AGRONOMSKI FAKULTET
SVEUČILIŠTA U ZAGREBU
Biljna virologija i fitopatogene bakterije skripta 19.5.2009
Skripta je sastavljena od predavanja dr. sc. Edyte Đermić i odabranih sadržaja iz fitopatološke literature. Sadrži poglavlja o općoj i specijalnoj biljnoj virologiji i bakteriologiji.
2
2
Sadržaj Laboratorijske tehnike i uvjeti rada ........................................................................................................................ 5 Uvod: osnovne laboratorijske tehnike ................................................................................................................ 5 Opća virologija ........................................................................................................................................................ 6 Morfologija virusa ............................................................................................................................................... 6 Klasifikacija i nomenklatura ................................................................................................................................ 9 Imenovanje kriprogramom ............................................................................................................................. 9 Suvremena klasifikacija ................................................................................................................................. 10 Baltimoreova podjela .................................................................................................................................... 10 Vegetativni ciklus i umnožavanje (replikacija) virusa........................................................................................ virusa........................................................................................ 11 Umnožavanje virusa s jednolančanom (+)RNA (IV. grupa po Baltimoreu).................................................... Baltimoreu) .................................................... 12 Prijenos virusa ................................................................................................................................................... 13 Prijenos virusa vektorima.............................................................................................................................. vektorima.............................................................................................................................. 13 Nastanak infekcije i fiziologija inficiranih biljaka............................................................................................... biljaka............................................................................................... 15 Fiziološke promjene na inficiranoj biljci........................................................................................................ biljci ........................................................................................................ 16 Simptomi ........................................................................................................................................................... 17 Dokazivanje , identifikacija i suzbijanje virusa .................................................................................................. 19 Dokazivanje i identifikacija............................................................................................................................ identifikacija ............................................................................................................................ 19 Suzbijanje Suzbijanje virusa............................................................................................................................................ virusa............................................................................................................................................ 24 Subviralni patogeni ........................................................................................................................................... 26 Specijalna virologija .............................................................................................................................................. 27 Žuta patuljavost ječma...................................................................................................................................... ječma ...................................................................................................................................... 27 Rizomanija......................................................................................................................................................... Rizomanija ......................................................................................................................................................... 28 Šarka šljive......................................................................................................................................................... šljive......................................................................................................................................................... 29 Mozaična bolest duhana ................................................................................................................................... 31 Mozaičana bolest krastavca .............................................................................................................................. 32 Bolest ljuštenja kore stabla agruma .................................................................................................................. 33 Prokariotski biljni patogenipatogeni- opći dio .................................................................................................................... 34 Morfologija i fiziologija fitopatogenih bakterija................................................................................................ bakterija................................................................................................ 34 Građa bakterija ............................................................................................................................................. 34 Fiziologija bakterija ....................................................................................................................................... 35 Sistematika fitopatogenih prokariota ............................................................................................................... 35 Mikoplazmama slični organizmi.................................................................................................................... organizmi .................................................................................................................... 36 Rikecije .......................................................................................................................................................... 38 Simptomi bakterioza ......................................................................................................................................... 39 3
Rad s bakterijamabakterijama- stvaranje čistih kultura ....................................................................................................... 40 Identifikacija bakterija i principi suzbijanja fitopatogenih bakterija................................................................ bakterija ................................................................ 41 Metode identifikacije bakterija..................................................................................................................... bakterija ..................................................................................................................... 41 Principi suzbijanja fitopatogenih bakterija.................................................................................................... bakterija.................................................................................................... 43 Specijalna bakteriologija ....................................................................................................................................... 44 Pseudomonas.................................................................................................................................................... Pseudomonas .................................................................................................................................................... 44 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola....................................................................................................... phaseolicola ....................................................................................................... 44 Pseudomonas syringae pv. lachrymans ........................................................................................................ 45 Pseudomonas syringae pv. glycinea.............................................................................................................. glycinea .............................................................................................................. 45 Pseudomonas syringae pv. tomato ............................................................................................................... 45 Xanthomonas .................................................................................................................................................... 46 Xanthomonas campestris pv. campestris ..................................................................................................... 46 Xanthomonas campestris pv. vesicatoria...................................................................................................... vesicatoria ...................................................................................................... 46 Xanthomonas campestris pv. juglandis......................................................................................................... juglandis ......................................................................................................... 47 Agrobacterium .................................................................................................................................................. 47 Agrobacterium radiobacter pv. tumefaciens ................................................................................................ 47 Agrobacterium radiobacter pv. rhizogenes................................................................................................... rhizogenes................................................................................................... 47 Agrobacterium radiobacter........................................................................................................................... radiobacter ........................................................................................................................... 47 Corynebacterium michiganense pv. michiganense....................................................................................... michiganense ....................................................................................... 48 Erwinia............................................................................................................................................................... Erwinia............................................................................................................................................................... 48 Erwinia carotovora pv. atroseptica .............................................................................................................. 48 Erwinia carotovora pv. carotovora............................................................................................................... carotovora............................................................................................................... 49 Erwinia amylovora......................................................................................................................................... amylovora......................................................................................................................................... 49 Prognoza bakterijske paleži u voćnjaku ............................................................................................................ 51 Ekologija i epidemiologija bakterijske paleži u voćnjaku. ............................................................................. 51 Prognozni model Maryblyt............................................................................................................................ Maryblyt ............................................................................................................................ 52 Prognozni model BIS ..................................................................................................................................... 54 Napomene:.................................................................................................................................................... Napomene:.................................................................................................................................................... 55 Dodatak................................................................................................................................................................. Dodatak ................................................................................................................................................................. 56 Izvod iz liste karantenskih štetočinjaštetočinja- virusi i bakterije................................................................................. bakterije ................................................................................. 56 Bibliografija ........................................................................................................................................................... 59
4
Laboratorijske tehnike i uvjeti rada Sve biljne patogene dijelimo na stanične (imaju staničnu građu)građu)- to su gljive i bakterije i bezstanične patogenepatogeneviruse i subviralne patogene.
Uvod: osnovne laboratorijske tehnike Prilikom laboratorijskog rada s biljnim patogenima važno je održavanje sterilnosti sterilnosti i pravilno skladištenje kemikalija. U laboratoriju se koriste laboratorijski pribor pribor te stakleno i plastično plastično posuđe. Dio posuđa i pribora nije moguće koristiti višekratno te se ono nakon upotrebe odbacuje, a ako je kontaminirano (kemijski ili biološki), sprema se na posebno odlagalište.
Kako bi se održali sterilni uvjeti, provodi se sterilizacija posuđa, pribora i hranidbenih podloga. Po potrebi, neke radnje se vrše u laminaru. Laminar je radni ormar s protokom sterilnog zraka. Sterilizacijom se uništavaju vegetativni i sporogeni mikroorganizmi i virusi. Od fizičkih metoda sterilizacije provode se suha sterilizacija i autoklaviranje. Autoklaviranje predstavlja metodu vlažne sterilizacija pregrijanom vodenom parom. Provodi se u hermetički zatvorenom uređaju autoklavu, najčešće pri temperaturi 121°C i tlaku 1bar.
Slika 1: laminar
Od kemijskih sredstava za dezinfekciju se najčešće koriste NaOH i deterdženti. Određene tehnike zahtijevaju provođenje pokusa za koje je potrebno osigurati i laboratorij, ali i uzgajalište biljaka.
Slika 2: autoklav
5
Opća virologija Morfologija virusa Budući da virusi nemaju staničnu građu, njihovo tijelo zovemo česticom. Virusi su nukleoproteinske submikroskopske infektivne čestice (makromolekule) tj. genetički elementi koji mogu egzistirati i izvan stanice, ali za replikaciju moraju biti u živoj stanici domaćina. Obligatni su stanični paraziti. Kako im je veličina manja od valne duljine svjetlosti kojom ih se promatra, nisu vidljivi svjetlosnim, već samo elektronskim mikroskopom. Trenutno je poznato oko dvije tisuće virusa, od čega gotovo polovica uzrokuje bolesti bilja. 1 Virusnu česticu sposobnu za ostvarivanje infekcije nazivamo virion, tj. virion je infektivna virusna čestica. Sve virusne čestice nisu virioni. Građa: virusna čestica sastoji se od proteinskog omotača kapside i nukleinske kiseline koja čini srž. Zajedno ih nazivamo nukleokapsida. Osim ova dva glavna dijela, virusne čestice mogu sadržavati još i: lipoproteinsku ovojnicu (peplos ili toga) na kojoj se nalaze nastavci (peplomere) što je kod biljnih virusa rijetka pojava (npr. virus brončavosti rajčice ima peplos),molekule vode i ione. Kapsida se sastoji od velikog broja proteinskih podjedinica koje se kod poliedričnih virusa udružuju u kapsomere. Može biti građena od jednog ili nekoliko proteina. Peplos nastaje od dijelova stanične membrane stanice domaćina. Važno je naglasiti da se prema morfologiji ne može identificirati biljni virus.
Slika 3: Osnovni oblici i građa biljnih virusa: a) nitasti, b) štapičasti, b-1 i b-2) pogled na građu kapside i srži i c i c -1) baciliformni, d i d -1) izometrični (okruglasti oblici) i e) čestica geminivirusa od dvije spojene čestice, NK - kukleinska kiselina, PP- proteinska podjedinica
Nukleinska kiselina čini 5-40% građe virusne čestice, dok ostatak od 60-95% ide na proteine. Anizometrični virusi imaju niži udio nukleinske kiseline u svojoj građi prema izometričnima. Virusi mogu imati i RNA i DNA, ali uvijek samo jedan tip molekule.
1
Agrios, G (2004). Plant Pathology 5th edition, str. 724
Po građi razlikujemo četiri tipa virusnih čestica (slika 3): a) anizometrični (izduženi, filamentozni). Postoje tri tipa ovakvih virusa: štapićasti. Npr: virus mozaika duhana (TMV) 300x18 nm nitasti (vijugavi). Npr: virus mozaične patuljavosti kukuruza baciliformni, zaobljeni na oba kraja, ili samo na jednom (tada kažemo da liče na puščano zrno). Npr: virus nekrotskog žućenja brokule • • •
2
b) izometrični (sferični, kuglasti, poliedrični). Obično su ikozaedri. Veličina im se izražava promjerom. Oko 80% ovih virusa ima promjer oko 30 nm. Razlikujemo dva tipa: manji, promjera 20-35 nm. Npr: virus mozaika krastavca (CMV) veći, promjera 60-110 nm. Npr: virus brončavosti rajčice (TSWV) • •
c)
multikomponentni (Slika 4) (mogu biti anizometrični i izometrični). To su virusi kod kojih je genom podijeljen na dijelove koji su pakirani u zasebne čestice. Npr. virus mozaika krastavca(CMV), virus šuštavosti duhana (TRV), virus mozaika vigne, v. mozaika lucerne,...). Podijeljenost genoma je prednost jer omogućuje nastanak novih virusnih sojeva. Olakšano je fenotipsko miješanje različitih virusnih sojeva, manje nukleinske kiseline i manje virusne čestice su stabilnije od velikih. Oko 30% biljnih RNA virusa ima podijeljeni genom.
Slika 4: podijeljeni genom virusa mozaika krastavca (CMV), mikrografija, shema i elektroforetsko očitovanje
Neke čestice multikomponentnih virusa mogu biti prazne. Treba napomenuti da se podijeljena RNA može nalaziti u više čestica, ili pak kod nekih virusa samo u jednoj. Različite čestice multikomponentnih virusa mogu se odvojiti metodom centrifugiranja u gradijentu gustoće.
2
geometrijsko tijelo čija se površina sastoji od 20 istostraničnih trokuta 7
d) bakteriofagi. Specifičnog su oblika. Najčešće su građeni od glave i repa, no ima ih i građenih samo od glave tako da izgledaju kao izometrični virusi. Obično im je genom dlDNA. U glavi se nalazi nukleinska kiselina koju ubacuju u bakterijsku stanicu. Ima ju litički i lizogeni3 ciklus. Litički je onaj kod kojeg odmah nakon umnožavanja virusa dolazi do lize stanice. Kod lizogenog se ciklusa genom faga ugrađuje u genom bakterije (profag) i replicira se s njim u diobama bakterijske stanice. Do lize dolazi nakon dužeg vremena i to u određenim uvjetima. Slika 5: bakteriofag
Fizikalna svojstva virusa: a) hidrodinamička svojstva- ponašanje virusa u tekućini b) elektroforetska svojstva c) optička svojstva- neki virusi apsorbiraju svjetlost d) biofizička svojstva: krajnja točka razrjeđenja – razrjeđenje pri kojem nestaje infektivnost trajanje infektivnosti in vitro- želi li se produljiti, moguće je viruse liofilizirati 4 termalna točka inaktivacije- temperatura koja nepovratno inaktivira infektivnost virusne čestice (moguće ju je odrediti za svaki virus) • • •
Filogenija i srodstveni odnosi virusa nisu potpuno jasni. Tri su hipoteze o nastanku virusa: a) regresivnom evolucijom od bakterija ili mikoplazmi b) virusi su porijeklom iz doba nastanka života t.j. kemijske evolucije, prije nego su se pojavili složeniji životni oblici c) virusi su nastali iz dijelova stanice domaćina- to su fragmenti kukleinske kiseline,„lutajući geni“ koji su izbjegli kontroli stanice i počeli se autonomno razmnožavati- ovo je danas najprihvaćenija hipoteza
3 4
Lizogeni ciklus (tip infekcije) je naziv za virogeni ciklus bakteriofaga Liofilizacijom inficiranog biljnog tkiva, organa ili pročišćenog virusa, može se izvršiti konzervacija virusa 8
Klasifikacija i nomenklatura Pri sistematizaciji i imenovanju virusa ne koristi se standardna binarna nomenklatura. Još uvijek postoji nekoliko različitih sistematizacija u upotrebi. Zbog specifičnosti svojstava virusa (građa i aktivnost) za njih se ne mogu primijeniti kriteriji koji vrijede za biljni i životinjski svijet. Među virolozima postoje nesuglasja s obzirom na klasifikaciju i nomenklaturu virusa. Uobičajeno je da virusi dobivaju opisna imena po simptomima koje uzrokuju na domaćinu na kojem je virus prvi puta opisan. Ovaj naziv se (najčešće) s engleskog prevodi na hrvatski. Službeno se koriste akronimi engleskih naziva, npr. za virus mozaika duhana, akronim je TMV od eng. tobacco mosaic virus. Više sistematske jedinice (rodovi, porodice) dobivaju naziv po glavnom predstavniku skupine uz nastavke za pojedine sistematske grupe. Nastavci za formiranje imena sistematskih jedinica u virologiji ()virales red ()viridae porodica ()virinae podporodica ()virus rod
Imenovanje kriprogramom Osobine virusa mogu se prikazati i kriprogramom pri čemu se dogovorenim kraticama prikazuju najbitnija svojstva pojedinih virusa. Značenje kriptograma: prema shemi: (1/2:3/4:5/6:7/8) 1 - vrsta NK: R = RNA; D = DNA 2 - broj lanaca NK: 1 = jednolančana; 2 = dvolančana 3 - molekularna masa NK (u Daltonima, =106) 4 - % NK u infektivnoj čestici - ako se dijelovi genoma nalaze u različitim česticama, onda se za svaki tip čestice posebno navodi ova vrijednost, a odvojene su znakom "+". 5 - vanjski oblik virusne čestice: S - sferičan (izometričan); E - izdužen s nezaokruženim krajevima; U - izdužen sa zaokruženim krajevima; X - kompleksna ili različita od gore navedenih 6 - oblik nukleokapside (NK + protein): iste oznake kao u 5 7 - vrste domaćina: A – aktinomicete, B – bakterije, M – fitoplazme, F – gljive, P – paprati, S – cvjetnice, I – beskralježnjaci, V –kralježnjaci 8 - vrste vektora: Ac - grinje ( Acarina); Al - štitasti moljci( Aleurodidae); Ap - lisne uši ( Aphididae); Cc -štitaste uši (Coccidae); Cl – kornjaši (Coleoptera); Di - muhe (Diptera); Fu – gljive (Fungi ); Gy - mrežaste; stjenice (Gymnocerata); Ne - nematode (Nematoda ); Ps - lisne buhe (Psyllidae); Si – buhe (Siphonoptera); Th – tripsi (Thysanoptera); Ve - neki drugi vektori; O - prenošenje bez vektora (mehanički); * - nepoznato svojstvo virusa; () -podatak je sumnjiv ili nepotvrđen; [] -kriptogram se odnosi na jednu grupu virusa
9
Suvremena klasifikacija se provodi sukladno građi virusa (tipu genoma i postojanju peplosa). Prema sustavu VAC (eng. vernancular name and cryptogram, narodni naziv i kriptogram) virusi se imenuju prema simptomima i prema domaćinu (na engleskom jeziku) uz dodatak kriptograma. Npr. TMV - Tobacco mosaic virus ( R/1:2/5:E/E:S/0 )
Baltimoreova podjela (1970.) svih virusa (ne samo biljnih) dijeli ih na šest skupina na temelju načina sinteze njihove mRNA. Obzirom na tip nukleinske kiseline, razlikujemo DNA i RNA viruse. Kako ove molekule mogu biti jednolančane i dvolančane, imamo sljedeće tipove nukleinskih kiselina u virusima: hrvatski naziv jlRNK (jednolančana RNK) dlRNK (dvolančana RNK) jlDNK (jednolančana DNK) dlDNK (dvolančana DNK)
engleski naziv (češće se koristi) ssRNA (single-stranded RNA) dsRNA (double-stranded RNA) ssDNA (single-stranded DNA) dsDNA (double-stranded DNA)
Baltimore je mRNA označio kao (+)RNA, a sve virusne nukleinske kiseline koje su joj komplementarne označene su znakom (-).
Slika 6: Baltimoreova klasifikacija virusa
I: dlDNA-virusi- animalni virusi, neki biljni virusi, npr. vir. mozaika cvjetače (= dobar prirodni vektor za ubacivanje strane, rekombinantne DNA u genom biljaka. II: jlDNA-virusi- ova pojava postoji samo kod virusa, npr. geminivirus III: dlRNA-virusi- npr. virus mozaika salate IV: (+)jlRNA-virusi - većina biljnih virusa V: (-)jlRNA-virusi - npr. virus bjesnoće, gripe, neki biljni virusi VI: jlRNA- retrovirusi (od biljnih samo virus mozaika cvjetače)
10
Vegetativni ciklus i umnožavanje (replikacija) virusa Viruse smatramo živima zbog replikacije, a neživima zbog kristalizacije. Dva su osnovna načela (koncepta) izgradnje virusnih čestica: a) jednostavnost građe: kapsida se sastoji od mnogobrojnih istovrsnih dijelova(proteinske podjedinice) koje se udružuju u komplekse (kapsomere) od po 5 ili 6 podjedinica. Te veće morfološke jedinice, nazivaju se prema tom broju pentamere, heksamere i sl. b) za sintezu dijelova virusne čestice potrebna je minimalna količina gena (nukleinskih kiselina) i troši se minimalna energija za njihovo slaganje u funkcionalnu virusnu česticu (slažu se spontano gotovo bez utroška energije) Faze vegetativnog ciklusa virusa: a) adsorbcija – prihvaćanje virusnih čestica na stanicu domaćina. To je selektivna faza ciklusa – određuje da li će virus napasti neku stanicu ili ne. Kod biljnih virusa najčešće nema ove faze je nema specifičnih receptora na površini biljnih stanica. Selektivnost biljnih virusa je često određena prijenosom putem različitih vektora (hrane se na određenim domaćinskim biljkama). b) penetracija – ulazak virusne čestice u stanicu domaćina gdje se potpuno razgradi ili u stanicu ulazi samo nukleinska kiselina virusa. Kod biljnih virusa omogućena je npr. ozljedom (rana). Kada virus dođe do stanične membrane, dolazi do deproteinizacije. Virusna nukleinska kiselina ulazi svojim 5’-krajem (“5 prim”) u citoplazmu stanice. c) multiplikacija – umnožavanje virusnih čestica. Nakon što virusna nukleinska kiselina dospije u citoplazmu stanice, događa se replikacija nukl. kiseline i sinteza virusnih proteina. d) konstituiranje novih virusnih čestica - kod biljnih virusa konstituiranje novih virusnih čestica ide spontano (bez sudjelovanja enzima). Npr. TMV – nukl. kis. se uvije tako da savršeno odgovara segmentu kapside (inicijacijski kompleks, 1.-34. proteinska podjedinica = 2 diska) Na taj kompleks se naslanjaju slijedeća 2 diska proteinskih podjedinica i u njih se “pakira” nastavak RNA, itd… e) izlaženje virusnih čestica iz stanice- biljni virusi najčešće izlaze plazmodezmijama, a samo kod virusa brončavosti rajčice izlaze pupanjem (tako virus brončavosti rajčice dobiva peplos). Specifične osobine umnožavanja virusnih čestica: a) razgradnja virusnih čestica b) dijelovi straih virusnih čestica ne ulaze u sastav novih c) za umnožavanje virusi koriste izmjenu tvari i energije (metabolizam) stanica biljke. Replikacija je prilično kompliciran proces. Mehanizam tog procesa ovisi o tipu virusa tj. njegove nukleinske kiseline. Virus uvijek u čestici ima samo 1 tip nukl. kiseline (samo RNA ili samo DNA; obje mogu biti jl ili dl). Za detalje v. Baltimoreovu podjelu. Neki virusi kodiraju i vlastite enzime za translaciju, međutim najčešće stanica biljke osigurava te enzime (polimeraze, nukleaze, ligaze), kao i energiju, prekursore za sintezu nukl. kiselina i proteina te cijeli sustav za sintezu proteina. Prisustvo virusa u stanici i sinteza virusnih dijelova djelomično inhibira sintezu staničnih nukl. kiselina i proteina.
11
Umnožavanje virusa s jednolančanom (+)RNA (IV. grupa po Baltimoreu) 5 Najveći broj biljnih virusa ima genom u obliku (+)jlRNA koja je ujedno i virusna mRNA. Proces umnožavanja započinje oslobađanjem nukleinske kiseline iz kapside. RNA virusa nosi zapis za stvaranja RNA-polimeraze (Slika 7) i to su prvi geni do čije translacije dolazi s virusne molekule. Ostaje otvoreno pitanje koliku ulogu u prijepisu genskog zapisa ima RNA-polimeraza domaćina, a koliku samog virusa. Replikacija virusne (+)RNA sastoji se od dvaju temeljnih koraka: na osnovi (+)RNA stvara se komplementarna (-)RNA, a potom na osnovu nje nastaje nova virusna (+)RNA Tijekom ovog procesa nastaju i dva međuprodukta: replikativni intermedijer koji se sastoji od potpunog (-) lanca na kojem se nalazi nekoliko (+) lanaca različite duljine i replikativna forma (oblik) koja je dvolančani kompleks sastavljen od (-) lanca i (+) lanca • •
•
•
Ovi nusprodukti koriste se u dijagnostici pri identifikaciji biljnih virusa s (+)jlRNA genomom pri čemu ih se izolira, a zatim analizira nakon elektroforetskog razdvajanja pri čemu se utvrdi njihova molekularna masa. Ova tehnika je vrlo značajna i u dijagnostici multikomponentnih virusa! Većina djelomično dvolančanih intermedijera replikacije se razdvoji na (-) i (+) lance RNA. (+)RNA su novi virusni genomi koji se pakiraju u proteinske omotače, kapside). (+)RNA je prvo poslužila kao mRNA za sintezu enzima (RNApolimeraza), a zatim za kodiranje u sintezi proteina (za izgradnju kapside). Isključivo nove molekule kapsidnog proteina se spontano slažu jedna do druge uz nove (+)RNA i nastaju nove virusne čestice.
Slika 7: Nukleotid virusa mozaika duhana, TMV. Četiri gena se prevode (dolazi do translacije) i stvaraju proteine molekularne mase 126, 183, 30 i 17,6K. Dva najveća proteina imaju funkciju RNA -polimeraze, protein od 30K omogućava
kretanje virusa od stanice do stanice, a protein od 17,6K gradi kapsidu. Brojevi na molekuli RNA označavaju nukleotide.
Umnožavanje retrovirusa ((+)RNA) i nekih DNA-virusa: Neki izazivaju nastanak tumora; tu se ubraja i HIV (2 molekule dlRNA). Replikacija reverznom transkripcijom (na osnovu (+)RNA sintetizira se uz enzim reverznu transkriptazu (-)DNA lanac. Na (-)DNA se sintetizira (+)DNA lanac (tada egzistira u obliku dlDNA koja se može ugraditi u genom domaćina) ili (+)RNA (= novi virusni genom). Npr. virus mozaika cvjetače (dlDNA) ili virus hepatitis B (dlDNA).
5
Prema Juretić, N (2002). Osnove biljne virilogije, str. 151 12
Virusi se umnažanjem vrlo brzo genetski mijenjaju. Nove varijante mogu nastati spontano i eksperimentalno . Za varijante koje nastaju spontano (prirodno) rabi se naziv soj. 6 Novi sojevi mogu nastati mutacijom, rekombinacijom (kombiniranjem gena dvaju ili više srodnih virusa), pseudorekombinacijom (razmjenom dijelova genetskog materijala srodnih multikomponentnih virusa) i komplementacijom (virus uzima jedan ili više proteina od drugog soja ili drugog virusa- ovo nije nasljedna promjena). Pri umnažanju virusa mogu nastati i defektne varijante. Virusi u domaćinu mogu uzrokovati dva tipa (ciklusa) infekcije: a) vegetativni tip- virusna nukleinska kiselina se ne ugrađuje u DNA domaćina. postoje dva podtipa vegetativnog tipa: litički (agresivne varijante)- nakon umnažanja nastale virusne čestice razaraju stanicu domaćina. Ovom tipu pripadaju brojni bakteriofagi te neki animalni virusi. perzistentni (blage forme)- stanica domaćina se ne uništava, već se nastavlja umnožavati i otpuštati nove viruse. Ovakav ciklus ima većina biljnih virusa te neki animalni (hepatitis B) b) latentni (virogeni) tip 7- virus svoj genom ugrađuje u genom domaćinske stanice. Susrećemo ga kod bakteriofaga i animalnih virusa, npr. HIV. •
•
Prijenos virusa Biljni virusi mogu biljke zaraziti na 3 osnovna načina: a) mehanički –dodirom biljaka, oruđem i namjerno sokom zaražene biljke (Slika 11) b) vektorom – životinjskm (insekti, nematode, grinje), gljivicama ili biljnim organizmima (parazitske cvjetnjače) c) vegetativnim umnožavanjem, cijepljenjem, sjemenom i peludom, dodirom korijena...
Prijenos virusa vektorima a) Prijenos gljivama- fungihorija Ovim se načinom prenosi tridesetak virusa. Neki od ovih virusa prenose se unutar stanica gljivice, dok se neki nalaze na površini trajnih spora ili zoospora. Nakon gljivične infekcija biljke može doći do karakterističnih simptoma viroze. 8 Vektor Primjer Chytridiales, Olpidium spp. Olpidium brassicae-virus nekroze duhana i njegov satelitni virus Plasmodiophorales, Polymyxa Polymyxa betae- virus rizomanije – šećerna repa spp. i Spongospora spp.
b) Prijenos oblićima (nematodama)- nematohorija Oko dvadeset biljnih virusa prenose tri roda ektoparazitskih nematoda. Virusi se ne mogu prenijeti preko stadija jaja. Oblići su kao vektori osobito opasni u trajnim nasadima (vinogradi i voćnjaci). Vektor Trichodorus spp. Xiphinema spp.
Tip virusa Tobravirusi Nepovirusi
Longidorus spp.
Nepovirusi
Primjer v. šuštavosti duhana v. prstenaste pjegavosti duhana i v. prstenaste pjegavosti rajčice v. crnih prstenova rajčice
6
Prema Juretić, N (2002). Osnove biljne virilogije, str. 187 Kod bakteriofaga ovaj tip infekcije zovemo lizogeni 8 Agrios, G (2004). Plant Pathology 5th edition, str. 743 7
13
c) Prijenos kukcima- entomohorija Kukci su najznačajniji vektori virusa. Oko 93% svih animalnih virusnih vektora predstavljaju kukci. Više od 70% kukaca koji prenose biljne viruse pripada redu jednakokrilaca (Homoptera) u kojem je porodica lisnih uši (Aphididae) koje su najznačajniji prenosioci biljnih virusa. Najznačajnije skupine kukaca vektora virusa: red jednakokrilci (Homoptera) porodica lisne uši (Aphididae) cvrčci (Cicadellidae i Delphacidae)
red red
kornjaši (Coleoptera) i resičari (Thysanoptera)
Kod perzistentnog načina prijenosa biljnih virusa lisnim ušima vrijeme akvizicije9 je duže a vrijeme latencije 10 iznosi od više sati do nekoliko dana. Kod neperzistentnog načina prijenosa biljnih virusa lisnim ušima, vrijeme akvizicije je kratko a presvlačenjem lisne uši najčešće gube sposobnost prijenosa virusa (retenc ija 11 je kratka). Suzbijanje se preporučuje kod perzistentnih vektora, odnosno virusa. Semiperzistentan prijenos: neperzistentan je po tome što virus ne cirkulira unutar vektora, no retencija je ipak duga (3-4 mjeseca). Glavne karakteristike neperzistentnogi perzistentnognačina prijenosa virusa lisnim ušima smještaj virusa u biljci akvizicija gladovanje prije akvizicije latencija inokulacija retencija
neperzistentni
perzistentni
epiderma kratka utječe kratka kratka kratka
provodno staničje duga ne utječe duga duga duga
Obzirom na mogućnost umnožavanja virusa u kukcu razlikujemo cirkulativni prijenos (virus se usiše i ponovo izlučuje slinom), propagativni (isto kao cirk., ali se virus još i umnožava u vektoru) i transovarijalni prijenos (virus se prenosi i na jaja vektora). d) od ostalih načina prijenosa treba osobitu pozornost obratiti na mogućnost prijenosa vegetativnim razmnožavanjem (gomoljima, lukovicama...) i cijepljenjem. Sjemenom se prenosi stotinjak virusa.
9
Vrijeme sisanja insekta na biljci potrebno da primi virusne čestice Razdoblje tijekom kojeg kukac ne može prenijeti virus na biljku 11 Vremenski period tijekom kojega je vektor sposoban inficirati novog domaćina 10
14
Nastanak infekcije i fiziologija inficiranih biljaka Biljni virusi mogu ući u stanice kroz rane nastale mehaničkim oštećenjima (u prirodi kroz ranice na vanjskoj stijenci epidermalnih stanica ili kroz ektodezmije 12), vektorima ili preko inficiranog sjemena. Proces ulaska virusa u biljne stanice nazivamo inokulacija. Virusi se mogu širiti unutar biljke na dva osnovna načina: a. međustanično - strujanjem plazme putem plazmodezmija b. provodnim elementima - najpodesniji je floem, ali može i ksilem. Većina biljnih virusa najčešće se ne umnožava u provodnim elementima. To je brži način širenja. U stanicama parenhima lista, virus se kreće brzinom od 1 mm, odnosno 8-10 stanica po danu. Ovisno o kompatibilnom ili inkompatibilnom odnosu između patogena i domaćina razlikujemo lokalnu i sistemičnu zarazu. Lokalna - virusne čestice šire se samo u određeni broj stanica u blizini inficirane stanice (zbog hipersenzitivnosti 13 domaćina). Najčešće se pojavljuju male smeđe nekrotizirane točkice. Sistemična - virus se nesmetano umnožava i širi po cijelom biljnom organizmu.
Slika 8: širenje virusa u biljci nakon mehaničke inokulacije
12
Ektodezmije su pore na kutikuli, analogne plazmodezmijama Hipersenzitivnost ili preosjetljivost: tkivo u kojem je došlo do prvotne infekcije vrlo brzo ugine
13
15
Unatoč sistemičnoj zarazi, ipak postoje biljni dijelovi koji najčešće nisu zaraženi (meritum i sjeme). Meristem se koristi u. kulturi meristema za dobivanje biljaka oslobođenih od virusa. 14 Meristem je tkivo koje intenzivno raste pa postoji jaka konkurencija između same biljne stanice i virusa za sve prekursore potrebne za umnožavanje. Meristem, također, nema provodnog staničja što onemogućuje dolazak virusa u meristem iz drugih dijelova biljnog organizma.
Fiziološke promjene na inficiranoj biljci Sama prisutnost virusne nukleinske kiseline u biljci, ili pak virusa, čak i u velikoj količini ne uzrokuje uvijek simptome zaraze. Tako, na primjer, neke biljke mogu sadržavati puno više koncentracije virusa od drugih, a pokazivati slabije izražene simptome ili čak biti bez izraženih simptoma. Ovo pokazuje da nije nedostatak hranjiva (gradivnih metabolita) nastao sintezom virusa glavni uzročnik promjena na inficiranoj biljci nego je riječ o neizravnom utjecaju metabolita nastalih djelovanjem virusa (npr. enzima) na metabolizam domaćina. 15 Inficirane biljke pokazuju sljedeće fiziološke promjene (različitog intenziteta): a) smanjenu fotosintezu b) smanjenu sintezu proteina i c) pojačano disanje (najjače u fazi promjene simptoma) Promjene koje nastaju virusnim infekcijama u konačnici uzrokuju štete u uzgoju bilja. Virusi tako utječu na količinu i na kakvoću uroda. Ne postoje točni podaci o štetama koje uzrokuju virusi, no oni su svakako najznačajniji uzročnici biljnih bolesti nakon gljivica. Veći je problem na višegodišnjim kulturama jer jednom inficirane, ostaju trajno zaražene, a simptomi ovise od godine do godine. Ako su simptomi izrazito jaki, napadnuta stabla se odstranjuju. Intenzitet pojave viroza na jednogodišnjim kulturama ovisi o postotku zaraženog sjemena i veličini populacije vektora koji prenosi virus. Osobito velika opasnost od širenja virusa prijeti kod vegetativnog razmnožavanja jer će cjelokupno potomstvo (klonovi) zaražene biljke također biti zaraženo. Dakle, štete od biljnih virusa mogu biti: a) kvantitativne- smanjen prinos (prirod) b) kvalitativne- smanjena kakvoća proizvoda. Npr: šećerna repa zaražena rizomanijom daje manje šećera
14 15
Kolokvijalno se često koristi naziv virus free, ili VF-biljke Agrios, G (2004). Plant Pathology 5th edition, str. 737 16
Simptomi Promjene do kojih dolazi u zaraženim biljkama mogu se očitovati kao specifični znakovi infekcije, simptomi. Skup svih simptoma jedne bolesti nazivamo sindromom. Ako su simptomi za neki virus dovoljno specifični, mogu poslužiti kao prvi korak u njegovoj identifikaciji. Gotovo sve virusne bolesti uzrokuju u određenoj mjeri pojavu patuljavosti ili prestanka rasta i smanjenje prinosa. Također, inficirane biljke obično žive kraće, iako virusne bolesti rijetko kada brzo ubijaju biljke. Vanjski (vidljivi) simptomi viroza: a) lokalni simptomi (često su primarni) klorotične lokalne lezije nekrotične lokalne lezije prstenaste lokalne lezije (klorotični ili nekrotični prsten unutar kojega je normalno zeleno tkivo) • • •
b) sistemični simptomi (često su sekundarni) (Slike 9 i 10) prosvjetljavanje nervature (šok simptomi) išaranost : mozaik - granice su često oštre šarenilo žutica pjege prstenasta pjegavost poremećaji u rastu: kovrčanje - abnormalan rast parenhima između nervature mjehuravost - abnorm. rast i parenhima i nervature nitavost (peršunavost) lista - lisno tkivo raste samo u uskom pojasu uz žile (neki sojevi CMV na rajčici; x-virus krumpira na rajčici) enacije - izrasline na naličju lista uz žile tumori skraćivanje internodija nekroze šarenilo cvijeta (tulipan) zastoj u rastu (patuljavost, kržljavost) •
•
•
• • •
c)
latentne zaraze - neke biljke, iako sistemično zaražene virusom, ne pokazuju simptome (skrivene zaraze). Ova pojava je važna u proizvodnji višegodišnjih vrsta.
d) fitocidne zaraze - smrtonosne, ali vrlo rijetke. Npr. u dolini Neretve 90-ih godina se pojavila epidemi ja bolesti letalnih nekroza rajčice (virus mozaika krastavca sa pridruženom satelitnom nekrogenom RNA). Unutarnji simptomi predstavljaju promjene nastale u tkivu biljke. Najznačajnije su nakupine virusa koje nazivamo virusne stanične uklopine ili inkluzije. Inkluzije mogu biti amorfne i kristalične.
17
Slika 9: prikaz nekih sistemičnih simptoma
Slika 10: ostali sistemični simptomi
18
Dokazivanje , identifikacija i suzbijanje virusa Dokazivanje i identifikacija Dokazivanju virusa pristupamo ako biljka pokazuje simptome napada (a želimo dokazati da je inficirana),ako želimo proizvesti biljke oslobođene od virusa ili iz bilo kojeg drugog razloga provjeriti da li je biljka inficirana. U većini pokusa s virusima koriste se i pokusne biljke koje služe za razmnožavanje virusa, istraživanje kruga domaćina i vladanja virusa in vivo. Dokazivanje virusa možemo vršiti: 1) biotestovima 2) metodama bojanja 3) serološkim metodama 4) molekularnim metodama 5) elektronskom mikroskopijom 6) elektroforezom 7) utvrđivanjem prisutnosti dlRNA 1) dokazivanje biotestovima koristi indikatorske biljke, odnosno biljke koje reagiraju specifičnim simptomima kako bi se barem približno mogao identificirati virus. Pokusne biljke mogu se upotrebljavati i za održavanje virusa u kulturi. Dva su tipa biotestova: a) mehanička inokulacija koja se koristi na zeljastim biljkama (Slika 11). Inokulum, odnosno biljni sok iz zaraženog biljnog organa (ili više organā, tada se uzorak prvo homognizira) priprema se s puferom ili vodom. List pokusne biljke se oštećuje abrazivom (silicijevim karbidom) i zaražava
Slika 11: mehanički prijenos biljnih virusa koristi se za dokazivanje virusa biotestovima
19
b) indeksiranje je metoda koja se koristi na drvenastim biljkama. Virus se na zdrave domaćine prenosi cijepljenjem. Simptomima treba puno vremena da se razviju (više mjeseci ili godina). 2) dokazivanje virusa metodama bojanja može se primjeniti kao nespecifičan test na gomoljima krumpira. Bojanjem rezorcin-modrilom utvrđuju se posljedice zaraze virusima. Kalusna tkiva koja nastaju uslijed infekcije boje se plavo. 3) serološke metode su najvažnije i najupotrebljavanije metode dokazivanja i identifikacije virusa. Ovim metodama se mogu identif icirati pojedini virusi, virusni sojevi, ali i bakterije. Zasnivaju se na reakciji koju antigen (bilo koji strani protein kao, na primjer virusni protein) pobuđuje u sisavcu ili ptici. Ovi organizmi na antigene reagiraju stvaranjem antitijela. Kako antitijelo reagira na specifičnu točku raspoznavanja na antigenu, a virus ima nekoliko ovakvih točaka, u organizmu nastaje mješavina antitijela. Ovakva antitijela zovemo poliklonska antitijela, a njihov serum poliklonski antiserum. Za preciznije utvrđivanje seroloških razlika danas se koriste monoklonski antiserumi (posjeduju specifičnost samo za jedno mjesto na antigenu).
Slika 12: priprema antiseruma
Najčešće korištene serološke metode su metode imunodifuzije i serološka analiza pomoću vezanog enzima (ELISA). Postoje jednostruka i dvostruka radijalna imunodifuzija u agarskom gelu. a)
dvostruka radijalna imunodifuzija (Slika 13) u agarskom gelu –DRID; provodi se tako da se tekući agar razlije po stakalcu (dovoljno je mikroskopsko predmetno stakalce). Nakon što se agar ukruti, u njemu treba napraviti dvije udubine udaljene 4-5 milimetara. U jednu se stavlja serum, a u drugu virusni uzorak. 16 Virusi i antitijela difundiraju u agaru. Kada se sretnu kompatibilna antitijela i antigeni, vežu se i dolazi do stvaranja imunoprecipitacijske linije. Želi li se ispitati više uzoraka, potrebno je načiniti više udubina. U središnju ide serum, a u ostale virusni uzorci.
Slika 13: DRID, As =
antiserum 16
Može se upotrijebiti sirovi ili pročišćen biljni sok, ili pak purificirani virus. 20
b) jednostruka radijalna imunodifuzija u agarskom gelu –JRID; razlikuje se od DRIDa po tome što se antitijela nalaze u gelu. Antiserum se dodaje u ohlađeni, ali još tekući agar. Nakon što se agar ukruti, u njemu treba napraviti udubinu u koju se stavlja virusni uzorak. Nastale precipitacijske linije su u obliku kruga. Ova metoda je brža i deset puta osjetljivija od DRIDa. Rezultati se vide za 30-60 min. c)
serološka analiza pomoću vezanog enzima –ELISA (od eng. enzyme-linked immunosorbent assay). Postoji nekoliko verzija ove metode. Najčešće se koristi dvostruka protutijelna sendvič-metoda, odnosno DAS- ELISA (od eng. double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay). Provodi se u mikrotitarskim pločicama od polistirena.
Slika 14: shematski prikaz metode ELISA
Prvo se u bazen ulijeva otopina antitijela (Slika 14, A). Ostavlja ih se da inkubiraju. Antitijela se vežu za stijenke bazena. Slijedi ispiranje pločice (da se ukloni višak antitijela). Dodaju se virusni uzorci. Virusi se vežu s antitijelima (Slika 14, B). Ponovo se provodi ispiranje (ispiru se nevezani virusi). Dodaju se antitijela s enzimima (Slika 14, C). Ispiranjem se odstranjuju nevezana antitijela. Naposlijetku se dodaje enzimatski supstrat i dolazi do promjene boje. Sama promjena boje može se utvrditi vizualno ili se intenzitet promjene boje može utvrditi kalorimetrijski.
Slika 15: rezultat metode ELISA
ELISA daje kvalitativne i kvantitativne podatke o virusu i omogućuje provjeru velikog broja uzoraka.
21
4) od molekularnih ili genetičkih metoda dokazivanja virusa koriste se: 1) lančana reakcija polimerazom- PCR (eng. polymerase chain reaction). PCR je ciklički proces umnožavanja molekule DNA. Broj dobivenih DNA se uvećava geometrijskom progresijom, a ciklus se ponavlja nekoliko desetaka puta (obično 30-40). Koraci u PCRu: 1. 2. 3.
denaturacija:dvostruka molekula DNA se denaturira visokom temperaturom sparivanje: početnice naliježu na 3' krajeva ciljanog segmenta DNA ekstenzija: DNA polimeraza katalizira produkciju novih komplementarnih lanaca
30 sek. na 94°C 30 sek. na 55°C 90 sek. na 72°C
Slika 16: termocikler, aparat u kojem se
odvija PCR
Komponente potrebne za PCR: • • • •
•
DNA koja služi kao predložak (nekoliko ng) dvije različite početnice (primera)17 četiri različita deoksiribonukleozid trifosfata (dNTP, N= A, T , C, G) Taq polimeraza (DNA polimeraza dobivena iz bakterije Thermus aquaticus otporna na visoke temperature) pufer u kojem se odvije reakcija i kofaktor za polimerazu (Mg2+)
Budući da su potrebne specifične početnice za svaku molekulu DNA, potrebno je znati ili o kojoj se molekuli radi, ili izvršiti DNA- sekvencioniranje. 18 Početnice se mogu nabaviti (kupiti) ili sintetizirati. Kako je većina biljnih virusa (+)jlRNA tipa, a PCR se može provoditi samo za molekule DNA, za takve je viruse potrebno prvo izvršiti reverznu transkripciju molekule RNA u molekulu DNA. Plateau-efekt javlja se tijekom kasnih ciklusa PCR-reakcije. Brzina akumulacije produkta pada ispod teoretskog maksimuma zbog: (1) iscrpljivanja supstrata (dNTP i klica), (2) nedostupnosti aktivnog mjesta na enzimu, (3) nestabilnosti enzima ili supstrata, (4) inhibicije konačnim produktom (5) kompeticije nespecifičnih produkata (dimeri klica) (6) nepotpune denaturacije pri visokoj koncentraciji produkta
Problemi koji mogu nastati u PCR-reakciji kontaminacije: prisutnost i najmanje količine nepoželjne DNA može uzrokovati probleme. Izvori DNA i nukleaza: ruke, odjeća, izlučine tijela (slina, znoj), laboratorijsko posuđe (pipete, epruvete), itd. nespecifična amplifikacija nema amplifikacije (DNA je “prljava”, klice nisu optimalne, reagensi su loši ili uništeni) korištenje pogrešne temperature u fazi sparivanja •
• • •
17 18
DNA sekvence koje su komplementarne regijama na 5’ i 3’kraju dijela DNA koji nas zanima Potrebno je znati sekvencu od oko 20 nukleotida na krajevina DNA fragmenta koji želimo sekvencionirati 22
Tehnika PCR se može upotrijebiti za kloniranje ciljanih nukleinskih sekvenci, detekciju sekvenci (dijagnostika u fitopatologiji), sekvencioniranje genoma... Kada imamo dovoljnu količinu DNA, moguće je izvršiti identifikaciju elektroforezom (Slika 17). Elektroforeza na gelu: nakon bojanja etidijevim bromidom gel se pregledava na UV-svjetlu pri čemu se vide nukleinske kiseline, pa tako i produkti umnožavanja tj. PCR-reakcije. Mogu se vidjeti nespecifični produkti umnožavanja. Dimeri klica brzo putuju pa se nalaze na dnu gela1.
Slika 17: agarozni gel obojan
etidijevim bromidom
2) Druga molekularna metoda koja se koristi je hibridizacija nukleinskih kiselina. Ovom metodom moguće je otkriti i identificirati cijeli genom virusa ili samo njegov dio. Upotrebljiva je za RNAviruse, DNA-viruse i viroide. Prvi korak je da se na temelju virusne nukleinse kiseline izradi 3 32 komplementarna DNA (cDNA) koja se obilježava tricijem H ili radioaktivnim fosforom P i dodaje se virusnim uzorcima gdje dolazi do vezanja. U praksi se kupuju gotove cDNA-probe koje omogućuju vrlo brzo analiziranje velikog broja uzoraka. 5) Elektronska mikroskopija više se koristi u istraživačke svrhe nego u dijagnostici. Daje podatke o izgledu virusnih čestica. 6) Elektroforetska istraživanja virusa (Slike 17 i 18): sve elektroforetske metode temelje se na kretanju električno nabijenih čestica u istosmjernom električnom polju prema jednoj od elektroda. Virusi se zbog kapside u elektroforezi ponašaju kao bjelančevine. Kreću se u električnom polju jer su molekule bjelančevina u suspenziji određene pHvrijednosti električki nabijene. Nakon elektroforetskog putovanja virusi se bojaju i očitavaju se rezultati. Metoda je dobra za identifikaciju virusa i otkrivanje miješanih infekcija. Služi i za odvajanje virusnih proteina i nukleinskih kiselina.
Slika 18: uređaj za elektroforezu
7) Utvrđivanje prisutnosti dlRNA odnosno replikativne forme (v. str. 11) koristi se isključivo kod virusa čiji je genom (+)jlRNA. Ovi virusi tijekom svog umnažanja produciraju replikativne forme koje nemaju utvrđenu biološku ulogu, no dlRNA je stabilnija i lakše ju je izolirati. Nakon izolacije (purifikacije)vrši se elektroforetska analiza dlRNA. Usporedbom elektroforograma s podacima iz literature dobiva se nepogrešiva dijagnoza bolesti. Metoda je naročito pogodna za multikomponentne viruse.
23
Suzbijanje virusa Da bi se suzbila neka virusna bolest, odnosno odlučilo koje će se metode suzbijanja virusa upotrijebiti, potrebno je poznavati ekologiju uzročnika, kao i epidemiologiju same bolesti. Najvažniji, i međudjelovanjem povezani, čimbenici koji utječu na širenje virusnih bolesti su:
a)
izvori virusne infekcije kultivirane biljke u usjevu korovne biljke u usjevu divlja vegetacija u okolici prezimljeni vektori ostalo: zemlja, voda, čovjek (oruđe, plodored...) b) svojstva virusa i prisutnost sojeva c) prijenos vektorima d) svojstva biljke domaćina (genotip, starost...) e) ekološki uvjeti- utječu na sve čimbenike u širenju biljnih bolesti • • • • •
Metode suzbijanja virusa dijelimo na preventivne, kojima sprečavamo zarazu i kurativne, kojima kojima nastojimo eliminirati virus iz biljke, odnosno ublažiti učinak bolesti. U proizvodnoj praksi upotrebljavamo preventivne mjere. Kurativne su, za sada neučinkovite (primjena kemijskih sredstava) 19 ili nepraktične (djelovanje povišenom temperaturom).
a)
preventivne mjere obuhvaćaju: proizvodnju zdravog sadnog i sjemenog materijala sprečavanje naknadnih zaraza tog materijala korištenje bezvirusnih biljaka, odnosno biljaka oslobođenih od virusa (udomaćen je naziv VFbiljke od eng. virus free). Komercijalno dobavljive bezvirusne biljke su virusno provjerene biljke (eng. virus tested) što znači da je biljka oslobođena određenog virusa. To ne znači da ista biljka nema virus čija se nazočnos nije niti pokušala utvrditi. kontrolu vektora i domaćina virusa dobru agrotehniku tla (sklanjanje biljnih ostataka, obrada) dezinfekciju alata izbor parcele pri sjetvi vegetativnu zaštitu kod koje vegetativna podloga pozitivno djeluje na ozdravljenje virotične plemke. Npr. šarka šljive na podlozi Prunus mahaleb izazivanje premuniteta namjernim izazivanjem blage virusne infekcije kako bi se biljka zaštitila od napada agresivnijeg soja virusa. Npr. zaštita rajčice u Kini karantensku službu. Vanjsku i unutarnju. (v. dodatak na kraju skripte) korištenje sorata otpornih na viruse 20 • • •
• • • • •
•
• •
Veliku mogućnost sprečavanju virusnih infekcija pruža stvaranje otpornih transgenetičkih biljaka. Još uvijek ne postoje komercijalno razvijene ovakve biljke.
19
Protuvirusna kemijska sredstva su fitotoksična. Kako virus koristi za svoje umnožavanje metabolizam domaćina, protuvirusno djelovanje ubija i stanicu(e) domaćina. 20 Za više informacija pogledati: Juretić, N (2002). Osnove biljne virilogije, str. 217 24
b) kurativne mjere: korištenje protuvirusnih kemijskih spojeva. Još ne postoje kemijski spojevi koji bi uspješno otklonili viruse iz biljaka. Ribovirin konkurira virusnoj bazi i nakon ugradnje zaustavlja sintezu nukleinske kiseline. Ovaj spoj šteti i biljci domaćinu. Neki fungicidi smanjuju simptome viroza tako što sprečavaju raspadanje kloroplasta. •
•
toplinski postupak. Ova metoda uspješno eliminira samo neke viruse (uglavnom izometrične) i mikoplazme. Primjenjena temperatura ovisi o mogućnosti preživljavanja biljke i osjetljivosti virusa. Ako su biljke nižeg habitusa (ili mlade i još malene, moguće ih je vijele podvrgnuti termoterapiji. Kod drvenastih kultura često se najprije plemka cijepi na mladu podlogu, potom tretira temperaturom 3738°C oko mjesec dana nakon čega se izolira pup (potencijalno oslobođen virusa) i cijepi na bezvirusnu podlogu. Kod tretmana cijelih biljaka neće se cijela biljka osloboditi virusa, nego najčešće samo pupovi. Primjer: izoliramo vegetacijski vršak vinove loze (ne sam meristem jer nebi preživio) i tretiramo ga in vitro 21 s 35°C 20ak dana. Nakon toga ga razmnožavamo mikropropagacijom.
•
kultura meristema. Još 30-ih godina prošlog stoljeća uočeno je da se koncentracija virusnih čestica smanjuje prema vršku korijena ili prema vegetativnom vršku, a da sam meristem nema virusa. Kasnije je utvrđeno da meristem ponekad ipak može sadržavati viruse. Ovo se svojstvo meristema koristi za oslobađanje biljaka od virusa. U meristemu nema virusa zbog odsutnosti provodnih elemenata kao i plazmodezmi. Također, smatra se i da postoji kompeticija virusnih čestica i meristemskih stanica u stvaranju nukleinskih kiselina na štetu virusa. Postoji i mogućnost postojanja prirodnih inhibitora umnožavanja virusa. Točan uzrok ovoj pojavi još nije poznat. Postupak se zasniva na kulturi vegetacijskog vrška najmanjih mogućih Slika 19: kultura meristema dimenzija koje mogu rasti u kulturi i davati izdanak.
virusom inficirana biljka (toplinski postupak)
kultura meristema (testiranje na viruse)
matičnjak- elitne bezvirusne matične biljke
daljnje razmnožavanje bezvirusnih biljaka
prijenos biljaka u zemlju (testiranje na viruse)
Slika 20: shematski prikaz koraka u proizvodnji bezvirusnih biljaka
21
Biljke in vivo ne bi preživjele ovu temperaturu. 25
•
•
toplinski postupak i kultura meristema. Najčešće se upotrebljava kod miješanih infekcija. mikrocijepljenje. Ovo je postupak cijepljenja meristema na zdrav klijanac in vitro. Metoda je važna za drvenaste kulture (citruse, vinovu lozu, jabuku, krušku...) Mikrocijepljenje se provodi i in vivo u proizvodnji sadnica jabuka.
Biljke oslobođene od virusa kadkada se fenotipski razlikuju od zaraženih. Do ove pojave dolazi ili zbog eliminacije virusa ili zbog mikromutacija nastalih samim postupkom oslobađanja.
Slika 21: rast jabuke nakon mikrocijepljenja
Za mnoge zeljaste vrste za oslobađanje od virusa koriste se metode uzgoja u kulturi biljnog tkiva. (v. skriptu iz Osnova biljne biotehnologije)
Subviralni patogeni Subviralni patogeni su virusni sateliti i viroidi. Satelitni virusi kodiraju proteine svog omotača, ali ne repliciraju se sami. Mala ovisna virusna čestica je satelitni virus npr. nekroza duhana.Veliki virus se naziva virus pomagač . npr. satelitni virus virusa nekroze duhana Satelitne RNA su linearne RNA molekulekoje ne kodiraju proteine omotača i ne mogu formirati svoj omotač, upakiravaju se u kapside svojih virusa pomagača, ne mogu se niti samostalno replicirati. Dolaze u sklopu drugih virusa, a mogu modificirati simptome virusnih zaraza (najčešće umanjuju jačinu simptoma). npr. satRNA virusa mozaika krastavca Viroidi su samostalne, infektivne, kružne (prstenaste) molekule RNA. U prirodi podsjećaju na štapiće. Nukleotidi se u takvim molekulama većinom sparuju zbog komplementarnosti (>50%) vežući se vodikovim vezama (nisu kovalentne!) kao u dvo lančanoj DNA. Kada se viroidi postupno podvrgnu temperaturi od 60-90°C te se veze kidaju, a denaturirana (razmotana) viroidna RNA je prsten. Inače, RNA je vrlo nestabilna, ali s velikim postotkom sparenih nukleotida je vrlo stabilna. Viroidi su oko 30 puta manji od najmanjeg virusnog genoma. Ovi štapići su još i dodatno uvijeni u trodimenzionalnu strukturu. Ranije su simptomi viroida pripisivani virusima jer su dosta slični. Prvi otkriveni viroid je viroid vretenastog gomolja krumpira (Potato Spindle Tuber Viroid, PSTV). Na vinovoj lozi također dolaze viroidi. Oni uzrokuju diskretne simptome, klorotične prstenčiće. Neki istraživači tvrde da vina proizvedena od grožđa s tih trsova imaju poseban bouquet. Za sada na lozi uzrokuju samo manje štete. Razlike viroida u odnosu na satelitsku RNA: viroidi su sasvim samostalni patogeni. Oni ne trebaju pomoć virusa pomagača, dok je satRNA trebaju.
26
Specijalna virologija Žuta patuljavost ječma PATOGEN: Virus žute patuljavost i ječma, BYDV (Barley yellow dwarf virus) (+)jlRNA izometrični virus (IV skupina po Baltimoreu) DOMAĆINI: virus napada oko sto vrsta porodice trava (Poaceae) , a među njima su ječam, pšenica, zob, raž, tritikale, kukuruz i mnogi travnati korovi. SIMPTOMI: Simptomi žute patuljavosti ječma ovise o domaćinu, razvojnoj fazi inficirane biljke, uvjetima okoline (temperatura, svjetlo) i virulentnosti soja virusa. Tipični znaci bolesti su zastoj u rastu (patuljavost) i promjena boje listova. Slične simptome mogu izazvati i abiotski faktori (niske temperature, višak ili manjak vode u tlu), nedostatak hranjiva (N i S) i oštećenja od herbicida. Na pojavu bolesti povoljno djeluju temperature 10-18°C. Pri nižim temperaturama uz manjak sunčevog svjetla (oblačno), kao i pri temperaturapa preko 30°C simptomi vezani uz promjenu boje nestaju.
Slika 22: simptomi na ječmu
Simptomi na ječmu (Slika 22): Dolazi do zastoja u rastu, a listovi poprimaju zlatnožutu boju uz pojavu gljiva čađavica. Početno žućenje javlja se na vrhovima listova šireći se prema osnovi plojke. Ako je zaraza nastupila u jesen, mlado lišće uz promjenu boje postaje deblje, čvršće i stoji uspravno. Rano zaražene biljke obično ne klasaju ili su im klasvi manji, često sterilni. Rast korijena je slab. Promjene mogu zahvatiti pojedine skupine biljaka, a pri jakom napadu, čitavo polje može biti zaraženo. •
Simptomi na pšenici (Slika 23): Početni znak bolesti je žućenje listova, koji kasnije poprime crvenkastu boju. Pri zarazama u ranim fazama razvoja, biljke dostižu samo trećinu do polovine svoje normalne visine. U tim slučajevima klasanje je rijetko, a prinosi zrna su bitno smanjeni. Ako zaraza nastupi kasnije, simptomi su blaži, vide se klorotične pruge između žila srednjih listova, a gornji listovi pocrvene. •
Slika 23: simptomi na pšenici
Simptomi na kukuruzu (Slika 24): Simptomi se javljaju na donjim listovima koji postaju tamnocrveni do ljubičasti počecši od vrha ili ruba plojke. Promjena boje postupno zahvaća i gornje listove. •
Simptomi na zobi (Slika 24): Prvo se na vrhu plojke javljaju nejasne žutozelene pjege, nakon čega lišće dobiva uspravan sabljast položaj i mijenja boju. Obično dolazi do sterilnosti metlice, a posljedica je znatno smanjenje uroda. Kod kasne infekcije oboljeli listovi imaju crvenilo na rubu plojke, a gubici uroda su proporcionalno manji. •
Slika 24: simptomi na kukuruzu i zobi
27
IZVOR ZARAZE I NAČIN PRENOŠENJA BOLESTI: Najvažniji izvor zaraze su višegodišnji travni korovi. Uz trave važan domaćin je i kukuruz koji ljeti predstavlja most za prijenos ovog virusa između žetve i sjetve ozimih žitarica. Uzročnika (virus) prenose lisne uši ( Rhophalosiphum padi, Rhophalosiphum maidis, Sitobion avenae, Schizaphis graminum). Prijenos je perzistentan. Kod ozimih usjeva najveće
su štete kod jesenske zaraze. Bolest se ne prenosi mehanički (dodirom biljaka), a nije sigurno prenosi li se sjemenom. SUZBIJANJE BOLESTI: Slika 25: utjecaj roka sjetve na pojavu bolesti Neizravne mjere: Otpornih sorata na ovu bolest na našem tržištu nema. Preporuča se kasnija jesenska i ranija proljetna sjetva. Jarine treba sijati dalje od ozimih usjeva. Ne pretjerivati s dušičnom gnojidbom. Nužno je suzbijati korove koji su mogući izvor zaraze. Izravne mjere: od nicanja svaki tjedan treba pratiti pojavu lisnih uši. U slučaju jačeg napada (obično u fazi 2 do 4 lista) provesti zaštitu sredstvima koja imaju dozvolu u RH za tu namjenu, kao npr: BetaBaythroid EC 025, Chromgor 40, Decis, Direkt 10 SC, Dursban E 48, Enduro 258 EC, Fastac 10 SC, Hostaquick EC 50, Karate Zeon, Metasystox EC 250, Pirifos EC, Pirimor 50 WG, Radotion E-50, Rogor 40. Prednost imaju insekticidi sa sistemičnim i brzim inicijalnim djelovanjem. •
•
Rizomanija PATOGEN: virus nekrotičnog žućenja listova šećerne repe, BNYVV (Beet necrotic yellow vein virus) 4 (+)jlRNA štapićasti virus (multikomponentni virus od 4 čestice) (IV skupina po Baltimoreu) Najveća koncentracija virusa je u korjenovim dlačicama i tankim korjenčićima. Virus se rijetko nalazi u nadzemnim organima biljke i nije nađen u sjemenkama. Virus se najakše detektira testom ELISA u homogenatu korijena. DOMAĆINI: sve kultivirane forme vrste Beta vulgaris (repa, šećerna repa...) i špinat. Nije pronađeno da su korovi na poljima zaraženi ovim virusom iako se lobodnjače njime mogu zaraziti mehaničkim putem. SIMPTOMI: koji mogu uputiti na rizomaniju su proliferacija lateralnih korjenčića (bradatost korijena), gubitak turgora, zaostatak u porastu korijena, uspravno i svijetlo lišće te Slika 26: simptomi rizomanije potamnjeli provodni snopovi na presjeku korijena. Iako virus uzročnik rizomanije nosi naziv virus nekrotičnog žutila žila šećerne repe, simptome nekrotičnog žutila na žilama zaraženih listova u praksi je teško uočiti. Simpromi se po polju javljaju lokalno, po žarištima (fokusi). Ponekad se, iako rijetko (zabilježeno je u Japanu i po tome je bolest i dobila ime) nakon žućenja razvijaju nekroze duž provodnih žila. Gdje god je prisutna, rizomanija uzrokuje značajne gugitke prinosa za čak 50-70% težine korijena i za 2-4% sadržaja šećera.
28
IZVOR ZARAZE I NAČIN PRENOŠENJA BOLESTI: Prenosi se putem gljivice Polymyxa betae koja parazitira na korijenu lobodnjača kojih gotovo uvijek ima na poljima šećerne repe. Virus je pronađen u zoosporama ove gljive. Bolesti pogoduju vlažna, neutralna do blago lužnata tla te niska područja. EPIDEMIOLOGIJA: Nađena je 50-ih godina prošlog stoljeća u Italiji. 70-ih i 80-ih ova bolest se proširila u niz zemalja srednje i istočne Europe. Sporadično se javlja i u Hrvatskoj te u većini zemalja u kojima se uzgaja šećerna repa. Ima je i u S. Americi i Azi ji. Nalazi se na EPPO A2 karantenskoj listi. SUZBIJANJE BOLESTI: Kemijsko suzbijanje vektora metil bromidom je ili preskupo ili nedjelotvorno , a i otrovno je.Potrebno je koristiti nove, barem djelomično otporne sorte (imaju gubitke manje do 15% na jako inficiranim tlima). Važno je i spriječiti prijenos tla s polja sa zarazom.
Šarka šljive PATOGEN: virus šarke šljive, PPV (Plum pox potyvirus, Sharka virus) (+)jlRNA nitasti virus (IV skupina po Baltimoreu) U citoplazmi stanica zaraženih listova pregledom elektronskim mikroskopom mogu se uočiti virusne uklopine propelerskog tipa. Virus je vrlo postojan. DOMAĆINI: vrlo širok krug domaćina roda Prunus. Uz šljivu zaražava i marelicu i breskvu, ali i divlje vrste. Smatra se da trešnja i višnja nisu dobri domaćini ovom virusu. SIMPTOMI (Slika 27): Simptomi se javljaju na listovima i plodovima. Na listovima se pojavljuju svijetle koncentrične pjege, a nervatura postaje svjetlija. Ako su oštećenja velika, može doći do defolijacije. Na plodu se prvo razvijaju pjege, a kasnije se smežura i deformira. Meso ploda je tamno, a okus mu je gorak. Koštica također ima svijetle prstene. Sastav tvari u takvim plodovima je također promijenjen, a cijeli plod je nekvalitetan. Kod nekih sorti može doći do otpadanja nezrelih plodova. Plodovi zaraženih marelica su često deformirani. Inficirana šljiva sorte Bistrica pokazuje jake simptome. Na nekim drugim sortama simptomi se javljaju samo na listovima. Ako se zaražena šljiva sorte Bistrica cijepi na crni trn (Prunus spinosa) dolazi do povlačenja simptoma i oni su na kraju ublaženi (vegetativna zaštita). Postoji više sojeva ovog virusa. Jedna od najznačajnijih viroza uopće. Gubici prinosa mogu biti i 100%. IZVOR ZARAZE I NAČIN PRENOŠENJA BOLESTI: Divlje vrste roda Prunus prirodan su izvor zaraze. Vektori su lisne uši. Prijenos je neperzistentan. Lako se prenosi i mehanički, dok se sjemenom ne prenosi. EPIDEMIOLOGIJA: Virus šarke proširio se iz Bugarske. Šarka na bugarskom znači šarenilo. Danas zadvaća dobar dio Europe i Mediterana, Indiju, Čile i SAD. SUZBIJANJE BOLESTI: Osnovna mjera zaštite je korištenje zdravog (testiranog ) sadnog materijala, cjepnog materijala te suzbijanje lisnih ušiju. Različite sorte su različito otporne na ovaj virus. Tolerantna sorta je Stanley. Nove metode dobivanja dobivanja otpornih sorti usmjerene su tehnologiji rekombinantne DNA (transgene biljke). Također, vrše se istraživanja izazivanja premuniteta namjernim izazivanjem virusne infekcije blagim sojevima.
29
Slika 27: simptomi šarke- A) mozaik na listovima šljive, B) svijetle koncentrične pjege i svjetlija nervatura, C) smežuranost ploda šljice, D i E) pjege na plodovima breskve, F) pjege i deformiranost ploda marelice i G) svijetli prsteni na košticama
marelice
30
Mozaična bolest duhana PATOGEN: virus mozaika duhana, TMV (Tobacco mosaic virus) (+)jlRNA štapićasti virus (IV skupina po Baltimoreu) Ovaj virus ima u biologiji vrlo velik značaj jer su uz pomoć njega obavljena mnoga velika otkrića u strukturnoj biologiji, virologiji kao i strukturi i funkciji genskog koda. Virus je vrlo stabilan i ima velik broj sojeva. U inficiranim stanicama mogu se naći virusne uklopine u obliku x-tijela, igličastih parakristala i pravih kristala oblika heksagonalne prizme. DOMAĆINI: Duhan i većina pomoćnica (Solanaceae), ali i krastavac, špinat i mnoge druge biljke. SIMPTOMI: Na listovima bolesnih biljaka pojavljuje se izrazit mozaik. Ako se virus mehaničkom inokulacijom prenese na listove duhana, na njima se obično ne pojavljuju lokalne lezije. Samo se pri višim temperaturama i jakom svjetlu pojavljuju na okuliranim listovima sitne klorotične pjege. Prvi simptomi sistemične infekcije su posvjetljavanje nervature na najmlađim listovima. Ubrzo dolazi do pojave mozaika i lisne deformacije. IZVOR ZARAZE I NAČIN PRENOŠENJA BOLESTI: Ovaj virus nema vektore koji bi ga prenosili. Najvjerojatnije u biljku ulazi kroz rane na površini, a ne kroz ektodezmije. Sjemenom i peludom se slabo prenosi. Danas ga najviše prenose čovjek i agrotehnička oruđa. Može se prenositi i tlom preko rana na korijenu.
Slika 28: simptomi mozaične bolesti
duhana na biljci duhana 22
SUZBIJANJE BOLESTI : u kontroli ovog virusa koristimo se agrotehničkim sanitarnim mjerama i upotrebom rezistentnih sorata. Pod agrotehničkim mjerama podrazumjeva se uklanjanje zaraženog biljnog materijala uz naknadno pranje ruku sapunom i izbjegavanje sjetve/sadnje kultura koje bi virus mogao napasti naredne dvije godine. Vrše se istaživanja s korištenjem transgenih biljaka u borbi protiv TMVa.
22
prema: Agrios, G (2004). Plant Pathology 5th edition, str. 758 31
Mozaičana bolest krastavca PATOGEN: virus mozaika krastavca, CMV (Cucumber mosaic virus) Multikomponentni virus. Ima tri molekule (+)jlRNA pakirane u tri čestice iste veličine. Trećoj čestici je pridružena je još jedna malena, četvrta RNA. Dvije dulje molekule RNA kodiraju proteine za replikaciju RNA, treća kodira protein zadužen za međustanično kretanje virusa, a četvrta, subgenomska, kodira kapsidu. U stanicama domaćina može formirati šesterokutne inkluzije. CMV napada više biljnih vrsta od bilo kojeg drugog virusa. Ima oko 800 domaćina. Uz papriku i rajčicu, napada i krastavce, dinje, tikvice, špinat, repe, krucifere... U povrtlarskoj proizvodnji najveće štete radi na paprici. Na rajčici u plantažnoj proizvodnji rijetko kada je zaraženo preko 10% biljaka. Ovaj virus ima velik broj sojeva, a može sadržavati i satelitsku RNA koja može utjecati na tip i jačinu simptoma na biljci domaćinu. Tako se u dolini Neretve devedesetih godina prošlog stoljeća pojavila epidemija bolesti letalnih nekroza rajčice koju je uzrokovao virus mozaika krastavca s pridruženom satelitnom nekrogenom RNA. SIMPTOMI(Slike 29 i 30): Na zaraženim biljkama javljaju se simptomi mozaika, patuljavog rasta, deformacije lista (nitavost) i deformacije ploda. Stupanj izraženosti simptoma ovisi o virulentnosti soja virusa, kultivaru, stadiju razvoja napadnute biljke i uvjetima okoline. Na paprici se prvo pojavljuje blagi klorotični mozaik, a kasnije i izražene žute pjege. Moguća je i pojava nitavosti lista. Zbog izobličenja cvjetova i sterilnosti polena dolazi do formiranja malog broja plodova koji su izobličeni s čestim nekrozama. Moguća je i pojava nekrotičnih crtica na stabljikama. Dolazi do patuljavog i metličavog rasta. Na rajčici (Slika 29)se u početku zaraze javlja blagi mozaik na listovima koji prelazi u nitavost. Dolazi do promjena u rastu biljke, a virulentni sojevi uzrokuju pojavu nekroza na stabljici i duž lisne nervature.
Slika 29: lijevo - zdrav list rajčice i desno - nitavost
zaraženog lista
IZVOR ZARAZE I NAČIN PRENOŠENJA BOLESTI: Virus mozaika krastavca najvećim se dijelom šiti lisnim ušima i to neperzistentnim prijenosom. Izvor virusa su korovne, ali i neke kultivirane vrste bilja koje rastu u blizini uzgajališta. U određenoj mjeri može se prenositi i sjemenom (kod nekih vrsta biljaka). Moguće je i mehaničko širenje do kojeg može doći rukovanjem biljkama u rasadniku i na polju, a virus se prenosi zaostalim zaraženim biljnim ostacima u tlu. SUZBIJANJE BOLESTI: Suzbijanje je najbolje provoditi kombinacijom nekoliko mjera. Svakako se preporučuje korištenje otpornih sorti. Za proizvodnju treba koristiti isključivo zdrav sadni materijal. Rasad i biljke u zatvorenom prostoru proizvoditi na novom supstratu bez zaraženih bijnih ostataka. U rasadu i zatvorenom prostoru uništavati sve zaražene biljke. Za proizvodnju u polju primjeniti plodored sa predkulturama koje nisu osjetljive prema virusu (pšenica, ječam i dr.). Uništavanje korova u usjevima neophodna je mjera jer su neki od njih mogući izvori zaraza. Kemijsko suzbijanje vektorskih uši može biti korisna mjera samo kod uzgoja na velikim površinama, izoliranim od drugih osjetljivih usjeva. Moguće je i spriječiti pristup ušima korištenjem prozirne folije.
32
Slika 30: simptomi mozaične bolesti krastavca: A) i B) mozaik na listu paprike, C) patuljavost na paprici i D) mozaik na
listu tikvice
Bolest ljuštenja kore stabla agruma PATOGEN: Citrus exocortis viroid, CEV Radi velike štete u SAD-u (Kalifornija i Florida). Vrlo je zarazan viroid. DOMAĆINI: citrusi (limun, grejp, naranča, mandarina). SIMPTOMI: pucanje kore uz spoj podloga-plemka. Zaražena stabla su kržljava, plodovi su manji i karakterističnog stanjenog oblika. Velike štete u SAD-u (Kalifornija i Florida). U Dalmaciji je većina citrusa na osjetljivim podlogama. Za nekoliko godina od zaraze (do 5) može biti nužno krčenje plantaže s ciljem sprječavanja širenja zaraze. NAČIN PRENOŠENJA BOLESTI: Prenosi se rukama i poljodjelskim alatom.
33
Slika 31: simptom CEVa- pucanje kore uz spoj podloga-plemka
Prokariotski biljni patogeni - opći dio
Prokariotski patogeni su fitopatogene bakterije, rikecije, fitoplazme i spiroplazme. Poznato je oko 1600 vrsta bakterija. Većinom su saprofitski organizmi. Biljne bolesti uzrokuje oko 100 vrsta, odnossno 300 sojeva bakterija. U usporedbi s brojem fitopatogenih gljiva ovo je malen broj no to ne umanjuje njihov značaj jer se one vrlo teško suzbijaju pa mogu nanijeti čak i veće štete od gljiva. Pasteur i Koch (Francuska) 1876. g. otkrili su da bolest bedrenicu (antraks) uzrokuje bakterija. Ovo je prva otkrivena bakterioza. Burrill (SAD) 1878. g. otkrio prvu bakteriozu biljaka, bakterijsku palež jabuke i kruške (Erwinia amylovora). Erwin F. Smith (SAD) je otkrio neke druge bakterioze biljaka a 1890. g. i tumor vrata korijena ( Agrobacterium tumefaciens) čiji mehanizam nastanka simptoma je razjašnjen tek 1980. g. Mnoge fitopatogene bakterije prodiru u sjeme i zaražavaju ga, kao npr. crna trulež kupusa ( Xanthomonas campestris ).
Morfologija i fiziologija fitopatogenih bakterija Građa bakterija Bakterije su heterotrofni jednostanični prokariotski organizmi. Građa njihove stanične stijenke je složena (više tipova; fitopatogene bakterije su pretežno Gram negativne), a sastoji se od proteina, lipida i polisaharida. U stanici nemaju membranama ograđenih struktura. Nemaju jezgru ali imaju nukleoid (DNA koju ne omeđuje jezgrina membrana). U citoplazmi se nalaze ribosomi (maleni- 70S) i ekstrakromosomske nukleinske kiselineplazmidi. Kromosomska nukleinska kiselina služi kao kontrolni centar bakterijske stanice. Nosi genetsku uputu za stvaranje nekoliko tisuća enzima i drugih proteina. Ima sposobnost samoreplikacije, što omogućuje staničnu diobu i upravlja svim staničnim aktivnostima. Rezervna tvar im je pretežno glikogen.
Slika 32: Slika 33: elektronska mikrografija najčešćih fitopatogenih
bakterija: A) Agrobacterium, B) Erwinia, C) Pseudomonas , D) Xantomonas
34
Flagele su bičevi koje mogu imati (najčešće) štapičaste bakterije. Služe za pokretanje. 23 Građene su od bjelančevine flagelina. Raspored i broj flagela koriste se u identifikaciji. Podjela po rasporedu bičeva: • • • • •
atriha monotriha lofotriha amfitriha (Pseudomonas) peritriha (Erwinia)
Slika 34: : raspored bičeva bakterija: A) atriha, B) monotriha ,
C) lofotriha, D) amfitriha i E) peritriha
Pili (fimbrije) su kratki, nježni (tanji od flagela), kruti izdanci na površini gram-negativnih bakterijski stanica. Građeni od proteina pilina.. Izrastaju iz citoplazme i prolaze kroz staničnu stijenku. Omogućuju prihvaćanje (priljubljivanje, adherenciju) bakterija na stanicu domaćina. Posebna tip su spolni pili odgovorni za prijenos genetičkog materijala iz bakterije u bakteriju prilikom konjugacije. Fitopatogene bakterije su asporogene i štapićaste. Izuzetak je Streptomyces koji je filamentozan. Aktinomicete formiraju višestanične niti, ostale se mogu udruživati u kolonije. Iako su paraziti, mogu se uzgajati na hranjivim podlogama. Unutar vrste postoje sojevi- patotipovi.
Fiziologija bakterija Bakterije se razmnožavaju diobom, a ponekad i pupanjem. Pod povoljnim uvjetima bakterija se može podijeliti svakih 20-50minuta što rezultira vrlo velikim povećanjem broja ovih organizama. Prijenos genetičkog materijala iz jedne u drugu bakteriju događa se u procesu konjugacije (podsjeća na spolno razmnožavanje). Bakterije su paraziti intercelulara. U biljku ne prodiru aktivno, već kroz prodorne otvore (puči, hidatode, nektarije...) i rane. Zbog toga se preporuča sterilizacija korištenog alata ili/i orezivanje biljnih dijelova za koje se sumlja da su zaraženi. Bakterije mogu proizvoditi pektolitičke i celulolitičke enzime te toksine, no u pravilu ne prodiru duboko u tkivopojavljuju se lokalno. Šire se dijeljenjem ili strujom tekućine u kojoj se nalaze.
Sistematika fitopatogenih prokariota Pojednostavljena taksonomija bakterija na osnovi osobina stanične stjenke na 4 koljena 24: Gracilicutes (tanka stanicna stjenka, tipicni gram-negativni organizami). Uključuje rodove: Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Agrobacterium i Xylella(spada u rikecije!) Firmicutes (debela stanična stjenka, gram-pozitivni organizami). Uključuje rodove: Streptomyces i Clavibacter (sin. Corynebacterium), Bacillus, Clostridium, Arthrobacter, Rhodococcus, Curtobacterium Tenericutes 25 (meka, savitljiva stanicna stjenka ili bez stanicne stjenke): razred Mollicutes. Uključuje rodove: Spiroplasma i Phytoplasma, Mendosicutes (prokarioti sa stanicnom stjenkom koja ne sadrži peptidoglikan)
23
Prema: Volner Z (2003). Opća medicinska mikrobiologija s epidemiologijom i imunologijom, str. 29 Prema: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 25 U daljnjem tekstu tretiraju se po tradicionalnijoj podjeli kao samostalan razred, odvojen od bakterija 24
35
U praksi se koristi podjela na gram pozitivne, gram negativne bakterije te rikecije, fitoplazme i spiroplazme. Rod
broj vrsta
reakcija po gramu
boja kolonija
Pseudomonas
7
G-
sivobijela (fluorescira zeleno)
Xantomonas
5
G-
žuta
Agrobactetium
4
G-
bijela
Erwinia
12
G
-
bijela
Corynebacterium
12
G+
krem
Streptomyces
1
G+
Slika 35: važni fitopatogeni rodovi
Subcpecijalne sistematske jedinice u bekteriologiji zovemo patogene varijatet ili patovar. Evolucija fitopatogenih bakterija i porijeklo parazitizma. Npr. bakterije roda Erwinia su evoluirale iz koliformnih bakterija. Na to ukazuje sličnost sekvence DNA. Predpostavlja se da je razvoj tekao preko saprofita koji žive u tlu te da se istovremeno razvijala patogenost prema biljkama i životinjama
Mikoplazmama slični organizmi Ovu grupu prokariota predstavlja razred Mollicutes koji obuhvaća prokariote koji imaju samo staničnu membranu, a ne i staničnu stijenku. Kada su ovi mikroorganizmi otkriveni 1967. godine, prvo se mislilo da su virusi. Kasnije su nazvani mikoplazmama slični organizmi. Kasnije se dokazalo da nisu mikoplazme pa su svrstani u vlastiti red Mycoplasmatales. Sistematika: Red: Mycoplasmatales Porodica: Mycoplasmataceae Rod: Phytoplasma Porodica: Spiroplasmataceae Rod: Spiroplasma
36
1) Spiroplazme 1972. g. su u oboljelim narančama i kukuruzu nađeni prokarioti osobitog oblika, dugačke spiralne niti (podsjećaju na razvučene opruge). Spiroplazme su pokretljive (zmijoliko se kreću ako se nalaze u tekućem mediju). MORFOLOGIJA: Svim članovima porodice Spiroplasmateceae svojstveno je da poprimaju spiralan oblik ako se uzgajaju u tekućem mediju (za razliku od mikoplazmi). U krutom mediju spiroplazme su kuglaste kao i mikoplazme.
Slika 36: Spiroplasma citri, lijevo je zdravo drvo, a
desno zaraženo
Spiroplazme imaju veličinu od oko 250 x 12 000 nm. Detaljno je proučena samo Spiroplasma citri koja je nađena u naranči. SIMPTOMI: Javlja se žućenje listova, skraćenje stabljike (internodiji se skraćuju), zastoj u rastu, prekida se normalna faza mirovanja biljke i pojavljuju se dodatni izbojci (proliferacija) na stabljici i korijenu. Pretpostavlja se da spiroplazme mijenjaju metabolizam giberelina. VEKTORI su cvrčci. Oni su im i sekundarni domaćini pa se u njima spiroplazme i umnožavaju. Neke teorije govore o tome da su spiroplazme najprije parazitirale na kukcima, a zatim da su počele zaražavati i biljke. Osim biljaka i beskralješnjaka spiroplazme mogu zaraziti i niže kralješnjake (npr. miša i hrčka) kod kojih uzrokuju kataraktu (zamućenje očnih leća) i kroničnu infekciju mozga. 2) Fitoplazme MORFOLOGIJA: građom najviše sliče bakterijama; jednostanični prokatioti, razmnožavaju se diobom ili pupanjem. Pleomorfne su, dakle neodređenog oblika. Nalaze se u floemu. Osjetljive su na antibiotike tipa tetraciklina, ali ne na penicilinske antibiotike. SIMPTOMI: izgledaju kao simptomi viroza (žutice), a uzrokuju i proliferacije. •
Zlatna žutica vinove loze, FD (franc. Flavescence Dorée)
Kod nas nije utvrđena, a gdje se pojavljuje, ekonomski je vrlo značajna fitoplazmoza.
Slika 37: simptomi zlatne žutice vinove loze
PATOGEN: Candidatus Phytoplasma vitis SIMPTOMI: Krajem svibnja i u lipnju za topla vremena dolazi do smanjenog rasta loze, skraćuju se internodiji, uvijaju se rubovi listova prema dolje. Tipični znakovi bolesti vidljivi su u jesen. Lišće bijelih kultivara požuti, a prema suncu ima zlatni sjaj. Rubovi listova su jako svinuti prema dolje. Lišće je kruto. Kod crvenih kultivara listovi poprime crvenkastu boju, a žile posmeđe. Lišće je kruto, rubovi uvijeni. Pri ranoj zarazi grozdovi se mogu osušiti, inače su bobe smežurane. Mladice slabo drvene pa tijekom zime smrznu. VEKTOR: u Hrvatskoj i Sloveniji najvažniji vektor je cikada Scaphoideus littoralis.
37
Rikecije Pronađene su 1970-ih godina uz pomoć elektronskog mikroskopa nađeni u ksilemskim provodnim elementima vinove loze sa simptomima Piercove bolesti. Razlikuju se od fitoplazmi po tome što imaju staničnu stijenku i osjetljive su na penicilin.Uzrokuju simptome slične virusima. Najčešće opće žućenje biljke. Ne mogu se uzgajati na umjetnim podlogama u laboratoriju. Ne prenose se mehanički inokulacijom, nego samo kukcima. Predstavnik je Xylella fastidiosa koja uzrokuje Pierceovu bolest vinove loze. Mikroorganizam se nalazi u ksilemskim provodnim elementima.
38
Slika 38: Xylella fastidiosa- kloroza na citrusu
Simptomi bakterioza 1) Gnjiloća ili mokra trulež nastaje maceracijom biljnog tkiva djelovanjem pektolitičkih enzima. Tkivo je rahlo, stanice su odvojene, dijelom su i razorene te iz njih izlazi sadržaj. Karakteristično za organe koji sadrže puno vode (lukovice, gomolji, …). Često na uskladištenim gomoljima i plodovima. 2) Pjege. Sitne vodenaste (“masne pjege”) se proširuju i postaju smeđe (nekrotiziraju). Toksini uzrokuju nastanak klorotičnog prstena oko pjege (“halo”). Često na grahu, duhanu, kukuruzu, begoniji (Pseudomonas). 3) Palež. Napadnuti organ ili njegov dio naglo posmeđi ili pocrveni i sasuši se (npr. E. amylovora na krušci, jabuci ili dunji, ponekad se javlja i eksudat). 4) Venuće nasteja zbog začepljenja provodnih elemenata, npr. Erwinia carotovora na krumpiru (crna noga) ili venuće rajčice. 5) Izrasline (hipertrofije, tumori) nastaju mnogostrukim diobama stanica tvornog tkiva (parenhimskog i žilnog), npr. Agrobacterium tumefaciens koji uzrokuje tumor vrata korijena velikog broja biljnih vrsta (polifagna bakterija).
Slika 39: simptomi bakterioza
39
Rad s bakterijama- stvaranje čistih kultura Fitopatogene bakterije (osim rikecija) mogu se uzgajati in vitro. Bakterije rastu na hranjivim podlogama u uvjetima koje najviše odgovaraju pojedinom vrstama. Hranjive podloge su sastavom prilagođene određenim vrstama baktrija. Priprema hranjivih supstrata za određivanje glavnih rodova i vrsta fitopatogenih bakterija: odvaga sastojaka miješanje sastojaka (ili upotreba već pripremljenih tržišno dobavljivih formulacija) mjerenje i podešavanje pH vrijednosti sterilizacija podloge u autoklavu izlijevanje podloge u petrijevke (dodavanje agara) i sušenje nacjepljivanje bakterija inkubacija u termostatu • • • • • • •
Čiste kulture su kulture s bakterijama samo jedne vrste. Postupak dobivanja čistih kultura (Slika 40): uzima se uzorak od zaraženog dijela biljke uzorak se površinski sterilizira nateijevim hipokloritom ili etanolom biljno tkivo se ispire i suši papirom (koristiti sterilno posuđe i oruđe) u epruvetu sa sterilnom vodom stavljamo uzorak biljnog tkiva otopinu biljnog tkiva razređujemo do tisuću puta otopine različite gustoće stavljamo na hranjivu podlogu i čekamo da se razviju kolonije iz odabrane kolonije prenosimo bakterije na novu petrijevku i dobivamo čistu kulturu • • • • • • •
Slika 40: dobivanje čiste kulture
40
Bakterisjke kulture čuvaju se na hranjivim podlogama. Mogu se zamrznuti u glicerolu na -18 ili -20°C, ili liofilizirati.
Identifikacija bakterija i principi suzbijanja fitopatogenih bakterija Metode identifikacije bakterija Da bi se utvrdio uzročnik neke bolesti, moraju se ispoštovati Kochovi postulati: 1) uzročnik mora biti dokazan za svaki slučaj iste bolesti (mora se pronaći mikroskopom u oboljelom tkivu) 2) uzročnik se mora izolirati iz domaćina i uzgojiti in vitro 3) bolest se mora reproducirati inokulacijom uzgojenog uzročnika u zdravog domaćina 4) isti uzročnik se mora dobiti iz domaćina inokuliranog u pokusu i izvornog domaćina U praksi se na osnovu jasnih simptoma pristupa ciljanom utvrđivanju uzročnika. Identifikaciju možemo vršiti sljedećim metodama: 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)
Mikroskopiranjem Odeređivanjem morfoloških osobina hranidbenih podloga (izgled, boja i oblik kolonija) Ispitivanjem biokemijskih osobina Serološkim metode (ELISA) v. poglavlje „Dokazivanje , identifikacija i suzbijanje virusa“, str. 19 Imunoflorescencijom (cijela bakterija sjaji ako su prisutna specifična protutijela) Bakteriofagnim svojstvima (osjetljivost na određene fage) Lančanom reakcijom polimerazom (PCR) v. poglavlje „Dokazivanje , identifikacija i suzbijanje virusa“, str. 21 8) Biološkim metodama
1. 2.
Mikroskopija nam može da ti okvirne podatke kojoj skupini pripada ispitivana bakterija Uzgoj bakterija na hranjivim podlogama može se koristiti u identifikaciji jer pojedine bakterije produciraju kolonije specifičnih osobina. Također, mogu se koristiti selektivne podloge koje inhibiraju rast neželjenih vrsta, antibiogram 26
Slika 41: Kolonije bakterija E. amylovora (desno) i Pseudomonas syringae pv. syringae (lijevo)
26
antibiogram je rezultat in vitro ispitivanja osetljivosti izolovanog bakterijskog soja na različite antibiotike i hemoterapeutike 41
3. 5. 8.
Ispitivanje biokemijskih osobina . Mogu se koristiti reakcija po gramu i KOH-test Imunoflorescencija (Slika 41): cijela bakterija sjaji ako su prisutna specifična protutijela. Kod bakterije P. syringae na UV-svjetlu kolonije i hranjivi medij s difuzibilnim pigmentom fluoresciraju Biološke metode: Hipersenzitivnoa reakcija (HR) na duhanu. Priređuje se čista kultura patogena, vrši suspenzija u sterilnoj vodi i inficiranje lista duhana. Pozitivna reakcija je pojava simptoma (nekroza na listu) . Zaraza nezrelih plodova (Slika 42) Na umjetno zaraženim nezrelim plodovima kruške nakon inkubacije u vlažnoj komori pojavile su se nekroze, a na nekima od njih se na mjestu inokulacije pojavio i eksudat. Pojava znakova bolesti nakon umjetne zaraze u laboratoriju koji odgovaraju znakovima bolesti koji se pojavljuju u prirodi sv jedoči o patogenosti testiranog izolata. Bakterijski izolati E. amylovora su patogeni na nezrelim plodovima (nekroza i kapljica eksudata). •
•
Slika 42: zaraza nezrelih plodova
42
Principi suzbijanja fitopatogenih bakterija
a)
Preventiivne mjere: 1) agrotehničke mjere 2) obavještajna služba 3) karantenska služba b) Preventivno kurativne mjere: 1) mehaničke mjere borbe 2) fizičko termičke mjere borbe 3) kemijske mjere borbe- učinkovita su jedino bakrena sredstva. Antibiotici se mogu davati dobre rezultate, ali mogu urokovati i fitotoksičnost. U Europi i Hrvatskoj nemaju dozvolu za primjenu u poljoprivredi (zbog opasnosti od pojave rezistentnosti). 4) biološke mjere borbe: antagonistički odnosi fitopatogenih bakterija i saprofitne mikroflore u tlu antagonistički odnosi fitopatogenih bakterija epifitne mikroflore (flora površine biljke) korištenje bakteriofaga • • •
43
Specijalna bakteriologija Pseudomonas naseljavaju uglavnom parenhimsko ali i druga biljna tkiva. Uzrokuju nekroze (pjegavost), palež, tumore, uvelost i trulež.
Pseudomonas syringae pv. tabaci (sin. Pseudomonas tabaci ) Bakterijska plamenjača (palež) duhana ili "divlja vatra". Naseljava parenhimska tkiva. Najštetnija na klijalištima (pogoduju toplina i vlaga). Zaražene biljke najprije potamne, zatim venu i poliježu i trunu. Na polju - klorotične pjege unutar kojih tkivo nekrotizira. Nekroza se širi i cijela biljka propada. Širenju bolesti pogoduje kiša, prenosi se insektima ali i pri berbi (radnici). Može se prenijeti i sjemenom te biljnim ostacima.
Slika 43: palež na listu soje, uzročnik
Pseudomonas tabaci
Pseudomonas solanacearum (sin.Ralstonia solanacearum) Uzrokuje bakterijsku uvelost i mrku trulež krumpira. Polifag. Lišće vene a na gomoljima trulež (tamne zone i žuto-bijeli eksudat). Bolest se prenosi gomoljima, biljnim ostacima u tlu i insektima (krumpirova zlatica). Razvoju bolesti pogoduje kiša i više temperature. Kod nas nije utvrđen.
Slika 44: Uvenuće lišća krumpira, uzročnik
Ralstonia solanacearum
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola ( sin. Pseudomonas phaseolicola ) Masna pjegavost graha (nekrotične pjege na lišću, peteljci i mahunama ili sistemična uvelost). Za razliku od Xanthomonas phaseoli ove pjege imaju klorotičnu zonu na rubu nekroza. Prenosi se sjemenom i biljnim ostacima. Plodored, zdravo sjeme. Neke sorte su otpornije. Slika 45: nekrotične pjege na
lišću graha, uzročnik Pseudomonas phaseolicola
44
Pseudomonas syringae pv. lachrymans ( sin. Pseudomonas
lachrymans )
Poligonalna pjegavost lišća krastavca. Može je se zamijeniti sa nekim gljivičnim bolestima. Kod bakterioze se javlja žućkasti eksudat ("suza") i napadnute zone lista ispadaju. Prenosi se sjemenom i biljnim ostacima. Plodored, zdravo sjeme.
Pseudomonas syringae pv. savastanoi ( sin.
Pseudomonas
savastanoi )
Uzročnika nastanka izraslina i tumora masline i oleandra (šuga masline). Prva proučavanja još 1886. u Italiji (istraživač Savastanoi). Ima je svugdje gdje se uzgajaju masline i oleandri. Česta u Dalmaciji. Tumori na korijenu, deblu, granama i lišću. Tumori s vremenom rastu a povećava im se i broj. Bakterija prodire u tkivo kroz ozljede nastale djelovanjem mraza ali i za vrijeme provođenja raznih agrotehničkih operacija. Pojavljuju se tumori na granama koji uzrokuju sušenje grana. Širi se eksudatom a vektor je Dacus oleae (maslinova muha). Ulazi preko rana. Dezinfekcija pribora u rezidbi, suzbijanje vektora, zdrav sadni i cjepni materijal.
Slika 46: tumori na maslini, uzročnik Pseudomonas savastanoi
Pseudomonas syringae pv. glycinea ( sin. Pseudomonas glycinea ) Bakterijska pjegavost soje. Podnosi hladnije uvjete. Žute pjege s tamnom nekrozom u središtu. Kasnije su pjege tamno-crvene a na kraju pocrne. Zaraza se prenosi sjemenom i eksudatom (na listu).
Pseudomonas syringae pv. tomato (sin. Pseudomonas tomato) Crna pjegavost lista i krastavost ploda rajčice. Na svim nadzemnim dijelovima javljaju se tamne pjege (ljubičaste, na kraju pocrne) okružene žućkastom klorotičnom zonom. Na plodovima također sitne sjajno-crne pjege = karakteristično. Tkivo ploda puca. Javlja se i eksudat. Širi se sjemenom. Slika 47: krastavost ploda rajčice, uzročnik
Pseudomonas tomato
45
Xanthomonas naseljavaju parenhim i provodna tkiva. Uzrokuju pjegavost, rjeđe uvelost i nastanak tumora.
Xanthomonas campestris pv. campestris Crna trulež provodnih snopova na kupusnjačama. Provodni snopovi pocrne, lišće je žuto i kupus ne formira glavicu. Štetna u Dalmaciji. Vektori su lisne uši i puževi. Može doći do sekundarnih infekcija drugim patogenima koji uzrokuju vlažnu trulež. Slika 48: Xsanthomonas campestris pv.
campestris, simptomi
Xanthomonas campestris pv. phaseoli (sin. Xanthomonas phaseoli )
Bakterijska pjegavost ili obična plamenjača graha. Cijela biljka brzo nekrotizira pa usjev izgleda kao spaljen. Na sortama graha sa bijelim mahunama slične simptome izaziva djelovanje UVzračenja. Na mahunama se javljaju pjege (zelenkaste, kasnije potamne) koje su obično udubljene = slično simptomima gljiva iz roda Colletotrichum; kod gljive su pjege jače udubljene, crne su i suhe, bez eksudata). Zdravo sjeme, Cu-preparati.
Slika 49: nekrotične pjege na lišću graha,
uzročnik Xanthomonas phaseoli
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (sin. Xanthomonas vesicatoria ) Krastavost ploda rajčice i bakterijska pjegavost lišća paprike. Vesicatorius = lat. krasta, mjehur, plik. Na listovima najprije nastaju uljaste pjege a nakon toga nekroze. Pjege ispadaju. Stabljike i cvjetovi isto napadnuti. Na plodu oko pjege tkivo puca i postaje plutasto. Prenosi se sjemenom i biljnim ostacima.
Slika 51: Xanthomonas vesicatoria, simptomi
na lišću rajčice
Slika 50: Xanthomonas vesicatoria, simptomi na plodu rajčice
46
Xanthomonas campestris pv. juglandis (sin. Xanthomonas juglandis)
Bakterijska pjegavost oraha. Pjege na lišću, peteljci, cvijetu pa i plodu. Pjege s vremenom pocrne. Na plodu može biti zahvaćena i jezgra - smežura se i pocrni. Lišće otpada.
Slika 52: Xanthomonas juglandis, simptomi
na plodu oraha
Agrobacterium izaziva nastanak tumora.
Agrobacterium radiobacter pv. tumefaciens (sin. Agrobacterium tumefaciens)
Izraziti polifag. Izaziva tumore na mjestu rane (najčešće na vratu korijena) ili kod cijepljenja koji nastaju pod utjecajem pojačanog lučenja biljnih hormona. Takve biljke zakržljaju. Bakterija u tlu može živjeti i 10 godina. Prenosi se vegetativnim razmnožavanjem, zaraženim alatom i navodnjavanjem. Tumor je u početku mekan a s vremenom otvrdne i potamni. Ova bakterija nosi u svojoj citoplazmi plazmid (=Ti-plazmid) koji nakon ulaska bakterije u biljku prelazi iz bakterijske stanice u biljnu stanicu gdje diktira stvaranje "opina" (posebna grupa spojeva) koje koriste u svom metabolizmu samo bakterije sa Ti-plazmidom. Ovo je primjer složenog parazitskog odnosa bakterije i biljke. Slika 53: Agrobacterium tumefaciens-umjetno indcirani
tumori na duhanu
Agrobacterium radiobacter pv. rhizogenes (sin. Agrobacterium rhizogenes) Nastaje puno novih korjenovih žila. Biljka zaostaje u rastu. Kosmatost korijena.
Agrobacterium radiobacter Znanstvenici ga smatraju A. tumefaciens bez Ti-plazmida.
47
Corynebacterium michiganense pv. michiganense Bakterijsko venuće rajčice. Pjege na listovima, rane na peteljkama i stabljici. Na kraju vene cijela biljka. Provodni snopovi su crni i na biljci se javlja eksudat. Na plodovima se javljaju žuto-bijele pjege sa smeđom bradavicom u sredini (ptičje oko). Prenosi se sjemenom, biljnim ostacima i mehanički.
Slika 54: Bakterijsko venuće
rajčice. Simptomi na biljci i prerez stabljike
Erwinia izrazita pektolitička aktivnost. Luče enzime (pektinazu, ...) koji razaraju stanične lamele u biljnom tkivu što uzrokuje maceraciju tkiva, vlažnu trulež ("soft-rot" grupa bakterija = carotovora).
Erwinia carotovora pv. atroseptica Smatra se varijantom E. caratovora pv. carotovora. Bolest se naziva "crna noga". Krumpir - prizemni dio biljke. Tamne pjege. Biljka kržlja, lišće se uvija i blijedi - kao da nema dovoljno vode. Gomolji su sitni i biljke se daju lako iščupati iz zemlje. Na prerezu gomolja vidljive su tamne zone. Ako zaraženi gomolji prezime u tlu oni su izvor zaraze naredne sezone. Bolest se prenosi i zaraženim sadnim materijalom. Prenose je i insekti (ličinke koje žive u tlu), a naročito se prenosi pri kontaktu zdravih i zaraženih gomolja na strojevima za sortiranje.
Slika 56: E. caratovora pv. carotovora, simptomi na nadzemnom dijelu biljke
Slika 55: E. caratovora pv. carotovora, simptomi na gomolju
48
Erwinia carotovora pv. carotovora Najčešći uzročnik vlažne truleži raznih biljaka (polifag). Krumpir, plodovi rajčice i paprike, mrkva, luk krastavci, duhan, kukuruz (stabljika, crni iznutra), šećerna repa, krizantema, ciklama, kaktusi, ... Prve se javljaju pjege, vlažne površine ("soft rot"). Razgrađuju se središnje lamele, ali i stanice što dovodi do raspadanja biljnog tkiva. Česti nastaje i neugodan miris (uglavnom je to rezultat djelovanja saprofitnih mikroorganizama koji naknadno naseljavaju razmekšano tkivo). Bakteri je ulaze putem rana, često uzrokovanih tučom i sl. Bolest prenose i muhe, a širenju infekcije pogoduje kiša.
Erwinia amylovora Bakterijska palež kruške, jabuke i drugih Rosaceae-a. Najopasnija bolest krušaka a osim njih napada jabuku, dunju, glog i puno drugih biljaka iz porodice Rosaceae. Potiče iz SAD odakle je prenijeta u Europu (Velika Britanija). Zatim se proširila zapadnom Europom. Imamo je i u Hrvatskoj (područje I Slavonije). Simptomi su vidljivi na svim biljnim dijelovima. Najranije se javljaju crne nekroze i uvijanje lišća (Slika 54). Čitavi cvatovi mogu pocrniti i propasti (Slika 58). Plodovi mumificiraju i ostaju visjeti na stablu sa vidljivim eksudatom (ukoliko je visoka vlažnost za toplog vremena) (Slika 59A). Mladice pocrne a vrh im se savije poput drške kišobrana (sličan simptom daje i ubod osice Janus compressus ali se tada mogu uočiti rupice od uboda i ličinke) (Slika 57). Bakterija prezimi u rubovima rak-rana a širi se vjetrom, kišom i kukcima (naročito u cvatnji; pčele, ose, muhe). Šire je i ptice (čvorci). Karantenska je bolest. Latentna zaraza je opasna. U pupovima je i ne vidi se.
Slika 58: E. amylovora- infekcija na mladom
Slika 57: E. amylovora- infekcija cvata i
izboju
mladih plodova
49
A
B
C
D
Slika 59: E. amylovora; A) simptomi na plodu, B) podloga inficirana bakterijama koje
se kreću descedentno, C) zaraženo stablo kruške, D) eksudat
Slika 60: bakterijska palež u voćnjaku jabuke i kruške
50
Prognoza bakterijske paleži u voćnjaku Kvaliteta prognoze ovisi o preciznosti i količini izmjerenih podataka, o klimatskim uvjetima u voćnjaku, preciznosti kod opažanja i bilježenja osoba koje nadgledaju voćnjak te znanju i iskustvu korisnika prognoznog modela. Najbolja prognoza se dobije kada se podaci mjere u voćnjaku za koji se izračunava prognoza, a ne na udaljenoj meteorološkoj postaji. Nepreciznosti prognoza su opravdane i iz razloga što je u voćnjaku prilično teško uočiti prve simptome zaraze, pa je moguće da su simptomi uočeni nešto kasnije nego što su se pojavili. U prognoziranju bakterijske paleži u voćnjaku koristimo dva modela. To su Maryblyt, razvijen u SADu i BIS, razvijen u Velikoj Britaniji. Rezultati provjere prihvatljivosti prognoznih modela omogućili su: točno predviđanje postojanja visokog rizika od nastanka zaraze, vrijeme nastanka zaraze, vrijeme nastanka simptoma bolesti. • • •
Prognozni model Maryblyt smatra se prihvatljivijim u kontinentalnom dijelu RH iako je i BIS izračunavao približno točnu prognozu. Razlog tome je što je Maryblyt reagirao i na najmanje nijanse u količini padalina, istovremeno predviđajući čak pet tipova simptoma i stupnjevito izražavajući visinu rizika zaraze tijekom cvatnje. Prognoza prema Maryblyt-u izračunavana je pomoću pripadajućeg kopjutorskog programa koji kod primjene Maryblyt-a u praksi brže izračunava prognozu.
Ekologija i epidemiologija bakterijske paleži u voćnjaku. Bakterijska palež se u našem podneblju javlja sporadično, jer u pojedinim sezonama klimatski uvjeti nisu povoljni za razvoj ove bolesti. To su sezone kada u periodu cvatnje nema povoljnih uvjeta za nastanak novih zaraza (npr. hladna proljeća, nedostatak padalina i sl.). Patogen u vrijeme koje ne omogućava njegovo brzo umnožavanje u biljnim tkivima perzistira u tkivu bez pojave vidljivih znakova bolesti.
51
Prognozni model Maryblyt Ovaj je model razvijen prvenstveno na jabukama. Koristeći niz parametara on utvrđuje visinu rizika od nastanka zaraze. Kao izlazne podatke Maryblyt precizno definira čak pet različitih tipova simptoma: palež cvata, aktivnost u rakranama i njihovo širenje, palež izbojaka i infekcije kroz ozljede. Nedostatak Maryblyt-a je da se nakon unošenja podatka za otpadanje latica (PF) u rubriku o fenofazama automatski prekida izračunavanje prognoze za palež cvata. Zato ovu fazu ne treba unositi u model sve dok u voćnjaku ne otpadne i zadnja latica kako bi se izbjegle pogrešne prognoze. Ovo je važno kod sekundarne cvatnje u kojoj je zaraza cvata također moguća, a koja je u pojedinim sezonama obilna. Zaraza u sekundarnoj cvatnji je vrlo opasna jer u to vrijeme vladaju povoljne temperature, a let pčela i ostalih kukaca je intenzivan. Ukoliko Maryblyt u cvatnji ne predvidi nastanak zaraze (I) on dalje ne izračunava pojavu simptoma na cvatu, ali izračunava razvoj drugih tipova simptoma.
Slika 61: : Rezultati prognoznog modela Maryblyt za Osijek 1997. godine.(=vrlo
povoljna za E.a.)
Legenda linijskog grafikona koji iscrtava računalni model Maryblyt: crvena linija = srednje dnevne temperature crvena horizontalna linija = 15,6°C, najniža temperatura na kojoj raste bakterijska populacija zelena linija = infektivni potencijal epifitske populacije vodoravna zelena linija = period cvatnje u kom je niska do umjerena vjerojatnost nastanka zaraze (oznake L i M) vodoravna žuta linija = period cvatnje u kom je visoka vjerojatnost zaraze (oznaka H) vodoravna crvena linija = dani u kojima se predviđa infekcija (oznaka I) Ispod "treshold" linije (minimalna temperatura koja bakterijskoj populaciji treba za zarazu; srednja dnevna temper. oko 15,6 C): plava isprekidana linija = pojava simptoma na izbojcima bijele okomite linije = cvatnja žute isprekidane linije = razvoj paleži cvata žute linije = aktivnost u rubovima rana i širenje rak-rana
52
Slika 62: : Rezultati prognoznog modela Maryblyt za Osijek 1998. godine
Slika 63: Rezultati prognoznog modela Maryblyt za Osijek 2001. godine
(nepovoljna za E.a.).
53
Prognozni model BIS BIS je prvenstveno sustav za određivanje trenutka nastanka zaraze cvjetova na temelju praćenja temperature i vlaženja (Van der Zwet i Lightner 1990). Dizajniran je i provjeren na jabukama i kruškama. BIS daje samo informacije o simptomima na cvatu i o simptomima na izbojcima i plodovima uzrokovanih zarazama kroz ozljede nastale u olujama. On ne prati znakove bolesti nastale širenjem simptoma na kori. U modelu BIS je pojava paleži izbojaka očekivana samo iza oluja s vjetrom brzine veće od 54 km/h i s oborinama koje ranjavaju biljku. To znači da je za prognoziranje paleži izbojaka modelom BIS neophodno imati vrlo detaljne podatke o nevremenima. Idealno bi bilo imati bilješke o svim jakim vjetrovima, grmljavinama i datume kada su uočena oštećenja plodova i izbojaka uzrokovana nevremenom. BOS, a nakon njega i BIS, je nastao na osnovi proučavanja laboratorijskih infekcija, u kontroliranim uvjetima (Billing 1974). To je razlog zašto postoje odstupanja u prognoziranju ovim modelom u prirodi. Razlike su najčešće uzrokovane udaljenošću mjernih instrumenata od voćnjaka za koji se izračunava prognoza i osjetljivšću sorte.
Slika 64: Rezultati prognoze bakterijske paleži modelom BIS za Osijek 2001. g. i usporedba s rezultatima Maryblyta.
Osnovni nedostatak korištenja modela BIS je taj što se njime rizik od indirektne infekcije, u kojoj bakterije dospijevaju u cvjetove i izbojke iz aktiviranih žarišta bolesti u biljkama nastalih zarazama u prijašnjim vegetacijskim sezonama, ne može procijeniti. Pojava ovako nastalih znakova bolesti u nekim sezonama može biti jaka, a oni mogu biti važan izvor inokuluma.
54
Napomene: Ne moraju se uvijek ostvariti zaraze u svim prognoziranim periodima visokog rizika, pa se ne moraju pojaviti niti simptomi u najranijim predviđenim rokovima. Važno je da modeli prognoze upozore o postojanju rizika zaraze dovoljno rano kako bi se stiglo reagirati primjenom kemijske zaštite, te da pravilno predvide pojavu simptoma. U Maryblytu se može unosom predviđenih temperatura i mogućih količina oborina prognozirati stanje u voćnjaku za maksimalno 4 dana unaprijed. Sredstva za zaštitu bilja (npr. aluminij fosetil - Aliette) primijenit će se u terminima u kojima je predviđen visok rizik od zaraze. Ti termini ovise i o načinu djelovanja pojedinog sredstva za zaštitu bilja. Rezultati provedenih analiza prikazani su grafički (Maryblyt - slike) i tabelarno (BIS - tablice) prema preporukama autora ovih modela. Prognoze obaju modela u našim uvjetima su prihvatljive jer su oba približno točno odredila termine mogućih zaraza i pojave simptoma. Ipak treba imati u vidu neka ograničenja prognoze bakterijske paleži ovim modelima.
55
Dodatak Izvod iz liste karantenskih štetočinja - virusi i bakterije NN 33/01 MINISTARSTVO POLJOPRIVREDE I ŠUMARSTVA 585 Na temelju članka 4. stavka 5. Zakona o zaštiti bilja (»Narodne novine«, br. 10/94 i19/94), ministar poljoprivrede i šumarstva donosi LISTE KARANTENSKIH ŠTETOČINJA BILJA L I S T A A1 KARANTENSKE ŠTETOČINJE BILJA KOJE NISU UTVRĐENE NA TERITORIJU REPUBLIKE HRVATSKE I. VIRUSI 1. Apple mosaic ilarvirus (in Rubus) 2. Barley stripe mosaic hordeivirus 3. Bean golden mosaic begomovirus 4. Beet leaf curl ?rhabdovirus 5. Black raspberry latent ilarvirus 6. Blueberry leaf mottle nepovirus 7. Cherry leaf roll nepovirus (in Rubus) 8. Cherry little cherry disease 9. Cherry necrotic rusty mottle disease 10. Cherry rasp leaf nepovirus 11. Chrysanthemum stunt viroid 12. Citrus blight disease 13. Citrus leprosis ?rhabdovirus 14. Citrus mosaic badnavirus 15. Citrus tatter leaf capillovirus 16. Coconut cadang-cadang viroid 17. Impatiens necrotic spot tospovirus 18. Lettuce infectious yellows ?closterovirus 19. Peach American mosaic ?closterovirus 20. Peach rosette mosaic nepovirus 21. Plum American line pattern ilarvirus 22. Potato spindle tuber viroid 23. Virusi krumpira (izvaneuropski): a) Potato Andean latent tymovirus b) Potato Andean mottle comovirus c) Potato black ringspot nepovirus d) Potato T trichovirus e) Potato yellow dwarf nucleorhabdovirus
56
f) Potato yellow vein ?crinivirus g) Potato yellowing alfamovirus 24. Raspberry leaf curl ?luteovirus 25. Raspberry ringspot nepovirus 26. Satsuma dwarf ?nepovirus 27. Squash leaf curl begomovirus 28. Strawberry crinkle rhabdovirus 29. Strawberry latent C ?rhabdovirus 30. Strawberry mild yellow edge disease 31. Strawberry veinbanding caulimovirus 32. Tobacco ringspot nepovirus 33. Tomato black ring nepovirus 34. Tomato mottle begomovirus (i ostali američki geminivirusi paprike i rajčice) 35. Tomato yellow leaf curl begomovirus 36. Watermelon silver mottle tospovirus II. PROKARIOTI 1. Apricot chlorotic leafroll phytoplasma 2. Burkholderia caryophylli (Burkholder) Yabuuchi et al. (= Pseudomonas caryophylli)
3. Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. insidiosus (McCulloch) Davis et al. (=Corynebacterium insidiosum) 4. Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann & Kotthoff) Davis et al. (=Corynebacterium michiganense)
5. Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Hedges) Collins & Jones (=Corynebacterium flaccumfaciens) 6. Elm phloem necrosis phytoplasma i vektor Scaphoideus luteolus van Duzee /Cicadellidae/ 7. Erwinia chrysanthemi Burkholder et al. 8. Grapevine flavescence dorée phytoplasma 9. Liberobacter africanum i Liberobacter asiaticum 10. Palm lethal yellowing phytoplasma 11. Pantoea stewartii (Smith) Mergaert et al . (=Erwinia stewartii ) 12. Peach rosette phytoplasma 13. Peach X-disease phytoplasma 14. Peach yellows phytoplasma 15. Potato purple-top wilt phytoplasma 16. Pseudomonas syringae Van Hall pv. persicae (Prunier et al.) Young et al.
57
L I S T A A2 KARANTENSKE ŠTETOČINJE BILJA KOJE SU UTVRĐENE NA OGRANIČENOM PODRUČJU REPUBLIKE HRVATSKE I. VIRUSI 1. Beet necrotic yellow vein benyvirus (Rhizomania) 2. Citrus tristeza closterovirus 3. Plum pox potyvirus 4. Tomato ringspot nepovirus 5. Tomato spotted wilt tospovirus II. PROKARIOTI 1. Apple proliferation phytoplasma 2. Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. michiganensis (Smith) Davis et al. (=Corynebacterium michiganense)
3. Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. 4. Pear decline phytoplasma 5. Potato stolbur phytoplasma 6. Pseudomonas syringae Van Hall pv. pisi (Sackett) Young et
58
