UNIVERSIDAD MAYOR ENFERMEDADES PARASITARIAS PARASITARIAS GUÍA DE LABORATORIO
Dr. Rafael Rodríguez 2012
Introducción a los Métodos de Diagnóstico de Enfermedades Parasitarias Consideraciones Generales La detección de los agentes involucrados en un proceso patológico es una condición elemental para el establecimiento de medidas tendientes a su eliminación, es decir, tratamientos terapéuticos o medidas de control. El proceso diagnóstico a que son sometidas las muestras obtenidas de individuos pueden arrojar diferentes grados de positividad o negatividad, por ello se reconoce que ningún método es 100 % efectivo, haciéndose necesario un control periódico de los animales para poder actuar tempranamente en una Parasitosis Los métodos de diagnóstico son herramientas que se utilizan en la práctica de la profesión, ya sea clínica o productiva, los cuales deben interpretarse en forma conjunta con otras prácticas científicas de la Medicina.
Tipos de Métodos de Diagnósticos Métodos Directos O también llamados de Certeza, cuyo fundamento es el hallazgo de estructuras parasitarias o el propio parásito, por ejemplo, porciones del parásito (proglótidas), parásitos enteros, ooquistes, larvas, huevos, etc. Para la detección de éstos parásitos es necesario conocer la ubicación de ellos para poder encontrarlos, por lo que va depender la técnica parasitológica que utilicemos y cual sería nuestra muestra a obtener.
Introducción a los Métodos de Diagnóstico de Enfermedades Parasitarias Consideraciones Generales La detección de los agentes involucrados en un proceso patológico es una condición elemental para el establecimiento de medidas tendientes a su eliminación, es decir, tratamientos terapéuticos o medidas de control. El proceso diagnóstico a que son sometidas las muestras obtenidas de individuos pueden arrojar diferentes grados de positividad o negatividad, por ello se reconoce que ningún método es 100 % efectivo, haciéndose necesario un control periódico de los animales para poder actuar tempranamente en una Parasitosis Los métodos de diagnóstico son herramientas que se utilizan en la práctica de la profesión, ya sea clínica o productiva, los cuales deben interpretarse en forma conjunta con otras prácticas científicas de la Medicina.
Tipos de Métodos de Diagnósticos Métodos Directos O también llamados de Certeza, cuyo fundamento es el hallazgo de estructuras parasitarias o el propio parásito, por ejemplo, porciones del parásito (proglótidas), parásitos enteros, ooquistes, larvas, huevos, etc. Para la detección de éstos parásitos es necesario conocer la ubicación de ellos para poder encontrarlos, por lo que va depender la técnica parasitológica que utilicemos y cual sería nuestra muestra a obtener.
En la práctica laboratorial usada en medicina humana se aplican técnicas diagnósticas que se fundamentan en tecnología imagenológica avanzada como por ejemplo, Ecosonografía, Tomografía axial computarizada (TAC), y Resonancia magnética nuclear (RMN). En medicina veterinaria su uso es parcial y escaso debido al costo y a la preparación previa del paciente. Se mencionarán a continuación los métodos directos más utilizados en la parasitología chilena.
Frotis sanguíneo: (método de capa delgada) para detectar hemoparásitos, principalmente protozoos y nematodos. Ectoparasitológico: Método empleado en la detección de ectoparásitos principalmente ácaros tales como garrapatas, otros ácaros productores de sarnas, insectos productores de miasis, pediculosis y pulicosis. Exámenes Parasitológicos de Abejas: Diagnóstico de Nosemosis y Amebiasis, permite observar esporas de Nosema apis o apis o los quistes de Malphigamoeba mellificae , a partir de abdómenes de abejas. Detección de ácaros traqueales, permite la detección de Acarapis woodi en los segmentos traqueales en el mesotórax. Detección del ácaro Varroa detructor , basado en la inspección visual de las crías o de los adultos de Apis melliphera para melliphera para la detección del ácaro. Coproparasitológicos: Se pueden clasificar según los resultados que se puedan obtener. Así si es un método diseñado para entregar resultados según cantidad de parásitos encontrados ellos serán del tipo cuantitativo o bien si solo evidencian la variedad o tipo de parásitos posible de encontrar en una muestra, ellos serán del tipo cualitativo. Los métodos cuantitativos necesitan de una implementaci ón especial para medir los volúmenes de soluciones y el peso de las heces utilizadas. Cualquiera sea la técnica empleada tienen como fundamento el principio f ísico del peso espec ífico de los huevos de los par ásitos, de tal forma que ellos pueden sedimentar o caer con cierta velocidad cuando son sometidos a soluciones de menor peso que ellos, o bien, flotan cuando son sometidos a soluciones sobresaturadas. Ambos principios permiten la recuperación de estructuras parasitarias para su observación, diagnóstico, pudiendo ser mejoradas mediante el uso de tinciones, en algunos casos. Los resultados se expresan en negativos, o de positividad en diversos grados. Así los huevos de tricostrongilideos sedimentan a razón de 20 a 40 mm. por minuto, los huevos de Cestodos lo hacen a 50 mm./ min y los de Fasciola hepatica a 100 mm. /min. Siendo este principio de peso específico de los huevos el utilizado en la mayor de los exámenes coproparasitológicos. A continuación se muestra un diagrama con los métodos coproparasitológicos más utilizados:
A continuación se mencionan los métodos coproparasitológicos más utilizados en relación a su utilidad. Coproparasitológico de Teuscher (sedimentación flotación Sulfato de Zinc 70%) permite detectar ooquistes y quistes de protozoos, huevos y larvas de Nemátodos y huevos de Cestodos y Tremados. Flotación sal común es menos sensible que el anterior y su rango de detección es el mismo. Coproparasitológico Cuantitativo de Mc Master, permite la detección de ooquistes de protozoos, huevos y larvas de Nematodos y huevos de Cestodos. Coproparasitologico de Telemann modificado, se aplica para detectar principalmente protozoos entéricos en exámenes seriados de humanos y también las especies animales. Método de Sedimentación con detergente, utilizado específicamente para la detección de huevos de Fasciola hepatica . Tinción de Ziehl - Neelsen para detección de Cryptosporidium sp. , se tiñen rosadas estas estructuras por ser ácido-alcohol resistentes. Frotis de vísceras, para detectar parásitos entéricos, principalmente Protozoos . Los métodos más utilizados en el diagnóstico Médico coproparasitologicos, ectoparasitológicos y frotis sanguíneos.
Veterinario
son
Métodos Indirectos Son denominados de presunción, inmunológicos o serológicos. Donde se utiliza como muestra principalmente suero sanguíneo u otros fluidos corporales inclusive deposiciones. Estos métodos permiten detectar la experiencia presente o pasada del hospedero, con algún agente. Se basan en la detección de anticuerpos que desarrolla el hospedero como reacción a un antígeno o agente. Se pueden utilizar fracciones antigénicas específicas, desechos metabólicos, secreciones, etc. Poseen la ventaja de ser rápidos y económicos y en algunos casos bastantes exactos, sin embargo no son 100% sensibles ni 100% específicos. Deben desarrollarse usando antígenos puros que no siempre es posible obtener y cuando no se logra, pueden
presentar reacciones cruzadas, es decir resultan positivos frente a otros parásitos que no son los pesquisados. Los parásitos presentan mosaicos antigénicos complejos los que pueden variar según etapa del ciclo de desarrollo en que se encuentra el parásito, o bien, simplemente eluden la respuesta del hospedero. Lo anteriormente expuesto determina que éstas técnicas presenten algunas limitaciones para su uso masivo en la detección de enfermedades parasitarias, no obstante existen técnicas probadamente buenas en el uso de estudios seroepidemiológicos o diagnóstico de masa. A continuación se muestra una tabla donde se clasifican algunas técnicas de diagnóstico serológico.
Actualmente se han incorporado técnicas basadas en la biología molecular de los agentes, entre las cuales se encuentra la Reacci ón Cadena de la polimerasa conocida como PCR. A continuación se detallan los métodos más utilizados en la práctica nacional: Inmunofluorescencia Indirecta IFI, método utilizado para la detección de anticuerpos contra Toxoplasma gondii y Trypanosoma cruzi en muestras de suero sanguíneo de especies animales. Es necesario contar con un microscopio con equipo de epifluorescencia, siendo importante que el operador sepa reconocer la positividad. Inmunofluorescencia Directa IFD, se utiliza para la pesquisa de ooquistes de Cryptosporidium sp . Y quistes de Giardia sp . En muestras de fecas de animales domésticos (bovinos, ovinos, caprinos, porcinos, caninos, felinos, etc.) pudiendo ser usada para la detección de los protozoos citados en humanos. Las fecas deben ser mantenidas en un preservador en base a formol sal. Ensayo Inmuno Enzimático ELISA para la detección de antígenos de Echinococcus granulosus en fecas de caninos. Se detectan sustancias producto del metabolismo de del parásito, los que se detectan mediante anticuerpos elaborados para tal efecto. Es una metodología ELISA-SANDWICH. Existe ELISA indirecta para la detección de Neospora caninum en sueros de bovinos, de Trichinella spiralis en cerdos entre otros.
Fijación del Complemento FC. Se detectan anticuerpos contra diversos antígenos en suero de animales, a través de la acción que ejerce el complemento destruyendo el antígeno en una unión antígeno-anticuerpo. Se utiliza para detectar anticuerpos contra Babesia equi, Theileria equi , y Trypanosoma equiperdum en suero de Equinos.
Tabla: Métodos diagnósticos serológicos más usados en algunas enfermedades parasitarias.
++++: Recomendada por alta sensibilidad y especificidad. +++: Confiables por su sensibilidad. + y ++: De utilidad limitada. ( ): No se realizan en Chile actualmente. 1: En fase experimental.
Introducción Protozoos Los protozoos son organismos unicelulares pertenecientes al reino de los Protistas, según clasificación de los reinos Monera, Protista, Plantae, Fungi y Animalia. En el reino Protista se encuentra el sub reino Protozoa, al que pertenecen organismos unicelulares que son eucarióntes, es decir que poseen un material cromosómico agrupado en uno o más núcleos separados del citoplasma por la membrana nuclear, a diferencia de los procarióntes que carecen de membrana nuclear, quedando el material cromosómico en contacto directo con el citoplasma, como es el caso de las bacterias. Los protozoos tienen su hábitat en cualquier ambiente del globo terrestre agrupando unas 64.000 especies de las cuales unas 7.000 son parásitas de otras especies animales. Los protozoos presentan diferentes esquemas reproductivos siendo agrupados en dos tipos de reproducción la asexuada y la sexuada. Algunos protozoos pueden alternar estas dos formas. El núcleo juega un rol importante en las divisiones celulares, pudiendo existir más de un núcleo por célula, ésta característica muchas veces permite diferenciar especies de protozoos según número y disposición de éstos. Los tipos de reproducción asexuada más conocidos son: Fisión binaria: a partir de un individuo se producen dos nuevos individuos, siendo la división longitudinal en los flagelados y transversal en los ciliados. Fisión múltiple o Esquizogonía: El núcleo se divide varias veces y de un mismo individuo resultan 4, 6, 8 o más individuos hijos. Endodiogenia: a partir de una célula madre se forman dos células hijas en su interior, semejentes a la célula de origen, la cual se rompe y libera el producto. Endopoligenia: es similar a la anterior, sin embargo se forman más de dos células hijas. Todos los productos de Esquizogonía, endodiogenia, endopoligenia reciben el nombre de Merozoitos y las células que las forman se llaman esquizontes o merontes. Los tipos de reproducción sexuada más conocida son: Conjugación: se produce un intercambio de material nuclear entre las células progenitoras. Singamia o Gamogonía: se juntan dos células reproductoras llamadas gametos y forman un cigoto. Si los gametos son de igual tamaño se llaman isogametos y si son de diferente tamaño uno de ellos es el macrogameto (usualmente hembra) y el microgameto (usualmente macho). Los gametos son producidos por células llamadas gamontes. La alimentación de los protozoos puede ser pasiva o activa, desplazándose para obtener los nutrientes y generalmente proviene de materiales orgánicos (detritus celulares, células enteras, fluidos corporales, etc.), es decir, su nutrición es de tipo Heterótrofa a diferencia de la Autótrofa como la de organismos que utilizan la clorofila. La forma de alimentación puede ser a través del Citostoma que constituye una abertura oral permanente en algunos protozoos, o bien, pueden ingresar mediante una abertura oral temporal de la pared del organismo, proceso conocido como Pinocitosis, ya al interior y dentro de una vacuola digestiva es atacado por las enzimas propias del protozoo. Los deshechos son eliminados por el Citopigio (abertura permanente) o por una abertura temporal. La movilización o locomoción de los protozoos, puede ser mediante cilios, flagelos, pseudópos (como las bacterias) o por membranas ondulantes que es el sistema más avanzado de locomoción que lo presentan los Trypanosomas sp.
A continuación se expone una somera clasificación del subreino de los protozoos, considerando las divisiones de importancia en parasitología veterinaria.
Introducción Cestodos y Trematodos Céstodos Son gusanos planos parecidos a una cinta, pertenecen al Sub Phylum Platyhelminthes . Es un grupo importante de parásitos internos que se localizan en el tubo digestivo de vertebrados. En la transmisión de su ciclo evolutivo participan huéspedes intermediarios vertebrados o invertebrados. El estado adulto de estos parásitos denominados Tenias se encuentra en el huésped definitivo vertebrado y los estados larvarios que reciben diferentes nombres se ubican en el huésped intermediario que pueden ser vertebrados o invertebrados. Dentro de la clasificación de estos Céstodos podemos distinguir dos grandes grupos Cyclophyllidea y Pseudopyillidea , Los primeros son las denominadas Tenias verdaderas con órganos de fijación bien visibles como gancho que estan dispuestos en una corona o rostelo y ventosas, en cambio, los segundos sólo poseen botrios o botridios que son surco presentes en el escolex o seudoventosas. Morfológicamente los adultos se pueden dividir en: Cabeza o escolex, el que tiene la misión de anclarse o sujetarse a la pared intestinal del huésped mediante ganchos, ventosas o botrios. Cuello, detrás del escolex que puede ser largo o corto con celulas germinales que dan origen a proglótidas, este proceso se conoce como estrobilación. Cuerpo o estróbila que está compuesto por proglótidas, que varían en número según la especie y que se van haciendo maduras asexualmente a medida que se alejan del cuello. Las estructuras internas de un Cestodo son la pared del cuerpo formado por varias capas, la más externa la cutícula con proyecciones llamadas microtricos, los que absorben el alimento por difusión u osmosis, transporte activo o por pinocitosis. Bajo la cutícula existen otras capas, entre las destacan capas musculares. Luego existe un parénquima en el que están insertos un sistema osmoregulador o excretor, un sistema nervioso, aparato reproductor hermafrodita el cual puede ser simple o doble. Cabe destacar la ausencia de tubo digestivo. En cada uno de los ciclos evolutivos de los dos grupos de Cestodos, los estados larvarios adquieren nombres y estados diferentes. Los Cyclophyllidea adultos eliminan huevos embrionados al medio ambiente, una vez que se liberan de las proglótidas maduras y son ingeridos por el huésped intermediario, dentro de este último se desarrolla el estado larvario que puede adquirir los siguientes nombres, según tipo de huésped y según el número de parásitos que se puedan originar de esta estructura larvaria, como se describe en el siguiente cuadro.
Estructura larvaria
Huésped intermediario
Número de tenias originadas
Cisticercoide
Invertebrado (ocasionalmente vertebrado)
Una Tenia
Cysticercus
Vertebrado
Una Tenia
Coenurus
Vertebrado
Cientos de Tenias
Hidátide
Vertebrado
Miles de Tenias
Los Pseudopyillidea dan lugar a dos estados larvarios en diferentes huéspedes intermediarios dentro del mismo ciclo evolutivo, el Procercoide y el Plerocercoide . Los huevos son eliminados por una abertura que se denomina poro genital. No cabe duda que estas parasitosis son una de las más importantes ya que causan grandes pérdidas económicas y tienen trascendencia en salud pública, puesto que involucran al ser humano. Otras parasitosis son las causadas por los Tremátodos, de los cuales existe un solo representante en nuestro país la Fasciola hepatica que sigue produciendo grandes pérdidas económicas en algunas regiones del país y que también puede afectar al hombre.
Trematodos Dentro de las características morfológicas se distingue la forma de su cuerpo que es aplanada dorsoventralmente, de forma lanceolada, conoide, cilindroide o filiforme. Son hermafroditas y la mayoría presenta un ciclo de vida indirecto. Poseen una cutícula que puede ser lisa o con espinas que le sirven para el transporte y como instrumento de alimentación al raspar la superficie donde habitan. Sus órganos de fijación son ventosas, una oral o anterior y otra ventral al parásito. Hacia el interior del parásito encontramos el sistema digestivo, el sistema reproductivo, un sistema excretor y un sistema nervioso. El sistema digestivo está compuesto por la ventosa oral, faringe, un esófago, intestino que se divide en dos grandes troncos y que se ramifican en ciegos, aunque algunas especies de tremátodo poseen ano. Su alimentación puede ser quimófaga, histófaga o hematófaga y colagófaga dependiendo de la ubicación y estado de desarrollo. El sistema reproductivo básicamente contiene las mismas estructuras que otros parásitos (ver esquema), siendo la mayoría hermafroditas a excepción de los Schistosomas que presentan sexos separados. El sistema excretor está ramificado por el cuerpo y se van uniendo conductos que desembocan en un poro excretor ubicado en el extremo posterior del tremátodo. El sistema nervioso presenta un anillo periesofágico, del cual se originan fibrsa y ganglios que se distribuyen por todo el cuerpo. Existen pigmentos o placas fotosensebles en algunos estados de desarrollo del parásito como en el Miracidio y en Cercarias que responderían a estímulos lumínicos, y la presencia de placas sensoriales alrededor de la ventosa oral en las formas juveniles del parásito y que desaparecen en el estado adulto. En algunos tremátodos (del grupo Paramphistomum ) existe un sistema circulatorio rudimentario. En el ciclo evolutivo de los tremátodos se pueden mencionar varios entados larvarios, el Miracidio, la Esporocisto, Redias, Cercarias, y Metacercarias. La ausencia de alguno de ellos dependerá de la especie parásita, generalmente el estado de metacercaia es el infectante para el huésped definitivo, aunque hay excepciones, y en la mayoría de los ciclos de los tremátodos podemos encontrar que necesitan de un huésped intermediario en la mayoría de los casos es un caracol que habita en un ambiente acuático. A continuación hay un esquema del aparato reproductor hermafrodita de un tremátodo.
Esquema del aparato reproductor masculino y femenino de un trematodo. A. Poro genital común; B. Cirro; C. Glándula prostática; D. Saco del cirro; E. Vesícula seminal; F. Vaso deferente; 0. Testículo; H. Vagina; I. Utero; J. Gotipo rodeado por las glándulas de Mehlis; K. Ovario; L. Conducto de Laurer; M. Receptáculo seminal; N.Conducto vitelógeno; 0. Glándulas vitel6genas.
A continuación se expone una breve clasificación del Phylum platyhemintos al cual Pertenecen los Céstodos y Tremátodos. Se menciona el cuarto Phylum de los Helmintos, los Acantocéfalos que en nuestro país no representan parasitosis. Por mencionar algunas características de los acantocéfalos son vermes de cuerpo largo, cilíndrico y cuerpo anillado, carecen de tubo digestivo y provistos de trompa retractil armada de ganchos, mediante la cual se aferran a la mucosa del tubo digestivo de vertebrados. La nutrición es por osmosis al igual que los Céstodos. Presentan dimorfismo sexual. Su ciclo es indirecto con la participación de insectos o crustáceos como huéspedes intermediarios. El acantocéfalo más conocido es el Macracanthorhynchus hirundinaceus que afecta al Cerdo.
Introducción de Nematodos El sub reino de los Helmintos presenta cuatro sub phylum, ellos son Cestoda (tenias), Trematoda (distomas), Acantocéfalos y Nematoda (gusanos redondos). Los cestodos son hermafroditas al igual que los tremátodos, excepto los del género Schistosoma. Los Acantocéfalos y Nematodos poseen sexos separados y dimorfismo sexual, en los cuales las hembras son de mayor tamaño que el macho. Este capítulo práctico trata de los nematodos o vermes redondos, los cuales en su estado parasitario se encuentran en diferentes órganos o sistemas del huésped. Algunos de ellos son específicos para determinados grupos animales (estenógenos), como lo son los Trichostrongilídeos de los rumiantes; en los cuales causan parasitismo gastro intestinal, que produce pérdidas cuantiosas ya sea en su forma "sub-clínica,, o bien "clínica,, y en algunas ocasiones la muerte de animales. Otros vermes parásitos son eurígenos (pueden parasitar a muchas especies diferentes) y además constituyen zoonosis, como por ejemplo Trichinella spiralis, la cual presenta casos en forma clínica en personas, algunas de las cuales lamentablemente mueren. Nematodos parásitos como los Ascarldeos presentan un potencial biótico impresionante, así un Ascaris suum hembra puede eliminar 250.000 o más huevos en un solo día, lo que equivale a por lo menos tres huevos por segundo. La morfología de estos vermes sigue el tenor de aquellos redondos o cilíndricos, donde se observan órganos con funciones básicas de alimentación y reproducción. Tienen presencia de un tubo digestivo verdadero, con una boca que puede tener la presencia de labios o de láminas cortantes o en algunos casos presentar un mayor o menor grado de desarrollo de su cápsula bucal. A continuación sigue un esófago que muchas veces tiene una forma característica para una especie, tanto la boca o cápsula bucal como el esófago son elementos que se utilizan en la para la identificación de ejemplares. Posterior al esófago sigue el intestino, formado por una monocapa de fibras musculares, terminando en el recto o cloaca que se abre en el ano que generalmente está en la cara ventral del extremo posterior del nematodo. En relación a su sistema reproductivo vemos que existe dimorfismo sexual, en los machos se pueden encontrar a groso modo estructuras que también sirven como instrumentos de diagnóstico en algunas especies de vermes. En algunas especies están presentes una bolsa copuladora en su extremo terminal posterior cuya función es abrazar a la hembra en el momento de la cópula y con las espículas (otro elemento reproductivo de contextura quitinosa) dilatar la vulva y facilitar la penetración de los espermatozoides. Los testículos generalmente uno se encuentran ramificados por su cuerpo como estructuras filiformes. Otros machos que no presentan estas estructuras reproductivas (espículas y bolsa copuladora) presentan un extremo posterior curvado que los permite diferenciar de las hembras. Las hembras pueden tener también uno o dos ovarios ramificados de igual manera, en algunas especies la abertura genital (vulva) presenta una estructura que la cubre y se denomina labio vulvar, el extremo posterior generalmente termina recto. Existen variaciones importantes de tamaño, donde las hembras se presentan con un mayor desarrollo. Otros aspectos morfológicos que se pueden mencionar es la presencia de un sistema nervioso formado por troncos nerviosos que ascienden desde el anillo esofágico hacia la boca y otros troncos nerviosos que descienden desde este anillo hacia su extremo posterior. Existe también un sistema excretor que tiene función osmoreguladora. Algunas características fisiológicas es su tipo de alimentación, por ejemplo, algunos se alimentan de material digerido o semidigerido que varía en composición según la
localización del parásito, es decir, si se encuentra en estómago, intestino delgado o intestino grueso. Otros pueden alimentarse de mucosa gastroentérica o de vías respiratorias y otros tratan de llegar vasos sanguíneos para obtener sangre de la cual se alimentan. Los nemátodos presentan entonces una diversidad de formas, así como también una variada gama de estados infectantes, a través de huevos, larvas infectantes, microfilarias, etc. Los que pueden transmitirse mediante un ciclo directo o indirecto con participación de huéspedes intermediarios o vectores en algunos casos. Así este capítulo de nematología parasitaria, constituye uno de los puntos de mayor relevancia en los temas de salud animal y humana; basta señalar que existen sobre la tierra más de 2.000 millones de personas afectadas por algún tipo de nemátodo parásito en estos precisos instantes. A continuación se expone una clasificación breve de los Helmintos de mayor relevancia veterinaria y humana, incluyendo en ellos al phylum Nematoda.
Introducción de Artrópodos Los artópodos son el grupo más numeroso de las especies animales que habitan la tierra, abarcando un 85 % de ellas, con cifras cercanas al millón de especies. Dentro de las artrópodos los más numerosos son los insectos con cerca de 800.000 especies. Son además de abundantes, grandes colonizadores de diferentes ambientes, cumpliendo así con su rol biológico. Son animales que se caracterizan por poseer sus apéndices (patas) articulados y tanto el cuerpo como los apéndices poseen una cubierta gruesa que contiene quitina la que forma el exoesqueleto. Esta cubierta tiene conexiones flexibles (membranas) que permiten el movimiento entre los segmentos. Poseen un corazón rudimentario en la parte dorsal del cuerpo ocupada por el homocele. Y poseen un sistema nervioso ganglionar ventral y uno eslabonado arriba del esófago que asemeja a un cerebro. Existen dentro de los artrópodos muchas especies benéficas para la humanidad (polinización, productores de miel, cera, seda, etc.), pero también, existen aquellas que representan un peligro al inocular veneno en su picadura o mordedura (animales ponzoñosos) o pueden producir daños a la agronomía constituyéndose en verdaderas plagas. Y aquellos que pueden ejercer un parasitismo temporal o permanente. Algunas de estas especies parásitas producen pérdidas económicas importantes al dañar la salud de los animales domésticos o los productos de especies de abasto. Las especies parásitas producen diferentes efectos sobre sus huéspedes, destacándose el efecto patógeno que realizan al inocular en su huésped virus, bacterias, protozoarios, helmintos u otros artrópodos. Otro efecto es el daño traumático que se produce al penetrar por piel, por ejemplo ácaros de la sarna, larvas de moscas que producen miasis donde se destruye tejido y se produce también una acción irritativa.
En esta clasificación resumida se pueden observar dos grandes grupos, aparte de los Pentastómidos, en los que se dividen los artrópodos, los Chelicerata que son los que poseen quilíceros como aparato de alimentación, con la clase Arachniderida que poseen cuatro pares de patas, no poseen antenas, ni alas, ni ojos compuestos. Los segmentos están agrupados en caso de los Aracnorida en dos segmentos, un Cefalotórax y un abdomen, y en el caso de los Acarinorida agrupados en un segmento fusionado (cabeza, tórax y abdomen). El otro grupo de los Mandibulata son aquellos que presentan mandíbulas como aparato de alimentación, que presenta la clase Insectasida donde encontramos los insectos que presentan tres segmentos, la cabeza que tiene un par de antenas, el tórax que tiene tres pares de patas, a veces un par o dos pares de alas y el abdomen que no tiene apéndices. La respiración es por medio de traqueas que se comunican al exterior por los estigmas. Algunos presentan ojos compuestos. Dentro de esta clase se pueden encontrar los Exopterygota, donde encontramos los piojos, chinches y vinchucas que se caracterizan por que el estadío ninfal es semejante con el de los ancestros (adultos), presentando una metamorfosis incompleta o hemimetabolos, es decir, huevo, ninfas o juveniles, adultos. Se pueden encontrar también los Endopteygota donde encontramos a las moscas, abejas y pulgas que se caracterizan por que en su evolución las larvas son muy diferentes a los ancestros (adultos), presentando una metamorfosis completa(holometabolos), es decir, huevo, larva, pupa, adulto.
Practico Nº 1
Métodos de Diagnóstico utilizados en la detección de Protozoos. Algunos de los métodos aquí descritos como por ejemplo la técnica de Teleman modificado se utiliza no sólo para detectar protozoos, sino que tambien, para el diagnóstico de otros parásitos como Nemátodos y Cestodos. Pero para efectos prácticos de una buena distribución de los diferentes métodos que se verán durante el sementre es que se decidio pasarla en este práctico
Coproparasitológico de Telemann Modificado Tinción de Ziehl-Neelsen Frotis sanguineo Diagnóstico de Nosemosis
Coproparasitológico de Telemann Modificado Soluciones Fijador: Formaldehído solución al 40% Na Cl (cloruro de sodio) Agua destilada Colorante: Lugol :Yodo Yoduro de potasio Agua destilada Tinción MIF (Merthiolate, lodo y Formol) Lugol Formaldehído solución 40% Timerosal (Merthiolate) 1: 1000
50 mI 5 gr 950 ml 1 gr 2 gr 30 mI 0.10 MI 0.15% 0,75 mI.
Materiales : Mortero con pistilo, pipeta pasteur, vaso p.p de 250 nil, tamiz, tubo de 10 nil, porta objetos, cubre objetos, cámara húmeda. Procedimiento : 1. Vaciar la mitad de la muestra al mortero y agregar fijador si la emulsión es muy espesa. 2. Tomar con una pipeta pasteur una gota de la emulsión fecal y colocarla en un portaobjetos numerado cubrir, con un cubreobjeto y dejar en una cámara húmeda. Esta es la preparación directa. 3. Tamizar la emulsión hacia un vaso p.p de 250 nil y observar el material retenido para ver si se encuentran parásitos macroscópicos. 4. Depositar aproximadamente 10 mI de la emulsión tamizada en el tubo de 10 mI ya numerado, agregar una columna de 1 mI de altura de éter sulfúrico o etílico al tubo de centrífuga. 5. Ocluir el tubo con el pulgar y agitar enérgicamente, destapar lentamente para reducir la presión generada. 6. Colocar los tubos en la centrífuga. Centrifugar por 5 minutos a 1500 o 1800 r.p.m. 7. Vaciar el sobrenadante en forma brusca invirtiendo el tubo. 8. Con la pipeta pasteur colocar 2 gotas de tinción MIF separadas por 3 cms. entre si, con la pipeta pasteur tomar 2 gotas de sedimento obtenido en el tubo centrifugado y colocarlas al lado de cada gota de MIF. 9. Mezclar con un asa desechable las gotas de sedimento y MIF. Cubrir con el cubre objeto y repetir la operación con el otro par de gotas. Esta es la preparación concentrada. 10. Colocar en una cámara húmeda hasta el momento de su lectura.
11. La lectura se debe efectuar para ambas preparaciones con aumentos de 400 x y 100 x e inmersión cuando sea necesario.
Consideraciones Generales : Esta metodología diagnóstica permite el hallazgo y reconocimiento de algunas estructuras protozoarias tales como quistes (Giardia sp., Entamoeba hystolitica y otros) y trofozoítos, aunque presenta un rendimiento algo inferior al método de Teuscher. Es una técnica que puede ser aplicada en forma complementaria al Teuscher en muestras de animales mamíferos (mascotas). Es la que se aplica para el examen seriado de deposiciones en las personas.
Tinción de Ziehl-Neelsen para detección de Cryptosporidium sp. Materiales : Porta objetos desgrasados, cubre-objetos, varillas para suspender porta objetos, fuente de agua corriente, microscopio provisto de lentes de 400x e inmersión. Soluciones: Tinciones para detección de organismos ácido-alcohol resistentes (fucsina fenicada, alcohol ácido, azul de metileno). El alcohol-ácido se prepara agregando 3 ml. de ácido clorhídrico concentrado a 97 ml. de alcohol etílico de 95º. Procedimiento: 1. Se obtiene una alícuota del sedimento de las muestras de fecas, debidamente tamizadas y decantadas. Con ella se confecciona un frotis delgado el que se deja secar al medio ambiente. 2. Este frotis se cubrirá con carbol ? fucsina o fucsina fenicada y se calentará hasta emitir vapores, pero sin permitir que hierva. 3. Se permite reaccionar durante 20 a 30 minutos. 4. Los frotis se lavan con agua corriente. 5. Se decolora con alcohol ácido durante 30 segundos a un minuto. 6. Se lava nuevamente con agua corriente. 7. Depositar azul de metileno para efectuar una contracoloración, que tiñe de azul aquello que no posea las características de ácido alcohol-resistente. 8. Lavar nuevamente con agua corriente. 9. Dejar secar a medio ambiente. 10. Recorrer la preparación con 400x, usando inmersión cuando sea necesario confirmar la presencia de los ooquistes. 11. En las muestras positivas, los ooquistes se observan de forma esférica, entre 4 a 6 urn. de diámetro, de color rojo o rosado intenso, mientras que el fondo se observa de color azul. Se debe tener cuidado ya que algunos hongos o levaduras, pueden
determinar una coloración similar pero su forma y tamaño son importantes para efectuar el diagnóstico diferencial. Se recomienda montar en forma permanente, una preparación positiva para que sirva de referencia.
Consideraciones Generales : Esta técnica utiliza las características ácido alcohol resistente de los ooquistes de Cryptosporidium sp ., siendo una técnica de bajo costo y ligeramente menos sensible que IFD pero que necesita mayor tiempo de lectura que esta última, no siendo necesario contar con un microscopio dotado con equipo para inmunofluorescencia (halógena o de mercurio).
Frotis sanguineo (Método Capa Delgada) Tinción : Giemsa : La solución colorante, puede adquirirse lista en el comercio. Este colorante se diluye un volumen de la solución con 10 volúmenes de agua destilada. Material : Portaobjeto desengrasado, cubreobjeto, capilar, bulbo, vaso copling, cubeta, cubeta de tinción, canastilla, porta canastilla, pocillos para enjuague. Procedimiento : 1. Depositar una gota de sangre en un extremo del portaobjeto con un capilar provisto de un bulbo. 2. Acercar el cubreobjeto a la gota de sangre formando un ángulo de 30' una vez extendida la gota en una de las caras de cubreobjeto, se arrastrará la sangre en el portaobjeto dejando una delgada lámina. La extensión de sangre se seca inmediatamente, posteriormente se rotula sobre la parte gruesa del frotis con un lápiz grafito. 3. Fijar la extensión en alcohol metilico durante 3 a 5 minutos. 4. Secar al aire. 5. Sumergir el frotis durante 20 a 30 minutos en el colorante diluido. La duración de la tinción puede prolongarse 1 hora o más. 6. Lavar con agua destilada neutra. 7. Poner vertical para secar. 8. Leer el frotis una vez seco, en un mínimo de 50 campos. Algunos exámenes requieres que se revise la mayor extensión posible. 9. La lectura debe ser realizada con aumento de 1 000x o superior (inmersión).
Diagnóstico de Nosemosis (Nosema apis) y Amebiasis (Malphigamoeba mellificae) Generalidades. Existe una variada gama de formas para detectar parásitos en las muestras de Apis mellifera , por ello los métodos aquí expuestos son aquellos que se utilizan en forma rutinaria en la Unidad de Parasitología y que han demostrado ser economicos y sensibles. En Chile, aún varias patologías apícolas se mantienen como exóticas, sin embargo, las presentes presentan un fuerte impacto en la condición sanitaria de la colmena, como lo son nosemosis en abejas adultas y varroasis en larvas y abejas adultas. Otras son exóticas como Acarapis woodi pero se pesquisan en cada muestra que ingresa al laboratorio para acumular antecedentes y demostrar la condición aludida. Procedimiento : 1. Separar 20 abdómenes de abejas adultas y depositarlos en un mortero. 2. Agregar 5 cc. de agua destilada o corriente. 3. Homogenizar vigorozamente con el pistilo del mortero. 4. Obtener una alicuota de 0,0 15 m1 con un capilar graduado provisto de un bulbo de goma. 5. Depositar la gota entre porta y cubre objeto. 6. Dejar "descansar" la muestra con la finalidad que los elementos en solución no se desplacen. 7. Observar a 400x. 8. Una muestra se considera positiva cuando se observan las estructuras características de las esporas de Nosema apis y/o los quistes de Ma1ph¡gamoeba mellificae. 9. Contar las esporas observadas en varios campos y luego obtener un promedio para expresar el resultado en "cantidad (n) de esporas por campo de 400x". Recomendaciones. Es conveniente mantener siempre constante el número de abejas a procesar en cada muestra, así mismo el volumen de agua en la solución, la alicuota obtenida y el instrumento óptico en cuanto al diámetro de su campo, ya que ello permitirá la estandarización de la prueba y las comparaciones entre las mismas.
Practico Nº 2
Métodos de Diagnóstico utilizados en la detección de Nematodos Algunos de los métodos aquí descritos como por ejemplo la técnica de Teuscher modificado se utiliza no sólo para detectar Nematodos, sino que tambien, para el diagnóstico de otros parásitos como Protozoos y Cestodos. Pero para efectos prácticos de una buena distribución de los diferentes métodos que se verán durante el sementre es que se decidio pasarla en este práctico . Lo mismo ocurre para la técnica de flotación en Sal común. Es una técnica sencilla, económica y factible de usar en actividades en Terreno.
Coproparasitológico de Teuscher Flotación en Sal común
Coproparasitológico de Teuscher (Sedimentación y Flotación en Sulfato de Zinc 70 %) Solución de Trabajo: 700 grs. de sulfato de zinc por cada 1000 cc de agua. Material y equipo necesario: Morteros con pistilos, vasos de precipitado de 250 m1, tamiz con malla n' 60, tubos de 22 m1, tubos de 10 m1 porta objetos, cubre objetos, microscopio y centrífuga de sobremesa. Procedimiento : 1.Separar las muestras fecales para posteriormente pesar 5 grs. de fecas en caso de bovinos y equinos. Para las especies ovina, caprina y otros se pesan 2 grs. 2.La muestra se coloca en un mortero, se disuelve con agua y se homogeneiza. 3.Verter la muestra, a través de un colador fino (n' 60) a un vaso de precipitado de 250 ml, lavando con porciones pequeñas de agua hasta completar un volumen de 200 ml 4.Decantar durante 20 minutos, luego de los cuales se elimina el sobrenadante y se vierte el sedimento en un tubo de ensayo de 22 ml, hasta completarlo, enjuagando cuidadosamente el vaso de precipitado. 5.Esperar 10 minutos y el sobrenadante resultante se elimina depositando el sedimento en un tubo de centrífuga de 15 ml de capacidad, cuidando de enjuagar el tubo de 22 ml con solución de sulfato de zinc al 70%; vertiendo al tubo de centrífuga hasta 10 ml 6.Centrifugar durante 10 minutos a 1.500 r.p.m. 7.Centrifugado el tubo de 15 ml se saca y se coloca en gradillas, adicionándoles con un gotario solución de sulfato de zinc al 70% hasta fonnar un menisco convexo, sobre el cual se deposita un cubre objeto de 18 x 18 ó 20 x 20 mm. 8.Esperar 5 minutos para que las estructuras presentes (huevos, ooquistes, quistes y otras) se adhieran a la cara inferior del cubre objetos mediante flotación. 9.Retirar el cubre objetos y montarlo sobre un porta objetos observando luego al microscopio. 10. Leer con aumentos de 1 00x y 400x.
Resultados : Los resultados se expresan de acuerdo a la siguiente pauta.
Positivos : x xx xxx xxxx
escasa cantidad regular cantidad abundante cantidad muy abundante cantidad
(1-10) (11-50) (51-100) (> 100)
Consideraciones generales de la técnica : Esta técnica permite detectar la presencia de protozoos (ooquistes y algunos quistes), helmintos (huevos o larvas de diversos nematodos, huevos de cestodos) y el algunos casos es posible observar algunos artrópodos en las fecas. Si bien es cierto es una de la técnicas de mayor uso en los laboratorios de la espcialidad, también presenta algunos inconvenientes en razón del peso específico de la solución, la cual deforma algunas estructuras (huevos de distomas) y destruye quistes de protozoos tales como Giardia sp., Cryptosporidium sp.y no permite la observación de trofozoítos.
Flotación en Sal común Generalidades : Este método es bastante sencillo y económico, sin embargo presenta menor sensibilidad que el método de Teuscher. Por ello se recomienda en aquellos laboratorios que no posean la implementación para efectuar otras técnicas. Materiales : Microscopio óptico, tamices, morteros, tubos de ensayo, porta objetos y cubre objetos. Solución : Solución de Cloruro de Sodio (Sal común) al 30 % ( 300 grs. de sal común en 1 litro de agua) Procedimiento: 1. Disolver en unos 50 cc. de solución salina, dos gramos de fecas. 2. Tamizar la solución. 3. Depositar la solución en un tubo de ensayo u otro recipiente hasta formar un menisco convexo. 4. Depositar un cubre objeto sobre el menisco.
5. Esperar 10 minutos. 6. Retirar el cubro objetos y montar sobre un porta objetos. 7. Leer en microscopio óptico.
Practico Nº 3
Métodos de Diagnóstico utilizados en la detección de Trematodos La Técnica de Sedimentación, permite pesquisar huevos de Fasciola hepatica , basandose en el principio físico del peso específico de los huevos, éstos por ser muy pesados sedimentan a una velocidad mayor lo que permite que se observen esperando el tiempo recomendado para este método. Sedimentan a una velocidad de 100 milímetrospor minuto. Para la detección de huevos de Cestodos se pueden utilizar otras técnicas ya vistas o que se verán luego. Por ejemplo, la técnica de Telemann permite detectarlos o el método de Teuscher modificado también (se verá en Nematodos)
Método de Sedimentación Observación de proglótidas
Método de Sedimentación Material : Mortero con pistilo, tamiz (colador con malla nº 60), vaso de precipitado de 250 mI, portaobjetos, cubreobjetos, pipetas pasteur.
Tinción : Lugol:Yodo Yoduro de potasio Agua destilada
1 gr. 2 grs. 30 ml.
Verde malaquita:Verde malaquita Agua destilada
1 gr. 1.000 MI.
Procedimiento : 1.Tomar una fracción de fecas del tamaño de una nuez o pesar 5 gramos. 2.Homogenizarlo en un vaso precipitado en unos 200 cc. de solución con detergente (cualquier detergente líquido comercial). 3.Tamizarlo y rellenar un vaso precipitado de 250 ml. con la misma solución hasta completar los 200 cc. 4.Dejar sedimentar o decantar por 10 minutos. 5.Eliminar el sobrenadante, agregar más solución detergente hasta completar 200 cc. y dejar sedimentar por 10 minutos más (este procedimiento es recomendable repetirlo cuantas veces sea necesario hasta obtener un sobrenadante de aspecto claro). 6.Transferir el sedimento a una placa Petri u otro recipiente adecuado. 7.Observar bajo lupa estereoscópica. Se puede agregar al sedimento final unas gotas de Lugol o Verde malaquita y se deja teñir por un minuto.
Consideraciones Generales : Este método se aplica para la detección rápida de huevos de alto peso específico (Fasciola hepática, cestodos y algunos nematodos). Presenta la ventaja de ser sencillo, rápido y económico, sin embargo su capacidad para detectar las estructuras es ligeramente inferior al método de Teuscher. Es una técnica complementaria.
Identificación de Proglótidas Material : portaobjetos, cubreobjetos, pinzas, placas de petri, disponer de alguna tinción como rojo carmin u otra. Para la identificación de proglótidas es necesario conocer la morfología interna y externa de un Cestodo, es decir tener referncia de como es aparato reproductor, como elimina huevos al medio ambiente, si lo hace eliminando de a uno o salen envueltos en una cubierta (capsulas ovigeras), o si elimina proglotidas solas o trozos de su estrobila. Por cuantos orificios (poros genitales) salen estos huevos, entre otros puntos a considerar. Lo ideal para la correcta clasificacion es constar con el escolex de la Tenia, ya que nos pude aportar antecedentes importantes al momento del diagnostico, como pr ejemplo, la presencia de un rostelo, cuantas filas de ganchos posee este rostelo, como es la forma de su s ventosas, si presenta o no apendice retractil en su rostelo, forma de los ganchos, etc. La identificacion de los ejemplares depende muchas veces de la visualizacion de detalles que permitan clasificar un parásito dentro de un género o incluso a que especie pertenece.En la identificacion de proglotidas lo ideal sería la tinción de ellas , lo que permite una mejor visualización del sistema reproductor y de su disposición interna.A continuación se muestra la morfología interna de una proglótida tipo que nos permitirá hacer más facil nuestro diagnóstico. Se muestran además los diferentes tipos de estados larvarios de los Cetodos
c.= Cirro; c.s.= Saco del cirro; g.s.= Seno genital oot.= Ooteca; ov.= Ovario; r.s.= Receptaculo seminal; t.= Testículos; ut.= Útero; vag.= Vagina; v.d.= Vaso deferente; vit.= Glándula vitelógena
A continuación se muestran una serie de imagenes extraidas de E. J. L. Soulsby (6ª Ed. 1968) que le servirán para la identificación de las preparaciones que se le entregarán para su identificación.
A.= Moniezia benedeni B.= Moniezia expansa
Thysanosoma actiniodes Proglótidas maduras
Dipylidium caninum, escolex y proglótida madura
Proglótida madura de Taenia solium l.e.c.= Canal excretor longitudinal; l.n.= Nervio lateral; oot.= Ooteca y glándula de Mehlis; ov.= Ovario; r.s.= Receptáculo seminal; t.= Testículos; ut.= Útero; vag.= Vagina; vit.= Glándulas vitelógenas; v.d.= Vaso deferente
Proglótidas de Taenia saginata = a y de Taenia solium = b. Observe las ramificaciones uterinas primarias o principales.
Escolex y proglótida madura de Taenia pisiformis
Características Forma del escólex Tamaño del escólex Corona de ganchos Tamaño de las proglótidas Ram. Uterinas primarias Tamaño de los huevos
Taenia saginata Rectangular 1 - 2 ml. ausente 1,5 - 2,5 alto x 1 ancho > 12 30 - 40 micrones
Taenia solium Piriforme 0,5 - 1 ml. presente 0,6 - 0,8 alto x 0,5 ancho < 12 30 - 40 micrones
Aqui se muestra la morfología interna de un Trematodo y sus estados evolutivos (Fasciola hepatica )
Práctico N°4
Métodos de diagnósticos utilizados para la detección de artrópodos Para la detección de artrópodos, el profesional que tome la muestre, debe en primer lugar hacer una buena anamnesis, sobre la aparción de las lesiones. En segundo lugar detectar si es que el agente está presente (en caso de que los artrópodos sean de gran tamaño, pulgas, piojos, garrapatas, etc), o si no es visible, deberá tomar una buena muestra. Una buena muestra, es aquella que nos permite pesquisar el agente parasitario del cual se sospecha. Para el caso de los artrópodos detectables por medio microscopio, se debe raspar con una hoja de bisturí del centro y borde de las lesiones, hasta que sangre y extraer pelos de raiz. A continuación se verán dos métodos utilizados em la deteción de artrópodos:
Ectoparasitológico Detección de Varroa sp.
Ectoparasitológico Solución : Hidróxido de sodio al 3%, Lactofenol (1 volumen de ácido láctico, 1 volumen de fenol o ácido carbólico, 1 volumen de glicerina, 1 volumen de agua destilada que puede usarse o no, dependiendo de cuán consistente se desee la solución). Materiales : Placas reloj, bisturí, pinzas. Procedimiento : 1.Las escamas o pelos son depositados en la placa reloj, agregando gotas de lactofenol se deja reposar durante 10 minutos aproximadamente para luego observar las estructuras parasitarias en el microscopio estereoscópico. 2.En caso de no tener lactofenol es posible usar hidróxido de sodio al 3%, calentando la placa reloj en el mechero, para luego ser observada en el microscopio estereoscópico ó microscopio óptico. 3.La lectura debe ser efectuada a aumento adecuado para la observación del ectoparásito buscado. 4.La identificación se efectúa en base a claves pictóricas existentes o según experiencia del observador.
Detección de Varroa sp Consideraciones Generales : La presencia de Varroa destructor puede ser registrada tanto en la cría operculada como en abejas adultas. Generalmente el diagnóstico es efectuado en las abejas adultas cuando ellas cumplen la fase de permanencia y diseminación, en la superficie de las obreras y zánganos y pocas veces se efectúa dicho diagnóstico en la fase reproductiva que ocurre en las larvas. En este documento se expondrán los dos metodologías. En cría operculada. Varroa destructor prefiere las larvas de zángano mas que las de obreras para efectuar su desarrollo reproductivo, en una proporción de 9-10 veces zánganos / 1 vez obreras, debido a una serie de mecanismos entre los cuales se cuenta la mayor producción de hormona juvenil 3 por parte de las larvas de zánganos, rugosidad del opérculo y duración de la fase operculada. En algunos casos la infestación es tan alta que los ácaros también atacan larvas de obreras. Procedimiento : 1. Abrir los opérculos bajo una fuente de luz directa, idealmente iluminador de fibra óptica de haz de luz fría y dirigible
