AISLAMIENTO DE ENZIMAS
Blga. Roxana Mestas Valdivia Area de Química Biológica Departamento de Biología Universidad Nacional de san Agustín
ESTUDIO DE UNA ENZIMA Involucra la investigación de un gran número de propiedades características que se detallan a continuación, pero de las que generalmente se estudian solo unas pocas: a) pro propie pieda dade dess fisico fisicoqu quím ímic icas as:: coeficientes de sedimentación y difusión; peso molecular; forma; punto isoeléctrico; estabilidad frente al calor, pH y oxidación; reversibilidad de la reacción y constante de equilibrio; calor, energía libre y entropía de la combinación enzima-sustrato y de su conversión en productos; medida de las constantes de velocidad de la reacción, efecto de activadores e inhibidores. b) estructura: composición en aminoácidos, secuencia, presencia de grupos prostéticos, grupos sulfhidrilos, etc. c) pro propie pieda dade dess en enzi zimá mátic ticas as:: naturaleza de la reacción, coenzimas, especificidad. d) pro propie pieda dade dess bi biol ológ ógic icas as:: significado en el metabolismo, acoplamiento con otras enzimas, localización, genética, efectos de su deficiencia, inmunología.
ESTUDIO DE UNA ENZIMA Involucra la investigación de un gran número de propiedades características que se detallan a continuación, pero de las que generalmente se estudian solo unas pocas: a) pro propie pieda dade dess fisico fisicoqu quím ímic icas as:: coeficientes de sedimentación y difusión; peso molecular; forma; punto isoeléctrico; estabilidad frente al calor, pH y oxidación; reversibilidad de la reacción y constante de equilibrio; calor, energía libre y entropía de la combinación enzima-sustrato y de su conversión en productos; medida de las constantes de velocidad de la reacción, efecto de activadores e inhibidores. b) estructura: composición en aminoácidos, secuencia, presencia de grupos prostéticos, grupos sulfhidrilos, etc. c) pro propie pieda dade dess en enzi zimá mátic ticas as:: naturaleza de la reacción, coenzimas, especificidad. d) pro propie pieda dade dess bi biol ológ ógic icas as:: significado en el metabolismo, acoplamiento con otras enzimas, localización, genética, efectos de su deficiencia, inmunología.
ASPECTOS TÉCNICOS DEL TRABAJO CON ENZIMAS Deben
evitarse altas temperaturas y acidez o alcalinidad extremas. Durante el aislamiento y la purificación conviene, en general, trabajar entre 0 y 4 °C y evitar pH mayor que 9 o menor que 5.
Debe
evitarse la formación de espuma, ya que la misma es indicador de desnaturalización proteica.
Los solventes orgánicos inactivan muchas enzimas a temperatura ambiente; de modo que los fraccionamientos con los mismos deben llevarse a cabo a baja temperatura y ésta no debe elevarse hasta que el solvente se haya eliminado o diluido a concentraciones inocuas.
Deben tomarse también varias precauciones en lo que q ue se refiere a las condiciones de la reacción: a) Elegir pH y tempe temperatura ratura en las las zonas zonas de mayor estab estabilidad ilidad de la enzima b) Llevar a cabo cabo la reacc reacción ión a tempe temperatura ratura const constante. ante. c) Ele Elegir gir un buffe bufferr adecua adecuado do para para evitar evitar cambios cambios de pH pH d) Evitar la introducci introducción ón de trazas de otras otras enzimas enzimas (por (por ejemplo saliva). e) Elegir una cantida cantidad d de enzim enzimaa adecuada adecuada para obtene obtenerr variaciones apropiadas de la magnitud a medir.
Objetivos del Aislamiento y Purificación de Enzimas Obtener un rendimiento máximo Poseer actividad catalítica máxima Máxima pureza
Aislamiento y Purificación Las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de células que además poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, proteínas inertes, ácidos nucleicos, polisacáridos o lípidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso de purificación.
Métodos de Estimación - Unidades Ensayo El primer requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de actividad mediante el cual pueda valorársela convenientemente. Para decidir si un paso de la purificación tiene sentido, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y después de ese paso, y comparar los resultados de varios procedimientos posibles. Sólo en términos cuantitativos se puede saber si se ha producido algún progreso. Puesto que una gran parte del tiempo empleado en el aislamiento de una enzima está dedicado a determinar la actividad de las distintas fracciones, es deseable que ésta sea una operación rápida; es preferible sacrificar precisión por rapidez en las determinaciones. La naturaleza del ensayo dependerá del tipo de reacción que cataliza la enzima. A veces resultará conveniente la medición de la aparición de un producto y otras la medición de la desaparición de sustrato.
Actividad La actividad de una enzima depende de condiciones tales como temperatura, pH, concentración; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para comparar actividades. La elección del sustrato es muy importante: debe ser barato, de fácil determinación, estable en ausencia de enzima y no sufrir reacciones laterales. Es necesario usarlo en concentración tal que sature la enzima, de modo que la velocidad sea independiente de la concentración de sustrato y proporcional a la cantidad de enzima.
Unidad Enzimática Es necesario definir una unidad enzimática arbitraria para poder expresar, en forma cuantitativa, la pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la purificación. La unidad enzimática se define en forma particular para cada reacción según sea conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formación de una determinada cantidad de producto (desaparición de reactivo) en un tiempo dado. La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad específica que es el cociente de actividad enzimática (expresada en unidades enzimáticas) y la cantidad total de proteínas
Selección de la fuente La actividad de una enzima varía considerablemente en diferente organismos y aún en los diversos tejidos de un mismo organismo. Para estudios mecanísticos generales, debe seleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima. En estos casos, particularmente en tejidos animales, la fuente debe ser fresca, dado que la mayoría de las enzimas se deterioran rápidamente. Frecuentemente una buena elección de la fuente de enzima permite simplificar la extracción y purificación de la enzima. Recuerde la fuente debe ser: Abundante Disponible Se deben hacer estudios comparativos Se debe saber su localización subcelular
Importancia de la localizacion intracelular de la enzima Las enzimas pueden localizarse dentro de los siguientes grupos:
I. Enzimas
en
solución
verdadera
en
el
citoplasma.
Permanecen en el sobrenadante luego de la eliminación de los componentes particulados. La ruptura de las células en un buffer adecuado libera tales enzimas al medio. II. Enzimas asociadas a estructuras celulares (membranas, mitocondrias, etc.). Pueden encontrarse a) en “solución” dentro de una membrana y pueden ser extraídas después de la destrucción de la misma; b) asociadas a material lipoproteico insoluble. Para pasarlas a solución debe disociarse el complejo. El conocimiento de la localización intracelular y solubilidad relativa de las enzimas ha permitido desarrollar procedimientos de extracción diferencial que facilitan la purificación
EXTRACCION DE ENZIMAS Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solución son a menudo críticas y requieren el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las células, eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de otras moléculas. A veces es necesario pasarlas a solución como complejo mucoproteico o nucleoproteico y disociarlo luego durante la purificación. Aunque la dispersión de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse mediante medios mecánicos, en muchos complejos enzimáticos están involucradas fuerzas específicas; de la naturaleza de las mismas depende el método a emplear.
MÉTODOS DE PURIFICACIÓN 1. Métodos de rotura celular 2. Precipitación fraccionada por cambios de pH 3. Desnaturalización fraccionada por calentamiento 4. Precipitación fraccionada con solventes orgánicos 5. Precipitación fraccionada por sales 6. Absorción fraccionada 7. Cromatografía en columna 8. Electroforesis
Métodos de rotura celular Implica la destrucción de la célula y el pasaje de las enzimas a solución o suspensión. Esto puede llevarse a cabo por:
a) Homogenización mecánica:
puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero, licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como alúmina, arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotónico (sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertónico, en un buffer adecuado para controlar el pH.
b) Homogeneización sónica: el choque de ondas sónicas o ultrasónicas provoca cambios de presión de miles de atmósferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados tejidos animales (bazo, riñón, eritrocitos).
c) Desintegración térmica:
El congelamiento y descongelamiento rápidos y repetidos suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelación se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al descongelarse, las células se destruyen osmóticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido.
d) Desintegración química:
se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, éter de petróleo, isopentanol, etc.
e)
Homogeneización por deshidratación : se basa en la precipitación de proteínas por solventes orgánicos. En la preparación del "polvo acetónico" se utiliza acetona en frío.
Precipitación por cambios de pH
The solubility of most globular proteins is markedly influenced by pH and ionic strength. This figure shows the solubility of a typical protein as a function of pH and various salt concentrations.
Desnaturalización por calentamiento 100
d a d i l i L b / u g l o S
0
0
100 Temperatura, ºC
Precipitación con solventes orgánicos Etanol
usado para la precipitación de proteínas sanguíneas Acetona para separar enzimas de extractos de músculo
Precipitación por sales
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR
La separación se basa en el tamaño de las partículas - Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
La separación se basa en la carga eléctrica de las partículas - Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble - Fase móvil: gradiente de sal o de pH
Cromatografía en SP Sephadex C-50. La fracción de la etapa anterior (50ml) del extracto de enzima preparado de tubérculos de Ullucus tuberosus "olluco" fue cromatografiada sobre una columna de SP Sephadex C-50 bajo las condiciones de ensayo de 2.3. La enzima fue eluída con 0.10 M de NaCl se colectaron fracciones de 4ml. Mansilla B. Juan C. (2004). Purificación Parcial y Caracterización Bioquímica de Fosfatasa Acida de Ullucus tuberosus Loz var. Rosascha lisa. Tesi optar el Titulo Profesional de Biólogo
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
Separa según la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con ligando libre
Cromatografía en Concanavalina A-Sepharosa. La fracción de fosfatasa ácida de Ullucus tuberosus "olluco" obtenida de la columna en SP Sephadex C-50 (32ml), fue cromatografiada sobre una columna de Concanavalina A-Sepharosa, bajo las condiciones de 2.4. La enzima fue eluída con 0.15 M de metil α -D manopiranósido. Se colectaron fracciones de 3ml, con un flujo de 1.2 ml por minuto
Mansilla B. Juan C. (2004). Purificación Parcial y Caracterización Bioquímica de Fosfatasa Acida
Cromatografía líquida de separación rápida de proteínas
ELECTROFORESIS
GEL DE APILAMIENTO PORO GRANDE CONCENTRAR Y ALINEAR PROTEINAS
GEL DE SEPARACION PORO PEQUEÑO SEPARA PROTEINAS POR TAMAÑO
DIÁLISIS
ANÁLISIS DE LOS DATOS Tabla de Purificación Estándar
1.Da una breve descripción de la fracción probada 2.Volumen 3.Concentración de la enzima 4.Unidades totales (= columna 3 x columna 2) 5.Concentración protéica 6.Actividad específica (= columna 3/columna5) 7.Rendimiento ( obtenido a partir de la columna 4 tomando el primer valor de esta columna como 100%) 8.Grado de purificación (obtenido a partir de la columna 6 tomando el primer valor de esta columna como
CRITERIOS DE PUREZA DE UNA ENZIMA
Ultracentrífuga Analítica Métodos Electroforéticos Enfoque Isoeléctrico Prueba de Solubilidad
Métodos para determinar Proteínas Método de Kjeldahl El método se basa en la destrucción de la materia orgánica con ácido sulfúrico concentrado, formándose sulfato de amonio que en exceso de hidróxido de sodio libera amoníaco, el que se destila recibiéndolo en: a) Acido sulfúrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de ácido es valorado con hidróxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o b) Acido Poco sensible. En desuso. bórico formándose borato de amonio el Se sigue empleando para análisis que se valora con ácido clorhídrico. elemental (p.e., alimentos)
Proteína total= N x 100/16
Método de Biuret Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico dando una coloración violeta. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados. -
H
C
C
O
O
NH2
NH
HN
C
++
C O
O
Cu
HN -
H O
C
N H2N
H
O
NH
HN O
H
H
NH C O
Biuret Complejo cúprico coloreado
Método de Bradford Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas.
