BIODEGRADACIÓN DE COLORANTES AZO BAJ B AJO O CONDICIONE CONDICIONES S REDUCTORAS REDUCTORAS POR BA CTERIAS GRAM-NEGATIVAS MESOFÍLICAS AISLADA AISL ADAS S DE DIVERSOS AMBIENTES AMB IENTES
María S. PEDRAZA CHAN1 , Gunther GEISSLER DAHLHEIM 1, Ma. Lilia CEDILLO RAMÍREZ1,2 y Andrés A. MUÑOZ GARCÍA1,2. 1
Posgrado en Ciencias Ambientales. Instituto de Ciencias Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Edif. 76 1er. Piso. Ciudad Universitaria. Puebla. 2 Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas. Instituto de Ciencias Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Edif. 76. 3er Piso. Ciudad Universitaria. Puebla.
[email protected] Palabras claves: Biodegradación, Biodegradación, Shewanella, Colorantes Azo RESUMEN
Los colorantes son hoy en día un problema ambiental creciente en la contaminación contaminac ión de ríos, debido a su pobre biodegradación, estos permanecen mucho tiempo en el ambiente transformándose naturalmente bajo condiciones reductoras y que en el peor de los casos se transforman en aminas aromáticas potencialmente potencialment e cancerigenas. cancerigenas . En la búsqueda de tratamientos amigables con el ambiente como es la biorremediación como una opción para la remoción de estos compuestos de las aguas residuales principalmente industrial se llevó a cabo este trabajo para lo cual se aislaron microorganismos de diversos ambientes que bajo diferentes condiciones de crecimiento y dependiendo de la capacidad del microorganismos para mineralizar el colorante se seleccionaron 27 colonias que se lograron identificar mediante pruebas bioquímicas estandarizadas; encontrando Morganella morganii,, Aeromonas hydrophila/caviae , Escherichia coli, Shewanella putrefaciens, Agrobacterium radiobacter, Kluyvera spp, Proteus vulgaris, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa , Citrobacter spp., Sphingomonas sp., Pseudomonas fluorescens. Shewanella putrefaciens pudo ser aislada tanto de aguas residuales, lixiviados del relleno sanitario de la ciudad de Puebla, como de lodos activados de la planta de tratamiento municipal y mostró ser una bacteria con capacidades de degradación de colorantes en medio líquido hasta con 100ppm del colorante en tan solo 1 día de inoculado. INTRODUCCIÓN
La contaminación ambiental con colorantes es un problema presente en México, desde épocas remotas, en el estado de Puebla (1835) con el inicio de las actividades actividad es de la industria textil “La Constancia Mexicana” que fue el pivote de la industrialización industrializ ación de la región y la primera en América Latina. Actualmente son pocas las industrias que se dedican a la elaboración elaboración de colorantes en nuestro país pero si hay gran número de ellas que los usan dentro de sus procesos industriales.
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Siendo la principal la industria textil que consume dos terceras partes de la producción total de los colorantes. (Melgoza et al. 2004). En base a la estructura química o grupo cromóforo se pueden diferencias entre 20 y 30 diferentes grupos de colorantes. Los colorantes azo, antraquinonas, ftalocianinas y triarilmetanos son cuantitativamente los grupos más importantes. El vasto conjunto de colorantes es clasificado en términos de su color, estructura y método de aplicación en el Colour Index (C.I.), en el cual en su tercera edición lista cerca de 28,000 nombres comerciales, que representan aproximadamente 10,500 diferentes colorantes, 4,500 de los cuales son recientemente producidos. (Van der Zee, 2002). En proceso ineficiente de teñido grandes cantidades de colorante se pierden en las aguas residuales afectando directamente al ambiente; la cantidad perdida depende de la clase de colorante y de su aplicación, esto puede variar entre 2% para colorantes básicos y 50% para colorantes azo reactivos (Melgoza et al, 2004). Los colorantes azo son usados por un sin número de industrias dentro de las que se encuentran la textil, la de alimentos, la farmacéutica, la papelera, la curtiduría, de cosméticos, la fotográfica etc. El sistema cromóforo de los colorantes consiste esencialmente del grupo azo (−N=N−) en asociación con uno o más sistemas aromáticos (Lorimer et al 2001 ); su estructura puede contener uno o varios de estos grupos. El fundamento de la producción de los colorantes azo fue desarrollada en 1858 cuando Gries descubrió el mecanismo de reacción: la diazotización, para los productos de los compuestos azo. Datos recientes sobre la producción mundial no están disponibles, sin embargo, se puede asumir que se han producido mayores cantidades de colorantes en vista de la producción de muchos pigmentos. Estos colorantes son compuestos xenóbioticos y cerca de 700 mil toneladas son producidas anualmente en todo el mundo. Estos compuestos conservan íntegro su color y estructura bajo exposiciones a la luz solar, polvo, bacterias y humedad, también muestran una alta resistencia a la degradación microbiana en sistemas de tratamiento de agua residual. En telas sintéticas como nylon, lycra, rayón y poliéster se pueden adherir, y continuamente se actualizan para producir nuevos colores, por lo que se incrementa su presencia en las descargas de aguas residuales industriales. El tratamiento de efluentes con descargas de colorantes azo es de interés debido a sus impactos estéticos y sobre todo tóxicos a los ecosistemas. Estos compuestos en un sistema acuático sufren varias reacciones alterando su estructura química que pueden dar por resultado nuevos compuestos xenóbioticos precarcinogénicos o cancerígenos. Estos colorantes en su forma purificada son rara vez directamente mutagénicos o carcinogénicos, excepto para algunos que poseen un grupo amino libre. La reducción de los grupos azo en el intestino, libera aminas aromáticas que son absorbidas por el intestino y excretadas en la orina. El riesgo de toxicidad aguda de aminas aromáticas es el cáncer de vejiga. Los compuestos azo son difíciles de biodegradar debido a su alta estabilidad a la luz y al ataque microbiano por lo que persisten en el ambiente. (Cabral et al. 2005, Wallace 2001). Estos compuestos sintéticos son resistentes a la degradación de la mayoría de las bacterias aerobias, ya que el fuerte carácter 2
capturador de electrones del grupo azo estabiliza estos agentes contaminantes aromáticos contra conversiones de la oxigenasa. Debido a su carácter recalcitrante en el ambiente aerobio, los colorantes azo eventualmente acaban en sedimentos anaerobios, acuíferos poco profundos, y aguas subterráneas o en el tracto grastrointestinal de animales superiores. (Razo, et al. 1997) La decoloración de colorantes azo por bacterias es iniciada por la reducción catalizada por la azoreductasa , como una consecuencia de los procesos de tratamiento de agua residual convencionales usualmente no pueden remover eficientemente el color azo ya que estos compuestos son aeróbicamente recalcitrantes; pero si el microorganismo aerobio es sujeto a condiciones microaerofilicas, entonces aumenta la tasa de decoloración. (Padamavathy et al. 2003). En un estudio realizado por Tan-Nico (2001) se probó la degradación secuencial de un sistema anaerobio/aerobio con colorantes azo sulfonados, Isik trabajó (2002) sobre la decoloración del rojo congo y negro directo 38 por E. coli y Pseudomonas sp en condiciones aeróbicas, anaeróbicas y microaerofilicas. Se han investigado la biodegradación con cultivos mixtos como los realizados por Itoh al lograr un cultivo mixto con Bacillus sp. y Pseudomonas stutzeri (2002). La biodegradación con hongos también es posible como lo muestra Tatarko (1998) al degradar el rojo congo por medio del hongo filamentoso Phanerochaete chrysosporium y en otro trabajo por la levadura Candida zeylanoides (Martins, 1999). MATERIALES Y MÉTODOS
Los microorganismos que se usaron en el tratamiento de colorantes azo se aislaron de diversos ambientes: del efluente del sistema de tratamiento de una industria textil (ETT), de lixiviados del relleno sanitario de la ciudad de Puebla (LIX), de lodos activados de la planta de tratamiento municipal del río Alseseca (LPT), del influente de la planta de tratamiento municipal Alseseca (IPT) y de aguas residuales del río Zahuapan del estado de Tlaxcala (AGZ). La composición del medio para el aislamiento fue (gr / litro) peptona de carne (5), extracto de levadura (2.5), NaCl (5), ZnSO 4 (0.1), colorante azo (0.05), agar (20), a pH de 6.87.0. Los colorantes usados en el aislamiento fueron marino remazol RGB, marino remazol C, azul de levafix CA y rojo intenso RGB que fueron proporcionados por Spintex, S.A. de C.V.; los colorantes naranja de metilo ( Fig 1) y rojo congo ( Fig. 2) se utilizaron como estándares. Todos los colorantes fueron de grado industrial.
Fig 1 Naranja de Metilo
Fig 2. Rojo Congo
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Para la identificación de estos microorganismos se contó con pruebas bioquímicas estandarizadas API20E, API20NE, y crecimiento en agar CPS ID3. Las pruebas preliminares y los experimentos de degradación se hicieron en placas de petri y en tubos de ensaye en condiciones aerobias, microaerofilicas y condiciones reductoras (bajo tensión de CO 2, 5%) con el mismo medio usado para el aislamiento, el seguimiento de la decoloración se hizo con espectroscopia UVVIS (Perkin Elmer Lambda 20 UV/VIS). Los experimentos aerobios y bajo condiciones reductoras se mantuvieron ambos en agitación a 200 rpm a 30ºC durante 3 días. RESULTADOS
Se aislaron 114 cepas como posibles candidatas para la degradación de los colorantes azo de los diferentes sitios muestreados, con la realización de pruebas preliminares se seleccionaron 27 colonias que mostraron resultados positivos en los experimentos de decoloración de las cuales 11 colonias provienen de IPT, 1 colonia de AGZ, 3 colonias de LPT, 4 de ETT y 8 colonias de LIX. En las figuras 3 y 4 se muestra como se observaron las placas para el aislamiento.
Fig.3. Crecimiento en Rojo Congo.
Fig. 4. Crecimiento en Rojo Intenso RGB
Siguiendo las técnicas de API y confirmando los resultados mediante el medio CPS ID 3 y algunas pruebas complementarias se lograron identificar las cepas seleccionadas como Morganella morganii,, Aeromonas hydrophila/caviae , Escherichia coli , Shewanella putrefaciens , Agrobacterium radiobacter, Kluyvera spp, Proteus vulgaris, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter spp., Sphingomonas sp., Pseudomonas fluorescens.
Aunque cabe hacer mención que para el caso de algunos bacilos Gram Negativos no fermentadoras aún no ha sido posible establecer el género al que pertenecen. Se realizaron algunos experimentos en el medio acetato-nitrato (1.0g KNO 3, 0.5g K2HPO4, 0.1g MgSO 4, 0.1g NaCl, 2.5G Agar, 100mg ZnSO 4, 1mg K1, 100ppm colorante) con diferentes fuentes de carbono, usando etanol, metanol, acetato de sodio y al colorante como tales. Pero aunque la mayoría de las colonias crecieron a las 24hrs., ninguna de ellas mostró una decoloración del medio con excepción de la cepa 14Ag BUAP que con etanol mostraba una ligera decoloración. Se decidió realizar nuevamente este experimento pero cambiando las condiciones, se usó el medio nutritivo con el que se hicieron las primeras pruebas de decoloración probando las mismas fuentes de carbono, los tratamientos no mostraron
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diferencias significativas, esto posiblemente se deba a que la degradación del colorante no esta en función de la fuente de carbono para las cepas aisladas. En los tratamientos de la decoloración de los colorantes solo se utilizaron el rojo congo, naranja de metilo y azul de levafix, los experimentos fueron realizados en tubos de ensaye con rosca en medio liquido y semigelificado. Once cepas fueron capaces de decolorar 100 ppm del rojo congo, cinco 100 ppm de naranja de metilo y 27 cepas fueron capaces de decolorar el azul de levafix en condiciones microaerofilicas. Las mismas cepas se probaron en condiciones aerobias y condiciones anaerobias dando resultados positivos de decoloración en ambas condiciones, con excepción de la cepa AOBUAP que muestra su actividad de decoloración lenta en condiciones aerobias. La tabla I muestra porcentajes de remoción de colorantes de algunos cepas seleccionadas por su gran actividad de decoloración. Tabla I. Porcentaje de remoción de las cepas que mostraron mejores resultados en condiciones aerobias y condiciones reductoras de CO 2. TRATAMIENTO AEROBIO
COLONIA 6AgBUAP 7AgBUAP 12Ag BUAP 12aAg BUAP 14Ag BUAP 15Ag BUAP 3LDh BUAP 5LDh BUAP 5' LDh BUAP 36BUAP 40BUAP 1MRG BUAP GBUAP AOBUAP ANBUAP
IDENTIFICACIÓN Aeromonas hydrophila/caviae
Bacilo gram negativo Shewanella putrefaciens Agrobacterium radiobacter Escherichia coli Shewanella putrefaciens Proteus vulgaris Shewanella putrefaciens Shewanella putrefaciens Pseudomonas putida Pseudomonas aeruginosa Sphingomonas sp. Citrobacter spp.
Bacilo gram negativo Shewanella putrefaciens
5% de CO 2
ROJO CONGO
AZUL DE LEVAFIX
ROJO CONGO
% remoción 90.42 98.81 99.85 99.34
% remoción 95.00 96.79 94.77 94.77
no se determino
% remoción 99.62 98.43 90.13 17.97 40.17
89.58
no se determino
91.08
no se determino
54.63 100.00 97.10
no se determino
97.52 98.22 23.21 5.79 66.77 no se determino
17.69 98.22
no se determino
no se determino
95.17 92.63 78.05
no se determino
no se determino
49.98 41.78
49.09 no se determino
no se determino
98.56
94.69
no se determino
La principal especie bacteriana con actividad azoreductasa fue Shewanella putrefaciens con una remoción detectada por la desaparición del color hasta del 97% del rojo congo y 100% del azul de levafix, seguida por Aeromonas y por tres especies de Pseudomonas (P. aeruginosa, P. putida y P. stutzeri ) y algunas enterobacterias ( E. coli, Morganella morganii, Proteus vulgaris y Kluyvera sp). Las siguientes figuras muestran los espectros de decoloración del rojo congo y azul de levafix para la bacterias Aeromonas hydrophila/caviae y Shewanella putrefaciens.
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Testigo Shewanella putrefaciens Aeromonas hydrophila/caviae
1.4
Testigo
2.0
Shewanella putrefaciens Aeromonas hydrophila/caviae
1.2 1.0
λ
máx
478nm
1.5
570nm
máx
0.8 s b A
λ
s b A
0.6 0.4
1.0
0.5
0.2
0.0 0.0 300
400
500
600
300
700
400
nm
Fig. 5 Efecto de la actividad bacteriana en el azul de levafix en condiciones aerobias a 30 °C y pH 6.8-7.0, durante 3.0 un periodo de 3 días.
500 nm
600
700
Fig. 6. Efecto de la actividad bacteriana en el rojo congo en condiciones aerobias a 30 °C y pH 6.8-7.0, durante un periodo de 3 días.
Rojo Congo Shewanella putrefaciens Aeromonas h ydrophila/caviae
2.5 2.0 s b A
1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 300
400
500
600
700
nm
Fig. 7. Efecto de la actividad microbiana en el rojo congo en condiciones anaerobias a 30 °C y pH 6.87.0, durante un periodo de 3 días.
DISCUSIÓN
La capacidad de bacterias anaerobia s facultativas para la degradación de colorantes azo puede ser una respuesta a los problemas de contaminación con estos colorantes, como la composición del medio utilizado en los tratamiento fue nutritivo esto puede sugerir que para sistema de tratamiento de colorantes puede ser adicionado con aguas de plantas de tratamiento municipal debido a la gran cantidad presente de materia orgánica. Se logró aislar Shewanella putrefaciens tanto de LPT, de IPT y de LIX sugiriendo que es una bacteria que podemos encontrar en diferentes ambientes tanto en agua, como en residuos sólidos y que tiene gran versatilidad metabólica
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para degradar contaminantes (Jahn M.K., et al. 2006), al lograrla aislar de los lixiviados del relleno sanitario. Esta bacteria que presentó mejores resultados de decoloración en condiciones aerobias y reductoras en concentraciones de 100 ppm de colorante rojo congo y azul de levafix. Los espectros de UV-VIS sugieren que los metabolitos producidos al atacar al rojo congo, difieren de los que aparecen al atacar el azul de levafix, ya que está en dependencia de la estructura química de cada colorante (Genc N. 2004). Tanto Shewanella putrefaciens como Aeromonas hydrophila/caviae mostraron ausencia de color en los medios antes de 24 h de inoculados, reflejando su gran actividad azoreductasa. CONCLUSIONES
La desaparición del color en los experimentos se debe principalmente a la ausencia del grupo cromóforo. Esta ausencia del grupo cromóforo se debe a la ruptura de grupo azo que es característico en estos colorantes debido al ataque de la azoreductasa de las bacterias microaerofilicas . Los metabolitos producidos por la ruptura de estos enlaces son aminas aromáticas, que para el caso del rojo congo puede ser la bencidina , una potencial amina cancerigena Se encontraro n bacterias de diferentes géneros capaces de atacar estos colorantes, entre las que se encuentran Enterobacterias y de las cuales ya se han reportado estudios debido a su presencia en el tracto grastrointestinal donde llevan a cabo la reducción de los colorantes azo como es el caso de E. coli, y Proteus vulgaris. Se pudo comprobar en este trabajo de la amplia variedad de microorganismos que podemos encontrar en el ambiente y que tiene capacidades para ser utilizadas dentro de la biotecnología, así como llevarnos a la idea de que bacterias que puedan estar mutando debido a la presencia de grandes contaminantes xenobióticos en la aguas residuales. REFERENCIAS
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