I.- TITULO: CARACTERIZACIÓN CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN NUTRICIONAL NUTRICIONAL DE DOS DOS TIPOS DE HARINA DE PEPA DE PACAE (Inga edulis Mart ). ). II.- PLANTEAMIENTO Y JUSTIFICACION DEL TEMA 2.1.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA: 2.1.2 DESCUBRIMIENTO DESCUBRIMIENTO DEL PROBLEMA: Las semillas del pacae se utilizan como alimento animal en nuestra amazoní amazonía, a, esto nos conlleva conlleva a pensar pensar que contien contienen en alto contenid contenido o prot protei eico co
que que
transfor transformaci mación ón
pued puede e
ser ser
apro aprove vech chad ado o
en alimenta alimentación ción humana humana
sati satisf sfac acto tori riam amen ente te
para salvagu salvaguarda ardarr
pre previ via a
los
altos altos
índices de desnutrición de algunas zonas de nuestra región.(1)
2.1.2 HECHOS: Los altos índices de desnutrición desnutrición
de algunas zonas de nuestra región
nos motiva a encontrar encontrar alternativas alternativas alimenticias alimenticias de productos productos de la zona que contengan contengan un alto valor nutritivo que ayude a disminuir estos índices y crear bienestar corporal que nos conlleve a un desarrollo como región.
2.1.3Planteamiento del problema ¿Cual de las dos variedades de pacae preponderantes en la selva central de nuestra región nos permite obtener obtener harinas con mayor contenido contenido nutricional, alto poder de digestibilidad digestibili dad y funcionalidad?
2.2.- JUSTIFICACIÓN JUSTIFICACIÓN La semilla del Pacae posee propiedades nutritivas como el alto contenido de calcio, fósforo y proteínas proteínas con alto grado de digestibilidad digestibilidad .Por ende previos previos análisis análisis se
pueden pueden
aprovech aprovechar ar dichos dichos nutrien nutrientes tes
mediante mediante la
elaboración elaboración de harinas que puedan ser utilizada como reforzamiento reforzamiento de alimentos como papillas y
mezclas tradicionales tradicionales para elaboración elaboración de
productos que combatan el grado de desnutrición de nuestra región.(3)
1
III.- OBJETIVOS 3.1 3.1 Ge Gene nera ral: l: Evaluar las dos variedades variedades de pacae que nos permitan obtener harinas con mayor contenido nutricional, alto poder de digestibilidad y funcionalidad.
3.22 Espe 3. Especí cífi fico cos: s: •
Caracterización Caracterización fisicoquímica fisicoquímica de las pepas del pacae (Humedad, (Humedad, ceniza, Extracto seco, Proteína bruta, fibra bruta, extracto no nitrogenado).
•
Elaboración de las curvas de secado para las pepas del pacae.
•
Realización de pruebas fitoquímicas en las pepas deshidratadas (Saponinas, fenoles, esteroides).
•
Evaluaci Evaluación ón cromatográ cromatográfica fica para
la cuantifica cuantificación ción de aminoácido aminoácidos s en las
harinas. •
Caracterización Caracterizac ión biológica de las proteínas en las harinas (PER, NPU).
IV.- MARCO TEORICO 4.1. El Pacae: Es un árbol pequeño de 8-3 m. de altura; fuste de 15-40 cm, muy ramificado, casi desde la base y corteza externa lisa de color pardo grisáceo. Hojas compuest compuestas, as, alternas alternas,, paripin paripinnad nadas, as, con estípulo estípulos s decídua decíduas s y ráquis ráquis alado alado pardo pardo tometoso tometoso.. .. El fruto fruto es una vaina vaina cilíndric cilíndrica a indehis indehiscen cente, te, con surcos surcos longitu longitudin dinales ales múltiples, de 40-120 cm. de largo y 3,5- 3,7 cm. de diámetro, verde oscuro pardotomentoso. tomentoso. Semillas en número de 10-20 por fruto, oblongas, negro a negro violáceo y cubiertas por un arilo blanco, algodonoso y dulce. El arilo de la semilla de los frutos maduros es comestible; es pulposo, suculento y dulce. Se consume directamente al estado fresco. Se utiliza también en la preparación de refrescos, y tiene potencial en la producción de alcohol de buena calidad. (1) Tradic Tradicion ionalm almen ente, te, los fruto frutos s de segun segunda da calid calidad ad son son consu consumid midos os por por el gana ganado do vacuno, porcino, aviar y en piscicultura; la semilla contiene proteínas en cantidad importante, que le dan potencial como ingrediente en alimentación animal. (1)
4.1.1 Variedades del Pacae: En la estrella fluvial del Marañón se conocen 22 variedades y especies de Pacae, como lo atestiguan los esposos Berlín en etnobiología, etnobiología, subsistencia y nutrición en una sociedad de la selva tropical: los
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III.- OBJETIVOS 3.1 3.1 Ge Gene nera ral: l: Evaluar las dos variedades variedades de pacae que nos permitan obtener harinas con mayor contenido nutricional, alto poder de digestibilidad y funcionalidad.
3.22 Espe 3. Especí cífi fico cos: s: •
Caracterización Caracterización fisicoquímica fisicoquímica de las pepas del pacae (Humedad, (Humedad, ceniza, Extracto seco, Proteína bruta, fibra bruta, extracto no nitrogenado).
•
Elaboración de las curvas de secado para las pepas del pacae.
•
Realización de pruebas fitoquímicas en las pepas deshidratadas (Saponinas, fenoles, esteroides).
•
Evaluaci Evaluación ón cromatográ cromatográfica fica para
la cuantifica cuantificación ción de aminoácido aminoácidos s en las
harinas. •
Caracterización Caracterizac ión biológica de las proteínas en las harinas (PER, NPU).
IV.- MARCO TEORICO 4.1. El Pacae: Es un árbol pequeño de 8-3 m. de altura; fuste de 15-40 cm, muy ramificado, casi desde la base y corteza externa lisa de color pardo grisáceo. Hojas compuest compuestas, as, alternas alternas,, paripin paripinnad nadas, as, con estípulo estípulos s decídua decíduas s y ráquis ráquis alado alado pardo pardo tometoso tometoso.. .. El fruto fruto es una vaina vaina cilíndric cilíndrica a indehis indehiscen cente, te, con surcos surcos longitu longitudin dinales ales múltiples, de 40-120 cm. de largo y 3,5- 3,7 cm. de diámetro, verde oscuro pardotomentoso. tomentoso. Semillas en número de 10-20 por fruto, oblongas, negro a negro violáceo y cubiertas por un arilo blanco, algodonoso y dulce. El arilo de la semilla de los frutos maduros es comestible; es pulposo, suculento y dulce. Se consume directamente al estado fresco. Se utiliza también en la preparación de refrescos, y tiene potencial en la producción de alcohol de buena calidad. (1) Tradic Tradicion ionalm almen ente, te, los fruto frutos s de segun segunda da calid calidad ad son son consu consumid midos os por por el gana ganado do vacuno, porcino, aviar y en piscicultura; la semilla contiene proteínas en cantidad importante, que le dan potencial como ingrediente en alimentación animal. (1)
4.1.1 Variedades del Pacae: En la estrella fluvial del Marañón se conocen 22 variedades y especies de Pacae, como lo atestiguan los esposos Berlín en etnobiología, etnobiología, subsistencia y nutrición en una sociedad de la selva tropical: los
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Aguaruna, Aguaruna, 1978. En Nuestra
selva central las
dos variedades variedades mas
preponderantes son : o
o
Inga Grenadensis Urb Inga benthamiana meisn
Estas dos variedades son conocidas comúnmente como la variedad blanca y la amarilla por el color del arilo respectivamente. (1)
4.1.2 Usos de las Pepas de Pacae : Algunas comunidades indígenas de la Amazonía, Amazonía, además de consumir la fruta como alimento, utilizan las semillas y hojas con fines medicinales: antidiarreico y antirreumático. Las semillas de especies seleccionadas son consumidas por ciertos grupos indígenas de Araracuara. En El Salvador se emplea la corteza de algunas especies para la producción de taninos. En el Vaupes, Colombia Colombia,, los indígenas indígenas utilizan la goma de ciertas ciertas especies especies para fijarl fijarlos os color colores es desti destina nado dos s a pintar pintar sombr sombrer eros, os, cana canasta stas s y otras otras artesanías. (2)
4.1.3
Compo Composic sición ión Fisico Fisicoquí químic micaa y Fitoq Fitoquím uímica ica de Las Pepas Pepas del Inga edul edulis is de la variedad grenadensis, Las semil semillas las de Inga grenadensis, Pacae: Las
comidas como vehículos, se divulgan para contener por 100 g, 118 calor calorías ías,, 63.3% 63.3% humed humedad ad,, 10.7 10.7 prote proteína ína de g, 0.7 0.7 grasa grasas s de g, carbohidratos carbohidratos total de 24.0 g, fibra de 1.6 g, ceniza de 1.3 g. Pulpa de Inga spp. contiene por 100 g, 60 calorías, 83.0% humedades, 1.0
proteínas de g, 0.1 grasas de g, 15.5 carbohidratos total de g, 1.2 fibras de g, 0.4 cenizas de g. Semillas secadas de Inga spp. contener por 100 g, 339 calorías, 12.6% humedad, 18.9 proteína de g, grasa de 2.1 g, carbohidratos total de 62.9 g, fibra de 3.4 g, ceniza de 3.5 g. Las semillas del género Inga se divulgan para contener los inhibidores de la tripsina y los inhibidores del chymotrypsin. (3)
3
4.2 Tendencia de los Sustitutos
Alimenticios con Harinas de Alto Valor
Proteico: En la década de 1970-1980 en varios países del mundo se implementaron programas de investigación tendientes a formular alimentos con un alto contenido de proteína de buena calidad, utilizando principalmente proteínas vegetales. La idea era utilizar estas formulaciones en sustitución de las proteínas de origen animal, que por su baja disponibilidad y alto costo no estaban disponibles para las poblaciones de escasos recursos. Para estos fines se han empleado proteínas de oleaginosas, de Cereales y de leguminosas, que combinadas, dan origen a alimentos de alto valor proteínico y contienen otros nutrientes que son deficitarios en la dieta de la población. Muchas formulaciones de esta naturaleza se han desarrollado y sometido a pruebas biológicas de calidad nutricional, utilizando animales experimentales, y finalmente el hombre. Se consideran dos grupos: a) sustitutos de leche, y b) extensores de alimentos de origen animal. (4)
Consideraciones Generales: La planificación y el desarrollo de estos alimentos debe tomar en cuenta consideraciones, de orden tecnológico-nutricional, cultural, social y económico, tales como: 1. Materia Prima: en lo posible debe ser local, ya que al importarla, no sólo se crea una dependencia, sino que se incrementa el costo final del producto.
2. Evaluación de Calidad: se han diseñado guías y metodologías para el control y la garantía de calidad de las fórmulas. Estas comprenden procedimientos de orden Tecnológico (aceptabilidad y estabilidad del producto), nutricional (calidad y digestibilidad de la proteína y tolerancia por los niños, y efecto suplementario a la dieta), toxicológico y sanitario.
3. Procesamiento y Comercialización: se han establecido procedimientos generales para el sistema de producción con respecto a la disponibilidad y características de la materia prima y la adición de suplementos y sabores. Con respecto a la
4
comercialización, se ha puesto especial atención a la forma de presentación, precio, estabilidad, envase, distribución y propaganda. Más que un concepto, las harinas compuestas son ya una realidad traducida en alimentos que se comercializan y se consumen, y que pueden contribuir significativamente al mejoramiento de la seguridad alimentaria y nutricional de la población centroamericana. (4)
4.2.1 Harinas Compuestas a base de Leguminosas y Otros: La tecnología para la preparación de harinas precocidas de frijol consiste en someter el grano a un proceso de cocción, deshidratación y molienda. El producto así obtenido está listo para consumo después de cocinarse durante 10 a 15 minutos. Este tipo de producto puede usarse en la preparación de harinas compuestas basadas en diferentes leguminosas de grano. La combinación del frijol común con otros frijoles como el caupí ( Vigna sinensis) o el gandul ( Cajanus cajan) pueden utilizarse posiblemente reduciendo el precio del producto y creando el interés para producir otras leguminosas en determinadas regiones. Este tipo de harina compuesta puede ser usado como sopa de diferentes tipos y sabores, o puede combinarse con otros alimentos en la preparación de sopas de alto valor nutritivo. (4)
5
4.3 Elaboración de harinas Precocidas: Son aquellas en la cual el índice de solubilidad y el índice de absorción es mayor que las harinas crudas. Se tienen dos fases que son la tecnológica y la fase nutricional (formulación de mezclas). (5)
Materia Prima Clasificación y Selección Lavado Tratamiento Térmico (89ºC) Secado o deshidratado (50-60ºC) Molienda Tamizado Harina El tiempo de tratamiento térmico para leguminosas es de 20-25 min.Los criterios que se deben tomar para la elaboración de una mezcla alimenticia son: (5) •
Deben tener un alto valor nutricional: Proteínas de alto poder nutricional, carbohidratos
fácilmente digestibles, densidad energética
adecuada (0.8-
1Kcal/g de alimento preparado) •
Estar libre de factores antinutricionales (Saponinas, inhibidores de proteasas, oligosacaridos, etc)
•
Preferentemente se debe usar materias primas locales
•
Debe corresponder a los hábitos alimenticios locales.
•
Debe tener una vida útil larga.
6
•
Debe tener un costo moderado.
4.4 El HPLC: Esta técnica se ha convertido, sin lugar a dudas, en la más popular y versátil de las técnicas analíticas modernas en los laboratorios de hoy. Los sistemas de HPLC se utilizan actualmente en una amplia variedad de campos. Día a día aumentan los requerimientos de confiabilidad de los datos analíticos y de eficiencia en el flujo de trabajo del laboratorio, para un desarrollo más rápido de nuevas drogas, para mejorar la seguridad de los alimentos, y para cumplir con estándares más altos en regulaciones ambientales.
Un aspecto importante en el análisis de los
aminoácidos es el hecho de que no se pueden detectar en el visible-UV. Existen varios reactivos que reaccionan con los aminoácidos dando compuestos coloreados o fluorescentes y que, por tanto, pueden utilizarse para análisis cualitativos o cuantitativos. Esto es lo que se denomina derivatización de los aminoácidos. Los métodos fluorimétricos tienen muchas ventajas respecto a la espectrofotometría para el análisis de aminoácidos. Necesidades proteicas . Se requiere un criterio para fijar las necesidades o exigencias en proteínas para el ser humano. Por ello se establece una "proteína de referencia" o "patrón". (6) A menudo es necesario identificar y cuantificar los aminoácidos individuales de una mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las investigaciones de la estructura de las proteínas. El uso de la cromatografía en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el número y la cantidad relativa de los diferentes aminoácidos presentes en una muestra (análisis cualitativo), aunque para los análisis cuantitativos es necesaria la cromatografía de gases o un analizador de aminoácidos .
(6) 4.4.1
Cromatografía en capa fina. Una importante aplicación de la
cromatografía en capa fina es la de servir como guía para el desarrollo de las condiciones óptimas para realizar separaciones por cromatografía de líquidos en columna. Proporciona una idea rápida de los aminoácidos mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, algunos cromatografistas son de la opinión de que los ensayos en capa fina deberían preceder siempre al uso de la
7
columna.En la cromatografía de papel se pueden aplicar grandes volúmenes de muestra, lo que permite la elución posterior de un aminoácido en particular para su posterior purificación y análisis, factor que tiene gran importancia en la identificación de un constituyente desconocido de la muestra. Antes de la realizar la cromatografía, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales cromoproteínas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio iónico. Los aminoácidos retenidos pueden eluirse a continuación añadiendo a la columna un pequeño volumen de amoniaco y lavando después con agua destilada. La separación de los aminoácidos se basa en que éstos se reparten de modo diferencial entre la fase móvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedimiento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el eluyente que será succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie del la placa.La identificación de un aminoácido se realiza comparando los valores de R f (factor de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia, debiéndose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad. La naturaleza de los aminoácidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los
diferentes solventes
pueden permitir una mejor
resolución de los
componentes ácidos, básicos o neutros. En general, aumentando la proporción de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de R f e introduciendo pequeñas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminoácidos básicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composición química del disolvente puede también limitar el rango de reactivos de localización que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el ácido sulfanílico no puede utilizarse con disolventes fenólicos. El poder de resolución de la cromatografía de capa fina puede aumentarse empleando técnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente
para
la
separación
cromatográfica
de
una
dimensión
(aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensión. Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ángulo de 90º y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado,
8
se sumerge en el reactivo de localización elegido. En la cromatografía de dos dimensiones, la composición de los dos disolventes es la que determina el orden en que debe utilizarse. (6)
Las separaciones bidimensionales permiten la resolución de un gran número de aminoácidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la primera dimensión se separan en la segunda. Esto es muy útil en la detección de los componentes que están en muy baja concentración y pueden quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentración alta cuando se utiliza la cromatografía en una dimensión. (6)
4.5 MÉTODOS BIOLÓGICOS QUE SE UTILIZAN PARA EVALUAR LA CALIDAD DE LA PROTEÍNA: 4.5.1 RELACION DE EFICIENCIA PROTEICA (PER).- Este
método fue
desarrollado por Osborne y Col. en 1979, el introdujo por primera vez que el crecimiento de las ratas es el reflejo de la
eficiencia de la proteína
suministrada, lo cuantifico con la relación cantidad de ganancia de peso por gramos de proteína consumida. Originalmente esta relación se realizaba a diferentes niveles de proteína, cuanto mas alto es el nivel de una proteína, es mas sensible a los cambios del PER, hubo necesidad de estandarizar el porcentaje de proteína, fijar un nivel para todas
las proteínas, para evitar
variaciones, se recomendó el 10% de proteínas para ratas en crecimiento. Para comparar la calidad de
varias proteínas, además
de estandarizar el
porcentaje de proteínas es necesario considerar otros factores como:
Edad.-LA edad de las ratas tiene un efecto en la medida de la calidad de las
proteínas, generalmente se usan ratas destetadas de
21 a 23 días.
Raza.-Diferentes razas de ratas presentes con diferentes rangos de peso, entre las razas que se usan tenemos alas ratas albinas raza Holtzman (mansas), Winster (agresivas) y otras.
9
Sexo.-El sexo de la rata usada tiene un efecto en el peso, los machos presentan mayor rapidez en el crecimiento
que las hembras, se
recomienda el uso de las ratas machos.
Numero de animales .-Diez ratas para cada una de las muestras problema y 10 para la muestra control
Periodo de Experimentación.- Es de cuatro semanas a 28 días notándose que los valores disminuyen con el tiempo ,la primera semana, el crecimiento es rápido y las subsiguientes es mas lento El PER de las proteínas de algunos de los alimentos se presentan en el cuadro siguiente:
ALIMENTO
PROTEINA (%)
PER
INCAPARINA
27
2-5
CORN-SOY-MILK
19
2-4
FORTESAN
23
2-6
PERUVITA
35
2-4
SOYA
40
2-3
HABAS
30
1-8
TRIGO
14
1-8
AVENA
13
2-2
GRANO DE GIRASOSL
30
2-1
GRANO DE ALGODON
53
2-3
9
2-0
---
2-5
TUBERCULO
DE
PATATA CASEINA (TESTIGO)
10
PER = Ganancia en peso/proteína consumida
4.5.2 UTILIZACION NETA DE LA PROTEINA (NPU).- Este método fue desarrollado por Miller y Bender (1975) mide directamente la utilización de la proteína determinando la cantidad de nitrógeno retenido proveniente del consumo de proteína de un alimento, es decir manifiesta en un solo índice tanto la digestibilidad de la proteína como el valor biológico de la mezcla de aminoácidos absorbidos por el intestino (7). En forma práctica el nitrógeno retenido se determina por la deferencia entre el nitrógeno corporal de un grupo de ratas alimentadas con una dieta aproteica. Se calcula usando la siguiente formula:
UNP
N corporal ratas dieta de ensayo –N corporal ratas dieta aproteica = ___________________________________________________________ Nitrógeno Ingerido
X 100
Los factores condicionales son:
11
Raza.-Se puede determinar el NPU en razas diferentes de ratas blancas, dando resultados similares. (7)
Sexo.-No hay significativa diferencia entre ambos sexos, se puede emplear en la experimentación ratas machos, hembras y ambos sexos, los valores del NPU no serán alterados. (7)
Número de animales.-16 ratas en edad de destete ,8 ratas
para ser
alimentados con la muestras de ensayo (4 para cada una),cuatro ratas para será alimentados con la
dieta aproteica y cuatro para ser alimentado con
caseína que sirven como grupo control. (7)
Periodo de experimentación.-Es de 10 días después de este tiempo los animales son sacrificados y el nitrógeno de las caracasa es analizado. (7) Antes de empezar a experimentación se dará a los animales una dieta de estock o de acostumbramiento con la finalidad de que todos empiecen el ensayo en las mismas condiciones en cuanto a alteraciones fisiológicas de adaptación enzimáticaDebemos de distinguir los siguientes términos:
NPU “Calculado”.-.Se denomina cuando se obtiene a partir
a. de los
valores determinados de la digestibilidad y del valor biológico.
NPU “calculado”=V.B X D/100 b. NPU “operativo” (NPU op).- Se refiere a la utilización de una proteína en
las condiciones en que realmente se consume, obteniéndose
experimentalmente a cualquier concentración proteica. (7) c. NPU”estandarizado” (NPU est).- Es una expresión pura de la calidad de una
proteína, que
se obtiene
experimentalmente
a
una
concentración proteica igual o inferior necesaria para la manutención de su peso (7)
4.5.3 Digestibilidad de las Proteínas. La digestibilidad de las proteínas resulta particularmente importante teniendo en cuenta que se trata de un principio nutritivo eminentemente de comportamiento plástico .Junto con el llamado valor biológico,
12
determina la utilización neta proteica (NPU).Por razones de técnica de laboratorio, cuando se trabaja
con proteínas se prefiere hacerlo en términos de nitrógeno,
elemento mas fácil de cuantificar y multiplicado por distintos factores (el mas común 6.25) se puede matemáticamente transformar en proteína. Las proteínas de los alimentos principales tienen 15% de nitrógeno, lo que explica el uso de ese factor y camia si los contenidos son mayores o menores; por ejemplo 5.97 para proteínas de algunos vegetales,6.38 si provienen de la leche, etc (8) La digestibilidad de una proteína teniendo en cuenta lo dicho en el párrafo precedente, es la proporción de nitrógeno alimentario absorbido y se expresa por la formula:
A/I = (I-(F-Fk))/I = Verdadera digestibilidad
Donde: A = nitrógeno absorbido. I = nitrógeno ingerido F = nitrógeno fecal Fk = nitrógeno endógeno segregado por el intestino
Por lo tanto el Valor biológico de las proteínas es la proporción de nitrógeno absorbido, que es retenido por el organismo, para mantener la integridad de los tejidos y permitir si fuese necesario el desarrollo y crecimiento si coincide con esa etapa de la vida. (8)
V.- FORMULACION DELA HIPOTESIS 5.1.- HIPÓTESIS GENERAL La harina elaborada a partir de la variedad grenadensis Urb. posee una alta calidad proteica y elevado poder de digestibilidad y funcionalidad.
c 13
5.2.1 VARIABLES INDEPENDIENTES •
Semillas de pacae.
5.2.2 VARIABLES DEPENDIENTES •
Proteína bruta
•
Cantidad de de aminoácidos esenciales
•
Eficiencia proteica (PER)
•
Utilización neta de proteína (NPU)
VI.- EXPLICACION DEL METODO DE TRABAJO 6.1.-Lugar de ejecución La parte primera del proyecto de caracterización fisicoquímica y Fitoquímica se realizará en los laboratorios de la facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro del Perú. La etapa final de análisis cromatográfico (HPLC) y caracterización biológica (PER, NPU) se llevara a cabo en los laboratorios de la facultad de de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria La Molina.
6.2.- Materia prima e insumos Para el desarrollo de la investigación se tomaran muestras aleatorias de dos variedades de Pace ( Inga Grenadensis Urb e Inga benthamiana meisn) de la finca Carpa pata, ubicada en el distrito de Mazamari, del departamento de Junín (Perú). Estos serán obtenidos de manera aleatoria, de acuerdo a la norma ISO 874 (muestreo de frutas y vegetales frescos). De esta muestra global por su estado fitosanitario y madurez, se seleccionaran los frutos destinados a los análisis.
6.3.- Equipos y materiales 6.3.1.- Equipos de laboratorio •
Equipo de extracción soxhlet de 250 mL
•
Condensadores rectos
14
•
Campana de extracción
•
Equipo de filtración al vacío de 250 mL
•
Nevera no frost marca HACEB N/f12 10 modelo 53 N12-2 LF
•
Balanza triple brazo marca OHAUS serie 700-800 (precisión 0.1 g),
con
capacidad para 2610 g
•
Horno de secado FISHER SCIENTIFIC ISOTEMP OVEN 737 G
•
Equipo de destilación semiautomático para determinación de nitrógeno
marca BUCHI modelo K314 •
Balanza analítica PRECISA XT 220 A (0.0001g precisión) .
•
Cromatógrafo.
•
Jaulas de metal con bebederos especiales
6.3.2.- Materiales •
Recipientes de aluminio y acero inoxidable
•
Cucharas
•
Cajas de petri de 20 g de capacidad
•
Crisoles de porcelana de 15 mL
•
Balones de fondo plano de 100 mL
•
Erlenmeyers de 250 mL
•
Micro bureta de 10 mL
•
Tubos de ensayo de 5 mL de capacidad (1 cm de diámetro X 7 cm de longitud)
•
Mortero
•
Papel filtro whathman Nº 604
•
Embudo de separación de 100 mL
•
Embudo de caña de 9cm. de diámetro
6.3.3.- Reactivos •
•
•
•
Metanol Agua Destilada Eter de petróleo Anhídrido acético
15
•
Solvente: n-butanol/Hac/H 2O en proporción 12:3:5.
•
Acetónica de ninhidrina al 0.25%.
•
Ad-libitium-agua
6.4.- Métodos de Análisis:
6.4.1 Determinación de las características físicas del la semilla Se valoraran organolépticamente, el color, olor, forma, textura, así como el peso promedio, que se determinó por pesaje de las muestras en la balanza . Tabla 2
Tabla 2
Características Variedad 1 Variedad 2 Forma Peso promedio Color Textura
6.4.2 Caracterización Química de las semillas A la materia prima se le realizarán todos los análisis en un diseño al azar, con dos repeticiones. Los métodos a emplear se presentan en la tabla 3.
TABLA 3. Métodos analíticos para caracterización de las semillas del Pacae (Inga edulis mart) DETERMINACION Humedad
METODO Desecación a 100- 105
ºC en estufa a presión
constante hasta peso constante Ceniza
Calcinación a 550 ºC, por 4 horas
Extracto etéreo
Soxhlet, por 4 horas
Proteína bruta
Kjeldahl
Fibra bruta
Método Weende
Extracto no nitrogenado
Por diferencia
(NNP)
16
En la tabla 4 se mostrarán los resultados del análisis químico y caracterización de los componentes nutricionales principales de la semilla del fruto del pacae (Inga edulis mart ) .Debido a que la mitad del contenido de la semilla es agua, es de vital importancia realizar un proceso de secado para evitar el deterioro del material por ataque de microorganismos e incrementar la vida útil del producto. Como se puede observar este proceso además concentra los macro nutrientes y su interés nutricional.
TABLA 4. Análisis Químicos realizados a las semillas secas del pacae (g/100g) Contenido base Humedad
Contenido base seca
Determinación variedad 1 variedad 2
variedad 1 variedad 2
Humedad Ceniza Proteína* Fibra Grasa ENN (Extracto no nitrogenado) *factor utilizado 5.7
6.4.4 Pruebas Cualitativas fitoquímicas Las pruebas se realizaran por triplicado a la materia prima.
6.4.4.1 Preparación de la muestra: Se tomaran 10g de semilla deshidratada, se maceraran en un mortero y se añadirán 30 mL de éter de petróleo y 30 mL de una mezcla de 9:1 de metanol-agua; la mezcla se dejara por
17
espacio de 15 minutos, se filtrara y posteriormente se separaran la fase acuosa de la fase etérea, en un embudo de separación.
6.4.4.2 Saponinas: Se tomara 1 ml de la fracción de metanol- agua del proceso anterior y se añadirán 9 ml de agua. Se filtrara y se transvasara 1 ml del filtrado a un tubo de ensayo, se agitó vigorosamente por 30 segundos y se dejó en reposo durante 15 minutos. La presencia de saponinas, se establecerá de acuerdo a la espuma sobrenadante y su altura en la muestra.
Los resultados, se interpretaran según los siguientes parámetros:
TABLA 5. Nivel del contenido de saponinas Altura (mm) Contenido de saponinas 5-9 10-14 Mayor a 15 Menor a 5
Bajo Moderado Alto Prueba negativa
6.4.4.3 Fenoles: A cinco tubos de ensayo de 5 mL, se adicionaran a cada uno, tres (3) gotas de la fracción metanólica-agua, posteriormente se añadió, tres (3) gotas de agua destilada con lo que se logró un color amarillo. Uno de los tubos se dejará como testigo y a los restantes se ira adicionando respectivamente una, dos, tres, cuatro, gotas de cloruro férrico (5%) La caracterización de fenoles se hace de acuerdo a la coloración así:
•
Ninguna reacción (no cambia de color) = no hay presencia de fenoles o
•
taninos.
Cambio en el color azul oscuro = fenoles o taninos pirogálicos (hidrosolubles).
•
Cambio de color a verde oscuro = fenoles o taninos de tipo catecol (flavonoides o taninos concentrados).
18
6.4.4.4 Esteroides (prueba de Lieberman-Buchard): Se colocará 1 mL de la fracción no polar (capa de éter de petróleo) en un crisol; se evaporará casi hasta sequedad y se adicionaran tres (3) gotas de cloroformo. Luego se secaran en campana de extracción y se adicionaran dos (2)
Prueba
Resultado muestra 1
Resultado muestra 2
Saponinas Esteroides Fenoles gotas de anhídrido acético seguido por una gota de ácido sulfúrico concentrado. Los cambios de color indican:
Azul o verde = esteroides Rojo, rosado o violeta = triterpenos Amarillo pálido = esteroides o triterpenos saturados
En la tabla 6 se presentaran los resultados de las pruebas realizadas Para las dos muestras de pepas de pacae.
TABLA 6. Resultados de pruebas fitoquímicas
Si se presentaran pruebas positivas para esteroides y fenoles, se realizaran estudios fitoquímicos posteriores para las pruebas positivas, que permitirán corroborar, la presencia de este tipo de sustancias cuantitativamente, que pueden ser un factor de interferencia en la asimilación de nutrientes.
6.4.5 ANÁLISIS DEL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS POR HPLC EN LAS DOS HARINAS
19
A continuación, se incluye un protocolo típico del análisis de
aminoácidos en
harinas: - Dejar a reflujo las muestras con HCl 6N durante 24 horas. -Evaporar a sequedad en evaporador rotatorio. - Añadir agua y evaporar a sequedad. - Realizar el examen cromatográfico de las soluciones problemas al
10% de
las muestras tratadas en solución acuosa de isopropanol a 10%. - El sistema solvente: n-butanol/Hac/H 2O en proporción 12:3:5. - Soporte papel Whatman nº1. - Longitud del papel 50 cm. - Método cromatográfico descendente. - Duración: 12 horas. - Solución reveladora: solución acetónica de ninhidrina al 0.25%. - Condiciones de revelado: 20 min a 105ºC. - Comparación frente a muestras puras de clorhidratos de aminoácidos.
6.4.6 METODOS BIOLÓGICOS PARA LA EVALUACION DE LA CALIDAD PROTEICA DE LAS HARINAS 6.4.6.1 RELACIÓN DE EFICIENCIA PROTEICA (PER) •
Se
cogeran 30 ratas ,20 de ellas para ser
nuestras harinas en
estudio(10 en
cada
alimentadas
con
tipo) y las otras 10
restantes con las raciones que contienen caseína.
•
Se pesaran cada rata y se colocaran en una jaula independiente y se anotaran inmediatamente en las hojas de registro. El peso promedio de los 3 grupos de ratas de menos 5 gramos.
•
Administrar a cada rata del grupo del problema 10 gramos de la dieta con
las
harinas
en
estudio, en
los
primeros
días
,sucesivamente 15 gramos,20 gramos, etc.
20
•
Administrar a cada rata del grupo control,10 gramos de la dieta preparada con caseína los primeros días, sucesivamente 15 gramos,20 gramos.
•
Administrar Ad-libitium agua en unos bebedores preparados de frascos con tubos de vidrio y tapón de jebe.
•
•
Alimentar a las ratas por un periodo de 4 semanas.
Registrar el peso de cada rata semanalmente ,el consumo y desperdicio de alimentos diariamente y anotar en la ficha de control correspondientemente.
•
Calculamos el PER
PER = Ganancia en peso promedio/proteína consumida promedio
Esto para cada animal y se calcula un promedio para cada grupo de proteína. Los
resultados se muestran como:
PER del alimento control (Caseína) PER del alimento en estudio (Muestras) •
El PER de los alimentos en estudio se
compara con
respecto al PER de la caseína, según:
Comparación= (PER Alimento/PER Caseína) X 100 •
Según la FAO un PER para considerarse alto, es decir de alta calidad proteica debe ser mayor o igual a 80% respecto al PER de la caseína.
6.4.6.2 UTILIZACIÓN NETA DE LA PROTEÍNA: •
Pesar 12 ratas de 21 a 23 días de edad de
ambos
sexos para
ser
alimentados con las harinas y cuatro con la dieta aproteica.
21
•
Colocar
a
cada
rata en una
jaula y
suministrar
una
dieta
de
acostumbramiento •
Administrar Ad-libitium agua en unos bebedores preparados de frascos con tubos de vidrio y tapón de jebe.
•
A partir del quinto día suministrar a 8 ratas la dieta preparada con el alimento (4 para cada tipo de harina) y a 4 ratas la dieta que no tiene proteína, previamente pesado, durante un periodo de 10 días
•
Después sacrificar a los animales ,abrir el cráneo ,la cavidad toráxica y los residuos del tubo digestivo
•
Pesar el cuerpo de los animales, secar la carcaza a 105 ºC por 48 h.
•
Pesar el animal seco y moler con todo el pelo, homogenizar y luego sacar una alícuota para determinar proteína
•
Determinaremos entonces la proteína con el método kjetdahl.
•
Sacar
promedio
de
nitrógeno
de
la
carcasa de
los
8
animales
alimentados(Cp) con la dieta de las harinas y el promedio de las cuatro ratas alimentadas con la dieta que no contiene proteínas(Co).
•
NPU = Cp-Co
x 100
I I = Nitrógeno ingerido •
Con la formula de NPU hallar NPU1 Y NPU2.
6.5.- Metodología Experimental: 6.5.1.- Descripción del diagrama de flujo:
22
•
Se seleccionaran las materias primas de las dos variedades de pacae para obtener sus respectivas semillas y analizar las humedades, cenizas, extracto seco, proteína bruta, extracto no nitrogenado. Se tendrá en cuenta
la
variedad de pacae y el estado de madurez de dicha leguminosa.
•
Se procederá a secar dichas semillas previo un tratamiento térmico de 89 ºC, cuando estas estén completamente secas se realizaran las pruebas cuantitativas fitoquímicas de saponinas, fenoles y esteroides.
•
Después de esta etapa se elaboraran harinas de dichas variedades de pepas para luego analizarlas cromatograficamente (HPLC) y determinar su composición de aminoácidos.
•
Como paso final caracterizaremos biológicamente estas harinas para ver su valor biológico y compararlas.
Materia Prima Clasificación y Selección Lavado Tratamiento Térmico (89ºC) Secado o deshidratado (50-60ºC) Molienda Tamizado
23
Harina
6.5.2 Esquema Experimental : Se elaboro el siguiente diagrama experimental de elaboración de harinas de pepa de pacae (Inga edulis mart ) para su respectiva evaluación y caracterización proteica nutricional.
24
6.5.2.- Diseños experimentales: 6.5.2.1 Diseño experimental para la caracterización fisicoquímica de las pepas de las dos variedades con tres repeticiones:
Base Seca Muestra 1
Base húmeda Muestra 2
Muestra 1
Muestra 2
Nº de Rep 1 2
H C PB F
G ENN H C PB F
G ENN H
C PB F
G ENN H
C PB F
3
Donde •
H= Humedad
•
C= Ceniza
•
PB=Proteína Bruta
25
G ENN
•
G=Material graso
•
ENN=Extracto no nitrogenado
6.5.2.2 Diseño experimental para la caracterización fitoquímica de las pepas secas de pacae con tres repeticiones: VARIEDAD 1 Nº repet.
Saponinas
Fenoles
VARIEDAD 2
Esteroides
Saponinas
Fenoles
Esteroides
1 2 3
6.5.2.3 Diseño experimental para el PER de las Harinas obtenidas: PARA CASEINA (PATRON) Nº de ratas
Peso inicial
1º Semana
2º Semana
3º Semana
4 Semana
Consumo de
GP
CP
Caseína
(Ganancia
(Consumo
en Peso)
de Proteína)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Para Harina 1 Nº de ratas
Peso inicial
1º Semana
2º Semana
3º Semana
4 Semana
Consumo de
GP
CP
alimento
(Ganancia
(Consumo
en Peso)
de Proteína)
1 2 3
26
4 5 6 7 8 9 10
Para Harina 2 Nº de ratas
Peso inicial
1º Semana
2º Semana
3º Semana
4 Semana
Consumo de
GP
CP
alimento
(Ganancia
(Consumo
en Peso)
de Proteína)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
6.5.2.4 Diseño experimental para el NPU:
PARAMETROS
HARINA1
HARINA
DIETA
(PROTEINA)
2(PROTEINA)
APROTEICA
Número de animales Contenido de nitrógeno promedio (g) de la carcasa (Nitrógeno corporal). Contenido de (g)
de
nitrógeno las
dietas
(Nitrógeno ingerido). NPU
27
6.5.2.5 Cuadro de comparación Muestras
NPU
PER
Harina de variedad 1
Harina de variedad 2
28
VII.- CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Tiempo Estimado :
11 Meses
29
1mes 2mes 3mes 4mes 5mes 6mes 7mes 8mes 9mes 10mes 11mes 12mes Recolección de
X
la materia prima Selección clasificación y
X
pelado Análisis fisicoquímico
X
X
de las pepas Secado y
X
deshidratado Análisis Fitoquímico Molienda y
X
tamizado Análisis
X X
Cromatográfico de la harina PER de la
X
Harina NPU de la
X X
Harina
X
Impresión, Encuadernación
X
y empastado
X
Otros
VIII.- PRESUPUESTO CODIGO 05
ASIGNACION DE GASTO DENOMINACION GASTOS CORRIENTES
IMPORTE EN S/. 2 500,00 30
05.03 05.03.20 05.03.20.01 05.03.30 05.03.30.01 05.03.30.02 05.03.32 05.03.32.01 05.03.33 05.03.33.01 05.03.39 05.03.39.01 05.03.39.02 05.03.39.03 05.03.46 05.03.46.01 05.03.49 05.03.49.01 05.03.52 05.03.52
BIENES Y SERVICIOS VIATICOS Y FLETES Viáticos BIENES DE CONSUMO Jaulas y Bebederos Material Biológico (Ratas) PASAJES Y GASTOS DE TRANSPORTE Pasajes SERVICIO DE CONSULTORIA Asesoria OTROS SERVICIOS DE TERCEROS Impresión, Encuadernación y empastado Refrigerio Fotocopiados INSUMOS DE LABORATORIO Reactivos MATERIALES DE ESCRITORIO Materiales de Escritorio Diversos ALQUILER DE BIENES MUEBLES Alquiler de Equipos de Laboratorio (Corridas de
2 500,00 200,00 200,00 500,00 350,00 150,00 150,00 150,00 100,00 100,00 850,00 400,00 100,00 350,00 150,00 150,00 100,00 100,00 450,00 450,00
HPLC) TOTAL
2 500,00
IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: 1. BRACK, E.W. Experiencias tradicionales y posibilidades de desarrollo en Selva Central In: (Pérez, C.O. de.). Actas del Curso Taller sobre Agroforestería Tropical, San Ramón. INADE, Lima. 1984.
2.
Portal Agrario [base de acceso
1
de
datos en línea] .Perú: Recursos naturales [fecha de septiembre
de
2006].
Disponible
en:
http://www.minag.gob.pe/rrnn_guaba.html.
3. Duque de James A. Manual de las cosechas de energía; 1983 [en línea] [fecha de
acceso
15
de
septiembre
de
2006].
Disponible
en:
http://www.minag.gob.pe/rrnn_guaba.html.
31
4. Dr. Luís G. Elías. Notas técnicas del Instituyo de Nutrición de Centro América (INCAP).Editorial Panam. Panamá; 2000.
5. Msc. Clara
espinoza Silva. Manual
de
Tecnología
de
Cereales
y
Leguminosas UNCP. Huancayo; 2002.
6. Monografias.com [en línea]. Análisis del contenido de Aminoácidos en Alimentos Con Fines Nutricionales; 2006. [fecha de acceso 30 de octubre del 2006].URL disponible: ttp://www.monografias.com/trabajos7/amin/amin.html. 7. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) [en línea]. BrooKhaven
national Laboratory [fecha de acceso 5 de octubre del 2006].URL disponible en: www.pharm.uky.edu/ASRG/ HPLC/hplcmytry.html
8. .Jc.Cheftel-Jl CUQ-D. Larrent. Proteínas Alimentarias. Editorial Acribia España; 1989.
9. Rolando Salinas. Alimentos y Nutrición. Bromatología aplicada a la salud. Editorial el ateneo. Buenos aires-Argentina; 1988.
ANEXOS 32
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DEL ALTO RENDIMIENTO (HPLC): UNA GUÍA DE LOS USUARIOS El HPLC es un método de análisis popular porque es fácil aprender y utilizar y no es limitado por la volatilidad o la estabilidad del compuesto de la muestra. La sección de la historia ilustra la evolución del HPLC a partir de los años 70 a los años 90. El HPLC moderno tiene muchos usos incluyendo la separación, la identificación, la purificación, y la cuantificación de varios compuestos. Es importante para ésos que usan HPLC para entender la teoría de la operación para recibir el análisis óptimo de sus compuestos. Para ésas interesadas al comprar o usar un HPLC hemos incluido una lista de fabricantes, guía de localización de averías, asistencia técnica, y una bibliografía a la ayuda reduce tu investigación personal y tiempo el referirse. Una vez que hayas terminado la teoría de la operación, te calificarán tomar un concurso )/rápido para probar tu comprensión de los sistemas del HPLC. (5)
33
Historia del HPLC : Antes de los años 70, pocos métodos cromatográficos confiables eran disponibles en el comercio al científico del laboratorio. Durante los años 70, la mayoría de las separaciones químicas fueron realizadas usando una variedad de técnicas incluyendo la cromatografía de la abrir-columna, la cromatografía de papel, y la cromatografía de capa delgada. Sin embargo, estas técnicas cromatográficas eran inadecuadas para la cuantificación de compuestos y de la resolución entre los compuestos similares. Durante este tiempo, ejercer presión sobre la cromatografía líquida comenzó a ser utilizado disminuir tiempo del flowthrough, así reduciendo tiempos de la purificación de los compuestos que son aislados con chromatogaphy de la columna. Sin embargo, los índices de corriente eran inconsistant, y la cuestión de si era mejor tener caudal constante o presión constante fue discutida. (Quím. analítica vol. 62, no 19, 1 Oct de 1990). (5)
34
La cromatografía líquida de alta presión fue desarrollada en los mediados de los años setenta y mejorada rápidamente con el desarrollo de los materiales de embalaje de la columna y la conveniencia adicional de detectores en línea. En los últimos años 70, los nuevos métodos incluyendo la cromatografía líquida de la fase reversa permitieron la separación mejorada entre los compuestos muy similares. Por los años 80 el HPLC era de uso general para la separación de compuestos químicos. Las nuevas técnicas mejoraron la separación, la identificación, la purificación y la cuantificación lejos
sobre las técnicas anteriores. Las computadoras y la
automatización agregaron a la conveniencia del HPLC. Mejoras en el tipo de columnas y reproductibilidad fueron llevadas a cabo así mientras que los términos tales como microcolumna, columnas de la afinidad, y HPLC rápido comenzaron al immerge. La última década ha considerado una empresa extensa en el desarrollo de las microcolumnas, y otra especializó columnas. Las dimensiones de la columna típica del HPLC son: XXX milímetro en longitud con un diámetro interno entre 3-5 milímetros. El diámetro generalmente de microcolumnas, o las columnas capilares, se extiende a partir del µm el 3 al µm 200. El HPLC rápido utiliza una columna que sea más corta que la columna típica, con una longitud de cerca de 3 milímetros desea, y él se embala con partículas más pequeñas. (5) Actualmente, uno tiene la opción de considerar tipos excesivos del x# de columnas para la separación de compuestos, tan bien como una variedad de detectores interconectar con el HPLC para conseguir el análisis óptimo del compuesto. Esperamos que esta revisión proporcione una referencia que todos los niveles de los usuarios del HPLC puedan encontrar respuestas rápidas a sus problemas del HPLC. Aunque el HPLC se considera extensamente ser una técnica principalmente para la investigación biotechnological, biomédica, y bioquímica así como para la industria farmacéutica, estos campos corrently abarcan el solamente cerca de 50% de usuarios del HPLC. (Quím. analítica vol. 62, no 19, 1 Oct de 1990). El HPLC es utilizado actualmente por una variedad de campos incluyendo los cosméticos, la energía, el alimento, y las industrias ambientales. (5)
35
Tendencias del futuro: El HPLC continuará siendo una de las técnicas más importantes de la separación del laboratorio para los propósitos analíticos y preparatorios. La biotecnología y las ciencias de vida es donde estará un procedimiento el HPLC crucial. Las compañías de la biotecnología utilizarán HPLC para continuar probando al gobierno que sus productos son no tóxicos, puros, y activos. Las columnas rápidas y del microbore serán importantes en el analítico y masa-escalan los usos preparatorios para los biologicals y los productos heterologously expresados del gene. Las técnicas de la afinidad y del immunoaffinity serán utilizadas más con frecuencia para la producción de
productos
farmacéuticos
biotechnological
debido
a
la
necesidad
del
ultrapurification para quitar todo el material indeseado de la célula huesped. El HPLC continuará siendo el apoyo principal en la purificación y la separación de proteínas, de peptides, y de nucleotides. Columnas analíticas más pequeñas serán necesarias traz el genoma humano. La necesidad de columnas chiral de la separación de una capacidad más exacta y más alta será necesitada por las compañías farmacéuticas para optimizar eficacia en la masa-producción de compuestos enantiomeric “activos”. La especialización en métodos de la detección y de la identificación aumentará de importancia. Esto implicaría la supervisión de agentes contaminadores ambientales, usando el embalaje especial del chelate para detectar los contaminantes del metal en el agua, desarrollando separaciones rápidas para supervisar métodos rápidos de la fermentación, y el convertirse en la identificación de virus y de bacterias. HPLC-MS será importante en medicina forense y tableros que gobiernan atléticos. El uso de HPLC-MS permitirá que los ciertos análisis y evidencia estén parados para arriba ante el tribunal. El HPLC solamente o conjuntamente con otros métodos puede supervisar para las drogas en atletas. La silicona era la resina/la ayuda de los años 80; posiblemente, las resinas orgánicas tomarán vuelo en años para venir puesto que son unreactive, ellas funcionan en una amplia gama de pH, reproductibilidad son favorables, pueden ser stereoselective, y pueden ser utilizadas con SEC (Knox, 1989). La cromatografía de Polytyptic aumentará de renombre al igual que los lasers debido a su selectividad y sensibilidad crecientes. Los detectores de la dispersión ligera pueden manar substituyen los detectores de RI en el futuro. Los detectores múltiples por sistema son un possiblity y la optimización originada en ordenador de
36
las condiciones del HPLC aumentará y guardará paso con el movimiento del conocimiento de informática.(5)
Usos para el HPLC: (5) El HPLC preparatorio refiere al proceso del aislamiento y a la purificación de compuestos. Importante es el grado de pureza del solute y del rendimiento de procesamiento, que es la cantidad de compuesto producida por tiempo de la unidad. Esto diferencia de HPLC analítico, donde está obtener el foco la información sobre el compuesto de la muestra. La información que puede ser obtenida incluye la identificación, la cuantificación, y la resolución de un compuesto.
Las separaciones químicas se pueden lograr usando HPLC utilizando el hecho de que ciertos compuestos tienen diversas tarifas de la migración dadas una columna particular y una fase móvil. Así, el chromatographer puede separar compuestos (más en separaciones chiral) de uno a que usa HPLC; el grado o el grado de la separación es determinado sobre todo por la opción de la fase inmóvil y de la fase móvil.
La purificación refiere al proceso de separar o de extraer el compuesto de la blanco de otro (relacionado posiblemente estructural) los compuestos o los contaminantes. Cada uno compuesto debe tener un pico característico bajo ciertas condiciones cromatográficas. Dependiendo de qué necesidades de ser separado y cómo de cerca está relacionado las muestras ser, el chromatographer puede elegir las condiciones, tales como la fase móvil apropiada, para permitir que la separación adecuada para recoger o para extraer el compuesto deseado mientras que se enjuaga a partir de la fase inmóvil. La migración de los compuestos y los contaminantes a través de la columna necesitan diferenciar bastante para poder ser recogido o extraer el compuesto deseado puro sin incurrir en ningún otro compuesto indeseado.
La identificación de compuestos de HPLC es una parte crucial de cualquier análisis del HPLC. Para identificar el compuesto de HPLC un detector debe primero ser seleccionado. Una vez que el detector se seleccione y se fije a los ajustes óptimos de la detección, un análisis de la separación debe ser desarrollado. Los parámetros de este análisis deben ser tales que un pico limpio de la muestra sabida
37
