UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
“Eficiencia de la biorremediación de suelos contaminados con
petróleo por bacterias nativas en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque, 2011”
TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA – PARASITOLOGÍA PRESENTADO POR:
Br. Cinthya Jaqueline Llanos Olivera
LAMBAYEQUE – PERÚ 2012
I.
INTRODUCCIÓN
En el Perú, al igual que en varios países del mundo la extracción del crudo de petróleo es una actividad económica muy importante, que genera divisas y elevadas ganancias, razón por la cual se le atribuye la denominación de “oro negro”. El crudo de
petróleo es utilizado para la elaboración de diversos combustibles, entre los que se encuentra el petróleo Diesel, que constituye la principal fuente de energía, tanto industrial como doméstica, habiéndose registrado en el Perú 18,6 millones de barriles de producción acumulada hasta abril del presente año (Sociedad Nacional de Minería, Petróleo y Energía, 2011). Para obtener Diesel el petróleo pasa por diversas etapas de refinería y durante el proceso pueden ocurrir derrames por mala manipulación o desperfectos mecánicos; sin embargo, éstos son menores si se comparan con los que se producen durante la extracción del crudo de pozos petroleros, que se pueden encontrar en mar abierto o suelo territorial. Inclusive, pueden existir derrames o filtración cuando el producto es almacenado en pozos subterráneos, contaminando el suelo adyacente, como sucede en los grifos. La contaminación ambiental por petróleo constituye una amenaza para la salud de los humanos, así como vegetales y animales. Esta problemática es un tema que en los
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últimos años ha sido preocupación del Estado y de los involucrados en la industria hidrocarburífica, por cuanto el uso indiscriminado e inadecuado manejo y disposición del petróleo ha generado daños al ambiente y riesgos tecnológicos. Anteriormente, las industrias no tenían mayor problema para eliminar sus residuos puesto que eran vertidos en los cauces de los ríos o dejados a la intemperie; sin embargo, cuando la velocidad de producción de residuos superó
la velocidad de degradación en el
ambiente, surgió la contaminación, y con ello la pérdida de especies animales y vegetales. En el suelo los hidrocarburos impiden el intercambio gaseoso con la atmósfera, iniciando una serie de procesos físico-químicos simultáneos como evaporación y penetración, que dependiendo del tipo de hidrocarburo, temperatura, humedad, textura del suelo y cantidad vertida pueden ser más o menos lentos, ocasionando una mayor toxicidad, además de tener una moderada, alta o extrema salinidad, que dificulta su tratamiento. Altos gradientes de salinidad pueden destruir la estructura terciaria de las proteínas, desnaturalizar enzimas y deshidratar células, lo cual es letal para muchos microorganismos usados para el tratamiento de aguas y suelos contaminados. Se ha determinado que en el suelo existen microorganismos, en especial las bacterias, que pueden utilizar el petróleo como fuente de carbono y energía, debido a que presentan peroxidasas y oxigenasas que permiten la oxidación de los hidrocarburos,
cambiando
las
propiedades
de
los
compuestos,
haciéndolos
susceptibles de ataques secundarios y facilitando su conversión a dióxido de carbono y agua. En algunas ocasiones no es necesario llegar a la mineralización, sino basta una oxidación para disminuir notablemente su toxicidad o aumentar su solubilidad en agua, incrementando su biodisponibilidad; no obstante, en el departamento de Lambayeque, se desconocen las características de las bacterias degradadoras de petróleo que se encuentran en los suelos contaminados; así como tampoco se ha investigado su eficiencia en la biorremediación.
Pimentel es un distrito turístico por sus playas que atraen visitantes y que a su vez generan ingresos económicos para el desarrollo local; sin embargo, existen zonas contaminadas por hidrocarburos, donde anteriormente se recepcionó y almacenó 3
petróleo para su posterior distribución. Debido al impacto ambiental negativo, los derrames de hidrocarburos ocasionan daños económicos, sociales y de salud pública en las zonas aledañas al lugar afectado, lo que hace necesario el uso de técnicas para su eliminación, pero por su elevado costo económico es necesario, buscar alternativas viables que sean ambientalmente correctas, simples y económicas. La biorremediación o utilización de microorganismos como las bacterias que metabolizan petróleo como fuente de carbono y energía, constituye una alternativa saludable frente al deterioro progresivo de la calidad del ambiente por el derramamiento de crudos, permitiendo la biodegradación de los hidrocarburos y recuperación de los suelos contaminados. La efectividad se incrementa con la bioaumentación o aplicación de bacterias propias de los suelos, adaptadas a las condiciones ecológicas. El conocimiento de las características
de
las
bacterias
nativas
degradadoras
de
petróleo
permitirá
incrementarlas y comercializarlas para la biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos en el departamento Lambayeque. Bajo el enfoque expuesto, se formuló el siguiente problema: ¿Cuál es la eficiencia (%) de la biorremediación de suelos contaminados con petróleo por bacterias nativas en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque? La hipótesis planteada fue: La eficiencia de la biorremediación será mayor de 30 % en suelos contaminados con petróleo por bacterias nativas en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque. El objetivo general del presente estudio fue determinar la eficiencia de la biorremediación de suelos contaminados con petróleo por bacterias nativas seleccionadas en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque. Los objetivos específicos fueron: aislar bacterias heterótrofas en suelos contaminados con petróleo en el distrito de Pimentel, departamento de Lambayeque; caracterizar las bacterias nativas y seleccionar para la biorremediación diez de ellas, cinco por requerir el menor tiempo para la utilización de petróleo como fuente de carbono y energía, y cinco bacterias por alcanzar el mayor número de unidades de actividad emulsificante (UAE); identificar a nivel de género las dos bacterias nativas degradadoras de petróleo con el mayor índice de germinación en Lactuca sativa L. “lechuga” y determinar su eficiencia en la biorremediación de suelos contaminados con petróleo.
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II.
ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS
2.1. Petróleo La palabra petróleo proviene de “petro” (piedra) y “oleo” (aceite), o sea “aceite de piedra”. Es un líquido oleoso bituminoso de origen natural compuesto por
diferentes sustancias orgánicas. Se encuentra en grandes cantidades bajo la superficie terrestre y se emplea como combustible y materia prima para la industria química. Los alcanos son la familia más numerosa en el petróleo crudo y se conocen como parafinas, pueden ser lineales o ramificados y su longitud varía entre 1 a 40 carbonos, aunque se ha logrado detectar cadenas de 60 carbonos. Los ciclos pueden ser saturados, donde varios carbonos se unen entre sí por medio de enlaces sencillos, o pueden ser aromáticos, donde algunos carbonos del ciclo están unidos por enlaces dobles. Los ciclosaturados se conocen como ciclo-alcanos, ciclo-parafinas o naftenos y son un componente minoritario del petróleo crudo. Los compuestos aromáticos son derivados del benceno, un anillo de seis carbonos unidos por tres enlaces sencillos y tres enlaces dobles alternados. Los anillos pueden encontrarse fusionados entre ellos o sustituidos con cadenas alifáticas. Los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HAP`s) o polinúcleoaromáticos comprenden entre 10 a 25 % del petróleo crudo y son las fracciones más pesadas (Arboleda y Bravo, 2008). El término hidrocarburos totales de petróleo (TPH) se usa para describir a un grupo extenso de sustancias químicas derivadas originalmente del petróleo. Algunos 5
TPH son líquidos incoloros o de color claro, que se evaporan fácilmente, mientras que otros son líquidos espesos de color oscuro o semisólidos que no se evaporan. Los TPH que son liberados al suelo pueden movilizarse hacia el agua subterránea, donde los componentes individuales pueden separarse de la mezcla original, dependiendo de las propiedades químicas de cada uno; algunos de estos componentes se evaporan en el aire y otros se disuelven en el agua subterránea alejándose del área donde fueron liberados. Otros compuestos se adhieren a partículas en el suelo y pueden permanecer así mucho tiempo, mientras que otras serán degradadas por microorganismos (Escorza, 2007). El petróleo está constituido por distintas fracciones de hidrocarburos. La fracción de alifáticos (con 18 a 35 átomos de carbono llamados parafinas), aromáticos (con uno o más anillos como benceno, naftaleno, y fenantreno), los polares, es decir asfaltenos altamente condensados y las resinas. El petróleo también posee compuestos orgánicos con sulfuro, nitrógeno, oxígeno, y constituyentes metálicos en poca proporción. Debido a la complejidad de la composición del petróleo, la biodegradación por parte de las bacterias dependerá de las proporciones que tenga cada una de sus fracciones (Acuña et al ., 2010). Los hidrocarburos son susceptibles a la biodegradación dependiendo del tamaño y tipo de molécula. Los alcanos de cadena larga son más resistentes a la biodegradación, a medida que la longitud de su cadena aumenta y cuando alcanzan un peso molecular superior a 500 ya no constituyen una fuente de carbono para el crecimiento microbiano. En general, la presencia de ramificaciones reduce la tasa de biorremediación porque los átomos de carbono terciario y cuaternario interfieren con los mecanismos de degradación o los bloquean totalmente (Elvira, 2009).
2.2. Bacterias degradadoras de petróleo Se ha detectado una variedad de bacterias que crecen en n- alcanos de cadena lineal de 11-19 carbonos del petróleo entre las que se encuentran Pseudomonas, Micrococcus, Corynebacterium, Nocardia y Mycobacterium. Los
n- alcanos largos (≥ 20 C) generalmente son sólidos a temperatura ambiental, y no están fácilmente disponibles para la microbiota degradadora. Los alcanos cíclicos y ramificados
son
oxigenados
por
cepas
especializadas
de
Mycobacterium, 6
Pseudomonas, siendo estas últimas objeto de estudios intensos en virtud a su
capacidad para oxidar compuestos aromáticos (Grant y Long, 1981). En muestras de agua de una poza de oxidación del Dren 1000, se aislaron bacterias degradadoras de petróleo, siendo identificadas como Pseudomonas: 40 %, Acinetobacter : 29,67 %, Xanthomonas : 16,67 %, Alcaligenes:
13,33 % y
Enterobacter : 3,33 % (Mendoza e Izusqui, 1999). Asimismo, en muestras de agua
contaminadas
por
petróleo
se
identificaron Acinetobacter,
Corynebacterium,
Pseudomonas, Aeromonas, Neisseria y Streptomyces (Merino et al ., 2002). Por su
parte,
Mendoza
e
Yzusqui
(1999)
y
Escalante
(2002),
identificaron
como
degradadoras de petróleo Pseudomonas aeruginosa, P. acidovorans, P. mallei, P. cepacia y P. pseudomallei.
En suelo contaminado con agua de producción o residuo generado por la industria petrolera, sometido a biorremediación microbiana durante 1 año y después a fitorremediación, se tomaron muestras y fueron aisladas las especies bacterianas P. vesicularis, Sphingomonas paucimobilis, Micrococcus sp., M. varians, M. roseus y M. sedentarius (Altamirano y Pozzo, 2000). A su vez, en muestras sólidas y líquidas,
consistentes de borras y aguas de pozas de sedimentación y decantación (purificación
secundaria)
se
aislaron
e
identificaron
Pseudomonas,
Bacillus,
Beijerinckia, Xanthobacter , Derxia y otros especímenes con características similares
al género Azotobacter (Guerra et al ., 1997).
2.3. Biorremediación de petróleo El término biorremediación hace referencia a la eliminación del petróleo u otros contaminantes mediante el uso de entes biológicos. En la eliminación de petróleo éste es oxidado hasta dióxido de carbono. Cuando se producen grandes vertidos, las fracciones de hidrocarburo volátiles se evaporan rápidamente quedando los compuestos aromáticos y alifáticos que serán eliminados por los organismos. En condiciones ideales hasta un 80 % de los componentes no volátiles son oxidados por bacterias en los 6 primeros meses; sin embargo, determinadas fracciones como los hidrocarburos con cadenas laterales y los hidrocarburos policíclicos permanecen en el ambiente por más tiempo. El petróleo que alcanza los sedimentos es degradado 7
muy lentamente y causa un impacto significativo a largo plazo en la pesca y en otras actividades que dependen de aguas no contaminadas (Madigan et al., 2004). La biorremediación
puede ser clasificada de acuerdo al organismo que
efectúa la degradación del contaminante. La fitorremediación es el uso de plantas para la remoción de metales pesados. También se pueden utilizar animales como Lumbricus terrestris “lombriz de tierra” , que absorbe metales pesados a través de los
tejidos y los acumula en las vías digestivas. A su vez, las bacterias son las más empleadas en el proceso de biorremediación, aunque también se emplean hongos, algas y cianobacterias. La biorremediación del suelo puede ser in situ y ex situ. In situ corresponde a los tratamientos que no requieren excavaciones del suelo contaminado. Por su parte, ex situ implica la excavación del suelo o el material a tratar y el manejo en un sistema controlado como una celda de “landfarming” o algún tipo de biorreactor (Benavides et al., 2006). Entre 1993 y 1998 se llevaron a cabo trabajos de investigación, con la finalidad de crear y adoptar una tecnología para la recuperación de áreas afectadas por la actividad petrolera en la cuenca del golfo San Jorge en Patagonia, Argentina. Inmediatamente después de producido el derrame por ruptura de un oleoducto se recuperó la mayor cantidad de petróleo mediante bombeo con camiones cisterna. Luego se delimitaron doce parcelas de 8 x 3 m, equivalentes a cuatro tratamientos ubicados al azar con tres repeticiones cada uno; y consistentes en T1= testigo (sin fertilizante); T2= 30 unidades de nitrógeno y 30 de fósforo (59 kg ha -1 de úrea, 46 % de N y 65 kg ha -1 de fosfato diamónico; 18:46:0); T3= 60 unidades de N y 60 de P; T4= 90 unidades de nitrógeno y 90 de fósforo. Las dosis fueron divididas en cuatro aplicaciones que fueron incorporadas en un laboreo con cincel hasta una profundidad de 20 o 30 cm cada 30 días. Según los resultados; antes de efectuar la primera fertilización y utilizar el cincel en la remoción, los hidrocarburos iniciales oscilaron entre 12,8 a 15,3 %, pero a medida que transcurrieron los meses el porcentaje disminuyó hasta 5-7 %. Cuando finalizaron las evaluaciones, después de 1 año los tratamientos con 60 y 90 unidades de N y P biodegradaron el petróleo un 60 % más que el testigo y 30 unidades de N y P (Luque et al., 2000). 8
Se llevó a cabo la recuperación de suelos de una playa utilizando Pseudomonas sp., aislada de agua contaminada con petróleo. Con el uso del
software Statgraphies v 6,0 se determinó que con la concentración de carbonato de calcio 0,01 M se obtuvo la mayor eficiencia de biodegradación con un máximo de 101,14 % y un mínimo de 75,66 %. Asimismo, para la concentración de sustrato 1,45 ppm se tuvo una eficiencia máxima de 101,34 % y un mínimo de 82,21 % y para la concentración de inóculo 10 8 un máximo de 101,78 % y un mínimo de 73,57 % (Morales, 2003). Por su parte, Prudencio (2001), evaluó seis cepas bacterianas en suelo contaminado con petróleo crudo agregando 1 L m -2 del consorcio bacteriano biorremediador. Para oxigenar el sistema, realizó la mezcla con posterior arado y finalmente el trillado diariamente durante el primer mes del tratamiento y semanalmente durante los meses siguientes. Los análisis efectuados en campo demostraron la disminución en la concentración de hidrocarburos totales de petróleo (TPH) desde 7,45 hasta 4,09 %, lo que significó un 40 % de reducción del contaminante con 16 días de tratamiento, cumpliéndose con la legislación peruana que denota para lugares contaminados una concentración de TPH menor de 5 %. Para el tratamiento biológico de lodos de refinería se utilizó la técnica de “Landfarming”, que consiste en un vertido controlado de hidrocarburos sobre una
superficie de terreno, el cual se somete a un proceso de remoción mediante arado y riego superficial con agregado de fertilizantes, con o sin incorporación de microorganismos. Los ensayos se realizaron en ocho parcelas de 2,5 por 4 m con un promedio de 0,06 % de nitrógeno total; 1,95 ppm de fósforo; 0,03 % de materia orgánica y un pH de 7,2. Las parcelas fueron sometidas a remoción a una profundidad de 20 cm. Utilizando palas se distribuyeron sobre ellas los residuos sólidos (10 kg m -2), que posteriormente fueron cubiertos con una capa fina de tierra. Dos de las parcelas se utilizaron como testigo (sin inoculación) y las seis restantes fueron inoculadas con tres cultivos bacterianos en la cantidad de 170 L, distribuidos uniformemente mediante riegos con manguera. El laboreo superficial se realizó con una frecuencia mensual a una profundidad de 20 a 25 cm y la frecuencia de riego fue semanal. Para un período de 6 meses el porcentaje de hidrocarburos consumidos fue 41,16 en las parcelas testigo y entre 61,83 a 72,80 % en las parcelas tratadas. 9
El contenido de hidrocarburos mostró en la parcela testigo un período de latencia de 2 meses, el cual no se observó en las parcelas inoculadas donde se inició la degradación
inmediatamente.
Asimismo,
para
obtener
una
depuración
de
aproximadamente un tercio del residuo se requirieron 5,4 meses en la parcela no inoculada y 2 meses en las inoculadas, lo que significó una eficiencia depurativa 2,7 meses mayor con la aplicación de microorganismos (Ercoli et al ., 1995a). Para el tratamiento de los residuos semisólidos de oleoductos, se propuso la biodegradación ex situ, en suelos especialmente acondicionados con agregados de microorganismos. Se seleccionó una parcela de 100 m 2, donde se acondicionaron 900 m2 y se efectuó el ensayo sobre 300 m 2. Para evitar contaminación de acuíferos se colocó una lámina de polietileno de 200 micrones de espesor a 50 cm de profundidad, se incorporaron 50 kg ha -1 de fósforo así como 250 kg ha -1 de nitrógeno y la parcela fue sometida a remoción hasta una profundidad de 20 a 25 cm por medio de arado desde el comienzo del ensayo, con una frecuencia de dos veces por mes. El residuo oleoso fue distribuido en dos partes: 1500 kg en un inicio y una vez seco después de un mes se incorporó el 50 % restante totalizando 3000 kg en 300 m
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(10 kg m -2), a continuación se agregó el cultivo microbiano a razón de 0,5 L m -2 y después de 8 meses se logró una degradación de 70 % de los hidrocarburos con una tasa mensual de 8,7 % (Ercoli et al ., 1995b). Suelos contaminados con agua que acompaña al petróleo en su extracción, con un contenido promedio de 19,56 % de hidrocarburos totales de petróleo (TPH), con sitios de acumulación superficial y costras salinas fueron sometidos a biorremediación. Se inició al tratamiento con laboreo agrícola programado, alternando trabajo en profundidad (labranza profunda con cincel, subsolador y arado de discos) para descompactar y airear los estratos subsuperficiales con trabajo en superficie (rastra de discos) para particular, airear y homogenizar la carga contaminante, asegurando su biodisponibilidad como sustrato degradable por la biota nativa. Transcurrido 1 año el contenido promedio de hidrocarburos se redujo a 3,25 % expresado como TPH residual, con un incremento de la población microbiana hidrocarburolítica nativa desde 3,2 x 10 2 a 3,5 x 10 5 UFC g-1 de suelo seco (Altamirano y Pozzo, 2000). 10
Se realizó un estudio para evaluar el desempeño de un biorreactor agitado y aireado (CSTR) en la biodegradación de lodo aceitoso proveniente del tanque de almacenaje de residuos de una refinería. Se utilizó un consorcio constituido por microorganismos aislados del propio lodo que fueron cultivados en una concentración de 5 % (v/v) de lodo, como única fuente de carbono y energía. El efluente acuoso fue reciclado, aumentando la eficiencia del proceso medida por el consumo de n-parafinas, pristano, fitano, hidrocarburos poliaromáticos, aceites y grasas. Las bacterias fueron predominantes en el proceso, siendo identificadas especies del género Pseudomonas y comprobándose la potencialidad de la utilización de biorreactores para el tratamiento de lodo aceitoso hasta antes considerado xenobiótico (Ururaky et al ., 1998). Se aplicó la técnica de biorremediación en un área impactada con 58 barriles de petróleo crudo de 14° API (petróleo pesado). El área fue humectada y aireada periódicamente mediante un tractor con arado de disco e independientemente de las cantidades iniciales de nutrientes existentes en el suelo se adicionaron urea y diamino fosfato en las relaciones C:N=60 y C:P=800; correspondientes a 0,22 y 0,047 kg m
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de nitrógeno y fósforo, respectivamente. A los 369 días se obtuvo una reducción de 78,08 % con niveles inferiores a 10 000 mg kg -1 de TPH (1%), valor recomendado para suelos contaminados por hidrocarburos por las normas internacionales. También se observó después de 265 días un período estacionario o de meseta, donde la disminución de la concentración fue inapreciable en lo que se conoce como un período de saturación. La concentración de microorganismos heterótrofos se mantuvo durante todo el proceso entre 10 6 y 108, valores favorables para que se efectúe la biodegradación. A partir de los 265 días comenzó el decrecimiento, coincidiendo con el período de saturación alcanzado en el nivel de hidrocarburos. Los niveles de microorganismos degradadores de hidrocarburos oscilaron entre 10 5 y 106 hasta los 229 días, superior al rango entre 10 3 y 104 recomendado en la literatura para que se efectúe la biorremediación. Asimismo, el análisis económico del proceso de biorremediación demostró un valor dentro del rango internacional para estos tratamientos: 51,10 USD m -3 (Alfonso, 2005).
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