacción. Almidón. Hidrólisis. Saccharomyces Cerviciae.
Fermentación.
Ácido clorhidrico.co Reactor Fermentador.
Destilación. Etanol.
IX.4. METODO DE ANALISIS. IX.4.1. Control y análisis de la materia prima. El almidón de la papa tiene las siguientes propiedades. Propiedades físicas organolépticas: •
Color
•
Olor
•
Sabor
IX.4.2. Análisis De La Composición Química Del Almidón Extraído •
Contenido de humedad, método gravimetrito.
37
•
Nitrógeno y proteína en la biomasa, por el método de Kjeldalh.
•
Carbohidratos Totales. Los Azúcares Totales según muestras duplicadas de filtrados fungales con el Método de Fenol - Acido Sulfúrico.
•
Almidón en el medio, según las lecturas de absorbancias del complejo coloreado de yoduro-yodato más almidón a 640 nm contra una curva de calibración.
IX.4.3. Análisis fisicoquímico de la fermentación alcohólica. •
Sólidos solubles, método refractometrico (ºBrix).
•
Grado alcohólico, método del alcoholímetro para determinar el grado alcohólico.
•
Densidad, se mide utilizando el picnómetro.
•
pH medido con el potenciómetro.
IX.5. Determinación del El Porcentaje de Rendimiento de la Hidrólisis. Se obtiene mediante la relación del Azúcar Teóricamente esperado con respecto al valor leído experimentalmente de acuerdo a la siguiente relación: (Grosz, 1999) Y =
360 g .de .glu cos a * X .gramos .de .almidón * 0.9 = Azúcar .Teórico 342 .g .de .almidón
Donde: - 360 g de glucosa corresponden al peso de dos moléculas de glucosa que se hidrolizan de una unidad monomérica (maltosa) del almidón. - 342 g peso de una unidad monomérica de almidón. - 0.9 es la fracción que indica que el 90% del almidón hidrolizan a azúcar, tomando un 10% en pérdida por almidón que no se alcanza a hidrolizar. % Re n dim iento =
Azucar exp erimental *100 Azucarteor ica
38 IX.6.
Determinación
del
El
Porcentaje
de
Rendimiento
de
la
Fermentación Alcohólica. Grosz, (1999). El Porcentaje de Rendimiento de la Fermentación Alcohólica se obtiene mediante la relación entre la cantidad real de alcohol producido y la esperada teóricamente en base a la concentración de azúcar de la solución a fermentar. Se expresa en porcentaje entre el volumen de alcohol determinado y el volumen esperado teóricamente. Si se trata de X gramos de azúcar, maltosa, el volumen de alcohol esperado teóricamente será: Y =
X .g .de .maltosa 100 .mL .de .solución
*
184 .g .de .alcohol 360 .g .de .maltosa
*
500 0,79
En donde: Y = mL de alcohol teórico, 184 es el peso de 4 moléculas de alcohol etílico que por fermentación se producen a partir de una molécula de maltosa o dos de glucosa, 360 es el peso de una molécula de maltosa equivalente a dos de glucosa, 0.79 es la densidad del etanol en g/mL, 500 es el volumen en mL medido para cada fermentación. (Grosz, 1999)
% Re n dim iento =
Alcohol . exp erimental * 100 Alcohol .Teórico
IX.7. Diseño De Experimentos para la Hidrólisis del Almidón de papa. De acuerdo a referencias bibliograficas y ensayos preliminares las variables seleccionadas (n) y sus niveles máximos (+) y mínimos (-). Manteniendo constante la temperatura de 120°C, la presión de 15 psi y el volumen de hidrólisis de 800 mL. Se realizan tres experimentos de Control (simbolizados como “0” en la matriz del diseño) que no son más que tres replicas con valores de variable intermedio de a los valores superior e inferior como lo muestra la matriz del diseño con el fin de evaluar el límite de confiabilidad de los experimentos de la matriz de diseño factorial e identificar los efectos significativos de la acción de las variables en forma individual o conjunta.
39 IX.7.1. OPTIMIZACIÓN DE LAS VARIABLES DE PROCESO. CUADRO 7: Niveles de variables a investigar. Variables
Unidad
Z1: Concentración de [HCl] Z2: Concentración del Almidón [AL] Z3: Tiempo de hidrólisis
Niveles
(N:mol/L) (%)
Inferior 0.05 6
Superior 0.10 18
(min.)
10
30
Fuente: Elaboración propia Donde: N=2n
N=23=8
CUADRO 8: Matriz de Diseño (2n) para la Hidrólisis del Almidón de la papa. Codificación ºN de Experimentos
Z1
Z2
Z3
Concentració n de [HCl]
Variables Concentración de Almidón
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
-1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 0 0 0
-1 -1 +1 +1 -1 -1 +1 +1 0 0 0
-1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 0 0 0
0.05 0.10 0.05 0.10 0.05 0.10 0.05 0.10 0.075 0.075 0.075
6 6 18 18 6 6 18 18 12 12 12
Tiempo de hidrólisis 10 10 10 10 30 30 30 30 20 20 20
Fuente: Elaboración propia IX.7.2. MODELO MATEMATICO PARA LA HIDROLIZIS DEL ALMIDÓN. % Re n dim iento = a 0 + ∑a 0 x1 + ∑a 2 x1 x 2 + ∑a3 x1 x 3 + ∑a 4 x1 x 2 x 3
x1 =
HCl − 0.075 0.025
40 x2 =
A −12 6
x3 =
t − 20 10
IX.8. Diseño De Experimentos para La Fermentación Alcohólica. Para la fermentación de los hidrolizados de almidón a alcohol por parte del Saccharomices cerevisiae fueron: La Temperatura (nivel superior 37°C, nivel inferior 25°C), el pH (nivel superior 6.0, nivel inferior 4.0, mediante buffers), y la concentración de azúcares reductores totales (nivel superior 12%, nivel inferior 6%). Manteniendo constante la concentración del inoculo, flujo de aire, la concentración de sales, y el tiempo de la hidrólisis (96 horas). IX.8.1. OPTIMIZACIÓN DE LAS VARIABLES DE PROCESO. CUADRO 9: Niveles de variables a investigar. Variables
Unidad
C1: Temperatura C2: Azucares totales C3: pH
Niveles Inferior
Superior
(ºC) (%)
25 6
37 12
Mol/l H+
4
6
Fuente: Elaboración propia
Donde: N=2n N=23 N=8 CUADRO 10: Matriz de Diseño para la fermentación Alcohólica. Codificación ºN de Experimentos
C1
C2
C3
1 2
-1 +1
-1 -1
-1 -1
Variables Azucares Temperatura totales 25 37
6 6
pH 4 4
41 3 4 5 6 7 8 9 10 11
-1 +1 -1 +1 -1 +1 0 0 0
+1 +1 -1 -1 +1 +1 0 0 0
-1 -1 +1 +1 +1 +1 0 0 0
25 37 25 37 25 37 31 31 31
12 12 6 6 12 12 9 9 9
4 4 6 6 6 6 5 5 5
Fuente: Elaboración propia
IX.8.2. Modelo Matemático para la fermentación Alcohólica. % Re n dim iento = b0 + ∑b1 X 1 + ∑b2 X 1 X 2 + ∑b3 X 1 X 3 + ∑b4 X 1 X 2 X 3
X1 =
T − 31 6
X2 =
AZU − 9 3
X3 =
pH − 5 1
X. ÁMBITO DE ESTUDIO. El presente trabajo de investigación se ejecutara en los laboratorios de procesos, bioquímica y análisis instrumental de la facultad de ingeniería química. XI. RECURSOS. XI.1. RECURSOS HUMANOS. Nombre Higinio Zúñiga Laboratorista
Función
Dedicación
Pago
Tutor Asistente
semanal 20 30
Mensual ($) 300 350
XI.2. RECURSOS MATERIALES.
Total ($) 1750 1600 3350
42 Descripción
Precio Unitario
Unidad
Cantidad
Total ($)
200
Un
Un
150 150
Infraestructura. Laboratorio
Materia prima. papa
0.35
Kg.
9
3.15 3.15
mL mL mL mL
10 1000 10 10
2 1 1.5 3.5
Reactivos Químicos: Acido clorhídrico Agua destilada Acido Sulfúrico Ioduro de potasio
2 1 1.5 3.5
8 Material De Laboratorio. Autoclave Bioreactor Balanza Analítica Destilador. Estufa
20 50 10 50 30
Un Un Un Un Un
1 1 1 1 1
20 50 10 50 30 160
80 80 50 30
Un Un Un Un
1 1 1 1
80 80 50 30 240
Material de Análisis. Refractómetro Potenciómetro Alcoholímetro Picnómetro
Tratamiento de la materia prima y obtención del almidón. Lavado Pelado
5 10
Un Un
1 1
5 10
43 Licuado sedimentado secado
15 5 25
Un Un Un
1 1 1
15 5 25 60
millón Un Un Un
1 4 3 3
1 20 9 12
Servicio de cómputo. Papel bond Impresión Empastado Copias de tesis
1 5 3 4
42
X.3. PRESUPUESTO DEDL PROYECTO. RUBRO Infraestructura. Materia prima. Reactivos químicos. Material del laboratorio. Material de análisis. Tratamiento de la M.P. y obtención del almidón. Servicio de cómputo. Imprevistos (10%). TOTAL
$ 150 3.15 8.5 160 240 60 42 66.365 663.65
Tipo de cambio 1$ = S/. 3.3
XI. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES. Código A1 A2 A3 A4 A5
Descripción Revisión bibliografica Formulación del marco teórico Adquisición de equipos y materiales Implementación del laboratorio Revisión de estrategia experimental
Duración (semanas) 2 1 1 1 1
44 A6 A7 A8
Ordenamiento de resultados Análisis de los resultados Redacción del informe final
Código
1 1 2
Semanas
Actividad 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
XII. BIBLIOGRAFÍA. Abouzied, M. M. (1986), Direct Fermentation of Potato Starch to Ethanol by Cocultures of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae. Environ. Microbiol., 52(5), 1055-1059. Afanador, A. M. 2005. El Banano verde en la producción de etanol. Biol Waste, 557(3), 51-68. Alonzo, (2006, 31 de Agosto). Diseño y puesta en marcha de un "sistema semicontinuo en dos etapas: hidrólisis - fermentación" para la producción de etanol a partir de almidón de papa. Boletín de la Papa, 6(10), 20-25. Extraído el 18 de Agosto de 2007 desde http://www.icfes.gov.co/revistas/recolqui/972602/972602abs.html Araya, R. (1998). Determinación de la concentración de nutrientes necesaria para mejorar el rendimiento del proceso fermentativo de la Fábrica Nacional de Licores. Tesis de Licenciatura para la obtención del título de Licenciado en Ingeniería Química, Escuela de Ingeniería Química, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica.
45
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