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2.1 2. 1
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2.2 2. 2
EL PERIODO DE DE LO LOS PR PRIMEROS MI MICROSCOPISTAS
2.3 2. 3
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2.4
EL DEBATE SOBRE LOS FERMENTOS
2.5
LOS AVANCES TÉCNICOS
2. 2.
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2.! 2. !
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AUGE DE LA MICROBIOLOGÍA GENERAL
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DESARROLLO DE LA INMUNOLOGÍA
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2.11 2.1 RELAC RE LACIO IONE NES S ENT ENTRE RE LA MI MICR CROB OBIO IOLO LOGÍ GÍA A Y OT OTRA RAS S CIE CIENC NCIA IAS S BIOLÓGICAS 3
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3.1 3. 1
OB'ETO MATERIAL( LOS MICROORGANISMOS
3.1.1
MICROORGANISMOS CE C ELULARES
3.1.2
VIRUS Y PARTICULAS SUBVIRASICAS
3.2
OB'ETO FORMAL
4
IMPO IM POR RTAN ANCI CIA A DE DE LA MI MICR CROB OBIO IOLO LOGÍ GÍA A
5.
UBICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL MUNDO VIVO
BIBLIOGRAFÍA
SITIOS )EBS RECOMENDADOS
1 INTRODUCCIÓN AL CONCEPTO Y CONTENIDO DE LA MICROBIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA La Microbiología se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia que trata de los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano. Esto hace que el objeto de esta disciplina venga determinado por la metodología apropiada para poner en evidencia, y poder estudiar, a los microorganismos. Precisamente, el origen tardío de la Microbiología con relacin a otras ciencias biolgicas, y el reconocimiento de las m!ltiples actividades desplegadas por los microorganismos, hay que atribuirlos a la carencia, durante mucho tiempo, de los instrumentos y t"cnicas pertinentes. #on la invencin del microscopio en el siglo $%&& comien'a el lento despegue de una nueva rama del conocimiento, ine(istente hasta entonces. )urante los siguientes *+ años su progreso se limit casi a una mera descripcin de tipos morfolgicos microbianos, y a los primeros intentos ta(onmicos, que buscaron su encuadramiento en el marco de los -sistemas naturales de los /einos 0nimal y %egetal. El asentamiento de la Microbiología como ciencia est1 estrechamente ligado a una serie de controversias seculares 2con sus numerosas filtraciones de la filosofía e incluso de la religin de la "poca3, que se prolongaron hasta finales del siglo $&$. La resolucin de estas pol"micas dependi del desarrollo de una serie de estrategias e(perimentales fiables 2esterili'acin, cultivos puros, perfeccionamiento de las t"cnicas microscpicas, etc.3, que a su ve' dieron nacimiento a un cuerpo coherente de conocimientos que constitituy el n!cleo aglutinador de la ciencia microbiolgica. El reconocimiento del origen microbiano de las fermentaciones, el definitivo abandono de la idea de la generacin espont1nea, y el triunfo de la teoría germinal de la enfermedad, representan las conquistas definitivas que dan carta de naturale'a a la joven Microbiología en el cambio de siglo. 4ras la Edad de 5ro de la 6acteriología, inaugurada por las grandes figuras de Pasteur y 7och, la Microbiología qued durante cierto tiempo como una disciplina descriptiva y aplicada, estrechamente imbricada con la Medicina, y con un desarrollo paralelo al de la 8uímica, que le aportaría varios avances metodolgicos fundamentales. 9in embargo, una corriente, en principio minoritaria, dedicada a los estudios b1sicos centrados con ciertas bacterias del suelo poseedoras de capacidades metablicas especiales, incluyendo el descubrimiento de las que afectan a la nutricin de las plantas, logr hacer ver la ubicuidad ecolgica y la e(trema diversidad fisiolgica de los microorganismos. )e esta forma, se establecía una cabe'a de puente entre la Microbiología y otras ciencias biolgicas, que lleg a su momento decisivo cuando se comprob la unidad química de todo el mundo vivo, y se demostr, con material y t"cnicas microbiolgicas que la mol"cula de la herencia era el 0):. #on ello se asiste a un íntimo y f"rtil intercambio entre la
Microbiología, la ;en"tica y la 6ioquímica, que se plasma en el nacimiento de la 6iología Molecular, base del espectacular auge de la 6iología desde mediados del siglo $$. Por otro lado, el -programa inicial de la Microbiología 2b!squeda de agentes infectivos, desentrañamiento y aprovechamiento de los mecanismos de defensa del hospedador3 condujeron a la creacin de ciencias subsidiarias 2%irología, &nmunología3 que finalmente adquirieron su mayoría de edad y una acentuada autonomía. Por !ltimo, la vertiente aplicada que estuvo en la base de la creacin de la Microbiología, mantuvo su vigencia, enriquecida por continuos aportes de la investigacin b1sica, y hoy muestra una impresionante -hoja de servicios y una no menos prometedora perspectiva de e(pansin a m!ltiples campos de la actividad humana, h umana, desde el control de enfermedades infecciosas 2higiene, vacunacin, quimioterapia, antibioterapia3 hasta el aprovechamiento econmico racional de los m!ltiples procesos en los que se hallan implicados los microorganismos 2biotecnologías3. 0sí pues, la sencilla definicin con la que se abri este apartado, escondía todo un c!mulo de contenidos y objetos de indagacin, todos emanados de una peculiar manera de apro(imarse a la porcin de realidad que la Microbiología tiene encomendada. En las pr(imas p1ginas ampliaremos y concretaremos el concepto al que hemos hecho r1pida referencia. /eali'aremos un recorrido por el desarrollo de la Microbiología a lo largo de su historia, que nos permitir1 una visin concreta de algunos de sus característicos modos de abordar su objeto de estudio< finalmente, estaremos en disposicin de definir este !ltimo, desglosado como objeto material y formal.
2 DESARROLLO HISTÓRICO DE LA MICROBIOLOGÍA. La Microbiología, considerada como una ciencia especiali'ada, no aparece hasta finales del siglo $&$, como consecuencia de la confluencia de una serie de progresos metodolgicos que se habían empe'ado a incubar lentamente en los siglos anteriores, y que obligaron a una revisin de ideas y prejuicios seculares sobre la din1mica del mundo vivo. 9iguiendo el ya cl1sico esquema de #ollard 2l=>?3, podemos distinguir cuatro etapas o periodos en el desarrollo de la Microbiología@ Primer periodo, eminentemente especulativo, que se e(tiende desde la antigAedad hasta llegar a los primeros microscopistas. 9egundo periodo, de lenta acumulacin de observaciones 2desde l?>+ apro(imadamente hasta la mitad del siglo $&$3, que arranca con el descubrimiento de los microorganismos por LeeuBenhoeC 2l?>+3. 4ercer periodo, de cultivo de microorganismos, que llega hasta finales del siglo $&$, donde las figuras de Pasteur y 7och encabe'an el logro de cristali'ar a la Microbiología como ciencia e(perimental bien asentada. #uarto periodo 2desde principios del siglo $$ hasta nuestros días3, en el que los
microorganismos se estudian en toda su complejidad fisiolgica, bioquímica, gen"tica, ecolgica, etc., y que supone un e(traordinario crecimiento de la Microbiología, el surgimiento de disciplinas microbiolgicas especiali'adas 2%irología, &nmunología, etc3, y la estrecha imbricacin de las ciencias microbiolgicas en el marco general de las #iencias 6iolgicas. 0 continuacin se reali'a un breve recorrido histrico de la disciplina microbiolgica, desglosando los períodos D y F en varios apartados tem1ticos.
2.1 PERIODO PREVIO AL DESCUBRIMIENTO DEL MICROSCOPIO 9i bien el descubrimiento efectivo de seres vivos no visibles a simple vista debi aguardar hasta el !ltimo tercio del siglo $%&&, sus actividades son conocidas por la humanidad desde muy antiguo, tanto las beneficiosas, representadas por las fermentaciones implicadas en la produccin de bebidas alcohlicas, pan y derivados l1cteos, como las perjudiciales, en forma de enfermedades infecciosas. )iversas fuentes escritas de la antigAedad griega y romana hablan de g"rmenes invisibles que transmiten enfermedades contagiosas. Lucrecio 2=?G++ a.#.3, en su - De rerum natura hace varias alusiones a -semillas de enfermedad. En el /enacimiento europeo, ;irolamo Hrascatorius, en su libro - De contagione et contagionis” 2*+F?3 dice que las enfermedades contagiosas se deben a -g"rmenes vivos que pasan de diversas maneras de un individuo a otro. Estos inicios de e(plicacin que renunciaban a invocar causas sobrenaturales fueron probablemente catali'ados por la introduccin en Europa de la sífilis, una enfermedad en la que estaba clara la necesidad de contacto para su contagio. Pero la -cosa que se transmite en la enfermedad sigui siendo objeto de conjeturas durante mucho tiempo.
2.2 EL PERIODO DE LOS PRIMEROS MICROSCOPISTAS. Ia en el siglo $&%, con la invencin de las primeras lentes para corregir la visin, surgi una cierta curiosidad sobre su capacidad de aumentar el tamaño aparente de los objetos. En el siglo $%& surgieron algunas ideas sobre aspectos de la física ptica de las lentes de aumento, pero no encontraron una aplicacin inmediata. 9e dice que ;alileo hi'o algunas observaciones -microscpicas invirtiendo su telescopio a partir de lentes montadas en un tubo, pero en cualquier caso est1 claro que no tuvieron ninguna repercusin. La primera referencia segura sobre el microscopio 2*?J*3 se debe a #onstantijn Kuygens, quien relata que el ingl"s #ornelis )rebbel tenía en su taller un instrumento magnificador, que recibi el nombre de microscopium en l?J+, en la 0ccademia dei Lincei, de /oma.
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El descubrimiento de los microorganismos fue obra de un comerciante holand"s de tejidos, 0ntonie van LeeuBenhoeC 2*?DJG*>JD3, quien en su pasin por pulir y montar lentes casi esf"ricas sobre placas de oro, plata o cobre, casi lleg a descuidar sus negocios. Habric unos cuatrocientos microscopios simples, con los que lleg a obtener aumentos de casi D di1metros. En *?>+ descubri que en una gota de agua de estanque pululaba una asombrosa variedad de pequeñas criaturas a las que denomin -anim1lculos. En *?D descubre las bacterias, por lo que se considera el -padre de la Microbiología. )urante varias d"cadas LeeuBenhoeC fue comunicando sus descubrimientos a la /oyal 9ociety de Londres a trav"s de una serie de cartas que se difundieron, en traduccin inglesa, en las -Philosophical 4ransactions. 9us magníficas dotes de observador le llevaron asimismo a describir proto'oos 2como Giardia, que encontr en sus propias heces3, la estructura estriada del m!sculo, la circulacin capilar, a descubrir los espermato'oides y los glbulos rojos 2por lo que tambi"n se le considera el fundador de la Kistología animal3, así como a detallar diversos aspectos estructurales de las semillas y embriones de plantas. LeeuBenhoeC se percat de la abundancia y ubicuidad de sus anim1lculos, observ1ndolos en vinagre, placa dental, etc.
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M-6,7,8-, ,987+, ; H,,
0unque los descubrimientos de LeeuBenhoeC despertaron inter"s al ser comunicados, pocos intentaron o pudieron reproducirlos seriamente. 0dem1s, la fabricacin
de lentes sencillas de gran aumento era difícil y el manejo de los microscopios simples, bastante engorroso. 9imult1neamente el ingl"s /obert KooCe 2*?D+G*>D3 usando microscopios compuestos, describi los hongos filamentosos 2*??>3, y descubri la estructura celular de las plantas 2 Micrographia, *??+3, acuñando el t"rmino c"lula. Pero el trabajo con microscopios compuestos aplicados al estudio de los -anim1lculos languideci durante casi J años, debido a sus imperfecciones pticas, hasta que hacia *D se desarrollaron las lentes acrom1ticas.
2.3 EL DEBATE SOBRE LA GENERACIÓN ESPONTÁNEA. La autoridad intelectual de 0ristteles por un lado, y la autoridad moral representada por la 6iblia, por otro, junto con las opiniones de escritores cl1sicos como ;aleno, Plinio y Lucrecio, a los que se citaba como referencias incontrovertibles en la literatura m"dica en la Edad Media y /enacimiento, dieron carta de naturale'a a la idea de que algunos seres vivos podían originarse a partir de materia inanimada, o bien a partir del aire o de materiales en putrefaccin. Esta doctrina de la - generatio spontanea” o abiog"nesis, fue puesta en entredicho por los e(perimentos de Hrancesco /edi 2*?J*G*?=>3, quien había acuñado la e(presin -Omne vivum ex ovo” 2*??3, tras comprobar que los insectos y nematodos procedían de huevos puestos por animales adultos de su misma especie. )emostr que si un tro'o de carne era cubierto con gasa de forma que las moscas no podían depositar allí sus huevos, no aparecían -gusanos, que "l correctamente identific como fases larvarias del insecto. Los descubrimientos de /edi tuvieron el efecto de desacreditar la teoría de la generacin espont1nea para los animales y plantas, pero la reavivaron respecto de los reci"n descubiertos -anim1lculos, de modo que aunque se acept la continuidad de la vida en cuanto a sus formas superiores, no todos estaban dispuestos a admitir el m1s amplio -Omne vivum ex vivo” aplicado a los microorganismos. Kubo que esperar un siglo m1s hasta que una serie de naturalistas recomen'aran el ataque a la teoría preformacionista. La''aro 9pallan'ani 2*>J=G*>==3 sostuvo una disputa con N.4. :eedham 2*>*DG*>*3 en la que el primero demostr que los -infusorios no aparecían en muestras de maceraciones animales o vegetales sometidas durante tiempo suficiente a ebullicin en frascos herm"ticamente cerrados, pero volvían a aparecer si se practicaban agujeros en el recipiente. 9in embargo los preformacionistas no se daban por vencidos< el mismo :eedham, recogiendo una idea ya e(presada por Kuygens, amigo de LeeuBenhoeC, replic Gcon argumentos vitalistas muy propios de la "pocaG que el calor había destruido la -fuer'a vegetativa de las infusiones y había cambiado la -cualidad del aire dentro de los frascos. )urante el primer tercio del siglo $&$ la doctrina de la arqueg"nesis o generacin espont1nea recibi un !ltimo refuer'o antes de morir, debido por un lado a ra'ones e(tracientíficas 2el auge del concepto de transmutacin producido por la escuela de la filosofía de la naturale'a3, y por otro al descubrimiento del o(ígeno y de su importancia para la vida, de modo que los e(perimentos de 9pallan'ani se interpretaron como que al
calentarse las infusiones, el o(ígeno del aire se destruía, y por lo tanto desaparecía la -fuer'a vegetativa que originaba la aparicin de microorganismos. 4heodor 9chBann 2**G*J3 present en *D? un m"todo seguro para refutar la teoría abiog"nica@ calent maceraciones en frascos a los que se había eliminado previamente el aire, pero no continu trabajando en esta línea. Para complicar m1s las cosas, la publicacin de -Sobre el origen de las especies” por )arBin en *+=, fue utili'ada por algunos preformacionistas para apoyar sus argumentos. El mismo KaecCel, en una fecha tan tardía como *??, se mostraba esc"ptico ante las pruebas aportadas por Pasteur.
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En *?* Pasteur publica otro informe en el que e(plica cmo se pueden capturar los -cuerpos organi'ados del aire con ayuda de un tubo provisto de un tapn de algodn como filtro, y la manera de recuperarlos para su observacin microscpica. )e esta forma quedaba definitivamente aclarado el origen de los microorganismos, y se abría la Edad de 5ro del estudio científico de las formas de vida no observables a simple vista. Los !ltimos esc"pticos quedaron silenciados cuando en *>> Nohn 4yndall 2*JG *=D3 aplic su sistema de esterili'acin por calentamiento discontinuo 2hoy conocida precisamente como tindali'acin3, que evidenci la e(istencia de formas microbianas de
reposo muy resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco m1s tarde por Herdinand #ohn al descubrir las esporas bacterianas.
2.4 EL DEBATE SOBRE LOS FERMENTOS On segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiolgica fue el establecimiento de la relacin que une ciertas transformaciones químicas que se dan en las infusiones con el crecimiento de los g"rmenes en ellas e(istentes. #agniardGLatour en *D?, y 9chBann y 7At'ing en *D> habían sugerido que las levaduras eran las causantes de la fermentacin alcohlica por la que el a'!car pasa a alcohol etílico y di(ido de carbono, pero se encontraron con la crítica adversa de los grandes químicos de la "poca 26er'elius, ohler y Liebig3. Liebig, hacia *F, había reali'ado importantes confirmaciones a la -teoría mineral sobre la nutricin de las plantas, enfrent1ndose a la -teoría del humus sostenida por 4haer, asestando un golpe a las ideas vitalistas heredadas de Leibni'. Puesto que se consideraba a las levaduras como plantas microscpicas, se suponía que los procesos de fermentacin y putrefaccin se debían a fenmenos químicos de descomposicin y muerte encuadrables en el marco de la teoría mineral de la fisiología vegetal. 9u convencimiento de que toda actividad vital se podía e(plicar en t"rminos de química y física retras por alg!n tiempo la adscripcin de estos fenmenos a c"lulas vivas. Hue Pasteur 2que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades pticas de los cristales de tartrato, venía suponiendo que estos compuestos tenían un orígen org1nico3 quien de nuevo intervino en el debate de forma decisiva. En *+> demostr que los agentes de la fermentacin l1ctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema que había surgido entre los destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentacin alcohlica se vio sustituida por una indeseable fermentacin l1ctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios que habría de durar hasta *>?, en los que Pasteur identific distintos microorganismos responsables de diferentes clases de procesos fermentativos. 0sí, en *? adscribe inequívocamente la fermentacin alcohlica a ciertos tipos de levaduras, y en *??, en sus Études sur le vin resume sus halla'gos al respecto, inaugurando la Microbiología 0plicada, una de las primeras derivaciones pr1cticas no empíricas emanadas de la 6iología. 0 finales del siglo $&$ eminentes bilogos como Kansen, en #openhague, y 6eijerinC, en )elft, desarrollaban su actividad en industrias y destilerías. 4rabajando sobre los agentes de la fermentacin butírica, Pasteur descubri la presencia de microorganismos que se desarrollaban en ausencia de o(ígeno, lo cual desmentía la creencia de que todas las formas de vida necesitan aire para crecer. 0cuñ los t"rminos aerobiosis y anaerobiosis para denominar, respectivamente, a la vida en presencia y en ausencia de o(ígeno. 4ras el descubrimiento de la anaerobiosis, el mismo Pasteur comprendi las distintas implicaciones energ"ticas subyacentes a la utili'acin de sustratos org1nicos en presencia y en ausencia de o(ígeno, demostrando que, en el segundo caso el rendimiento 2medido como crecimiento microbiano3 era siempre menor, al no poder reali'arse la degradacin total de las correspondientes sustancias.
Ona profundi'acin en los fenmenos de fermentacin lleg cuando en *=> 6uchner obtuvo, a partir de levaduras, una preparacin en'im1tica 2'imasa3 que era capa' de reali'ar la misma transformacin de -fermentacin que las c"lulas vivas. Este descubrimiento, que evocaba las propuestas de 6er'elius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques químico y biolgico@ las fermentaciones eran procesos químicos catali'ados por en'imas presentes dentro de c"lulas vivas, que podían ser estudiados e(tracelularmente. )e esta forma, la 6ioquímica, nacida como una rama de la química fisiolgica, que se venía especiali'ando en la en'imología, encontr una alian'a fructífera y duradera con la joven Microbiología.
2.5 LOS AVANCES TÉCNICOS La doctrina del pleomorfismo, vigente durante buena parte del siglo $&$, mantenía que los microorganismos adoptaban formas y funciones cambiantes dependiendo de las condiciones ambientales. 0 estas ideas se oponían frontalmente investigadores como 7och, Pasteur y #ohn, que estaban convencidos de la especificidad y constancia morfolgica y fisiolgica de cada tipo de microorganismo 2monomorfismo3. El pleomorfismo había surgido como una e(plicacin a la gran variedad de formas y actividades que aparecían en un simple frasco de infusin, pero ya Pasteur, en sus estudios sobre la fermentacin, se había percatado de que los cultivos que aparecían podían considerarse como una sucesin de distintas poblaciones de microorganismos predominantes, que, a resultas de sus actividades, condicionaban la ulterior composicin de la comunidad microbiana. La solucin definitiva a esta cuestin dependía, de nuevo, de un desarrollo t"cnico, que a su ve' iba a suministrar una de las herramientas características de la nueva ciencia@ los m"todos de cultivo puro. Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el miclogo 6refeld, quien logr aislar esporas de hongos y cultivarlas sobre medios slidos a base de gelatina. Por su menor tamaño, este m"todo se hacía inviable para las bacterias, por lo que se recurri a un m"todo basado en diluciones@ Lister, en *> reali' diluciones secuenciales de cultivos mi(tos, hasta lograr muestras en las que e(istía una sola c"lula. Pero la t"cnica era larga y tediosa y, adem1s, normalmente slo se lograban aislar c"lulas del tipo bacteriano m1s abundante en el cultivo original< sin embargo, el e(perimento sirvi para confirmar la naturale'a -particulada de los agentes de las fermentaciones.
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El desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento fue una consecuencia de las investigaciones llevadas a cabo por 6eijerincC y inogradsCy entre * y los primeros años del siglo $$, sobre bacterias implicadas en procesos biogeoquímicos y poseedoras de características fisiolgicas distintivas 2quimioauttrofas, fijadoras de nitrgeno, etc.3. Estos medios, donde se aplica a pequeña escala el principio de seleccin natural, se diseñan de forma que su composicin química definida favore'ca slo el crecimiento de ciertos tipos fisiolgicos de microorganismos, !nicos capaces de usar ciertos nutrientes del medio. 5tra importante aportacin a este -período de cultivo dentro del desarrollo de la Microbiología surgi del uso de medios diferenciales, en los que se manifiesta alg!n rasgo bioquímico o metablico, lo que contribuye a la identificacin microbiana. Hue Art' quien, en *=J, introdujo el uso de indicadores de pK, incorporados en los medios, lo cual permitía revelar la produccin de acidificaciones por fermentacin en ciertas bacterias.
Mientras tanto, en la ciudad de Nena se había creado una atmsfera de progreso donde confluían grandes naturalistas como KaecCel, 9trassburger o 0bb" interaccionando con una pujante editorial especiali'ada en 6iología y Medicina 2;ustav Hischer3 y con una poderosa industria ptica y química. Estas influencias recíprocas se plasmaron en numerosos proyectos que reflejaban la efervescencia de las ciencias naturales tras la estela de )arBin 2cfr. Nahn et al., *=+3. #oncretamente, la industria ptica de 0bb" y Qeiss, que se mantenía en cone(in con la compañía vidriera 9chott, pudo satisfacer la necesidad de 7och de perfeccionar el microscopio compuesto, introduciendo lentes acrom1ticas y una iluminacin inferior provista de condensador. El mismo 0bb" desarroll en *> el objetivo de inmersin en aceite. Por otro lado, la industria química 609H, que por aquella "poca se encontraba en pleno auge de patentes de nuevos colorantes, sumistr al laboratorio de 7och una serie de derivados de anilina que teñían las bacterias permitiendo su f1cil visuali'acin al microscopio en frotis de tejidos infectados. En *>+ #arl eigert tiñ bacterias con pirocarmín, un colorante que ya venía siendo usado desde hacía unos años en estudios 'oolgicos. En años sucesivos se fueron introduciendo el a'ul de metileno 27och, *>>3, la fuchsina, y el violeta cristal. En *JG*D Qiehl y :eelsen desarrollan su m"todo de 1cidoGalcohol resistencia para teñir Mycobacterium tuberculosis. En *F el patlogo dan"s #hristian ;ram establece una tincin de contraste que permite distinguir dos tipos bacterianos en funcin de sus reaccin diferencial de tincin y que, como se vería mucho m1s tarde, reflejaba la e(istencia de dos grupos de bacterias con rasgos estructurales distintivos. En *= Loeffler logra visuali'ar flagelos bacterianos por medio de su t"cnica de impregnacin arg"ntica. #omo veremos m1s adelante, la misma industria de colorantes alemana previa a la primera guerra mundial fue decisiva tambi"n para los comien'os de la quimioterapia.
I:9-*0-* ;: 9-6,7,8-," <6+, ; :0 ,:0,60-* *+6 , A
O+-/, ; -*967-*" <6+, ; :0 ,:0,60-* *+6 , :0 I*;7+6-0 8+-0 C06: Q-77 Estas innovaciones t"cnicas 2m"todos de cultivo, microscopía y tinciones3 fueron fundamentales 2junto con los sistemas de esterili'acin abordados en el anterior apartado3 para la consolidacin de la Microbiología como ciencia, permitiendo eliminar las grandes dosis de especulacin que hasta entonces habían predominado.
2. EL PAPEL DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS ENFERMEDADES. )urante el siglo $&$ la atencin de muchos naturalistas se había dirigido hacia las diversas formas de animales y plantas que vivían como par1sitos de otros organismos. Este inter"s se redobl tras la publicacin de los libros de )arBin, estudi1ndose las numerosas adaptaciones evolutivas que los distintos par1sitos habían adquirido en su peculiar estilo de vida. 9in embargo, la adjudicacin de propiedades de par1sitos a los microorganismos vino del campo m"dico y veterinario, al revalori'arse las ideas sobre el origen germinal de las enfermedades infecciosas. En *D+ 0gostino 6assi 2*>>DG*+?3 demostr que cierta enfermedad del gusano de seda 2mal di segno3, que había hecho su aparicin en Lombardía, se debía a un hongo 2 Botrytis bassiana3. #uatro años m1s tarde N.L. 9chRnlein descubri la asociacin de un hongo con una enfermedad humana de la piel. En *F Kenle, de la escuela fisiolgica de Nohannes MAller, plante la teoría de que las enfermedades infecciosas est1n causadas por seres vivos invisibles, pero de nuevo la confirmacin de estas ideas tuvo que esperar a que la intervencin de Pasteur demostrara la e(istencia de microorganismos específicos responsables de enfermedades. Kacia mediados del siglo $&$ otra enfermedad infecciosa 2pebrina3 comen' a diseminarse por los criaderos de gusano de seda de toda Europa, alcan'ando finalmente a #hina y Napn. 0 instancias de su maestro Nean 6aptiste )umas, Pasteur acept el reto de viajar a la Proven'a para investigar esta enfermedad que estaba dejando en la ruina a los industriales sederos, a pesar de que nunca hasta entonces se había enfrentado con un problema de patología. Es m1s que probable que Pasteur viera aquí la oportunidad de confirmar si sus estudios previos sobre las fermentaciones podían tener una e(tensin hacia los procesos fisiolgicos del hombre y de los animales. Es sorprendente que, al principio no se mostrara dispuesto a aceptar la idea de que la pebrina fuera una enfermedad ocasionada por un agente e(traño, creyendo durante los dos primeros años que se trataba de alteraciones meramente fisiolgicas. 4ras una serie de tanteos, y en medio de una intensa actividad intelectual que le obligaba a repasar continuamente los e(perimentos y las conclusiones e(traídas, inmerso en el drama personal de la muerte de su padre y de dos de sus hijas en un corto lapso de tiempo, Pasteur llega finalmente, en *?=, a identificar al proto'oo Nosema bombycis como el responsable de la epidemia, y por medio de una serie de medidas de control, "sta comien'a a remitir de modo espectacular. La intervencin de bacterias como agentes específicos en la produccin de enfermedades fue descubierta a raí' de una serie de investigaciones sobre el carbunco o 1ntra(, enfermedad que afecta a ganado y que puede transmitirse al hombre. #. )avaine, entre *?D y *?, encontr que en la sangre de vacas afectadas aparecían grandes cantidades de microorganismos a los que llam bacteridios< adem1s, logr inducir la enfermedad e(perimentalmente en vacas sanas, inocul1ndoles muestras de sangre infectada. En *>J el m"dico alem1n #.N. Eberth consigui aislar los bacilos filtrando sangre de animales carbuncosos. Pero fue /obert 7och 2*FDG*=*3, que había sido alumno de Kenle, quien con su reciente t"cnica de cultivo puro logr, en *>?, el primer aislamiento y
propagacin in vitro del bacilo del 1ntra( 2 Bacillus anthracis3, consiguiendo las primeras microfotografías sobre preparaciones secas, fijadas y teñidas con a'ul de metileno. M1s tarde 2**3, 7och y sus colaboradores confirmaron que las esporas son formas diferenciadas a partir de los bacilos, y m1s resistentes que "stos a una variedad de agentes. Pero m1s fundamental fue su demostracin de que la enfermedad se podía transmitir sucesivamente a ratones sanos inocul1ndoles bacilos en cultivo puro, obtenidos tras varias transferencias en medios líquidos. Este tipo de estrategias para demostrar el origen bacteriano de una enfermedad fue llevado a una ulterior perfeccin en *J, con la publicacin de - Die thiologie der !uber"ulose”, donde se comunica por primera ve' la aplicacin de los criterios que Kenle había postulado en *F. Estos criterios, que hoy van asociados al nombre de 7och, son los siguientes@ *. El microorganismo debe de estar presente en todos los individuos enfermos. J. El microorganismo debe poder aislarse del hospedador y ser crecido en cultivo puro. D. La inoculacin del microorganismo crecido en cultivo puro a animales sanos debe provocar la aparicin de síntomas específicos de la enfermedad en cuestin. F. El microorganismo debe poder ser reaislado del hospedador infectado de forma e(perimental. Hue asimismo 7och quien demostr el principio de especificidad biolgica del agente infeccioso@ cada enfermedad infecciosa específica est1 causada por un tipo de bacteria diferente. Estos trabajos de 7och abren definitivamente el campo de la Microbiología M"dica sobre firmes bases científicas. )urante las dos d"cadas siguientes la Microbiología e(periment una aut"ntica edad de oro, en la que se aislaron y caracteri'aron muchas bacterias patgenas. La 0lemania del /eich, que a la sa'n se había convertido en una potencia política y militar, se decidi a apoyar la continuidad de los trabajos del equipo de 7och, dada su enorme importancia social y econmica, creando un &nstituto de investigacin, siendo 7och su director en el )epartamento de 9alud. )e esta forma, en la Escuela 0lemana se aislaron los agentes productores del clera asi1tico 27och, *D3, de la difteria 2Loeffler, *F3, del t"tanos 2:icolaier, *+ y 7itasato, *=3, de la neumonía 2HraenCel, *?3, de la meningitis 2eichselbaun, *>3, de la peste 2Iersin, *=F3, de la sífilis 29chaudinn y Koffman, *=+3, etc. &gualmente se pudieron desentrañar los ciclos infectivos de agentes de enfermedades tropicales no bacterianas que la potencia colonial se encontr en ultramar@ malaria 29chaudinn, *=*G*=D3, enfermedad del sueño 27och, *=?3, peste vacuna africana 2debida al ingl"s 6ruce, *=+G*=>3, etc. Por otro lado, la Escuela Hrancesa, nucleada en el &nstituto Pasteur, se concentr en los estudios sobre los procesos infectivos, la inmunidad del hospedador, y la obtencin de vacunas, sobre todo a raí' de la vacuna antirr1bica ensayada por Pasteur 2*+3, contribuyendo al nacimiento de la &nmunología 2ver apartado 2. 9 3
2.! DESARROLLO DE LA ASEPSIA" #UIMIOTERAPIA Y ANTIBIOTERAPIA Los avances de las t"cnicas quir!rgicas hacia mediados del siglo $&$, impulsados por la introduccin de la anestesia, trajeron consigo una gran incidencia de complicaciones postGoperatorias derivadas de infecciones. On joven m"dico brit1nico, Noseph Lister 2*J>G *=*J3, que había leído atentamente los trabajos de Pasteur, y que creía que estas infecciones se debían a g"rmenes presentes en el aire, comprob que la aplicacin de compuestos como el fenol o el bicloruro de mercurio en el lavado del instrumental quir!rgico, de las manos y de las heridas, disminuía notablemente la frecuencia de infecciones postGquir!rgicas y puerperales. M1s tarde, Paul Ehrlich 2*+FG*=*=3, que había venido empleando distintas sustancias para teñir c"lulas y microorganismos, y que conocía bien el efecto de tincin selectiva de bacterias por ciertos colorantes que dejaban, en cambio, incoloras a c"lulas animales, concibi la posibilidad de que algunos de los compuestos de síntesis que la industria química estaba produciendo pudieran actuar como -balas m1gicas que fueran t(icas para las bacterias pero inocuas para el hospedador. Ehrlich concibi un programa racional de síntesis de sustancias nuevas seguido de ensayo de "stas en infecciones e(perimentales. 4rabajando en el laboratorio de 7och, prob sistem1ticamente derivados del ato(ilo 2un compuesto que ya 4hompson, en *=+, había mostrado como efica' contra la tripanosomiasis3, y en *== inform de que el compuesto ?? 2salvars1n3 era efectivo contra la sífilis. 0unque el salvars1n presentaba algunos efectos colaterales, fue durante mucho tiempo el !nico agente disponible contra enfermedades producidas por espiroquetas, y sirvi para ilustrar brillantemente la valide' del enfoque de la llamada quimioterapia 2t"rmino acuñado por el mismo Ehrlich3, de modo que encau' toda la investigacin posterior. En *=J> ;erhard )omagC, en cone(in con la poderosa compañía química &.;. Harbenindustrie, inici un ambicioso proyecto de b!squeda de nuevos agentes quimioter1picos, siguiendo el esquema de Ehrlich< en *=DJG*=D+ descubre la accin del rojo de prontosilo frente a neumococos hemolíticos dentro del hospedador, pero señala que esta droga es inactiva sobre bacterias creciendo in vitro. La e(plicacin la sumistra el matrimonio 4r"fouSl, del &nstituto Pasteur, al descubrir que la actividad antibacteriana depende de la conversin por el hospedador en sulfanilamida. El mecanismo de accin de las sulfamidas 2inhibicin competitiva con el 1cido paraGaminoben'oico3 fue dilucidado por el estadounidense )onald ). oods. Las investigaciones de "ste encaminaron a la industria farmac"utica hacia la síntesis de an1logos de metabolitos esenciales, introduciendo un enfoque m1s racional frente a la "poca anterior, m1s empírica. En *>F, el m"dico ingl"s . /oberts había descrito las propiedades antibiticas de ciertos cultivos de hongos 2 #enicillium glaucum3 contra las bacterias, e introdujo en Microbiología el concepto de antagonismo. 5tros investigadores de finales del siglo $&$ reali'aron observaciones similares, pero fue Hleming quien, en *=J=, logr e(presar ideas claras sobre el tema, al atribuir a una sustancia química concreta 2la penicilina3 la accin inhibidora sobre bacterias producida por el hongo #enicillium notatum. Hleming desarroll
un ensayo crudo para determinar la potencia de la sustancia en sus filtrados, pudiendo seguir su produccin a lo largo del tiempo de cultivo, y mostrando que no todas las especies bacterianas eran igualmente sensibles a la penicilina. Las dificultades t"cnicas para su e(traccin, junto al hecho de que el inter"s de la "poca a!n estaba centrado sobre las sulfamidas, impidieron una pronta purificacin de la penicilina, que no lleg hasta los trabajos de #hain y Hlorey 2*=F3, comprob1ndose entonces su gran efectividad contra infecciones bacterianas, sobre todo de ;ramGpositivas, y la ausencia de efectos t(icos para el hospedador. &nmediatamente comen' una b!squeda sistem1tica de microorganismos del suelo que mostraran actividades antibiticas. En *=FF 0. 9chat' y 9. aCsman aCsman descubren la estreptomicina, producida por Streptomyces griseus, griseus, siendo el primer ejemplo de antibitico de amplio espectro. Los die' años que siquieron al t"rmino de la segundad guerra mundial vieron la descripcin de =? antibiticos distintos producidos por +> especies de microorganismos, principalmente pr incipalmente 0ctinomicetos. 0ctinomicetos. En la d"cada de los ? se abri una nueva fase en la era de los antibiticos al obtenerse compuestos semisint"ticos por modificacin química de antibiticos naturales, pali1ndose los problemas de resistencia bacteriana a drogas que habían empe'ado a aparecer, disminuy"ndose en muchos casos los efectos secundarios, y ampli1ndose el espectro de accin. 0parte de la revolucin que supusieron en el campo de la aplicacin clínica, los antibiticos ha permitido notables avances en el desentrañamiento de determinados aspectos de arquitectura y funcin moleculares de las c"lulas susceptibles 2paredes celulares microbianas, ribosomas, síntesis proteica, etc.3.
2.$ AUGE DE LA MICROBIOLOGÍA GENERAL. ;ran parte de los avances en Microbiología descritos hasta ahora se debieron a la necesidad de resolver problemas pr1cticos. Pero hacia finales del siglo $&$ una serie de investigadores Galgunos de ellos procedentes de 1reas m1s cl1sicas de la Kistoria :aturalG desarrollaron importantes estudios b1sicos que fueron revelando una enorme variedad de microorganismos y sus actividades metablicas, así como su papel crucial en ciclos biogeoquímicos, sus relaciones con procesos proces os de nutricin vegetal, etc. El descubrimiento de la quimioautotrofía, obra del gran microbilogo ruso 9ergei inogradsCy 2*+?G*=+D3, oblig a revisar los conceptos previos, procedentes de la Hisiología %egetal, de que el crecimiento autotrfico dependía de la presencia de clorofila. inogradsCy había comen'ado investigando las bacterias del hierro descubiertas por #ohn en *>+, observando que podían crecer en medios minerales, por lo que supuso que obtenían su energía de la o(idacin de sales ferrosas a f"rricas 2*3. En *=, combinando t"cnicas de observacin secuencial de cultivos microscpicos con ensayos microquímicos sobre bacterias del a'ufre 2 Beggiatoa$ Beggiatoa$ !hiothrix3, !hiothrix3, infiri que estos microorganismos o(idaban sulfuro de hidrgeno hasta a'ufre elemental 2acumulando "ste como gr1nulos3, y luego hasta 1cido sulf!rico, obteniendo de este modo su energía. Estas observaciones pueden haber sido el arranque del concepto de litotrofía. Pero el descubrimiento de la
quimioautotrofía lleg cuando al año siguiente inogradsCy y 5meliansCy pasaron a estudiar las bacterias nitrificantes, demostrando de manera clara que la energía obtenida de la o(idacin del amonio o del nitrito era usada para fijar #5J 2*=G*=3. M1s tarde el mismo inogradsCy e(tendi la demostracin a cultivos puros en los que el agente solidificante de los medios era el gel de sílice. La e(plicacin del proceso de o(idacin de los compuestos de a'ufre no lleg hasta los estudios de )angeard 2*=**3 y 7iel 2*=*J3. :uevas capacidades metablicas fueron reveladas al estudiar los procesos respiratorios de las bacterias que o(idan hidrgeno o metano 29Rhngen, *=?3. El químico 6erthelot había señalado 2*+3 que los microorganismos del suelo podían incorporar nitrgeno molecular directamente del de l aire. Hue igualmente inogradsCy inogradsCy el primero en aislar una bacteria capa' de fijar nitrgeno atmosf"rico 2%lostridium 2%lostridium pasteurianum3 pasteurianum3 y en e(plicar el ciclo del nitrgeno en la naturale'a 2*=3, siendo el holand"s Martinus 6eijerincC 2*+*G*=D*3 el descubridor de &'otobacter de &'otobacter como como bacteria aerobia fijadora de vida libre 2*=*3. M1s tarde 6eijerincC demostr por m"todos químicos que, en efecto, &'otobacter efecto, &'otobacter incorpora incorpora nitrgeno de la atmsfera mientras crece 2*=3. La importancia de la fijacin de nitrgeno para la nutricin vegetal lleg con los estudios sobre bacterias formadoras de ndulos nd ulos en las raíces de las leguminosas. Ia Ia los e(perimentos cuantitativos sobre plantas creciendo en recipientes, reali'ados por 6oussingault a mediados del siglo $&$, habían indicado que las leguminosas asimilaban nitrgeno de la atmsfera. En *?? %oronin %oronin descubri las bacterias de los ndulos n dulos radicales de esta familia de plantas. HranC, en *>=, demostr que los ndulos parecían inducirse por las mismas bacterias albergadas en ellos, y ard ard 2*>3 us bacterias procedentes pr ocedentes de ndulos machacados para inocular semillas, logrando la produccin de ndulos en suelo est"ril, y describiendo en un bello trabajo el proceso de infeccin, con su produccin de -hifas 2cordn de infeccin3. 4ras la introduccin del concepto de simbiosis por )e 6ary, en *>, fue 9chindler 2*F3 el primero en describir los ndulos radicales como resultado de una simbiosis entre planta y bacterias. Los trabajos de Kermann Kellriegel 2*D*G*=+3 y de su colaborador Kermann illfahrt 2*+DG*=F3, que trabajaban en la Estacin E(perimental de 6ernburg, comunicados en primer lugar en un congreso en 6erlín, en *?, y publicados en un artículo ejemplar en *, asociaron la fertilidad nitrogenada natural de las leguminosas con la presencia de sus ndulos radicales, señalando que estos ndulos se inducían por microorganismos específicos< de este modo lograron una brillante síntesis de las observaciones microbiolgicas y químicas. El mismo año de * 6eijerincC logr el cultivo puro in vitro de vitro de las bacterias nodulares 2a las que bauti' como Bacillus como Bacillus radicicola3, radicicola3, observando que no reducían nitrgeno en vida libre< m1s tarde 2*=3 aport la prueba definitiva de que las bacterias aisladas eran capaces de nodular específicamente ciertas especies de leguminosas, adquiri"ndose de esta forma la facultad de fijar nitrgeno en su asociacin con la raí' de la planta. &rnicamente el nombre definitivo para las bacterias de (hi'obium3 fue propuesto por HranC, quien durante mucho los ndulos de leguminosas 2 (hi'obium3 tiempo se había negado a reconocer los resultados de Kellriegel y illfahrt, y que había oscilado en sus opiniones, desde suponer que la fijacin de nitrgeno era un rasgo general de las plantas, hasta creer que las estructuras intranodulares observadas a microcopio 2bacteroides3 eran gr1nulos de reserva 2incluidas las que "l mismo observ en plantas no leguminosas de los g"neros &lnus g"neros &lnus y y )leagnus )leagnus,, originadas por una bacteria bauti'ada en su honor G *ran"ia3< *ran"ia3< incluso cuando se convenci de que los simbiontes eran bacterias 2y no hongos o mi(omicetes3, pensaba que "stas slo estimulaban a que las plantas fijaran
nitrgeno en sus hojas< su -conversin 2y a!n así incompleta y con reticencias3 no lleg hasta *=J. El aislamiento de los bacteroides intranodulares 2Pra'moBsCi, *=3, y la relacin entre su formacin y la fijacin de nitrgeno 2:obbe y Kiltner, *=D3 complet esta primera oleada de investigacin sobre este tema que tanta trascendencia presentaba para la 0gronomía. Estos estudios est1n en la base de todos los ulteriores trabajos de Microbiología 0grícola, de modo que esta especiliadad fue incorporada tempranamente a los laboratorios científicos y estaciones e(perimentales. Las obras trascendentales de inogradsCy y 6eijerincC abrieron un nuevo hori'onte para el estudio de la diversidad microbiana. La escuela escu ela de 6eijerincC, en la Oniversidad 4"cnica de )elft, fue continuada por por 0.N. 7luyver y #.6. van :iel, siendo este !ltimo el -padre de la escuela norteamericana desde su establecimiento en #alifornia, ya que form a figuras tan importantes como /.I. /.I. 9tanier, /.E. Kungate o M. )oudoroff. La escuela holandesa fundada por 6eijerincC tuvo asimismo otra fructífera -colonia en la ciudad alemana de 7onstan', donde :. Pfennig continu el trabajo emprendido junto a van :iel en )elft. 4odos estos autores, y sus colaboradores, fueron reali'ando contribuciones esenciales sobre una amplia diversidad de bacterias, descubriendo la variedad de las bacterias fotosint"ticas, los tipos de organismos litotrficos, y profundi'ando en multitud de aspectos estructurales y fisiolgicos de las bacterias reci"n descubiertas. #omo dice 4.). 6rocC en una recensin de 7luyver 2*=?*3 -los hombres de la escuela de )elft de Microbiología ;eneral fueron pioneros en una "poca en la que la mayoría de los investigadores estaban demasiado fascinados por problemas aplicados en medicina, agricultura o industria, como para preocuparse por microorganismos quimiosint"ticos o fotosint"ticos, o por aquellos que muestran fermentaciones inusuales.... Pero, como en tantas otras ocasiones, este enfoque de ciencia b1sica ha sido e(traordinariamente f"rtil, y aparte de la profundi'acin en la unidad y diversidad de la vida ha dado origen a penetrantes percepciones en multitud de problemas planteados, tarde o temprano, a las ciencias c iencias biolgicas.
2.% DESARROLLO DE LA INMUNOLOGÍA La inmunología es, en la actualidad, una ciencia autnoma y madura, pero sus orígenes han estado estrechamente ligados a la Microbiología. 9u objeto consiste en el estudio de las respuestas de defensa que han desarrollado los animales frente a la invasin por microorganismos o partículas e(traños, aunque su inter"s se ha volcado especialmente sobre aquellos mecanismos altamente evolucionados e integrados, dotados de especificidad y de memoria, frente a agentes reconocidos por el cuerpo como noGpropios, así como de su neutrali'acin y degradacin. #omo tantas otras ciencias, la &nmumología presenta un prolongado período preG científico, de observaciones y apro(imaciones meramente empíricas. La resistencia a ulteriores ataques de una enfermedad infecciosa fue ya recogida en escritos de la antigAedad< el historiador griego 4ucídides 2F?FGFF a.#.3 narra que en una epidemia acaecida durante la guerra del Peloponeso, los enfermos eran atendidos solo por aquellos que habían sobrevivido previamente a la enfermedad, en la seguridad de que "stos no volverían a ser contagiados. &gualmente, en la antigua #hina se había observado que las personas que en su niñe' habían h abían padecido la viruela no la adquirían m1s adelante en su
vida. Los mismos chinos, en el siglo $& a. #., fueron los primeros en intentar una aplicacin de estas observaciones que indicaban la induccin de un estado protector por medio de una forma suave de la enfermedad@ la inhalacin de polvo de escaras de viruela provocaba un ataque suave que confería resistencia ante infecciones posteriores. Ona modificacin fue introducida en 5ccidente en el siglo $%&&& por Pylarini y 4imoni, y fue populari'ada en ;ran 6retaña por Lady Mary ortley Montagu, esposa del embajador ingl"s en #onstantinopla, tras una serie inicicial de pruebas sobre -voluntarios 2 sic, en realidad prisioneros3. 9in embargo, este tipo de pr1cticas no llegaron a arraigar ampliamente, ya que no estaban e(entas de riesgos, entre los cuales figuraba la posibilidad de transmisin de otras enfermedades. El primer acercamiento a la inmuni'acin con criterios racionales fue reali'ado por el m"dico ingl"s EdBard Nenner 2*>F=G*JD3, tras su constatacin de que los vaqueros que habían adquirido la viruela vacunal 2una forma benigna de enfermedad que slo producía p!stulas en las manos3 no eran atacados por la grave y deformante viruela humana. En mayo de *>=? inocul a un niño fluido procedente de las p!stulas vacunales de 9arah :elmes< semanas despu"s el niño fue inyectado con pus de una p!stula de un enfermo de viruela, comprobando que no quedaba afectado por la enfermedad. Nenner public sus resultados en *>= 2- &n en+uiry into the causes and e,,ects o, the variolae vaccinae...”3, pronosticando que la aplicacin de su m"todo podría llegar a erradicar la viruela. Nenner fue el primero en recalcar la importancia de reali'ar estudios clínicos de seguimiento de los pacientes inmuni'ados, consciente de la necesidad de contar con controles fiables. La falta de conocimiento, en aquella "poca, de las bases microbiolgicas de las enfermedades infecciosas retras en casi un siglo la continuacin de los estudios de Nenner, aunque ciertos autores, como 4urenne, en su libro - -a syphili'ation” 2*>3 lograron articular propuestas tericas de cierto inter"s. El primer abordaje plenamente científico de problemas inmunolgicos se debi, de nuevo, a Pasteur. Estudiando la bacteria responsable del clera aviar 2m1s tarde conocida como #asteurella aviseptica3, observ 2*3 que la inoculacin en gallinas de cultivos viejos, poco virulentos, las protegía de contraer la enfermedad cuando posteriormente eran inyectadas con cultivos normales virulentos. )e esta forma se obtuvo la primera vacuna a base de microorganismos atenuados. Hue precisamente Pasteur quien dio carta de naturale'a al t"rmino vacuna, en honor del trabajo pionero de Nenner. En los años siguientes Pasteur abord la inmuni'acin artificial para otras enfermedades< concretamente, estableci de forma clara que cultivos de Bacillus anthracis atenuados por incubacin a F+# conferían inmunidad a ovejas e(puestas a contagio por carbunco. Ona famosa demostracin p!blica de la bondad del m"todo de Pasteur tuvo lugar en Pouilly le Hort, el dos de junio de **, cuando ante un gentío e(pectante se pudo comprobar la muerte del grupo control de ovejas y vacas no inoculadas, frente a la supervivencia de los animales vacunados. 0ños despu"s, abordaría la inmuni'acin contra la rabia, enfermedad de la que se desconocía el agente causal. Pasteur observ que "ste perdía virulencia cuando se mantenían al aire durante cierto tiempo e(tractos medulares de animales infectados, por lo que dichos e(tractos se podían emplear efica'mente como vacunas. /eali' la primera vacunacin antirr1bica en humanos el ? de julio de *+, sobre el niño Noseph Meister, que había sido mordido gravemente por un perro rabioso. 0 este caso siguieron otros muchos, lo
que vali a Pasteur reconocimiento universal y supuso el apoyo definitivo a su m"todo de inmuni'acin, que abría perspectivas prometedoras de profila(is ante muchas enfermedades. Estos logros determinaron, en buena medida, la creacin del &nstituto Pasteur, que muy pronto reuni a un selecto grupo de científicos, que enfocarían sus esfuer'os en diversos aspectos de las inmuni'aciones y de sus bases biolgicas. 0 su ve', los norteamericanos 9almon y 9mith 2*?3 perfeccionaron los m"todos serolgicos de Pasteur, lo que les permiti producir y conservar m1s f1cilmente sueros tipificados contra la peste porcina.
caricatura deMetchniCov 0 finales del siglo $&$ e(istían dos teorías opuestas sobre los fundamentos biolgicos de las respuestas inmunes. Por un lado, el 'ologo ruso &lya &lich MechniCov 2*F+G*=*?3, que había reali'ado observaciones sobre la fagocitosis en estrellas de mar y pulgas de agua, estableci, a partir de *D, su -4eoría de los fagocitos, tras estudiar fenmenos de englobamiento de partículas e(trañas por los leucocitos de conejo y de humanos. &nform que e(istían fenmenos de eliminacin de agentes patgenos por medio de -c"lulas devoradoras 2fagocitos3 que actuaban en animales vacunados contra el carbunco, y e(plic la inmuni'acin como una -habituacin del hu"sped a la fagocitosis. M1s tarde, ya integrado en el &nstituto Pasteur, propugn la idea de que los fagocitos segregan en'imas específicos, an1logos a los -fermentos digestivos 2*=3. Esta teoría de los fagocitos constituy el n!cleo de la teoría de la inmunidad celular, de modo que la fagocitosis se consideraba como la base principal del sistema de defensa inmune del organismo. Por otro lado, la escuela alemana de 7och hacía hincapi" en la importancia de los mecanisnos humorales. Emil von 6ehring 2*+FG*=*>3 y 9hibasaburo 7itasato 2*+?G *=D*3, a resultas de sus trabajos sobre las to(inas del t"tanos y de la difteria, observaron que el cuerpo produce -antito(inas 2m1s tarde conocidas como anticuerpos3 que tendían a neutrali'ar las to(inas de forma específica, y evidenciaron que el suero que contiene antito(inas es capa' de proteger a animales e(puestos a una dosis letal de la to(ina correspondiente 2*=3. La intervencin de Ehrlich permiti obtener sueros de caballo con niveles de anticuerpos suficientemente altos como para conferir una proteccin efica', e igualmente se pudo disponer de un ensayo para cuantificar la -antito(ina presente en suero. Ehrlich dirigi desde *=? el &nstituto Estatal para la &nvestigacin y #omprobacin de 9ueros, en 9teglit', cerca de 6erlín, y, a partir de *==, estuvo al frente del mejor equipado &nstituto de 4erapia E(perimental, en HranCfurt. )urante este !ltimo periodo de su vida, Ehrlich produce una impresionante obra científica, en la que va ahondando en la comprensin de la inmunidad humoral. En *= da a lu' su -4eoría de las cadenas laterales, en la que formula una e(plicacin de la formacin y especificidad de los
anticuerpos, estableciendo una base química para la interaccin de "stos con los antígenos. Por su lado, /. 7raus visuali'a por primera ve', en *=>, una reaccin antígenoGanticuerpo, al observar el enturbiamento de un filtrado bacteriano al me'clarlo con un suero inmune específico 2antisuero3. En *= Nules 6ordet 2*>G*=?*3 descubre otro componente s"rico relacionado con la respuesta inmunitaria, al que bauti'a como -ale(ina, caracteri'ado, frente al anticuerpo, por su termolabilidad e inespecificidad. 2M1s tarde se impondría el nombre de complemento, propuesto por Ehrlich3. El mismo 6ordet desarroll, en *=*, el primer sistema diagnstico para la deteccin de anticuerpos, basado en la fijacin del complemento, y que inici una larga andadura, que llega a nuestros días. La conciliacin de las dos teorías se debi a 0lmorth rigth y 9teBart /. )ouglas, quienes en *=F descubren las opsoninas, anticuerpos presentes en los sueros de animales inmuni'ados y que, tras unirse a la superficie bacteriana, incrementan la capacidad fagocítica de los leucocitos. El 1rea de la inmunopatología inicia su andadura con la descripcin del fenmeno de anafila(ia producido por introduccin en un animal de un suero de una especie distinta 2Portier y /ichet, *=J< 0rthus, *=D3, lo que a su ve' abriría la posibilidad de m"todos de serodiagnstico, con aplicaciones m!ltiples en Medicina, Qoología, y otras ciencias biolgicas. En *=+ Pirquet sugiere que la enfermedad del suero 2un fenmemo de hipersensibilidad3 tiene relacin directa con la produccin de anticuerpos contra el suero inyectado, introduciendo el t"rmino de alergia para referirse a la reactividad inmunolgica alterada. La inmunoquímica cobra un gran impulso en las primeras d"cadas del siglo $$ con los trabajos de 7arl Landsteiner 2*?G*=FD3. 9u primera contribucin de importancia había sido la descripcin, mediante reacciones de aglutinacin, del sistema de antígenos naturales 206#3 de los eritrocitos humanos 2*=*G*=J3, completada 2en colaboracin con %on )ungern y Kir'feld3, con las subdivisiones del grupo 0 y el estudio de su transmsin hereditaria. Estos trabajos sirvieron de estímulo para avan'ar en el desentrañamiento de la especificidad química de los antígenos que determinan la formacin de anticuerpos. Landsteiner estudi sistem1ticamente las características de inmunogenicidad y especificidad de reaccin de antígenos con anticuerpos, vali"ndose de la modificacin química de antígenos, denominando haptenos a aquellos grupos químicos que por sí mismos no desencadenan formacin de anticuerpos, pero sí lo hacen tras ser conjugados a proteínas portadoras. La cuestin de las reacciones antígenoGanticuerpo se convirti en otra pol"mica entre escuelas hasta finales de los años J. Mientras Ehrlich y sus seguidores mantenían que estas reacciones tienen una base puramente química, 6ordet y sus discípulos las e(plicaban como fenmenos físicos de reacciones entre coloides. La resolucin del debate debi aguardar hasta finales de los años D, al incorporarse avances t"cnicos como la electroforesis, la cromatografía en papel, la ultracentrifugacin y el microscopio electrnico. Keidelberg y 7endall 2*=D?3 purificaron anticuerpos a partir de sueros por disociacin de precipitados. 4iselius 2*=D=3 demostr que los anticuerpos constituyen la fraccin gammaGglobulínica del suero. %einte años despu"s /./. Porter y ;.M. Edelman establecen la estructura de las inmunoglobulinas. )urante este lapso de tiempo se descubre
que la síntesis de anticuerpos ocurre en las c"lulas plasm1ticas, aunque "stas no son puestas en relacin a!n con los linfocitos< durante muchos años se sigui creyendo que los linfocitos eran c"lulas pasivas, sin funcin inmune. Por aquella "poca se describe, tambi"n, la diversidad de inmunoglobulinas, lleg1ndose al establecimiento de una nomenclatura. Enseguida comien'a la era de los m!ltiples e(perimentos sobre timectomía en ratones neonatos y sobre bursectomía en aves, así como los de reconstitucin de animales irradiados, con timocitos y c"lulas de la medula sea, y que permiten afirmar el papel esencial de los linfocitos, encuadrarlos en tipos funcionales 4 y 6, y relacionarlos con las respuestas inmunes celular y humoral, respectivamente. Ona importante faceta de la inmunología de la primera mitad del siglo $$ fue la obtencin de vacunas. 9e lograron to(oides inmunog"nicos a partir de to(inas bacterianas, en muchos casos por tratamiento con formol@ to(oide tet1nico 2Eisler y LoBenstein, *=*+3 y to(oide dift"rico 2;lenny, *=J*3. En *=JJ se desarrolla la vacuna 6#; contra la tuberculosis, haciendo uso de una cepa atenuada de Mycobacterium tuberculosis, el bacilo de #almetteG;u"rin. La utili'acin de coadyuvantes se inicia en *=*?, por LeMoignic y Piroy. La inmunogen"tica nace cuando 6ernstein describe en *=J* el modelo de transmisin hereditaria de los cuatro grupos sanguíneos principales, bas1ndose en el an1lisis estadístico de sus proporciones relativas, y con el descubrimiento por Landsteiner y LevTne 2*=J>3 de los nuevos sistemas M: y P. Los e(perimentos de transfusiones sanguíneas interespecíficas permitieron distinguir la gran complejidad de los antígenos sanguíneos, e(plicables seg!n unos D alelos m!ltiples. Ona contribucin esencial a las ideas sobre el mecanismo de formacin de los anticuerpos la reali' el australiano Macfarlane 6urnet 2*==G*=+3, al establecer su teoría de la seleccin clonal< "sta argumenta que cada linfocito 6 sinteti'a un !nico tipo de anticuerpo, específico para cada antígeno 2determinante antig"nico3, de modo que la unin del antígeno causa la proliferacin clonal del linfocito 6, con la consecuente síntesis incrementada de anticuerpos específicos. &gualmente, 6urnet lan' una hiptesis sobre el mecanismo subyacente a la autoGtolerancia inmunolgica, que fue confirmada e(perimentalmente por Peter MedaBar. M1s recientemente :iels Nerne ha reali'ado nuevas aportaciones y refinamientos a la teoría de la seleccin clonal, proponiendo un modelo de regulacin inmune conocido como teoría de las redes idiotípicas. Los avances en &nmunología durante los !ltimos años han sido espectaculares, consolidando a "sta como ciencia independiente, con su conjunto propio de paradigmas, ya relativamente escindida de su tronco originario microbiolgico. Entre los hitos recientes hay que citar la t"cnica de produccin de anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas, desarrollada originalmente por #"sar Milstein y ;eorges 7ohler en *=>+, y que presenta una enorme gama de aplicaciones en biomedicina, o el desentrañamiento de los fenmenos de reorgani'acin gen"tica responsables de la e(presin de los genes de inmunoglobulinas, por 9usumu 4onegaBa.
2.1& ORIGEN Y DESARROLLO DE LA VIROLOGÍA
La %irología ha sido la ciencia microbiolgica de origen m1s tardío, habiendo surgido como resultado del halla'go de enfermedades infecciosas en las que la demostracin de implicacin de microorganismos se demostraba esquiva con los medios habituales disponibles a finales del siglo $&$. La euforia que se vivía en los 1mbitos científicos y m"dicos, al socaire de la edad de oro de aislamiento de bacterias patgenas, se plasm en el prejuicio de que la incapacidad de hacer crecer los agentes causantes de ciertas enfermedades se debía a una t"cnica inapropida o mal aplicada. El bot1nico ruso )imitri &BanovsCi había observado 2*=J3 que la enfermedad del mosaico del tabaco podía ser reproducida e(perimentalmente usando el fluido que atravesaba los filtros de porcelana que normalmente retenían a las bacterias, pero siendo incapa' de aislar y crecer el supuesto microorganismo, abandon la investigacin. Pocos años m1s tarde 2*=3, y probablemente sin tener noticias del trabajo de &BanovsCi, 6eijerinC reali' e(perimentos similares con el mismo sistema, y en otro rasgo de su genio, enfrent1ndose a los conceptos de la "poca, avan' la idea de que el agente filtrable 2un contagium vivum ,luidum, seg!n su e(presin3, debía de incorporarse al protoplasma vivo del hospedador para lograr su reproduccin. Este tipo de agentes infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron llamados en principio -virus filtrables, quedando m1s tarde su denominacin simplemente como virus. 0quel mismo año de *= Loeffler y Hrosch descubren los virus animales al comprobar que un virus filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En *=* /eed descubre el primer virus humano, el de la fiebre amarilla, y en *== Landsteiner y Pope detectan el de la poliomielitis. 0 comien'os de siglo #opeman desarrolla su t"cnica de multiplicacin de virus animales en embriones de pollo, con la que P. /ous aisla y cultiva el virus del sarcoma aviar 2*=**3. Los virus bacterianos fueron descubiertos en *=*+ por H.. 4Bort, si bien su trabajo no alcan' la elegancia y claridad del desarrollado poco m1s tarde por el canadiense H"li( dUK"relle 2*=*>3< fue "ste quien acuñ el t"rmino bacteri,ago, y supuso correctamente que el fenmeno de lisis por estos agentes debía de estar ampliamente difundido entre las bacterias. 0unque su esperan'a en la aplicacin de los fagos como elementos bactericidas para uso m"dico no pudo satisfacerse, la contribucin de los virus bacterianos al avance de la gen"tica y biología moleculares ha sido decisiva@ de hecho, los primeros estudios cuantitativos sobre replicacin vir1sica se reali'aron sobre fagos de )scherichia coli, lo que suministr modelos aplicables a otros virus, incluidos los de animales. En *=J+ 6ordet y 6al describen por primera ve' el fenmeno de lisogenia, pero las relaciones entre los ciclos lítico y lisog"nico de los fagos no fueron aclaradas hasta los estudios de 0ndr" LBoff 2*=+3. La primera visuali'acin de un virus se debe a las observaciones a microscopio ultravioleta del bacterilogo ingl"s 6arnard 2*=J+3, y en *=D= se reali'a la primera fotografía de un virus a microscopio electrnico. Pero los avances m1s significativos en el estudio de la composicin y estructura de los virus se inician con la purificacin y cristali'acin, por endell M. 9tanley, del virus del mosaico del tabaco G4M%G 2*=D+3, aplicando procedimientos típicos de la cristali'acin de en'imas. &nicialmente 9tanley comprob que el 4M% contenía gran proporcin de proteína, pero poco m1s tarde detecta, adem1s, la presencia de 1cido nucleico. 0 partir de aquí, la %irología entra en una fase de
ciencia cuantitativa, en la que participan numerosos físicos, bioquímicos y genetistas, en un esfuer'o interdisciplinar que da origen a la moderna 6iología Molecular. On importante avance metodolgico para el estudio de los virus animales se debi a Enders, eller y /obbins 2*=F=3, al desarrollar por primera ve' un m"todo para la multiplicacin vir1sica sobre cultivos de tejidos de mamíferos, t"cnica que fue perfeccionada m1s tarde por el equipo de /enato )ulbecco. Los recientes progresos en las numerosas t"cnicas de biología molecular han propiciado una aut"ntica e(plosin de descubrimientos sobre la biología de los virus y de sus c"lulas hospedadoras< baste citar la replicacin del genomio de 0/: de los retrovirus por reversotranscripcin a 0):, los fenmenos de transformacin oncog"nica vir1sica y su aplicacin a los estudios generales del c1ncer, el diseño de vacunas recombinantes por manipulacin in vitro de genomios vir1sicos, la pr(ima aplicacin clínica de la primeras terapias g"nicas en humanos recurriendo a vectores vir1sicos, etc. En el terreno de las necesidades urgentes, la metodología e(istente ha permitido la r1pida identificacin y caracteri'acin del virus de la inmunodeficiencia humana, lo que se est1 traduciendo en una intensa y racional b!squeda de procedimientos para prevenir y eliminar la inesperada epidemia de 9&)0. En años recientes han sido descubiertos dos nuevos tipos de entidades infectivas, subvir1sicas@ 4.5. )iener describi en *=?> la e(istencia de 0/: desnudos infectivos en plantas, a los que llam viroides, y en *=* Prusiner puso de manifiesto que determinadas enfermedades de mamíferos se deben a partículas proteicas aparentemente desprovistas de material gen"tico, a las que bauti' como priones.
2.11 RELACIONES ENTRE LA MICROBIOLOGÍA Y OTRAS CIENCIAS BIOLÓGICAS. El auge de la microbiología desde finales del siglo $&$ se plasm, entre otras cosas, en el aislamiento de gran variedad de cepas silvestres de microorganismos, lo que suministr un enorme volumen de nuevo material biolgico sobre el que trabajar, aplic1ndose una serie de enfoques que eran ya habituales en las ciencias naturales m1s antiguas< así, había que crear un marco ta(onmico 2con sus normas de nomenclatura3 para encuadrar a los organismos reci"n descubiertos, era factible desarrollar trabajos sobre morfología y fisiología comparadas, sobre variabilidad y herencia, evolucin, ecología, etc. )e este modo la joven Microbiología fue objeto, en pocos años, de la utili'acin, a un ritmo acelerado, de los m"todos ta(onmicos y e(perimentales que habían ido surgiendo y madurando desde el siglo $%&&& en los 1mbitos de la -Kistoria :atural cl1sica. 0unque nos referiremos en otro apartado /v0ase cap. 12 a los avances de 4a(onomía Microbiana, vale la pena reseñar aquí los esfuer'os tempranos para lograr un clasificacin bacteriana por parte de #ohn 2*>+3 y Migula 2*=F3, que sustentaban su concepto de especie predominantemente sobre caracteres morfolgicos. Pero hacia *= era evidente la arbitrariedad e insuficiencia de este tipo de clasificaciones, de modo que los intentos posteriores hicieron uso de caracteres bioquímicos 25rma Nensen, *==3, o de una me'cla
de rasgos morfolgicos, bioquímicos, patog"nicos y de tincin 26uchanan, *=*+3. El sistema de ta(onomía bacteriana adquiri un nuevo impulso a partir de la *V edicin del - Bergey3s Manual o, Determinative Bacteriology” 2*=JD3, y de las propuestas de 7luyver y van :iel 2- #rospects ,or a natural system o, classi,ication o, bacteria”, *=D?3. En cuanto a la nomenclatura, no fue hasta *=+ en que cuaj un #digo &nternacional de :omenclatura 6acteriolgica, aunque ya se venía aplicando desde hacía tiempo el procedimiento tipolgico para los microorganismos, con criterios similares a los de la Qoología y la 6ot1nica. El establecimiento de relaciones ta(onmicas precis el recurso a m"todos cada ve' m1s amplios y afinados de an1lisis gen"tico, estructural o fisiolgico. En un apartado anterior ya vimos las cone(iones tempranas entre la 6ioquímica y la Microbiología a propsito del descubrimiento de la base en'im1tica de las fermentaciones, lo cual abri el camino para dilucidar el metabolismo energ"tico microbiano, y para demostrar su similitud química con rutas metablicas de organismos superiores. 5tro paso importante en la percepcin de la unidad bioquímica del mundo vivo deriva del descubrimiento de las vitaminas 2t"rmino acuñado por HunC en *=**3, al establecerse que determinados factores de crecimiento requeridos por algunos microorganismos eran químicamente similares a las vitaminas necesarias en la dieta de los animales, y que este tipo de compuestos representa precursores biosint"ticos de coen'imas del metabolismo celular. 0sí pues, este tipo de investigaciones sent claramente la idea de la unidad química de los seres vivos, independientemente de su encuadre ta(onmico, y encau' una buena parte de los trabajos bioquímicos hacia los microorganismos, dadas sus cualidades de facilidad de manejo y cultivo en laboratorio. En cuanto a las cone(iones de la Microbiología con la ;en"tica, ya 6eijerinC, en *=, tras anali'ar la teoría de la mutacin de )e %ries, había predicho que los microoganismos podrían convertirse en objetos de investigacin m1s adecuados que los sistemas animales o vegetales. Pero las primeras cone(iones entre ambas ciencias arrancan de la necesidad que hubo, a principios del siglo $$, de determinar la se(ualidad de los hongos con fines ta(onmicos. En *=+ Maire demostr la e(istencia de meiosis en la formacin de ascosporas, y #laussen 2*=>3 evidenci fusin de n!cleos en 0scomicetos, mientras que 7niepp, hacia finales de los años D había recogido un gran volumen de informacin sobre procesos se(uales en 6asidiomicetos. El sueco Lindegren 2*=D?3 reali'a las primeras cartografías gen"ticas en cromosomas de Neurospora, durante su estancia en el laboratorio californiano de Morgan< este !ltimo, propugnador de la -teoría de los genes 2*=J?3, confiaba desde hacía años en ampliar sus "(itos, logrados en Drosophila, hacia el estudio de la gen"tica microbiana. En *=F*, otros dos discípulos de Morgan, 6eadle y 4atum, aislan mutantes au(otrficos de Neurospora, con lo que se inicia el estudio de la base bioquímica de la herencia, y convierten a este hongo en una valiosa herramienta de trabajo en esta línea de investigacin. Las estrategias diseñadas por 6eadle y 4atum fueron aplicadas por Luria y )elbrAcC 2*=FD3 a cultivos bacterianos, investigando la aparicin de mutaciones espont1neas resitentes a fagos o estreptomicina. La cone(in de estos e(perimentos con las observaciones previas de ;riffith 2*=J3 sobre la transformacin del neumococo, llev a 0very y colaboradores 2*=FF3 a demostrar que el -principio transformante portador de la
informacin gen"tica es el 0):. En *=F= ErBin #hargaff demuestra bioquímicamente la transmisin gen"tica mediante 0): en )scherichia coli , y en *=+J 0lfred Kershey y Martha #hase, en e(perimentos con componentes marcados de fagos, ponen un elegante colofn a la confirmacin de la funcin del 0):, con lo que se derribaba el antiguo y asentado -paradigma de las proteínas que hasta mediados de siglo intentaba e(plicar la base de la herencia. )e esta forma, la Microbiología e(perimental se sit!a en pleno centro del nacimiento de la ;en"tica molecular, de la mano de los avances paralelos en 6ioquímica 2an1lisis por rayos $ de la estructura del 0): debido a Maurice ilCins y /osalind HranClin, modelo de atson y #ricC de la doble h"lice del 0):, etc.3, dando origen esta confluencia a lo que se ha llamado la -Edad de 5ro de la 6iología Molecular.
3 OB'ETO DE ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGÍA El objeto de estudio de una ciencia se puede desglosar en dos apartados@ objeto material y objeto formal.
3.1 OB'ETO MATERIAL( LOS MICROORGANISMOS La Microbiología es la ciencia que se ocupa del estudio de los microorganismos, es decir, de aquellos organismos demasiado pequeños para poder ser observados a simple vista, y cuya visuali'acin requiere el empleo del microscopio. Esta definicin implica que el objeto material de la Microbiología viene delimitado por el tamaño de los seres que investiga, lo que supone que abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y ta(onmicos@ desde partículas no celulares como los virus, viroides y priones, hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los proto'oos y parte de las algas y de los hongos. )e esta manera la Microbiología se distingue de otras disciplinas organísmicas 2como la Qoología y la 6ot1nica3 que se centran en grupos de seres vivos definidos por conceptos biolgicos homog"neos, ya que su objeto de indagacin se asienta sobre un criterio artificial que obliga a incluir entidades sin m1s relacin en com!n que su pequeño tamaño, y a e(cluir a diversos organismos macroscpicos muy emparentados con otros microscpicos. 0 pesar de esto 2o incluso debido a ello3, la Microbiología permanece como una disciplina perfectamente asentada y diferenciada, que deriva su coherencia interna del tipo de metodologías ajustadas al estudio de los organismos cuyo tamaño se sit!a por debajo del límite de resolucin del ojo humano, aportando un conjunto específico de conceptos que han enriquecido la moderna 6iología. Podemos definir, pues, a los microorganismos como seres de tamaño microscpico dotados de individualidad, con una organi'acin biolgica sencilla, bien sea acelular o celular, y en este !ltimo caso pudiendo presentarse como unicelulares, cenocíticos, coloniales o pluricelulares, pero sin diferenciancin en tejidos u rganos, y que necesitan
para su estudio una metodología propia y adecuada a sus pequeñas dimensiones. 6ajo esta denominacin se engloban tanto microorganismos celulares como las entidades subcelulares.
3.1.1 MICROORGANISMOS CELULARES #omprenden todos los procariotas y los microorganismos eucariticos 2los proto'oos, los mohos mucosos, los hongos y las algas microscpicas3. El encuadre de todos estos grupos heterog"neos ser1 abordado en el pr(imo capítulo.
3.1.2 VIRUS Y PARTICULAS SUBVIRASICAS 5tro tipo de objetos de estudio de la microbiología son las entidades no celulares, que a pesar de no poseer ciertos rasgos atribuibles a lo que se entiende por vida, cuentan con individualidad y entidad biolgica, y caen de lleno en el dominio de esta ciencia. Los virus son entidades no celulares de muy pequeño tamaño 2normalmente inferior al del m1s pequeño procariota3, por lo que debe de recurrirse al microscopio electrnico para su visuali'acin. 9on agentes infectivos de naturale'a obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su incorporacin al protoplasma vivo para que su material gen"tico sea replicado por medio de su asociacin m1s o menos completa con las actividades celulares normales, y que pueden transmitirse de una c"lula a otra. #ada tipo de virus consta de una sola clase de 1cido nucleico 20): o 0/:, nunca ambos3, con capacidad para codificar varias proteínas, algunas de las cuales pueden tener funciones en'im1ticas, mientras que otras son estructurales, disponi"ndose "stas en cada partícula vir1sica 2virin3 alrededor del material gen"tico formando una estructura regular 2c1psida3< en algunos virus e(iste, adem1s, una envuelta e(terna de tipo membranoso, derivada en parte de la c"lula en la que se desarroll el virin 2bicapa lipídica procedente de membranas celulares3 y en parte de origen vir1sico 2proteínas3. En su estado e(tracelular o durmiente, son totalmente inertes, al carecer de la maquinaria de biosíntesis de proteínas, de replicacin de su 1cido nucleico y de obtencin de energía. Esto les obliga a un modo de vida 2 sic3 parasitario intracelular estricto o fase vegetativa, durante la que el virin pierde su integridad, y normalmente queda reducido a su material gen"tico, que al superponer su informacin a la de la c"lula hospedadora, logra ser e(presado y replicado, produci"ndose eventualmente la formacin de nuevos viriones que pueden reiniciar el ciclo. Los viroides son un grupo de nuevas entidades infectivas, subvir1sicas, descubiertas en *=?> por 4.5. )iener en plantas. Est1n constituidos e(clusivamente por una pequeña mol"cula circular de 0/: de una sola hebra, que adopta una peculiar estructura secundaria alargada debido a un e(tenso, pero no total, emparejamiento intracatenario de bases por 'onas de homología interna. #arecen de capacidad codificadora y muestran cierta semejan'a con los intrones autocatalíticos de clase &, por lo que podrían representar secuencias intercaladas que escaparon de sus genes en el transcurso evolutivo. 9e desconocen detalles de su modo de multiplicacin, aunque algunos se locali'an en el
nucleoplasma, e(istiendo pruebas de la implicacin de la 0/: polimerasa && en su replicacin, por un modelo de círculo rodante que genera concat"meros lineares. Esta replicacin parece requerir secuencias conservadas hacia la porcin central del viroide. Los viroides aislados de plantas originan una gran variedad de malformaciones patolgicas. El mecanismo de patogenia no est1 aclarado, pero se sabe que muchos de ellos se asocian con el nucleolo, donde qui'1 podrían interferir< sin embargo, no e(isten indicios de que alteren la e(presin g"nica 2una de las hiptesis sugeridas3< cada mol"cula de viroide contiene uno o dos dominios conservados que modulan la virulencia. En *=? se descubri que el agente de la hepatitis delta humana posee un genomio de 0/: de tipo viroide, aunque requiere para su transmisin 2pero no para su replicacin3 la colaboracin del virus de la hepatitis 6, empaquet1ndose en partículas similares a las de este virus. 0 diferencia de los viroides vegetales, posee capacidad codificadora de algunas proteínas. Los ARNs satélites son pequeñas mol"culas de tamaño similar al de los viroides de plantas 2DDGF bases3, que son empaquetados en c1psidas de determinadas cepas de virus 2con cuyos genomios no muestran homologías3. 9e replican slo en presencia del virus colaborador específico, modificando 2aumentando o disminuyendo3 los efectos patgenos de "ste. Los virusoides constituyen un grupo de 0/:s sat"lites no infectivos, presentes en el interior de la c1psida de ciertos virus, con semejan'as estructurales con los viroides, replic1ndose e(clusivamente junto a su virus colaborador. Los priones son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original, descubiertas por 9tanley Prusiner en *=*, responsables de ciertas enfermedades degenerativas del sistema nervioso central de mamíferos 2por ejemplo, el -scrapie o prurito de ovejas y cabras3, incluyendo los humanos 2Curu, síndrome de ;erstmannG 9traAssler, enfermedad de #reut'feldtGNaCob3. 9e definen como pequeñas partículas proteicas infectivas que resisten la inactivacin por agentes que modifican 1cidos nucleicos, y que contienen como componente mayoritario 2si no !nico3 una isoforma anmala de una proteina celular. 4anto la versin celular normal 2PrP#3 como la patgena 2PrP9c en el caso del -scrapie3 son glicoproteínas codificadas por el mismo gen cromosmico, teniendo la misma secuencia primaria. 9e desconoce si las características distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los respectivos oligosac1ridos que adquieren por procesamiento postGtraduccional. 0 diferencia de los virus, los priones no contienen 1cido nucleico y est1n codificados por un gen celular. 0unque se multiplican, los priones de nueva síntesis poseen mol"culas de PrP que reflejan el gen del hospedador y no necesariamente la secuencia de la mol"cula del PrP que caus la infeccin previa. 9e desconoce su mecanismo de multiplicacin, y para discernir entre las diversas hiptesis propuestas qui'1 haya que dilucidar la funcin del producto normal y su posible conversin a la isoforma patgena infectiva.
/ecientemente se ha comprobado que, al menos algunas de la enfermedades por priones son simult1neamente infectivas y gen"ticas, una situacin inslita en la Patología humana, habi"ndose demostrado una relacin entre un alelo dominante del PrP y la enfermedad de #reut'feldtGNaCob. El gen del prin 2#rn4p3 est1 ligado gen"ticamente a un gen autosmico 2 #rn4i3 que condiciona en parte los largos tiempos de incubacin hasta el desarrollo del síndrome.
3.2 OB'ETO FORMAL 4odos los aspectos y enfoques desde los que se pueden estudiar los microorganismos conforman lo que denominamos objeto formal de la Microbiología@ características estructurales, fisiolgicas, bioquímicas, gen"ticas, ta(onmicas, ecolgicas, etc., que conforman el n!cleo general o cuerpo b1sico de conocimientos de esta ciencia. Por otro lado, la Microbiología tambi"n se ocupa de las distintas actividades microbianas en relacin con los intereses humanos, tanto las que pueden acarrear consecuencias perjudiciales 2y en este caso estudia los nichos ecolgicos de los correspondientes agentes, sus modos de transmisin, los diversos aspectos de la microbiota patgena en sus interacciones con el hospedador, los mecanismos de defensa de "ste, así como los m"todos desarrollados para combatirlos y controlarlos3, como de las que reportan beneficios 2ocup1dose del estudio de los procesos microbianos que suponen la obtencin de materias primas o elaboradas, y de su modificacin y mejora racional con vistas a su imbricacin en los flujos productivos de las sociedades3. Hinalmente, la Microbiología ha de ocuparse de todas las t"cnicas y metodologías destinadas al estudio e(perimental, manejo y control de los microorganismos, es decir, de todos los aspectos relacionados con el modo de trabajo de una ciencia empírica.
4 IMPORTANCIA DE LA MICROBIOLOGÍA La Microbiología es una ciencia biolgica e(traordinariamente relevante para la humanidad, dado que los microorganismos est1n presentes en todos los h1bitats y ecosistemas de la 4ierra y sus actividades presentan una gran incidencia en numerosísimos 1mbitos de inter"s@ Los microorganismos han sido los primeros en aparecer en la evolucin, y constituyen seguramente la mayor parte de la biomasa de nuestro planeta. 9e calcula que slo hemos descrito menos del *W de los microorganismos e(istentes, por lo que los bilogos tienen una gran tarea por delante para estudiar esta parte de la biodiversidad. Las actividades microbianas sustentan los ciclos biogeoquímicos de la 4ierra@ los ciclos del carbono, del nitrgeno, del a'ufre o del fsforo dependen de modo fundamental de los microorganismos. Las actividades metablicas microbianas son e(cepcionalmente variadas, siendo algunas de ellas e(clusivas del mundo procaritico. La biolología b1sica tiene aquí un gran
campo de estudio. El aspecto aplicado y la incidencia econmica y social de los microorganismos es ingente, y aquí daremos unas breves pinceladas@ 0spectos beneficiosos@ 4odas las culturas desarrollaron de modo empírico multitud de bebibas y alimentos derivados de fermentaciones microbianas@ vino, cerve'a, pan, verduras fermentadas, etc. Produccin de multitud de productos industriales@ alcoholes, 1cidos org1nicos, antibiticos, en'imas, polímeros, etc. La ingeniería gen"tica empe' con los microorganismos, que siguen desempeñando un papel fundamental en la nueva generacin de medicamentos recombinantes y de terapias novedosas En su aspecto perjudicial, la Microbiología dedica una especial atencin a los microorganismos patgenos, sobre todo a los que afectan a la humanidad Las enfermedades microbianas han sido causa de grandes males a nuestra especie. 6aste recordar que la peste 2muerte negra3 caus a mediados del siglo $&% la muerte de la tercera parte de la poblacin europea, y ya en la primera mitad del siglo $% lleg a afectar a m1s del >+W. 6asta leer la literatura o ver las pinturas de la "poca para darse cuenta del impacto terrorífico que supuso, lo que a su ve' supuso un factor esencial en el surgimiento de las ideas del /enacimiento. )esde la "poca del descubrimiento de 0m"rica, las e(ploraciones han conllevado el intenso trasiego de agentes patgenos de un lugar a otro. La desaparicin de buena parte de la poblacin indígena se debi en buena parte a no tener defensas frente a la viruela europea, pero a su ve' los descubridores importaron la sífilis a Europa. :o hace falta resaltar el papel que ha tenido la microbiología m"dica, desde la "poca de Pasteur y 7och, en la lucha contra las enfermedades infecciosas 2antisepsia, desinfeccin, esterili'acin, quimioterapia3. I aunque ahora tengamos nuevos retos 29&)0, fiebres hemorr1gicas, etc.3, no cabe duda de que la Microbiología est1 contribuyendo a no perder esta permanente batalla contra los g"rmenes patgenos. 0parte de todas estas actividades de los microorganismos sobre los humanos, hay que tener en cuenta que e(isten g"rmenes que afectan a animales, plantas, instalaciones industriales, que afectan a alimentos, etc., representando otras tantas 1reas de atencin para la Microbiología.
5 UBICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL MUNDO VIVO 4ras el descubrimiento de los microorganismos, a los naturalistas de la "poca les pareci normal intentar encuadralos dentro de los dos grandes reinos de seres vivos conocidos entonces@ animales y plantas. )e este modo, a finales del siglo $%&&& las algas y
los hongos quedaron en el reino #lantae, mientras que los llamados -infusorios se encuadraron en el reino &nimalia. 0 mediados del siglo $&$ se empe' a ver que esa clasificacin era demasiado sencilla, y que el grupo de los infusorios era muy heterog"neo. En *?? KaecCel, seguidor de )arBin, propone un famoso 1rbol filogen"tico con tres reinos@ 0nimalia Plantae Protista@ todos los seres vivos sencillos, sean o no fotosint"ticos o mviles. )entro de "l consideraba los siguientes grupos@ Proto'oos Proto'oos 0lgas Kongos Moneras 2Xbacterias3 Pero esta clasificacin iba a ser puesta en entredicho a mediados del siglo $$, cuando las t"cnicas de microscopía electrnica y bioquímicas demuestran la gran diferencia de las bacterias respecto del resto de organismos. )e hecho, ya en los años ? se reconoce que esta diferencia representa la mayor discontinuidad evolutiva del mundo vivo. En *=>F, el Manual Bergeys 2la biblia -oficiosa de la clasificacin bacteriana3 considera que la clasificacin al m1(imo nivel del mundo vivo debe reconocer la e(istencia de dos -/einos@ Procaryotae 2material gen"tico no rodeado de membrana nuclear3 Eucaryotae 2n!cleo aut"ntico3 Pero en los años recientes, la incorporacin a la ta(onomía de los m"todos de biología molecular, especialmente la secuenciacin de 0/: ribosmico y la genmica, est1obligando a nuevos planteamientos. Para resumir, hoy se asume lo siguiente@ E(isten dos tipos de organi'acin celular, la procaritica y la eucaritica. )entro de los seres vivos con organi'acin procaritica, e(isten dos grandes -dominios o -imperios@ Bacteria 2las eubacterias o bacterias -cl1sicas3 y &rchaea 2antes llamadas arqueobacterias3 0 su ve', el dominio eucaritico comprende numerosas líneas filogen"ticas, muchas de ellas de microorganismos. Los mismos Proto'oos es un grupo muy heterog"neo, que comprende líneas filogen"ticas diversas y a veces muy separadas en el tiempo evolutivo. El alumno ampliar1 todo esto cuando comience su estudio de la ta(onomía microbiana.
BIBLIOGRAFÍA
60L)/I, P. 2*=*3@ -La batalla contra las bacterias. /evert", 6arcelona. 6/5#7, 4.). 2*=?*3@ -Milestones in Microbiology 2reedicin de *=>+3. 0merican 9ociety for Microbiology, ashington, ).#. #5LL0/), P. 2*=>?3@ -4he development of Microbiology. #ambridge Oniversity Press, #ambridge. E(iste versin española@ -El desarrollo de la Microbiología, Ed. /evert". de 7/O&NH, P. @ -#a'adores de microbios. 6iblioteca #ientífica 9alvat. )E6/Y, P. 2*==+3@ -Louis Pasteur. 6arcelona, #írculo de Lectores. )O659, /. -Louis Pasteur. 6iblioteca 9alvat de ;randes 6iografías. N0K:, &., /. LZ4KE/, 7. 9E:;L0O6 2eds.3 2*==3@ -Kistoria de la 6iología. Labor, 6arcelona. 25riginal alem1n@ %E6 ;ustav Hischer %erlag, Nena *=+3. 7/&E;, :./. 2*=3@ 6acterial classification@ an overvieB. #an. N. Microbiol. 34@ +D?G+F. M0/;OL&9, L., 7.%. 9#K0/4Q 2*=+3@ -#inco /einos. Labor, 6arcelona. MO//0I, /.;.E. 2*=F3@ Kigher ta(a, or a place for everithing...[. En@ -6ergeyUs manual of 9ystematic 6acteriology. illiams \ ilCins, 6altimore. 940#7E6/0:)4, E. 2*=3@ Phylogenetic relationships vs. phenotypic diversity@ hoB to achieve a phylogenetic classification system of the eubacteria. #an. N. Microbiol. 34@ ++JG ++?.
ÍNDICE 1
CARACTERES DISTINTIVOS DE LOS PROCARIOTAS
2
COMPOSICIÓN #UÍMICA BÁSICA DE LA CÉLULA PROCARIÓTICA
3
ESTRUCTURA GENERAL DE UNA CÉLULA PROCARIÓTICA
1 CARACTERES DISTINTIVOS DE LOS PROCARIOTAS
%amos a e(poner los rasgos distintivos de los procariotas en forma de tabla comparativa con los eucariotas, de modo que se aprecien mejor los rasgos distintivos de cada tipo de organi'acin celular@
Procariotas Genóforo On solo cromosoma 0): c.d., c.c.c. 2cadena doble, circular cerrado covalentemente3 :o e(iste membrana nuclear :o histonas Replicación del material genético@ no mitosis rgani!ación del citoplasma :o org1nulos de tipo eucariticos :o citosqueleto 2no corrientes citopl1smicas3 /ibosomas >9
Eucariotas N)*+,-+/0/ %arios cromosomas 0): c.d. lineal, terminado en telmeros E(iste membrana nuclear Kistonas Replicación del material genético@ mitosis
rgani!ación del citoplasma 5rg1nulos 2mitocondrias, cloroplastos, retículo endopl1smico, ;olgi, lisosomas, etc3 #itosqueleto y corrientes citopl1smicas /ibosomas 9
0parte de estos que acabamos de citar, e(isten otros rasgos que, aunque no universales, caracteri'an a numerosos procariotas@ 9us membrana plasm1ticas carecen de esteroles, salvo los micoplasmas 2pero en este caso los esteroles proceden del hospedador eucaritico al que parasitan3, algunas especies de cianobacterias y de bacterias melitotrofas. La movilidad no es universal, pero muchas bacterias se mueven en medios acu1ticos debido a unas estructuras llamadas flagelos, que nada tienen que ver con los flagelos eucariticos. Las eubacterias 2dominio Bacteria3 poseen, salvo los micoplasmas, una pared celular a base de una peptidoglucano 2una macromol"cula que no e(iste en eucariotas3. Muchas arqueas 2dominio &rchaea3 poseen pared celular, diferente a las del dominio Bacteria.
2 COMPOSICIÓN #UÍMICA BÁSICA DE LA CÉLULA PROCARIÓTICA El contenido en agua de una c"lula vegetativa bacteriana típica es de un >W, mucho menor que el de los eucariotas 2que ronda el =W3. Ona c"lula de )scherichia coli, creciendo de forma equilibrada en un medio a base de glucosa y sales minerales, a D>*#, tiene la composicin@
tipo de componente
Porcenta"e so#re peso seco
proteína 0/: 0): Lípidos Lipopolisac1rido Peptidoglucano ;lucgeno total macromol"culas@ Pequeñas mol"culas org1nicas@
++. J.+ D.* =.* D.F J.+ J.+ =?.* J.=
&ones inorg1nicos@
*.
5bs"rvese que@ las macromol"culas constituyen la porcin mayoritaria de la masa celular 2=?W3< las proteínas representan m1s de la mitad de esta cantidad< las bacterias poseen una proporcin de 0/: superior a la de los eucariotas< la mayor parte de los compuestos son semejantes a los de eucariotas, pero dentro de las macromol"culas encontramos dos que son e$clusivas de los procariotas 2concretamente, de eubacterias, aunque no de todas3@ lipopolisac1rido 2e(clusivo de ;ramGnegativas3< peptidoglucano 2presente en eubacterias ;ramGpositivas y ;ramGnegativas3.
3 ESTRUCTURA GENERAL DE UNA CÉLULA PROCARIÓTICA %eamos de qu" partes principales se compone una c"lula procaritica/consultar la ,igura2. Karemos una enumeracin desde el e(terior al interior celular. Los nombres en ro"o indican los componentes obligatorios de cualquier bacteria, mientras que los dem1s son -dispensables en el sentido de que no son universales, sino que est1n presentes en grupos m1s o menos amplios de procariotas@
c%psula o capa mucilaginosa capa & paracristalina vaina #otones de ancla"e pared celular protoplasto, que a su ve' se compone de mem#rana citopl%smica 2que puede tener o no invaginaciones3 citoplasma, que incluye@ genóforo, constituido por un cromosoma en algunas especies, uno o varios pl%smidos 2elementos gen"ticos
e(tracromosmicos3 ri#osomas inclusiones org%nulos Pueden e(istir, adem1s, apéndices filamentosos@
'lagelos 'im#rias 2X pelos3
I90* -;0:-0;0 ; :0 7+6+60 ; *0 ::0 86,06-,+0" ,* 0:*,7 ; 77 ,98,**+7 9K7 060+67+-,7.
En los pr(imos temas abordaremos el estudio de estos componentes de la c"lula procaritica, centr1ndonos en su composicin química, estructura y sus funciones o papeles.
1 1.1
TAMAO DE LOS PROCARIOTAS C,*7*-07 ;: 8@, +090, ; :07 0+6-07
2
FORMA
3
AGRUPACIONES BACTERIANAS
4
FENÓMENOS DE MULTICELULARIDAD EN BACTERIAS
1 TAMAO DE LOS PROCARIOTAS El tamaño es un par1metro que est1 determinado gen"ticamente, pero los valores concretos para cada ra'a o cepa de bacterias vienen influidos por una serie de condiciones ambientales 2nutrientes, sales, temperatura, tensin superficial, etc3.
Las bacterias suelen presentar un pequeño tamaño, por lo general menor que el de una c"lula eucaritica típica. 25bs"rverse en el esquema la comparacin entre el tamaño de una bacteria típica como )scherichia coli 2.+ ( J m3 y el de una c"lula eucariota3. 9in embargo, e(iste un amplio rango de tamaños, seg!n las especies@ Ona bacteria grande es Beggiatoa gigantea, con un tamaño similar al de muchas c"lulas eucariticas 2F m3. 9in embargo, los aut"ntico -gigantes entre las bacterias se han descubierto hace poco@ En *==D se desubri una bacteria que mide ,+ mm de longitud. 9e trata de )pulopiscium, un comensal del intestino del pe' cirujano. En *=== se descubri en un lago de :amibia una bacteria 2a la que se bauti' como !hiomargarita3 que alcan'a los > m. Bacillus megaterium mide *.D ( D m.
Ona bacteria relativamente pequeña es 5aemophilus in,luen'ae, que mide .J+ ( *.J m. Los organismos celulares cultivables m1s pequeños que e(isten son los micoplasmas, muchos de los cuales no superan los .J m de di1metro. Las nanobacterias o ultramicrobacterias miden en torno a .+ m, pero la mayoría no se han podido cultivar, y slo se pueden estudiar al microscopio.
1.1 C-0,*),*/0 ,+ ,6),7- 8//7- , +/0 9/*8,:/0( Metodolgicas6 9e necesita recurrir a microscopios para su visuali'acin, y emplear t"cnicas especiales adecuadas al pequeño tamaño< Para sacar conclusiones sobre muchas características de las bacterias hay que hacer estudios -promediados, es decir, obtenidos a partir de una gran poblacin de c"lulas, y no sobre un solo individuo. 2El estudio de c"lulas bacterianas aisladas es posible, pero es complicado y no se emplea en la mayor parte de la investigacin habitual sobre procariotas3. #ropiedades ,7sicas@ se derivan del comportamiento como partículas coloidales@ movimiento broBniano 2movimiento aleatorio derivado del empuje de mol"culas de agua alrededor de la bacteria3< capacidad de dispersar la lu' 2el llamado efecto 4yndall3. Por esta ra'n, las suspensiones acuosas relativamente densas de bacterias tienen una apariencia -turbia 2trasl!cida3< aumentan la viscosidad del medio donde van suspendidas. Por tener carga el"ctrica@ migran en un campo el"ctrico y aglutinan y precipitan a altas concentraciones de sales. #ropiedades biolgicas6
La relacin superficie]volumen 29]%3 es muy alta. En efecto, supongamos una c"lula esf"rica< en dicha c"lula, la relacin 9]% es D]r, 2la superficie de una esfera es F^r J mientras que su volumen es F]D^r D3. 5 sea, cuanto menor sea el radio 2r3 mayor ser1 esta relacin. Esto significa que el pequeño tamaño de las bacterias condiciona un ma(or contacto directo con el medio am#iente inmediato que las rodea, lo que se traduce en que reciben las influencias ambientales de forma inmediata. El pequeño tamaño condiciona una alta tasa de crecimiento. La velocidad de entrada de nutrientes y la de salida de productos de desecho es inversamente proporcional al tamaño de la c"lula, y a su ve', estas tasas de transporte afectan directamente a la tasa metablica. Por lo tanto, en general, las bacterias crecen 2se multiplican3 de forma r1pida.
2 FORMA
Los principales tipos de formas bacterianas son@ cocos 2c"lulas m1s o menos esf"ricas3< bacilos 2en forma de bastn, alargados3, que a su ve' pueden tener varios aspectos@ cilíndricos fusiformes en forma de ma'a, etc. 0tendiendo a los tipos de e(tremos, "stos pueden ser@ redondeados 2lo m1s frecuente3 cuadrados
biselados afilados espirilos@ al igual que los bacilos, tienen un eje m1s largo que otro, pero dicho eje no es recto, sino que sigue una forma de espiral, con una o m1s de una vuelta de h"lice. vibrios@ proyectada su imagen sobre el plano tienen forma de coma, pero en el espacio suelen corresponder a una forma espiral con menos de una vuelta de h"lice. 5tros tipos de formas filamentos, ramificados o no anillos casi cerrados formas con prolongaciones 2con prostecas3 Estos distintos tipos de morfologías celulares deben de haberse originado por mecanismos evolutivos, a saber, por seleccin y estabili'acin adaptativa frente a las distintas presiones ambientales presentes en diferentes nichos ecolgicos. Relaciones entre tamaño y forma
)ifusión citopl%smica* Este aspecto lo ilustraremos con una bacteria típica de forma bacilar. Ona proteína de unos + C)a difundiría desde la periferia del citoplasma al eje longitudinal en menos de medio segundo, mientras que si difundiera desde un polo de la c"lula al opuesto, tardaría unos + segundos. #omo vemos, el tiempo de difusin es muy breve. )ifusión desde el medio e$terior* el entorno inmediato de las bacterias es bastante peculiar, debido al bajo valor de n!mero de /eynolds que poseen. El n!mero de /eynolds 2/3 es un par1metro muy empleado en &ngeniería y 0rquitectura para e(presar la tensin o estr"s que soporta una estructura determinada inmersa en el medio local que la sustenta. / equivale a la relacin entre la fuer'a de inercia y fuer'a de friccin 4eniendo en cuenta la masa y velocidad de movimiento de una bacteria como ). coli@ m X * G*J g v X D m]s tenemos que el valor / para esta bacteria es de *G+. )e aquí se deduce que la inercia es irrelevante, mientras que predominan las fuer'as viscosas. Por lo tanto, las bacterias llevan, en su avance, un entorno local debido a la resistencia por viscosidad. Este entorno es una fase fluida cuya forma reproduce, ampliada, la forma de la bacteria en cuestin.
+e"ora en las propiedades ,idrodin%micas o de flotación* Es posible que la forma tambi"n tenga relacin con propiedades hidrodin1micas. Por ejemplo, las
bacterias mviles raramente son esf"ricas< la forma ptima sería aquí la bacilar. )e hecho, e(isten pocos casos de cocos flagelados. #omo veremos oportunamente, e(iste un grupo de bacterias alargadas pero con morfología espiral y que est1n muy bien adapatadas a avan'ar en medios muy viscosos. Esta morfología de las espiroquetas ha debido ser seleccionada evolutivamente precisamente por este factor ecolgico. Por otro lado, las formas con prostecas, prolongaciones, las morfologías en disco o en l1mina parecen estar especiali'adas en facilitar la flotacin. Las bacterias adoptan formas en las que optimi'an la relacin 9]%, y por consiguiente su entorno local. %eamos algunos ejemplos de valores 9]%@ los menores valores los poseen las bacterias esf"ricas 2cocos3, en las que 9]% X +.. La forma esf"rica permite una mayor resistencia frente a la desecacin< los bacilos alcan'an valores de 9]% de alrededor de *< las formas espirales y las bacterias con prolongaciones vivas 2prostecas3 tienen valores mayores que los de los bacilos< la mejor relacin 9]% conocida 2de *?3 la posee la curiosa bacteria cuadrada de alsby.
3 AGRUPACIONES BACTERIANAS Las bacterias normalmente se multiplican por fisin transversal binaria. En muchas especies, las c"lulas hijas resultantes de un evento de divisin por fisin tienden a dispersarse por separado al medio, debido a la actuacin de fuer'as físicas 2movimiento broBniano, ci'allamiento, corrientes de conveccin, etc3. Esto hace que al observar al microscopio una poblacin de estas bacterias veamos mayoritariamente c"lulas aisladas. Pero en algunas especies las c"lulas hijas pueden permanecer unidas entre sí 2al menos durante un cierto tiempo tras la divisin de la que proceden3 debido a que el tabique sea incompleto o a la e(istencia de capas mucosas que retienen juntos los productos de la divisin. 9i la tendencia a permanecer unidas es baja, tendremos agrupaciones de dos c"lulas, que dependiendo que sean de morfología esf"rica o alargada, se denominan como@
diplococos diplo#acilos 9i la tendencia a permanecer unidas es mayor 2por m1s tiempo3, nos encontramos con varias posibilidades, dependiendo del n!mero de planos de divisin y de la relacin entre ellos@ 9i los tabiques son paralelos entre sí 2o sea, e(iste un solo plano de divisin3@ estreptococos 2cadenetas arrosariadas de cocos3 y estrepto#acilos 2cadenetas de bacilos3. 9i e(iste m1s de un plano de divisin, en el caso de cocos podemos encontrar tres
posibilidades@ dos planos perpendiculares@ tétradas 2F c"ls. en un plano3 o m!ltiplos< tres planos ortogonales@ sarcinas 2paquetes c!bicos3< muchos planos de divisin@ estafilococos 2racimos irregulares3. En el caso de bacilos, se pueden dar variantes adicionales, debido a la posibilidad de que se produ'can movimientos postfisionales 2en algunos casos con desgarro3@ bacilos en empali!ada o en pa-uetes de cigarrillos 2debido a giros de *o3 dos bacilos en 1ngulo 2en forma de letra o /3 varios bacilos formando -letras c,inas0.
4 FENÓMENOS DE MULTICELULARIDAD EN BACTERIAS #iertos grupos de bacterias e(hiben una pluricelularidad incipiente, de modo que se dan conjuntos de c"lulas asociadas permanentemente. En muchos casos, dentro de estos grupos celulares e(isten formas celulares diferenciadas y especiali'adas. Por supuesto, en ninguna instancia se puede hablar de diferenciacin de tejidos 2algo e(clusivo de eucariotas3.
+i$o#acterias. #omo estudiaremos oportunamente, se trata de bacterias con dos fases dentro de su ciclo de vida@ una fase a base de en"am#res donde todas las c"lulas se mueven coordinadamente, y otra fase a base de cuerpos fructificantes en los que se aloja un tipo especiali'ado de c"lula llamado mi$ospora. 'ilamentos 1 tricomas de ciertos grupos de iano#acterias. En ellos las c"lulas vegetativas individuales est1n unidas entre sí por puentes citoplasm1ticos 2permitiendo, por tanto, comunicacin intercelular3. #iertas cianobacterias filamentosas poseen, adem1s, c"lulas especiali'adas 2,etero-uistes5 a-uinetos. Los filamentos no son e(clusivos de cianobacterias, ya que tambi"n se dan en ciertas bacterias ;ramGnegativas no fotosint"ticas. uerpos circulares del género Thermus@ unas *F c"lulas se encuentran englobadas por una pared e(terna com!n. 'ilamentos cenoc6ticos ramificados de los Actinomicetos@ constituyen las denominadas -hifas 2por analogía con las de los hongos3, que a su ve' originan -micelios.
C68,7 <6+-<-0*+7 ; A? Myxococcus fulvus =B? Stigmatella aurantiaca =C? Chondromyces crocatus. S. aurantiaca 9-; *07 15& 9-607. =D M. D,6-*" Microbiol Rev " &(!&>1&2" 1%%?
M-6,60<07 :+6*-07 ; 066-;, ; 68,7 <6+-<-0*+7 ; Myxococcus xanthus. A :0 ;60 7 8; /6 ;+0:: ; * 68, 0-6+," 9,7+60*;, :0 ;-78,7--* ; :07 9-J,78,607.
ÍNDICE( 1
CÁPSULA
1.1
CONCEPTOS GENERALES
1.2
MÉTODOS DE OBSERVACION Y ESTUDIO
1.3
COMPOSICIÓN #UÍMICA Y ESTRUCTURA
1.4
FUNCIONES
1.4.1
PROPIEDADES O PAPELES GENERALES
1.4.2
PROPIEDADES PARTICULARES
2
CAPA S =CAPA SUPERFICIAL PARACRISTALINA?
3
VAINAS
4
BOTONES DE ANCLA'E
BIBILIOGRAFÍA
1
CÁPSULA
1.1
CONCEPTOS GENERALES
La c1psula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas bacterias en sus ambientes naturales, consistente en acumulacin de material mucoso o viscoso, situado e(ternamente respecto de la pared celular 2o, en su caso, respecto de la capa 9 y de la vaina3. Las c1psulas se pueden describir en funcin de@ su grado de asociacin con la superficie celular subyacente 2sobre todo pared3@
7ntegral@ íntimamente asociada con la superficie celular, a saber, con la P.#. Periférica@ asociada a la sup. celular slo en determinadas condiciones, pero finalmente se dispersa al medio e(terior. su consistencia y sus límites e(ternos@ R6gida@ con suficiente consistencia estructural como para evitar la entrada de partículas como las de tinta china o nigrosina. 9uele tener un límite e(terior definido. 'le$i#le@ poca consistencia, de modo que no e(cluye partículas. 0dem1s, es deformable y carente de límites precisos. Kay una cierta confusin en la nomenclatura de las c1psulas. :osotros usaremos los siguientes conceptos@
%psulas en sentido estricto son aquellas de tipo r6gido e integral. apas mucilaginosas son las de tipo fle$i#le ( periférico. Glucoc%li$ es el conjunto de estructuras superficiales bacterianas, e(teriores respecto de la pared celular, y compuestas de polisac1rido. Las c1psulas son estructuras inertes, -no vivas, carentes de papel activo 2metablico3, pero que confieren a las bacterias importantes propiedades@ 0dhesin a c"lulas hermanas, generando microcolonias y consorcios. 0dhesin a sustratos inertes o vivos, lo que les permite _la coloni'acin de sus nichos ecolgicos 2p. ej., tejidos de organismos superiores3 Proteccin contra agentes antibacterianos.
1.2
MÉTODOS DE OBSERVACION Y ESTUDIO
9u observacin a microscopía ptica en fresco es difícil, ya que su índice de refraccin es similar al del medio. 0l ser una estructura muy hidratada 2==W de agua3, su observacin con las t"cnicas habituales de microscopía electrnica de transmisin 2ME43 y
de barrido 2ME63 revela una notable contraccin de su estructura. 0dem1s, los colorantes habituales tienen poca afinidad hacia ella.
I90* 0 9-6,7,80 8+-0 ; :0 K87:0 ;: *9,,, =Streptococcus pneumoniae?
A microscop6a óptica@ 9e recurre a tincin negativa por medio de nigrosina o tinta china 2resaltan como un halo transparente sobre el fondo oscuro del porta3. A microscop6a electrónica@ Kay que recurrir a la estabili'acin previa de la estructura capsular 2para evitar su contraccin ulterior3 por medio de anticuerpos anticapsulares o de lectinas. 4ras esta operacin, se procede a la tincin por una ferritina catinica 2p. ej., el rojo de rutenio3, con afinidad hacia polianiones. Para investigar m1s sobre la estructura de la c1psula se recurre igualmente a difracción de ra(os 8 del polisac1rido capsular.
Aislamiento del material capsular@ El material de las capas mucosas 2es decir, de las c1psulas fle(ibles y perif"ricas3 es muy f1cil de aislar, ya que tiende a dispersarse continuamente en el medio de cultivo. Por lo tanto, se puede aislar directamente de los sobrenadantes resultantes de la centrifugacin del cultivo correspondiente. El material de las c1spulas rígidas e integrales puede aislarse tratando al cultivo con agua caliente o con 1cidos o 1lcalis d"biles.
1.3
COMPOSICIÓN #UÍMICA Y ESTRUCTURA
En general, el material capsular se compone de macromol"culas asim"tricas que, en muchos casos constan de una serie de unidades repetitivas@ polisac1ridos o polip"ptidos.
c%psulas polisacar6dicas a3 Keteropolisac1ridos aninicos, cuyas unidades repetitivas constan de a'!cares 2osas3, aminoa'!cares, 1cidos urnicos, polioles 2en muchos casos con radicales fosfato, formiato, succinato, etc.3. b3 Komopolisac1ridos neutros, como i3
levanos 2polímeros de unidades de fructosa unidas por 2J ?3
ii3 de(tranos iii3 celulosa c3 alginatos 2p. ej., en &'otobacter$ #seudomonas3, consistentes en una alternancia de distintos tipos de 1cidos urnicos. J3 c%psulas polipept6dicas 2slo encontradas en el g"nero Bacillus3. Est1n formadas por glutamilGpolip"ptidos. 0sí p. ej., en B. anthracis el p"ptido es slo de )Gglut1mico. Las c1psulas y capas mucilaginosas bacterianas constituyen el llamado ant6geno : 1capsular. Ona misma especie puede constar de distintas ra'as, cada una de ellas con un 0g 7 distintivo, distinguible del de las dem1s por su composicin química y su inmunorreactividad. Por ejemplo, en )scherichia coli se encuentran unos > tipos diferentes de especificidades de 0g 7. Las c1psulas polisacarídicas est1n unidas a la superficie subyacente, sobre todo a la pared celular.
/a estructura es a base de una matri' muy hidratada, con una ordenacin regular radial, o a veces, en l1minas conc"ntricas.
1.4
FUNCIONES
En laboratorio, muchas bacterias suelen perder la capacidad de formar c1psulas al cabo de varios subcultivos. 0sí pues, la posesin o no de c1psula es algo que no afecta a la viabilidad de las bacterias. Pero en medios naturales, las c1psulas confieren a las bacterias una serie de propiedades, que dependen del nicho ecolgico particular donde viva cada bacteria. Estudiaremos una serie de propiedades o papeles generales, comunes a todas las c1psulas, para concluir con algunos ejemplos de papeles específicos.
1.4.1 PROPIEDADES O PAPELES GENERALES *3 Mejora en las propiedades de difusin de nutrientes hacia la c"lula. Los polisac1ridos e(tracelulares aninicos funcionan como una resina de intercambio. J3 Proteccin contra la desecación D3 Proteccin contra la predación por parte de proto'oos. F3 Proteccin contra agentes anti#acterianos@ a3 contra metales pesados b3 contra bacterifagos
c3 contra c"lulas fagocíticas 2p. ej., la c1psula del neumococo3 d3 contra detergentes e3 contra anticuerpos +3 Ad,esión a sustratos@ a3 sobre sustratos inertes@ propiedad importante, sobre todo en medios acu1ticos. La mayoría de las bacterias acu1ticas no son planctnicas, sino que viven en interfases 2superficies, sedimentos3, donde los nutrientes difunden mejor. %eamos cmo se produce el proceso@ i3
la bacteria se adhiere por la c1psula al sustrato<
ii3 la c1psula supone un aumento de superficie bacteriana, lo que se traduce en una mejora en la capacidad de absorber nutrientes< iii3 la bacteria se multiplica, form1ndose una microcolonia donde los individuos est1n m1s protegidos frente a los agentes antibacterianos< iv3 se forman consorcios con otros microorganismos. Ello permite una -alian'a o colaboracin metablica entre distintas especies, por la que se produce la degradacin concertada de sustratos insolubles. Esta propiedad tiene una serie de importantes secuelas econmicas@
corrosin y obstruccin de cañerías<
formacin de placa dental y caries<
formacin de biopelículas en cat"teres y prtesis quir!rgicas
b3 sobre sustratos vivos 2tejidos de organismos superiores3@ i3
En sistemas -normales 2efectos ben"ficos3@ La flora 2X microbiota3 autctona que coloni'a los epitelios de los animales superiores est1 englobada en glucoc1li(, estando las bacterias adheridas a la superficie tisular. Es decir, las c1psulas pueden actuar como ad,esinas 2mol"culas para la adhesin3. 5tro ejemplo de ello lo da la microflora autctona de la simbiosis del rumen
ii3
En sistemas patolgicos@ La c1psula es uno de los factores de virulencia, de los que depende el inicio de muchas infecciones por parte de bacterias patgenas. 9i, adem1s, la flora autctona del individuo afectado est1 alterada o disminuida, esto supone un nicho ecolgico vacío o perturbado, que puede ser coloni'ado por bacterias patgenas, en parte gracias a su glucoc1li(, que adem1s
las protege frente a surfactantes, c"lulas fagocíticas, anticuerpos, etc. Muchas c1psulas polisacarídicas no son reconocidas como material e(traño por el sistema inmune, debido a que su estructura -mimeti'a estructuras del propio hospedador. 5tras c1psulas sobrapasan la capacidad de respuesta del sistema inmune, o bien no activan eficientemente al sistema complemento.
I90* 0*-90;0 @ 97+60 : 9,;, * @ :0 K87:0 0+6-0*0 /0; :0 0-* ;: ,98:9*+, ;: ,78;0;,6 909<6,( E: ,98,**+ C3 ;: ,98:9*+, +-*; 0 <-067 7,6 :0 786<-- 0+6-0*0" 86, 7+, 7 9K7 ;-<-: 7- :0 0+6-0 8,7 K87:0. P,6 ,+6, :0;," :0 ::0 <0,+-0" 86,/-7+0 ;: 68+,6 8060 C3 *, 8; -*+60-,*06 -* ,* :0 0+6-0" ; 9,;, @ 7 /-+0 :0 <0,-+,7-7.
1.4.2 PROPIEDADES PARTICULARES Entre las propiedades conferidas por las c1psulas a algunas bacterias tenemos@ *3 #omo receptores para ciertos bacterifagos. J3 En las bacterias tropicales fijadoras de :J atmosf"rico, de los g"neros Derxia y Bei8erinc"ia la gruesa y espesa c1psula act!a como barrera frente a la difusin de 5J, con lo cual evitan la inactivacin de la en'ima nitrogenasa. D3 En (hi'obium 2fijador de :J en simbiosis con las raíces de leguminosas3 el polisac1rido e(tracelular act!a en la fase de reconocimiento entre la bacteria y la planta específica, a trav"s de lectinas de esta !ltima. F3 En &cetobacter xylinum la c1psula es a base de fibrillas de celulosa que retienen burbujas de aire, lo cual hace que la bacteria flote hasta su nivel adecuado.
2 CAPA ;S< =CAPA SUPERFICIAL PARACRISTALINA> #apa que, en muchas eubacterias 2sobre todo ;ramGpositivas3, envuelve a la pared celular, formada por el ensamblaje regular de subunidades id"nticas de proteínas o glucoproteínas. En ;ram negativas la capa 9 se une a la membrana e(terna, mientras que el
;ram positivas lo hace al peptidoglucano. En muchas 0rqueas es la !nica capa que rodea al protoplasto, por lo que en ellas cumple funciones de aut"ntica pared celular.
)isposición simetría binaria@ filas oblicuas paralelas simetría cuadrangular@ simetría he(agonal@
unidades morfológicas ;96,7 tetr1meros he(1meros
La unin entre los monmeros se reali'a por enlaces no covalentes@ hidrfobos inicos, bien directos, o por mediacin de cationes puentes de hidrgeno
Papel@ En eubacterias provistas de pared celular. la capa 9 cumple varios papeles como tami! molecular protector que impide la entrada de agentes antibacterianos Parece que en muchos casos tambi"n protege frente a fluctuaciones inicas y de pK, estr"s osmtico, etc. En algunas bacterias patgenas, puede ser un factor de virulencia, al proteger a la bacteria frente al ataque del complemento y de los fagocitos. En 0rqueas da forma ( rigide! a muchas especies, ejerciendo papeles equivalentes al de una pared celular. En arqueas halfilas 2p. ej., 5alobacterium3 la capa 9 de glucoproteína contiene glucop"ptidos especiales, y est1 estabili'ada por altas concentraciones de sodio, presentes en su nicho. En arqueas termoacidfilas 2Sul,olobus3 e(isten glucoproteínas en matrices he(agonales, ricas en amino1cidos polares 29er, 4hr3, estando la capa 9 estabili'ada por los bajos pK del medio.
3
VAINAS
9on estructuras tubulares 2ramificadas o no3 compuestas de un heteropolímero, a base de proteína, lípido y polisac1rido, que engloban a conjuntos de c"lulas bacilares en cadenetas o filas. La vaina est1 en contacto con la pared celular subyacente, pero no hay enlaces entre ambas. En Sphaerotilus y -eptothrix las vainas se recubren de ac!mulos de (idos e hidr(idos de He y Mn. #onforme se dividen por fisin binaria, las c"lulas de los e(tremos del filamento van sinteti'ando nuevo material de la vaina que las va rodeando. Las 0rqueas Methanothrix y Methanospirillum poseen vainas proteicas con subunidades dispuestas en anillos, y son las que confieren la forma.
4
BOTONES DE ANCLA'E
9on ac!mulos de mucopolisac1ridos 1cidos, segregados en puntos concretos de la c"lula, a nivel de pared celular, e(tremos de prostecas y ped!nculos o de tallos inertes en alg!n momento del ciclo de vida de ciertas bacterias. Hacilitan la unin de las bacterias que los poseen a sus sustratos. #omo ejemplo, los discos adhesivos 2-holdfast3 en el e(tremo de las prostecas de %aulobacter .
BIBILIOGRAFÍA 6E%E/&);E, N.4. 2*=3@ 4he bacterial surface@ general considerations toBards design and function. #an. N. Microbiol. 34@ D?DGD>J. 6E%E/&);E, N.4., L.L. ;/0K0M 2*==*3@ 9urface layers of bacteria. Microbiol. /ev. ;;@ ?FG>+. 65OL:5&9, ;.N., 7. N0:: 2*==3@ 6acterial polysaccharide capsule synthesis, e(port and evolution of structural diversity. Molec. Microbiol. 3@ **=G*JD. #594E/45:, N.., ;.;. ;EE9EI, 7.GN. #KE:; 2*=>3@ El mecanismo de adherencia en las bacterias. &nv. y #iencia 2mar'o3@ ??G>>. ;544E9M0:, 9., %. 945O4 2*==*3@ /egulation of capsular polysaccharide synthesis in )scherichia coli 7*J. Molec. Microbiol. ;@ *+==G*??. 75%0L, 9.H. 2*=3@ Paracrystalline protein surface arrays on bacteria. #an. N. Microbiol. 34@ F>GF*F. LE#KE:E/, N., H. &EL0:) 2*==3@ 9tructure and biosynthesis of proCaryotic glycoproteins. 0nnu. /ev. 6iochem. ;<@ *>DG*=F.
1
INTRODUCCIÓN
2
PAREDES DE LAS EUBACTERIAS
2.1
EL PEPTIDOGLUCANO( COMPOSICIÓN #UÍMICA Y ESTRUCTURA
2.1.1 COMPOSICIÓN #UÍMICA Y ESTRUCTURA BÁSICAS DEL PEPTIDOGLUCANO 2.1.2
EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM>NEGATIVAS
2.1.3
EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM>POSITIVAS
2.2 RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIÓN EN EL PEPTIDOGLUCANO 2.3 OTROS COMPONENTES DE LA PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAM>POSITIVAS( LA MATRIQ 2.4 PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES 2.5
LA PARED DE BACTERIAS GRAM>NEGATIVAS
2.5.1
LA MEMBRANA ETERNA DE BACTERIAS GRAM>NEGATIVAS
2.5.1.1 ETERNA
COMPOSICIÓN #UÍMICA Y ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA
2.5.1.1.1
F-0?-+@-0 =FL>
2.5.1.1.2
L--+0/*:- =LPS>
2.5.1.1.3
L/ +-:-8,@/ =LPP" +-:-8,@/ , B:/)>
2.5.1.1.4
P:-8,@/0 , +/ ,9:// ,8,:/
2.5.1.2 2.5.2 3
PAPELES Y FUNCIONES DE LA MEMBRANA ETERNA EL ESPACIO PERIPLÁSMICO
PAREDES DE LAS AR#UEAS
BIBLIOGRAFÍA
1 INTRODUCCIÓN
La mayor parte de los procariotas posee una pared celular 2P.#.3 rígida rodeando al protoplasto. Las e(cepciones son los micoplasmas 2dentro del dominio Bacteria3 y algunas arqueas, como !hermoplasma. 0l microscopio electrnico se puede observar como una capa en íntimo contacto con la membrana citopl1smica, con un espesor que oscila entre * y nm 2seg!n especies3 Gfrente a los nm de la membrana celularG , y con una estructura m1s o menos compleja, seg!n los tipos bacterianos. a3 Las paredes celulares m1s frecuentes en eubacterias siguen dos modelos alternativos que, como veremos comparten un componente com!n@ paredes de tipo ;ramGpositivo o de tipo ;ramGnegativo. b3 Onas pocas eubacterias 2como las del g"n. #lanctomyces3 poseen paredes a base de proteínas. c3 Las 0rqueas poseen paredes diferentes a las de eubacterias y se pueden agrupar en diversos tipos. El grueso de este capítulo est1 dedicado al estudio de las paredes ;ramGpositivas y ;ramG negativas, con sus principales variantes, pero finali'aremos con una alusin a los principales modelos de paredes arqueanas. 0unque el alumno reali'ar1 en pr1cticas de labororatorio la tincin de ;ram, vamos a e(plicarla aquí brevemente. La tincin de ;ram es la m1s importante entre las tinciones llamadas diferenciales 2aquellas que no tiñen de la misma manera a todos los tipos de bacterias3. /esumiendo, esta tincin consta de varios pasos@ *. &maginemos un frotis en porta de vidrio con una muestra de varios tipos de bacterias, que se han fijado por calor. En la primera fase, esta preparacin de trata con un primer colorante llamado violeta cristal o violeta de genciana. J. 0 continuacin se añade una solucin de lugol 2yodoGioduro3, que act!a como -mordiente, formando una laca relativamente resistente con el violeta. En este momento todas las bacterias est1n
teñidas de color violeta. D. 0hora reali'amos una descoloracin diferencial con etanol o una me'cla de etanol y acetona. Lo que ocurre es que algunas bacterias 2las que llamaremos ;ramG negativas3 pierden el color violeta 2quedarían pr1ctimante transparentes al microscopio3, mientras que otras 2las ;ramGpositivas3 resisten el tratamiento, y retienen el colorante violeta. F. Hinalmente, tratamos el porta con un segundo colorante 2colorante de contraste3@ se trata de un colorante de color rojo o rosa, como la fucsina o la safranina. Este colorante tiñe ahora a las bacterias previamente descoloradas por el etanol. Por lo tanto, el resultado en la observacin al microscopio es que las bacterias ;ramGpositivas se ven de color violeta, y las ;ramGnegativas de color rosa o rojo. #omo veremos enseguida, esta diferencia de comportamiento ante la tincin de ;ram refleja el hecho de que ambos tipos de eubacterias poseen dos tipos estructuralmente diferentes de pared celular, aunque ambas posean en com!n la posesin de peptidoglucano. 0 continuacin estudiaremos con cierto detalle la pared celular de eubacterias.
2 PAREDES DE LAS EUBACTERIAS
#onsisten en un esqueleto macromolecular rígido, llamado peptidoglucano 1 mucopéptido o mure6na, que en ;ramGpositivas se encuentra inmerso en una matri! aniónica de pol6meros a!ucarados< y en ;ramGnegativas est1 rodeada por una mem#rana e$terna5 e inmersa en un espacio peripl%smico. #omen'aremos abordando esa macrol"cula tan peculiar llamada peptidoglucano, para despu"s estudiar globalmente y por separado la pared de ;ramGpositivas y ;ramGnegativas, con algunas variantes que se pueden presentar.
2.1 EL PEPTIDOGLUCANO( COMPOSICIÓN #UÍMICA Y ESTRUCTURA En las bacterias ;ramGpositivas el peptidoglucano representa el componente mayoritario de la pared celular 2+GW en peso3, mientras que en ;ramGnegativas supone slo del * al *W.
2.1.1 COMPOSICIÓN #UÍMICA Y ESTRUCTURA BÁSICAS DEL PEPTIDOGLUCANO Est1 formado por repeticiones de una unidad disacarídica fundamental unida a su ve' a un tetrap"ptido. )istintas cadenas 2formadas por el esqueleto de a'!cares3 se unen entre sí por determinados enlaces peptídicos entre tetrap"tidos de cadenas diferentes. %eamos todo ello en su concrecin química@
/a unidad disacar6dica repetitiva* consiste en N Gacetilglucosamina 2:0;3 unida por enlace `2*F3 a N Gacetilmur1mico 2:0M3. 5bs"rvese que el :0M es el DG5G)GlactilG"ter de la :0; 2o sea, se deriva de unir el 1cido )Gl1ctico con el 5K del #GD de la :0;3. Las distintas unidades disacarídicas se van uniendo entre sí por enlaces `2*F3 entre el :0M de una unidad y la :0; de la siguiente. Este enlace es susceptible a la rotura catali'ada por el en'ima liso'ima. El n!mero de repeticiones 2n3 puede oscilar entre * y *.
/a cadena tetrapept6dica* )esde el grupo carbo(ilo de cada 1cido :0M, y mediante un enlace amido, se encuentra unido el tetrap"ptido. On tetrap"ptido típico de muchas bacterias es@
LGalaninaGGG)Gglut1micoGGGmesoGdiaminopim"licoGGG)Galanina 5bs"rvese la alternancia de amino1cidos ) y L en el tetrap"ptido.
/a estructura glo#al* Las distintas cadenas polisacarídicas, con sus respectivos tetrap"ptidos, se unen entre sí por medio de puentes o enlaces peptídicos, entre un amino1cido de una cadena 2p. ej., el amino1cido nD, como el mesoG)0P del ejemplo3 y otro amino1cido de una cadena adyacente 2la )Gala terminal3. )e este modo, la estructura global es una sola macromolécula gigante que envuelve al protoplasto, formando un s%culo rígido, a modo de tejido continuo, que tiene el volumen y la forma de la bacteria respectiva.
En bacterias ;ramGnegativas este s1culo est1 formado por una sola capa 2o unas pocas3 de cadenas de P;. En ;ramGpositivas e(isten varias capas 2hay varios niveles de P;3. 0 continuacin describiremos por separado el P; de ;ramGpositivas y ;ramG negativas, dando indicaciones de sus principales variantes.
2.1.2 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAMNEGATIVAS En la mayor parte de ;ramGnegativas el peptidoglucano corresponde a la composicin y estructura que acabamos de describir. 9in embargo, en las espiroquetas, el diamino1cido en posicin D, en ve' de ser mesoG)0P, est1 sustituido por la LGornitina 2que tambi"n es un diamino1cido3. El enlace entre cadenas polisacarídicas se reali'a normalmente mediante unión pept6dica directa entre el grupo car#o$ilo de la )=ala terminal ( el grupo =amino del meso=)AP. 0hora bien, en este enlace participan solamente el +W de los tetrap"ptidos. Los dem1s p"ptidos no participan en enlaces, y entre estos !ltimos se encuentran incluso dip"ptidos y trip"ptidos. El resultado es una capa simple de PG 2de * nm de espesor3, a modo de malla floja, y con grandes poros 2los -huecos dejados por las 'onas donde no hay enlace peptídicos3. Ello e(plica el comportamiento de las bacterias ;ramGnegativas en la tincin de ;ram@ al añadir el alcohol, se produce una deshidratacin que tiende a contraer la estructura del P;, pero los poros son grandes y por ellos sale el primer colorante 2el violeta de genciana3. El ulterior tratamiento de la preparacin con el colorante de contraste 2fuchsina o safranina3 tiñe a estas bacterias de rojo.
2.1.3 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAMPOSITIVAS Es m1s variado que el de ;ramGnegativas, sobre todo en funcin de ciertas variantes en la composición del tetrapéptido y del tipo de enlaces entre los tetrapéptidos.
ariantes en composición del tetrapéptido@ En #acterias orineformes* el grupo G#5G en del )Gglu 2J3 puede estar amidado o unido a una glicina 2;ly3< el aa 2*3 puede ser ;ly o LG9er, en lugar de la LGala< el hidro(ilo en ? del :0M puede estar acetilado, lo que hace que el P; de estas bacterias sea resistente a la liso'ima. +uc,as #acterias Gram=positivas carecen de mesoG)0P 2D3, y en su lugar puede e(istir@ LLG)0P LGdiaminobutírico 2)063 LGlisina LGhomoserina LGornitina +odalidades de uniones interpept6dicas* enlace directo entre la )Gala2F3 y el G:KJ libre del diamino1cido en 2D3 enlace )Gala2F3GG8GGdiamino1cido2D3, donde $ representa un puente, que puede consistir en@
un solo amino%cido@ LGala, o )GisoG0sn un péptido corto@ LGalaGGLGala LGalaD LGalaD GG LGornitina ;ly+ enlace )Gala2F3 GGG>mismo tetrapéptido?GGG diamino1cido 2D3 enlace entre )Gala2F3 y el )Gglu2J3 2y no el aa en D3, por medio de un p"ptido en el que debe de e(istir obligatoriamente un diamino1cido 2p. ej., )Glys, )Gornitina3. )esde el punto de vista estructural, el P; de ;ramGpositivas se caracteri'a por la e(istencia de m!ltiples capas, e(istiendo entrecru'amientos tanto entre cadenas adyacentes en el mismo nivel como entre niveles distintos. El resultado es una red tridimensional gruesa 2hasta + capas en algunos Bacillus3, y m1s compacta que en ;ramGnegativas. )e todas formas, el grado de compacidad varía entre especies, y depende de@ n de :0M que contengan tetrap"tidos que participen en entrecru'amientos< longitud del puente peptídico
Ello condiciona a su ve' la intensidad de la gramGpositividad en la tincin de ;ram.
2.2 RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCIÓN EN EL PEPTIDOGLUCANO La arquitectura molecular del s1culo de mureína est1 a!n sujeta a debate. 9in embargo, uno de los modelos recientes m1s aceptado se podría resumir de la siguiente manera@ Los resultados de difraccin de rayos $ parecen indicar que las unidades disacarídicas de las cadenas est1n giradas unas respecto de otras, formando una estructura helicoidal de orden F o +. 0 resultas de ello, los p"ptidos protruyen alternativamente@ hacia arriba, a la i'quierda, hacia abajo, a la derecha, y vuelta a empe'ar, etc. Esta organi'acin permite que una cadena de P; se pueda unir con cadenas cercanas de su mismo nivel, así como con cadenas por encima y por debajo de su nivel, formando un perfecto entramado tridimensional 2al menos en las ;ramGpositivas3. La orientacin de las cadenas a'ucaradas en relacin con la superficie celular a!n est1 debatida. Parece que se disponen casi paralelas a la superficie celular, con una tendencia a una forma espiral por encima de la membrana citopl1smica. 9i consideramos una bacteria de forma bacilar, esta espiral cerrada se dispone siguiendo el perímetro circular 2y no siguiendo el eje longitudinal3. Los grupos tetrapeptídicos salen perpendicularmente de los :0M, en sentido vertical hacia la membrana. 9in embargo, cuando dos tetrap"tidos de un nivel se unen entre sí, forman un puente casi hori'ontal, formando 1ngulos de unos =o repecto de los esqueletos carbonados, y siguiendo el eje longitudinal de la c"lula. Esta estructura confiere una serie de importantes propiedades@ *3 Gran rigide!, que contrarresta las fuer'as osmticas a que est1 sometido el protoplasto 2aguanta presiones de unas + a *+ atmsferas3. Esta rigide' depende de@ a3 el grado de entrecru!amiento< b3 el hecho de que el enlace @1 4 es mu( compacto. La alternancia regular entre anillos piransicos de :0; y de :0M genera uno de los polisac%ridos m%s esta#les desde el punto de vista termodin1mico, que recuerda en su -estilo a la quitina y a la celulosa< c3 la alternancia en el tetrap"ptido, de amino%cidos en configuraciones ) ( / supone una factor adicional que confiere a!n m1s fuer'a estructural, y adem1s permite que todas las cadenas laterales de estos amino1cidos se dispongan hacia el mismo lado, facilitando la formacin de puentes de K.
J3 Pero, al mismo tiempo, la estructura permite una nota#le fle$i#ilidad. Ello colabora, junto con su rigide', a soportar variaciones amplias de la tensin osmtica del protoplasto. D3 ondiciona la forma celular. 0unque la química del P;, por sí misma, no determina la forma, es su disposicin espacial la responsable principal de esta forma.
2.3 OTROS COMPONENTES DE LA PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAMPOSITIVAS( LA MATRI #omo ya dijimos, el P; de las bacterias ;ramGpositivas se encuentra inmerso en una matri', que puede representar hasta el +W del peso de la pared celular, y que est1 constituida por largos polímeros denominados %cidos teicoicos, pudiendo e(istir tambi"n 2o en su lugar3 los %cidos teicurónicos y los lipoteicoicos. Estos componentes llegan a sobresalir de la superficie celular y suministran especificidad antig"nica.
Ácidos teicoicos@ Est1n presentes en muchas bacterias ;ramGpositivas, pero no en todas. 9on polímeros de hasta D unidades de glicerolGfosfato o ribitolGfosfato, unidas entre sí por enlaces fosfodi"ster, en los que la mayoría de los grupos G5K est1n sustituidos por GK, a'!cares, aminoa'!cares o )Galanina. Los 1cidos teicoicos est1n unidos covalentemente al peptidoglucano, concretamente al G5K en posicin ? del :0M, a trav"s de una unidad de enlace, variable seg!n las especies. 2Por ejemplo, en una especie de Micrococcus, el elemento de enlace consiste en glicerolGPD GG:0;GP3.
Ácidos teicurónicos@ #iertas bacterias ;ramGpositivas, cuando se someten a un r"gimen de limitacin de fosfato son incapaces de sinteti'ar 1cidos teicoicos, pero en su lugar producen 1cidos teicurnicos. Los teicurnicos consisten en polímeros aninicos formados por la alternancia de 1cidos urnicos 2que tienen grupos G#55K libres3 y amino'!cares como la :GacetilG galactosamina. Ácidos lipoteicoicos@ Est1n presentes en todas las bacterias ;ramGpositivas, aun en condiciones de carencia de fosfato. 9e trata simplemente de 1cidos glicerolGteicoicos que se encuentran unidos a la mem#rana citopl%smica, concretamente se unen por enlace fosfodi"ster con glucolípidos de membrana, mientras que el otro e(tremo de la cadena queda e(puesto al e(terior. En Streptococcus pyogenes las cadenas de lipoteicoicos se encuentran asociadas con la llamada prote6na +, originando una microfibrillas que sobresalen notablemente hacia el e(terior celular 2observables a microscopio electrnico3, y que facilitan la unin a las c"lulas de animales en que parasitan estas bacterias.
'unciones de los pol6meros de la matri!@ Parece ser que su papel principal es suministrar una carga neta negativa a la pared celular, lo que permite captar cationes divalentes 2p. ej., Mg3, que a su ve' se necesitan para muchas actividades en'im1ticas de la membrana citopl1smica o del espacio peripl1smico, que participan de la morfog"nesis y divisin de la pared celular. #omo ya dijimos, los 1cidos teicoicos y teicurnicos son buenos antígenos. #uando no est1n cubiertos por estructuras m1s e(ternas 2como c1psulas3, constituyen el ant6geno som%tico de las #acterias Gram=positivas. Hinalmente, en algunas bacterias, sumistran, junto con el P;, receptores específicos para la adsorcin de ciertos bacterifagos.
2.4 PARED CELULAR DE LAS BACTERIAS ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES )eterminadas bacterias ;ramGpositivas 2corineformes, Nocardia y, en especial Mycobacterium3 presentan una pared celular muy compleja, con a#undancia de l6pidos 2algo e(cepcional entre las ;ramGpositivas3. Estas bacterias no se tiñen con los colorantes normales, pero una ve' que se han teñido con fucsina 2for'ando mediante calentamiento de la preparacin3, tienen resistencia a decolorarse por una me'cla de 1cido clorhídrico al DW en etanol de =?o. Por ello se denominan como bacterias %cido=alco,ol resistentes. Esta propiedad depende
esencialmente de la presencia, en su pared celular de unos lípidos llamados %cidos micólicos. 8uímicamente, esta pared celular consiste en un esqueleto formado por dos tipos de polímeros, unidos covalentemente entre sí@ un peptidoglucano especial 2la diferencia m1s importante es que en ve' de :Gacetil mur1mico e(iste :GglucolilGmur1mico3< un ara#inogalactano de gran peso molecular. 0mbos polímeros se encuentran enla'ados a trav"s de fosfodi"ster entre una unidad de mur1mico y una de las arabinosas. Pero a su ve', este esqueleto se une covalentemente a los %cidos micólicos. Los 1cidos miclicos son `Ghidro(i1cidos grasos ramificados en , cuya longitud de cadena es grande 2desde #> a #=* en Mycobacterium3. Est1n unidos al esqueleto de la P.#. de forma uniforme, a trav"s de enlaces con los G5K en + de las unidades de arabinosa. Por lo tanto, el esqueleto de la P.#. de estas bacterias consiste en@ peptidoglucanoGGGarabinogalactanoGGG1cidos miclicos. Pero aparte de este esqueleto complejo, la P.#. de las bacterias 1cidoGalcohol resistentes e(hibe una variedad de lípidos@ *3 Glucol6pidos* a3 +icolatos de tre,alosa@ dos unidades de trehalosa unidas entre sí por enlace 2**3, y en donde los grupos ? y ? est1n unidos con 1cidos miclicos. #onstituyen el llamado factor de crecimiento en cuerdas, debido a que son responsables de la agregacin de los individuos bacterianos en forma de -cuerdas. b3 &ulfol6pidos de tre,alosa@ est1n locali'ados en la periferia de la P.#., y parecen ser impartantes factores de virulencia. En Mycobacterium tuberculosis 2el bacilo de la tuberculosis3 estos sulfolípidos de trehalosa funcionan como evasinas, es decir, facilitan el que la bacteria escape a la accin de los macrfagos inhibiendo la fusin del fagosoma con el lisosoma, lo cual puede e(plicar el hecho de que estosmicroorganismos tengan "(ito como par1sitos intracelulares. c3 +icósidos@ Locali'ados en la periferia, consisten en la unin por enlace "ster entre 1cidos miclicos y a'!cares 2incluyendo 1cidos urnicos, deso(iosas, amino'!cares, etc.3. J3 eras* Onin de 1cidos miclicos con ftioceroles 2alcoholes ramificados de alto peso molecular@ #D G #DF3.
El alto contenido en lípidos confiere una serie de propiedades a estas bacterias 2aparte de la 1cidoGalcohol resistencia ya citada3@ aspecto y consistencia c"rea de sus colonias< crecen formando grumos en medios líquidos< gran impermeabilidad de la P.#., que a su ve' condiciona una gran resistencia a la desecacin y gran resistencia a sustancias antibacterianas 2detergentes, o(idantes, 1cidos, bases, etc3.
2.5 LA PARED DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS La pared de las bacterias ;ramGnegativas es estructuralmente m1s compleja que la de ;ramGpositivas, cosa que se puede comprobar al observar un corte transversal al microscopio electrnico@ por encima de la membrana citopl1smica y hasta el e(terior se pueden apreciar + capas, altern1ndose las claras 2LJ, L+3 y las oscuras 2m1s densas a los electrones@ L*, LD, LF3. La capa densa LF corresponde al peptidoglucano 2ya estudiado3, que se encuentra inmerso en la capa clara L+, que consiste en un espacio peripl%smico, limitado entre la membrana citopl1smica y una mem#rana e$terna. La delgada capa de peptidoglucano no constituye m1s del +G*W de la pared. 0 continuacin estudiaremos la peculiar membrana e(terna de las bacterias ;ramGnegativas y el espacio peripl1smico.
2.5.1 LA MEMBRANA ETERNA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS 9e trata de una estructura de bicapa lipídica e(clusiva de las bacterias ;ramG negativas. #omo otras bicapas lipídicas, consta de una doble capa de lípidos, junto con proteínas de matri' 2estas !ltimas atravesando total o parcialmente la bicapa3. Por supuesto, en la bicapa lipídica, los grupos polares quedan hacia afuera, mientras que los hidrfobos tienden al interior. 0hora bien, la composicin química y la disposicin de los elementos de esta membrana e(terna son muy distintos a los de una membrana típica@ la bicapa es altamente asimétrica@ en la capa e(terna e(iste un ?W de proteínas y un FW de una macromol"cula e(clusiva de esta membrana e(terna@ el lipopolisac%rido 1/P&< en la capa interna no hay LP9, e(istiendo fosfolípidos 2HL3, lipoproteínas 2LPP3 y otras proteínas. El conjunto es un mosaico fluido que permite el despla'amiento lateral de los fosfolípidos, del LP9, y de las proteínas, pero no de las lipoproteínas unidas covalentemente al peptidoglucano. 9in embargo, esta fluide! es menor que la de la membrana citopl1smica.
2.5.1.1 COMPOSICIÓN #UÍMICA Y ESTRUCTURA DE LA MEMBRANA ETERNA La membrana e(terna se encuentra unida con el peptidoglucano subyacente a trav"s de distintos componentes y tipos de enlaces@ enlaces iónicos, mediados por cationes divalentes, entre distintas proteínas de la membrana e(terna y el P;< enlaces ,idrófo#os entre fosfolípidos y proteínas de la capa interior de la membrana e(terna con el P;< enlaces covalentes entre algunas mol"culas de lipoproteína y el P;. Parece ser que la membrana e(terna est1 en contacto directo con la plasm1tica en numerosos puntos, denominados 'onas de adhesin. Puede que se trate de regiones en las que produ'ca una aut"ntica fusin entre estos dos tipos de membrana, facilitando qui'1 el transporte de ciertas sustancias desde el e(terior al interior celular. Estudiaremos a continuacin los componentes de la membrana e(terna, aludiendo a su composicin química, estructura y funciones. 2.5.1.1.1 F-0?-+@-0 =FL>
9e locali'an en la l1mina interna de la m. e(t. La composicin en fosfolípidos es similar a la de la membrana citopl1smica, con un ligero enriquecimiento en fosfatidilG etanolamina. 2.5.1.1.2 L--+0/*:- =LPS>
9e trata de una macromol"cula e(clusiva de la l1mina e(terna de la membrana e(terna de bacterias ;ramGnegativas, responsable de muchas de las propiedades biolgicas de estas bacterias. 9e le conoce tambi"n con el nombre de endoto$ina 2to(ina termoestable, no difusible3. 9e trata de un glucolípido complejo, que podemos considerar compuesto de tres regiones o dominios@
l6pido A, que es la porcin m1s pro(imal, y de car1cter hidrofbico< regin intermedia, llamada oligosac%rido medular< regin distal 2cadena lateral espec6fica, polisacarídica3 a base de repeticiones de unos pocos a'!cares. Es de car1cter hidrofílico y constituye el ant6geno som%tico de las ?bacterias ;ramGnegativas. i El l6pido A@ esta regin es pr1cticamente id"ntica en todas las bacterias ;ramGnegativas. #onsiste en un disac1rido formado por dos unidades de glucosamina unidas por enlace `2*?3, pero donde todos los grupos G5K 2menos uno3 y G:KJ est1n sustituidos 2unidos a otras mol"culas3@ 5bs"rvese que e(isten + 2a veces ?3 1cidos grasos, todos ellos saturados, con predominio de `G hidro(imirístico 2un 1cido graso #*F3.
El G5K original en F est1 sustituido por arabinosaminaGfosfato. El G5K en * est1 sustituido por fosforilGetanolamina 2a veces pirofosforilGetanolamina3.
ii El oligosac%rido medular 2tambi"n llamado cora!ón o ncleo3@ se une al lípido 0 a trav"s del G5K en D. 9e pueden considerar dos fracciones@ la fraccin del n!cleo interno, a base de dos tipos de a'!cares e(clusivos de ;ramG negativas@ JGcetoGDGdeso(ioctnico 27)53 y LGgliceroG)Gmanoheptosa 2Kep3. 0lguna de las Kep y alguno de los 7)5 pueden a su ve' estar unidos a fosforilGetanolamina 2o pirofosforilGetanolamina3. Esta regin es muy rica en grupos cargados, especialmente con carga negativa 2de los fosfatos y 7)53. La fraccin del n!cleo e(terno est1 constituida a base de he(osas 2glucosa, galactosa, :0;, y a veces algunas he(osas m1s raras3.
iii adena lateral espec6fica@ polisac1rido repetitivo, que se proyecta hacia el e(terior celular, y que constituye el Ag som%tico de bacterias ;ramGnegativas. #onsiste en la repeticin 2hasta F veces3 de unidades tri=5 tetra= o pentasacar6dicas 2en estos dos !ltimos casos uno de los a'!cares de cada repeticin queda lateral respecto del esqueleto lineal que forman los dem1s3. )e todas estas regiones del LP9 la !nica indispensa#le para la via#ilidad es el l6pido A. Los mutantes incapaces de sinteti'ar las cadenas laterales o el oligosac1rido medular dan colonias rugosas y est1n afectados en distintas propiedades biolgicas, pero pueden sobrevivir.
PAPE/E& B 'CN7NE& )E/ /P& *. Papel estructural@ el LP9 es el componente esencial de la membrana e(terna. La porcin hidrofbica 2las cadenas de 1cidos grasos del lípido 03 se proyectan hacia el interior de esta membrana. Precisamente es la estructura del lípido 0 la principal responsable de la menor fluide' de dicha membrana, y por lo tanto de la mayor resistencia física. 25bs"rvese que, mientras cualquier fosfolípido tiene dos cadenas de 1cido graso, el lípido 0 posee + o ?, todas ellas unidas al mismo disac1rido, generando una mol"cula m1s -masiva.3. J. 0 su ve', la propiedad anterior hace que sea menos solu#le a detergentes ( m%s resistente a disolventes org%nicos.
D. Es menos permea#le a muc,as moléculas ,idrofó#icas, incluyendo antibiticos, debido a las largas cadenas laterales hidrofílicas. F. 9e une a cationes divalentes 2como Mg o Qn3, lo que contribuye a la mayor estabilidad de la membrana e(terna. Esta presencia de cationes suministra un am#iente adecuado para muc,as funciones de la P.. 29i añadimos un agente quelante como el E)40, o eliminamos el Mg y lo sustituimos por #a, se produce la desorgani'acin de la membrana e(terna3. +. #omo ya dijimos, el LP9 constituye la endoto$ina de las bacterias ;ramGnegativas. La funcin como endoto(ina se debe a la regin del lípido 0. 9us propiedades como endoto(ina est1n en el origen de muchos síntomas patolgicos propiciados por patgenos ;ramGnegativos@ a. pirogenicidad 2induccin de fiebre3 b. hipotensin c. en casos graves, choque letal, por fallo cardíaco d. actividad necrtica de tejidos. ?. Pero igualmente, tiene efectos #eneficiosos@ estimula una serie de mecanismos defensivos del hospedador, incluyendo la activacin del complemento, que puede ocasionar la lisis de la bacteria, mejora las propiedades de los fagocitos, etc. Es decir, a pesar del nombre de endoto(ina, el LP9 no es intrínsecamente t(ico, sino que su efecto depende de la respuesta del hospedador. El macrfago es la c"lula del hospedador principal responsable de la mediacin de los efectos del LP9, tanto los positivos como los negativos. El macrfago posee receptores de membrana para detectar el LP9 bacteriano, y en respuesta a "l, libera una serie de mol"culas mediadoras 2citoquinas3 que act!an a su ve' sobre diversas partes del sistema inmunitario. )e hecho, los efectos negativos se deben a comportamientos incontrolados desencadenados en el propio sistema inmunitario. >. El LP9, y concretamente las cadenas laterales constituyen el ant6geno som%tico , cuya especificidad viene determinada por la secuencia repetitiva de a'!cares. Esta porcin condiciona la virulencia de las bacterias ;ramGnegativas patgenas, por lo que debe de ser esencial en la interaccin hospedadorGpar1sito. J.+.*.*.D /a lipoprote6na 1/PP5 lipoprote6na de Draun 9u porcin polipeptídica es una pequeña proteína 2>.J C)a3 muy abundante en la membrana e(terna, y es la responsable de la unin covalente entre "sta y el peptidoglucano. La proteína tiene una configuracin mayoritaria en Gh"lice, que atraviesa el espacio peripl1smico, y parece que se agrega formando trímeros. Ona de las LPP del trímero 2por t"rmino medio3 se une covalentemente con el peptidoglucano.
El amino1cido :Gterminal es una cisteína cuyo grupo sulfhidrilo est1 unido por enlace tio"ter a un diglic"rido, y cuyo grupo amino se une por enlace amido con un 1cido graso 2p. ej., palmítico3. )e este modo, la porcin :Gterminal de la LPP est% em#e#ida en la l%mina interna de la mem#rana e$terna. El amino1cido #Gterminal es una lisina. Ona de cada tres mol"culas de LPP usa esta Lys para establecer un enlace peptídico entre su propio grupo G:KJ libre y el G#55K libre del mesoG)0P del P;. Por t"rmino medio, por cada die' unidades disacarídicas del P;, e(iste un enlace covalente con la LPP. La principal 2y probablemente !nica3 funcin de la lipopproteína es meramente estructural@ estabili'ar el complejo entre peptidoglucano y membrana e(terna. Esta unin es tan fuerte que permite aislar la membrana e(terna y el peptidoglucano como una unidad. J.+.*.*.F Prote6nas de la mem#rana e$terna Est1n intercaladas en esta membrana, participando en la estabili'acin de la arquitectura tridimensional, interaccionando unas con otras y con los lípidos. Entre ellas, las m1s importantes son las porinas.
L07 -:/0 7,* 86,+*07 ; *,7 35 D0" @ 7 060* <,690*;, 8:@,:-0 ,* 0*0:7 -*+6-,67" @ 0+60/-70* :0 9960*0 ; 806+ 0 806+. S <*-* 7 869-+-6 : 807, ; 77+0*-07 0 +60/7 ; ;-,7 0*0:7 -*+6-,67" 7-986 @ 7 87, 9,::06 70 ,980+-: ,* : +090, ; :,7 0*0:7 =7:* 76 9,::07 *+6 5&& !&& ;0:+,*?. E* :07 *+6,0+6-07" :07 8,6-*07 ,:0,60* * :0 :-8,** ,*+60 :07 70:7 -:-067 @ J-7+* * : ,7-7+90 -*+7+-*0: ;,*; 8070* 806+ ; 7 /-;0. E(isten otras proteínas minoritarias parecidas a porinas, que act!an como canales espec6ficos que permiten el paso de ciertas mol"culas@ vitamina 6*J, quelatos de He, nuclesidos, maltode(trinas, etc. 0lgunas de ellas sirven simult1neamente como receptores de fagos.
2.5.1.2 PAPELES Y FUNCIONES DE LA MEMBRANA ETERNA *3 0ct!a como tami! molecular, que permite la difusin !nicamente de mol"culas relativamente pequeñas. Esto supone una protección frente a muc,os agentes anti#acterianos* colorantes, 1cidos biliares, antibiticos, en'imas 2p. ej., la liso'ima, que podría alcan'ar y atacar al P;3. /ecu"rdese que las porinas slo permiten el paso de sustancias hidrofílicas por debajo del tamaño especificado por el di1metro de los canales. J3 #ondiciona propiedades de superficie@ a3 grado de humedad 2humectabilidad3
b3 adhesividad c3 carga el"ctrica. D3 Es la estructura donde se fi"an los componentes del complemento 2sistema defensivo de los animales superiores que conduce a la insercin, en la membrana e(terna, de una serie de proteínas llamadas complejo de ataque a la membrana, que agujerea dicha membrana y ocasiona la lisis de la bacteria3. F3 #iertas proteínas y cadenas laterales del LP9 pueden ser lugares de adsorcin 2receptores espec6ficos3 de fagos y bacteriocinas. +3 Punto de anclaje del anillo e(terno 2-L3 del corp!sculo basal de los flagelos. J.+.J
EL E9P0#&5 PE/&PL9M
Entre la membrana e(terna y la membrana citopl1smica e(iste un compartimento acuoso bañando al peptidoglucano, denominado periplasma o espacio peripl%smico. El volumen de este compartimento puede llegar a representar un JGFW del volumen celular total. El contenido del periplasma 2el -gel peripl1smico3 incluye@ /:asa y fosfatasa, que digieren mol"culas que por sí mismas no pueden pasar al citoplasma. Penicilinasa@ degrada penicilina, evitando destruccin de P; proteínas de transporte de nutrientes 2p. ej., de maltosa3 proteínas de transporte de nutrientes 2p. ej., de maltosa3 proteínas de unin a estímulos químicos. En bacterias desnitrificantes y quimiolitoautotrofas, e(isten proteínas implicadas en el transporte de electrones. El periplasma cumple una función de osmorregulación@ El periplasma es una solucin densa, con alta concentracin de macromol"culas, y que participa en la regulacin de la osmolaridad celular frente a la tonicidad del medio e(terior. Para ello, e(iste en este espacio peripl1smico un oligosac%rido derivado de la mem#rana citopl%smica 25)M, o seg!n sus iniciales inglesas, M)53, a base de * unidades de `G)Gglucosa 2unidas entre sí por enlaces *J3 con sustituyentes 1cidos. En medios de alta osmolaridad 2por ejemplo, en los fluidos corporales3, disminuye la concentracin del oligosac1rido. En ambientes de baja osmolaridad 2p. ej., aguas fecales3, aumenta mucho la concentracin de dicha mol"cula. )e este modo, la presin de turgor del protoplasto se transmite contra el peptidoglucano, que como sabemos ya, es la estructura de la pared celular. que aguanta las variaciones de presin osmtica.
3 PAREDES DE LAS AR#UEAS
0unque las arqueas pueden comportarse como ;ramGpositivas o como ;ramG negativas, no se suele aludir a esto en este dominio de procariotas, ya que sus paredes tienen poco que ver con las de eubacterias. E(ceptuando el g"nero!hermoplasma, carente de pared celular, las dem1s arqueas poseen, por encima de la membrana citopl1smica, alg!n tipo de estructura con funciones de pared celular. En muchos casos las funciones de pared celular son ejercidas simplemente por una capa 9 paracristalina 2v"ase tema F3, a base de disposicin regular de subunidades id"nticas de una proteína o glucoproteína 2p. ej., Methanococcus$ Methanogenium3. /ecuerde que en ciertas arqueas de ambientes e(tremos, esta capa 9 est1 estabili'ada por factores de esos ambientes@ En el halfilo obligado 5alobacterium las subunidades de glucoproteína se estabili'an por altas concentraciones de in :a. En el termoacidfilo Sul,olobus la estabilidad la confieren los bajísimos pK. En Methanospirillum y en Methanothrix varias c"lulas, cada una con su capa 9, se encuentran englobadas por una vaina com!n, a base de proteínas y carbohidratos, con una estructura a base de anillos paralelos. En Methanosarcina y 5alococcus la capa 9 se encuentra rodeada de metanocondroitina, un polímero a base de :GacetilGgalactosamina, glucurnico, glucosa y manosa. 2Esta metanocondroitina es similar al condroitín sulfato presente en tejido conjuntivo de animales3. Hinalmente, los miembros del orden Methanobacteriales poseen una pared de pseudomure6na, un e(traño peptidoglucano no basado en :0M. #onsiste en un esqueleto de unidades repetitivas de :0; unidas por enlace `2*D3 con :GacetilG talosaminournico 2:04, un a'!car e(clusivo de estos organismos3. El grupo G:KJ del :04 va unido a su ve' con un tetrap"ptido, pero en "ste slo participan amino1cidos de la serie L. 0l igual que en la mureína de las eubacterias, las diversas cadenas se unen entre sí por enlaces peptídicos entre el amino1cido terminal 2F3 de un tetrap"ptido y el diamino1cido 2D3 de otra cadena.
BIBLIOGRAFÍA ARFC/& )E )7C/GA7N #094&LL5, H. y otros 2JD3@ El periplasma procariota. &nvestigacin y #iencia 32 2junio3@ >FG J. H&9#KE44&, %.E. 2*==*3@ Proteína estreptoccica M. &nv. y #iencia H9 2agosto3@ /&E49#KEL, E.4., K. 6/0)E 2*==J3@ Endoto(inas bacterianas. &nv. y #iencia 93@ *?GJF.
ARFC/& )E RE7&7N
HE/;O95:, 9.N. 2*==J3@ 4he periplasm. en -ProCaryotic structure and function@ a neB perspective. 9ociety for ;eneral Microbiology \ #ambridge Oniversity Press, pp.D**G DD=. K0:#5#7, /.E.. 2*==*3@ 6acterial outer membranes@ evolving concepts. 09M neBs ;H@ *>+G*J. K0:#5#K, /.E.., /. 9&EK:EL, :. M0/4&: 2*==3@ 5uter membrane proteins of #seudomonas. Molec. Microbiol. 4@ *?=G*>+. :&70&)5, K. 2*==?3@ 5uter membrane. En@ - )scherichia coli and Salmonella typhimurium. #ellular and molecular biology, JV edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#. 2*==?3, p1gs. >GJJ. 5L&%E/, ).6. 2*==?3@ Periplasm. En@ - )scherichia coli and Salmonella typhimurium. #ellular and molecular biology, JV edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#. 2*==?3, p1gs. G*D. P0/7, N.4. 2*==?3@ 4he murein sacculus. En@ - )scherichia coli and Salmonella typhimurium. #ellular and molecular biology, JV edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#. 2*==?3, p1gs. FG+>. /0E4Q, #./.K. 2*==3@ 6iochemistry of endoto(ins. 0nnu. /ev. 6iochem. ;9@ *J=G*>. 9#K&/ME/, 4., N.P. /59E:6O9#K 2*==*3@ ProCaryotic and euCaryotic porins. #urr. 5pin. 9truct. 6iol. @ +D=G+F+.
A+0:-0;, :
9-6,:7" 15 <66, 2&&
ÍNDICE( 1
INTRODUCCIÓN
2
BIOSÍNTESIS DEL PEPTIDOGLUCANO DE MUREÍNA
3
CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR
3.1
CRECIMIENTO DE LA PARED EN UNA BACTERIA GRAM>NEGATIVA : Escherichia coli ............................................................................................................. ..
3.2
CRECIMIENTO Y SEPTACIÓN EN UNA BACTERIA GRAM>POSITIVA(
Enterococcus faecalis
4
PROTOPLASTOS Y ESFEROPLASTOS
5
FORMAS L
BIBLIOGRAFÍA
1
INTRODUCCIÓN
En el capítulo anterior estudiamos la composicin química, estructura y funciones de los principales tipos de paredes celulares procariticas. En este capítulo trataremos un aspecto din1mico del tema de las paredes@ cmo se sinteti'a el peptidoglucano de las eubacterias, y cmo se produce el proceso general de crecimiento de la pared, incluyendo el evento particular de formacin del septo transversal que marca el -nacimiento de dos c"lulas hijas. :os concentraremos en la biosíntesis del peptidoglucano, debido a su inter"s intrínseco y aplicado 2sobre este proceso act!an diversos antibiticos, algunos de gran importancia clínica3. )esde el punto de vista topolgico, todas las capas de las envueltas bacterianas 2membranas, pared celular3 son superficies cerradas sobre sí mismas, físicamente continuas para mantener la integridad y viabilidad de la c"lula. Pero por otro lado, deben de ser susceptibles de e(pandirse durante el crecimiento por incorporacin de nuevos materiales. 0dem1s, todos los constituyentes deben crecer coordinadamente e incorporarse en los lugares precisos. Por ejemplo, en el caso de las bacterias ;ramGnegativas, distintos componentes deben de ir a parar a diferentes locali'aciones@ periplasma, P;, membrana e(terna, e incluso medio e(terior. )urante cada ciclo celular, hay una fase en la que los materiales de las envueltas 2y concretamente, de la pared celular que nos ocupa ahora3 deben de facilitar la divisin de la c"lula en una descendencia de dos c"lulas hijas. Hinalmente, queda el problema de la energía. Los procesos biosint"ticos requieren aporte de energía química, pero el 04P y compuestos similares no pueden salir del protoplasto. Precisamente en este capítulo vamos a ver algunas de las estrategias bioquímicas y moleculares que las bacterias han evolucionado para solventar estos puntos para el caso del peptidoglucano. %eremos que la estrategia implica varias fases@ 9íntesis de precursores en el citoplasma Ensamblaje parcial en membrana 4ransporte a la cara e(terna e(terna de la membrana Ensamblaje final en el e(terior, mediante reacciones que no precisan energía
2 BIOSÍNTESIS DEL PEPTIDOGLUCANO DE MUREÍNA #onsta de F etapas@ *. 9íntesis de precursores solubles en el citoplasma. J. Estos precursores son transferidos a un transportador lipídico situado en la membrana citopl1smica 2un poliisoprenol fosfatado llamado undecaprenilGfosfato3, donde se forman las unidades disacarídicas con el pentap"ptido. D. Las unidades disacarídicas se polimeri'an en cadenas lineales fuera de la membrana, pero a!n unidas al undecaprenilGfosfato de la membrana. F. Onin del polímero lineal así formado al peptidoglucano pree(istente en la pared celular, por entrecru'amiento de 2al menos3 parte de sus p"ptidos respectivos. 0 estas etapas hay que añadir una fase adicional de regeneracin del transportador lipídico, una ve' que ha cumplido su misin, para que pueda ser operativo en un nuevo ciclo de síntesis. %eamos, pues, en m1s detalle, cmo ocurre este interesante proceso@
'ase *. Los monosac1ridos que luego van a constituir la unidad disacarídica repetitiva del esqueleto del peptidoglucano 1NA+ ( NAG se activan al unirse a urid6n difosfato 1C)P. 2En general, los monosac1ridos que han de incorporarse a polímeros de pared celular bacteriana se activan mediante su unin con nuclesidosGfosfato.3 Por lo tanto, en esta fase se sinteti'an por separado@ :0;GO)P :0MGO)P Luego se va produciendo la adición secuencial ( ordenada de los distintos amino%cidos al :0M 2en reacciones que requieren energía e iones Mn3@ *. LGala J. )Gglu D. mG)0P 2u otro diamino1cido< p. ej. LGlys en Staphylococcus aureus3
F. )GalaG)Gala 5bservar que no se produce un tetrap"ptido, sino un pentapétido. El !ltimo paso de adicin de amino1cidos es la unin del dip"ptido )GalanilG)Galanina, que se ha sinteti'ado en dos fases@ una racemasa convierte la LGala a )Gala< creacin de enlace peptídico entre dos )Gala.
'ase 2* El O)PG:0MGpentap"ptido se transfiere ahora a un transportador de membrana, llamado undecaprenil=fosfato 2que abreviaremos como LipGP3, en una reaccin catali'ada por una translocasa específica. El undecaprenilGfosfato es un poliisoprenoide de ++ 1tomos de # 2#++, derivado de la repeticin ** veces de la unidad isoprenoide, con un fosfato terminal3. 9e le conoce tambi"n con el nombre de #actoprenol, pero hoy se sabe que no es e(clusivo de bacterias. El bactoprenol permite el transporte y ensamblaje de sustancias que, como los a'!cares, son hidrofílicas, y no podrían pasar por sí mismas la barrera hidrofbica de la membrana. Ona ve' que el :0MGpentap"tido est1 unido al undecaprenil 2por medio de pirofosfato3, una transferasa transfiere a "ste la :0; desde el O)PG:0;. 9e genera pues el enlace `2*F3 entre :0; y :0M. Por lo tanto, se obtiene@ LipGPGPG :0M2pentap"ptido3G:0;.
E* 7+0 7-+0-* 7 0*;, 7 86,;* :0 9,;-<-0-,*7 @ 0 7+;-09,7 * :0 7+6+60 K7-0 ;: PG. P,6 98:,( * Staphylococcus aureus : 68, >COOH ;: D>:+K9-, * 8,7--* =2? 7 09-;0;, =8070 0 >>CO>NH 2. P,6 ,+6, :0;," 7 -*+6,;* :,7 8*+7 88+;-,7" @ * : 07, ; 7+0 0+6-0 ,*7-7+* * *0 8*+0:--*0" @ 7 * 0: 68, 09-*, +69-*0: ; :0 L>L7 * 8,7--* =3?. T0*+, :0 +607:,070 ,9, :0 +60*7<6070 7+K :,0:-0;07 * : :0;, -+,8:K79-, ; :0 9960*0" ; 9,;, @ : 8667,6 L-8>P>P>NAM=8*+088+-;,?>NAG" * 7+ 9,9*+, 7+K ,:0*;, 0-0 : -+,8:0790" 0*:0;, 0 :0 :K9-*0 -*+6*0 ; :0 9960*0 0 +60/7 ; 0+,86*,:.
F/0, 3( P-+,:/* , /:/0 )/,0 0/*/:@*/0( A,60 : 0+,86*,: 7 ;0 :0 /:+0 * :0 9960*0 =*0 78- ; <:-8><:,8 ;7; :0 080 -*+6*0 07+0 :0 J+6*0?" ; 9,;, @ :,60 @ : 8667,6 67:+0*+ ; :0 <07 2 @; J87+, 0-0 : 9;-, 0,7, J+6-,6 0 :0 9960*0. E*+,*7 +-* :06 :0 8,:-96-0-* ; /06-07 *-;0;7 ;-7006;-07( ::, 7 :,60 * *0 60-* ; 8:/0+)*-0/*. C,*7-7+ * :0 *-* ; 0;0 *-;0; ;-7006;-0 =,* 7 8*+088+-;,? *-;0 0 7 678+-/, L-8>P>P" ,* : J+69, :-6 =6;+,6? ; *0 0;*0 86J-7+*+ @ 0 7 / 7+K *-;0 0 ,+60 9,::0 ; L-8>P>P.
En el proceso se libera uno de los LipGPGP 2o sea, el undecaprenil, pero en forma pirofosforilada3. 9obre este LipGPGP act!a una fosfatasa específica, que elimina el fosfato terminal, regener1ndose el undecaprenilGfosfato, que queda dispuesto para otro ciclo como el descrito.
'ase 4* El polímero surgido de la fase anterior es una cadena lineal de P; sin entrecru'ar, y unido a!n al transportador lipídico de membrana. 0hora este polímero naciente 2con sus pentap"ptidos3 reacciona, por transpeptidación, con un P; aceptor pree(istente. En esta reaccin se ven implicados el grupo #X5 de la )Gala 2F3 del P; naciente y el grupo G:KJ libre del diamino1cido 2D3 del P; aceptor 2o del !ltimo amino1cido del puente peptídico3. E7+, 7 :, 9-79, @ ;-6 @ : *:0 88+;-, *+6 D>0:0 =4? D>0:0 =5? ;: PG *0-*+ 7 / 77+-+-;, 8,6 ,+6, *:0 88+;-," *+6 ;-0 D>0:0 =4? : ;-09-*,K-;, ;: PG *0-*+.
La energía para esta reaccin la suministra la hidrlisis concomitante del enlace peptídico entre las dos )Gala terminales. Es decir, en cada reaccin de transpeptidacin se libera una )Gala, correspondiente a la que ocupaba la posicin 2+3. Ia dijimos en el capítulo anterior que no todos los tetrap"ptidos participan en entrecru'amientos. Las )Gala terminales 2en +3 de los p"ptidos no implicados en tales entrecru'amientos son eliminadas por una en'ima llamada )G)Gcarbo(ipeptidasa. Esta en'ima e(plica no slo que en el P; maduro e(istan tetrap"ptidos 2y no los pentap"ptidos originales3, sino tambi"n la e(istencia de trip"ptidos.
Muchas bacterias controlan el grado de entrecru'amiento de su P; maduro. &ncluso algunas pueden eliminar totalmente muchos de los p"ptidos originalmente unidos al :0M, mediante en'imas conocidas gen"ricamente con el nombre de autolisinas. 0sí por ejemplo, Micrococcus luteus Gun coco ;ramGpositivoG merced a su actividad :0MGLGalaGamidasa, presenta un P; que no est1 entrecru'ado en un +G>W.
Anti#ióticos -ue actan a nivel de la #ios6ntesis de peptidoglucano* Estos antibiticos tienen un efecto bactericida sobre bacterias en crecimiento. Ello se debe a que, al inhibir determinados pasos del ciclo de síntesis y ensamblaje del P;, provocan la acumulación de precursores de dic,o PG, lo que a su ve' desencadena la activación de las autolisinas de la bacteria, que degradan el P; y que finalmente provoca la lisis celular 2en medios hipotnicos3, por entrada masiva de agua a la c"lula. *. 'osfomicina@ act!a inhibiendo la formacin del DG5G)GlactilG"ter de la :0; 2o sea, del :0M3. Parece ser que la base molecular estriba en la semejan'a estructural entre el este antibitico y el PEP 2es decir, la fosfomicina es an1logo estructural del PEP, lo que lleva a la inactivacin de la en'ima correspondiente a esta reaccin3. J. icloserina@ 9e comporta como an1logo estructural de la )Galanina, por lo que inhibe la actuacin de la racemasa que convierte la LGala a )Gala, así como de la reaccin de unin de dos )Gala. D. unicamicina@ inhibe la traslocasa que cede el :0M unido hasta entonces al O)P y lo pasa al bactoprenol 2fase JV3. F. ancomicina ( ristocetina@ inhiben la segunda transglucosidacin 2fase DV3, es decir, la unin de diversas unidades disacarídicas. +. Dacitracina@ se une al undecaprenolGpirofosfato, bloqueando su desfosforilacin, e impidiendo por lo tanto, la regeneracin del transportador de membrana. ?. Anti#ióticos @=lact%micos 1p. e".* penicilinas5 cefalosporinas@ inhiben la reaccin de entrecru'amiento por transpeptidacin. /)studiaremos su mecanismo de accin en m9s detalle en el cap7tulo 1: sobre ;uimioter9picos y &ntibiticos2.
3 CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR #omo ya dijimos al comien'o de este tema, aunque la pared celular es una estructura cerrada y sin solucin de continuidad, debe permitir su e(pansin 2crecimiento3, y esto supone que se han de romper ciertos enlaces si se quiere que el nuevo material se ensamble con el pree(istente mediante nuevas uniones, es decir, debe e(istir una accin concertada de mureínGhidrolasas y de mureínGsintasas. Por otro lado, hay que tener en
cuenta que en el crecimiento de la pared celular se producen dos tipos de procesos@ la e(pansin 2aumento de tamaño3 de esa pared, y la formacin del tabique transversal en el centro de la c"lula. El crecimiento y septacin del peptidoglucano est1n basados en la actividad controlada y locali'ada en puntos determinados, de una gama de autolisinas, especialmente las dotadas de actividad transglucosidasa y]o transpeptidasa. )ebido a que estas en'imas son los sitios de accin de las penicilinas 2y otros antibiticos `Glact1micos3, se les conoce tambi"n con el nombre de PDP 2de penicillin4binding proteins< v"ase la tabla *3. 406L0 * #ropiedades de las #B#s de Escherichia coli PDP P6P *V, *6
NI moléculasJ célula Actividad en!im%tica conocida Posi#les funciones * cada una 4ransglucosilasa]transpeptidasa 9íntesis de P; durante la elongacin celular
P6P J
J
4ranspeptidasa
P6P D
+
P6P F
**
P6P +
*
4ransglucosidasa]transpeptidasa 9íntesis de P; durante la septacin 2tabique3 )G)Gendopeptidasa] Kidrlisis de los entrecru'amientos durante la elongacin )G)carbo(ipeptidasa )G)Gcarbo(ipeptidasa )estruccin del pentap"ptido no entrecru'ado
#recimiento de la forma bacilar
3.1 CRECIMIENTO DE LA PARED EN UNA BACTERIA GRAMNEGATIVA : Escherichia coli El crecimiento de la pared en ). coli se puede considerar dividido en dos fases@ *. #recimiento en longitud 2elongacin3, mientras la c"lula crece en tamaño. J. Produccin del tabique transversal 2septacin3, que conduce a la formacin de dos c"lulas hijas.
Elongación Las PDPs son las encargadas de la elongacin de las cadenas de P; naciente 2por transglucosidacin de las unidades disacarídicas3 y simult1neamente, por transpeptidacin, logran el entrecru'amiento. Las cadenas nacientes del P; se intercalan en la parte cilíndrica del s1culo de P; gracias a que las PDP4 ( PDP; cortan enlaces del P; pree(istente. La PDP2 interviene aquí tambi"n para transpeptidacin. La cadena de P; se va elongando unidireccionalmente
alrededor de la circunferencia de la c"lula. 9e calcula que e(isten unos J sitios de insercin de nuevo material en cada c"lula, dispersos de forma m1s o menos uniforme por toda la superficie de la c"lula. La maquinaria biosint"tica tarda minutos en completar cada circunferencia de elongacin.
'ormación del ta#i-ue transversal La divisin de la bacteria por fisin binaria sim"trica se logra por medio de una invaginacin circular de las envueltas 2membrana citopl1smica y peptidoglucano3 en mitad de la c"lula madre. En el inicio de este proceso tiene un papel esencial la proteína HtsQ, y m1s tarde intervienen otras proteínas Hts.
'tsK es una proteína imprescindible, presente tanto en eubacterias como en arqueas, que muestra parecido con las tubulinas eucariticas. 0l parecer, al igual que las tubulinas, la HtsQ se une a ;4P, con lo que se promueve su polimeri'acin. 6ajo control del ciclo celular, la HtsQ se ensambla poco antes de la divisin en el centro de la c"lula, formando un -anillo citocin"tico en el lado citopl1smico de la membrana celular. E(isten indicios fuertes de que la formacin de este anillo de HtsQ señali'a el sitio por donde se producir1 la divisin y se activar1 el crecimiento del peptidoglucano del tabique transversal. Ona ve' que HtsQ ocupa el lugar del futuro septo, entran en accin otras proteínas Hts, formando un complejo llamado Ldivisoma0. E* :07 <,+,60<07 0 9-6,7,8-, :+6*-, 7 / 9, 0, :0 -*/0-*0-* ; 9960*0 @ ,*7+-+ :0 0/0*0;-::0 ;: 78+," 7 :,0:-0* :07 9,::07 ; F+7Q. La hiptesis señala que los polímeros de HtsQ se van -contrayendo, de modo que -tiran de las envueltas hacia el interior, provocando la típica invaginacin alrededor del centro del bacilo, y que simult1neamente, la HtsQ provoca la activacin de la PDP3 1'ts7, que es una transglucosidasa]transpeptidasa específica del tabique transversal. 0 microscopio electrnico se observa que este tabique est1 formado por dos l1minas de P; 2densas a los electrones3 separadas entre sí por otra transparente. El final de la divisin ocurre como consecuencia de la invaginacin de la membrana e(terna entre las dos l1minas de P;. #mo se ensambla la membrana e(terna con relacin al P;[ Parece ser que esta membrana se ensambla en buena medida por procesos espont1neos guiados por interacciones entre el LP9 y proteínas, sirviendo el P; subyacente como andamio que facilita el montaje de toda la estructura. Parece ser que las 'onas de adhesin 2junturas de 6ayer3 son importantes para la correcta colocacin de LP9 y proteínas de la membrana e(terna.
3.2 CRECIMIENTO Y SEPTACIÓN EN UNA BACTERIA GRAMPOSITIVA( Enterococcus faecalis 0 diferencia de lo visto en ). coli, en el enterococo 2 )nterococcus ,aecalis3 el crecimiento del P; no es difuso, sino !onal, comen'ando en el centro 2'ona ecuatorial3 y avan'ando hacia afuera. %"ase en la figura el e(perimento de marcado de pared celular con anticuerpos fluorescentes, con ulterior seguimiento del marcaje al microscopio@ tras unos *+ minutos despu"s del marcado se observa que e(iste una banda ecuatorial oscura 2no marcada, por lo tanto est1 constituida por material nuevo reci"n insertado3, mientras que los polos de las c"lulas siguen enteramente marcados. 4ras D o ? minutos observamos c"lulas enteramente sin marcar, intercaladas entre c"lulas con uno de sus polos marcados. El proceso se puede describir así@ *. En la c"lula adulta antes de la divisin aparece una banda ecuatorial donde la pared celular se hace m1s gruesa.
J. )ebajo de esta 'ona engrosada 2hacia el interior del citoplasma3 se va depositando nuevo material, lo que marca el inicio de la formacin del tabique transversal. Enseguida aparece una muesca en la banda ecuatorial. D. El tabique, con un grosor doble al de la pared celular de la superficie celular, sigue avan'ando, hasta que... F. ... se completa. 9imult1neamente a los pasos D y F la 'ona de nueva síntesis de P.#. superficial alcan'a el ecuador de las cel!las hijas nacientes. +. El tabique completo de doble grosor va siendo escindido en dos mitades desde el e(terior hacia el centro, por accin de autolisinas. )e esta forma se le adjudica a cada c"lula hija la nueva pared correspondiente a uno de sus polos 2el otro procede, intacto, de la c"lula madre3. %"ase igualmente la figura que muestra en m1s detalle la formacin del tabique. La idea que se saca del proceso en esta bacteria es que posee una sola 'ona de crecimiento de P;, con dos regiones de deposicin de nuevo material@ la regin del tabique transversal propiamente dicho, y la regin adyacente, ya en la superficie celular, responsable de la e(pansin de la pared perif"rica, a ambos lados del tabique.
4 PROTOPLASTOS Y ESFEROPLASTOS Mediante procedimientos de laboratario se puede lograr eliminar total o parcialmente la pared celular bacteriana. 9e denominan protoplastos las c"lulas bacterianas a las que se ha desprovisto totalmente de pared celular, mientras que esferoplastos son aquellas c"lulas bacterianas que poseen restos de pared.
#tención. E(isten dos posibles m"todos alternativos@ *. Por destruccin del entramado del P; mediante en'imas líticas 2liso'ima, peptidasas3. En el caso de bacterias ;ramGnegativas, previamente hay que desorgani'ar la membrana e(terna para hacerla permeable a estas en'imas. Ello se logra usando el quelante E)40 y]o sometiendo las c"lulas a bajas temperaturas. J. Por inhibicin de la formacin de nuevo P; en las c"lulas en crecimiento, trat1ndolas p. ej., con penicilina. 9i se parte de un mutante au(otrofo para un componente del P; basta hacer crecer a la bacteria en un medio carente de dicho componente. Estos m"todos permiten@ en el caso de ;ramGpositivas, la desorgani'acin total de su pared, por lo que se obtienen protoplastos<
en el caso de las ;ramGnegativas, quedan restos de membrana e(terna y de peptidoglucano atrapados en ella, por lo que se obtienen esferoplastos. En ambos casos, protoplastos y esferoplastos pueden revertir a la forma normal eliminando el tratamiento 2retirando la liso'ima, o la penicilina3.
Los protoplastos son osmticamente sensibles@ E* * 9;-, -8,+*-," 7+0::0* =:-7-7 ,79+-0? E* * 9;-, -7,> , -86+*-, 7 90*+-**.
Protoplastos y esferoplastos son formas osmóticamente sensi#les debido precisamente a que al no e(istir o estar desorgani'ado parcialmente el P;, ya no se pueden contrarrestar las fuer'as de presin osmtica e(istentes en los medios hipotnicos en que normalmente se cultivan o suspenden las bacterias. Por lo tanto, si se quieren obtener suspensiones estables de estas formas, hay que obtenerlas en medios o soluciones isotónicos o ligeramente ,ipertónicos, para evitar su lisis@ soluciones de :a#l ,J+G,+ M< sorbitol o sacarosa ,*G,+ M< polietil"nglicol 2PE;3 al >,+W. En estos medios los protoplastos y esferoplastos poseen formas esf"ricas, independientemente de la forma que tuviera la bacteria con pared de que proceden. 9e emplean en varios aspectos de investigacin b1sica@ m"todo suave para luego obtener e(tractos libres de c"lulas y fracciones subcelulares. en algunas bacterias, m"todo para hacerlas permeables al 0):, en e(perimentos de
transformacin gen"tica. para reali'ar fusin entre protoplastos de diferentes cepas de la misma especie e incluso entre especies distintas. 9e trata de un m"todo de obtencin de -recombinantes som1ticos usado para determinados estudios gen"ticos en bacterias que no tengan sistemas naturales de transferencia gen"tica.
5 FORMAS L 9on c"lulas bacterianas carentes total o casi totalmente de P.#., con formas pleomrficas, irregulares y globulares, que se producen de forma espont1nea en algunas especies bacterianas 2p. ej., Streptobacillus monili,ormis3 cuando se cultivan en medios a base de suero 2que son hipertnicos3. Las colonias de las formas L naturales son muy características@ en -huevo frito, bif1sicas. 9e pueden obtener de forma inducida formas L en diversas bacterias ;ramGpositivas y ;ramGnegativas, trat1ndolas con penicilina en medios hipertnicos. Las formas L inestables se generan por tratamientos breves, y pueden revertir con frecuencia a la forma normal con pared. Poseen algo de P;, aunque "ste se encuentra alterado respecto al P; de la c"lula normal. Las formas L estables se producen por tratamientos m1s prolongados, y no suelen revertir al tipo normal. La mayoría carecen totalmente de peptidoglucano. 0sí pues, en las formas L el peptidoglucano ha sido eliminado total o parcialmente, pero de manera que ya no puede servir de aceptor de nuevo P;.
BIBLIOGRAFÍA APFC/& )E /7DR& )E RE'EREN7A %0Q8OEQ, ). 2*=?3@ 6iosíntesis del peptidoglucano@ mecanismos de accin y selectividad de los antibiticos inhibidores. En@ 6ioquímica y 6iología Molecular 2#oordinador@ L. #ornudella3. 9alvat, 6arcelona, p1gs. *DDG*F. K&4E, ). 2*==+3@ -4he physiology and biochemistry of ProCaryotes. 5(ford Oniversity Press, :ueva IorC y 5(ford. #onsultar el capítulo *.
ARFC/& )E RE7&7N
7E::E)I, E.P. 2*==?3@ MembraneGderived oligosaccharides. En@ - )scherichia coli and Salmonella typhimurium. #ellular and molecular biology, JV edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#. 2*==?3, p1gs. *?FG*>*. LO47E:K0O9, L. 2*==D3@ HtsQ ring in bacterial cytoCinesis. Mol. Microbiol. 9* FDGF=. LO47E:K0O9, N., 0. MO7KEEE/NEE 2*==?3@ #ell division. En@ - )scherichia coli and Salmonella typhimurium. #ellular and molecular biology, JV edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#. 2*==?3, p1gs. *?*+G*?J+. :0::&:;0, :. 2*==*3@ #ell division and peptidoglycan assembly in )scherichia coli. Mol. Microbiol. ;* >=*.>=+. :0::&:;0, :., H.6. &E:4NE9, E. MOL)E/, #.L. 5L)/&:;K 2*==J3@ Envelope groBth in )scherichia coli. 9patial and temporal organi'ation. En ProCaryotic structure and function@ a neB perspective. 9ociety for ;eneral Microbiology \ #ambridge Oniversity Press, #ambridge, pp. *+GJJ*. /0E4Q, #K./.K. 2*==?3 6acterial lipopolysaccharides@ a remarCable family of bioactive macroamphiphiles. En@ - )scherichia coli and Salmonella typhimurium. #ellular and molecular biology, JV edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#. 2*==?3, p1gs. *D+G*?D. %0: KE&NE:55/4, N. 2*==?3@ Murein synthesis. En@ - )scherichia coli and Salmonella typhimurium. #ellular and molecular biology, JV edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#. 2*==?3, p1gs. *J+G*DF. %&#E:4E, M., N. E//&:;45: 2*==?3@ 9truture, function and controls in microbial division. Mol. Microbiol. 2M* *G>. %&:ELL0, )., P. 65OL5#, /. )U0/& 2*==D3@ ;4Pase enters the ring. #urr. 6iol. 3* ?+G ??.
A+0:-0;, :
9-6,:7" 15 <66, 2&&
ÍNDICE( 1 1.1 1.1.1
MEMBRANA CITOPLÁSMICA COMPOSICIÓN #UÍMICA CARENCIA" EN GENERAL" DE ESTEROLES
1.1.2
LÍPIDOS
1.1.3
PROTEÍNAS
1.2
ESTRUCTURA
1.3
FUNCIONES DE LA MEMBRANA CITOPLASMICA
1.3.1
PARTICIPACIÓN EN PROCESOS BIOENERGÉTICOS
1.3.2 PARTICIPACIÓN EN BIOSÍNTESIS DE POLÍMEROS DE LAS ENVUETAS 1.3.3 PUNTO DE ANCLA'E DEL CROMOSOMA Y DE ALGUNOS PLÁSMIDOS 1.3.4
BARRERA SELECTIVA
1.3.5
EPORTACIÓN DE MOLÉCULAS DE SUPERFICIE
2
TRANSPORTE DE NUTRIENTES
2.1
TRANSPORTE PASIVO INESPECÍFICO O DIFUSIÓN SIMPLE
2.2
TRANSPORTE PASIVO ESPECÍFICO O DIFUSIÓN FACILITADA
2.3
TRANSPORTE ACTIVO
2.3.1
TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE PROTONES
2.3.2
TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE IONES SODIO
2.3.3
TRANSPORTE ACTIVO DIRIGIDO POR ATP
2.3.4
TRANSPORTE ACOPLADO A TRANSLOCACION DE GRUPOS
2.4 3
TRANSPORTE DE HIERRO ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS INTRACITOPLÁSMICAS
3.1
MESOSOMAS
3.2
CROMATÓFOROS
3.3
OTRAS INVAGINACIONES
3.4
TILACOIDES
BIBLIOGRAFÍA ENLACES
1 MEMBRANA CITOPLÁSMICA 1.1 COMPOSICIÓN #UÍMICA La membrana citopl1smica bacteriana es la estructura de tipo bicapa proteoGlipídica que delimita al protoplasto. 9u proporcin proteínas@ lípidos es superior a la de las membranas celulares eucariticas, llegando a alcan'ar valores relativos de @J.
1.1.1 CARENCIA" EN GENERAL" DE ESTEROLES Las membranas procariticas, a diferencia de las de eucariotas, carecen de esteroles 2con las salvedades de #ianobacterias, ciertas bacterias metilotrofas< adem1s, los micoplasmas presentan colesterol, pero lo -secuestran de las c"lulas eucariticas a las que parasitan3. Pero en cambio, en muchas bacterias e(iste una peculiar clase de compuestos policíclicos, denominados ,opanoides 2triterpenoides pentacíclicos3 que parecen condicionar parte de la rigide' de las membranas citopl1smicas. Los hopanoides se sinteti'an a partir del mismo tipo de precursores que los esteroles. 2Por cierto, como dato curioso diremos que los sedimentos de combustibles fsiles como el petrleo presentan cantidades gigantescas de hopanoides, lo que confirma el papel que tuvieron las bacterias en su formacin3.
1.1.2 LÍPIDOS 0bundan sobre todo los fosfol6pidos derivados del 1cido fosfatídico@ fosfatidiletanolamina fosfatidilglicerol cardiolipina 2difosfatidilglicerol3 En bacterias ;ramGpositivas, adem1s se encuentran glucol6pidos y glucofosfol6pidos. La composicin y proporcin concretas de los distintos tipos de lípidos son variables entre distintas cepas bacterianas, y dentro de cada cepa, en funcin de las condiciones de cultivo 2temperatura, pK, etc.3.
Los 1cidos grasos esterificados con el glicerol en los fosfolípidos son principalmente@ *3 saturados, como p. ej.@ a3 palmítico 2*?@3 b3 mirístico 2*F@3 c3 de cadena ramificada 2muy frecuentes en muchas bacterias ;ramGpositivas3 J3 monoinsaturados 2sobre todo en ;ramGnegativas3, como p. ej.@ a3 palmitoleico 2cisG=, *?@*3 b3 cisGvacc"nico 2cisG**, *@*3 0 diferencia de eucariotas, no e(isten 1cidos grasos poliinsaturados, con la e(cepcin de las #ianobacterias. Este grupo de bacterias fotosint"ticas tiene, adem1s, la capacidad de modificar mediante desaturasas el grado de saturacin de sus 1cidos grasos, lo que representa un mecanismo adaptativo frente a cambios de temperatura. Las bacterias pueden modificar la proporción entre %cidos grasos insaturados ( saturados, con objeto de mantener un estado de fluide' adecuado en la membrana, como adaptacin a cambios de temperatura@ a altas temperaturas, aumenta la proporcin de 1cidos grasos saturados, a bajas, aumenta la de los insaturados. Las bacterias psicrfilas 2amantes del frío3 presentan casi todos sus 1cidos grasos de tipo insaturado. En 0rqueas, en lugar de los habituales lípidos a base de "steres de 1cidos grasos con glicerol, e(isten l6pidos a #ase de éteres de alco,oles de cadena larga con glicerol 2p. ej., difitanilGglicerolGdi"teres3. Los alcoholes suelen ser derivados poliisoprenoides. Este tipo de membranas son m1s rígidas que las de eubacterias. &ncluso e(isten arqueas con membranas a partir de tetrafitanilGdiglicerolGtetra"tereres, que consituyen bicapas monomoleculares. #omo ya vimos en el tema anterior, la membrana citopl1smica alberga un transportador lipídico de tipo politerpenoide, llamado undecaprenil=fosfato, presente en pequeña cantidad 2*W3. &gualmente se dan -uinonas isoprenoides 2como la menaquinona o la ubiquinona3 que, como veremos en otro capítulo, participan en cadenas de transporte de electrones. En algunas bacterias e(isten igualmente variedades de pigmentos carotenoides.
1.1.3 PROTEÍNAS
#onstituyen la mayor parte de la membrana bacteriana 2hasta el W en peso seco3. E(iste una gran variedad de tipos de proteínas en una misma bacteria 2hasta J3, pero la composicin y proporcin concreta varía seg!n las condiciones de cultivo. 9eg!n su locali'acin en la membrana, y su grado de unin con la porcin lipídica, se distingue entre@
prote6nas integrales de mem#rana 1endoprote6nas@ son proteínas estrechamente unidas a la membrana, por lo general atravesadas en plena bicapa lipídica. 9on difíciles de e(traer, teni"ndose que recurrir a detergentes y]o disolventes org1nicos para separarlas respecto de los lípidos. Las proteínas integrales pueden despla'arse lateralmente en la bicapa lipídica, pero no son capaces de rotar, por lo que siempre presentan una determinada orientacin o polaridad. 0lgunas presentan hidratos de carbono que sobresalen hacia la superficie e(terna 2glucoproteínas3. Prote6nas periféricas 1 epiprote6nas@ unidas a la superficie de la membrana, de forma m1s d"bil, por lo que son m1s f1ciles de e(traer y purificar. &ncluso algunas establecen contactos slo transitorios con la membrana.
1.2 ESTRUCTURA
+étodos de o#servación ( estudio 0 microscopio ptico, se recurre a la tincin con 0'ul %ictoria. 0 microscopio electrnico, en cortes ultrafinos, se observan una estructura de unos > nm de grosor, con dos capas e(ternas densas a los electrones limitando una capa central transparente. Los estudios mediante difraccin de rayos $ y de resonancia magn"tica nuclear 2/M:3 demuestran una estructuracin b1sica a base de cadenas de fosfolípidos en una bicapa, seg!n se describe a continuacin.
Estructura #onsiste en una bicapa lipídica, con los grupos polares 2hidrfilos3 hacia afuera, y las cadenas hidrofbicas de 1cidos grasos 2o, en el caso de 0rqueobacterias, de alcoholes3 hacia adentro, ajust1ndose al modelo de mosaico fluido de 9inger y :icholson. &nmersas en esta bicapa se encuentran las abundantes proteínas, que pueden moverse lateralmente en el mosaico de mol"culas de lípidos, igualmente dotados de una r1pida movilidad. Parece ser que no e(iste movilidad de lípidos entre las dos capas. La membrana citopl1smica es asim"trica 2aunque no tanto como la membrana e(terna de ;ramGnegativas3. Esto se traduce en el hecho de que muchos de los procesos que tienen lugar en la membrana sean vectoriales 2tengan una direccin determinada3.
1.3 FUNCIONES DE LA MEMBRANA CITOPLASMICA La membrana citopl1smica de los procariotas es una notable estructura multifuncional 2como uno podría esperar de la constatacin del gran n!mero de tipos de proteínas3, siendo el sitio donde se producen muchos procesos metablicos complejos, en un grado desconocido en el resto del mundo vivo. #itemos brevemente las principales funciones de la membrana procaritica 2aunque en este y otros temas las estudiaremos en detalle3@
Darrera osmótica 2que mantiene constante el medio interno3, impidiendo el paso libre de sales y de compuestos org1nicos polares Es el l6mite meta#ólicamente activo de la célula@ establece la frontera entre el protoplasto y el medio e(terno, impidiendo la p"rdida de metabolitos y macromol"culas del protoplasto. 0hora bien, merced a sistemas de transporte, permite selectivamente el paso de sustancias entre el e(terior y el interior 2y viceversa3. &nterviene, adem1s, en procesos #ioenergéticos 2fotosíntesis, respiracin3 Participa en la #ios6ntesis de componentes de mem#rana5 de pared ( de c%psulas, En la secreción de prote6nas.
)esglosaremos brevemente estos diversos tipos de papeles de la membrana.
1.3.1 PARTICIPACIÓN EN PROCESOS BIOENERGÉTICOS #ontiene todos los componentes requeridos para la transduccin de energía y la produccin de 04P, por procesos respiratorios. En el caso de una bacteria quimiotrofa, esto incluye@ deshidrogenasas cadenas de transporte de electrones 2con quinonas, citocromos, etc.3 04PGasas 204P sintasas]hidrolasas3 0lgunas bacterias fotosint"ticas anaerobias tambi"n incluyen este tipo de componentes en la membrana citopl1smica. En un capítulo posterior veremos en m1s detalle cmo e(plica la teoría quimiosmtica de Mitchell el acoplamiento entre el funcionamiento de las cadenas de transporte electrnico 2o de la 04PGhidrolasa3 y la generacin de un gradiente de protones a trav"s de la membrana 2potencial electroquímico o fuer'a protnGmotri'3, el cual a su ve' puede@ generar 04P 2desarrollo de un trabajo químico3 promover transporte de ciertos nutrientes 2trabajo osmtico3 promover movimiento flagelar 2trabajo mec1nico3.
1.3.2 PARTICIPACIÓN EN BIOSÍNTESIS DE POLÍMEROS DE LAS ENVUETAS #omo ya hemos visto en temas anteriores, la membrana alberga transportadores 2como el undecaprenilGP3 y en'imas relacionados con fases de la biosíntesis de polisac1ridos de la c1psula, peptidoglucano, 1cidos teicoicos y teicurnicos y lipopolisac1rido. &gualmente en ella se locali'an los en'imas implicados en la síntesis de los lípidos de la propia membrana.
1.3.3 PUNTO DE ANCLA'E DEL CROMOSOMA Y DE ALGUNOS PLÁSMIDOS #omo veremos, sigue estando debatido si un tipo de invaginacin de la membrana, llamado mesosoma 2ver m1s adelante, en este capítulo, apartado D.*3 es o no un artefacto, pero parece fuera de duda que el cromosoma se ancla de alguna manera a la cara interna de la membrana 2sea a los mesosomas, o como proponen otros, a la cara interna de los anillos peris"pticos3. En la 'ona de anclaje parecen residir algunos de los en'imas encargado de la replicacin. La membrana tiene igualmente un papel en la separacin 2segregacin3 de las dos copias del cromosoma replicado a las c"lulas hijas.
1.3.4 BARRERA SELECTIVA
Mantiene la constancia del medio interno 2impidiendo la salida de iones, metabolitos y macromol"culas3, pero simult1neamente permite o promueve activamente la entrada de nutrientes ( la salida de los productos de desec,o o de ciertas moléculas e$cretadas. La funcin de transporte de nutrientes ser1 tratada en detalle m1s adelante en este capítulo.
1.3.5 EPORTACIÓN DE MOLÉCULAS DE SUPERFICIE 9e trata de un sistema por el que ciertas proteínas son trasladadas a su locali'acin definitiva en la membrana citopl1smica, por la intervencin de la proteína Iid#, que interacciona con 'onas hidrofbicas de aquellas. On ejemplo de proteínas insertadas de este modo lo constituye la 04PGsintasa de eubacterias. Este sistema, al parecer filogen"ticamente primitivo, aparece en eubacterias, parte de arqueas 2euriarqueas3 y en mitocondrias 2donde se denomina 5(a*3 y cloroplastos 20lbD3, pero no en eucariotas. 2> SISTEMA S,*
El sistema 9ec es un sistema universal para la secrecin de proteínas, es decir, aparece en los tres dominios de la vida, aunque con variantes en cada uno de ellos. :osotros vamos a describir el caso de las eubacterias. Las proteínas secretadas se sinteti'an como preGproteínas dotadas en el e(tremo :G terminal de un p"ptido señal, de unos JGD amino1cidos. )icha 'ona consta a su ve' de un e(tremo :Gterminal cargado positivamente, seguida de un trecho hidrofbico, y termina con una 'ona m1s polar dotada al final del sitio que va a ser roto por la peptidasa del líder. #uando a!n est1 en el citoplasma, la preGproteína naciente se une a la proteína 9ec6 2una chaperona específica de esta ruta3, la cual impide que la preGproteína se pliegue totalmente. La proteína 9ec0, que forma un homodímero, reconoce el complejo 9ec6Gpreproteína, y lo traslada al complejo de proteínas de membrana 9ecIE;, que tiene un canal interior de unos JGD . 20l parecer el canal consta de DGF complejos 9ecIE;3. 0hora, la proteína 9ec0, con gasto de 04P, logra que los primeros JGD amino1cidos de la preGproteína entren a trav"s del canal 9ec, con lo que el p"ptido señal aparece por el lado e(terior de la membrana. Ona ve' que el p"ptido señal asoma por el otro lado de la membrana, es cortado en el sitio específico por la peptidasa líder, lo que ayuda a liberar al e(terior la parte madura de la proteína secretada. 3> SISTEMA SRP
El sistema 9/P procaritico es mucho m1s sencillo que el homlogo 9/P que se encuentra en la membrana del retículo endopl1smico de eucariotas. En este sistema, el e(tremo :G terminal de la proteína naciente es reconocido por la partícula de reconocimiento de señal, conocida por sus siglas 9/P. La 9/P eubacteriana consta de un pequeño 0/: y una proteína 2Hfh3.
Ona ve' que la 9/P reconoce el e(tremo :Gterminal de la proteína naciente, parece que provoca la detencin moment1nea de la traduccin, y conduce a esa proteína naciente hasta el receptor de la partícula 9/P 29/3, a nivel de membrana citopl1smica. 0 su ve' esto provoca la interaccin del p"ptido naciente con el complejo 9ec, que ser1 el que logre la secrecin o insercin en membrana de la proteína madura. 4> SISTEMA T/8
Este sistema se ha empe'ado a caracteri'ar recientemente, y solo se ha descubierto en procariotas y en cloroplastos, pero no en mitocondrias ni en eucariotas. 9e caracteri'a por trasladar al e(terior 2o al espacio peripl1smico de ;ramGnegativas3 proteínas ya en su con,iguracin nativa, y en su caso, dotadas ya de sus cofactores 2grupos He9, molibdopterina, cofactores nucleotídicos, etc.3. Es decir, a diferencia de los anteriores, las proteínas se pliegan ]y en su caso adquieren los cofactores3 antes de ser trasladadas. Este sistema se llama 4at debido a que reconoce una secuencia señal en la que e(isten dos argininas -gemelas 2una a continuacin de otra,
2 TRANSPORTE DE NUTRIENTES Lo primero que tiene que hacer un microorganismo a la hora de su nutricin es captar los nutrientes que necesite desde el medio e(terior. )ebido a que la bicapapa lipídica act!a como barrera que impide el paso de la mayor parte de las sustancias, esto significa que deben e(istir mecanismos específicos para lograr la entrada de los nutrientes. 0dem1s, teniendo en cuenta que las bacterias suelen vivir en medios diluidos, deben reali'ar un -trabajo para trasladar muchos de esos nutrientes en contra del gradiente de concentracin. 4radicionalmente se viene considerando tres m"todos principales de transporte de sustancias a trav"s de la membrana@ transporte pasivo inespecífico 2X difusin simple3< transporte pasivo específico 2X difusin facilitada3< transporte activo. #omo veremos, los m1s importantes en procariotas son los sistemas de transporte activo.
2.1 TRANSPORTE PASIVO INESPECÍFICO O DIFUSIÓN SIMPLE Este transporte consiste en la difusin pasiva de ciertas sustancias para las que la membrana es impermeable, debido a la diferencia de concentracin 2#3 a ambos lados de
dicha membrana 2la sustancia tiene mayor concentracin fuera que dentro de la c"lula3. 0parte de esta diferencia de concentracin, en la difusin pasiva influyen@ la constante de permeabilidad 2P3, es decir, el grado de permeabilidad de la membrana a la sustancia en cuestin< el 1rea o superficie total 203 a trav"s de la que se produce el transporte. Las membranas citopl1smicas son impermeables en sí mismas a la mayor parte de las mol"culas. 9lo se da en el caso de 5J, #5J, :KD, agua y otras pequeñas sustancias polares no ioni'adas. La difusin simple se produce por el paso de estas sustancias a trav"s de poros inespecíficos de la membrana citopl1smica.
2.2 TRANSPORTE PASIVO ESPECÍFICO O DIFUSIÓN FACILITADA Es un proceso que permite el paso de compuestos por difusin a trav"s de transportadores estereoespecíficos y 2al igual que en el caso anterior3 sobre la base de un gradiente de concentracin 2en la direccin termodin1micamente favorable3. El transportador suele ser una proteína integral de membrana 2permeasa o facilitador3, cuya conformacin determina un canal interior, y por el cual un determinado sustrato puede alcan'ar el interior, sin gasto de energía. 9e piensa que cuando el soluto se une a la parte de la permeasa que da al e(terior, esta proteína sufre un cambio conformacional que libera la mol"cula en el interior. #omo al entrar la mol"cula, enseguida entra en el metabolismo y desaparece como tal, esto basta para mantener el gradiente de concentracin que permite esta difusin. La difusin facilitada e(hibe propiedades similares a las de las reacciones en'im1ticas@ Especificidad de sustrato@ cada permeasa transporte un solo tipo de sustratos químicamente parecidos. #in"tica de saturacin de tipo MichaelisGMenten, es decir, la velocidad de transporte aumenta con la concentracin de sustrato, hasta un valor límite 2%ma(3 por encima del cual ulteriores aumentos del soluto no aumentan dicha velocidad 2debido a que todas las porinas disponibles est1n ya totalmente ocupadas3@ %elocidad de entrada@ %ent X %m1( k9e(t ]7 m k9e(t %elocidad de salida@ %sal X %m1( k9int ]7 m k9int 0unque este sistema de transporte es muy com!n en eucariotas, es muy raro encontrarlo en bacterias. La e(plicacin evolutiva es que los procariotas suelen vivir en ambientes con pocas concentraciones de nutrientes, y por lo tanto no es frecuente que se den gradientes adecuados. Ona de las pocas e(cepciones la constituye el glicerol, que es
transportado por difusin facilitada en una amplia gama de bacterias, tanto ;ramGpositivas como ;ramGnegativas. #onforme el glicerol entra, es r1pidamente convertido a glicerolG fosfato< por lo tanto, la concentracin interna de glicerol como tal es pr1cticamente nula, lo que facilita esta difusin incluso a bajas concentraciones e(teriores de esta sustancia. En >ymomonas e(iste un facilitador de membrana que transporta glucosa.
2.3 TRANSPORTE ACTIVO #onsiste en el transporte de sustancias en contra de un gradiente de concentración, lo que requiere un gasto energético. En la mayor parte de los casos este transporte activo 2que supone un trabajo osmtico3 se reali'a
a e$pensas de un gradiente de O 1potencial electro-u6mico de protones previamente creado a ambos lados de la membrana, por procesos de respiracin y fotosíntesis< por hidrlisis de AP. Los sistemas de transporte activo son los m1s abundantes entre las bacterias, y se han seleccionado evolutivamente debido a que en sus medios naturales la mayoría de los procariotas se encuentran de forma permanente o transitoria con una baja concentracin de nutrientes.
Los sistemas de transporte activo est1n basados en permeasas específicas e induci#les. El modo en que se acopla la energía metablica con el transporte del soluto a!n no est1 dilucidado, pero en general se maneja la hiptesis de que las permeasas, una ve' captado el sustrato con gran afinidad, e(perimentan un cambio conformacional dependiente de energía que les hace perder dicha afinidad, lo que supone la liberacin de la sustancia al interior celular. Estudiaremos los siguientes tipos de transporte activo@ transporte activo ligado a simporte de protones< transporte activo ligado a simporte de iones :a transporte activo dirigido por 04P transporte acoplado a translocacin de grupos.
2.3.1 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE PROTONES #omo se recordar1, el simporte se puede definir como el transporte simult1neo de dos sustratos en la misma direccin, por un mismo transportador sencillo. En el caso del transporte activo ligado a simporte de protones, lo que ocurre es que uno de los sustratos 2K3 ha creado previamente un gradiente de concentracin, cuya disipacin es aprovechada por el otro sustrato para entrar con "l. Este otro sustrato puede ser@ una mol"cula de carga negativa@ en este caso, su simporte ligado a protones tiende a disipar slo el gradiente de concentracin. Ejemplos@ transporte de iones fosfato, de glutamato, etc. una mol"cula neutra@ en este caso, su simporte tiende a disipar no slo el gradiente de concentracin, sino tambi"n el gradiente el"ctrico. Ejemplo@ en )scherichia coli, la lactosa usa una `GgalactsidoGpermeasa, que es una de las permeasas bacterianas m1s intensamente estudiadas. Por otro lado, ciertas mol"culas catinicas 2iones 7 , lisina3, son transportadas directamente a trav"s de permeasas, en ausencia de simporte de protones.
2.3.2 TRANSPORTE ACTIVO LIGADO A SIMPORTE DE IONES SODIO 9e puede considerar una versin modificada del anterior@ algunas sustancias no son transportadas activamente de forma directa por el potencial electroquímico de protones, sino indirectamente, a trav"s de un gradiente de :a que a su ve' se origina a e(pensas de dicha fuer'a protnGmotri' 2fpm3. El sustrato entra por una permeasa, junto con iones :a, pero a su ve' este sodio se recicla por un sistema de antiporte, a e(pensas de la disipacin del potencial de protones. Ejemplo@ el a'!car melibiosa, en el caso de la enterobacteria ). coli.
Estos dos tipos de transporte activo ligados a simporte quedan inhibidos si tratamos las c"lulas con alg!n agente ionóforo 2p. ej., el antibitico valinomicina3, que destruye el potencial electroquímico de protones. El transporte activo ligado a simporte de iones 2K, :a3 resulta muy econmico, ya que slo se gasta un protn por cada mol"cula transportada, mientras que por cada 04P sinteti'ado se suelen gastar D protones que se disipan en las 04Pasas. Las permeasas que reali'an este transporte suelen ser proteínas integrales de membrana provistas de unos *J segmentos transmembranosos en configuracin de Gh"lice.
2.3.3 TRANSPORTE ACTIVO DIRIGIDO POR ATP El tipo paradigm1tico de este tipo de transporte se denomina de transportadores AD o APasas de tr%fico, y se conocen muchos ejemplos en eubacterias y arqueas. %amos a describir el caso de un sistema 06# en enterobacterias 2como ). coli3. 9e trata de un sistema de varios componentes, en el que e(isten proteínas peripl1smicas que captan el sustrato con gran afinidad, y lo llevan hasta unas proteínas de membrana, las cuales acoplan el paso de dicho sustrato hasta el citoplasma 2sin alteralo químicamente3 con la hidrlisis de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
Elementos de este tipo de sistema* Porinas u otras proteínas de membrana e(terna para lograr la difusin del sustrato desde el medio hasta el espacio peripl1smico. Proteína2s3 solubles de espacio peripl1smico que se unen al sustrato con gran afinidad. On heterodímero formado por dos proteínas integrales de membrana 2cada una de ellas posee + o ? trechos en Gh"lice que atraviesan la membrana citopl1smica3, que son la permeasa propiamente dicha del sistema 2el canal por donde pasa el sustrato3. )os proteínas perif"ricas de membrana citopl1smica, adosadas al lado citopl1smico, que incluyen el mdulo conservado 06# que acopla la hidrlisis de 04P con el transporte unidireccional del sustrato a trav"s de la membrana.
+odelo del mecanismo de este sistema*
*. El sustrato e(geno normalmente entra al periplasma a trav"s de alg!n canal inespecífico o porina de membrana e(terna 2por ejemplo, en enterobacterias se pueden usar las porinas generales conocidas como 5mpH y 5mp#3. J. La proteína peripl1smica específica, antes de su unin al sustrato tiene una determinada configuracin 2denominada -abierta3, con dos grandes lbulos globulares unidos formando un 1ngulo 2la forma recuerda una almeja a medio abrir3. #uando el sustrato pasa al periplasma, la correspondiente proteína de unin peripl1smica se une a "l con gran afinidad 2.*G* M3, y al unirse cambia de conformacin. En esta configuracin, llamada -cerrada, el sustrato se encuentra -enterrado entre los dos lbulos de la proteína 2-almeja cerrada3. D. Mientras tanto, el dímero de proteínas integrales de membrana 2antes de la unin con la proteína peripl1smica3 se encuentra en un estado energi'ado pero incapa' de transportar sustrato. En esta situacin, puede unirse 2por la parte que da al periplasma3 al complejo formado por la proteína peripl1smica 2en configuracin -cerrada3 ligada al sustrato. 0l hacer esto, el heterodímero de membrana cambia de conformacin, de modo que ahora muestra mayor afinidad hacia la proteína peripl1smica y se abre su canal para dejar entrar el sustrato. F. Entonces, el complejo de membrana alcan'a su estado de mínima energía, y con ello descarga el sustrato en el citoplasma y se logra la separacin de la proteína peripl1smica 2que vuelve a su configuracin -abierta3. +. Hinalmente, la hidrlisis de 04P catali'ada por las proteínas perif"ricas 06# 2adosadas a la membrana y asociadas a las proteínas integrales3 suministra la energía para que el heterodímero de membrana vuelva a su estado energi'ado inicial, preparado así para otro ciclo de transporte.
E: 7-7+90 ABC ; 0+6-07 G609>*0+-/07" @;0 87+, ; 90*-<-7+, 0*;, :, -98;-9,7 8,6 0:* 86,;-9-*+, @ 0:+6 , :- 9-* :0 9960*0 J+6*0 =,*/67-* 0 7<6,8:07+,7?( P,6 98:,( +60+9,7 E. coli ,* : @:0*+ EDTA * *0 7,:-* +098,*0;0 -7,+*-0 =,* * 2& ; 7006,70?. C*+6-<09,7 : 7;-9*+, ; ::07 :, 6778*;9,7 * *0 7,:-* ; MC: 2 * <6, =&C?. E: 67:+0;, 7 @ :07 86,+*07 ;: 86-8:0790 7080* 0: 9;-, J+6*,. E7+, 7 * 07, ; +60+09-*+, 8,6 *J-6), -08*@ ,6--*0 86;-;0 ; ,*+*-;,7 ;: 86-8:0790. S ,9860 @ -6+,7 7-7+907 ; +60*78,6+ @;0* -*+-:-0;,7" ;-;, 0 @ 6@-6* 8060 7 <*-,*09-*+," /K , :-8,@/0 , ,9:// *8-+0*/" -8:/0 ,0,*@?*/0 ,+ ,0/*- ,:+0*-. P,6 ,*+60" 7+ 7-7+90 *, 7 / 0<+0;, 8,6 :,7 0*+7 -,*<,6,7. P,6 7+0 60*" 0 7+ 7-7+90 * G609>*0+-/07 7 : 0 ::090;, ;60*+ 9, +-98, ;8:/0-:8, /*80,09+, / *J-6), -08*-<.
Los sistemas 06# de bacterias ;ramGpositivas est1n menos estudiados, pero en general se parecen a los de ;ramGnegativas, salvo que carecen del transportador libre peripl1smico. En su lugar e(iste una proteína con funciones equivalentes 2captar el nutriente del e(terior3, pero que est1 anclada al lado e(terno de la membrana citopl1smica, cerca del heterodímero integral de membrana 2la unin es mediante su cisteína :Gterminal, que se une a un fosfolípido3. E(isten muchos ejemplos de transportadores procariticos de tipo 06#, y cada uno de ellos est1 especiali'ado en transportar un sustrato específico o varios sustratos parecidos. Ejemplo de sustratos transportados de esta forma@ Monosac1ridos como arabinosa, galactosa, maltosa, ribosa, (ilosa, etc. 5ligosac1ridos &ones org1nicos e inorg1nicos 0mino1cidos como histidina, glicina, leucina, etc. 5ligop"ptidos
0lgunas vitaminas y metales. 9iderforos con hierro
2.3.4 TRANSPORTE ACOPLADO A TRANSLOCACION DE GRUPOS Es un sistema de transporte que acopla la entrada del sustrato con su modificacin química por unin covalente con un grupo químico. Estrictamente hablando, no es un transporte activo, porque no funciona en contra de un gradiente de concentracin, pero se considera de hecho como activo, ya que la concentracin del sustrato modi,icado dentro de la c"lula supera con creces a la del sustrato sin modi,icar en el e(terior. Este sistema supone un ahorro de energía metablica@ aunque en el transporte se gasta un enlace rico en energía, el sustrato queda modificado en su paso a trav"s de la membrana en la forma que la bacteria emplea como primer intermediario de su ruta metablica. Es decir, con un solo proceso se cumplen dos funciones distintas@ transporte y preparacin química para la ruta, que de todas formas habría que reali'ar. :o es de e(trañar que este tipo de transporte haya sido seleccionado frecuentemente en la evolucin bacteriana, y que hoy lo encontremos en muchos procariotas, especialmente en bacterias anaerobias o aerobias facultativas que recurren a fermentaciones 2recordar que las fermentaciones tienen un rendimiento energ"tico menor que los procesos respiratorios< por lo tanto, es -lgico que se seleccionen mecanismos ahorradores como el descrito3. El caso mejor estudiado de esta clase de transporte lo constituye el llamado sistema de fosfotransferasa de a!cares 2seg!n las casi inevitables iniciales inglesas@ P493. En ). coli el sistema P49 permite el transporte de glucosa, manosa, fructosa y los polioles sorbitol y manitol. #onsta de varios componentes que funcionan como una cadena de transportadores del grupo fosfato de alta energía del fosfoenolpir!vico 2PEP3 hasta el a'!car a transportar en cuestin. Las dos primeras proteínas son inespecíficas respecto del a'!car 2son comunes a los diversos sustratos a transportar3, tienen locali!ación citopl%smica y su s6ntesis es constitutiva. 9e conocen como En'imaG& 2E&3 KPr 2esta !ltima es una pequeña proteína termoestable, rica en histidina3. El otro componente, llamado En'ima && 2E&&3 es espec6fico de cada a!car, y su síntesis es induci#le por el correspondiente sustrato@ 9uele estar compuesto por tres subunidades o dominios@ E&&0 2hasta hace poco llamado E&&&3 es citopl1smico y soluble< E&&6 es un dominio perif"rico de membrana@ aunque es hidrfilo, se liga al lado citopl1smico de la membrana a trav"s de E&&#. E&&# es una proteína integral de membrana
%eamos cmo funciona el sistema@ *. Por un lado, el a'!car se une al en'ima E&&# específico, pero "ste por sí mismo no puede liberar al a'!car sin modificar en el interior celular. J. Mientras tanto, la E& catali'a 2en presencia de Mg3 la transferencia del fosfato de alta energía del PEP a la KPr. D. La KPr fosforilada 2KPrGP3 transfiere el fosfato al en'ima &&0 específico del a'!car kp. ej., la glucosa 2E&&0;lc 3 o el manitol 2E&&0Mtl3. F. La E&&0GP r1pidamente, y en presencia de Mg, transfiere el fosfato a la en'imaG&&6 específica con la que se asocia 2p. ej., E&&6;lc3, que a su ve' fosforila el a'!car 2en el caso de la glucosa convirti"ndola en glucosaG?GP3@ en este momento la E&&# pierde su afinidad por el a'!car modificado, que de esta forma entra en el citoplasma, preparado ya para actuar como sustrato de la primera reaccin del catabolismo de este a'!car. 5tros ejemplos de transporte acoplado a translocacin de grupos@ Entrada de 1cidos grasos mediante un sistema de transferencia de #oen'ima 0, que los transforma en acilG#o0. Entrada de purinas y pirimidinas, mediante un sistema de fosforribosilGtransferasas@ purina o pirimidina 2e(terior3 P/PP :MP 2interior3 P 2P/PP X fosforribosilGpirofosfato3 2:MP X nuclesido monofosfato3 En bacterias es frecuente encontrar varios sistemas de transporte para un mismo nutriente 2p. ej., )scherichia coli posee cinco sistemas para transportar la galactosa y tres sistemas para algunos de los amino1cidos. Los diversos sistemas se diferencian en cuanto a su requerimiento energ"tico, su afinidad, su regulacin, etc. Lgicamente, la evolucin ha debido seleccionar esta redundancia de sistemas de transporte con objeto de permitir que el microorganismo sobreviva bajo diversas circunstancias ambientales.
2.4 TRANSPORTE DE HIERRO El hierro es un cofactor de muchas en'imas y citocromos, por lo que las bacterias necesitan captarlo. La captacin de hierro se complica porque el in f"rrico 2HeD3 es muy insoluble. 0dem1s, las bacterias que viven dentro de animales superiores tienen un problema@ en los fluidos y tejidos de sus patrones el hierro libre es muy poco abundante 2el hierro suele estar acomplejado con proteínas3, por lo que se vuelve vital aprovisionarse con este elemento de alguna manera.
Muchas bacterias secretan unas mol"culas de bajo peso molecular llamadas en general sideróforos, que son capaces de formar quelatos 2complejos3 con el hierro f"rrico. Por ejemplo, )scherichia coli secreta un siderforo llamado enterobactina. #uando la enterobactina se une al hierro, forma un complejo octa"drico, que luego se engar'a con un receptor específico de la membrana e(terna, tras lo que el hierro se libera al espacio peripl1smico, desde donde entra al citoplasma por medio de una proteína de unin peripl1smica acoplada a un sistema 06# similar al visto m1s arriba.
3 ESTRUCTURAS MEMBRANOSAS INTRACITOPLÁSMICAS 3.1 MESOSOMAS 9on estructuras membranosas intracitopl1smicas que se observan en la mayor parte de las bacterias, constituidas por invaginaciones de la membrana citopl1smica.
#servación@ 0 microscopio ptico se pueden detectar con tincin negativa con 1cido fosfot!ngstico. 0 microscopio electrnico se observa que, por lo general, el mesosoma se ubica en determinadas locali'aciones@ sitios donde se inicia la divisin celular< tabiques transversales en crecimiento 2incluyendo los que delimitan el compartimento de la endospora3< 'onas cercanas a los nucleoides 2cuerpos nucleares3. )esde hace mucho tiempo se viene discutiendo si los mesosomas son en realidad estructuras aut"nticas de la bacteria, o como dicen otros, meros artefactos de las t"cnicas microscpicas empleadas. El debate a!n no est1 apagado, seg!n algunos destacados microbilogos.
Estructura ( composición@ Los mesosomas m1s característicos y patentes son los de bacterias ;ramGpositivas. 9u aspecto al microscopio electrnico es el de repetidas invaginaciones de la membrana@ una invaginacin primaria en forma de s1culo irregular, de la que surge una invaginacin secundaria, llamada t!bulo mesosmico, que rellena el hueco de la invaginacin primaria. El t!bulo mesosmico suele consistir en un conjunto de pequeñas vesículas arrosariadas, o t!bulos, conectados entre sí, a veces con aspecto de cebolla. Los mesosomas de ;ramGnegativas son menos conspicuos y menos complejos@ se manifiestan como pequeñas invaginaciones de la membrana, con forma laminar o a base de tubos dispuestos de forma verticilada.
'unciones@ La porcin de membrana del mesosoma correspondiente a la invaginacin primaria 2pero no así a la secundaria3 posee una composicin semejante a la de la membrana
citopl1smica, por lo que se le pueden aplicar los papeles que ya hemos estudiado 2transporte de electrones, síntesis de componentes de las envueltas...3. Probable papel en la síntesis del septo transversal, qui'1 regulando las autolisinas implicadas en la divisin celular 2v"ase tema +bis3. Puntos de anclaje del cromosoma bacteriano 2y qui'1 de algunos pl1smidos3, actuando en la segregacin de los cromosomas hijos a las c"lulas hermanas 2y en el caso de las bacterias esporuladas, en la segregacin segr egacin de los cromosomas a los compartimentos de la c"lula madre 2esporangio3 y de la preespora. Qonas de secrecin de ciertas e(oen'imas 2p. ej., penicilinasa en Bacillus en Bacillus3. 3.
3.2 CROMATÓFOROS 9on invaginaciones de la membrana citopl1smica de las bacterias purp!reas 2un grupo de bacterias fotosint"ticas ano(ig"nicas3 que albergan su aparato fotosint"tico. )ependiendo de las especies, pueden adoptar formas variadas@ 0 modo de vesículas huecas< capas de repliegues conc"ntricos, a modo de l1minas paralelas, cercanas a la membrana citopl1smica< formando t!bulos, aislados o en haces. Los cromatforos suponen obviamente una adaptacin para aumentar la superficie de membrana !til capa' de reali'ar las funciones propias de la fotosíntesis.
3.3 OTRAS INVAGINACIONES En muchas bacterias quimiolitoautrofas 2especialmente las nitrificantes3 e(isten invaginaciones de la membrana 2a menudo denominadas citomembranas3 que permiten una mayor superficie para la reali'acin de sus actividades respiratorias. 9us formas y ,otomicrogra,7as2. disposiciones son igualmente muy variadas /v0anse ,otomicrogra,7as2. En &'otobacter En &'otobacter , una bacteria aerobia fijadora de nitrgeno atmosf"rico, y que presenta una altísima tasa respiratoria, se pueden detectar tambi"n invaginaciones de membrana que aumentan la superficie disponible para sus intensos procesos de o(idacin.
3.4 TILACOIDES 9on sacos membranosos aplastados presentes en las cianobacterias, que no est%n en continuidad con la mem#rana citopl%smica< en su cara e(terna se disponen filas de ficobilisomas /v0ase cap7tulo ?2. ?2. El conjunto de membrana tilacoidal ficobilisomas es el responsable de la fotosíntesis o(ig"nica en este grupo de procariotas.
BIBLIOGRAFÍA
6559, ., ., N.M. LO#K4. 2*==?3@ Periplasmic binding proteinGdependent 06# transporters. coli and Salmonella typhimurium. typhimurium. #ellular and molecular biology, JV En@ - )scherichia coli and edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#., p1gs. **>+G*JJD. )0:#K&:, 0. 2*=>3@ Membrane integration of carbohydrate transport in bacteria. Microbiol. 9ci. 4@ J?>GJ?=. )/E9, ;. 2*==J3@ &ntracytoplasmic membranes in bacterial cells@ organi'ation, function and biosynthesis. En -ProCaryotic structure and function@ a neB perspective. 9ociety for ;eneral Microbiology \ #ambridge Oniversity Press, #ambridge, pp. JF=GJ>F. ;L0QE/, 0.:. 2*=J3@ Phycobilisomes@ structure and dinamics. 0nn. /ev. Microbiol. 3@ *>DG*=. ;5L)H&:E, K., 4.0. L0:;5/4KI L0:;5/4KI 2*=3@ 0 groBing interest in bacterial ether lipids. 4rends 6iochem. 9ci. 3@ J*>GJJ*. 7060#7, K./., E. 6&6&, P.). /5EPE 2*==3@ 6etaGgalactoside transport in )scherichia in )scherichia coli@ coli@ a functional dissection of lac permease. lac permease. 4rends 6iochem. 9ci. ;@ D=GD*F. 70):E/, /.N. 2*==?3@ #ytoplasmic membrane. En@ - )scherichia coli and coli and Salmonella typhimurium. typhimurium. #ellular and molecular biology, JV edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#., p1gs. +G?. M0L5:EI, M0L5:EI, P.#., P.#., 4. K094&:;9 &L95: 2*==?3@ &onGcoupled transport trans port and transporters. En@ - )scherichia coli and coli and Salmonella typhimurium. typhimurium. #ellular and molecular biology, JV edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#., p1gs. **DG**F>. P594M0, P. P..,., N.. LE:;ELE/, ;./. N0#5695: 2*==?3@ PhosphoenolGpyruvate@ carbohydrate phosphotransferase systems. En@ - )scherichia )scherichia coli and coli and Salmonella typhimurium. typhimurium. #ellular and molecular biology, JV edicin 2H.#. :eidhart, ed.3. 0merican 9ociety for Microbiology Press. ashington, ).#. 2*==?3, p1gs. **F=G**>D. K&4E, ). 2*==+3@ -4he physiology and biochemistry of ProCaryotes. 5(ford Oniversity Press, :ueva IorC IorC y 5(ford. #onsultar el capítulo *+ 2transporte 2 transporte de solutos3.
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CIT CI TOP OPLA LASM SMA A BA BACT CTER ERIA IANO NO(( VIS VISIÓ IÓN N DE DE CON CON'U 'UNT NTO O
2
MATE MA TERI RIAL AL GE GENÉ NÉTI TICO CO(( EL EL NUC NUCLE LEOI OIDE DE
2.1 EL CROMO CROMOSOM SOMA A PROCAR PROCARIOT IOTA A 2.1.1
MÉTODOS DE OBSERVACIÓN Y ESTUDIO
2.1.2 2.1. 2 COMP CO MPO OSI SICI CIÓ ÓN #UÍ #UÍMI MICA CA"" ESTR ESTRUC UCTU TURA RA Y ORG ORGA ANI NIQA QACI CIÓ ÓN DEL DEL CROMOSOMA 2.2
PLÁSMIDOS
2.2.1
DEFINICIÓN Y CONCEPTOS GENERALES
2.2 2. 2.2
FENOTIPOS DE DETERMINADOS POR LO LOS PLÁSMIDOS
2.2.3
REPLICACIÓN DE LOS PLÁSMIDOS
2.2.4
REGULACIÓN DE DEL NWMERO DE DE CO COPIAS
2.2 2. 2.5
REPARTO DE DE LA LAS CO COPIAS A LA LAS S CÉ CÉLULA LAS S HI HI'AS
2.2. 2.2. INCO COM MPATI TIBI BILI LIDA DAD D ENT ENTRE RE PLÁ LÁSM SMID IDO OS Y GRU RUPO POS S DE INCOMPATIBILIDAD 2.3
3
ELEMENTOS GE GENÉTICOS MÓVILES 2..3.1
ELEMENTOS ELEMEN TOS TRANSP TRANSPONIBLES ONIBLES CLÁSIC CLÁSICOS OS
2.3.2
NUEVOS ELEMENTOS GENÉTIC GENÉTICOS OS MÓVILES
RIBO RI BOSO SOMA MAS S SÍN SÍNTE TESI SIS S Y PLEG PLEGAM AMIE IENT NTO O DE PRO PROTE TEÍN ÍNAS AS
3.1 3. 1
ESTRUCTURA DEL RIBOSOMA EUBACTERIANO.................. .............................. ................... ....... ..
3.2 3. 2
EL MECANI NIS SMO DE DE LA LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS
3.3 3.3 EL PL PLEG EGAM AMIE IENT NTO O DE DE LAS LAS PR PROT OTEÍ EÍNA NAS( S( PAP APEL EL DE LA LAS S PRO PROTE TEÍN ÍNAS AS CELADORAS =CHAPERONAS? 4
INCL IN CLUS USIO IONE NES S Y ORGÁ ORGÁNU NULO LOS S PROC PROCAR ARIO IOT TAS
4.1 4.1.1
INCLUSIONES DE RESERVA INCLUSIONES POLISACARÍDICAS
4.1.2 GRÁNULOS DE POLI>X>HIDROIBUTÍRICO =PHB? Y DE POLI> HIDROIALCANOATOS 4.1.3
INCLUSIONES DE HIDROCARBUROS
4.1.4
GRÁNULOS DE CIANOFICINA
4.1.5
GRÁNULOS DE POLIFOSFATOS
4.1.
GLÓBULOS DE AQUFRE
4.2
OTRAS INCLUSIONES
4.2.1
INCLUSIONES DE SALES MINERALES
4.2.2
FICOBILISOMAS
4.3
ORGÁNULOS PROCARIÓTICOS CITOPLÁSMICOS
4.3.1
CARBOISOMAS = CUERPOS POLIÉDRICOS?
4.3.2
VACUOLAS DE GAS
4.3.3
CLOROSOMAS
4.3.4
MAGNETOSOMAS
ENLACES
1 CITOPLASMA BACTERIANO( VISIÓN DE CON'UNTO El citoplasma bacteriano es la masa de materia viva delimitada por la membrana citopl1smica. En su interior se albergan@ cuerpos nucleares 2nucleoide3< pl1smidos 2no en todas las cepas bacterianas3< ribosomas< inclusiones 2no en todas3< org1nulos 2no en todas3.
0l igual que en los dem1s seres vivos, el citoplasma es un sistema coloidal cuya fase dispersante es agua junto con diversas sustancias en solucin 2citosol3, y cuya fase dispersa est1 constituida por macromol"culas y conjuntos supramoleculares 2partículas submicroscpicas3. La viscosidad es mayor que la del citoplasma eucaritico, estando desprovisto de corrientes citopl1smicas.
#servación* 0 microscopía ptica, obviamente es poco lo que se puede distinguir en "l. En las c"lulas jvenes se suele teñir de modo uniforme, teniendo un car1cter basfilo 2debido a la abundancia de 0/:3. En las c"lulas viejas se tiñe irregularmente, debido a la aparicin de inclusiones y a la acumulacin de sustancias de desecho. 0 microscopía electrnica destaca el car1cter granulado, producido por los numerosos ribosomas 2que a los aumentos habituales aparecen como partículas esf"ricas3, aunque se observa una 'ona irregular hacia el centro, m1s transparente a los electrones, que se debe a los cuerpos nucleares 2nucleoide3. En los intersticios entre las partículas granuladas e(iste una sustancia amorfa en la que no se pueden distinguir m1s detalles, y que corresponde a la fase dispersante acuosa de la que habl1bamos m1s arriba.
/a nueva visión del citoplasma #acteriano 12MM; Los nuevos m"todos citolgicos y moleculares nos est1n dando una nueva visin en la que el citoplasma bacteriano est1 m1s organi'ado y es m1s din1mico de lo que pens1bamos hasta hace poco. /esumiremos esta nueva imagen@ en el citoplasma bacteriano hay una clara separacin espacial y funcional entre la 'ona central, donde se locali'a el nucleoide y en la que se da la transcripcin, respecto de la 'ona perif"rica rica en ribosomas, en la que se da la síntesis de proteínas. La maquinaria para la replicacin del cromosoma 2replisoma3 se locali'a en un sitio concreto, hacia el centro de la c"lula, y muy probablemente ligado a la membrana. Por el replisoma fijo va pasando el cromosoma para su replicacin, empe'ando por el origen ori% . Los cromosomas hijos van siendo despla'ados hacia los polos 2segregacin3, de modo que conforme avan'a la replicacin, cada ori% se sit!a cada ve' m1s cerca de un polo celular. La proteína HtsQ es homloga de la tubulina eucaritica, y al comien'o de la divisin se polimeri'a formando un anillo por debajo de la membrana en el centro de la c"lula. Este anillo parece servir de andamio para el -divisoma, implicado en la formacin del septo transversal que conduce al nacimiento de las dos c"lulas hijas. Kay una proteína homloga de la actina, que se polimeri'a formando amplias h"lices que recorren la c"lula de polo a polo, y que junto con el peptidoglucano, determina la forma celular 9e han descubierto proteínas que oscilan r1pida y continuamente de un e(tremo a otro de la c"lula 2en cuestin de segundos3, y que parecen implicadas en la regulacin del ciclo celular.
En resumidas cuentas, hoy sabemos que el citoplasma procaritico es m1s din1mico, estructurado y complejo que lo que creíamos hace unos pocos años. GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG En este capítulo nos dedicaremos al estudio de las principales estructuras y macromol"culas que alberga el citoplasma. #omen'aremos con la organi'acin a gran escala del material gen"tico bacteriano, seguiremos con una r1pida revisin sobre los
ribosomas y la síntesis y plegamiento de las proteínas, y terminaremos con las inclusiones y org1nulos especiales que presentan algunas bacterias.
2 MATERIAL GENÉTICO( EL NUCLEOIDE El 0): es el material gen"tico de los procariotas, al igual que del resto de seres vivos 2celulares3. )icho 0): est1 contenido en una regin concreta del citoplasma, denominada nucleoide, en la mayoría de los casos sin estar separado por membrana 2hay un par de bacterias en las que se ha descubierto una membrana rodeando al nucleoide3. El genoma es el conjunto de genes y secuencias de 0): de un organismo. En el caso de bacterias, el elemento obligatorio del genoma es el cromosoma, aunque es frecuente encontrar unidades de replicacin autnomas llamadas pl1smidos, que son dispensables 2si se pierden, la bacteria sigue siendo viable3.
2.1 EL CROMOSOMA PROCARIOTA 2.1.1 MÉTODOS DE OBSERVACIÓN Y ESTUDIO A microscop6a óptica En las c"lulas en fresco, los nucleoides se pueden poner de manifiesto 2usando microscopio de contraste de fases3 ajustando el índice de refraccin del medio 2haciendo que dicho índice sea igual al del resto del protoplasma3. 9e logra m1s detalle usando los recientes microscopios confocales de barrido. Osando tinciones 2en preparaciones fijadas previamente3@ se pueden emplear colorantes b1sicos 2como los de tipo Heulgen3, siempre que previamente se destruya el 0/:r 2que podría enmascarar al nucleoide3 mediante hidrlisis 1cida o en'im1tica. 5tro buen sistema es emplear el #romuro de etidio, colorante que se intercala en la doble h"lice del 0): y que permite visuali'ar los nucleoides de color anaranjado con un microscopio provisto de lu' ultravioleta.
A microscop6a electrónica de transmisión Para evitar artefactos de laboratorio, frecuentes en la fase de fijacin para la microscopía electrnica, se recurre a un m"todo de congelacin r1pida seguida de criosubsitucin. Las im1genes muestran al nucleoide como una regin m1s o menos delimitada y libre de ribosomas, dentro del citoplasma, no rodeada de membrana, con muchos lbulos y un aspecto fibroso. :uevas t"cnicas de microscopía electrnica combinada con an1lisis computeri'ado de im1genes acaban de revelar que el nucleoide de las c"lulas en reposo 2en fase estacionaria3 se empaqueta de un modo muy ordenado, formando toroides espirales recubiertos de subunidades de una proteína especial.
+étodos de o#tención Para obtener nucleoides -intactos se recurre a la lisis suave de las c"lulas 2con detergentes no inicos3 en altas concentraciones de sales 2p ej., :a#l3 con posterior ultracentrifugacin en gradientes de densidad de sacarosa. 9i el procedimiento se reali'a a J+# el nucleoide se aisla relativamente libre de restos de membrana, pero si se hace en frío 2F#3 el nucleoide queda asociado a grandes restos de envueltas.
Estudios moleculares La biología molecular, especialmente a trav"s de las t"cnicas de 0): recombinante, permite la caracteri'acin física detallada de los genomas. Muchos genomas de procariotas han sido cartografiados mediante mapas de restriccin, pero en la actualidad ya contamos con m1s de F genomas totalmente secuenciados, lo que est1 permitiendo avances espectaculares en todos los 1mbitos de la gen"tica y bioquímica de estos microorganismos.
2.1.2 COMPOSICIÓN #UÍMICA" ESTRUCTURA Y ORGANIACIÓN DEL CROMOSOMA Los cromosomas aislados muestran una composicin de un ?W de 0):, DW de 0/: y *W de proteínas. El 0): sigue el modelo cl1sico de atson y #ricC@ dos hebras antiparalelas en doble h"lice de J nm de di1metro, paso de rosca de D,F nm y * pares de nucletidos por cada vuelta de la espiral. La mayor parte de este 0): est1 en conformacin 6, aunque e(isten 'onas donde se puede dar la configuracin Q. En la mayor parte de las bacterias este 0): constituye un solo cromosoma circular, cerrado covalentemente 20): c.c.c.3. E(isten algunas e(cepciones, en el sentido de que podemos encontrar cromosomas lineares o incluso m1s de un grupo de ligamiento 2m1s de un cromosoma3@ en el g"nero Borrelia el cromosoma es lineal con los e(tremos cerrados covalentemente 2es decir, los e(tremos forman una especie de bucle de horquilla3< bacterias del g"nero Streptomyces tambi"n poseen un cromosoma lineal, pero sus e(tremos contienen secuencias cortas repetidas y est1n acomplejados con proteínas, lo que recuerda de alg!n modo los telmeros eucariotas< algunas bacterias parecen poseer dos o m1s cromosomas@ (hodobacter sphaeroides$ @ibrio$ -eptospira y Brucella presentan dos cromosomas circulares Sinorhi'obium melitoti presenta tres cromosomas circulares )istintas cepas de Bur"holderia cepacia presentan entre J y F cromosomas &grobacterium tume,aciens cuenta con un cromosoma lineal y otro circular. Las bacterias son organismos ,aploides@ poseen un solo cromosoma. 9in embargo, cuando las c"lulas bacterianas se encuentran en crecimiento activo, y debido al desfase de
la divisin celular respecto de la replicacin, cada individuo puede albergar varias copias de ese cromosoma. Por ejemplo, ). coli puede llegar a * copias. &'otobacter puede llegar hasta las * copias al final de la fase de crecimiento e(ponencial. On caso e(tremo lo constituye la bacteria gigante )pulopiscium, que aumenta el n!mero de copias en cuatro rdenes de magnitud 2unas *. veces3, aunque se desconoce el significado de este descomunal -e(ceso.
amaQo del cromosoma Ona bacteria típica, como )scherichia coli posee un cromosoma con F.> pares de Cilobases 2Cb3. Pero los rangos de tamaño oscilan entre las > Cb de Mycoplasma genitalium 2una bacteria carente de pared y par1sita3 y las m1s de *J Cb de ciertas bacterias capaces de diferenciacin celular y fenmenos de multicelularidad 2cianobacterias, actinomicetos3.
rgani!ación del cromosoma ( de la cromatina #acterianos 9i despleg1ramos el cromosoma de ). coli de modo lineal, mediría * mm, es decir, * veces m1s de lo que mide la longitud de la bacteria. 9i adem1s tenemos en consideracin que el cromosoma ocupa slo *W del volumen celular, nos daremos cuenta que debe de estar densamente empaquetado. #mo es la organi'acin a gran escala de este cromosoma dentro de la c"lula[ Esta es una cuestin que a!n desconocemos en todos sus detalles. 0 continuacin e(ponemos un resumen de lo que se sabe 2o sospecha3 actualmente@ La doble h"lice est1 superenrollada negativamente sobre sí misma. Parte de este superenrollamiento se debe al equilibrio entre la actuacin de dos en'imas@
A)N girasa, que es un tipo especial de topoisomerasaG&& que tiende a introducir superhelicidad negativa< A)N topoisomerasa=7, que tiende a relajar la superhelicidad negativa, cortando cada ve' en una de las dos cadenas de la doble h"lice, pasando la cadena intacta por el hueco, y volviendo a sellar el enlace fosfodi"ster que antes rompi. 0parte de este superenrollamiento producido por -topoen'imas, el material gen"tico bacteriano presenta interacciones con una serie de prote6nas estructurales. El conjunto de 0): y proteínas estructurales se denomina Lcromatina05 pero, nunca aparecen histonas. 9alvo en algunas arqueas, esta cromatina procaritica tiene menos densidad de proteínas que la cromatina de eucariotas. %eamos algunas de esas proteínas. En )scherichia coli, e(iste la proteína b1sica C, un heterodímero 2KOG, KOG`3, que presenta cierto parecido con las histonas aut"nticas 2pero sin guardar homología con ellas3. :o forma aut"nticos nucleosomas con el 0):. En otras bacterias, e(isten proteínas homlogas con la KO. En todos los casos se unen d"bilmente al 0): -normal, pero en cambio lo hacen con gran afinidad hacia 0): curvado o que forme bucles, induciendo mayores curvaturas en ese 0):. La unin de KO no depende del reconocimiento de ninguna secuencia particular. Parece que su papel no slo es estructural, sino que tambi"n colaboran con otras proteínas en procesos de recombinacin
homloga, recombinacin específica, reparacin del 0): y e(presin gen"tica. La 7' 2llamada así por las iniciales inglesas de factor de hospedador para la integracin3 es una proteína que reconoce un tipo de secuencia de *D pares de bases, y que al unirse al surco menor de la doble h"lice provoca grandes curvaturas locales en ella. )e esta forma colabora en procesos de recombinacin específica /lo veremos en la seccin de Gen0tica2 y de e(presin de ciertos genes. /ecientemente se ha descubierto un importante tipo de prote6na estructural para el mantenimiento del cromosoma 1&+. 9e trata de un homodímero con forma de % en el que cada bra'o de la % es un monmero. 0mbos monmeros interaccionan por la base de la %. Las dos puntas de esa % contienen dominios de unin e hidrlisis del 04P, e interact!an a su ve' con una serie de proteínas accesorias relacionadas con la organi'acin y mantenimiento del 0): durante la replicacin y segregacin de los cromosomas hijos. #omo se ve, tanto el superenrollamiento como la compactacin generada por las proteínas estructurales tienen una notable influencia sobre las funciones del 0):, ya que modulan procesos tan importantes como la replicacin, transcripcin, recombinacin y e(presin g"nica, aunque estamos lejos de conocer e(actamente los mecanismos implicados. El papel biolgico del 0/: que se detecta en los nucleoides aislados in vitro tampoco est1 claro. Este no es un 0/: especial, sino 0/: naciente, y parece servir para mantener -sujetos los diversos dominios superenrollados. Ia aludimos antes al descubrimiento reciente de que en la fase estacionaria, cuando las bacterias carecen de fuente de energía y no pueden seguir creciendo, el nucleoide e(perimenta una reorgani'acin radical, en la que el 0): se arrolla de formando toroides espirales separados entre sí por una capa de subunidades de una proteína especial 2)ps3, y dando lugar a una macroestructura coGcristalina muy regular. Probablemente esto suponga una adaptacin para proteger el 0): sin gastar energía. Hinalmente, otro tema largamente debatido es el modo de asociacin del cromosoma con la membrana citopl1smica 2qui'1 a trav"s de mesosoma[3. Kay indicios de que el cromosoma, y concretamente su origen de replicacin /ori%2$ se encuentra -anclado a determinadas proteínas de la membrana 2proteínas que probablemente est"n implicadas en el inicio de la replicacin cromosmica3. En los cromosomas circulares, la replicacin avan'a bidireccionalmente desde el sitio ori% , hasta que las dos horquillas se encuentran a * de ese lugar, termin1ndose la replicacin.
2.2
PLÁSMIDOS
2.2.1 DEFINICIÓN Y CONCEPTOS GENERALES 0unque en general es adecuado decir que el genoma de los procariotas consta de un solo cromosoma, muchas bacterias poseen, adem1s, uno o varios elementos gen"ticos accesorios e(tracromosmicos, a los que denominamos pl%smidos.
9e definen como elementos gen"ticos e(tracromosmicos con capacidad de replicación autónoma 2es decir, constituyen replicones propios3. 4odos los pl1smidos bacterianos estudiados son de 0): de cadena doble. La inmensa mayoría son circulares cerrados covalentemente 2c.c.c.3 y superenrollados 2aunque en Borrelia y algunos 0ctinomicetos e(isten pl1smidos lineares3. 0lgunos pl1smidos poseen, adem1s, la capacidad de integrarse reversiblemente en el cromosoma bacteriano@ en esta situacin se replican junto con el cromosoma 2bajo el control de "ste3, y reciben el nombre de episomas. En cuanto al tamaQo, e(iste una amplia gama@ desde pl1smidos muy pequeños 2de unas J Cb3 hasta pl1smidos muy grandes 2ciertos pl1smidos de #seudomonas tienen + Cb3. &ncluso e(isten -megapl1smidos en ciertos (hi'obium que llegan a tener *? Cb. 2)e hecho, ciertos -megapl1smidos se ha visto que son imprescindibles, por lo que se han recalificado como cromosomas3. #ada tipo de pl1smido tiene un nmero medio de copias por c"lula característico. Por regla general, los grandes pl1smidos tienen una o dos copias por c"lula 2pl1smidos con control estricto de la replicación3, mientras que los pequeños suelen estar presentes como varias copias 2*3, denomin1ndose pl1smidos de control rela"ado. En funcin de que los pl1smidos sean o no transmisibles de una bacteria a otra por medio de contactos intercelulares, se pueden distinguir@
pl%smidos con"ugativos 2autotransmisibles3, que son aquellos que se transfieren entre cepas por medio de fenmenos de con"ugación. 0lgunos de estos pl1smidos no slo se transfieren entre cepas de la misma especie, sino que son capaces de hacerlo entre especies y g"neros muy diversos, recibiendo el muy apropiado nombre de pl%smidos promiscuos o de amplio espectro de hospedadores, permitiendo transferencia ,ori!ontal de información genética entre grupos bacterianos filogen"ticamente alejados. pl%smidos no con"ugativos, carentes de esta propiedad de conjugacin. )entro de esta categoría e(iste un subgrupo, el de los pl1smidos movili!a#les@ son aquellos no autotransmisibles que pueden ser transferidos por la accin de un pl1smido conjugativo coe(istente en la misma bacteria. /&mpliaremos el estudio de los pl9smidos con8ugativos en la seccin de Gen0tica bacteriana2.
2.2.2 FENOTIPOS DETERMINADOS POR LOS PLÁSMIDOS Los pl1smidos no suelen ser indispensables para la viabilidad de la bacteria, y muchos de ellos se pierden en ausencia de una presin selectiva. Ona bacteria puede ser -curada de su2s3 pl1smido2s3, es decir, se le pueden eliminar, bien de forma espont1nea, bien por una serie de tratamientos en el laboratorio 2incubando las bacterias a temperaturas cercanas a la m1(ima o por agentes químicos como el naranja de acridina, que se insertan entre las bases del 0):3. La ra'n de esta curacin de los pl1smidos es que esos
tratamientos interfieren con su replicacin sin afectar a la replicacin del cromosoma. Esto hace que en sucesivas divisiones de una bacteria, el pl1smido se vaya -diluyendo en la poblacin resultante. Los pl1smidos no suelen determinar productos esenciales para el crecimiento 2por eso son dispensables3, pero en la naturale'a parece que resultan favorecidas las bacterias con alg!n pl1smido, qui'1 porque acarrean ventajas selectivas en determinados ambientes o en determinadas condiciones. E(iste una variedad de fenotipos ( funciones determinados por pl%smidos@ /esistencia a antibiticos 2pl1smidos /< los estudiaremos en la seccin de Gen0tica3. /esistencia a metales pesados 2por ejemplo, resistencia a mercurio3. Pl1smidos de virulencia@ produccin de to(inas, factores de penetracin en tejidos, adherencia a tejidos del hospedador, etc., en ciertas bacterias patgenas. Produccin de bacteriocinas 2proteínas t(icas producidas por bacterias que matan a otras de la misma especie3. Produccin de siderforos 2quelatos para secuestrar iones HeD3. Otili'acin de determinados a'!cares. Otili'acin de hidrocarburos, incluyendo algunos cíclicos recalcitrantes 2degradacin de tolueno, (ileno, alcanfor, etc.3 en #seudomonas. &nduccin de tumores en plantas 2pl1smido 4i de &grobacterium tume,aciens3. &nteracciones simbiticas y fijacin de nitrgeno en ciertos (hi'obium. etc... 5bs"rvese que la mayor parte de estos fenotipos no est1n directamente relacionados con el proceso de crecimiento bacteriano, sino que se pueden calificar como funciones para ocupar nic,os ecológicos y resistir circunstancias adversas. Los dos fenotipos de -utili'acin de...2fuente alternativa de #3 nos recuerdan que muchas bacterias est1n sometidas a períodos alternos de hambrunas y de -festines de comida@ ciertas bacterias, como #seudomonas se adaptan a los períodos de hambre de las fuentes habituales de # recurriendo a fuentes Le$óticas0, como hidrocarburos cíclicos. La informacin para los en'imas degradativos correspondientes la llevan en pl1smidos. Por qu", entonces, si determinadas propiedades conferidas por pl1smidos son tan !tiles, no han pasado a lo largo de la evolucin a ser codificadas por el cromosoma[ :o podemos contestar a ciencia cierta a esa pregunta, pero cabe especular que resulta ventajoso que algunas poblaciones bacterianas dispongan de ciertos genes en replicones distintos del cromosoma, de modo que los cromosomas no lleguen a ser demasiado grandes. #uando no hay presin selectiva para los rasgos conferidos por un pl1smido, "ste se puede perder de parte de la poblacin. Pero cuando e(iste dicha presin selectiva 2p. ej., un antibitico3, sobreviven y se multiplican preferencialmente las bacterias portadoras del pl1smido, de modo que en poco tiempo, la poblacin contiene mayoritariamente dicho elemento. 0dem1s, como muchos pl1smidos son autotransmisibles o movili'ables, pueden transferirse a cepas que originalmente carecían de ellos. En resumen, se logra una gran fle(ibilidad adaptativa sin -cargar demasiado el cromosoma o replicn principal.
Kay pl1smidos que, aunque se pueden evidenciar por m"todos físicos 2p. ej., electroforesis3, no se ha podido demostrar que determinen ning!n rasgo fenotípico@ tales pl1smidos se califican como cr6pticos, constituyendo un ejemplo de -0): egoísta 2slo se mantienen por su capacidad de replicacin, sin necesidad de aportar ventaja selectiva clara a la bacteria que los alberga3.
2.2.3 REPLICACIÓN DE LOS PLÁSMIDOS #omo dijimos, los pl1smidos son replicones, es decir, unidades de replicacin autnoma, pero ello no significa que codifiquen toda la maquinaria para su propia replicacin. )e hecho, la mayoría de los pl1smidos slo codifican unas pocas proteínas para este fin, y aprovechan la maquinaria de replicacin de la bacteria hu"sped 20): polimerasas, ligasas, primasas, etc3, que act!a sobre unas secuencias del pl1smido denominadas secuencias ori@ , donde tiene lugar el inicio de esa replicacin. #ada tipo de pl1smido se replica por uno de dos principales tipos de mecanismos@ *. +odelo de replicación en 1t,eta* comien'a por la separacin de las dos cadenas en el sitio ori@ , creando una estructura que se parece a la letra griega 2theta3. En algunos pl1smidos, la replicacin es unidireccional 2slo hay una horquilla de replicacin , que avan'a a lo largo de la mol"cula, hasta que vuelve al sitio ori@$ en el que las dos mol"culas hijas se separan3. 5tros pl1smidos se replican en por un modelo bidireccional 2dos horquillas de replicacin de sentidos opuestos, que se encuentran cerca de la mitad de la mol"cula3. La replicacin en es frecuente en pl1smidos de bacterias ;ramGnegativas. J. +odelo de replicación en 1sigma5 o modelo del c6rculo rodante* una de las dos cadenas es rota a nivel de ori@ , de modo que el e(tremo D suministra el cebador para la replicacin de la -cadena adelantada. La cadena despla'ada 2cadena -menos3 funciona como cadena retrasada 2-lagging3 y debe ser replicada a partir de sitios de cebado especiales. Este tipo de replicacin es frecuente en pl1smidos de bacterias ;ramGpositivas.
2.2.4 REGULACIÓN DEL NMERO DE COPIAS La regulacin del n!mero medio de copias de cada pl1smido en cada bacteria es una propiedad característica dependiente de cmo se controla el inicio de replicacin, siendo diferentes los mecanismos en los pl1smidos de alto n!mero de copias 2con control relajado3 y en los pl1smidos de bajo n!mero de copias 2de control estricto3. En general, los pl1smidos de control relajado tienen mecanismos que inhiben el inicio de replicacin slo cuando el n!mero de copias ha llegado a un cierto nivel. En cambio, los pl1smidos de control estricto tienen mecanismos que logran que slo se repliquen una ve' o un pequeño n!mero de veces en cada ciclo celular.
2.2.5 REPARTO DE LAS COPIAS A LAS CÉLULAS HI'AS
Muchos pl1smidos poseen sistemas de reparto 2X particin3, que tienden a asegurar que una ve' que el pl1smido ha sido replicado, cada una de las c"lulas hijas va a recibir al menos una copia. 0 falta de un tal sistema, y si el reparto fuera aleatorio, de ve' en cuando, las propias fluctuaciones de la segregacin aleatoria harían que parte de la progenie no recibiera una copia, con lo que quedaría curada de ese pl1smido. El reparto de las copias a las c"lulas hijas se suele deber a las llamadas funciones par , que est1n cerca de los genes rep y de la 'ona ori. 9e trata de cortas secuencias de 0): que de alguna manera a!n no aclarada, debe unirse a alguna 'ona de la membrana de la bacteria que se duplica durante la divisin celular, de modo que cada copia, unida a una de esas 'onas, se segrega a una c"lula hija.
2.2. INCOMPATIBILIDAD ENTRE PLÁSMIDOS Y GRUPOS DE INCOMPATIBILIDAD #ada pl1smido, dentro de la amplia diversidad de los que se conocen, se suele clasificar seg!n el grupo de incompati#ilidad al que pertenece 2los grupos de incompatibilidad se suelen denominar con las siglas &nc seguidas de una letra may!scula 2por ejemplo &ncP, &ncH&&, etc.3. 9e dice que dos pl1smidos son incompatibles cuando no pueden coe(istir establemente en la misma bacteria en ausencia de una presin selectiva permanente. ;rupo de incompatibilidad es el conjunto de pl1smidos incompatibles entre sí. La incompatibilidad depende del hecho de que los distintos miembros de un mismo grupo poseen el mismo tipo de sistema de control del nmero de copias ( de reparto de dichas copias a las c"lulas hijas. En cada c"lula con dos pl1smidos distintos del mismo grupo de incompatibilidad, el n!mero total de copias n0n6 X : 2determinado por el sistema de control3 no varía, pero por fluctuaciones aleatorias en el reparto, algunas c"lulas heredan m1s copias de uno de los pl1smidos que del otro, y tras varias generaciones aparecen c"lulas carentes de uno o del otro pl1smido 2n0 X y n6 X :, o viceversa3.
2.3
ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES
En los años > del pasado siglo se descubrieron en bacterias los primeros ejemplos de 0): -saltarín, elementos que presentaban la por entonces novedosa propiedad de moverse de un lado a otro de los genomas, pasando desde pl1smidos a cromosomas 2o viceversa3 o desde un pl1smido a otro de la misma bacteria 2para entendernos, los llamaremos elementos gen"ticos transponibles -cl1sicos, por el simple hecho de que son los que fueron estudiados en primer lugar3. Pero desde hace unos *+ años se est1n descubriendo nuevos tipos de elementos gen"ticos mviles, que no encajan en el modelo de los cl1sicos. En conjunto, esta gama de elementos nos est1n mostrando que en los genomas procariticos e(iste una especie de -pool de 0): con propiedades especiales de movili'acin, que confieren a veces notables rasgos fenotípicos a las cepas que los poseen,. 0dem1s bien por ellos mismos o bien por el hecho de que a veces son transportados entre cepas de la misma especie o de diferentes especies 2mediante pl1smidos conjugativos y fagos3, se pueden transferir de unas bacterias a otras, constituyendo un -pool compartido de material gen"tico. I finalmente, estos elementos aportan una notable plasticidad a los
genomas, suministrando una base potente sobre la que act!a la seleccin y por lo tanto la evolucin de los procariotas.
2.3.1 ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES CLÁSICOS 9on entidades gen"ticas discretas que forman parte de cromosomas y de pl1smidos, capaces de moverse de un lugar a otro del genoma 2pasando a otros lugares del replicn original, o a otros replicones presentes en la misma bacteria3. #omo estudiaremos oportunamente en la seccin de ;en"tica, esta capacidad de transponerse se debe a un tipo de recombinacin específica denominado transposición. E(isten varias clases de mecanismos de transposicin, pero muchas de ellas suponen la simult1nea replicacin del elemento, de modo que queda una copia en el sitio original y aparece una copia nueva en la nueva locali'acin. Los elementos gen"ticos mviles acarrean una serie de reorgani!aciones en los genomas@ inversiones de segmentos gen"ticos, delecciones, cointegraciones entre dos replicones, etc. Kay que resaltar que estos elementos no son replicones, es decir, no poseen la capacidad de replicacin autnoma que hemos visto en cromosoma y pl1smidos, sino que son partes integrantes de los genomas de muchas bacterias, confiriendo plasticidad genética sobre la que pueden actuar mecanismos evolutivos. Esto hace que los genomas bacterianos, y sobre todo los pl1smidos, sean relativamente din1micos y maleables a escala evolutiva.
2.3.2 NUEVOS ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVILES #omo dijimos, en los !ltimos años se han descrito nuevos tipos de elementos mviles que no se ajustan a los cl1sicos. 0lgunos de ellos poseen funciones simult1neamente de pl1smidos y transposones, otros tienen me'clas de rasgos de fagos y de pl1smidos, etc. )escribiremos brevemente algunos de ellos@ Ono de los primeros tipos de -nuevos elementos son los llamados transposones con"ugativos5 que presentan la propiedad de promover su diseminacin de una bacteria a otra por conjugacin. Los transposones movili!a#les consisten en un transposn que posee un sitio ori! similar al de ciertos pl1smidos conjugativos, y que puede ser transferido -pasivamente a otra c"lula mediante un pl1smido conjugativo coGresidente 2es decir, presente en la misma c"lula de origen3. Las islas genómicas son elementos discretos de 0): con tamaños de entre * y + Cb, presentes en ciertas cepas de una especie pero ausentes en otras, y que confieren notables ventajas adaptativas 2para ocupar nichos ecolgicos3. Muchas islas genmicas se asemejan a enormes transposones atípicos, que se insertan preferentemente en o cerca de ciertos genes cromosmicos 2como p. ej., genes de 0/:t3, que est1n enmarcados por secuencias cortas repetidas 2similares a las que usan ciertos fagos, como el fago 3, y que de hecho codifican una en'ima de tipo integrasa como la del propio fago . 0lgunas de estas islas a su ve' pueden transferirse activamente a otras c"lulas debido a que poseen tambi"n genes parecidos a los de los pl1smidos conjugativos. 0 su ve', las islas genmicas son de varios tipos en funcin de la ventaja adaptativa que confieren a las cepas que las albergan@ Las primeras en descubrirse fueron las llamadas islas de patogenicidad. 4ienen la capacidad de conferir a la cepa notables capacidades patog"nicas sobre animales, debido a que llevan genes de to(inas, adhesinas, siderforos, etc3. Ejemplos@ la -inocente )scherichia coli se convierte en una bacteria uropatgena cuando adquiere una cierta -isla< el temible bacilo del clera 2@ibrio cholerae3 parece proceder de inocuos parientes que, de ve' en cuando adquieren una de esas islas, y que codifica la to(ina col"rica< casos similares se han visto en otras bacterias ;ramGnegativas 2Aersinia$ Salmonella$ Neisseria3 y ;ramGpositivas 2 -isteria$ %lostridium3 Mientras que los casos anteriores son islas de patogenicidad locali'adas en el cromosoma, se han descubierto tambi"n ejemplos de islas situadas en pl1smidos. 4al es el caso del bacilo del carbunco 2mal llamado 1ntra( en español3 2 Bacillus anthracis3, que produce sus tres to(inas debido a genes de una isla genmica plasmídica. 0lgunas bacterias patgenas de plantas 2 anthomonas$ )r=inia3 tambi"n poseen islas genmicas. 0lgunas bacterias 2como ciertos #seudomonas3 poseen en islas cata#ólicas los genes que les confieren la propiedad de degradar compuestos contaminantes 2(enobiticos3. 0lgunas especies del grupo de (hi'obium poseen islas &(m 2de symbiotic3 donde se locali'an genes responsables de la interaccin simbitica con las raíces de ciertas
leguminosas.
En resumidas cuentas@ los elementos mviles permiten que los genomas procariticos sean relativamente -modulares y -maleables, y habida cuenta de que por sí mismos o por el efecto de pl1smidos y fagos se pueden movili'ar entre cepas y especies diferentes, suministran mecanismos r%pidos de cam#io evolutivo. En el caso de la adquisicin de islas genmicas, observa que el fenotipo de la bacteria cambia espectacularmente 2p. ej., de no patgena a patgena, de no simbitica a simbitica, etc3, por lo que este fenmeno se ha calificado como de -evolucin por saltos cu1nticos. 0ntes de terminar esta parte del tema sobre el 0): procaritico, debemos decir que la mayor parte del genoma bacteriano consta de genes y conjuntos de genes 2y a diferencia de eucariotas, e(iste poco 0): -no g"nico y pocas secuencias cortas repetidas sin funcin clara3. La mayoría de los genes codifican proteínas, bien sean estructurales o en'im1ticas. La -ruta de e(presin por la que la secuencia de un gen se decodifica hasta proteína consta de dos fases@ transcripcin y traduccin. On concepto muy importante a tener ya en cuenta, y que distingue la organi'acin gen"tica procaritica de la eucaritica es que los genes bacterianos relacionados con una misma funcin gen"tica suelen estar agrupados de forma contigua, formando una unidad de transcripcin y de regulacin gen"tica que se denomina operón, bajo el control unitario de unas secuencias de 0): colocadas en el lado +, entre las que siempre e(iste una llamada promotor, que es el lugar de entrada de la 0/: polimerasa.
3 RIBOSOMAS SÍNTESIS Y PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS
3.1 ESTRUCTURA DEL RIBOSOMA EUBACTERIANO La ausencia de membrana nuclear en los procariotas hace que la traduccin de un mensaje ocurra mientras ese mensaje a!n no ha terminado de formarse@ tan pronto como ha comen'ado la transcripcin de un opern, los ribosomas se unen al e(tremo +U del mensajero naciente, y da comien'o enseguida la traduccin del mensaje. Esto constituye otro rasgo distintivo de la e(presin gen"tica en procariotas@ la transcripción ( la traducción est%n estrec,amente acopladas. &gualmente característico de las eubacterias es el hecho de que el primer amino1cido que se incorpora no es la metionina, sino la :G formilGmetionina. #omo ya vimos, en las micrografías electrnicas de cortes finos de bacterias el citoplasma aparece muy granulado, correspondiendo estos granos a los *. a *+. ribosomas que posee cada c"lula 2dependiendo de la fase de crecimiento3. El ribosoma es probablemente el complejo supramacromolecular m1s estudiado, a pesar de lo cual, y debido a su e(traordinaria complejidad, a!n reserva una buena cantidad de aspectos no totalmente comprendidos. :os referiremos a la composicin y estructura del ribosoma eubacteriano 2concretamente, de la especie en que est1 mejor estudiado@ )scherichia coli, por supuesto3. El ribosoma est1 compuesto de un ?DW de 0/: 2que a su ve' representa m1s del =W del 0/: total de la bacteria3 y un D>W de proteínas. El ribosoma eubacteriano posee un coeficiente de sedimentacin de >9, frente al de 9 de los ribosomas citopl1smicos eucariticos. 6ajando la concentracin de iones Mg cada ribosoma se disocia en sus dos subunidades@ la pequeña 2D93 y la grande 2+93. Cn vivo esta disociacin ocurre cada ve' que se completa la síntesis de una mol"cula de proteína, para volver a unirse las dos subunidades al inicio del mensaje de otro gen. M!ltiples t"cnicas moleculares 2algunas relativamente recientes3 permiten desentrañar aspectos de los ribosomas@ difraccin de rayos $< difraccin de neutrones< inmunoelectromicroscopia.
&u#unidad pe-ueQa 13M& #apeles@ Est1 implicada principalmente en decodificar la informacin del 0/:m. #ontiene los sitios de unin para los 0/:t cargados. 4iene un papel central en el inicio de la traduccin.
%omposicin y estructura@ #ontiene un solo tipo de 0/:@ el 0/:r *?9, con una característica estructura secundaria con 'onas de emparejamiento intracatenario 2de cadena doble3 y bucles. Posee J* tipos de proteínas, denominadas 9*, 9J ... 9J*. Las posiciones relativas de algunas de estas proteínas han podido ser -cartografiadas en el conjunto de la estructura de la subunidad D9 por las t"cnicas citadas arriba.
&u#unidad grande 1;M& #apeles@ &nterviene principalmente en la formacin del enlace peptídico entre el amino1cido situado en el sitio 0 2ligado a su 0/:t3 y el p"ptido naciente 2unido a un 0/:t3 del sitio P. %omposicin y estructura@ Posee dos tipos de 0/:@ 0/:r JD9 y 0/:r +9, cada uno con su correspondiente y peculiar estructura secundaria 2En general, los 0/:r presentan abundantes 'onas de emparejamientos intracatenarios y bucles de cadena sencilla3. #ontiene DJ tipos de proteínas diferentes, denominadas L* ... LDJ. La L> y la L*J tienen la misma secuencia, pero la L> est1 modificada químicamente en su e(tremo amino por unin con un radical acetilo. #on e(cepcin de L>]L*J, que est1n presentes en F copias cada una, las dem1s aportan una sola mol"cula cada una a la subunidad grande. %"ase en la figura la locali'acin de algunas de estas mol"culas dentro de la estructura global. La secuencia primaria y la estructura secundaria de los 0/:r est1n muy conservados evolutivamente@ hay pocas diferencias entre bacterias muy alejadas desde el punto de vista filogen"tico 2Podría el alumno e(plicar el porqu" de esta notable conservacin química y estructural[3. Parece ser que el papel principal de los 0/:r es suministrar un -n!cleo sobre el que se van ensamblando ordenadamente las proteínas ribosmicas, interaccionando con sitios específicos de los 0/: y con otras proteínas. /ecientemente se est1n acumulando pruebas de que el 0/:r pueda jugar, adem1s, alg!n papel funcional, aparte del estructural@ El 0/:r *?9, adem1s de unirse por su e(tremo DU con la secuencia de 9hineG)algarno del e(tremo +U del 0/:m, parece representar un papel en la terminacin de la síntesis de proteínas. El 0/:r JD9 tiene un papel en la elongacin, interaccionando con factores EH. &ncluso e(iste la sospecha de que es una ribo'ima necesaria para la actividad peptidilGtransferasa.
3.2 EL MECANISMO DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS
0!n no tenemos un cuadro completo de cmo coordina el ribosoma la compleja serie de reacciones que forman parte de la traduccin@ unin y liberacin de los 0/:t, transpeptidacin, movimientos coordinados del molde de 0/:m y del p"ptido naciente, etc. 9in embargo, el intenso estudio al que se est1n sometiendo el ribosoma y el proceso de la traduccin desde los años ? ha permitido notables profundi'aciones. El alumno de biolgicas puede recurrir a los conocimientos que se imparten en otras asignaturas de la Licenciatura 26ioquímica, ;en"tica, 6iología Molecular3 y a alguno de los e(celentes te(tos modernos. El sitio de entrada del ribosoma al 0/:m es la secuencia de &,ine=)algarno 1&= )5 cerca del e(tremo + del mensajero, de unas = pb, y complementaria de e(tremo D del 0/:r *?9 2de la subunidad pequeña del ribosoma3. Esta secuencia de 9G) est1 situada dentro de una regin m1s amplia de secuencia no aleatoria que abarca desde la base J a la *D. 4ambi"n es importante la distancia entre la 9G) y el codn iniciador. La formacin del complejo iniciador con la subunidad D 9 requiere los factores de iniciacin &H*, &HJ e &HD, el 0/:m y un 0/:t especial, cargado normalmente con el amino1cido :GformilGmetionina. 2El grupo formilo bloquea el grupo amino de ese amino1cido iniciador, de modo que obliga a que la síntesis proceda slo en una direccin3.
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omo los procariotas suelen tener mensajes policistrnicos, cuando un ribosoma llega al final de un gen, se puede mover hasta encontrar otro codn iniciador, pero si el espacio intercistrnico es muy grande, se puede disociar el ribosoma, de modo que las subunidades deben reensamblarse para continuar la lectura del mensaje.
3.3 EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS( PAPEL DE LAS PROTEÍNAS CELADORAS =;CHAPERONAS<> Kasta hace poco se pensaba que el polip"ptido naciente adquiría espont1neamente su configuracin funcional al ser sinteti'ado en el ribosoma. Pero hoy se sabe que tanto el correcto plegamiento de las proteínas como su adecuado ensamblaje en complejos requiere el concurso de unas proteínas especiales, conocidas como prote6nas celadoras o Lcara#inas moleculares0, debido a que su papel es vigilar y eventualmente corregir el plegamiento. 29e est1 imponiendo, para denominarlas, la castellani'acin de su nombre ingl"s@ chaperonas, procedente de chaperones3. Estas proteínas est1n presentes en todos los seres vivos. 0lgunas de ellas se inducen ante determinados estr"s ambientales< de hecho se descubrieron como proteínas inducibles ante un aumento de temperatura, por lo que se denominaron como prote6nas del c,o-ue térmico 2 con su acrnimo ingl"s sp3.
En )scherichia coli se han estudiado especialmente la )na7, )naN, ;rpE, ;roEL y ;roE9. Parece que act!an de un modo secuencial@ *. #uando el ribosoma a!n est1 sinteti'ando la proteína y ya ha -asomado la primera porcin del polip"ptido, se une la )naN a esa parte del polip"ptido a!n sin plegar. J. Enseguida se une la )na7, que ha formado antes un complejo con el 04P, y se produce hidrlisis de este 04P 2pero quedando el 0)P unido a )na73, lo que aumenta la afinidad de )na7 por el polip"ptido sin plegar. D. #uando se ha sinteti'ado toda la proteína, la ;rpE se une al complejo polip"ptidoG )naNG)na7G0)P, liberando el 0)P. F. :uevas mol"culas de 04P se unen ahora a )na7, con lo que se facilita la disociacin de las proteínas )na7 y )naN respecto del polip"ptido. En este momento, muchos polip"ptidos pueden haber adquirido su configuracin final, pero otros necesitan a!n un paso final de -refinamiento@ +. El polip"ptido pasa al canal interior formado por ;roEL y ;roE9, que catali'an 2con gasto de 04P3 la correcta isomeri'acin, de modo que la proteína adquiere su plegamiento nativo biolgicamente activo.
4 INCLUSIONES Y ORGÁNULOS PROCARIOTAS 4.1
INCLUSIONES DE RESERVA
9on ac!mulos de sustancias org1nicas o inorg1nicas, rodeadas o no de una envuelta limitante de naturale'a proteínica, que se originan dentro del citoplasma bajo determinadas condiciones de crecimiento. #onstituyen reservas de fuentes de # o : 2inclusiones org1nicas3 y de P o 9 2inclusiones inorg1nicas3. Estudiaremos@ *3 7nclusiones org%nicas* a3 inclusiones polisacarídicas b3 gr1nulos de poliG`Ghidro(ibutírico 2o, en general de poliG`Ghidro(ialcanoatos3 c3 inclusiones de hidrocarburos d3 gr1nulos de cianoficina J3 7nclusiones inorg%nicas* a3 gr1nulos de polifosfato b3 glbulos de a'ufre
4.1.1 INCLUSIONES POLISACARÍDICAS 9on acumulaciones de 2*F3 glucanos, con ramificaciones en 2*?3, principalmente almidn o glucgeno 2seg!n especies3, que se depositan de modo m1s o menos uniforme por todo el citoplasma cuando determinadas bacterias crecen en medios con limitación de fuente de N, pero donde a!n sean abundantes las fuentes de # y energía. En esta situacin, se detiene pr1cticamente la síntesis de proteínas y de 1cidos nucleicos, y la mayor parte del # asimilado se convierte r1pidamente en estos materiales de reserva. #uando a estas c"lulas las pasamos a un medio rico en :, pero carente de fuente de #, estas inclusiones se usan como fuente interna de # para la síntesis de 1cidos nucleicos y proteínas. Estas inclusiones act!an, pues, como sistemas de almacenamiento de carbono osmóticamente inertes 2la c"lula puede albergar grandes cantidades de glucosa que, si estuvieran como mol"culas libres dentro del citoplasma, podrían tener efectos osmticos muy negativos3. Para observarlas se recurre a la tincin con una solucin de &J &7 2como el lugol3 glucgeno@ aparece de color pardoGroji'o< almidn 2amilopectina3@ color a'ul
4.1.2 GRÁNULOS DE POLIHIDROIBUTÍRICO =PHB> Y DE POLI HIDROIALCANOATOS Los gr1nulos de poliGGhidro(ibutírico son ac!mulos del poli"ster del 1cido `G hidro(ibutírico 2X DGhidro(ibutírico3, rodeados de una envuelta proteínica, y que al igual que en el caso anterior, se producen en ciertas bacterias como reserva osmóticamente inerte de en condiciones de hambre de :. 0dem1s de la proteccin osmtica, estos gr1nulos suponen la ventaja de neutrali'ar un metabolito 1cido 2el grupo carbo(ilo de cada unidad de `Ghidro(ibutírico desaparece como tal, al intervenir en el enlace "ster con la siguiente unidad3. En las especies de Bacillus constituye la fuente de carbono y energía al inicio de la esporulacin. Ona funcin semejante parece implicada a la hora del enquistamiento de &'otobacter . Ona c"lula puede contener de a *J de estos gr1nulos, que miden unos .JG.> m de di1metro, y que van provistos de una envuelta proteica de unos DGF nm de grosor. Pueden llegar a representar el W en peso de la c"lula. 0 diferencia de los ac!mulos de polisac1ridos, los gr1nulos de PK6 son visibles a microscopio ptico en fresco, debido a su elevado índice de refringencia. 9e tiñen bien mediante :egroG9ud1n. En los !ltimos años est1 quedando patente que los gr1nulos descritos de PK6 son un ejemplo de una clase m1s amplia de gr%nulos de poli=@=,idro$i=alcanoatos. P,6 98:,( 0*;, ;+69-*0;07 78-7 ; seudomonas 6* * *>,+0*, ,9, <*+ ; 06,*," 7 09:0 * 8,:96, ; 7+67 ;: K-;, X>-;6,J->,+0*,-," ,* *0 <*-* 9+0:-0 790*+ 0 :0 ;: PHB. C-6+07 807 ; Ralstonia eutropha" 0*;, 6* * :,70 86,8-*-, 86,;* ,8,:96,7 0:0+,6-,7 ; *-;0;7 ; >-;6,J-+6-, >-;6,J-/0:6-, =3>-;6,J-8*+0*,-,?. EJ-7+* -*+670*+7 8678+-/07 ; 086,/09-*+, ,*9-, ; 7+,7 8,:96,7" 0 @ :,7 PHA 7 ,98,6+0* ,9, J:*+7 +69,8:K7+-,7 -,;60;0:7. P,6 98:," :0 98670 6-+K*-0 ICI +-* 80+*+0;,7 86,7,7 -*;7+6-0:7 8060 <06-06 PHA ;,*; 07- : %& ; :07 *-;0;7 7,* ; -;6,J-/0:6-," @ ;0 * 8,:96, <:J-: ,96-0:-0;, ,* : *,96 ; B-,8,: . L,7 8,:96,7 0 07 ; 4> , 5>-;6,J-+6-, 3>-;6,J-+6-, 7,* 9K7 :06,7" 9K7 :K7+-,7 9K7 -,;60;0:7 =7 0* 98:0;, * :0 <06-0-* ; */077? ®
4.1.3 INCLUSIONES DE HIDROCARBUROS 9on ac!mulos de reserva 2con envuelta proteinica3 de los hidrocarburos que determinadas bacterias 2especialmente 0ctinomicetos y relacionados3 usan como fuente de #.
4.1.4 GRÁNULOS DE CIANOFICINA Muchas cianobacterias 25(ifotobacterias3 acumulan grandes gr1nulos refringentes de reservas nitrogenadas cuando se acercan a la fase estacionaria de crecimiento. Estos
gr1nulos de cianoficina son ac!mulos de un copolímero de arginina y asp1rtico@ consta de un n!cleo de poliasp1rtico, en el que todos los carbo(ilos de las cadenas laterales est1n unidos con LGarginina. 9u síntesis no est1 basada en el mecanismo habitual en ribosomas, ya que no se ve inhibida por el cloramfenicol.
4.1.5 GRÁNULOS DE POLIFOSFATOS 9e denominan tambi"n gr1nulos de volutina o metacrom1ticos. El nombre de -metacrom1ticos alude al efecto metacrom1tico 2cambio de color3@ cuando se tiñen con los colorantes b1sicos a'ul de toluidina o a'ul de metileno envejecido, se colorean de rojo. 0 microscopio electrnico aparecen muy densos a los electrones. 9on ac!mulos de polifosfato, polímeros lineales del ortofosfato, de longitud variable 2por t"rmino medio, unas + unidades3, que representan un modo osmticamente inerte de almacenar fosfato. Parece ser que la parte central de estos gr1nulos constituye un n!cleo formado por lípidos y proteínas. En algunos casos pueden constituir una fuente de energía, en sustitucin del 04P 2se trata en este caso de una especie de -fsil bioquímico[3. 9e acumulan cuando alg!n otro nutriente distinto del fosfato se hace escaso 2sobre todo cuando va desapareciendo el sulfato3. En estas condiciones se detiene la síntesis de los 1cidos nucleicos, y la volutina se acumula a la espera de su utili'acin para esta síntesis de nucleicos, cuando apare'ca el nutriente originalmente limitante.
4.1. GLÓBULOS DE AUFRE Las inclusiones de 9 aparecen en dos grupos de bacterias que usan sulfuro de hidrgeno 29KJ3@ las bacterias purp!reas del a'ufre 2que usan el 9KJ como donador de electrones para la fotosíntesis3< bacterias filamentosas no fotosint"ticas como Beggiatoa$ !hiomargarita o !hiothrix, que lo usan como donador de electrones para sus o(idaciones. En ambos casos, el sulfuro de hidrgeno es o(idado a a'ufre elemental 293, que en el citoplasma se acumula como glbulos muy refringentes y rodeados de envuelta proteínica. Estos glbulos son transitorios, ya que el 9 se reutili'a por o(idacin hasta sulfato, cuando en el medio se agota el sulfuro.
4.2
OTRAS INCLUSIONES
4.2.1 INCLUSIONES DE SALES MINERALES 0c!mulos grandes, densos y refringentes de sales insolubles de calcio 2sobre todo carbonatos3 que aparecen en algunas bacterias 2como &chromatium3, cuyo papel parece consistir en mantenerlas en el fondo de los lagos y ríos.
4.2.2 FICOBILISOMAS 9on estructuras supramacromoleculares, en forma de cilindros o bastones, adosadas a la superficie de la membrana tilacoidal de las #ianobacterias, confiriendo a "sta un típico aspecto -granuloso en las micrografías electrnicas. #omo se puede ver en el esquema, est1n constituidas por pilas de discos a base de fico#iliprote6nas, cromoproteínas que sirven como -antenas para la captacin de lu' en la fotosíntesis de estos procariotas. Los grupos cromforos son@ ficocianinas, aloficocianinas y ficoeritrina. #omo veremos oportunamente, la disposicin ordenada de los distintos pigmentos tiene un papel central en la -canali'acin de la energía de la lu' hacia los centros de reaccin 2ubicados ya en plena membrana tilacoidal3 donde se locali'an los complejos fotosint"ticos proteínasGclorofilas.
4.3 ORGÁNULOS PROCARIÓTICOS CITOPLÁSMICOS #omo ya dijimos, en procariotas no e(isten por regla general org1nulos citopl1smicos rodeados por unidad de membrana. Las !nicas e(cepciones est1n constituidas por los tilacoides de las 5(ifotobacterias, ya estudiados en el capítulo anterior. En algunos grupos bacterianos se pueden encontrar org1nulos citopl1smicos no rodeados por unidad de mem#rana 2o sea, sin bicapa lipídica3. Muchos de ellos presentan envueltas basadas en subunidades de proteínas@ carbo(isomas vacuolas de gas clorosomas magnetosomas.
4.3.1 CARBOISOMAS = CUERPOS POLIÉDRICOS> Estructuras presentes en bacterias fotoautotrofas 2#ianobacterias y ciertas bacterias purp!reas3 y quimioautotrofas 2nitrificantes, !hiobacillus3, de apariencia poli"drica con tendencia a esf"rica. 9u di1metro oscila entre + y + nm, y est1n rodeadas de envuelta monocapa proteinica de unos D,+ nm. El interior tiene aspecto granular, debido a la acumulacin de la en'ima ri#ulosa=#ifosfato=car#o$ilasa 2/u6is#o, la carbo(idismutasa, el en'ima clave en el ciclo de #alvin de asimilacin de #5J3. 0unque se pens que eran los sitos de fijacin del #5J, parece m1s bien que se trata de reservas de dicha en'ima.
4.3.2 VACUOLAS DE GAS 9on org1nulos muy refringentes al microscopio ptico, que al electrnico muestran una estructura a base de agrupaciones regulares de ves6culas de gas. #ada vesícula tiene una forma de cilindro bicnico 2JG* nm de longitud y unos > nm de di1metro3, rodeado de una monocapa de unidades globulares de proteína ensambladas helicoidalmente
que dan un aspecto a bandas 2-costillas3. Esta envuelta es impermeable al agua, pero permeable a los gases, por lo que la composicin y concentracin del gas dentro de la vesícula depende de las que e(istan en el medio. #onforme se sinteti'an y ensamblan las vesículas, el agua va siendo eliminada del interior. Las vesículas de gas est1n constituidas por dos tipos de proteína@ la mayoritaria ;vp0 es una pequeña proteína rígida y muy hidrfoba. 9u rigide' est1 en la base del hecho de que las vesículas y vacuolas de gas aguanten presiones e(ternas. La proteína minoritaria ;vp# tiene como funcin refor'ar las vesículas de gas. La funcin de estas vacuolas es mantener un grado de flota#ilidad óptimo en los h1bitats acu1ticos a las bacterias que las poseen, permiti"ndoles alcan'ar la profundidad adecuada para su modo de vida 2seg!n los casos, para obtener una intensidad adecuada de lu', concentracin ptima de o(ígeno o de otros nutrientes3. Las vacuolas de gas son muy frecuentes en eubacterias fototrofas 2#ianobacterias y bacterias fotosint"tiocas purp!reas y verdes3< tambi"n se dan en algunas arqueas 2 5alobacterium, algunas metangenas3 y en bacterias prostecadas 2&ncalomicrobium$ #rosthecomicrobium3.
4.3.3 CLOROSOMAS 9on vesículas oblongas situadas por debajo de la membrana citopl1smica, que contienen los pigmentos antena de las bacterias fotosint"ticas verdes 2antigua familia %hlorobiaceae3. 9on invisibles a microscopía ptica< miden *G*+ nm de longitud y unos + nm de anchura, estando rodeadas de una monocapa de proteínas. 9e disponen por debajo de la membrana citopl1smica, sin estar en continuidad con ella, aunque en muchos casos aparecen conectadas a trav"s de un ped!nculo de naturale'a no lipídica.
4.3.4 MAGNETOSOMAS 9on org1nulos sensores del campo magn"tico terrestre, que aparecen en ciertas bacterias acu1ticas flageladas microaerfilas o anaerobias 2p. ej., en &+uaspirillum magnetotacticum3. #onsisten en cristales homog"neos de magnetita 2HeD5F3, de formas cuboGocta"dricas o de prisma he(agonal delimitados por una envuelta proteínica. Los diversos cristales suelen disponerse en filas paralelas al eje longitudinal de la bacteria, o en otras agrupaciones regulares de varios unidades, hasta varias decenas. Hueron descubiertas en *=>+, y se sabe que permiten la orientacin magn"tica a las bacterias que las poseen 2bacterias magnetot1cticas3, determinando la orientacin de su natacin. En el hemisferio :orte, el campo magn"tico est1 orientado hacia abajo, y en el sur hacia arriba. Las bacterias magnetot1cticas del hemisferio septentrional se orientan al :, y las del meridional, al 9. Por consiguiente, cuando las bacterias son removidas de los fondos donde viven, por magnetota(ia pueden volver al fondo, que es donde encuentran las concentraciones de o(ígeno adecuadas para su modo de vida.
LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA ESPORULACIÓN 1.1
INTRODUCCIÓN A LA ESPORULACIÓN BACTERIANA
1.2
OBSERVACIÓN DE LAS ESPORAS
1.3
ESTRUCTURA Y COMPOSICION #UIMICA DE LA ENDOSPORA
1.3.1
PROTOPLASTO O NWCLEO
1.3.2
PARED DE LA ESPORA
1.3.3
CORTEQA O CÓRTE
1.3.4
CUBIERTAS
1.3.5
EOSPORIO
1.4
DESENCADENAMIENTO DE LA ESPORULACIÓN
1.5
FASES DE LA ESPORULACIÓN
1.
GENÉTICA MOLECULAR DE LA ESPORULACIÓN
1.!
CUERPOS PARASPORALES
1.$
PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LAS ESPORAS( SU FUNDAMENTO
1.%
GERMINACIÓN DE LA ENDOSPORA
1.%.1
PREACTIVACIÓN
1.%.2
ACTIVACIÓN
1.%.3
INICIACIÓN O GERMINACIÓN EN SENTIDO ESTRICTO
1.%.4
TERMINACIÓN Y CRECIMIENTO ULTERIOR
2
EOSPORAS
3
DIFERENCIACIONES EN LOS ACTINOMICETOS
4
#UISTES BACTERIANOS
5
DIFERENCIACIONES EN CIANOBACTERIAS
ENLACES
Kasta ahora hemos abordado la estructura y funciones de las diversas partes de la c"lula procariota. Para terminar esta seccin del programa, en este capítula vamos a tratar de algunos casos de diferenciacin celular en bacterias, es decir, procesos por los que a partir de c"lulas -normales 2vegetativas3 se producen formas celulares especiali'adas. 0lgunas de ellas son formas de reposo, capaces de aguantar mucho tiempo en ausencia de nutrientes 2caso de la endospora3. Muchas de ellas pueden resistir circunstancias ambientales adversas 2la endospora es, de hecho, la forma bacteriana m1s resistente a calor, desecacin, lu' O%, etc3.
1 LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA ESPORULACIÓN 1.1 INTRODUCCIÓN A LA ESPORULACIÓN BACTERIANA 0lgunas especies de bacterias ;ram positivas 2principalmente de los g"neros Bacillus$ %lostridium$ Sporosarcina y !hermoactinomyces3, disponen de una notable estrategia adaptativa cuando se ven sometidas a privacin de nutrientes en su medio ambiente@ si los niveles de fuentes de #, :, o P caen por debajo de un umbral, esto constituye una señal a la c"lula de que se avecina un largo período de privacin de nutrientes. Entonces, la c"lula se implica en una serie de complejos cambios gen"ticos, metablicos, estructurales, etc. 2proceso de esporulación o esporogénesis3, que conducen a la diferenciacin, en el interior de la c"lula vegetativa original, de una c"lula durmiente 2la endospora3. La c"lulaGmadre 2o sea, la c"lula vegetativa original que gener la endospora3 finalmente se autolisa, liberando la espora, que es capa' de permanecer en estado criptobitico, durmiente, varios decenios, Gincluso siglos. Las esporas son f1cilmente diseminadas por el aire< cuando caen en medios ricos en nutrientes, se desencadena su germinación, se reinicia la actividad metablica, de modo que cada espora genera una nueva c"lula vegetativa, capa' de divisn binaria, etc. 5 sea, la esporulacin se puede considerar como un proceso de supervivencia -en !ltima instancia, la -!ltima carta que se juegan ciertas bacterias ;ram positivas cuando se enfrentan a condiciones severas de hambre de nutrientes.
&ignificado adaptativo@ Estas bacterias suelen vivir en medios nutricionalmente pobres 2suelos, hierba seca, etc.3. La esporulacin es un proceso muy refinado que ha aparecido evolutivamente en una línea filogen"tica de bacterias ;ramGpositivas, y que les permite sobrevivir largos períodos de carencia nutricional. 20tencin@ :5 son estrictamente formas de resistencia3. Las endosporas son formas de reposo 2y no formas reproductivas3, que representan una etapa del ciclo de vida de ciertas bacterias, y que se caracteri'an por una estructura peculiar, diferenciada respecto de las c"lulas vegetativas, por un estado metablico pr1cticamente detenido, y por una elevada resistencia a agentes agresivos ambientales. La esporulacin bacteriana es un sistema modelo donde se pueden estudiar, con relativa sencille', determinados pro#lemas #iológicos m%s generales@ qu" bases moleculares y gen"ticas tiene la diferenciación de un tipo de célula a otro tipo distinto[, cmo se regula el proceso en función del tiempo ( del espacio[, cmo se -reparten los papeles0 los tipos celulares implicados[, etc. Por esta ra'n, presenta un enorme inter"s para los bilogos, interesados en escudriñar las bases íntimas de este tipo de importantes cuestiones, tan frecuentes en los organismos superiores.
1.2 OBSERVACIÓN DE LAS ESPORAS 0l microscopio ptico, en fresco 2sin teñir3, aparecen como cuerpos esf"ricos, ovoides e incluso en algunas especies, cilíndricos, mu( refringentes, libres, o a!n incluidos en la c"lula vegetativa 2c"lula madre3. Esporangio X c"lula madre espora El tamaño relativo de la espora, y su situacin en el esporangio, son criterios ta(onmicos importantes en las bacterias esporulantes. 9eg!n que el di1metro de la espora sea o no mayor que el de la c"lula vegetativa@ Esporas deformantes Esporas no deformantes 9eg!n la locali'acin de la espora dentro del esporangio@ 4erminal 9ubterminal #entral Los esporangios deformantes de %lostridium son característicos@ en forma de cerilla o palillo de tambor 2plectridios3 en huso 2clostridios3
inción@
:o se tiñen por los colorantes normales. Kay que for'ar por calor y]o mordientes 2por ejemplo, tras teñir refor'adamente con fuchsina, resisten decoloracin por alcoholG #lK3. 5tra tincin muy empleada es la refor'ada con verde de malaquita 2+ue es la +ue el alumno reali'a en nuestras pr9cticas de laboratorio3.
1.3 ESTRUCTURA Y COMPOSICION #UIMICA DE LA ENDOSPORA Partes que comprende la endospora@
Protoplasto o ncleo 2-core, en ingl"s3, con la membrana citopl1smica de la espora 2membrana esporal interna3. Pared de la espora 2X Germen de la pared de la futura célula vegetativa3. orte!a o córte$, rodeado e(ternamente de la membrana esporal e(terna. u#iertas E$osporio 2no universal@ las esporas de algunas especies carecen de "l3.
M*:-:/?@/ ,+,*8:*/ 6), ),08:/ +/0 /:8,0 :*/+,0 , )/ ,-0-:/
1.3.1 PROTOPLASTO O NCLEO El citoplasma de la espora est% mu( des,idratado. 9us componentes est1n inmovili'ados en una matri! de -uelatos de iones aOO ( %cido dipicol6nico . El citoplasma de la espora contiene altas concentraciones de ion #a 2*GDW del peso seco de la espora3, y de 1cido dipicolínico 2)P03 2*W en peso3< ambos est1n
formando un quelato, llamado dipicolinato c1lcico 2)P#3, una sustancia e(clusiva de las esporas bacterianas.
Papel del )P@ #omo veremos, es una -reserva de #aJ, que durante la esporulacin secuestra este in, lo que tendr1 un papel importante en la deshidratacin del protoplasto< durante la germinacin, la liberacin del #aJ ser1 fundamental en este proceso. El protoplasto contiene un cromosoma completo, condensado, y todos los componentes indispensables para reiniciar el crecimiento vegetativo cuando la espora germine, pero carece de muchos componentes típicos de la c"lula vegetativa@ posee una pe-ueQa dotación de ri#osomas, junto con componentes estables de la maquinaria de síntesis de proteínas 20/:t, cofactores, etc.3 0/: polimerasa. nuclesidos monoG y difosfatados, pero no NP 1no ,a( AP carece de componentes inestables@ no ,a( ARNm5 ni en!imas #iosintéticas5 ni amino%cidos ni #ases nitrogenadas li#res5 ni cofactores reducidos 1NA) oA pero en cambio, e(iste una gran cantidad de una serie de pequeñas proteínas especiales 2llamadas &A&P, del ingl"s -small acidGsoluble proteins3. #uando se produ'ca la germinacin, estas proteínas ser1n hidroli'adas r1pidamente, y los amino1cidos resultantes ser1n empleados en la síntesis de nuevas proteínas necesarias en la germinacin y crecimiento ulterior. 0dem1s, las 909Ps est1n acomplejando al 0): 2induciendo en "l un cambio conformacional hacia la rara forma 0, en ve' de la 6 habitual3, protegi"ndolo del daño por lu' O%. la -moneda energ"tica de la espora es el 3=fosfoglicerato, otra mol"cula estable del protoplasto, que ser1 convertido r1pidamente a JGfosfoglicerato, y de "l a PEP 2fosfoG enolGpir!vico3 al germinar la espora 2el PEP es donador de P para generar 04P3. /odeando al protoplasto est1 la mem#rana citopl%smica 1mem#rana interna de la espora, una bicapa lipídica carente de fluide!, posiblemente como resultado de su estructura policristalina.
1.3.2 PARED DE LA ESPORA &ituación@ inmediatamente por encima de la membrana interna de la espora 2ver micrografía a microscopio electrnico, o el esquema de la ultraestructura3. omposición@ a base de un peptidoglucano 2P;3 similar al de la c"lula vegetativa, con sus característicos enlaces entre los tetrap"ptidos. 'unciones@ al germinar la espora, dar1 lugar a la pared celular de la nueva c"lula vegetativa, confiri"ndole, mientras tanto, resistencia osmtica. rigen@ se sinteti'a a partir de la prespora, atravesando los precursores la membrana interior que hemos citado arriba.
1.3.3 CORTEA O CÓRTE /Obs0rvese su aspecto a microscopio electrnico6 transparente a los electrones$ relativamente gruesa$ a base de l9minas conc0ntricas2.
omposición@ un peptidoglucano 2P;3 especial, diferente en composicin al P; de la c"lula vegetativa@ DW del :0M tiene tetrap"ptidos normales, pero el grado de entrecru'amiento es muy bajo 2?W3. *+W del :0M tiene solo la LGala inicial, en lugar de tetrap"tido. ++W de una modificacin del 1cido mur1mico 2lactama del 1cido mur1mico3, producida por condensacin del G#55K lactilo con el G:KJ, para formar la lactama correspondiente3.
rigen@ 9e sinteti'a a partir de la c"lula madre, con sus intermediarios ensamblados a nivel de la membrana e(terna que rodea a la corte'a. Propiedades de la corte!a@ *3 4iene un bajo grado de puentes entre tetrap"ptidos 2slo un ?W3. Ello condiciona@ a3 una estructura m1s la(a, floja y fle(ible que el peptidoglucano normal, capa' de e(pandirse en ausencia de cationes que neutralicen sus grupos negativos 2sobre todo del m)0P y del glut1mico de los tetrap"ptidos3. Esto es la base de su apariencia de gel. b3 su r1pida autolisis, durante la germinacin de la espora. J3 la lactama del mur1mico condiciona una gran resistencia a la liso'ima. La corte'a est1 limitada por la mem#rana esporal e$terna, procedente de invaginacin de la membrana citopl1smica de la c"lula vegetativa madre. Posee una polaridad opuesta a la de la membrana esporal interna.
1.3.4 CUBIERTAS omposición ( estructura@ la composicin depende de las especies, pero en general, a base de una o varias proteínas de tipo queratina, todas muy ricas en cisteína y en amino1cidos hidrfobos, y que llegan a constituir el ?W en peso seco de la espora. 6uena parte de la cisteína se añade postGtraduccionalmente, por modificacin de la proteína inmadura. 0 microscopio electrnico se puede comprobar el gran grosor 2volumen3 de las cubiertas, y su aspecto relativmante denso a los electrones.
Propiedades@ son muy insolubles e impermeables, e impiden la entrada de numerosos agentes químicos, incluyendo sustancias t(icas. La abundancia de puentes 9G9 las hace muy compactas y muy estables químicamente.
*.D.+ EOSPORIO En B. cereus es una estructura membranosa transparente, a modo de saco cerrado, delgado y flojo, envolviendo al resto de la espora de una forma -suelta, despegado en principio respecto de las cubiertas 2tras la liberacin de la espora, al perderse el contenido acuoso que había entre e(osporio y cubiertas, aquel se pega a "stas3. En B. subtilis y B. megaterium, el e(osporio est1 envolviendo a la espora de una forma m1s estrecha, estableciendo algunos contactos físicos con la superfie de las cubiertas.
omposición -u6mica@ me'cla de proteínas, polisac1ridos complejos, y lípidos. Propiedades@ muy resistente a en'imas proteolíticas, lo que sugiere 2pero no prueba directamente3 que el e(osporio puede representar alg!n papel como barrera de defensa e(terna de la espora.
1.4 DESENCADENAMIENTO DE LA ESPORULACIÓN Para que se produ'ca la esporulacin, se necesitan dos condiciones previas@ *3 los cultivos bacterianos han de estar en #uenas condiciones< J3 cuando cesa el crecimiento e$ponencial, la mayoría de las c"lulas entran en esporulacin, aunque el proceso no es sincrnico 2hay desfases entre unas c"lulas y otras3, de modo que en un lapso de tiempo relativamente breve 2+,+G horas en Bacillus subtilis3 casi todo el cultivo aparece en forma de esporas, habiendo desaparecido las c"lulas vegetativas. /a división celular t6pica de la fase de crecimiento e$ponencial ( la esporulación son procesos mutuamente e$clu(entes. 8u" est6mulo es el responsable de desencadenar la esporulacin[ Lo que detiene el crecimiento de estas bacterias y dispara la esporulacin es un estado de inanición, de carencia de nutrientes. El nutriente limitante que puede desencadenar la esporulacin puede ser@ la fuente de carbono, la fuente de nitrgeno o incluso la carencia de fosfatos.
1.5 FASES DE LA ESPORULACIÓN
%amos a estudiar la esporulacin en Bacillus subtilis o en B. megaterium, dos de las bacterias esporuladas mejor investigadas, y que completan la esporulacin al cabo de unas >G horas de su inicio, a D>#. 9e pueden distinguir siete fases consecutivas 2adem1s de la fase - anterior a la esporulacin3. #ada fase se denota con un n!mero romano, y su duracin en horas se e(presa como subíndice de t, p. ej., tJ. #omo veremos enseguida, cada fase se distingue por un2os3 evento2s3 citolgico2s3 peculiar2es3 y por una serie de cambios bioquímicos propios@
'ase M 1célula vegetativa@ 0l final del periodo de crecimiento e(ponencial, la c"lula vegetativa contiene dos cromosomas.
'ase 7 1tM=t* El material gen"tico 2los dos cromosomas3 se condensa constituyendo un filamento a$ial ancho, que ocupa el centro de la c"lula, seg!n su eje longitudinal. #ada nucleoide est1 unido a uno de los e(tremos de la c"lula. En ve' de iniciarse una divisin celular sim"trica 2con septo central3, se forman dos esp6culas de la pared celular cerca de los polos hacia el interior, rodeadas de la correspondiente invaginacin de la membrana citopl1smica. #ada espícula est1 señalando una 'ona donde se est1 formando el anillo de HtsQ 2proteína contr1ctil de tipo tubulina@
v0ase el tema 3 9e sinteti'an y se liberan al medio anti#ióticos y varias e$oen!imas. Ona serie de proteasas se encargan del turnover de proteínas intracelulares, cuyos amino1cidos constituyentes ser1n empleados para sinteti'ar nuevas proteínas específicas de la esporulacin.
'ase 77 1t=t2* 9e termina por formar un septo transversal acéntrico, cerca de un polo de la c"lula, por invaginacin de la membrana citopl1smica, y deposicin de nuevo peptidoglucano entre las dos membranas adyacentes. #ada nucleoide queda segregado en uno de los dos compartimentos -ue se ,an formado@ un cromosoma va al compartimento pequeño 2compartimento de la preespora3< la otra copia del cromosoma va al compartimento grande 2célula madre3. En esta fase contin!a la síntesis de los antibiticos y de las e(oen'imas 2serinaGproteasas, metaloGproteasas, ribonucleasas, Gamilasa, etc3.
'ase 777 1t2=t3* 7ndependi!ación del protoplasto de la preespora respecto de la célula madre. Para ello, lo primero que ocurre es la degradacin selectiva del peptidoglucano del septo que se había depositado en la fase && 2esta degradacin comien'a por el centro, es decir, por donde se había cerrrado, y sigue hacia la periferia, y en ella intervienen los productos de varios genes3. Entonces, la membrana citopl1smica de la c"lula madre va creciendo unidireccionalmente alrededor de la preespora, hasta que "sta queda libre en el citoplasma del esporangio. 5bs"rvese que el citoplasma de la preespora queda rodeado por dos mem#ranas de polaridad opuesta@ la interior tiene la polaridad normal, pero la e(terior, derivada del crecimiento de la membrana de la c"lula madre, tiene polaridad invertida 0 partir de esta fase el turnover 2renovacin3 de proteínas slo tendr1 lugar en la c"lula madre, deteni"ndose en el compartimento de la preespora. 'ase 7 1t3=t4* 9e forma casi por completo la corte!a de la espora, por deposicin de peptidoglucano entre las dos membranas. 9in embargo este P; a!n no est1 -maduro 2no tiene todavía las características que estudiamos en el apartado *.D.D3. 4ambi"n se deposita el peptidoglucano de la pared celular 2que constituye el germen de la pared celular de la futura c"lula vegetativa3. #oincidiendo con esto, la preespora ad-uiere su aspecto refr%ctil al microscopio ptico en fresco. #omien'a la síntesis del %cido dipicol6nico 1)PA, así como la acumulación de a2O. En las bacterias que lo poseen, en esta fase comien'a la síntesis del e(osporio.
'ase 1t4=t;5;*
Los materiales de las cu#iertas 2que se habían ido sinteti'ando durante las fases && y &&& en el compartimento de la c"lula madre3, comien'an a depositarse por fuera de la membrana esporal e(terna. 0l final de esta fase se ad-uiere la resistencia al octanol. #ontin!a la acumulacin de )P0, que sigue secuestrando iones #aJ 2formacin del quelato de dipicolinato c1lcico, )P#3.
'ase 7 1t;5;=tH* La preespora madura ,asta espora. Madura la corte'a 2para generar el característico P; cortical, m1s la(o, con su bajo porcentaje de entrecru'amientos Gpor actuacin de endopeptidasasG y la lactama del :0M3. Maduran las cubiertas. El citoplasma de la espora se hace m1s ,omogéneo ( m%s denso a los electrones. Por una serie de ra'ones a!n no totalmente aclaradas, la espora se hace resistente al calor ( al cloroformo. 9e adquiere resistencia a las radiaciones ultravioleta 1C. 9e adquiere resistencia a la liso!ima.
'ase 77 1tH=t<* /i#eración de la espora madura por autolisis de la c"lula madre. las bacterias que han producido e(osporio, cuando la espora sale al e(terior, este e(osporio pierde su contenido de citoplasma 2procedente de la c"lula madre3, quedando como un saco vacío y plegado, unido a las cubiertas. La parte superior de la figura muestra un gr1fico de los principales cambios que acabamos de comentar, e(presados en funcin del tiempo transcurrido desde el inicio de la esporulacin.
1. GENÉTICA MOLECULAR DE LA ESPORULACIÓN Las c"lulas pueden detener el proceso de la esporulacin si durante las F primeras fases se les suministra el nutriente que estaba limitando y que fue responsable del desencadenamiento 2efecto de des#lo-ueo meta#ólico3. Pero a partir de la fase % el aporte de nutrientes no tiene ya ese efecto inhibidor@ el proceso de la esporulacin ya es irreversible, y se dice que la c"lula est1 comprometida 1 o#ligada a esporular.
El proceso de la esporulación es mu( ordenado en el tiempo ( en el espacio. En su base gen"tica e(iste un conjunto de varios operones específicos de la esporulacin /operones spo 2, sometidos a un finísimo control gen"tico espacial y temporal. El conjunto de estos operones 2que se encuentran en cuatro 'onas distintas del cromosoma3, se denomina esporulón, y comprende m1s de *J+ genes. Las principales características de los operones del esporuln son@
Los operones est1n inactivos durante el crecimiento vegetativo< se van activando de modo ordenado ( secuencial, para luego ser reprimidos 2una ve' han actuado3< est1n sometidos a interacciones pleiotrpicas unidireccionales< e(iste una -comunicacin regulatoria entre el compartimento de la espora y de la c"lula madre 2interacciones espaciales3< dentro de los mecanismos gen"ticos implicados en la e(presin y regulacin de los distintos operones correspondientes a fases distintas de la esporulacin, un papel muy importante es el jugado por las su#unidades sigma 1 alternativas de la 0/:G polimerasa.
1.! CUERPOS PARASPORALES 0lgunas bacterias esporuladas, como Bacillus thuringiensis$ B. popiliae y algunas especies de %lostridium, forman cristales proteicos en el esporangio simult1neamente a la formacin de la endospora@ son los llamados cuerpos parasporales. #ada c"lula madre e(hibe una sola inclusin, que se puede presentar libre en el citoplasma, o bien englobada en el e(osporio de la espora. Los cuerpos parasporales pueden ser amorfos, pero los m1s típicos son pseudocristales octaédricos 1#ipiramidales. Est1n compuestos de la agregacin regular de subunidades de una glucoproteína de unos *J C)a, sinteti'ada durante la fase &%. La funcin de estos cuerpos parasporales en la esporulacin es desconocida 2e incluso puede que de hecho, no tenga tal tipo de funcin3. 6ajo condiciones alcalinas, se disuelven y la proteína se convierte en una poderosa to$ina para larvas de lepidópteros y otros insectos, cuando las ingieren v6a oral 2pero no por vía parenteral3. %eamos cmo se produce el proceso de la to(icidad@ *. La oruga come materia vegetal que lleva bacterias esporuladas. El cuerpo parasporal se libera junto con la espora, cuando la c"lula madre se autolisa. J. Los cuerpos parasporales se disuelven en el tracto digestivo de la oruga 2que es alcalino3, la proteína sufre proteolisis, lo que la transforma en una to(ina. D. Esta to(ina altera la permea#ilidad del epitelio intestinal de la oruga, de modo que los líquidos alcalinos del intestino pasan a la ,emolinfa, que incrementa su pK por encima de , lo cual termina provocando la par%lisis r%pida del insecto5 ( finalmente su muerte. El significado #iológico m1s probable de este fenmeno es que la produccin de cuerpos parasporales sea una variante de la esporulacin que evolucion durante la adaptacin de estas bacterias a sus nichos ecolgicos, como una manera de asegurar la germinación de las endosporas@ la oruga ingiere los cristales junto con las esporas. Los cristales parasporales matan a la oruga, que se pudre. La oruga muerta y en putrefaccin
aseguraría un entorno adecuado en nutrientes para que se alimentaran y multiplicaran las c"lulas vegetativas que surgieran de la germinacin de esas esporas. )esde hace tiempo ciertos grupos de agricultores vienen usando inculos de bacterias esporuladas de las especies productoras de cuerpos parasporales para rociar sus plantas y protegerlas de insectos@ estamos ante un aut"ntico insecticida biolgico, biodegradable, selectivo hacia las plagas e inofensivo para los seres superiores. La moderna &ngeniería ;en"tica ha logrado insertar y e(presar genes codificadores de las to(inas parasporales de Bacillus thuringiensis en plantas de cultivo. Koy día e(isten millones de hect1reas de cultivo de plantas transg"nicas 6t 2sobre todo algodn, maí', y patata3 que dependen menos de los insecticidas químicos merced a estos genes bacterianos 2aunque ello no ha evitado las críticas de ciertos grupos ecologistas opuestos por sistema a todo lo que suene a manipulacin gen"tica por t"cnicas de 0): recombinante3.
1.$ PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LAS ESPORAS( SU FUNDAMENTO Las endosporas son células en estado de dormancia, con una #a"6sima tasa meta#ólica 2hipometabolia, la menor que e(iste en el mundo vivo3, y capaces de conservar su vitalidad durante larguísimos períodos. 9on muy resistentes a la accin de diversos agentes químicos 2octanol, cloroformo3 y físicos 2altas temperaturas, congelacin, desecacin, radiaciones3. *3 ipometa#olia* Poseen la m1s baja tasa respiratoria de todos los seres vivos. Por ello son capaces de sobrevivir en ausencia de nutrientes durante largos períodos de tiempo. J3 )ormancia* Esta propiedad se refiere al hecho de que la espora tiene una gran inercia a los sustratos e(genos. #omo veremos, la espora slo perder1 la dormancia cuando se haya activado para la germinacin. D3 Resistencia al calor* Las esporas de ciertas especies resisten el calor h!medo de *Jo# durante * min, lo cual condiciona los par1metros para esterili'ar materiales / v0ase el cap7tulo EF titulado <&ccin de agentes ,7sicos sobre las bacterias” 2. Esta elevada resistencia a las altas temperaturas es un subproducto de los cambios evolutivos que condujeron a la deshidratacin como medio para lograr la hipometabolia y la dormancia. Por lo tanto, la deshidratacin es la clave de las anteriores propiedades. 2En cambio, como dijimos antes, al menos parte de la resistencia al calor seco, es decir, en ausencia de vapor de agua, se debe a las proteínas 909P, que protegen al 0): de los daños o(idativos de este tipo de calor3. F3 )es,idratación* El muy bajo contenido en agua de la espora 2.D g de agua]g de peso seco frente a los DGF g de agua]g de peso seco de la c"lula vegetativa3 hace que la espora sea muy refr1ctil al microscopio ptico en fresco. Ello condiciona las propiedades *, J y D. #u1l es el mecanismo de la deshidratacin, base a su ve' de tantas propiedades biolgicas de las endosporas[ El tema es a!n objeto de debate. %amos a e(poner
brevemente una hiptesis 2*==3, seg!n la cual habría D etapas en la consecucin de la espora deshidratada y resistente al calor@ a3 En las fases &&& y &% el 1cido dipicolínico va entrando al protoplasto de la prespora. 9imult1neamente el #aJ entra desde el e(terior a la c"lula madre por transporte activo, y de ella al protoplasto de la prespora por difusin facilitada. 9e forma el correspondiente quelato de dipicolinato c1lcico 2)P#3. Este es un proceso con retroalimentacin positiva, ya que conforme el #aJ queda -secuestrado en forma de quelato 2lo que significa que no hay de hecho iones #aJ libres en el interior de la prespora3, se facilita m1s la entrada de mayores cantidades de #aJ. Parte del #aJ y de otros cationes se acomplejan tambi"n con macromol"culas del protoplasto. 4odo ello redunda en que la corte!a se -ueda sin cationes< por lo tanto, no hay posibilidad de neutrali'ar las cargas negativas del peptidoglucano cortical las cargas negativas de la corte'a se repelen se produce la e$pansión del peptidoglucano cortical en su e(pansin, la corte'a se -topa con las cubiertas rígidas, por lo que presiona so#re el protoplasto sale m%s agua del protoplasto. b3 Resultado final* termoesta#ili!ación 1 termorresistencia del protoplasto. La gran p"rdida de agua hace que los diversos compuestos del protoplasto se compacten entre sí, lo que facilita sus interacciones con los cationes. El resultado es la formación de un gel a #ase de una matri! constituida por complejos supramoleculares, macromol"culas y pequeñas mol"culas densamente empa-uetados5 unidos entre s6 e inmovili!ados. Parece ser que esta es la base principal de la enorme resistencia al calor h!medo por parte de la endospora. +3 Resistencia a los ra(os C* Parece que depende de varios componentes@ a3 absorcin de lu' O% por las cu#iertas< b3 por el )P< c3 pero cada ve' est1 m1s claro que las proteínas &A&P tienen un papel central en esta resistencia a los O%. #omo ya dijimos, las 90P9 de tipo ] acomplejan al 0): y favorecen su configuracin de tipo 0, lo cual a su ve' provoca un cambio en su fotoquímica 2ver apartado siguiente3< d3 cam#io en la foto-u6mica del A)N de la espora@ se puede e(plicar parcialmente por la misma des,idratación del protoplasto, que impide que se formen dímeros de pirimidina entre pirimidinas adyacentes de una misma cadena del 0):. #omo veremos en el capítulo *D, estos dímeros de pirimidina constituyen el principal tipo de fotoproductos generados por rayos O% en el 0): de la c"lula vegetativa, base de la mayor parte de los efectos delet"reos de estas radiaciones. Por otro lado, las 909P de tipo ] que acomplejan el 0): hacen que en la espora la lu' O% provoque otro tipo de alteracin, llamada fotoproducto de la espora 2que consiste en +GtiminilG+,?Gdihidrotimina3 que se produce en menor cantidad. 0unque la acumulacin de fotoproductos de la espora puede ser igual de letal que la de los
dímeros de pirimidina, cuando germina la espora se pone inmediatamente en marcha un eficiente sistema de reparacin específico de ese fotoproducto. ?3 resistencia a agentes -u6micos* La resistencia de la endospora a agentes como octanol, cloroformo, etc. se debe a la impermea#ilidad de las cu#iertas, gracias a su gran grosor y su peculiar composicin a base de proteínas ricas en amino1cidos hidrfobos y con abundantes puentes disulfuro 2cistinas3. La resistencia a la liso'ima se debe por un lado a la propia impermeabilidad de las cubiertas, y a la resistencia de la corte'a.
1.% GERMINACIÓN DE LA ENDOSPORA La germinacin es el proceso por el cual una espora se convierte al estado vegetativo. Es mucho m1s r1pida que la esporulacin 2dura unos = minutos3. Podemos considerar en ella cuatro etapas, seg!n el modelo de Hoster y Nohnstone 2*==3@ *. preactivacin J. activacin D. iniciacin 2o germinacin en sentido estricto3 F. crecimiento ulterior 2entrada en fase vegetativa3
1.%.1 PREACTIVACIÓN 0ntes de que la espora est" en condiciones de germinar se requiere que sus cu#iertas se alteren. En la naturale'a esto ocurre por erosión por enve"ecimiento progresivo. 0rtificialmente, en laboratorio, se puede recurrir a alg!n procedimiento para alterar esas cubiertas@ tratando las esporas a altas temperaturas, pero inferiores a su inactivacin 2*o# durante unos minutos3< por radiaciones ioni'antes< por pK bajos< por tratamiento con sustancias que posean grupos G9K libres 2p. ej., mercaptoetanol3.
1.%.2 ACTIVACIÓN La activacin es una etapa a!n reversi#le, desencadenada por un agente químico e(terno 2germinante3 presente en el medio. Este agente es variable seg!n las especies@ iones inorg1nicos 2MnJ, MgJ3< LGalanina en B. subtilis< glucosa u otros a'!cares< adenina u otras bases nitrogenadas.
El germinante es detectado por un receptor alost"rico a nivel de la membrana esporal interna. Ona ve' que dicho receptor se activa, adquiere una capacidad proteolítica específica que le permite romper una proen'ima que hasta ese momento se encontraba unida covalentemente al peptidoglucano de la corte'a. La en'ima resultante reconoce la lactama del :0M y comien'a a hidroli'ar el peptidoglucano cortical. La consecuencia es que comien'a a entrar agua al protoplasto de la espora, por lo que la espora pierde su característica refringencia, y se comien'a a perder la resistencia al calor. )urante toda esta etapa el meta#olismo est% an latente.
1.%.3 INICIACIÓN O GERMINACIÓN EN SENTIDO ESTRICTO En esta etapa la germinacin se hace ya irreversi#le, y se rompe definitivamente el estado de dormancia, si bien el meta#olismo es endógeno 2no depende todavía de sustancias e(ternas3. Los principales acontecimientos bioquímicos son@ se pierde )PA, lo que supone p"rdida de #a< este aOO pasa al córte$, donde neutrali'a las cargas negativas se favorece la re,idratación del protoplasto ( su ,inc,amiento, favorecido por la concomitante contraccin del crte(, mientras contin!a y se completa r1pidamente la hidrlisis del P; cortical< el 3=fosfoglicérico 2DGP;3 se convierte en JGP;, y "ste en PEP, que a su ve' dona su fosfato de alta energía para producir AP< las pequeñas proteínas &A&Ps se ,idroli!an por una proteasa específica que hasta ese momento estaba inactiva. )e este modo los amino1cidos constituyentes de las 909Ps se reutili'an para la síntesis de nuevas proteínas por parte de la pequeña dotacin de ribosomas y dem1s mol"culas accesorias< La 0/: polimerasa comien'a a sinteti'ar 0/: 2comien'a la transcripcin de genes vegetativos3.
1.%.4 TERMINACIÓN Y CRECIMIENTO ULTERIOR 0parece ya el meta#olismo e$ógeno, de modo que la espora puede tomar nutrientes del e(terior y metaboli'arlos. Los eventos bioquímicos y estructurales m1s notorios son@ se sinteti'a A)N< el protoplasto crece a!n m1s< la pared de la espora sirve como cebador 2germen3 para la produccin de la pared de la célula vegetativa naciente< la c"lula vegetativa sale por rotura de las cu#iertas, que puede ser de tipo polar o ecuatorial. Kay que aclarar que al salir, esta c"lula vegetativa se tiñe como ;ramG negativa, y slo adquirir1 su típica grampositividad despu"s de la primera divisin.
S/+/ , +/ ),/ *K+)+/ ,,8/8/ /+ ?/+ , +/ ,:/* . O90,:/ +/ :-8):/ , +/0 *)9,:8/0
2 EOSPORAS )eterminadas bacterias /Methylosinum$ (hodomicrobium2 forman esporas reproductivas por gemaciones sucesivas al final de sus prostecas. Estas e(osporas poseen una envuelta a base de pared rodeada de una c1psula o cubierta gruesa.
3 DIFERENCIACIONES EN ACTINOMICETOS Los actinomicetos constituyen un grupo amplio y complejo de bacterias ;ram positivas con tendencia a un tipo de crecimiento micelial y un estilo de vida similar a los hongos. Muchos de los ta(ones de 0ctinomicetos y bacterias relacionadas poseen c"lulas diferenciadas de tipo reproductivo, gen"ricamente conocidas como esporas. Estudiaremos brevemente la diferenciacin en dos g"neros típicos.
Género Actinoplanes Las especies de este g"nero producen micelios vegetativos de sustrato 2subterr1neos3. 0lgunos de estos micelios generan hifas verticales que sobresalen a la superficie. El e(tremo de cada una de estas hifas se diferencia para constituir un saco llamado esporangio, que se fragmenta en un conjunto de esporas móviles 2flageladas3 llamadas !igosporas o esporangiosporas.
Género Streptomyces
Horma un micelio de sustrato ramificado, interrumpido de ve' en cuando por pared transversal 2son por lo tanto organismos cenocíticos, es decir, el segmento de micelio limitado por dos tabiques sucesivos contienen varios cuerpos nucleares3. #uando hay limitacin de nutrientes se comien'a a formar un micelio aéreo a partir de ramificaciones de las hifas subterr1neas. En los e(tremos de algunas de estas hifas a"reas las c"lulas se diferencian en cadenas de esporas. )urante la formacin de estos micelios a"reos y de las esporas la poblacin de micelios subterr1neos sufre una lisis masiva.
Propiedades de las esporas de los estreptomicetos@ la pared celular de la espora es m1s gruesa que la de la c"lula vegetativa< no hay cambio cualitativo en el peptidoglucano< no hay crte( ni cubiertas< son mu( ,idrofó#icas@ se resisten a ser suspendidas en agua. Esto parece que se debe a una vaina que rodea a la pared celular, compuesta a base de t!bulos autoGensamblables. resisten m1s al calor y a la desecacin en comparacin a las c"lulas vegetativas, pero menos que las endosporas. son meta#ólicamente durmientes 2c"lulas en reposo3.
4 #UISTES BACTERIANOS 9on c"lulas que se producen en algunas especies por engrosamiento de la pared celular de la célula vegetativa, por deposicin de nuevos materiales e(ternamente a la membrana citopl1smica, al mismo tiempo que se acumulan materiales de reserva en el citoplasma. Poseen meta#olismo endógeno, y resisten al calor, a la desecacin y a agentes químicos m1s que la correspondiente c"lula vegetativa 2pero menos que las endosporas3. Ejemplos@ 8uistes de &'otobacter y Bdellovibrio. Microquistes de Mi(obacterias, llamados mi$osporas* sus envueltas constan de una corte'a, rodeada de cubiertas 2interna y e(terna3. Estas cubiertas se componen de una glucoproteína muy rica en polisac1ridos.
5 DIFERENCIACIONES EN CIANOBACTERIAS En las cianobacterias filamentosas 2que forman tricomas3 se pueden observar dos tipos principales de c"lulas diferenciadas a partir de las vegetativas@ heteroquistes y acinetos.
etero-uistes 1 ,eterocistes
9on c"lulas de término, sin funcin reproductiva, especiali!adas en la fi"ación de nitrógeno molecular 1N2, de mayor tamaño que las c"lulas vegetativas. La cone(in entre c"lulas vegetativas y heteroquistes se establece a trav"s de un estrangulamiento de los polos de "stas. La unin est1 atravesada por una serie de finos canales llamados microplasmodesmos, que reducen al mínimo el intercambio de sustancias entre ambas c"lulas. Por fuera de la pared celular 2que es de tipo ;ramGnegativo3, e(isten tres cu#iertas@ una capa laminada interna a base de glucolípidos e(clusivos de cianobacterias< una capa ,omogénea central a base de polisac1ridos< una capa fi#rosa e$terna, tambi"n polisacarídica, pero menos compactada. Estas tres capas evitan la difusión del 2 al interior del heteroquiste, lo que representa uno de los mecanismos para la protección de la nitrogenasa 2complejo en'im1tico que reduce el :J a :KF, y que es muy sensible al o(ígeno3. Pero el heteroquiste dispone de m1s -estrategias para la proteccin de la nitrogenasa@ aparte de los microplasmodesmos, en las uniones con las c"lulas vegetativas adyacentes se forman sendos -tapones de cianoficina< los tilacoides se disponen como un retículo polar y perif"rico, y carecen de fico#ilisomas, por lo que no pueden reali!ar la fase 77 de la fotos6ntesis. Por lo tanto, los heteroquistes no generan o$6geno, ya que slo reali'an la fotofosforilacin cíclica.
Acinetos 1a-uinetos 9on formas de reposo que se originan a partir de c"lulas vegetativas, por acumulacin de nuevas capas de materiales polisacarídicos por fuera de la pared celular, y por formacin de ac!mulos de reserva en el citoplasma. /esisten m1s que las c"lulas vegetativas los períodos de desecacin y de congelacin, pero no al calor. #uando las condiciones ambientales mejoran, se producen sucesivas divisiones transversales en el acineto, que finalmente se convierte en un filamento m1s corto y menos grueso que los tricomas, llamado ,ormogonio.
ÍNDICE( 1
INTRODUCCIÓN AL CRECIMIENTO BACTERIANO
2
CICLO CELULAR PROCARIÓTICO
2.1
CICLO CELULAR EN FUNCIÓN DEL TIEMPO DE GENERACIÓN
2.2
CONTROL DEL CICLO CELULAR
3
MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS
3.1
MEDIDA DE MASA CELULAR
3.1.1
MÉTODOS DIRECTOS
3.1.2
MÉTODOS INDIRECTOS
3.2
MEDIDA DEL NWMERO DE INDIVIDUOS
3.2.1
MÉTODOS DIRECTOS
3.2.2 4 4.1
MÉTODOS INDIRECTOS
CRECIMIENTO BALANCEADO = E#UILIBRADO? EPRESIÓN MATEMÁTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO
5
CULTIVO CONTINUO =SISTEMAS ABIERTOS?. #UIMIOSTATO
CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS
.1 CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LÍ#UIDO .2
CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SÓLIDOS
1 INTRODUCCIÓN AL CRECIMIENTO BACTERIANO 9e suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocíticos 2en los que la duplicacin del
genoma no se acompaña de divisn celular3 el crecimiento se traduce en aumento de tamaño de la -colonia cenocítica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista@ 0 escala individual 0 escala poblacional Los eventos de crecimiento en el 1mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de "ste podemos abordar los siguientes temas@ inicio y transcurso de la replicacin cromosmica y de pl1smidos / v0ase v0ase tema ? 2< 2< segregacin de cromosoma y pl1smidos a las c"lulas hijas< 2< síntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular /tema 2< señales que coordinan la replicacin genmica con la divisin celular. El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tpicos@ cin"tica del crecimiento< factores que afectan al tiempo de generacin 2g3< factores ambientales que limitan el crecimiento. En el presente capítulo nos dedicaremos al estudio de algunos aspectos del ciclo celular procaritico, pero sobre todo nos centraremos en el crecimiento de poblaciones 2que es el m1s frecuentemente empleado al trabajar con microorganismos3, con una visin de algunos m"todos para obtener crecimientos balanceados. La influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento son el objeto de los temas EF 2agentes EF 2agentes físicos3 y E 2agentes químicos3.
2
CICLO CELULAR PROCARIÓTICO
On ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados que comien'a con la formacin de una nueva c"lula y termina cuando dicha c"lula se divide en otras dos hijas. Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una serie de eventos identifica#les que se van produciendo en una secuencia fi"a, de modo que para que se produ'ca cada uno de ellos hace falta que se complete el anterior. Los periodos del ciclo celular procaritico son@ fase # 2equivalente a la 9 eucaritica3@ replicacin del 0): cromosmico< fase ) 2equivalente a ;J M3@ se distingue porque su terminacin coincide con el final de divisin celular< fase innominada, equivalente a la ;* eucaritica. Lo característico del ciclo es que las fases ( ) son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generacin 2g3, 2g3 , lo hace a e(pensas de la fase -;*. Por ejemplo, en )scherichia en )scherichia coli, coli, # X unos F min, y ) X unos J min.
2.1 CICLO CELULAR EN FUNCIÓN DEL TIEMPO DE GENERACIÓN %amos a estudiar es tudiar con el ejemplo de ). de ). coli qu" coli qu" ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generacin.
uando gSO) E(iste fase ;* 2intervalo que precede a la replicacin3. En estas condiciones podemos observar nítidamente periodos diferenciados entre sí 2de síntesis de 0): y de divisin celular3. uando gO) Ia no e(iste ;*, y cada ronda de replicacin comien'a inmediatamente tras la precedente divisin celular 2es decir, cada c"lula hija reci"n nacida se embarca inmediatamente en replicar el cromosoma, y una ve' que ha terminado de replicarlo, la c"lula inicia la divisin celular3. uando gTO) Las rondas de replicacin de un ciclo se inician antes de que haya terminado la divisin celular del anterior 2superposicin parcial entre fases # y )3. ya no se puede detectar fase ) como tal. La síntesis de 0): es uando gT continua durante todo el ciclo. 9e inician rondas de replicacin cromosmica antes de que haya terminado la anterior. Esto se traduce en que los cromosomas muestran un típico patrn de replicación dicotómica y en que dichos cromosomas pasan a cada c"lula hija ya embarcados en una nueva ronda de replicacin. Ona característica del ciclo es que, cuanto m1s rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generacin 2g3, mayor es el tamaño medio de las c"lulas. Es decir, los individuos de una cepa bacteriana que est" en un medio rico son m1s grandes que los individuos de esa misma cepa creciendo en un medio pobre.
2.2 CONTROL DEL CICLO CELULAR )e lo anterior se deduce que debe de e(istir alg!n tipo de acoplamiento entre las ondas de replicacin y la divisin celular. Este es un campo de investigacin a!n joven, del que no conocemos todavía todos los detalles. Las copias de cromosomas reci"n replicadas se encuentran en principio adyacentes de la membrana citopl1smica 2unidas a sendos mesosomas[3 probablemente unidas a trav"s de sus respectivos orígenes de replicacin 2ori% 2ori% 3. 3. :o se sabe muy bien cmo esas copias se van separando de modo que cada una va a parar a una c"lula hija. 9e sabe que en este reparto o partición de los cromosomas intervienen varias proteínas, entre ellas Par0 y Par6,, que en las c"lulas a punto de dividirse se sit!an en los dos polos opuestos. Es posible Par6 que e(ista alg!n mecanismo -activo para separar estos cromosomas, pero parece ser que tambi"n intervienen los mecanismos -pasivos de crecimiento de membrana y pared celular en el tabique transversal en crecimiento.
4ambi"n se sabe hoy que e(isten dos secuencias paralelas e independientes de acontecimientos que controlan el ciclo celular@ un control es sensible a una masa umbral celular para desencadenar el inicio de la replicacin del cromosoma, y el otro responde a cierta longitud umbral 2en el caso de los bacilos3 para que ocurra el reparto de los cromosomas y la formacin del tabique. El comien'o de la replicacin del cromosoma se indica mediante la unin de muchas unidades de la proteína )na0 2unida a 04P3 al origen de replicacin 2ori% 2ori% 3. 3. Ona ve' que se ha iniciado una ronda de replicacin en ori% , esta regin queda hemimetilada, pero en ve' de ser metilada inmediatamente, queda secuestrada u ocultada a efectos de la metilasa )am y de la maquinaria de replicacin. 9e sugiere que en este fenmeno est1 implicada una proteína 29eq03, que a su ve' ayudaría a esconder a ori% en en la membrana. 9lo m1s tarde 2y por factores desconocidos, pero que puede que tengan que ver de nuevo con la proporcin entre sitios de inicio y alg!n par1metro celular como masa o volumen3, vuelven a quedar las secuencias ori% disponibles para su metalicin y uso en una nueva ronda. :540@ :540@ La metilasa )am es una en'ima que metila las dos adeninas de la secuencia ;04#]#4 ;04#]#40;. 0;. El alumno seguramente sabr1 sabr 1 ya que esta metilasa metila las adeninas de esa es a secuencia a partir p artir de 0): hemimetilado. El 0): de la c"lula est1 totalmente metilado en esas secuencias, pero cuando pasa la horquilla de replicacin, la cadena reci"n sinteti'ada carece de esa modificacin, hasta que llega la metilasa )am, que reconoce la secuencia hemimetilada y metila la adenina de la cadena no metilada. On rasgo curioso de la regin ori% para para el inicio de la replicacin cromosmica es que contiene una proporcin pr oporcin de secuencias ;04#]#4 ;04#]#40; 0; muy superior su perior a la media del resto del genoma. El comien'o de la tabicacin parece que requiere dos señales@ por un lado, el cromosoma ha debido terminar su replicacin y las copias hijas deben de estar separadas en e(tremos opuestos por otro lado, la c"lula debe haber alcan'ado una longitud umbral #omo ya vimos en el cap7tulo , , llegado el momento, la proteína HtsQ 2que hasta entonces estaba diseminada por toda la c"lula3, se concentra ahora en la parte central, señalando el plano de la tabicacin@ se forma un -anillo citocin"tico o divisoma, en el que la HtsQ se va -contrayendo hacia el interior 2hidroli'ando ;4P hasta ;)P3. 0 continuacin se van ensamblando en el divisoma varias proteínas Hts, entre ellas la P6PD, que como vimos es una transglucosidasaGtranspeptidasa específica del tabique, que va produciendo peptidoglucano en el septo transversal. La terminacin del tabique señala el final del ciclo celular.
3 MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS
En la pr1ctica habitual del laboratorio, los e(perimentos se reali'an siempre con poblaciones bacterianas, a menudo tomando muestras en diversos momentos de su crecimiento en un medio de cultivo. En el resto del capítulo nos vamos a referir al crecimiento microbiano a escala de poblaciones. #omen'aremos con algunos m"todos habituales de medir ese crecimiento poblacional, algunos de los cuales ser1n aprendidos -en vivo por el alumno en las pr1cticas de laboratorio. El crecimiento de una poblacin o cultivo bacterianos se puede e(presar en funcin de@ aumento de masa del cultivo aumento del n!mero de c"lulas 0mbos tipos de e(presiones son equivalentes entre sí en cultivos que est"n en crecimiento #alanceado o e-uili#rado 2en el que todos los componentes aumentan una misma proporcin por unidad de tiempo3.
3.1 MEDIDA DE MASA CELULAR 3.1.1 MÉTODOS DIRECTOS En estos m"todos se requieren preparaciones limpias, sin partículas e(trañas.
)eterminación del peso ,medo* se tara un tubo de centrífuga< se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante< se determina el peso del sedimento. I*,*/*-*+7( 60*;7 66,67" ;-;, 0: :@-;, -*+6::06 6+*-;," 0 0*+0 ;8*; 0 7 / ; :0 <,690 +-8, ; 0680-,*7 ; :0 80" -*+*7-;0; ;: 980@+09-*+," +.
2 )eterminación del peso seco* como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado 2*+#, toda la noche3, hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el *G*+W de los valores de peso h!medo. I*,*/*-*+7( 9+,;, +;-,7, =6@-6 9, +-98,? ,* 07+0*+7 66,67( 7 ;-<-: 8706 9*,7 ; 1 9 ,* J0+-+; * :07 0:0*07 0-+0:7 ; :0,60+,6-,. 1 9 ; 87, 7, @-/0: 0 *07 5J1&% 0+6-07.
3 )eterminación del nitrógeno total@ t"cnica de microG7jeldahl. 4 )eterminación de un componente caracter6stico@ peptidoglucano, 0):, 0/:, proteínas, 04P, clorofilas en organismos fotosint"ticos, etc. C,9*+06-,7( 7 7: 706 * 0+6-07 8060 :07 @ ,+6,7 9+,;,7 9K7
3.1.2 MÉTODOS INDIRECTOS +edida de consumo de nutrientes o de producción de algn meta#olito por unidad de tiempo . Ejemplos@ consumo de o(ígeno 285J3 y consumo de carbnico 28#5J3, determinados por el respirmetro de arburg. Produccin de 1cidos. 2 +étodos tur#idimétricos 1ópticos. 9on muy usados en la pr1ctica cotidiana del laboratorio. La base com!n de estos m"todos consiste en la medicin de la cantidad de lu' dispersada o transmitida a trav"s de un cultivo bacteriano. R,6;9,7 0@ @ :07 778*7-,*7 0+6-0*07 ;-78670* :0 :" 0: -0: @ 0:@-6 806+:0 8@0 778*;-;0 * 00 =<+, T*;0::?. L0 ;-7867-* ; :0 : 7" ;*+6, ; -6+,7 :9-+7" 86,8,6-,*0: 0 :0 9070 ;: :+-/,. a Espectrofotómetro@ Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o 6ioquímica. Mide la densidad ptica 2).5.3, es decir la absorbancia 2una medida de la lu' transmitida a trav"s de la supensin3. Por supuesto, hay que reali'ar una curva est1ndar para relacionar los valores de 0 con la masa bacteriana en una muestra problema. C,9*+06-,7( L0 0*+-;0; ; : ;-78670;0 7 8 6,8,6-,*0: 0: ,-*+ *+6 : +090, ; :0 806+:0 :0 :,*-+; ; ,*;0 -*-;*+ :0 7*7--:-;0; ; :0 +*-0 09*+0 87 0 :,*-+;7 ; ,*;0 =? ,6+07. L0 86,8,6-,*0:-;0; *+6 A 9070 0+6-0*0 7:, 7 /K:-;0 8060 Z1& !:7[9:.
# Nefelómetro@ Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est1 situado en 1ngulo recto respecto de la direccin de la lu' incidente, y lo que se mide es pues, la lu' dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro.
3.2 MEDIDA DEL NMERO DE INDIVIDUOS 3.2.1 MÉTODOS DIRECTOS %mara de recuento de Petroff=auser* #onsiste en un portaobjetos especial con una graduacin en superficie y unas medidas muy concretas@ e(cavacin con .J mm de profundidad< 1rea de * mmJ, dividida en un retículo de J+ cuadrados grandes< cada cuadrado grande est1 subdividido a su ve' en F(F X *? cuadrados pequeños. 5 sea, la muestra se distribuye en *? ( J+ X F celdillas 2cuadros pequeños3. La muestra, una ve' dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el n!mero de c"lulas en varias celdillas 2normalmente en *?, equivalentes a uno de los cuadros grandes3. 9e anota el n!mero n de
c"lulas observadas en esas *? celdillas. Entonces, la concentracin celular es f1cil de establecer@ n ( J+ ( + ( * X concentracin en c"lulas]ml. V*+007( 7 * 9+,;, 9 6K8-;,. I*,*/*-*+7( 7:, 7-6/ 8060 778*7-,*7 6:0+-/09*+ ,**+60;07 =Z1&J1& :7.[9:?. P,6 ;0, ; 7+ /0:,6 : *96, ; ::07 /-7+07 * : 098, ;: 9-6,7,8-, 7 9 8@, 8,, 7-*-<-0+-/, 7+0;7+-09*+. E* 0+6-07 9/-:7" 0 @ -*9,/-:-06:07 86/-09*+" ,* *0 9:0 ; 0:,,: 00.
2 ontadores electrónicos de part6culas 1tipo oulter* 9e hace pasar una suspensin microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente el"ctrica. #ada ve' que por un orificio 2D m di1metro3 pasa una partícula 2p. ej., bacteria3 se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el n!mero y el tamaño de las partículas que van pasando. 2El tamaño detectado es funcin de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula3. C,9*+06-,7( 0 @ 706 778*7-,*7 07,:+09*+ :-67 ; 806+:07 J+6007 =:07 8@07 760* ,*+0-:-0;07 66*09*+ ,9, 0+6-07" :07 90,67 8;* ,+606 : ,6-<--, ;: 08060+,?.
3.2.2 MÉTODOS INDIRECTOS Recuento de via#les en placa* Los m"todos de recuento de n!mero de c"lulas que hemos visto hasta ahora 2los directos3 no distinguen entre c"lulas vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las c"lulas vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. 2Ona c"lula se define como viable cuando, colacada en un medio adecuado, es capa' de dividirse y dar descendencia3. El m"todo habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio slido 2con agar3. #ada c"lula viable dar1 origen a una colonia visible despu"s del tiempo adecuado de incubacin. #ontando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alícuota utili'ado, es f1cil deducir el n!mero de c"lulas viables en la suspensin original. 2Para esto, mira el ejemplo de la diapositiva, y sobre todo, estate atento a la pr1ctica correspondiente, que se suele reali'ar en la DV tanda3. Mientras tanto, y para luego repasar esa pr1ctica, puedes reali'ar un e(perimento onGline sobre crecimiento bacteriano
P60-,*7( 8060 9-*-9-06 :,7 66,67 7+0;7+-,7 ; 97+6," 7 6,9-*;0 79606 5 8:007 ; 0;0 ;-:-* 0 @ 706 8-8+07 */07 * 0;0 ;-:-* ,*+06 :07 8:007 ;,*; J-7+0* *+6 5& 3&& ,:,*-07. C,9, *, 8,;9,7 060*+-06 @ 0;0 ,:,*-0 *, 86,;0 ; 9K7 ; * -*;-/-;, = 7+, 7
78-0:9*+ -6+, 8060 0+6-07 @ <,690* 0680-,*7 ; 2 , 9K7 ::07?" : 6*+, 7 6<-6 *, 0 ::07 /-0:7 60:7 7-*, 0 *-;0;7 <,690;,607 ; ,:,*-0 =UFC?. P,6 :, +0*+," *0 UFC ,6678,*;" ,9, 9*-9," 0 *0 0+6-0" 86, 7,6 +,;, * 0+6-07 ,* 0680-,*7" :0 9;-;0 8,6 7-96 * 8:00 -*<60/0:,60 : *96, 60: ; -*;-/-;,7" 8,6@ 0;0 UFC 8; ,6678,*;6 0 ;,7 , 9K7 -*;-/-;,7 @ 7+00* *+,7 0: 76 7960;,7 * :0 8:00.
2 Recuento so#re filtros* 9e usa para suspensiones diluidas de bacterias. 9e hace pasar un gran volumen de suspensin a trav"s de una membrana de nitrocelulosa o de nylon est"riles 2con un di1metro de poro que retiene las bacterias pero permite el tr1nsito de sustancias3. Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las c"lulas retenidas. )ichas colonias se cuentan, deduci"ndose la concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin que se hi'o pasar por el filtro.
4 CRECIMIENTO BALANCEADO = E#UILIBRADO> Ona poblacin de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus par1metros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, no de c"lulas, 0):, 0/:, proteínas, etc., es un valor constante ( similar en cada caso@ M]M X :]: X k0):]k0): X kproteínas]kproteínas X ... X 7
0sí pues, durante este crecimiento, de tipo e(ponencial o logarítmico, el cultivo se comporta como una reaccin autocatalítica de primer orden@ velocidad de aumento del componente X 7cantidad del componente 4ambi"n se puede decir que el no de c"lulas, la masa celular u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado. Este tipo de crecimiento se denomina #alanceado o e-uili#rado. 9e caracteri'a, pues, por ser el crecimiento en el que todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera@ aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente e$ponencial de crecimiento 1 , que es característico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado.
4.1 EPRESIÓN MATEMÁTICA DEL CRECIMIENTO BALANCEADO
Para deducirla vamos a aprovechar la definicin empírica anterior, atendiendo por un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del n!mero de individuos.
a En función del aumento de masa celular* , y por lo tanto, dM H MI Idt
9i integramos, resulta@ MJM : H e /t4t:2
0plicando logaritmos neperianos@ *J.* )e aquí se puede deducir que el coeficiente es *J.J
# En función del aumento del nmero de células. 9upongamos que partimos de una c"lula. 4ras una divisin 2generacin celular3, tendremos J, tras dos divisiones tendremos F, luego , etc@ tenemos una serie geom"trica. *, J, JJ, JD, JF, ... Jn 2donde n es el n!mero de generaciones transcurridas3. 9i en ve' de partir de una c"lula partimos de : c"lulas iniciales, tenemos@ : X :Jn < por lo tanto@ :]: X Jn
*J.D
Por otro lado, el n!mero de generaciones se puede calcular f1cilmente teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generacin 2g3@
9ustituyendo esta e(presin en la frmula *J.D tenemos@ :]: X J2tGt3]g 0pliquemos logaritmos neperianos@
*J.F
0hora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos e(presiones matem1ticas *J.* y *J.F que hemos deducido 2la de la seccin 0, basada en masa, y la de la seccin 6, basada en n!mero de individuos3 son equivalentes@ , y por lo tanto@ 2tGt3 X 2tGt3]glnJ, de donde se deduce el valor del coeficiente de crecimiento
e(ponencial@ , e(presado en hG*
*J.+
Esta es la e(presin matem1tica del coeficiente del crecimiento balanceado, en funcin del tiempo medio de generacin 2g3. En un medio ideal, sin ideal, sin limitacin de nutrientes, este coeficiente es X m1(, o sea, el m1(imo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un crecimiento balanceado no restringido. En un medio donde e(ista algn nutriente limitante 2o sea, cuya concentracin est1 por debajo del límite de eficiencia de las permeasas3, el crecimiento balanceado es de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al m1(imo, seg!n la frmula empírica siguiente 2ecuacin de Monod3@
donde k9 es la concentracin del nutriente limitante< 7 9 es la constante de saturacin, equivalente a la concentracin de nutriente para la que el coeficiente es semim1(imo. #omo se puede ver, la tasa de crecimiento 2medida por 3 es una funcin gr9,ico2. Este hiperblica de la concentracin del sustratro 2nutriente3 limitante /ver gr9,ico2. sustrato puede ser una fuente de # y]o de energía, fuente de :, de P, un factor de crecimiento, etc.
E98:,7 ; S( :0 S 8060 :0 :,70 * E. coli 7 7 1\1&>M :0 S 8060 : +6-8+<0*, * 7+0 0+6-0 7 2\1& >>! M E7+,7 0,7 /0:,67 7 ;* 0 :0 /+8/ /?/ , +/0 ,:,/0/0 , ,9:// 0-0 :,7 77+60+,7" :, 0: 7 *0 //8/* ,-+)8/,8, /6):/ , +/0 9/*8,:/0 / +-0 ,-0 )Q +)-0 * *+6-*+7 * :,7 @ *,690:9*+ /-/*. =P,6 : ,*+606-," :,7 9;-,7 ; :0,60+,6-, ;,*; 7 7:* :+-/06 :07 0+6-07 7:* 76 9K7 ,**+60;,7?.
#omo veremos en el apartado ?, en la naturale'a, y en los sistemas de cultivo cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o temprano el crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o se acumulan sustancias de desecho.
5 CULTIVO CONTINUO =SISTEMAS ABIERTOS>. #UIMIOSTATO El cultivo continuo es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de abierto de flujo que se compone de@ una c1mara de cultivo de volumen constante, a la que llega un suministro de nutrientes, y de la que se eliminan o separan los productos t(icos de desecho 2por un dispositivo de rebosadero3. Ona ve' que el sistema alcan'a el equilibrio, el n!mero de c"lulas y la concentracin de nutrientes en la c1mara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema est1 en estado estacionario, con las c"lulas creciendo e(ponencialmente. Los par1metros a tener en cuenta son@ flujo 2f 3, 3, medido en ml]h volumen de la c1mara de cultivo 2v, en ml3 densidad celular en la c1mara 2$3 factor de dilucin ) X f]v 2en hG*3. E(iste una p"rdida de c"lulas por el rebosadero@ Gd(]dt X () El crecimiento bruto es d(]dt X ( Por lo tanto, el crecimiento neto es d(]dt X ( G () X (2 G )3 9i logramos que el coeficiente de crecimiento 23 se haga igual al factor de dilucin 2)3, entonces d(]dt X , y por lo tanto la concentracin de c"lulas se hace constante 2(X (3. El cultivo se encuentra entonces en estado din%mico de e-uili#rio. Las p"rdidas de c"lulas por drenaje se compensan con co n las ganancias por crecimiento.
Ona de las maneras de lograr un cultivo continuo es mediante el llamado -uimiostato@ en el quimiostato podemos controlar de modo independiente la densidad de la poblacin celular y la velocidad de crecimiento del cultivo. La densidad celular en el equilibrio se controla ajustando el factor de dilucin 2)3, mientras que la velocidad de crecimiento se controla variando la concentracin del nutriente limitante en la c1mara reservorio 29/ 3. 3. En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad de tasas de crecimiento e$ponencial El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que e(iste un nutriente o sustrato presente en una concentracin suficientemente baja como para limitar la densidad de poblacin. 0sí pues, el quimiostato tambi"n permite elegir la densidad de células a la que se quiere trabajar.
&lgunos comentarios sobre el gr9,ico6 La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilucin 2)3. Este margen es el m1s adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En cambio, el valor de tiempo de generacin 2g3 var6a ampliamente. 5 sea, el quimiostato puede obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte la densidad celular.9in embargo, a valores e(tremos de dilucin, se puede ver que el equilibrio se rompe@ 0 altas tasas de dilucin la concentracin microbiana cambia r1pidamente, y en un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente 2)#@ dilucin crítica3. Es decir, el cultivo se -lava porque su velocidad de crecimiento es inferior a la tasa de dilucin. 0 muy bajas diluciones 2)M3 el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la fuente de energía. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energía slo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no queda para el crecimiento. 0 este valor lo llamamos energ7a de mantenimiento. Los procesos relacionados con esta energía de mantenimiento son el potencial de membrana, el transporte de solutos y la renovacin de proteínas.
Aplicaciones del cultivo continuo en -uimiostato* 0portan una fuente continua de c"lulas en fase e(ponencial, lo que se aplica a procesos industriales de fermentación 2produccin de bebidas alcohlicas, de antibiticos, de amino1cidos, etc3. En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite estudiar@
aspectos fisiológicos 2por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante3< selección de mutantes estudios ecológicos.
CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS En los sistemas cerrados 2que pueden ser líquidos o slidos3, no e(iste aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de c"lulas ni de sustancias de desecho. En estos sistemas la fase e$ponencial de crecimiento #alanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y]o a la acumulacin de desechos.
.1 CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LÍ#UIDO
#omo se puede constatar en el anterior gr1fico, el crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar@
'ase de retardo 1fase Llag0* Es el período de tiempo durante el que el inculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. 9e trata de un período de a"uste meta#ólico. 9u duracin depende de varios factores@ tamaño del inculo< bondad del inculo 2estado metablico previo del inculo3@
si el inculo procede de c"lulas en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coen'imas y otros constituyentes de las c"lulas son bajos, y las c"lulas deben reponerlos en el medio fresco. si las c"lulas est1n dañadas por alg!n agente, el lag tambi"n es largo, ya que necesitan un tiempo para la reparacin de los daños. si las c"lulas del inculo se tomaron de un cultivo previo en fase logarítmica, el lag es m1s corto. medio del que procede el inculo@ si el medio es similar al medio fresco, el lag es m1s corto< si el medio del inculo era un medio rico y el medio fresco es m1s pobre, la fase de retardo se hace m1s larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la síntesis de las en'imas biosint"ticas que estaban reprimidas en el medio rico. Pero aun cuando la inoculacin se hace desde un cultivo previo en fase logarítmica, cuyo medio sea id"ntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. Por qu"[@ necesidad de neutrali'ar sustancias t(icas en el medio fresco< porque se produce dilucin de ciertos metabolitos intracelulares al inocular las bacterias en el medio nuevo< por lo tanto, hasta que no se vuelva a alcan'ar una concentracin de esos metabolitos adecuada para el crecimiento, "ste no -arranca. E98:,( S8,*09,7 @ -*,:09,7 *0 0+6-0 +6,+6<-0 * * 9;-, :-609*+ K-;," 7,9+-;, 0 0-60-*( * * 86-*-8-," 7 86,; ;-:-* ; CO 2" 8,6 :, @ 7 6+06;0* 60-,*7 ; 06,J-:0-* @ 6@-6* 7+ CO 2" 7 86,; * 6+06;,.
2 'ase de transición5 de crecimiento acelerado, que conduce a 3 'ase de crecimiento e$ponencial 1 fase logar6tmica. La fase J se debe a que cada c"lula entra en la fase e(ponencial con desfase respecto de sus compañeras. Ello demuestra que las c"lulas del inculo no est1n todas en las mismas condiciones fisiolgicas. )urante la fase logarítmica se da un crecimiento #alanceado no restringido durante unas pocas generaciones 2normalmente menos de *3. El tiempo de generacin 2g3 es característico para cada especie o cepa, en cada medio concreto@ El valor del tiempo de generacin 2g3 depende de@ composicin del medio temperatura pK osmolaridad 2tonicidad3, etc. Los microorganismos heterotrofos suelen crecer m1s r1pidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sint"ticos, y dentro de estos !ltimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono. 0lgunos microoorganismos tienen, a su temperatura
ptima tiempos de generacin muy cortos 2*+, J min3, mientras que otros tienen crecen m1s lentamente, con tiempos de generacin que pueden ser de varias horas o incluso días.
4 'ase de aceleración negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a ; 'ase estacionaria* Esta fase se caracteri'a porque el coeficiente neto de crecimiento se ,ace nulo 2 X 3, pero an e$iste crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares. En este período se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho. &ncluso el pK del medio empie'a a hacerse inadecuado para el crecimiento celular. 9i la bacteria crece en un medio complejo, la fase F de transicin 2de aceleracin negativa3 puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas 2p. ej., puede recurrir a amino1cidos como fuente de # una ve' agotados los hidratos de carbono3. En la fase estacionaria a!n e(isten reacciones metablicas, pero el meta#olismo general es diferente al de la fase logar6tmica@ las c"lulas son m%s pe-ueQas, debido a que e(iste divisin celular despu"s de que se haya detenido el incremento de masa< suelen ser m1s resistentes a agentes físicos y químicos< e(iste reciclado de ciertos materiales intracelulares< baja el contenido en 0/:.
'ase de transición ,acia H 'ase de muerte e$ponencial* 9e da muerte y lisis masiva, e(ponencial, del cultivo. 9e debe a agotamiento de reservas de energ6a. 0lgunas veces las c"lulas aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas 2formas -fantasmas, -ghost3. La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies 2por ejemplo, en bacterias ent"ricas es suave, mientras que en Bacillus es m1s acentuada3. 4e recuerdo que puedes hacer un e(perimento virtual con la curva de crecimiento de una bacteria. 8ue disfrutes.
.2 CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SÓLIDOS On medio slido es una solucin nutritiva 2como el líquido3, pero incorporado a un gel, que le da consistencia. Los tipos de gelificantes usados para los medios slidos /m9s explicaciones en la 1K tanda de pr9cticas2@
