Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Volk & Wheeler, 1993).
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Pelczar & Chan, 1986). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).
Pewarnaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histologi yaitu Cristian Gram (Cappuccino & Sherman, 1983). Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp
Dinding sel organisme gram positif cukup tebal (20-80 nm) dan terdiri 60 sampai dengan 100 peptidoglikan. Semua bakteri gram positif pos itif mempunyai polimer lurus asam N -asetil muramat dan N-asetil glukosamin, namun ada variasi dalam panjang dan komposisi jembatan peptida yang mengaitkan silang tetra peptida dari satu asam N -asetil -asetil muramat dengan polimer po limer disampingnya. Beberapa organisme gram positif juga menggandung substansi dinding sel ya ng disebut asam teikoat yang dikaitkan pada asam muramat dari lapisan peptidoglikan. Disamping asam teikoat yang terikat pada peptidogli pept idoglikan kan ( yang tidak terdapat pada semua se mua bakteri gram positif ), semua bakteri gram positif mengandung asam teikoat te ikoat tipe gliserol yang terikat pada membran sel.Karena satu ujung asam terikoat yang terikat membran berasosiasi dengan lipida dalam membran, maka disebut asam lipoteikoat.
Dinding sel bakteri gram negatif mempunyai susunan kimia yang lebih rumit dari bakteri gram positif. Sebagai contoh, dinding sel gram negatif mengandung lebih sedikit peptidoglikan ( 10 sampai 20 persen bobot kering dinding sel), tetapi diluar lapisan peptidoglikan, ada struktur ³membran kedua³, yang tersusun dari protein, fosfolipid, lipopolisakarida (asam lemak yang dirangkaikan dengan polisakarida). Komponen lipopolisakarida dinding sel bakteri gram negatif sangat penting karena toksisitasnya pada hewan. Pewarnaan gram digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Terutama amat berarti di laboratorium diagnostik rumah sakit, karena informasi yang diperoleh dar i pengamatan spesimen yang diwarnai dengan pewarnaan gram dengan cepat dapat memberikan petunjuk akan organisme penyebab suatu infeksi. Penggolongan atas bakteri Gram positif dan Gram negatif dilakukan setelah pencucian dengan alkohol. Pada pengecatan pertama semua bakteri berwarna ungu. Pada percobaan didapat bahwa semua bakteri bersifat gram negatif karena saat dicuci dengan alkohol, lipid akan terektraksi dari dinding sel, pori-porinya mengembang. Zat warna yang mula-mula diberikan keluar dari sel sehingga sel menjadi tidak berwarna. Sebelum di lakukan pengecatan kita membuat film. Pada pengecatan yang pertama zat warna yang di gunakan adalah gentian violet. Gentian violet merupakan kompleks zat warna primer. Pada saat pencucian alkohol usahakan sampai tidak terdapat zat warna yang larut tetapi jangan terlalu lama karena akan menyebabkan kemungkinan bakteri gram negatif dapat berubah menjadi gram positif. Setelah di cuci dengan air pewarnaan selanjutnya adalah dengan safranin/ fuchsin selama 1-2 menit. Penambahan zat warna ini sebagai pewarna tandingan setelah organisme yang kehilangan kompleks warna ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol. Telah di ketahui bahwa komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan dinding sel gram negatif. Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi, menyebabkan pori - pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya kompleks gentian violet pada langkah pemucatan. Sel bakteri gram positif mengikat zat warna dasar dengan kuat sehingga tidak dapat di lunturkan oleh zat peluntur dan tidak dapat di warnai lagi oleh zat lawan. Untuk sel-sel gram negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Larutan lipid oleh pemucat yang
di gunakan dalam pewarnaan gram diduga memperbesar pori- pori dinding sel sehingga proses pemucatan pada sel-sel gram negatif berlangsung lebih cepat. Bakteri gram negatif daya pengikatan warna dasarnya tidak kuat sehingga dapat di lunturkan dan dapat di warnai kembali oleh zat lawan. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri menurut Pelczar & Chan (1986) adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengk erut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu (Pelczar & C han ,1986).
