TEMAS 29 a Través Del Microscopio

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6,50 EURO

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I. TECNICAS

4 El microscopio acústico Calvin F. Quate 14 Microscopios con sonda de barrido H. Kumar Wickramasinghe 24 El microscopio de efecto túnel Gerd Binnig y Heinrich Rohrer

a m u S

32 Microscopía confocal Jeff W. Lichtman 38 Microscopios de rayos X Malcolm R. Howells, Janos Kirz y David Sayre 46 La física de superficies Rodolfo Miranda 56 Técnicas de microfotografía Jearl Walker

II. OBSERVACIONES

64 Camillo Golgi y la reacción negra Paolo Mazzarello 72 Cajal y la estructura histológica

del sistema nervioso José M. López Piñero 80 Las primeras observaciones Brian J. Ford 84 Representación visual de embriones humanos Bradley R. Smith 90 Aplicaciones biológicas del microscopio de fuerzas Carlos Bustamante y Ricardo García

TECNICAS

N A M D O

O G L E A H IC M

El microscopio acústico Este instrumento es hoy un medio de trabajo común en distintas especialidades científicas y actividades industriales. En este artículo de 1979 uno de sus creadores explicaba los fundamentos en que se basa Calvin F. Quate

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as ondas sonoras que vibran en la atmósfera con frecuencias inferiores a unos 20.000 hertz (oscilaciones por segundo) nos son familiares como medio de comunicación. Por ejemplo, las oscilaciones de la voz humana pertenecen a este grupo. La atmósfera no constituye un medio favorable para la propagación de ondas acústicas de frecuencias más elevadas, ultrasónicas. Estas vibraciones inaudibles se disipan rápidamente en gases tales como el aire. Las ondas de los ultrasonidos pueden propagarse a distancias apreciables con moderada atenuación sólo en líquidos y sólidos. Las ondas acústicas que vibran en esos medios condensados a frecuencias ultrasónicas se emplean para la formación de imágenes y no para la comunicación. Existen dispositivos ultrasónicos basados en la producción y detección de ondas acústicas con frecuencias del orden del megahertz (un millón de oscilaciones por segundo). Se emplean frecuentemente en el estudio de objetos submarinos y en averiguar características estructurales internas de los órganos del cuerpo humano y de materiales. Por ejemplo, un feto en el seno de una mujer preñada puede ser examinado de este modo con completa inocuidad. El microscopio acústico constituye una extensión de la tecnología de formación ultrasónica de imágenes. Sus ondas ultrasónicas tienen frecuencias próximas a un gigahertz (mil millones de oscilaciones por segundo), cerca de mil veces mayores que las frecuencias típicas de los sistemas macroscópicos de formación ultrasónica de imágenes. En términos de las longitudes de onda la comparación es ilustrativa. Se miden en metros las 4

longitudes de onda de los sonidos producidos por la voz humana, en milímetros las de los ultrasonidos empleados en los dispositiv os macroscópicos de formación de imágenes y en micrometros las de la mayoría de los microscopios acústicos perfeccionados. Es decir, las ondas empleadas en estos nuevos dispositivos de formación de imágenes son de longitud comparable con la de las ondas electromagnéticas de la luz visible. No hay que sorprenderse, por tanto, de que el microscopio acústico empiece a proporcionar imágenes con una resolución que no desdice de la que tienen las imágenes conseguidas con el microscopio óptico ordinario. Lo que puede resultar extraño es que los que trabajan en este campo se esfuercen, no en igualar la resolución del microscopio óptico, sino en rebasarla. Pero no se trata solamente de la resolución. El srcen del contraste en los sistemas acústicos es completamente distinto del de los ópticos. Ciertas propiedades, hasta ahora inaccesibles, de los objetos microscópicos empiezan a entrar en consideración en las imágenes acústicas. Se confía en que el microscopio acústico encontrará su lugar al lado del microscopio óptico, el microscopio electrónico y el futuro microscopio de rayos X, formando una línea de dispositivos complementarios para explorar el mundo de las cosas muy pequeñas. S. Y. Sokolov, de la Unión Soviética, tuvo en el decenio de 1920 la idea de utilizar ondas acústicas del orden de los gigahertz en un sistema de microscopía. Pero la tecnología necesaria para producir tales ondas no estuvo disponible hasta comienzos del decenio de 1960. Gran parte de los primeros trabajos sobre dispositivos

ultrasónicos de muy alta frecuencia fueron realizados por Hans E. Bömmel y Klaus Dransfeld en los Laboratorios Bell. A finales de ese decenio, James S. Imai e Isadore Rudnick, de la Universidad de California en Los Angeles, se las ingeniaron para producir en helio líquido ondas acústicas de una longitud de onda de sólo 0,2 micrometros.

A

hora, a finales del decenio de 1970, varios grupos, con técnicas algo diferentes, están empeñados en la tarea de intentar desarrollar un sistema práctico de microscopía acústica. En las primeras fases del esfuerzo tuvieron un papel destacado los investigadores de la Zenith Radio Corporation, dirigidos por Adrianus Korpel y Lawrence W. Kessler. (Este último ha pasado a la Sonoscan, Inc., que fabrica una versión de barrido con láser del microscopio acústico.) Nuestro grupo de la Universidad de Stanford ha perseguido el objetivo activamente durante cinco años. Hemos conseguido reducir la longitud de onda operativa en nuestro dispositivo de cinco micrometros a medio micrometro. Mientras tanto, ¿qué es lo que hemos descubierto? Hemos aprendido que un microscopio acústico puede construirse con un elemento focalizador más simple que el constituido por las lentes del microscopio óptico ordinario. Hemos encontrado que la resolución de un microscopio acústico sólo está limitada por la longitud de onda con la que opera y que las aberraciones no desempeñan un papel importante. Hemos demostrado que los detalles en las micrografías acústicas pueden ser tan finos como en las micrografías ópticas. Hemos confirmado que es fácil medir el espeTEMAS 29

sor de películas de semiconductores y metales con las ondas acústicas y que, por tanto, es posible estudiar la adhesión de tales películas a un substrato. En el caso de muestras biológicas, hemos conseguido imágenes con un elevado contraste de varios tejidos sin necesidad de una tinción previa. Confiamos en que esta cualidad

del microscopio acústico permitirá que pronto pueda emplearse para lograr nueva información de las células vivas. ¿Cómo se forman las imágenes en un microscopio acústico? Al igual que en el microscopio óptico, la base reside en el cambio de la velocidad de propagación de las ondas al atrave-

sar la superficie de separación existente entre dos medios materiales distintos. En las ondas acústicas este cambio es mucho mayor que el que presentan las ondas luminosas. El índice de refracción, que mide las velocidades relativas de la luz entre dos medios, nunca es mayor de 1,9 y usualmente no vale más de 1,5. Por

D R O F N A T S E D D A D I S R E IV N U , R A G U R L E I N A D

1. MICROGRAFIA ACUSTICA de un conjunto de cromosomas humanos, obtenida por el autor y sus colaboradores, en el departamento de física aplicada de la Universidad de Stanford, como prueba del grado de resolución alcanzado por el nuevo dispositivo ultrasónico de formación de imágenes. Con este fin, tanto el portaobjetos con la muestra como la lente del instrumento estaban sumergidos en argón líquido. Se mantenían a una temperatura de 85 grados kelvin (menos 188 grados Celsius) rodeando el recipiente que contenía el argón líquido de un baño con nitrógeno líquido. Se analizaron electrónicaA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

mente las señales ultrasonoras registradas para obtener la imagen de los cromosomas en una pantalla de televisor. Las líneas verticales que aparecen en la fotografía obedecen a defectos en el proceso de barrido. El frotis de cromosomas fue preparado en el laboratorio de Howard M. Cann en la facultad de medicina de la Universidad de Stanford. Se eliminó el recubrimiento de proteína de los cromosomas y fueron teñidos de la forma habitual para poner de manifiesto en las micrografías ópticas su estructura en bandas. El aumento es de 3500 diámetros. 5

el contrario, la velocidad de las ondas sonoras puede cambiar en un factor diez al atravesar una interfaz (superficie de separación) sólido-líquido adecuada. RAYO El elemento focalizador primario R LENTE SONORO del microscopio acústico, desarrollado RAYO por nuestro grupo en Stanford, conLUMINOSO siste en una interfaz esférica cónRAYO LUMINOSO cava, de unos 40 micrometros de radio, formada entre zafiro y agua. En tal superficie de separación los rayos sonoros se desvían fuertemente ha2. TANTO LOS RAYOS SONOROS COMO LOS RAYOS LUMINOSOS se refractan, o desvían, al cia dentro al entrar en el líquido. En atravesar la superficie de separación entre materiales en los que las velocidades de propa- nuestro sistema todos los rayos congación de las ondas son distintas. El ángulo de desviación es mucho mayor en los rayos so- vergen en un estrecho “embudo” prónoros (diagrama de la izquierda). La presencia de una concavidad esférica en el material de ximo En al centro dicha de interfaz curvatura el cambio de la esen mayor índice de refracción (esto es, en el que las ondas se propagan más deprisa) servirá pa- fera. de la derecha). En esta situación, los rayos so- la velocidad de la luz sería pequeño ra localizar ambas clases de rayos diagrama ( noros convergen más rápidamente que los rayos luminosos y en consecuencia la aberración y el ángulo de convergencia del haz resultante en la imagen obtenida es menor. Para las ondas sonoras, la distancia local es 1,3 localizado sólo sería ligero. La aberracon la letra R). Para los rayos ción resultante debería eliminarse veces mayor que el radio de curvatura de la lentesimbolizado ( luminosos, la distancia focal es unas tres veces mayor que el radio de curvatura de la lente. recurriendo a sistemas de lentes con múltiples superficies refringentes. En el caso acústico, una lente esférica con una única superficie refringente resulta casi la hipótesis ideal. ZAFIRO AGUA La fuerte convergencia hace que la aberración sea mínima. Además, el recubrimiento antirreflector, semejante al comúnmente empleado en RADIO DE CURVATURA las lentes ópticas, puede aplicarse al DE LA LENTE zafiro para reducir la reflexión de las (40 MICROMETROS) ondas acústicas en la interfaz. Sin DISTANCIA FOCAL (40 MICROMETROS) embargo, las reflexiones residuales TRANSDUCTOR no pueden eliminarse completamente PIEZOELECTRICO y constituyen una pequeña fuente de (OXIDO DE CINC) interferencia. Por fortuna, podemos CAPAS distinguir las diferentes reflexiones DESVIADORAS con ayuda de una señal de prueba (ORO) formada por un pulso momentáneo de ultrasonido. La parte del pulso que viaja a través del líquido se reflejará a partir del objeto y llegará al recepALAMBRE LENTE tor más tarde que la parte reflejada DESVIADOR por la lente. Este procedimiento per(ORO) mite identificar la causa de las ondas PLANO FOCAL reflejadas, pues quedan registradas en distintos momentos. LIMITADOR

D D O T N A D

RAYO SONORO

D D O T N A D

DE RAYOS (DIOXIDO DE SILICIO)

CAPA ANTIRREFLECTORA (VIDRIO)

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as principales componentes del sistema acústico son bastante simples, si se comparan con el prodigioso despliegue de equipo electrónico necesario para producir las señales y prepararlas para conseguir la 3. LENTE ACUSTICA diseñada por el grupo del autor en Stanford. Consiste en una superficie imagen final. Se ha diseñado nuescóncava y esférica de separación entre zafiro y agua formada en la punta biselada de una tro sistema de modo que podamos llevar las señales hacia dentro y hacia izquierda corta varilladepositada de unos 6 en milímetros de diámetro ( de la ).lente La película se fuera de la celda acústica tan pronto encuentra la superficie posterior de zafiropiezoeléctrica convierte lasque señales eléctricas en otras acústicas durante el proceso de formación de la imagen. La misma pelí- como sea posible. La razón de esta cula sirve a continuación para convertir las señales acústicas en señales eléctricas en la fa- manera de proceder reside simplese siguiente de lectura. La parte ampliada de la derecha muestra el perfil aproximado del haz mente en que, en la actualidad, las de ultrasonidos localizado en el agua. Las líneas blancas paralelas en ambos esquemas ilus- señales eléctricas son más fáciles de trativos son los frentes de onda acústicos. La superficie lisa de la varilla de zafiro se ha he- manipular que las acústicas. cho rugosa para dispersar las ondas espurias. Además, se aplica usualmente un elemento El primer paso en el proceso d e la antirreflector de vidrio a la superficie frontal de la lente al objeto de reducir las reflexionesobtención de la imagen consiste en convertir una señal eléctrica en otra acústicas internas. 6

TEMAS 29

acústica por medio de una película piezoeléctrica depositada en la superficie posterior de la lente de zafiro. La película está formada por numerosos cristalitos, cada uno de los cuales tiene una dirección preferida: su eje longitudinal, en general, es perpendicular a la superficie del substrato en el que está depositado. Un campo eléctrico alterno aplicado a lo largo de dicho eje comprimirá y expansionará el cristal según vaya variando la polaridad del campo. Desde hace años, se dispone de películas piezoeléctricas, las cuales forman ya parte de muchos dispositivos acús-

ajustarse fácilmente la razón entre estas traslaciones y con ello la amplificación de las imágenes puede variar de cien a varios millares. En nuestro sistema actual, el barrido mecánico se consigue de la manera siguiente. Se fija la muestra a un disco circular unido a un soporte que es impulsado horizontalmente por un altavoz. El altavoz vibra con una frecuencia de 60 hertz y srcina corrimientos horizontales de la muestra comprendidos entre 100 y 200 micrometros. El conjunto puede trasladarse en dirección vertical, pues el altavoz va montado sobre guías ver-

sado por un motor de corriente continua, es mucho más lento que el movimiento horizontal. Los visitantes que acuden a nuestro laboratorio suelen plantear dos cuestiones: 1. a ¿No introduce, el movimiento relativo entre la muestra y la lente, vibraciones perturbadoras en la parte sólida del aparato o bien turbulencia en el líquido? 2. a ¿Por qué no se sustituye el método de barrido mecánico por otro electrónico, que eliminaría la necesidad de mover todos los componentes y así podría ser más rápido? Respecto a la primera cuestión, al-

zoeléctrica ticos comerciales. de óxidoLadepelícula cinc quepienosotros empleamos permite convertir la energía electromagnética en energía acústica o mecánica con un rendimiento que se aproxima al 50 por ciento. La lente acústica localiza el haz de ultrasonidos, producido de este modo, sobre una zona muy pequeña en el plano del objeto. La imagen se consigue moviendo dicha zona a lo largo del plano objeto, punto por punto y línea a línea, realizando un barrido. El procedimiento es análogo al de una cámara de televisión donde, luego de enfocar la imagen sobre una superficie fotosensible, se registra rastreando la superficie con un haz de electrones. Sin embargo, en el microscopio acústico el barrido se realiza mecánicamente y su velocidad es mucho menor. Necesita varios segundos para completar el campo, lo cual hace necesario almacenar durante algún tiempo las señales registradas antes de que puedan ser utilizadas para formar una imagen del objeto. Las señales reflejadas por el objeto y guardadas en la memoria electrónica terminan amplificándose y modulan la intensidad del haz de electrones en un receptor usual de televisión. La imagen se consigue rastreando el haz de electrones a través de la pantalla en sincronía con el movimiento realizado por el haz acústico al seguir el objeto (o, en nuestro modelo actual, con el realizado por el objeto respecto al punto focal del haz acústico). Se mantiene una correspondencia punto por punto entre las posiciones del impacto del haz electrónico sobre el monitor de televisión y la posición del impacto sobre el objeto del haz acústico. Si el impacto del haz electrónico se traslada un centímetro sobre la pantalla del televisor mientras el impacto del haz acústico se traslada sobre el objeto diez micrometros, la imagen resultante corresponderá a un aumento de mil diámetros. Puede

ticales. El movimiento vertical, impul-

gunas veces se presentan vibraciones

A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

MOTOR DE CONTINUA (MUEVE SEGUN EJE Y)

SOPORTE MOVIL MOVIMIENTO SEGUN EJE Y

TORNILLO MICROMETRICO

MOVIMIENTO SEGUN EJE X

ALTAVOZ (MUEVE SEGUN EJE X) PLACA BASE CABLE COAXIAL ENTRADA DE SEÑALES

SALIDA DE SEÑALES

MUESTRA GOTITA DE AGUA SOPORTE DE LA MUESTRA BLOQUE DE LA LENTE D D O T N A D

4. BARRIDO MECANICO de la muestra en dos dimensiones. Se consigue en la versión actual del microscopio acústico de Stanford por medio del aparato representado. El disco circular que sostiene la muestra se desplaza horizontalmente entre 100 y 200 micrometros por un altavoz que vibra con una frecuencia de 60 hertz (oscilaciones por segundo). El corrimiento vertical del conjunto muestra-altavoz está gobernado por un motor eléctrico de corriente continua. El movimiento vertical es mucho más lento que el horizontal. Las señales acústicas reflejadas por la muestra se analizan electrónicamente y se destinan a modular la intensidad del haz electrónico de un televisor. La imagen se forma rastreando el haz electrónico sobre la pantalla sincrónicamente con el movimientode la muestra relativo al punto focal del haz acústico. La razón entre corrimientos de los dos haces da el aumento de la imagen final. 7

en la muestra, pero son muy pequeñas, probablemente debido a que los modos de resonancia mecánica del objeto son de frecuencias muy superiores a los 60 hertz del proceso de barrido. En cuanto a turbulencia en el líquido, hasta el momento no se ha observado. A medida que perfeccio-

nemos el instrumento y observemos detalles más finos, estos factores podrán resultar importantes, pero no es ése el caso por ahora. Las imágenes conseguidas con el instrumento están bien enfocadas con bordes nítidos en todo el campo de visión. La respuesta a la segunda pregun-

a

b

ONDA INCIDENTE

INFERIOR AL ANGULO CRITICO

ONDA REFLEJADA REFLECTOR ELASTICO c

d

ANGULO CRITICO

D D O T N A D

A D A J E L F E R E T N E M A N R E T N I A D N O

SUPERIOR AL ANGULO CRITICO

ta va ligada a las posibilidades de invención. Apreciamos ciertamente las ventajas potenciales del barrido electrónico, pero todavía no hemos logrado dar con un método no mecánico eficaz de barrido con un haz bien enfocado.

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l examen de las superficies sólidas con este instrumento se realiza exponiéndolas a las ondas esféricas convergentes que proceden de la lente acústica y luego registrando las ondas divergentes reflejadas con ayuda de la misma lente que ahora actúa en sentido inverso. Las imájadas generadas genes mue stranpor propiedades las ondas refleesp eciales. Conviene entender la razón física de las diferencias entre estas imágenes y las producidas por sistemas ópticos. Debido a que es más fácil imaginarse la situación en el caso de ondas planas, describiremos las diferencias esenciales para éstas y después discutiremos el proceso general para ondas esféricas, convergentes y divergentes. Al incidir una onda plana p erpendicularmente sobre una superficie elástica plana se reflejará según la dirección opuesta con una fase idéntica a la de la onda incidente. Sin embargo, cuando la onda incidente avanza en una dirección inclinada respecto a la normal puede excitarse una nueva onda, que aparece pegada a la superficie. Si esto ocurre, la onda reflejada vuelve con un ángulo igual al de incidencia, pero con una fase que es distinta de la correspondiente a la onda incidente. Este fenómeno, denominado reflexión total interna, ha sido intensamente estudiado en las ondas luminosas que inciden en superficies transparentes por P. K. Tien, de los Laboratorios Bell, y otros autores. Forma la base de la nueva tecnología de la óptica de ondas guiadas [ véase “La óptica de ondas guiadas”, por Amnon Yariv; INVESTIGACIÓ N Y CIEN CIA , marzo, 1979].

E

n los sistemas acústicos estas 5. ANGULO CRITICO para la reflexión interna. Es un concepto importante para comprender ondas especiales viajan a lo larel fundamento físico de las propiedades especiales de las imágenes conseguidas en mi- go de las superficies libres y de las croscopía acústica. Puede hacerse visible en términos esquemáticos con ayuda de la ilus- interfaces. Pueden ser excitadas ajustración, en la que tanto las ondas incidentes como las reflejadas se han representado como tando la dirección de las ondas insi fueran ondas planas. Cuando una de tales ondas incide perpendicularmentea)( será re- cidentes con el valor del ángulo críflejada en dirección opuesta con una fase idéntica a la de la onda incidente. Los frentes de tico. Para ángulos menores o mayores las ondas planas se han representado alternando líneas blancas de trazo seguido y de trazo que el crítico, la onda se r efleja totalinterrumpido. Los trazos seguidos designan crestas de las ondas; los interrumpidos, valles. mente en fase con la incidente y no Cuando la dirección de la onda plana incidente se inclina respecto a la normal formando un se transmite energía vibratoria hacia cierto ángulo (c), a lo largo de la superficie del material reflector se excita una onda refleja- el interior del sólido. Para ondas sonoda internamente y se altera la fase de la onda reflejada. (Se ha supuesto que el salto en la ras incidentes en una superficie de fase fue de media oscilación.) Si los ángulos de inclinación son menores o mayores que el separación líquido-sólido, el ángulo crítico (b, d) las ondas se reflejan en fase. En microscopía acústica las ondas reflejadas in- crítico puede llegar a ser de sólo diez ternamente viajan por todas las superficies. grados.

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TEMAS 29

K. W. Andrews y R. I. Keightly, de la British Steel Corporation, han empleado la reflexión total interna de ondas sonoras de alta frecuencia para examinar diversos materiales sólidos. Es sabido que las propiedades elásticas de los materiales cambian al aumentar los esfuerzos que soportan, y sería de esperar que d icho a

cambio afectase a la velocidad de las ondas sonoras que se propagan a lo largo de la superficie del material. Andrews y Keightly han demostrado que el ángulo crítico para la reflexión total interna varía no sólo con el esfuerzo aplicado, sino también con la composición del material. En su aparato se determinan los ángu-

ZAFIRO

b

AGUA

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IN CIDE

ON

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los críticos exponiendo la superficie a un haz de ondas sonoras planas, inclinado varios grados respecto a la posición de incidenci a perpendicular. El transductor piezoeléctrico, para la recepción de las señales reflejadas, está también inclinado los mismos grados respecto a la perpendicular aunque en dirección opuesta.

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REFLECTOR ELASTICAMENTE DURO

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REFLECTOR ELASTICAMENTE BLANDO

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REFLECTOR ELASTICAMENTE DURO CON UNA CAPA SUPERPUESTA UNICA

D D O T N A D

6. ONDAS ESFERICAS CONVERGENTES de ultrasonidos formada s por salen reflejadas con la fase opuesta. En el caso de un material elásla lente zafiro-agua en el microscopio acústico. Se han representa- ticamente duro (b), la transición de ciclo completo en el ángulo crítido después de ser reflejadas por cuatro superficies reflectoras dis- co es abrupta y los frentes de onda reflejados permanecen aproxitintas. En el caso de un reflector ideal (a) los frentes de onda refleja- madamente esféricos. En un material elásticamente blandoc),( la dos divergentes coinciden exactamente con los frentes de onda que transición es gradual y los frentes de onda reflejados muestran disinciden convergiendo. Las otras tres superficies reflejan en fase las torsión. En un sustrato con una única capa superpuesta (d), la disondas incidentes, excepto en el sector de la onda próximo al ángulo torsión es aún mayor. Las ondas reflejadas se comportan de un mocrítico. Debido a la reflexión total interna, en aquel sector las ondas do más complicado que el expuesto. A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

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Con este sistema experimental pueden examinarse las faltas de homogeneidad en las propiedades elásticas de los materiales, que resultan, por ejemplo, de los cambios de composición en las aleaciones.

Como ya hemos dicho, en nuestro microscopio acústico las ondas ultrasonoras incidentes son esféricas y convergentes y el contraste que aparece en las imágenes procede de los complejos detalles del proceso de reflexión en ondas esféricas. En términos simples, puede decirse que los frentes de onda se reflejan en fase excepto en el sector de la onda próximo al ángulo crítico. A causa de la reflexión total interna, este sector se refleja con una fase diferente. Las consecuencias de este sutil corrimiento de fase son decisivas. Consideremos los frentes de onda

Supongamos después de experimentar que en la transición la reflexión. en fase cerca del ángulo crítico para reflectores elásticos los frentes de onda reflejados se trasladen toda una longitud de onda, es decir, de una cresta a la siguiente. Para un material duro, el zafiro, por ejemplo, la transición será brusca y los frentes de onda reflejados permanecerán aproximadamente esféricos. En un material blando la transición será gradual y los frentes de la onda reflejada resultarán distorsionados. Mostrarán poca relación con las ondas esféricas srcinales. En el caso de un substrato con una sola capa superpuesta hay dos interfaces reflectoras y dos ángulos críticos, el primero determinado por el material de la capa superpuesta y el segundo influenciado por el material del substrato. Ya que los frentes de onda reflejada deben trasladarse dos longitudes de onda sucesivas, la distorsión es aún mayor que con una sola superficie blanda. (Para mayor claridad, se ha simplificado la forma de onda en la figura 6. En realidad, la amplitud de la 7. AMPLITUD de la señal reflejada proce- onda reflejada nunca es igual a la dente del microscopio acústico. Está mos- amplitud de la onda incidente y, en trada sobre la pantalla de un osciloscopio en consecuencia, el comportamiento real función del espaciado entre la lente y la su- de las ondas se vuelve más compliperficie reflectora. En el pico de cada una de cado. Aunque no hemos medido la estas trazas el reflector está colocado en el forma real de las ondas, estamos sepunto focal de la lente. A la izquierda del pi- guros de que este modelo ofrece los co, el reflector queda expuesto a un haz con- rasgos esenciales de la cuestión.) vergente. A la derecha está expuesto a un haz divergente. Las diferencias de forma de ómo detectamos los frentes de las porciones oscilantes de estas trazas proonda distorsionados? Lo hace ceden de diferencias de las propiedades el transductor piezoeléctrico. Un elásticas de las superficies reflectoras. La transductor piezoeléctrico de pelícutraza superior corresponde a una superficie la delgada, con una dimensión transde silicio puro. La central pertenece a una versal que sea mucho mayor que la superficie de silicio cubierta con una capa longitud de onda, actúa como un dede aluminio de un micrometro. La traza infe- tector sensible a la fase. Su respuesta rior está producida por una superficie de si- será máxima para ondas planas con licio con una capa de dos micrometros de frentes de onda paralelos al plano del aluminio. De este modo, pueden detectarse transductor. En esta situación toda hasta cambios extraordinariamente peque- el área del transductor será excitada ños en el espesor. en fase. Si los frentes de onda inci-

D R O F N A T S E D D A D I S R E IV N U , R A L A T A H A L L U D B A

¿C

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den oblicuamente, algunas regiones de la película transductora estarán expuestas a componentes de la onda de fase variable que se anularán con otras. La lente convertirá las ondas esféricas reflejadas en ondas planas, si su centro de curvatura coincide con el punto local de la lente. Si los frentes de onda están distorsionados, las ondas planas que llegan al transductor también lo estarán. Cualquier variación en la forma de los frentes de onda alterará la respuesta del transductor. Es esta variación en la señal detectada, debida a las faltas de homogeneidad en las propiedades la causa del objeto, elásticas contraste la en quelas constituye imágenes acústicas. Entre la lente y el punto focal, como ya hemos indicado, el haz acústico incidente es esférico y convergente, mientras más allá de este punto los frentes de onda son esféricos y divergentes. La curvatura del frente de onda incidente en la superficie del objeto reflector cambia al variar el espaciado entre la lente y el objeto. Una onda convergente será reflejada con los cambios de fase que hemos descrito. En el punto local, la onda incidente no será ni convergente ni divergente. Más allá del punto focal, la onda divergente tendrá un carácter diferente de reflexión. Las trazas osciloscópicas procedentes de la respuesta del transductor, en función del espaciado entre la lente y el objeto reflector, son reveladoras a este respecto. Abdullah Atalar, un investigador de nuestro grupo, ha mostrado que materiales con diferentes constantes elásticas, por ejemplo, producirán trazas osciloscópicas notablemente diferentes. La diferencia en el ángulo crítico para la reflexión total interna srcina la diferencia en las porciones oscilantes de dichas trazas. La respuesta del transductor para un substrato con una única capa superpuesta produce en el osciloscopio una traza particularmente interesante. Por ejemplo, hay un gran cambio en la forma de la traza correspondiente a una superficie de silicio puro cuando se deposita sobre ella una capa de aluminio de un micrometro. El cambio es todavía mayor si la capa depositada tiene dos micrometros de espesor ( véase la figura 7 ). En este ejemplo hay un espaciado lente-objeto correspondiente a un pico en la respuesta para la capa de dos micrometros y, en cambio, se presenta un valle en la respuesta para una capa de un micrometro. Con este método son naturalmente fáciles de acusar pequeños cambios en el espeTEMAS 29

D R O F N A T S E D D A D I S R E V I N U , E T A U Q . F N I V L A C

8. UNA SUPERFICIE DE ACERO, tal y como aparece en una micrografía acústica (derecha). Se obtiene una imagen completamente diferente de la que produce un instrumento óptico (izquierda). El ma-

yor contraste entre los granos cristalinos individuales en la imagen acústica debe ser atribuido a ligeras variaciones en las propiedades elásticas de los granos.

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9. UNA ALEACION DE COBALTO Y TITANIO, tal y como aparece en estas micrografías contrapuestas. Una se ha tomado con el microscopio óptico ( izquierda ) y la otra con el microscopio acústico sor o en las propiedades elásticas de una película delgada. Por ejemplo, Robert G. Wilson y Rolf D. Weglein, de los Laboratorios de Investigación Hughes, han encontrado que el proceso acústico da lugar a notables variaciones de contraste en imágenes de objetos con múltiples capas, tales como los circuitos microelectrónicos. Como hemos mencionado, la longitud de onda con la que opera el mejor microscopio acústico es aproximadamente de un micrometro, que no difiere mucho de las longitudes de onda de la luz visible. Hasta cierto punto puede decirse que se trata de una mera coincidencia. Si la longitud de onda límite para el sistema sonoro hubiera sido de diez micrometros, el microscopio acústico hubiera llamado poco la atención excepto para aplicaciones especiales. Si la longiA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

(derecha ). Las formas manchadas en la imagen acústica corresponden a regiones en las que la aleación tiene una composición diferente.

tud de onda límite hubiera sido de una décima de micrometro, la microscopía acústica habría sido preponderante. La importancia de un microscopio, por encima de todos los demás factores, queda definida por la resolución límite. En el microscopio acústico, ¿qué es lo que determina dicho límite? Se trata de la absorción del sonido a lo largo del camino acústico seguido en el líquido. En alguna forma hay que emplear líquidos si el objeto debe moverse respecto a la lente. Aunque los líquido s hacen posible el uso de longitudes de onda cortas, absorben energía. Las moléculas de muchos líquidos muestran modos de vibración que son excitados por las ondas de alta frecuencia. La absorción para tales líquidos es tan intensa que su empleo está excluido. Con mucho, el líquido preferido ha

sido el agua. Por fortuna, el agua es compatible con las muestras biológicas vivas. La velocidad de las ondas sonoras en el agua es de unos 1500 metros por segundo y la absorción es menor que en la mayoría de los demás líquidos, aunque aumenta con las frecuencias elevadas. El argón es otro líquido interesante para la microscopía acústica. Sus propiedades acústicas son semejantes a las del agua, excepto en cuanto a la velocidad del sonido, pues el argón tiene una velocidad que es sólo el 60 por ciento de la del agua. El argón tiene otro inconveniente: sólo existe en estado líquido en un estrecho margen de temperaturas en torno a los 85 grados kelvin (menos 188 grados Celsius). Por tanto, es un líquido criogénico y hay que diseñar un equipo especial para los instrumentos que 11

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10. ELEMENTOS DE CIRCUITOS MICROELECTRONICOS construidos sobre la superficie de una pastilla de silicio. Se han reproducido tres veces: una en forma de una micrografía ópticaizquierda ( ) y dos en forma de micrografías acústicas obtenidas con el objeto en diferentes posiciones locales (centro y derecha). El dispositivo consta de varios transistores interconectados. Las extensiones semejantes a dedos que conectan los transistores son tiras de películas de aluminio operan con tales líquidos. Así se ha hecho para el microscopio acústico y Daniel Rugar, otro investigador de nuestro grupo, ha obtenido imágenes de elevada calidad con tal sistema. El argón líquido es también importante por constituir un escalón intermedio en el paso de agua a helio líquido. La absorción del sonido en la fase líquida del isótopo helio 4 es tan pequeña que puede considerarse despreciable. La velocidad del sonido en tal medio es la octava parte de la del agua. En nuestro grupo, Joseph E. Heiserman está diseñando un microscopio acústico que emplee helio líquido como medio transmisor del sonido. Tiene la esperanza de conseguir un poder de resolución superior al del microscopio óptico.

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oda esta información de base constituye el prólogo de las imágenes conseguidas. En el pasado, a los visitantes a nuestro laboratorio les eran mostradas, en primer lugar, las imágenes y entonces se les preguntaba si deseaban ver el instrumento. Esta manera de proceder nos ahorraba mucho tiempo. En aquella época las micrografías acústicas poseían una calidad inferior a la de las micrografías ópticas y eran examinadas como una mera curiosidad. Los visitantes rara vez pedían darse una vuelta por el laboratorio y ver el instrumento en funcionamiento. Esto ya no ocurre. La mejora en calidad de las imágenes ha producido un intenso interés por el instrumento y nos vemos obli12

depositadas a partir del vapor. La banda lisa que cruza la parte superior de la imagen es el sustrato de silicio puro; las texturas arenosas están ocasionadas por capas superpuestas de silicio policristalino. La inversión de contraste en las imágenes acústicas ayuda a identificar la estructura detallada sobre la pastilla. El dispositivo fue proporcionado por el doctor Roderick D. Davies, de la Universidad de Stanford.

gados a emplear cierto tiempo en explicar los detalles sobre su modo de operar. Pero la esencia de cualquier programa de microscopía estriba en conseguir las imágenes. Creemos que las acústicas que acompañan el presente artículo pueden competir con sus oponentes ópticas. Las imágenes son de tres clases: de materiales, de circuitos de microelectrónica y de células vivas. El elemento común es el tamaño: todos los objetos tienen detalles cuyas dimensiones se miden en micrometros. A sim ple vista, met ales como el acero parecen ser uniformes, pero en realidad tienen estructuras muy complejas, que consisten en granos cristalinos individuales cementados conjuntamente a lo largo de sus bordes. La micrografía acústica de una superficie de acero parece completamente distinta de su oponente óptica ( véase la figu ra 8 ). El mayor contraste en la imagen acústica da una mejor idea de la orientación relativa de los cristales en la superficie. En nuestro caso, la superficie ha sido pulida y atacada de manera que los límites de grano parecen limpios en la micrografía óptica, pero este paso no es necesario con el sistema acústico. Las aleaciones presentan otra clase de falta de homogeneidad. En una aleación de cobalto y titanio, por ejemplo, la mezcla puede condensarse en varias fases, cada una con una proporción entre cobalto y titanio distinta. Las fases difieren en su elas-

ticidad, divergencia que constituye la causa del contraste en la imagen acústica ( véase la figura 9 ). Las propiedades de estas aleaciones dependen grandemente del tamaño y la distribución de sus fases. La circuitería microelectrónica constituye otra buena fuente de objetos para la micrografía acústica. Los detalles estructurales de tales dispositivos a menudo aparecen con mejor contraste que en las micrografías ópticas, que se ven más uniformes ( véase la figura 10 ). Además, con el instrumento acústico se pueden obtener varias imágenes diferentes del mismo objeto, cada una correspondiente a un espaciado distinto entre el objeto y la lente. Cada una de dichas imágenes proporciona un nuevo nivel de detalle. En nuestra investigación dicha información “en profundidad” ha motivado un interés más destacado que cualquier otra característica. En el mundo biológico existen muchas estructuras celulares en la escala de los micrometros. De una manera rutinaria se visualizan con el microscopio óptico, pero no sin dificultad. A menudo se presenta una falta de contraste visible. El problema reside en que las estructuras de las células son casi completamente transparentes: sólo absorben una minúscula parte de luz. Se han realizado extraordinarios esfuerzos para compensar tal deficiencia y aumentar el contraste. El método usual es el del teñido selectivo de las células. TEMAS 29

D R O F N A T S E D D A D I S R E V I N U , E T A U Q . F IN V L A C

11. CELULA AISLADA. Se trata de un fibroblasto obtenido del tejido conjuntivo de un embrión de pollo. Se ha representado mediante su imagen óptica (izquierda) y la correspondiente imagen acústica (derecha). La célula se hizo crecer sobre un portaobjetos de vidrio con colágeno y fue fijada con metanol por Randal N. Johnston en Stanford. Ambas micrografías revelan la red de fibras internas que afecConstituye un arte altamente desarrollado y añade color a las imágenes, pero requiere tiempo y no puede ser aplicado a las células vivas. Las técnicas ópticas asociadas con la microscopía de contraste de fase y la microscopía de luz polarizada permiten introducir cambios sutiles para aumentar el contraste, pero todavía queda campo para introducir nuevas mejoras. Al emprender esta parte de la investigación, nuestra ignorancia entonces en las cuestiones biológicas quedará ilustrada con una anécdota. Cuando por primera vez preguntamos la manera de obtener glóbulos blancos de la sangre, en un laboratorio biológico de Stanford se nos pidió que dijéramos cuántos glóbulos deseábamos. Ya que queríamos obtener unas pocas imágenes, contestamos que necesitábamos diez glóbulos. Esta respuesta sólo podía proceder de un profano en biología. Se nos explicó que el número mínimo de glóbulos que podía aislarse era el de un millón, y todos cabían en un simple portaobjetos. En muchos casos sería deseable estudiar el conjunto de estos glóbulos, pero no es fácil. El coste de la película fotográfica necesaria para registrar las imágenes de todos estos glóbulos sería exagerado. En los laboratorios de biología es corriente registrar unas veinte imágenes de cada glóbulo. Incluso si se limitase el estudio a sólo el uno por ciento de los glóbulos, el coste resultaría prohibitivo. Con ayuda de circuitos especiales conectados a nuestro instrumento A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

tan a toda la célula. El contraste en la imagen óptica se obtuvo con una técnica de tinción selectiva. El contraste en la imagen acústica procede de variaciones en las propiedades elásticas de las estructuras en la célula. El que la técnica acústica no requiera tinción sugiere que podemos llegar a visualizar tales estructuras en células vivas.

acústico puede reducirse dicho coste. Tales imágenes se pueden registrar directamente en una cinta magnética. El tiempo de reproducción en un registrador magnetofónico (a una cadencia de treinta imágenes por segundo) para 10.000 glóbulos sería de una hora y el coste, el de la cinta. Hasta ahora hemos realizado micrografías de tres clases principales de entidades biológicas: linfocitos (glóbulos blancos de la sangre), fibroblastos (células de soporte de los tejido s) y cromos omas. El he cho de haber obtenido imágenes tan buenas de distintas estructuras celulares sin necesidad de emplear tinciones indica que podremos observar algunas de tales estructuras en el interior de las células vivas.

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as imágenes que hemos elegido para ilustrar el presente artículo son ideales en muchos aspectos para la microscopía acústica y demuestran lo que todavía puede conseguirse. Son muy diferentes de las imágenes que era obvio elegir cuando emprendimos este tipo de estudio. Cuando echamos una mirada hacia atrás comprobamos que los ejemplos primitivos, tales como la unión entre materiales opacos, fueron simples extensiones del trabajo que se venía haciendo acerca de la formación acústica de imágenes a frecuencias ultrasónicas más bajas. Los ejemplos que mostramos no estaban incluidos en nuestra lista srcinal. Han evolucionado de una manera tan natural como inesperada.

En una ocasión estábamos seguros de que la reflexión de las ondas sonoras en una superficie de zafiro puro sólo debía venir determinada por el contorno del haz acústico. Se presentaría un máximo al colocar el reflector en el punto local que iría disminuyendo de acuerdo con el perfil del haz a medida que el reflector fuera separado del plano correspondiente. Nada nos hacía suponer que las propiedades elásticas de la superficie reflectora quedaban codificadas en las ondas divergentes. En otra ocasión, trabajamos intensamente para perfeccionar un microscopio acústico del tipo de transmisión. Nunca sospechamos que las imágenes obtenidas por reflexión, particularmente de muestras biológicas blandas, pudieran ser tan vigorosas.

BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA ACOUSTIC MICROSCOPY: BIOMEDICAL APPLICATIONS. Ross A. Lemons y Calvin F. Quate en Science, vol. 188, n.o 4191, págs. 905-911; 30 de mayo de 1975. ACOUSTIC IMAGING: CAMERAS, MICROSCOPES, PHASED ARRAYS, AND HOLOGRAPHIC SYSTEMS. Dirigido por Glen Wade. PlePress, 1976. Anum MICROSCOPY COUSTIC AT OPTICAL WAVELENGTHS. V. Jipson y C. F. Quate en Applied Physics Letters, vol. 32, n.o 12, págs. 789-791; 15 de junio de 1978. A N A NGULAR -S PECTRUM A PPR OACH TO CONTRAST IN REFLECTION ACOUSTIC MICROSCOPY. Abdullah Atalar en Journal of Applied Physics , vol. 49, n. o 10, págs. 5130-5139; octubre 1978.

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Microscopios con sonda de barrido Estos instrumentos permiten estudiar las características de los cuerpos con un detalle inasequible a los microscopio ordinarios, examinándolos a muy corta distancia con una sonda cuyo espesor puede ser de un solo átomo H. Kumar Wickramasinghe

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os objetos cuyas dimensiones son menores que la longitud de onda de la luz visible se han convertido en un campo fundamental de la ciencia y tecnología contemporáneas. Los biólogos estudian las moléculas de las proteínas o el ADN; los especialistas en ciencia de materiales examinan los defectos atómicos de los cristales; los ingenieros microelectrónicos construyen circuitos cuyo espesor es de escasas decenas de átomos. No hace muchos años, todo ese mundo diminuto sólo podía observarse mediante métodos muy complejos y con frecuencia destructivos, tales como la microscopía electrónica y la difracción de rayos X, que alejaban ese estudio fuera del alcance de instrumentos tan sencillos y directos como los microscopios ópticos ordinarios. Una nueva familia de microscopios abrió este dominio a la observación directa. Estos dispositivos permiten cartografiar los cuerpos a escala atómica y molecular, estudiar las propiedades magnéticas y mecánicas de la materia e incluso poner de manifiesto las variaciones de temperatura con una resolución mucho mayor de la que ha sido posible hasta la actualidad, sin necesidad de alterar las muestras o exponerlas a radiaciones perjudiciales de alta energía. Este avance parecía imposible. Al fin y al cabo, hace más de 100 años, el físico y óptico alemán Ernst Abbe describió una limitación fundamental de cualquier microscopio que se base en la capacidad de las lentes para localizar la luz o cualquier otra radiación: la difracción difumina los detalles de los objetos cuyas dimensiones sean menores que media longitud de onda de la radiación utilizada. 14

Los nuevos microscopios —representados por el microscopio de efecto túnel, por el cual Gerd Binnig y Heinrich Rohrer, del laboratorio de investigación de la empresa IBM en Zurich, recibieron el premio Nobel en el año 1986— superaron con facilidad la barrera de Abbe. El principio rector de su funcionamiento ya había sido descrito en 1956. J. A. O’Keefe, que por entonces trabajaba en el Servicio Cartográfico del Ejército de los Estados Unidos, diseñó un microscopio en el que la luz atravesaría un pequeño orificio para incidir a continuación sobre una pantalla opaca, iluminando un objeto situado justo enfrente de dicha pantalla. La luz transmitida a través de la muestra o reflejada a través del orificio quedaría registrada durante un barrido de la muestra. O’Keefe señaló que la resolución de este “microscopio de barrido de campo próximo” estaría limitada únicamente por el tamaño del orificio y no por la longitud de onda de la luz. En principio, este dispositivo permitiría obtener imágenes de alta resolución, es decir, imágenes con detalles de tamaño mucho menor que la mitad de una longitud de onda. O’Keefe era consciente de que no existía la técnica necesaria para fijar la posición de un objeto o moverlo con la precisión requerida. Sin embargo, en el año 1972, Eric A sh, del University College de Londres, adoptó la estrategia de O’Keefe para superar la barrera de Abbe recurriendo a una radiación de longitud de onda larga. Hizo pasar una radiación de microonda s con una longitud de onda de tres centímetros a través de un orificio de tamaño similar al de una cabeza de alfiler y la dirigió sobre un

objeto situado ante él, registrando una imagen con una resolución de 150 micras, es decir, una longitud 200 veces menor que la longitud de onda de la radiación utilizada. Por aquel entonces se disponía ya de medios para controlar la posición y el movimiento de una muestra con la precisión necesaria para superar la resolución de un microscopio óptico ordinario. En el mismo año en que tuvo lugar la demostración de Ash, Rusell Young, de la Oficina Nacional de Pesos y Medidas, consiguió manipular objetos de tres dimensiones con una precisión del orden del nanómetro (la milmillonésima parte de un metro). Para ello se sirvió de cerámicas piezoeléctricas, que cambian de tamaño en una escala ínfima cuando varía el valor del potencial eléctrico a que está sometido el material. El control mediante materiales piezoeléctricos abrió el camino para el desarrollo, en 1981, del exponente máximo de un microscopio de barrido de campo próximo, el denominado STM , o microscopio de efecto túnel [ véase “El microscopio de efecto túnel”, por Gerd Binnig y Heinrich Rohrer, en este mismo número].

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n el microscopio de efecto túnel, la “apertura” es una sonda de tungsteno pequeña. El extremo de la misma, finísimo, puede constar de un solo átomo y medir 0,2 nanómetros de anchura. Los controles piezoeléctricos aproximan la punta hasta una distancia de uno o dos nanómetros de la superficie de una muestra conductora, cercanía en que las nubes electrónicas del átomo del extremo de la sonda y del átomo más próximo de la muestra se solapan. Cuando se aplica un pequeño voltaje a la sonda, TEMAS 29

los electrones atraviesan ese intervalo (efecto túnel) y dan lugar a la aparición de una minúscula corriente. La intensidad de la corriente en cuestión es extraordinariamente sensible al valor de la distancia de separación; de manera característica, la intensidad disminuye en un factor 10 cuando la distancia en cuestión aumenta en 0,1 nanómetros, es decir, la mitad del diámetro de un átomo. Los controles piezoeléctricos X e Y (que gobiernan el movimiento en las dos dimensiones de un plano) mueven la sonda a lo largo y ancho de la superficie de la muestra en un barri-

de los átomos de la superficie de la muestra y disminuyendo hasta anularse cuando cruzara los intervalos existentes entre los átomos. Lo que sucede en realidad es que la sonda se mueve hacia arriba y hacia abajo siguiendo la topografía de la muestra. Un mecanismo de retroalimentación detecta las variaciones que se producen en la corriente srcinada por efecto túnel y varía el voltaje aplicado a un tercer control Z. El control piezoeléctrico Z mueve la sonda en un sentido vertical en la cuantía necesaria para estabilizar la corriente, lo cual equivale a mantener cons-

sión de los controles y la finura del sistema de barrido son suficientes, las imágenes del ST M pueden llegar a resolver átomos individuales, cuyo diámetro es del orden de 0,2 nanómetros. Una resolución, pues, extraordinaria: la longitud de onda mecanicocuántica de los electrones que experimentan el efecto túnel en la sonda —es decir, la “radiación” que da lugar a la imagen— es de aproximadamente un nanómetro. El mapa que levantan estas imágenes no es de naturaleza topográfica en el sentido literal de la palabra; antes bien, representan una super-

sucesivas do exhaustivo, trayectorias de forma paralelas tal que del las barrido están separadas quizá sólo una fracción de nanómetro. Si la sonda se mantuviera a una altura constante, la corriente srcinada por el efecto túnel variaría de modo espectacular, aumentando cuando la sonda pasara sobre elevaciones del tenor

del microscopio tante la distancia y laentre superficie el extremo de la muestra.

probabilidad ficie de efecto de túnel queequiprobable. se produzca el La efecto túnel no queda unívocamente determinada por la topografía de la superficie de la muestra, ya que se ve afectada también por las variaciones en la abundancia y energía de los electrones superficiales. Cuando la muestra que se observa sólo contiene un ele-

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as variaciones en el voltaje aplicado al control piezoeléctrico Z se traducen electrónicamente en una imagen del relieve de la superficie. Si la agudeza de la sonda, la preci-

N E G IN F L E D IN S , M B ,IR E T L O W F A L O

1. SONDA DE SILICIO de un microscopio de fuerza de láser, afilada hasta alcanzar un espesor de pocos átomos; se cierne sobre una superficie. El microscopio, desarrollad o en el laboratorio del autor, proporciona imágenes del relieve de una superficie barriéndola con una sonda vibrante muy pequeña, situada a esA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

casos nanómetros (milmillonésimas de metro) por encima de la muestra, desde donde “percibe” débiles fuerzas atractivas provenientes de la superficie. Esta microfotografía de 1300 aumentos muestra una sonda que desarrolló Olaf Wolter en la central alemana IBM en Sindelfingen. 15

mento, la probabilidad de que se produzca el efecto túnel se ajusta estrechamente a su topografía, “topografía” que pone de manifiesto también las variaciones en la composición atómica. Por ejemplo, la presencia de un átomo contaminante en una superficie, en lo demás uniforme, puede dar lugar a una anomalía en forma de protuberancia o de pozo, en función de sus propiedades electrónicas. El éxito del STM renovó la confianza de los investigadores ante la posibilidad de utilizar una sonda para observar una muestra con una precisión del orden del tamaño atómico

tricos. Desde aquella fecha, este microscopio ha permitido obtener imágenes de la superficie de múltiples sustancias y se han aprovecha do incluso sus propiedades para utilizarlo a escala nanométrica: la punta de la sonda de este instrumento nos faculta para aplicar con gran precisión un voltaje capaz de disecar moléculas o de estudiar sus propiedades electrónicas. Más aún, el STM posibilitó el nacimiento de toda una familia de microscopios con sonda de barrido basados en una tecnología similar a la descrita. El primer vástago de esta serie tenía por objetivo

ciones de su progenitor: la obtención de imágenes con el STM está restringida fundamentalmente a los conductores eléctricos. Con frecuencia, hasta los materiales conductores o semiconductores, como el silicio, están recubiertos por una capa de óxido aislante. Aunque los materiales biológicos no suelen ser conductores, con el STM se han podido cartografiar ciertas muestras biológicas colocadas en una superficie conductora y sumergidas en un electrolito. En el año 1985, Binnig, junto con Calvin F. Quate, de la Universidad de Stanford, y Christoph Gerber, de

sirviéndose de controles piezoeléc-

superar una de las p rincipales limita-

copio la IBM dede fuerza Zurich, atómica diseñaron ( AFMel),microsun dispositivo con sonda de barrido que no requería que la muestra fuera conductora. Al igual que el ST M , este microscopio se basa en el movimiento de una aguja pequeñísima —en este caso, una punta de diamante de dimensiones atómicas montada en una lámina metálica— sobre la muestra sometida al barrido. En lugar de la corriente producida por efecto túnel, el AFM registra los perfiles de la fuerza repulsiva srcinada por el solapamiento de la nube de electrones de la punta con las nubes de electrones de los átomos superficiales de la muestra. De manera similar a la aguja de un tocadiscos, la punta de la sonda “lee” la superficie de la muestra. La lámina metálica actúa a modo de resorte que mantiene la punta de la sonda en contacto con la superficie durante su recorrido por la topografía atómica, siguiendo una serie de surcos paralelos sucesivos.

PANTALLA CONTROL PIEZOELECTRICO

VOLTAJE

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G EN E R AD DE RE OR TROALIME NTAC ION

SEÑAL DE REFERENCIA

CORRIENTE DE TUNEL

N E K I K N A H

STM

cala 2. MICROSCOPIO atómica por medio DE EFECTO de electrones TUNEL ( que):atraviesan, percibe la topografía por efecto de túnel, unaelsuperficie intervalo entre a esla sonda y la superficie. Una cerámica piezoeléctrica, cuyo tamaño cambia ligeramente en respuesta a los cambios en el voltaje aplicado, gobierna la sonda de tungsteno en tres dimensiones. Se aplica un voltaje a la punta de la sonda, que se acerca hacia la superficie (conductora o semiconductora) hasta que se inicia una corriente de túnel. La punta va peinando la superficie en una serie de surcos sucesivos. La corriente de túnel tiende a variar con la topografía; un mecanismo de retroalimentación responde moviendo la punta arriba y abajo, siguiendo el relieve de la superfic ie. Los movimientos de la punta se traducen en una imagen. 16

n el diseño srcinal del AFM, la medición de la deflexión de la lámina se llevaba a cabo con la producción de una corriente de túnel entre dicha lámina y la punta de un STM montada sobre ella. Un mecanismo de retroalimentación respondía a las variaciones de la corriente de túnel, ajustando el voltaje aplicado a un control piezoeléctrico Z que movía la muestra verticalmente. La deflexión y, por tanto, la fuerza repulsiva, se mantenía constante; las variaciones en el voltaje aplicado al control piezoeléctrico Z reproducían los rasgos topográficos de la muestra y servían de base para la formación de la correspondiente imagen. De este modo, dicha imagen podía resolver átomos individuales. Al igual que en el STM , el poder de resolución del AFM era muy grande; dicha resolución venía limitada únicamente por la acuidad de la punta de la sonda de diamante y no por ninguna longitud de onda. TEMAS 29

M IB E D N O S T A W . J S A M O H T N IO C A G I T S E V N I E D O R T N E C , A R T S N E E F . M . R

3. ALINEACION DE LOS ATOMOS, a modo de cuentas de un rosario, en esta imagen de una muestra de arseniuro de galio, un semiconductor, obtenida con un STM. Esta imagen es compuesta: dado que los átomos de galio (azul ) y de arsénico (rojo) tienen diferentes propiedades eléctricas, sus imágenes se han obtenido por separado, bajo condiciones diferentes. En el caso de los átomos de galio, la Aunque el primer AFM era capaz en principio de proporcionar imágenes de cualquier substancia, conductora o no, la presión de la punta de diamante (del orden de una millonésima de gramo) era suficiente para distorsionar o mover muchas de las moléculas biológicas. Paul K. Hansma y sus colaboradores, de la Universidad de California, redujeron dicha presión en un factor de 10. Un factor que contribuye a aumentar la presión de la punta es la delgada película de agua y contaminantes que inevitablemente se depositan sobre la punta y sobre la superficie de la muestra. Cuando la punta se acerca mucho a la superficie y las capas de contaminantes entran en contacto, aparecen unas fuerzas de adhesión que tienden a unir la punta con la muestra, con lo que se refuerza la presión de barrido. El grupo de Hansma eliminó este A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

corriente túnel fluía desde la punta —cargada negativamente— haSTM estaba cia la muestra; para los átomos de arsénico, la punta del cargada positivamente y el sentido de la corriente se invertía. Proporcionó esta imagen Randall M. Feenstra, quien la creó en el laboratorio de investigación Thomas J. Watson de la compañía IBM, en Yorktown Heights.

efecto sumergiendo punta y muestra en una gota de agua. Se reemplazó también el mecanismo del STM por un nuevo sistema de detección de la deflexión de la sonda, desarrollado en el centro de investigación de IBM Thomas J. Watson, en Yorktown Heights, Nueva York; consiste en un haz de láser que la lámina refleja. El movimiento de la lámina altera la trayectoria del haz reflejado, de tal forma que una célula fotoeléctrica colocada en la trayectoria del haz, a cierta distancia, es capaz de detectar los pequeños movimientos que experimenta la lámina. La señal producida por la célula fotoeléctrica activa el control piezoeléctric o Z para que la separación se mantenga constante. El sensor óptico proporciona una medida más precisa de la deflexión de la punta que el sensor basado en el efecto túnel y ello hace que el contac-

to del AFM sea más consistente y suave. Como resultado de todas estas mejoras, Hansma y sus colaboradores llegaron a obtener imágenes de sustancias biológicas con un detalle casi atómico. Tomaron incluso instantáneas de un proceso molecular a medida que va transcurriendo; en concreto: la polimerización de la proteína de fibrina, uno de los componentes principales de los coágulos de la sangre. l mismo tiempo que el AFM se iba desarrollando, mi grupo del departamento de investigación de IBM en Yorktown Heights investig aba nuevas formas de controlar la calidad en la fabricación de materiales microelectrónicos. En su esfuerzo por construir ordenadores más rápidos y potentes, los ingenieros disminuyen constantemente el tamaño de los elementos de los circuitos y de los dis-

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positivos de almacenamiento de datos. La búsqueda de imperfecciones en los circuitos hace necesario trabajar con resoluciones al menos 10 veces menores que el tamaño del menor de los elementos; las dimensiones de los propios elementos de los circuitos se estaban acercando ya por entonces al límite de resolución teórica de los microscopios ópticos ordinarios, que es del orden de 250 nanómetros. Durante algún tiempo, el microscopio electrónico de barrido ( SEM ) se convirtió en la herramienta microelectrónica habitual: este instrumento permite resolver hasta un detalle de

valor del SEM en el control de calidad de estos dispositivos. Los microscopios con sonda de barrido —sencillos, directos y potentes— parecían responder a nuestras necesidades. Sin embargo, la utilización del STM exige que la muestra sea conductora, cuando en los dispositivos microelectrónicos se utilizan materiales semiconductores y aislantes además de conductores. El AFM puede proporcionar imágenes de un conjunto más amplio de materiales; ahora bien, el propio AFM avanzado, más suave, contacta con los materiales con fuerza suficiente para contaminar o dañar

El más logrado de ellos fue el microscopio de fuerza de láser ( LFM ), inventado en colaboración con Yves Martin y Clayton C. Williams. La “fuerza” del LFM es la pequeña interacción atractiva que aparece entre una superficie y una sonda situada a una distancia de 2 a 20 nanómetros, un intervalo mucho mayor que en el STM y el AFM . En los materiales semiconductores y aislantes, la fuerza es consecuencia principalmente de la tensión superficial del agua que condensa entre la punta de la sonda y la superficie de la muestra, pero intervienen también las fuerzas de van

el SEM requiere algunos nanómetros. que laSin muestra embargo, esté revestida por una capa metálica y que se observe al vacío; su resolución tridimensional es baja. Por otra parte, sus electrones de alta energía pueden dañar o destruir un dispositivo de semiconductor, lo que limita el

tos.elementos los Por eso, mis delicados colegas ydeyolos desarrocircuillamos una nueva familia de microscopios con sonda de barrido, capaces de registrar los perfiles de los dispositivos electrónicos, cualquiera que sea su composición, sin necesidad de rozar su superficie.

racciones der Waals (débiles electrostáticas y transitorias entre los inteátomos o las moléculas).

N E K I K N A H

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a fuerza atractiva es ínfima, mil veces menor que las repulsiones interatómicas registradas con el AFM. El LFM detecta la existencia de esta fuerza a través de su efecto sobre la dinámica de una sonda vibrante, un afilado alambre de tungsteno de LASER medio milímetro de longitud con una punta vuelta hacia abajo, cuyo diámetro queda reducido a 50 nanóLENTE metros o menos. (Luego se utilizaFOTODIODO ron sondas de silicio cuyo extremo es finísimo, de tamaño atómico.) Un transductor piezoeléctrico situado en la base del alambre transforma la corriente variable en una vibración, La frecuencia base del transductor se halla por encima mismo de la frecuencia de resonancia mecánica más baja del alambre (cifrada en unos 50 kilohertz ). Dado que el alambre en cuestión está vibrando con una frecuencia muy próxima a la de resonancia, amplifica la señal de base de forma anáCONTROL PANTALLA loga a la lengüeta de un instrumento PIEZOELECTRICO musical. La punta de la sonda puede oscilar medio nanómetro, aun cuando el transductor del otro extremo sólo se esté desplazando una centésima de nanómetro a lo más. Sin embargo, cuando la punta vibrante se aproG EN E R AD O R xima a la muestra, las débiles fuerDE RE TROALIME zas atractivas que percibe “ablandan” NTAC ION el alambre y decae su frecuencia de resonancia, que se aleja entonces de la frecuencia base, con lo cual disSEÑAL DE REFERENCIA minuye la amplitud de la vibración. 4. MICROSCOPIO DE FUERZA ATOMICA AFM ( ): barre una muestra con un diamante montado Un sensor de láser detecta el camen un delgado brazo metálico. La nube de electrones de la punta del diamante (que puede bio de amplitud. Esta detección se acabar en un solo átomo) interacciona con las nubes de electrones de los distintos átomos lleva a cabo por interferometría, técde la muestra, produciendo una fuerza repulsiva que varía con el relieve de la superficie. Es-nica de uso en la medición precisa de ta fuerza actúa sobre la sonda y los movimientos que produce se recogen mediante un haz distancias con frecuente aplicación, de láser que se refleja en el brazo que la sostiene y que detecta finalmente en un sensor de por citar dos casos, en astronomía y fotodiodo. Un mecanismo de retroalimentación responde a los cambios en la trayectoria del geofísica. Un haz de láser se desdohaz activando un control piezoeléctrico que ajusta la altura de la muestra de tal forma que la bla en un haz de referencia, reflejado deflexión del brazo permanezca constante. Los movimientos de la muestra dibujan el perfil por un espejo o un prisma estaciode la superficie. El AFM proporciona sin problemas imágenes de materiales aislantes. nario, y un haz de exploración, refle-

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TEMAS 29

jado en la parte posterior de la punta de la sonda. Los dos haces reflejados se recombinan e interfieren entre sí para dar lugar a un haz cuya fase es extremadamente sensible a la longitud recorrida por el haz de exploración. La fase se desplaza en un sentido u otro con cada oscilación de la punta; la cuantía de este desplazamiento pone de manifiesto la amplitud de la vibración. El interferómetro puede así detectar cambios de amplitud mínimos, de sólo 10 –5 nanómetros. La amplitud tiende a disminuir cuando la sonda pasa sobre las protra, donde lastopográficas tuberancias fuerzas atractivas de la muesson más fuertes, y a aumentar cuando dicha sonda está situada sobre las depresiones. Tal y como sucede en los otros microscopios con sonda de barrido, un mecanismo de retroalimentación responde a los cambios que se producen en el comportamiento de la punta de la sonda variando el voltaje aplicado a un control piezoeléctrico Z con el fin de estabilizar la amplitud de la vibración y, en consecuencia, la separación existente entre la sonda y la superficie de la muestra. Con las fluctuaciones en el voltaje piezoeléctrico se dibuja el perfil de la superficie. Procediendo de este modo, el LFM puede detectar el relieve de la superficie con una precisión del orden de 5 nanómetros (equivalente al espesor de unos 25 átomos), y, dada su capacidad de percibir la topografía de la superficie desde cierta distancia, puede inspeccionar la situación en el interior de grietas profundas y estrechas. Este instrumento es válido, en principio, no sólo para el examen de microcircuito s terminados, sino también para el control de calidad de las superficies de silicio sobre las que se construyen. Habida cuenta del ancho y espesor de las estructuras de los c ircuitos, un sustrato que deje de ser perfectamente liso en una cuantía algo mayor que unos cuantos espesores atómicos puede resultar inaceptable. Por idéntica razón, la densidad cada vez más elevada con que se almacena la información en los discos magnéticos significa que los datos deben escribirse y leerse en una escala más fina, con cabezales menores que se acerquen mucho más a los discos. Para evitar la colisión, tanto los discos como los cabezales tienen que ser tan lisos que deben construirse con una precisión casi atómica. Una variante del LFM , el microscopio de fuerza magnética ( MFM ), nos permite verificar las prestaciones de A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

IA N R

O F I L A C , A R A B R A B . A T S , A M S N A H . K . P

5. CADENAS DE POLIMEROS del aminoácido alanina; forman una estructura rugosa en la placa de un microscopio sobre la que se depositó y evaporó una disolución de dicho polímero. En esta imagen de AFM, obtenida por Paul K. Hansma y su equipo de la Universidad de California, cada protuberancia corresponde a un aminoácido. La imagen muestra una superficie de tres nanómetros de ancho. esos cabezales, que se pueden resumir en la definición, uniformidad e intensidad del campo magnético que producen. En lugar de la aguja de tungsteno o silicio, el MFM está provisto de una sonda imantada de níquel o hierro. Cuando la sonda vibrante se aproxima a una muestra magnética, la punta se ve sometida a una fuerza que cambia su frecuencia de resonancia y, con ello, su amplitud de vibración. El MFM puede perfilar la estructura del campo magnético srcinado por los cabezales de registro de datos con una resolución superior a los 25 nanómetros. Este dispositivo permite también estudiar la estructura de las unidades magnéticas (“bits”) de almacenamiento de datos en los discos y en otros medios, proporcionando información tanto sobre el funcionamiento de los cabezales como sobre la calidad del medio de almacenamiento. ves Martin, David Abraham y yo mismo desarrollamos otra versión especializada del LFM , el microscopio de fuerza electrostática. En este caso, la sonda vibrante posee una carga eléctrica y la amplitud de vibración resulta afectada por las fuerzas electrostáticas que srcinan las cargas de la muestra. Con la ayuda de este microscopio se pueden describir las propiedades eléctricas de los

Y

microcircuitos a muy pequeña escala. Y, así, para modificar las propiedades del silicio, se le suelen añadir pequeñas cantidades de átomos de impurezas, conocidas con el nombre genérico de contaminantes. Estos contaminantes proporcionan electrones, que se mueven con libertad en el seno del silicio, o capturan electrones, que dejan “huecos” cargados positivamente, capaces también de moverse por la red cristalina. La distribución y concentración de los átomos contaminantes desempeñan un papel crítico para el buen funcionamiento de una pastilla (“chip”). Una forma de esquematizar la situación de estos átomos contaminantes consiste en aplicar un voltaje entre la sonda de un microscopio de fuerza electrostática y la superficie de la muestra. El voltaje srcina una migración de los electrones o agujeros de conducción por debajo de la sonda, apareciendo así una región cargada que ejerce una fuerza electrostática sobre dicha sonda. Los movimientos consiguientes de la sonda proporcionan una medición muy precisa a pequeña escala de la carga eléctrica y, en consecuencia, de los electrones o agujeros involucrados y de las correspondientes concentraciones de átomos contaminantes. Los microscopios de fuerza magnética y electrostática son dos de los 19

sistemas con sonda de barrido que se han diseñado para registrar otras propiedades superficiales de los materiales distintas de las meramente topográficas. Está también el microscopio térmico de barrido, que desarrollé en colaboración con Williams. La sonda de este microscopio era quizás el termómetro más fino del mundo, sensible a variaciones de temperatura superficial del orden de la diezmilésima de grado a una escala de decenas de nanómetros. La sonda consistía en un alambre de tungsteno rematado en una punta cuya sección mediría unos 30 nanómetros. Un

LASER

DIVISOR DEL HAZ

CELULA DE BRAGG

cubría la sonda. revestimiento de El otroníquel metal,quedaba níquel, separado del tungsteno por una capa aislante en toda la extensión de la sonda, salvo en su extremo. La unión níquel-tungsteno se comporta como un termopar, generando un voltaje proporcional a su temperatura.

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l microscopio térmico de barrido fue desarrollado en las primeras etapas de nuestra búsqueda de la mejor forma de levantar perfiles de los dispositivos microelectrónicos, antes de la introducción de los AFM GENERA DOR y LFM . En nuestros primeros expeDE RET ROALIMEN rimentos, llevados a cabo en 1985, TACION encontramos que este dispositivo podía servir realmente como una sonda superficial rápida. En primer lugar, se hacía pasar una corriente a través de la punta que calentara la TRANSDUCTOR sonda; cuando la energía desprenPIEZOELECTRICO dida al aire en forma de calor es igual a la energía suministrada en forma de corriente, la temperatura de la MICROPASTILLA punta se estabiliza, alcanzando por regla general un valor de algunos grados por encima de la temperatura del entorno. Cuando la punta calentada se aproxima a una muestra, que por ser un sólido conduce el calor mucho mejor que el aire, la tasa de pérdida de ca lor aumenta. La disminución que experimenta el voltaje en la unión del terCONTROL mopar a consecuencia del enfriaPIEZOELECTRICO miento proporciona una medida de la distancia que separa la punta de la muestra. (Para reducir la sensibili6. EL MICROSCOPIO DE FUERZA DE LASER ofrece una imagen topográfica de una muestra dad del sistema a las fluctuaciones (típicamente un componente microelectrónico) pasando una sonda de tungsteno o silicio a erráticas de la temperatura, lo que una altura de pocos nanómetros sobre la muestra en cuestión. La punta vibra con una fre- hacemos en realidad es conferir una cuencia cercana a su frecuencia de resonancia. Las fuerzas atractivas de van der Waals y vibración a la punta de la sonda de la tensión superficial del agua que condensa entre la sonda y la muestra actúan sobre la son- amplitud menor que el nanómetro, da, modificando su frecuencia de resonancia y reduciendo con ello su amplitud de vibración. con una frecuencia del orden de un La variación de dichas fuerzas y, por tanto, del recorrido de la punta de la sonda responde alkilohertz. El voltaje disminuye cada relieve de la superficie. Una sonda de láser controla la posición de la punta por medio de un vez que la punta se acerca a la mueshaz que se desdobla en dos. Uno de estos haces se refleja en un prisma estacionario; el otro tra y aumenta cuando se separa de atraviesa una célula de Bragg —dispositivo que modifica la frecuencia del haz— y es refle- ella; la amplitud de la fluctuación del jado por la cara posterior de la sonda. Los dos haces se recombinan y su interferencia pro- voltaje aumenta cuando la distancia duce una señal (para la frecuencia de la célula de Bragg) que mide la vibración de la sonda. media que separa la punta vibrante DETEC TOR

N E IK K N A H

PRISMA

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TEMAS 29

de la muestra disminuye.) En consecuencia, la pérdida de calor revela los detalles de la topografía de la superficie de dicha muestra conforme la sonda la va barriendo, de forma análoga a como sucede en el caso de la corriente de efecto túnel, la repulsión interatómica o las atracciones de van der Waals en los otros modelos de microscopios con sondas de barrido.

Y V E L E R R IE P

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l proceso de fabricación no permitía obtener sondas termopares cuyas dimensiones bajasen más allá de los 30 nanómetros, lo cual limitaba el poder de resolución de los microsLF M ,de rición del copios térmicos cuya barrido. resolución La apaes mucho mayor, desvió la sonda térmica hacia otros usos más especializados. Con esa sonda se pueden obtener imágenes que muestren las variaciones de temperatura en las células vivas, proporcionando así datos sobre los mecanismos del metabolismo; puede medir el flujo de una pequeña corriente de líquido o gas mediante el control de las pérdidas de calor que se producen cuando la punta de la sonda se calienta y se coloca en el seno de dicha corriente. Posibilita también la utilización de una técnica analítica conocida por espectroscopía de absorción fototérmica, con un nivel de resolución sin precedentes. La espectroscopía de absorción fototérmica se basa en el hecho de que cada elemento absorbe luz con mayor eficiencia a una longitud de onda específica. El procedimiento consiste en enviar un haz de láser de longitud de onda variable sobre la muestra en estudio. Se toma la temperatura de la muestra conforme se va variando la longitud de onda del láser; una brusca elevación de temperatura

7. RUGOSIDADES NANOMETRICAS en un surco grabado en una superficie de silicio de una micra de anchura. Pierre Levy, que trabajaba entonces en el centro de investigación de la compañía IBM en Yorktown Heights, obtuvo esta imagen utilizando un microscopio de fuerza de láser, instrumento capaz de reproducir los perfiles topográficos de una superficie a pequeña y a gran escala. con una determinada longitud de onda pone de manifiesto la mayor eficiencia de la absorción. Una “huella dactilar” completa de las longitudes de onda de absorción puede revelar la composición de la muestra. La sonda

térmica abría el camino de la espectroscopía a pequeña escala, la posibilidad de cartografiar a pequeña escala las variaciones en la composición superficial. Mi grupo incrementó aún más la

M IB E D N O S T A W . J S A M O H T I.

. C , IN T R A

M S E V Y

8. UNIDADES MAGNETICAS O “BITS” de una micra o dos de diámetro: aparecen en forma de cráteres en estas imágenes obtenidas con un microscopio de fuerza magnética, un microscopio de fuerza de láser equipado con una sonda imantada de hierro o níquel, sensible a los gradientes de fuerza magnética. Los “bits”, que almacenan información en discos magnetoópticos, se forman exponiendo un disco a un campo magnético al mismo tiempo que un láser altamente A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

localizado calienta la superficie, permitiendo de este modo que los dominios magnéticos de la región calentada se reorienten. En estas imágenes, obtenidas por Yves Martin en el centro de investigación Thomas J. Watson de IBM en Yorktown Heights, se puede comparar la estructura magnética de un “bit” normalizquierda ( ) con la de otro producido con un láser de baja potencia centro ( ) y con un campo magnético muy débil. 21

se realiza una serie de barridos sucesivos sobre una superficie, al tiempo que un interferómetro de láser mide la deflexión del brazo de la lámina. Utilizando esta técnica, los investigadores consiguieron calibrar —por poner un caso— la resistencia que ofrecen las irregularidades atómicas de una superficie de grafito. Su intención era llegar a determinar de este modo la forma en que ese rozamiento afectaba a las propiedades macroscópicas de los materiales.

N E IK K N A H

CONTROL PIEZOELECTRICO

TUNGSTENO ELECTRONICA NIQUEL

AISLANTE

MICROPASTILLA

9. SONDAS TERMICAS que registran variaciones de temperatura de hasta la diezmilésima de grado en una escala de decenas de nanómetros. La sonda está constituida por un núcleo de tungsteno recubierto de níquel, pero aislado del mismo en toda su extensión salvo en su punta de 30 nanómetros de espesor. Allí se unen estos dos metales para formar un termopar que genera un voltaje proporcional a su temperatura. Este dispositivo puede cartografiar el relieve de una superficie detectando las variaciones en la pérdida de calor desde la sonda caliente hacia la muestra que va peinando. resolución que permite esta técnica: hasta el nivel de los átomos individuales. Para alcanzar este objetivo, prescindimos del termopar, volviendo a la punta de tungsteno desnuda, puntiaguda a escala atómica, propia del STM . Esta punta representa el papel de uno de los dos metales de un termopar; el otro lo es la propia muestra (si se trata de un metal) o un electrodo de metal sobre el que se deposita dicha muestra. Al principio, el instrumento opera de forma análoga al microscopio de efecto túnel. Se establece una diferencia de potencial entre la punta de la sonda y el metal y se va acercando la punta hacia la superficie, hasta que empieza a circular una corriente por efecto túnel. A continuación, se interrumpe la corriente y se calienta la superficie con la ayuda del láser de longitud de onda variable. El pequeño termopar formado por la superficie calentada y la sonda (que se calienta como con22

secuencia de su proximidad a la superficie) genera un voltaje cuyo valor es proporcional a su temperatura. A su vez, el valor de la temperatura indica cuánta energía se ha absorbido por el átomo sobre el que se encuentra la sonda. La absorción puede ser registrada átomo por átomo para cada longitud de onda del láser, lo cual permite discriminar la composición de la muestra con la más elevada resolución. La mera enumeración de esos avances que se consiguieron en mi laboratorio basta para hacerse una idea de la extraordinaria versatilidad de la técnica de las sondas de barrido. En otros centros se desarrollaron más variantes de esta misma técnica. Gary McClelland y sus colaboradores del centro de investigación Almadén de IBM en San José, California, han modificado el AFM con el fin de poder medir la fricción a escala atómica. Con la punta de la sonda de un AFM

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ntretanto, el grupo de Hansma había desarrollado un microsco-

( SICM pio de),barrido que barre de una conductancia muestra no iónica con una punta de metal o diamante, sino con una micropipeta de vidrio que contiene un pequeño electrodo. Los investigadores sumergen la muestra y la pipeta en un baño electrolítico (verbigracia, una solución salina) y establecen una diferencia de potencial entre el electrodo de la pipeta y otro electrodo del baño. Una corriente de iones tiende a fluir entre los electrodos a través de la abertura de la pipeta, pero cuando la pipeta se acerca a la superficie de la muestra, la corriente se hace más débil. La corriente se anula cuando la pipeta de barrido toca la muestra, dado que este hecho produce la obturación de su abertura. Equipado con un mecanismo de retroalime ntación que mantiene una corriente iónica constante a través de la abertura de la pipeta, el SICM perfila la topografía de una muestra. El tamaño de la abertura de la pipeta limita la resolución del SICM hasta unas 0,2 micras (podría incluso llegarse a los 10 nanómetros). Este dispositivo resulta más indicado para algunas tareas específicas, como puede ser el estudio del comportamiento eléctrico de una célula viva. Cuando se estimula una célula, los canales iónicos de su membrana se abren y se cierran, facilitando el paso de pequeñas corrientes de iones por los mismos. Otro dispositivo de barrido con micropipeta representa lo que podríamos considerar un retorno a los orígenes de la microscopía de barrido de campo próximo. Hace ya más de cuarenta años, O’Keefe concibió la estrategia con la que superar la barrera de Abbe y mejorar el poder de resolución de los microscopios ópticos; pero en aquel tiempo no existía la técnica necesaria para peinar una muestra con la precisión de una fracción de la longitud de onda. Los controles con una precisión del orden del TEMAS 29

nanómetro, una innovación adelantada por el STM , abrieron el camino para construir el microscopio óptico de elevado poder de resolución con el que soñaba O’Keefe. Dos grupos de trabajo, uno dirigido por Dieter Pohl, de IBM de Zurich, y el otro por Michael Isaacson, de la Universidad de Cornell, diseñaron microscopios ópticos de barrido de campo próximo. Se ilumina una de las caras de una muestra muy delgada; la otra cara se barre con una micropipeta cuyas paredes están recubiertas por una lámina de aluminio opaca. Un fotodiodo situado en el gida porde extremo lalapunta. pipeta Así mideobtuvieron la luz recomicrofotografías de luz transmitida con una resolución (limitada por el diámetro de la pipeta) del orden de 50 nanómetros, es decir, la décima parte de una longitud de onda. La utilización de pipetas todavía más delgadas puede proporcionar una resolución de 10 nanómetros, multiplicando por 25 la que proporcionan los mejores microscopios ópticos al uso. Lejos de reemplazar a la microscopía óptica, la tecnología con sonda de barrido extiende sus posibilidades. Los microscopistas están ahora en disposición de transferir los refinamientos de los últimos 100 años —técnicas para reforzar el contraste y poner de manifiesto ciertas características específicas, tales como el contraste de polarización, la inmunofluorescencia y el contraste de fase— a la microscopía óptica de barrido de campo cercano. Gracias a los microscopios con sonda de barrido podemos “entrar” en el reino diminuto, nanométrico, de moléculas y microcircuitos. Aplicada esa misma técnica a la microscopía óptica, nos asomamos a ese mundo sutil en los términos familiares de luz, sombras y colores.

BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA VACUUM TUNNELING: A NEW TECHNIQUE FOR M ICROSCOPY . Calvin F. Quate en Physics Today, vol. 39, n. o 8, págs. 26-33; agosto de 1986. TIP TECHNIQUES FOR MICROCHARACTERI ZATION ATERIALS . Y. Martin, C.enC. WilliamsOFyMH. K. Wickramasinghe

Scanning Microscopy, vol. 2, n.o 1, pági-

nas 3-8; marzo de 1988. SCANNING TUNNELING MICROSCOPY AND ATOMIC FORCE MICROSCOPY : APPLICATION TO BIOLOGY AND TECHNOLOGY. P. K. Hansma, V. B. Elings, O. Marti y C. E. Bracker en Science, vol. 242, n.o 4876, págs. 209-216; 14 de octubre de 1988.

A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

COLABORADORES DE ESTE NUMERO Asesoramiento y traducción:

José M.ª Vidal: El microscopio acústico; Amando García: Microscopios con sonda de barrido; Rodolfo Miranda: El microscopio de efecto túnel y Microscopios de rayos X; Luis Bou: Microscopía confocal; J. Myro y A Menéndez: Técnicas de microfotografía; José M.ª Valderas Martínez: Camillo Golgi y la reacción negra ; R. Martínez Murillo: Las primeras observaciones; Esteban Santiago: Representación visual de embriones humanos.

Portada:D. Keller

INVESTIGACION Y CIENCIA DIIRECTOR GENERAL José M.ª Valderas Gallardo DIRECTORA FINANCIERA Pilar Bronchal Garfella EDICIONES a CruzCampos PRODUCCIÓNJuan M.Pedro Iglesias Gómez Capón

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El microscopio de efecto túnel Este tipo de microscopio revela las estructuras de las superficies átomo a átomo. Lo describían en Investigación y Ciencia sus propios creadores. Un año después —en 1986— recibían el premio Nobel de física Gerd Binnig y Heinrich Rohrer

“L

a superficie fue inventada por el diablo”, decía el ilustre físico Wolfgang Pauli. La frustración de Pauli se basaba en el hecho de que la superficie de un sólido representa la frontera entre éste y el mundo exterior. Mientras un átomo del interior de un sólido está totalmente rodeado por otros átomos, uno de la superficie puede interaccionar con otros átomos de la misma, o con los que estén inmediatamente debajo de ésta. Por tanto, las propiedades de la superficie de un sólido difieren radicalmente de las del interior. Así, los átomos de la superficie a menudo se colocan en una ordenación geométrica diferente de las de los otros átomos del sólido para minimizar la energía total del sistema. En virtud de este tipo de procesos, las estructuras superficiales poseen tal complejidad que han resistido hasta ahora una descripción teórica y experimental suficientemente precisa. En el laboratorio de investigación de IBM en Zurich hemos desarrollado un instrumento que hace posible caracterizar cuantitativamente las complejidades de las superficies: el microscopio de efecto túnel. Nuestro microscopio permite “ver” los átomos de la superficie uno a uno. Puede incluso resolver estructuras que tienen sólo una centésima parte del tamaño del átomo. Una herramienta así tiene aplicaciones importantes, por ejemplo, en la industria microelectrónica. Al disminuir el tamaño de la pastilla (“chip”) de silicio —que es el elemento clave en la arquitectura de los computadores— aumenta rápidamente su área superficial en relación a su volumen. Por tanto, la superficie adquiere creciente importancia en la operación de la pastilla y en sus interacciones con otros ele24

mentos lógicos. El microscopio de efecto túnel probablemente contribuirá también a la comprensión de otros fenómenos físicos, químicos y biológicos. La microscopía de efecto túnel es el producto de una larga evolución. Se acepta que la microscopía comenzó en el siglo XV cuando se hicieron lentes de aumento para observar insectos. A finales del siglo XVII , Antony van Leeuwenhoek desarrolló el microscopio óptico, que reveló la existencia de células, agentes patógenos y bacterias. Aunque la microscopía óptica se ha desarrollado hasta convertirse en una técnica refinada y versátil, tiene un límite físico: el microscopio óptico no puede resolver estructuras atómicas. La razón es que la longitud de onda promedio de la luz visible es unas 2000 veces mayor que el diámetro típico de un átomo, que es del orden de unos tres angstrom. (El angstrom es una unidad de longitud igual a una diez mil millonésima de metro, 1 Å = 10 –10 m). En otras palabras, intentar visualizar estructuras atómicas con luz visible es co mo pretender descubrir grietas del tamaño de un cabello en una pista de tenis tirando pelotas sobre su superficie y observando su deflexión.

La primera exploración con éxito de estructuras atómicas surgió de un descubrimiento básico de la mecánica cuántica: la luz y otras clases de energía exhiben características tanto de partículas como de ondas. En 1927, Clinton J. Davisson y Lester H. Germer, de los laboratorios de la Bell Telephone, confirmaron la naturaleza ondulatoria del electrón. Encontraron, asimismo, que un electrón de alta energía tenía una longitud de onda más corta que un electrón de baja energía. Un electrón de suficiente energía presentaría, pues, una longitud de onda comparable al diámetro de un átomo. Este hecho condujo a la invención del microscopio electrónico. Con microscopía electrónica se han observado proyecciones de filas de átomos e incluso orbitales atómicos en delgadas películas cristalinas.

¿P

or qué inventar otro tipo de microscopio, si el electrónico tiene tan alto poder de resolución? La razón para ello es que la microscopía electrónica, si bien ha demostrado ser fructífera para observar estructuras de volumen en materiales cristalinos, no puede resolver estructuras superficiales excepto en circunstancias muy especiales. Un electrón de

1. EL MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL tiene dos secciones, suspendidas de muelles, que anidan dentro de un armazón cilíndrico de acero inoxidable. La sección interior contiene el mecanismo del microscopio. Si se desea producir imágenes de alta resolución de las estructuras superficiales, el microscopio debe ser apantallado de las pequeñas vibraciones provocadas por los pasos de las personas o por el sonido. Los imanes (sujetos al fondo del armazón de acero inoxidable) y las placas de cobre (adheridas al fondo de las secciones externa e interna) amortiguan las vibraciones. Cualquier perturbación hace que las placas se muevan hacia arriba y hacia abajo en el campo magnético generado por los imanes. El movimiento produce corrientes inducidas en las placas. La interacción entre las corrientes inducidas y el campo magnético frena el movimiento de las placas y, por tanto, el de las dos secciones del microscopio. Para el trabajo en vacío se coloca una campana de acero sobre el armazón exterior del microscopio. TEMAS 29

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alta energía penetra profundamente en la materia y apenas si revela pormenor alguno de la estructura superficial. Un electrón de baja energía se mueve lentamente y lo desvían con facilidad los campos eléctricos o magnéticos de la muestra. En los años cincuenta, Edwin W. Müller daba un gran paso adelante con su invención del microscopio iónico de emisión de campo, un instrumento altamente sensible a las superficies. Por desgracia, su campo de aplicación es muy limitado. La muestra que se desea estudiar debe tallarse como una fina

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Y G I N IN B D R E G

PLACA PIEZOELECTRICA

SUJECIONES ELECTROSTATICAS MUESTRA PUNTA

TRIPODE (HECHO DE BARRAS PIEZOELECTRICAS)

E L O P R O W N A I

FUENTE DE VOLTAJE PARA LAS BARRAS PIEZOELECTRICAS

debe ser, aguja de también, pocos angstrom estable de frente radio a los y elevados campos eléctricos característicos de la técnica. El principio de operación del microscopio de efecto túnel permite obviar estas dificultades. La principal diferencia entre el microscopio de efecto túnel y todos los demás es que no utiliza partículas libres; en consecuencia, no se necesitan lentes ni fuentes especiales de electrones o fotones. Su única fuente de radiación son los electrones ligados que ya existen en la muestra sometida a investigación. Para comprender este principio imaginemos que los electrones ligados a la superficie de la muestra son análogos al agua de un lago. Del mismo modo que parte del agua se filtra al terreno circundante formando corrientes subterráneas, algunos electrones de la superficie de la muestra se “fugan” de ésta y srcinan una nube electrónica alrededor de la muestra. De acuerdo con la física clásica, esta nube no podría existir porque la reflexión en los límites de las superficies confina las partículas dentro de ellas. Sin embargo, esto no es cierto en mecánica cuántica, donde cada electró n se comporta como una onda: su posición no está bien definida, se “difumina”. Se explica así la existencia de electrones allende la superficie de la materia. La probabilidad de encontrar un electrón decae rápidamente —de una manera exponencial— con la distancia de la superficie. Este efecto se conoce tradicionalmente como “efecto túnel” ya que los electrones parecen estar cavando túneles más allá de su frontera clásica.

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a primera verificación experi2. CONSTA EL DISPOSITIVO DEL MICROSCOPIO de una muestra y una aguja para barrer la mental del efecto túnel fue llesuperficie. Materiales piezoeléctricos, que se expanden o contraen al aplicarles voltaje, per- vada a cabo hace un cuarto de siglo miten que el dispositivo resuelva estructuras que tienen tan sólo una centésima parte del ta-por Ivar Giaever, de la General Elecmaño de un átomo. Un portamuestras piezoeléctrico acomoda la muestra sobre una placa tric Company. Para ello colocó una metálica horizontal. Un trípode piezoeléctrico barre la punta sobre la superficie de la mues- capa aislante, rígida y delgada, sepatra, simultaneando alta estabilidad y precisión. rando dos placas metálicas llamadas

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TEMAS 29

electrodos. La distancia entre los electrodos era lo suficientemente pequeña como para que las nubes electrónicas asociadas a ellos se solaparan ligeramente. Una diferencia de potencial entre los electrodos —inducida por un voltaje aplicado— hace que algunos electrones fluyan de un electrodo a otro a través del solapamiento entre las nubes de carga. Este flujo equivale al flujo de agua subterránea entre dos lagos adyacentes cuando uno está más alto que otro. Hemos construido el microscopio de efecto túnel haciendo algunos cambios básicos en la típica configuraplazamos ción de túnel. unoEndeprimer los electrodos lugar, reempor la muestra que queremos investigar. A continuación, sustituimos el otro electrodo por una punta afilada como una aguja. Y finalmente reemplazamos la capa aislante rígida por otro aislante, no rígido, un líquido, un gas o el vacío, por ejemplo, de modo que fuera posible desplazar la punta de la aguja sobre los contornos de la superficie de la muestra. Para barrer la superficie empujamos la punta hacia la muestra hasta que las nubes electrónicas respectivas se tocan suavemente. La aplicación de un voltaje entre la punta y la muestra induce que los electrones pasen de una a otra a través de un estrecho canal en las nubes electrónicas. Este flujo se llama corriente de túnel. Como la densidad de una nube electrónica decae exponencialmente con la distancia, la corriente de túnel es sumamente sensible a la distancia entre la punta y la superficie. Un cambio en la distancia en una cantidad igual al diámetro de un solo átomo hace disminuir la corriente de túnel en un factor de 1000.

A

sí pues, nos es dado explotar la sensibilidad de la corriente túnel para realizar mediciones precisas de la posición vertical de los átomos de la superficie de la muestra. Mientras la punta va barriendo la superficie, un mecanismo electrónico de realimentación mide la corriente de túnel y mantiene la punta a distancia constante sobre los átomos de la superficie. De este modo, la punta sigue los contornos de la superficie. El movimiento de la punta es leído y procesado por un computador y aparece en una pantalla o en un registrador. Se obtiene una imagen tridimensional de la superficie obligando a que la punta barra un conjunto de líneas paralelas entre sí. Una distancia de 10 centímetros en la imagen viene a representar una distancia de 10 angsA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

ELECTRONICA

PANTALLA DEL COMPUTADOR

PUNTA MOVIL

NUBE ELECTRONICA E L O P R O W N IA

SUPERFICIE DE LA MUESTRA

3. EN EL EFECTO TUNEL DE ELECTRONES está basada la operación del microscopio. Una nube electrónica ocupa el espacio entre la superficie de la muestra y la punta de la aguja (abajo). La nube es consecuencia de la indeterminación en la localización del electrón (un resultado de sus propiedades ondulatorias); hay una probabilidad no nula de encontrar al electrón más allá de la frontera superficial de un conductor ya que el electrón está difuminado. La densidad de la nube electrónica disminuye exponencialmente con la distan cia. Un flujo de electrones a través de la nube, inducid o por una diferencia de potencial, es, por tanto, extremadamente sensible a la distancia entre la superficie y la punta. Al barrer esta última la superficie, un mecanismo de realimentación mide el flujo de electrones (llamado la corriente túnel) y mantiene constante la altura de la punta por encima de los átomos de la superficie (arriba). De este modo, la punta sigue los contornos de la superficie. El movimiento de la punta se lee y procesa por un ordenador y aparece en una pantalla o en un registrador. Barriendo con la punta un conjunto de líneas paralelas se obtiene una imagen tridimensional de alta resolución de la superficie examinada. trom en la superficie. Se ha conseguido un aumento de 100 millones. ¿Cómo es posible mover la punta sobre la muestra manteniendo constante la distancia entre ella y la superficie, que es de menos de 10 angstrom, con una estabilidad y precisión superior a los 0,1 angstrom? En primer lugar, el microscopio debe ser apantallado de las vibraciones externas, como las causadas por el sonido en el aire o por la gente que anda por el edificio. En segundo lugar, los movimientos de la punta deben ser muy precisos. Y, por último, la punta será tan afilada cuanto lo permitan los límites de rigidez y estabilidad. Dos etapas, o secciones, suspendidas de unos muelles, anidan en el armazón de acero inoxidable del microscopio y protegen de las vibraciones la distancia de túnel. Ambas

etapas —de sección triangular— están hechas de barras de vidrio. La segunda sección se desliza en el interior de la primera, de la cual está suspendida mediante tres muelles. A su vez, la primera etapa está suspendida del armazón exterior también mediante tres muelles. La segunda sección lleva el corazón del microscopio: la muestra y el dispositivo de barrido de la punta. Cuando el conjunto del microscopio está en vacío, la resistencia al movimiento es mínima y ambas etapas de suspensión podrían oscilar casi indefinidamente bajo cualquier perturbación. El fenómeno del amortiguamiento por corrientes de Foucault es lo que utilizamos para detener este movimiento. Para ello, se colocan unas placas de cobre en la parte inferior de ambas secciones que se deslizan entre 27

unos imanes permanentes y sujetos al armazón exterior. Al deslizarse las placas arriba o abajo, el campo magnético hace que los electrones de conducción del cobre se muevan induciendo las llamadas corrientes de Foucault. La interacción entre las corrientes inducidas y el campo magnético frena el movimiento de las placas y protege, por tanto, el microscopio hasta de las vibraciones más pequeñas. Una vez eliminadas las vibraciones externas, se acomoda la muestra. Nos servimos para ello de un dispositivo especialmente desarrollado que trans-

taje al cuerpo del piezoeléctrico, que así se contrae. Los otros dos pies se moverán ligeramente. A continuación, fijamos las otras dos patas, soltamos la tercera y quitamos el potencial aplicado de suerte que el cuerpo se estire de nuevo hasta su tamaño srcinal. El portamuestras se ha movido justamente un paso. El tamaño del paso se puede regular entre 100 y 1000 angstrom. El portamuestras caminará a lo largo de la placa en la dirección deseada, ya que puede girar alrededor de cualquiera de sus patas. Cuando el portamuestras ha llevado la muestra hasta la posición de

lución vertical obtenida hoy sobre la superficie de la muestra queda limitada sólo por las vibraciones. En el momento actual esta resolución se halla en el rango de contadas centésimas de angstrom.

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metálica porta la muestra horizontal a través situada de una en laplaca segunda etapa. El cuerpo del portamuestras consiste en una lámina de material piezoeléctrico que se expande o se contrae al aplicarle un voltaje. El portamuestras posee tres pies metálicos, dispuestos en un triángulo, que están recubiertos de una capa delgada de material aislante. Los pies pueden fijarse a la placa metálica aplicando un voltaje entre ellos y ésta. Movemos el portamuestras de la manera que a continuación detallamos. Supongamos, por ejemplo, que fijamos sólo un pie y aplicamos un vol-

la superficie túnel elegida,deempezamos la muestra.a Para barrer mover la punta de la aguja de barrido se emplea un trípode rígido hecho de tres barras de material piezoeléctrico. Cuando aplicamos un voltaje para expandir o contraer una de las barritas, las otras dos se tuercen ligeramente. En consecuencia, la punta se mueve en línea recta distancias de hasta 10.000 angstrom. Más aún, el movimiento es muy sensible a la magnitud del voltaje aplicado: un voltaje de 0,1 volt produce un movimiento de 1,0 angstrom. La precisión del movimiento del trípode es finísima, hasta el extremo de que la reso-

tungsteno. Ahora bien, si se desea una resolución lateral de dos angstrom, la aguja debe tener un solo átomo al final de la punta. Normalmente ese átomo viene de la misma muestra. Lo desplazan de ella altos campos eléctricos producidos al aplicar una diferencia de potencial de entre 2 y 10 volt entre la muestra y la punta. La suerte desempeña un papel importante en este paso final y por eso estamos intentando afilar la punta mediante bombardeo con un haz de iones de alta energía. Así se pueden eliminar átomos de la superficie de un modo muy controlado.

a resolución lateral del microscopio está limitada por lo afilada que sea la punta. Con respecto a esto, la naturaleza ha sido generosa con el microscopio túnel. Es relativamente fácil hacer una punta afilada que nos dé una resolución lateral de 6 a 12 angstrom: sólo hace falta pulir la punta de una aguja, normalmente de

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4. SUPERFICIE DE SILICIO visualizada por el microscopio de efecto túnel; consiste en un conj unto de celdas unidad de forma romboidal. Cada celda mide 27 angstrom (un angstrom es una diezmilmillonésima de m etro, 1 Å = 10 –10 m) de lado. La celda se llama 7 por 7 porque cada lado mide siete distancias atómicas. Cada 7 por 7 con28

tiene 12 protuberancias en dos grupos de seis. Las protuberancias parecen corresponder a las superficies de los átomos individuales. Se elevan 1,3 angstrom sobre el resto. La imagen se obtuvo aplicando un voltaje para que los electrones pasaran de la punta a la superficie. TEMAS 29

Además de delinear la topografía atómica de la superficie, el microscopio de efecto túnel revela la composición atómica. La corriente de túnel depende de la distancia de túnel y de la estructura electrónica de la superficie. Ahora bien, cada elemento atómico posee una estructura electrónica característica. La capacidad del microscopio para resolver tanto la topografía como la estructura electrónica lo hace útil para la investigación en física, química o biología. Estudiamos en primer lugar un caso simple: las estructuras topográficas de monocristales superficial homogénea. caracterizados por unaLos estructura cristales constan de capas atómicas idénticas que se apilan ordenadamente unas sobre otras. Resultados de experimentos de difusión de electrones o átomos indicaban que la capa superior difería de las otras y era más compleja, pero resultaba difícil determinar la estructura detallada de esta capa superficial. La estructura de superficie más conocida es la celda unidad de silicio. La celda unidad tiene forma de rombo; cada borde de la celda mide siete distancias atómicas, por lo que la celda se denomina 7 por 7. Cada 7 por 7 contiene 12 protuberancias, que no se habían visualizado antes. Cada protuberancia corresponde manifiestamente a un solo átomo. Aunque de estética agradable, la disposición de los átomos de la superficie reviste suma complejidad. En cambio, las estructuras de las capas interiores del silicio son relativamente simples. Su celda unidad es 49 veces menor que la 7 por 7 y contiene sólo dos átomos. Otra diferencia radica en el hecho de que la capa superficial es mucho más rugosa que cualquier capa del volumen. Aunque ahora se conoce la estructura superficial y ha sido posible obtener una gran cantidad de información sobre ella a través de otros experimentos, se ignora por qué razón la superficie forma esta estructura y no otra cualquiera. Otro cristal cuya superficie se comprende ahora mejor es el de oro. Hemos encontrado que, al cortar el cristal en una dirección paralela a sus capas atómicas, la cara resultante es plana. En cambio, un corte en una dirección diagonal a las capas atómicas produce una superficie más rugosa. Así como el estudio actual de la corteza terrestre nos ayuda a comprender que ésta se formó hace millones de años, el estudio de las superficies nos permite entender cómo se modificaron desde que se cortaran. Las teorías actuales A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

R E R H O R H C I R IN E H Y IG N N I B D R E G

20

] 1 0 0 [ M O R T S G N A

10

0

0

10

20 ANGSTROM [110] [110]

Z [001]

[110] Y [010] X

[100] [001]

M O R T S G N A ,5 3 E L O P R O W N A I

OM GSTR 5,0 AN

5. OXIGENO ADSORBIDO en níquelarriba ( ) observado en escala atómica. Los átomos de oxígeotra(color no [11-0].) El están modelo separados del cristal 3,5 de angstrom níquel cúbico en unacentrado dirección,enllamada lascaras[001], (abajoy) 0,5 sugiere angstrom la razón en la para ello. La geometría del modelo predice que si la distancia entre dos átomos de níquel- contiguos a lo largo de la dirección [001] es de 3,5 Å el espaciado a lo largo de la dirección [110] será de 2,5 Å. Sin embargo, larepulsión electrónica entre dos átomos de oxígeno es demasiado grande para permitirles permanecer establemente en puntos de la red separados- tan sólo 2,5 angstrom. Por tanto, los átomos de oxígeno que caigan a lo largo de la dirección 0][11distarán entre sí, por lo menos, dos veces el parámetro de red, lo que corresponde a la distancia observada de 5,0 angstrom. A veces se observan separaciones de cinco veces el parámetro de red, pero nunca de tres o cuatro veces. Habrá que investigar la causa de esta anomalía. 29

predicen que la superficie cortada diagonalmente adquiere una estructura dentada porque esa configuración tiene una energía menor que la configuración plana y, consecuentemente, es más estable.

ra 5 ).

U

na rama más exótica de la física, el estudio de la superconductividad, se ha beneficiado también de la aplicación de la microscopía de efecto túnel. El material superconductor se caracteriza por su completa falta de resistencia eléctrica. El uso de cables superconductores libres de pérdidas por calentamiento ahorra-

dos por debajo de una temperatura crítica, unos pocos grados por encima del cero absoluto (–273,15 grados centígrados). Un grupo de investigadores de la Universidad de Stanford, dirigidos por Calvin F. Quate, ha desarrollado un microscopio de efecto túnel que opera a bajas temperaturas. Usaron su microscopio para visualizar la estructura electrónica de las superficies de varios conductores a temperatura ambiente. Enfriaron luego los conductores por debajo de la temperatura crítica de cada uno y estudiaron los cambios en su estructura

Nuestras observaciones confirman resultados previos de experimentos de difusión: la distancia entre los átomos de oxígeno adsorbidos sobre la superficie del níquel varía con la dirección. En particular, los átomos de oxígeno que e stán a lo largo de una cierta dirección, llamada [001], están separados por una distancia igual al parámetro de red; esto es, la distancia entre dos átomos de níquel contiguos a lo largo de esa dirección. En cambio, los átomos de oxígeno a lo largo de la dirección - perpendicular, llamada [11 0], están separados dos o cinco parámetros de

eléctrica. ría cantidades Así, por enormes ejemplo, deelenergía acelerador para la colisión de haces de partículas del Fermilab utiliza imanes superconductores para alcanzar elevados campos magnéticos ahorrando energía. Hay un inconveniente, sin embargo. Se sabe que la superconductividad sólo ocurre en algunos conductores cuando han sido enfria-

sentar pruebas electrónica. Esteexperimentales grupo puede predel crecimiento de las regiones superconductoras en las superficies. El microscopio de efecto túnel ha posibilitado una comprensión más detallada de ciertas reacciones químicas. Nuestro grupo ha observado en una escala atómica la adsorción de oxígeno en níquel ( véase la figu-

Sospechamos red, pero nunca queuno, estatres anomalía o cuatro. la causa algún tipo de efecto de apantallamiento entre las cargas eléctricas del níquel y del oxígeno, pero se requiere una investigación exhaustiva para determinar los detalles de la interacción real. Todas las aplicaciones que hemos examinado hasta ahora se basan en

R E R H O R H IC R N I E H

6. EL COLLAR DEL VIRUS Ø 29 conecta la cabeza del microorganismo a su cola. Gracias a micrografías electrónicas sin procesar como ésta ofrecida aquí, se ha logrado poner de manifiesto la es30

tructura de l collar. E l conocimie nto detal lado de dic ha estruct ura resulta decisivo para controlar la propagación de ciertas infecciones víricas. TEMAS 29

la capacidad del microscopio para detectar estructuras cuyas dimensiones se miden en fracciones de angstrom. Tan alta resolución no siempre es necesaria. Hay algunos campos de investigación donde, si bien la resolución del microscopio de efecto túnel sea tan sólo de algunas decenas de angstrom, podemos esperar, en virtud de resultados ya obtenidos, que su uso producirá información nueva y valiosa y estimulará progresos significativos. En particular, para muchas aplicaciones, la posibilidad de operar el microscopio de efecto túnel en aire a presión atmosférica com-

En un esfuerzo cooperativo con los físicos españoles Arturo Baró, Nicolás García y Rodolfo Miranda, de la Universidad Autónoma de Madrid, y el biólogo José L. Carrascosa, del Centro de Biología Molecular, hemos confirmado que la cabeza del virus conocido como Ø 29 mide 400 300 200 angstrom. Ha quedado desvelada la estructura de la conexión entre la cabeza y la cola del virus, llamada collar, que parece desempeñar un papel significativo en el proceso de infección. El resultado está de acuerdo con lo que se conocía a partir de microfotografías de microscopio electrónico procesadas.

pensará lución que conhubiere. creces la pérdida de reso-

punta Además de sondeo de producir serviráimágenes, para com- la probar circuitos electrónicos. En efecto, las sondas que verifican los componentes electrónicos deben ser miniaturizadas al mismo ritmo que los propios componentes. La punta puede valer de sonda local del voltaje así como de fuente de corriente. En todas las aplicaciones descritas es vital que el proceso de obtención de la imagen no destruya ni altere el objeto. Pero el microscopio de efecto túnel promete también ser una herramienta para estimular procesos químicos específicos. Una de las características notables del microscopio es poseer un haz de electrones de baja energía extremadamente bien focalizado: su corriente túnel. La energía del haz puede estar precisamente en el rango de energías de la mayoría de los procesos químicos. Por tanto, ajustando el haz a energías específicas, los investigadores pueden provocar a voluntad ciertas reacciones. Este modo de operación del microscopio y las otras capacidades del instrumento parecen abrir una gama de posibilidades de investigación completamente nueva.

U

na de estas aplicaciones se encuentra en el estudio de la fricción. Para minimizar las pérdidas de energía asociadas al rozamiento, los investigadores están interesados en conocer mejor la estructura y las causas de la rugosidad superficial del material industrial. Recientes estudios sugieren que el microscopio de efecto túnel resulta especialmente adecuado para este tipo de trabajo. Nuestro microscopio ha demostrado también su utilidad en biología, aunque sólo alcance hoy resoluciones laterales de unos 10 angstrom. Este es otro caso en que la relativamente baja resolución del microscopio queda más que compensada por su capacidad para suministrar un método directo y no destructivo de visualizar muestras biológicas. Otros microscopios destruyen parcialmente las muestras enfocadas. Así, en microscopía electrónica convencional, las muestras deben recubrirse con una delgada capa metálica y, ya que se estudian en vacío, se secan. Este proceso podría alterar las muestras de un modo indeseable —e incontrolable— pues las moléculas de agua constituyen parte esencial de las substancias biológicas. En el microscopio de efecto túnel puede incluso usarse agua como barrera aislante entre la muestra y la aguja de sondeo. (El agua es un conductor relativamente pobre, a no ser que contenga iones como los que se forman cuando se disuelve cloruro sódico en ella.) Explotando la sensibilidad del microscopio de efecto túnel hemos barrido la superficie del ácido nucleico ADN con la ayuda de E. Courtens, del laboratorio de investigación de IBM en Zurich, y de H. Gross y J. Sogo, del Instituto Politécnico Federal. Hemos observado una serie de zigzags correspondiente a la estructura helicoidal del ADN. A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

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BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA ENERGY GAP IN SUPERCONDUCTORS MEASURED BY E LECTRON T UNNELING . Ivar Giaever en Physical Review Letters, volumen 5, n.o 4, págs. 147-148; 15 de agosto de 1960. (111) F ACETS AS THE ORIGIN OF RECON STRUCTED AU(110) SURFACES. G. Binnig, H. Rohrer, Ch. Gerber y E. Weibel en Surface Science, vol. 131. n. o 1, págs. L379384; agosto, 1983. REAL-SPACE OBSERVATION OF 2 X 1 STRUCTURE OF C HEMISORBED O XY GE N ON NI(110) BY SCANNING TUNNELING MICROSCOPY . A. M. Baró, G. Binnig, 11. Rohrer, Ch. Gerber, E. Stoll, A. Baratoff y F. Salvan en Physical Review Letters, vol. 52, n.o 15, págs. 1304-1307; 9 de abril de 1984.

31

Microscopía confocal Esta técnica microscópica no tiene rival para la producción de imágenes nítidas, sean planas o en tres dimensiones Jeff W. Lichtman

M

arvin Minsky es el padre de la inteligencia artificial. También es autor de otro importante logro. En los años cincuenta construyó un microscopio óptico revolucionario, que le permitía observar con claridad capas sucesivas de una muestra sin tener que rebanar el espécimen en finos cortes. Minsky no recibió el debido reconocimiento cuando patentó su “microscopio de barrido por etapas, de doble enfoque”. En los diecisiete años de vigencia de la patente no percibió derecho s ni royalties, y no se fabricó ningún instrumento de concepción similar. Treinta años después, su método —hoy denominado “microscopía confocal”— ha prendido con fuerza y se ha tomado la revancha, hasta convertirse en uno de los progresos más notables de la microscopía óptica de nuestro siglo. No está claro si el interés que suscita ha sido encendido por

el redescubrimiento de los primeros trabajos de Minsky o por la reinvención de su idea por otros. Sea como fuere, el feliz resultado es que ah ora contamos con docenas de tipos de microscopios confocales, en una gama que va desde lo rudimentario hasta lo barroco. Minsky desarrolló la técnica mientras reflexionaba sobre el funcionamiento del cerebro. Razonó que, si fuera posible cartografiar las conexiones entre todas las neuronas, el diagrama circuital revelaría indicios del modo en que opera el cerebro. Por desdicha, al aplicar las técnicas de la

microscopía óptica ordinaria a la identificación de las sutiles interconexiones de las neuronas de un corte cerebral se tropieza con un grave obstáculo técnico. En los microscopios ópticos, cuando el objetivo enfoca luz tomada de planos situados por debajo de la superficie del tejido cerebral (o de cualquier material grueso y translúcido), la imagen se torna rápidamente incomprensible. Tratar de ver elementos nerviosos profundos de tal tejido equivale a tratar de localizar un objeto hundido en una charca cenagosa proyectando sobre el agua una

1. GRANOS DE POLEN de girasol arriba ( ) y de pino (serie inferior). Estos “retratos” han sido preparados a partir de imágenes obtenidas con un microscopio confocal de planos sucesivos de cada grano. Un ordenador digitalizó dichas imágenes —llamadas secciones ópticas — y las combinó. Tales reconstrucciones digitales pueden observarse en cualquier orientación; el polen de pino se muestra (de izquierda a derecha) en vista lateral, en vista lateral opuesta, girado 72 grados respecto a la primera posición, y desde arriba.

N A M T H IC L .

W F F E J

32

TEMAS 29

A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

33

T U N T S E H C . H W E H T T A M

2. UNA MICROCAPSULA DE POLIMERO rellena de fluido ( esfera grande), de 0,1 milímetros de diámetro. La imagen se obtuvo a partir de una pila de secciones ópticas, entre las que se contaban las esferas menores aquí mostradas. Las imágenes fueron preparadas por Matthew H. Chestnut para comparar la integridad estructural linterna: la luz es reflejada por tantas y tan diminutas partículas que resulta imposible distinguir el objeto de su entorno. Para conseguir una representación nítida de un plano individual de una muestra, lo ideal sería recoger luz reflejada del plano de interés y sólo desde él. Pero el material situado por encima y por debajo de ese plano también devuelve luz, creando imágenes borrosas. Al mismo tiempo, el fenómeno de dispersión puede reducir el contraste. La dispersión se produce al incidir la 34

de esta cápsula con la de otras con diferente composición. Se distingue la cápsula (en verde) del fluido que la llena marcando estos componentes con tintes diferentes. El análisis detallado de muchas vistas no reveló roturas en la cáps ula, pero sí ciertas fugas del fluido interior.

luz sobre partículas diminutas y reflejarse de ellas, incidiendo de nuevo en otras partículas y así hasta alcanzar la superficie detectora. Las señales producidas por esta luz desviada al azar no aportan información; crean un resplandor difuso que tiende a encubrir la luz procedente del plano de interés.

C

on unas pocas modificaciones en el microscopio normal Minsky minimizó la difuminación de la imagen y reforzó el contraste. Evitó que se produjera gran parte de la dis-

persión; para ello hizo pasar la luz de iluminación a través de un objetivo que enfocaba los rayos en un haz bicónico, cuya forma recuerda un reloj de arena. Después llevó el foco de este haz (la angostura en el reloj de arena), que es un punto de luz nítido e intenso, sobre una porción mínima de la muestra, a la profundidad deseada. Tal proceder garantizaba que esa zona sería la más intensamente iluminada del espécimen y, por tanto, la que reflejase más luz. Igual de importante es que, al enfocar un área, Minsky garantizaba que el resto de TEMAS 29

N A M T H IC L . W F F E J

3. LA RECONSTRUCCION TRIDIMENSIONAL de una neurona es la “estrella” de esta secuencia de fotogramas. La estructura que vemos en los sucesivos cuadros está girada unos 1 0 grados en torno a un eje vertical con respecto a cada cuadro anterior. La se-

cuencia constituye una película de la célula, vista en rotación. Para ver la neurona en tres dimensiones, deberá mirar con los ojos bizcos un par de imágenes; cada ojo tiene que estar enfocado en una imagen diferente.

la muestra apenas recibi-

Minsky era que éstas pro-

miendo ría iluminación, con ello la supridispersión. La microscopía óptica al uso iluminaría la muestra entera y se desviaría la luz incidente. La estrategia de enfocar la iluminación sobre una región circunscrita limitaba la dispersión total. Pero no impedía que la luz fuese devuelta y dispersada por el tejido iluminado suprayacente e infrayacente a la zona de interés (el tejido que se encuent re dentro de las porciones cónicas del haz iluminador). Gracias a un segundo ajuste Minsky impidió también que gran parte de esta luz espuria alcanzase la superficie detectora; sabía que la luz devuelta era enfocada por el objetivo en un plano situado muy por encima de la muestra. Colocó en ese plano una máscara con una abertura diminuta, que dispuso de modo que la luz de retorno pasara a su través hasta la superficie detectora. El resultado fue impresionante: la señal procedente del punto iluminado pasaba íntegra a través del orificio de la pantalla y alcanzaba la superficie detectora; al propio tiempo, la máscara eliminaba casi toda la luz procedente del tejido exterior al punto. Se formaba así una imagen casi perfecta del punto, esencialmente no perturbada por la dispersión ni difuminada por la luz procedente de zonas no enfocadas. El problema obvio que planteaban las dos primeras fases del método de

nítida, sí, pero porcionaban una sólo imagen de un punto diminuto. Para producir una representación del plano entero, añadió una característica más: la exploración secuencial por líneas, o “barrido”. Corrió la muestra poquito a poco, barriendo el plano de enfoque con el punto luminoso a lo largo de líneas paralelas inmediatas. Al final, cada una de las áreas yacentes a una profundidad dada visitaba el haz iluminador fuertemente concentrado, enviando en secuencia una señal clara a través del orificio filtrante hasta el detector. Minsky maniobraba la muestra con dos diapasones electromagnéticos de horquilla. Uno lo desplazaba a lo largo de c ada línea y el otro lo hacía pasar de una línea a la siguiente paralela del plano.

A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

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ara ver la imagen completa de un plano, hacía que la luz que atravesaba el orificio incidiera en un detector fotomultiplicador. Este detector, a su vez, generaba un flujo de señales eléctricas con las que se confeccionaba una imagen en una pantalla de larga persistencia, tomada de un radar. Subiendo o bajando el objetivo y repitiendo el proceso de barrido, aparecía en la pantalla otro 4. NEURONAS ACTIVAS (objetos coloreados) resaltadas en este cor- plano de la muestra. La te de tejido cerebral de un roedor. La figura es una compilación, ge- elección de una pantalla nerada por orden ador, de tres imáge nes confocales realizadas, con grande fue un error táctico. 12 segundos de diferencia, por Michael E. Dailey y Stephen J. Smith. Cuando Minsky les pedía a Cada punto temporal se codificó mediante un color, rojo primero, ver- sus colegas que examinaran de luego y por fin azul. La imagen nos revela que las neuronas se ex- el artilugio, éstos solían citaron en instantes distintos y se mantuvieron activas durante dos tener dificultad para interpretar la imagen que estade los pulsos (así la célula amarilla) o durante los tres ( blanca). Y E L I A D . E L E A H IC M Y H T I M S . J N E H P E T S

35

)s a fí a r g to f(o N A C I L U C N A S U S Y N A M T H IC L . W F F E J ), s jo u b i (d D S /J N A M D I E N H C S D E R A J

Así funciona la microscopía confocal

L

os microscopios confocales consiguen elevada resolución en un plano seleccionado merced a tres procesos fundamentales. En el primero, se enfoca luz ( amarilla en a ) mediante una lente objetivo, creando un haz bicónico cuyo vértice o foco ilumina una zona de la muestra, a la profundidad deseada. A continuaci ón, la luz reflejada por esa área (azul ) es enfocada y concentrada en un punto, permitiéndosele que pase en su totalidad a través de una abertura de una máscara situada frente a un dispositivo detector. Las regiones opacas que rodean al orific io de filtrado cierran el paso a los rayos reflejados por la regiones suprayacentes

(en rojo en b ) e infrayacentes ( en naranja ) del plano de interés. Por último, la luz se traslada de una zona a otra hasta explorar el plano por completo. La nitidez que esta técnica proporciona resulta evidente en las fotografí as al pie, obtenidas, respectivamente, con un microscopio tradicional (izquierda ) y con uno confocal ( derecha ). Ambas imágenes corresponden a un mismo músculo de ratón, marcado por fluorescencia para resaltar los puntos que entran en contacto con una neurona motora. Para acel erar el barrido, se incorpora un disco provisto de cientos de finos orificios, a través de los cuales se envía y recoge la luz ( c ).

a

c

DETECTOR

DETECTOR

ORIFICIO FINO

ESPEJO BEAM- DESDOBLADOR SPLITTING DEL MIRROR HAZ FUENTE LIGHT LUMINOSA SOURCE ESPEJO DESDOBLADOR DEL HAZ

FUENTE LUMINOSA

LENTE LENS

b

OBJETIVO

SPINNING DISCO GIRATORIO DISK OBJECTIVE OBJETIVO

PLANO DE ENFOQUE MUESTRA

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SPECIMEN MUESTRA

TEMAS 29

N A M T H IC L . W F F E J

5. LA TEXTURA SUPERFICIAL de una pastilla (“chip”), mostrada en dos a tres profundidades. El nivel más profundo es verde; el más aluna micrografía óptica ( y ensuperpuesto una imagen confocal to, rojo. Se obtiene así información que no es posible captar en la micompuesta (derecha ). Ennormal esta izquierda última se) han los barri- crofotografía ordinaria. ban viendo. Como Minsky dedujo más tarde, la imagen presentada era excesivamente grande. “Les mostré el microscopio confocal a muchos visitantes, pero nunca parecieron muy impresionados con lo que veían en la pantalla de radar”, cuenta. “No caí en la cuenta hasta mucho de spués de que no basta sólo con que un instrumento posea elevado poder de resolución; es preciso también que la imagen parezca nítida. Tal vez el cerebro humano precise de cierto grado de compresión foveal para aplicar sus facultades visuales más sobresalientes. En cualquier caso, debí haber utilizado película fotográfica ¡o cuando menos, haber instalado una pantalla más pequeña!” Pero Minsky no hizo ni lo uno ni lo otro.

I

nvestigadores y fabricantes han ideado muchos métodos para combinar las características esenciales de la microscopía confocal: iluminación de una pequeña porción de la muestra, filtrado de la luz de retorno a través de una abertura alineada con la región iluminada y barrido del espécimen. La muestra suele permanecer quieta; en casi todos los dispositivos es el haz luminoso el que viaja. Para acelerar la velocidad de adquisición de la imagen, algunos microscopios desplazan el haz con espejos oscilantes, que obligan a la luz incidente en ellos a fluir raudamente a través de una muestra, que es barrida como barre el rayo electrónico la pantalla de un televisor. Estos espejos permiten reconstruir una imagen en menos de un segundo. Tales instrumentos exigen fuentes luminosas de más brillo que las que Minsky tenía a su disposición; después de todo, han de producir de cada zona una señal que sea detectable casi instantáneamente. Los láseres, muy intensos y A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

fáciles de enfocar en zonas pequeñísimas, se utilizan para este propósito. Para ahorrar tiempo se emplean también múltiples puntos de luz que exploren simultáneamente diferentes regiones de la muestra. Algunos de estos dispositivos incorporan discos giratorios provistos de muchas aberturas, a través de las cuales pasa la luz de iluminación y la de retorno. Otros equipos se valen de sistemas de rendija, que abrevian el tiempo de barrido iluminando líneas en vez de puntos. Las técnicas de barrido rápido han permitido la observación de planos completos de un espécimen en tiempo real, muchas veces, directamente a través de un ocular. Casi todos los microscopios confocales modernos sacan partido de otro avance revolucionario: el procesamiento digital de imágenes. Conforme un microscopio confocal barre planos sucesivos de la muestra, produce una pila de imágenes, cada una de las cuales constituye una sección óptica; tales secciones vienen a ser imágenes de finos cortes. Los programas de procesamiento de imágenes no sólo registran el brillo de cada zona de cada sección, sino también la ubicación de esa área en la muestra, o sea, su localización en un plano individual (las coordenadas x e y) así como la profundidad de éste (la coordenada z ). Los lugares definidos mediante la terna de coordenadas se llaman “vóxeles”, equivalentes en tres dimensiones de los elementos de imagen, o “píxeles” de una imagen bidimensional. Los programas de procesamiento de imágenes compilan vóxeles y preparan con ellos reconstrucciones tridimensionales de objetos microscópicos. También manipulan vóxeles, lo que permite hacer girar alrededor de un eje las imágenes reconstruidas y

observarlas desde todos los ángulos. Gracias a esta técnica nos es dado efectuar rápidamente observaciones que de otra forma hubieran resultado sumamente caras y laboriosas. Por ejemplo, en investigación cerebral, los sistemas de microscopios confocales conectados a ordenadores han resultado valiosísimos para descubrir la estructura del sistema nervioso, y en ellos se apoya la o bservación de tejidos cerebrales vivos.

L

a microscopía confocal se ha convertido en una aglutinación ultrarrefinada de láseres, instrumentos ópticos, sistemas electromecánicos de barrido y de procesamiento informático de imágenes. Ha dado a la microscopía la capacidad de ver el interior de los objetos y de crear, casi a voluntad, imágenes estereoscópicas. El sueño de Minsky —la cartografía microscópica de los circuitos cerebrales— parece estar cobrando realidad.

BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA A N EVAL UATIO N OF C ONFOCAL VERSUS CONVENTIONAL IMAGING OF BIOLOGICAL STRUCTURES BY FLUORESCENCE LIGHT MICROSCOPY. J. G. White, W. B. Amos y M. Fordham, en Journal of Cell Biology, volumen 105, n.o 1, páginas 41-48; julio de 1987. M EMOIR ON INVENTIN G THE C ONFOCAL SCANNING MICROSCOPE . M. Minsky en Scanning, vol. 10, n.o 4, páginas 128-138; julio/agosto de 1988. HIGH-RESOLUTION IMAGING OF SYNAPTIC STRUCTURE WITH A SIMPLE CONFOCAL MICROSCOPE. J. W. Lichtman, W. J. Sunderland y R. S. Wilkinson en New Biologist, vol. 1, n. o 1, páginas 75-82; octubre de 1989. CONFOCAL MICROSCOPY. Recopilación de Tony Wilson. Academic Press, 1990.

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Microscopios de rayos X Los trabajos en microscopía de rayos X blandos culminaron en el decenio de 1980 con la construcción de instrumentos cuya resolución decuplicaba la del microscopio óptico. En este artículo de 1991, algunos de sus creadores detallan la historia de ese logro Malcolm R. Howells, Janos Kirz y David Sayre

C

ada adelanto en las técnicas microscópicas ha proporcionado a los científicos nuevas perspectivas sobre el funcionamiento de los organismos vivos y la naturaleza de la propia materia. La invención del microscopio de luz visible a finales del siglo XVI mostró un reino antes desconocido de plantas y animales unicelulares. El desarrollo de la cristalografía de rayos X a principios del siglo XX ofreció las primeras imágenes precisas de la materia con “resolución atómica”. Durante las décadas siguientes, los microscopios electrónicos han proporcionado imágenes directas de virus y minúsculas estructuras superficiales. Ahora, otro tipo de microscopio que utiliza rayos X en vez de luz visible o electrones aporta un modo diferente de examinar los detalles diminutos. Los microscopios de rayos X tienen una resolución bastante mejor que la de los microscopios ópticos. Sirven, además, para trazar mapas de la distribución de ciertos elementos químicos. Algunos pueden formar imágenes en tiempos brevísimos, y los hay incluso que prometen capacidades tan especiales como la de obtener imágenes tridimensionales. A diferencia del microscopio electrónico convencional, el microscopio de rayos X permite mantener los especímenes al aire y en agua, lo que significa que las muestras biológicas pueden ser estudiadas bajo condiciones similares a las de su estado natural. La iluminación usada, rayos X “blandos” en el rango de longitud de onda de 20 a 40 angstroms (un angstrom es la diezmilmillonésima parte de un metro), es, además, lo suficientemente penetrante como para producir en muchos casos imágenes de células 38

biológicas sin alterar. Debido a la longitud de onda de los rayos X e mpleados, los microscopios de rayos X blandos nunca alcanzarán una resolución más alta que la posible con microscopios de electrones. Pero sus propiedades especiales harán viables investigaciones que complementen las realizadas con instrumentos basados en la luz visible y en los electrones. El sueño de construir un microscopio de rayos X data de 1895, cuando Wilhelm Röntgen, de la Universidad de Würzburg, descubrió los rayos X. La capacidad de los rayos X para penetrar en objetos sólidos aportó un motivo de peso para utilizarlos en microscopía. Sin embargo, los científicos descubrieron rápidamente que no se podía refractar o reflejar rayos X del mismo modo que se hacía con la luz visible. Las primeras imágenes se realizaron, por contra, mediante la proyección de rayos X a través de un espécimen puesto en contacto con una película fotográfica ordinaria. Los rayos X que atravesaban el espécimen impresionaban la película; la imagen resultante podía examinarse con un microscopio óptico. Esta forma de microscopía de rayos X, conocida como microrradiografía de contacto, se sigue empleando todavía hoy en día. A principio s del siglo XX se conocía la naturaleza de los rayos X: ondas electromagnéticas que tan sólo diferían de la luz visible en que tenían una longitud de onda mucho más corta. Este descubrimiento implicaba que la microscopía de rayos X ofrecía un posible camino hacia la alta resolución. La longitud de onda de la luz visible limita la máxima resolución del microscopio óptico a unos

2500 angstrom. Los microscopios ópticos construidos hace más de un siglo ya se aproximaban mucho a ese límite. Los biólogos se dieron cuenta de que, para comprender la organización y función de las células, se necesitaba una mejor resolución y pensaron que los rayos X, con una longitud de onda más corta, podrían servirles. Por desgracia, el gran tamaño de grano de las películas fotográficas ponía un freno a la microrradiografía de contacto. El microscopio óptico utilizado para examinar la película impresionada limitaba aún más esta técnica. Por culpa de estas limitaciones la primitiva microscopía de rayos X no pudo igualar, ni mucho menos superar, la resolución de la microscopía óptica ya existente. Se necesitaba un sistema que pudiera producir una imagen de rayos X focalizada. El desarrollo de tal sistema resultó ser una tarea difícil, que sólo se está consiguiendo actualmente.

E

n 1923, Arthur H. Compton mostró que los rayos X podían ser eficientemente reflejados por superficies muy bien pulidas, si los rayos incidían sobre ellas con un ángulo rasante pequeño. Con una superficie de forma apropiada, los rayos X podían focalizarse y, así, producir imágenes ampliadas similares a las obtenidas mediante sistemas ópticos convencionales. A finales de los años cuarenta, Paul H. Kirkpatrick y su grupo de la Universidad de Stanford decidieron construir un microscopio de rayos X de alta resolución basado en este principio, pero su esfuerzo por obtener una resolución mejor que la del microscopio óptico fracasó. Las aberraciones y las pequeñas tolerancias en la manufactura de las TEMAS 29

superficies que este diseño requería planteaban serias limitaciones. Mientras que las prestaciones de los microscopios de rayos X no mejoraban, un competidor —el microscopio electrónico— efectuaba rápidos progresos. Así, durante los años cuarenta, los microscopios electrónicos alcanzaban rutinariamente una resolución mejor que la obtenida con microscopios de luz visible. La comunidad de biólogos , por su parte, empezó a desarrollar las técnicas de preparación de especímenes necesarias para aprovechar las capacidades del microscopio electrónico. Desde entonces, la vertido en una microscopía electrónica herramienta se ha habitual conpara toda una generación de biólogos, impulsando avances extraordinarios en la comprensión de la función y estructura celulares. El éxito de la microscopía electrónica llevó a

una interrupción temporal en el desarrollo del microscopio de rayos X. n los últimos decenios el interés por la microscopía de rayos X resurgió gracias, en gran parte, a varios avances técnicos importantes. El más significativo de ellos ha sido el desarrollo de nuevas fuentes de rayos X. Para lograr imágenes de alta resolución, algunos tipos de microscopios de rayos X necesitan fuentes de un brillo sin precedentes. El decenio de 1980 fue testigo de rápidos progresos en el brillo de las fuentes de rayos X basadas en la radiación

ron las únicas fuentes de rayos X blandos disponibles durante la mayor parte de este siglo. También se ha producido un gran progreso en el desarrollo de láseres de rayos X y de plasmas emisores de rayos X, que son capaces de producir pulsos de rayos X de intensidad suficiente como para formar una imagen en un nanosegundo (una milmillonésima de segundo) o menos. Los detectores de rayos X también han experimentado drásticas mejoras. Se han introducido detectores electrónicos y resinas fotosensibles (materiales formados por una fina

partículas de sincrotrón cargadas (radiación al ser emitida acelerapor das por un campo magnético). Como resultado de lo anterior, el brillo disponible hoy en día es millones de veces mayor que el obtenido mediante los tubos de rayos X que fue-

ataques capa de químicos plástico cuya cambia resistencia cuando se a expone a la acción de haces de electrones o rayos X), que han reemplazado a la película fotográfica en muchas aplicaciones. Las resinas han demostrado ser detectores de ra-

E

N R E K R E T IE D , N O S R E D N A IK R E

1. PLACA ZONAL DE FRESNEL formada por anillos concéntricos de oro sobre una membrana de nitruro de silicio de tan sólo 1200 angstrom de espesor. Los rayos X que atraviesan las zonas interanulares son difractados y focalizados. Gracias a ello, se pueden construir lenA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

tes para rayos X análogas a las utilizadas en microscopios de luz visible. La anchura del menor espaciado entre anillos (que es aproximadamente igual a la resolución máxima alcanzable por el microscopio empleando la placa) es de unos 300 angstrom. 39

yos X baratos, idóneos y con resolución casi 100 veces mejor que la de la película fotográfica. Merece reseñarse otro avance importante: se consiguió finalmente focalizar rayos X con precisión supe-

rior a la óptica mediante el uso de “placas zonales de Fresnel”. Estos dispositivos son redes de difracción circulares formadas por anillos concéntricos, transparentes alternados con opacos, cuyo espaciado disminuye al

MICRORRADIOGRAFIA DE CONTACTO HAZ DE RAYOS X MUESTRA

aumentar la distancia desde el centro. Las ondas se difractan cuando atraviesan los anillos transparentes. De este modo, cada parte del rayo incidente sufre una deflexión apropiada para que las ondas converjan hacia un punto focal común. Las lentes de placas zonales se han utilizado para focalizar luz, ondas de radio, sonido e incluso neutrones. En 1960, Albert V. Baez, entonces en el Observatorio Astrofísico Smithsoniano de Harvard, propuso que tales placas podrían focalizar también rayos X. La fabricación de placas zonales

de alta nico complejo. resolución Laesmejor un problema resolución técposible para una placa dada viene a 2. DIAGRAMA DE DAÑOS producido en la resina como resultado del paso de los rayos X a ser igual al tamaño más fino de su través de la muestra (izquierda). Un revelador ataca las regiones dañadas por la radiación espaciado zonal. Para conseguir una (derecha). resolución mejor que la del microscopio óptico se necesita, por tanto, crear zonas cuyos espaciados sean HAZ DE RAYOS X MICROSCOPIO DE VISUALIZACION DE RAYOS X mucho menores que la longitud de onda de la luz. Las técnicas de fabriMUESTRA cación óptica convencionales no están, naturalmente, a la altura de este PLANO cometido. Sin embargo, se han consIMAGEN truido placas zonales con espaciados de sólo 300 angstrom, en torno a la MICROPLACA vigésima parte de la longitud de onda CONDENSADOR ZONAL DETECTOR de la luz visible, aplicando métodos DE PLACA ZONAL desarrollados para la manufactura 3. LAS PLACAS ZONALES DE FRESNEL sirven como objetivo y lente condensadora de ra- de microcircuitos. yos X. La primera placa focaliza el haz sobre la muestra; la segunda amplía la imagen sobre Un método para abordar este proun detector. blema, iniciado por Gunter Schmahl y Dietbert Rudolph, de la Universidad de Gotinga, consiste en la utilización MICROSCOPIO DE BARRIDO DE RAYOS X PORTAMUESTRAS de técnicas holográficas de ultravioCON BARRIDO leta (generalización de las técnicas EN LAS DIRECPLACA ZONAL MUESTRA usadas en la creación de hologramas CIONES X-Y HAZ DE de luz visible) para imprimir un diaRAYOS X grama de placas zonales en una película de resina fotosensible. El método holográfico ha tenido un éxito impreCONTADOR FUENTE sionante, pero está limitado por la DIAFRAGMA DE RAYOS X PUNTUAL difracción de la luz ultravioleta a DE APERTURA anchuras de la zona externa de unos 4. HAZ DE RAYOS X FOCALIZADO, que barre toda la muestra, de lado a lado y de arriba aba- 500 angstrom. jo; los rayos que inciden en cada punto se miden en un detector de rayos X de cómputo proporcional. tra técnica, más precisa, consiste en utilizar haces de electrones para “dibujar” el diagrama de placas HOLOGRAFIA DE RAYOS X (TIPO GABOR) zonales en la resina. Los métodos de HOLOGRAMA GRABACION RECONSTRUCCION microfabricación posibilitan la transR X O ferencia de estos diagramas a estrucS E T O T C turas de oro, níquel o germanio. La Y N N U A E E L Z R R R técnica del haz de electrones fue ya G A A T E E H S A E MUESTRA R D H N utilizada en 1974 en el laboratorio de IM O Z O C Dieter Kern en el Centro de InvestiC A E H R gación Thomas J. Watson de IBM, DETECTOR IMAGEN VIRTUAL DE RESINA donde todavía se siguen fabricando las mejores placas zonales disponibles 5. INTERFERENCIA entre los haces de rayos X incidentes y dispersados. La interferencia gra- (hoy las prepara allí Erik Anderson, ba un holograma en una lámina de resina izquierda ( ). La imagen se reconstruye derecha ( ) del Centro para Optica de rayos X del iluminando el holograma con luz de láser digitalizando el holograma y tratándolo matemáti- Laboratorio berkeleyano Lawrence, camente. bajo la dirección de David Attwood). RESINA(PMMA)

PERFIL DEDEL LARELIEVE RESINA

O

S S I K R O B A G

40

TEMAS 29

) a h c e r e d ( S L L E W . C . O , G N E H C . C . P Y ) ro t n e c ( N A M T T U G . P ,) a d r e i u q z i( Y E L K C U B . H C , E IN P . J , T R E B L I G .J

Imágenes con resolución superior a la del microscopio óptico obtenidas con tres técnicas de microscopía de rayos X diferentes MICROSCOPIODEBARRIDO

MICROSCOPIO DE VISUALIZACION

6. IMAGEN DE UNA CELULA DE TEJIDO CONJUNTIVO de un embrión de pollo (izquierda ) obtenida por John Gilbert, Jerome Pine y Christopher Buckley con el microscopio de barrido de rayos X en el Laboratorio Nacional de Brookhaven. En la imagen se aprecian dos núcleos, cada uno con dos nucléolos, así como numerosos gránulos demasiado pequeños para observarse bajo el microscopio óptico. La imagen está tomada manteniendo la célula en ambiente húmedo y sin recurrir al proceso de tinción. Usando el microscopio de visualización de rayos X de Gotinga en el anillo de almaTodas las microfotografías de barrido de rayos X mostradas en este artículo se tomaron usando placas zonales producidas por este equipo. Pambos Charalambous, que trabaja en el grupo de Ronald Burge del King’s College londinense, también ha realizado placas zonales de precisión mediante una técnica afín. Las placas zonales de más alta resolución fabricadas tienen anchos de zona externa entre 200 y 300 angstrom. Las placas zonales para rayos X son bastante pequeñas, alrededor de 0,1 milímetros de diámetro, y de pequeño espesor, para que trabajen mejor con rayos X de longitudes de onda mayores que unos cinco angstrom.

MICRORRADIOGRAFIADECONTACTO

cenamiento de BESSY en Berlín, el profesor Peter Guttman y sus colaboradores obtuvieron una imagen de la estructura filamentosa de un cromosoma perteneciente a una larva de mosquito también en ambiente húmedo y sin tinción previa ( centro). P. C. Cheng y O. C. Wells mediante microscopía de contacto (derecha) obtuvieron la imagen de una célula seca de tejido conjuntivo humano, en la que se muestran fibras de sostén fuera del núcleo de la célula. La imagen muestra la superficie de la resina sensible a los rayos X ampliada por un microscopio electrónico.

aspectos importantes. En primer lugar, las resinas fotosensibles empleadas como detectores (generalmente PMMA, la materia prima del plexiglás) permiten una resolución superior a la de las películas fotográficas que se utilizaban en un comienzo. En segundo lugar, la imagen grabada en el material detector es visualizada por instrumentos de más alta resolución, principalmente el microscopio electrónico. Ambos avances surgen de un artículo publicado en 1956 por William A. Ladd y sus colaboradores, de la Colu mbian Carbon Company de Nueva York.

Los pioneros de la microscopía que utiliza detectores de resinas fueron Ralph Feder y Eberhard Spiller, de IBM. Aunque el método de contacto posee muchas ventajas, incluidas una relativa simplicidad y comodidad, la resolución de las imágenes de contacto está limitada por la fidelidad de los procedimientos de lectura disponibles y por la falta de nitidez de la imagen debido a fenómenos de difracción, auténtico problema a la hora de estudiar especímenes gruesos. El microscopio de visualización de rayos X utiliza óptica de localización para formar una imagen ampliada en

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os avances técnicos han permitido que los microscopios de rayos X alcancen resoluciones que van más allá del límite del microscopio óptico. Cuatro métodos de rayos X que lo logran son la microscopía de contacto, la microscopía de visualización, la microscopía de barrido y la holografía. Cada una tiene sus peculiares ventajas. La microscopía de contacto es la técnica más socorrida. La microscopía de contacto moderna difiere de la primitiva microrradiografía en dos A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

N A M H T O R . S . S Y

S L L E W O .H R . M , N E S B O C A J . H C

7. HOLOGRAMA DE RAYOS X (izquierda), que proporciona la información para generar las dos imágenes reconstruida, de un agrupamiento de vacuolas s ecas de almacenamiento de enzimas. Una de ellas muestra la imagen con contraste de intensidad (centro) y la otra con contraste de fase (derecha). 41

I L A . Y , Y E L K C U B . C

8. TENDON HUMANO ENFERMO estudiado por Christopher Buckley y Yusuf Ali con el microscopio de barrido de rayos X del Laboratorio Nacional de Brookhaven. Las imágenes de secciones del tendón sin teñir fueron tomadas con rayos X de energía justo unos pocos cientos de veces, que puede ser grabada a continuación por un detector de resolución modesta. Los dispositivos de más alta resolución emplean lentes de placas zonales de Fresnel como elemento focalizador. El dispositivo de grabación puede ser una película fotográfica sensible a los rayos X o un detector electrónico. El grupo de Schmahl en Gotinga construyó un microscopio de este tipo que alcanza resoluciones de 550 angstrom, utilizando el tipo de placas zonales creadas holográficamente a las que nos hemos referido antes. Los microscopios de visualización de rayos X ofrecen múltiples ventajas; la principal: toda la muestra es iluminada y visualizada al mismo tiempo. Esto permite tomar la imagen rápidamente, lo que ayuda a eliminar la falta de nitidez de las imágenes que provenga del movimiento y minimiza el daño que la radiación pueda infligir a las muestras biológicas. Se evita, además, la necesidad de fuentes de rayos X avanzadas con un gran grado de coherencia, u organización de fase. Estos microscopios, sin partes móviles, resultan en principio muy fiables y susceptibles de comercialización . Un consorcio de las

por debajo ( izquierda ) y por encima ( centro ) de 350 eV, valor al cual el calcio aumenta bruscamente su absorción de rayos X. Restando la primera imagen de la segunda, obtenemos la imagen diferencia ( derecha ).

universidades de Gotinga y Aquisgrán, junto con la compañía de óptica Carl Zeiss, desarrolló un instrumento de este tipo ( véase la figura 11 ). El grupo de Gotinga mostró cómo obtener una imagen cuyo nivel de gris fuera proporcional al cambio de fase de los rayos X producido por la transmisión a través del espécimen. Este microscopio de “contraste de fase” permitirá, tarde o temprano, una mayor flexibilidad en la longitud de onda, dosis menores de rayos X y una mayor resolución, quizá. Durante años, los microscopios de visualización y de contacto llevaron ventaja sobre otros diseños en términos del número de microfotografías de rayos X producidas. Pero la situación cambió merced a la aparición en escena de varios nuevos microscopios de rayos X de barrido. En los microscopios de barrido, se forma la imagen elemento (píxel) a elemento, igual que si se tratara de la imagen de una pantalla de televisión. El proceso comienza con el uso de una placa zonal que focaliza el haz de rayos X en un punto iluminado de la muestra. Algunos rayos atraviesan la muestra; la fracción del haz incidente que pasa a través de él d e-

termina el tono de gris asignado a este píxel. El punto localizado barre la muestra en líneas de lado a lado y de arriba abajo, grabando sucesivos píxeles. El tamaño del haz determina la resolución. Aunque parezca lento y laborioso, el método de barrido tiene claras ventajas. La técnica se presta fácilmente a la grabación de imágenes basada en ordenadores y al análisis químico punto a punto. Por otra parte, permite mantener la muestra en aire, mientras que casi todo el recorrido del haz de rayos X se encuentra en vacío. Además, el barrido minimiza el tiempo de exposición del espécimen a la radiación dañina. Sin embargo, este método, cuando se lleva a cabo con una placa zonal de Fresnel, requiere un haz de rayos X blandos coherente, que sólo puede ser suministrado por una gran instalación de radiación de sincrotrón.

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l primer microscopio de barrido de rayos X que alcanzó resolución superior a la del óptico fue construido en 1982 por uno de nosotros (Kirz), Harvey Raback y John Kenney, de la Universidad estatal de Nueva York en Stony Brook. Está emplazado en la Fuente Nacional de Radiación de Sincrotrón ( NSLS ), en el Laboratorio Nacional de Brookhaven. Se acaba de reconstruir para mejorar su resolución e incrementar su velocidad en la toma de imágenes, lo que permitirá aprovechar las características de una nueva fuente de rayos X, llamada 9. VACUOLA DE ALMACENAMIENTO DE ENZIMAS de una célula pancreática. La secuencia ondulador. Este dispositivo obliga a de imágenes muestra cambios de tamaño y densidad a medida que la vacuola va descar- seguir a los electrones, mediante camgando su contenido proteínico. Esta secuencia, producida por Kaaren Goncz y Stephen S. pos magnéticos, una trayectoria suaRothman con el microscopio de barrido de rayos X de Brookhaven, da una medida cuantita- vemente ondulada, lo que provoca la tiva de dichos cambios. emisión de un haz estrecho de gran

N A M H T O .R S . S , Z C N O G . K

42

TEMAS 29

brillo. Con tal haz, el microscopio produce imágenes en un tiempo aproximado de un minuto. En su reforma intervino un amplio grupo de investigadores; entre otros: Christopher Buckley, Mark Rivers y Deming Shu, así como físicos de Stony Brook, del NSLS y del Centro para óptica de rayos X. Un microscopio similar construido por el King’s College opera en el laboratorio Daresbury en Cheshire. Entre sus metas fundamentales, la microscopía de rayos X se propuso la de examinar material biológico en condiciones próximas a las de su estado natural. Esto requiere que las que posean muestras estén cierto intactas grosor.y,En poreltanto, estudio de tales objetos es apropiada la utilización de rayos X blandos, puesto que tienen aproximadamente el poder de penetración adecuado. Persiste el interés en el uso de la holografía mediante rayos X, una técnica relacionada con el método empleado en la fabricación de placas zonales, para visualizar tales muestras en tres dimensiones. La holografía tridimensional con rayos X requiere una resolución mejor que la actualmente posible. Pero los microscopistas consiguen imágenes holográficas bidimensionales detalladas. La holografía presenta la característica adicional, como ocurre en la microscopía de contacto, de no precisar mecanismo de enfoque. La visualización holográfica fue propuesta en 1948 por Dennis Gabor, de la Compañía Británica Thomson Houston. Se fundamenta en el hecho de que la radiación electromagnética, ya sea en el rango visible o en otros, es un fenómeno ondulatorio sujeto a interferencia, de manera parecida a la producida en las ondas en el agua. Cuando dos ondas interfieren, las crestas de las ondas coinciden en ciertos lugares (reforzándose entre sí), mientras que en otros lugares una cresta coincide con un valle (cancelándose entre sí). El resultado neto es un diagrama de máximos y mínimos formado cuando la onda difundida por la muestra se combina con el haz original que iluminó a ésta. Gabor llamó holograma a la grabación de este diagrama. Un holograma almacena información sobre la amplitud y la fase de la onda difundida, proporcionando datos suficientes para reconstruir una imagen de la muestra con características tridimensionales. Baez propuso en 1952 un esquema de microscopio holográfico de rayos X carente de lentes. El diseño era conceptualmente sencillo, pero su realización técnica resultaba muy A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

compleja. Ni la intensidad de las fuentes coherentes de rayos X ni la resolución de las emulsiones fotográficas disponibles estaban a la altura del proyecto. Esas limitaciones tecnológicas se superan a finales de los años ochenta; Dennis Joyeux en Francia, Sadao Aoki en Japón, James Trebes y Ian McNulty en EE.UU., junto a sus respectivos colaboradores, produjeron hologramas de alta resolución mediante rayos X.

cen diferentes aspectos de la estructura de la muestra. En general, los microscopios de rayos X y los electrónicos tienen ventajas complementarias. Los segundos hace mucho tiempo que superaron la resolución de los microscopios ópticos y, para muchas muestras, a DIOXIDO DE SILICIO

ALUMINIO

12,5 MICRAS

E

n 1987, Chris Jacobsen, trabajando con Kirz y Stephen S. Rothman del Laboratorio Lawrence de la keley y con uno Universidad dedeCalifornia nosotros (Howells), en Bermostró el primer microscopio holográfico con resolución superior a la del microscopio óptico. Usaron un ondulador, como fuente de rayos X, y detectores de alta resolución, que inicialmente producían hologramas tras una hora de exposición proporcionando una resolución promedio en la imagen mejor que 1000 angstrom. Se redujo el tiempo de exposición a un minuto y mejoró la resolución hasta los 600 angstrom, pero la obtención de imágenes tridimensionales requiere una resolución proxima a la resolución intrínseca de la resina, unos 100 angstrom para PMMA. Cuando los microscopios de rayos X son una realidad, la atención se dirigió a sus más fructíferas aplicaciones. Se utilizaron microscopios de rayos X para examinar una amplia variedad de muestras, desde lombrices de tierra contaminadas con metales pesados hasta células humanas cancerosas, desde pelos de la epidermis a carbón, dispositivos semiconductores o cemento. Gran parte de las investigaciones se centraron en estudiar la capacidad de los microscopios y su aplicabilidad al estudio de diferentes clases de muestras. Ante la corta historia de los microscopios de rayos X de alta resolución, había que mostrarse cauteloso a la hora de juzgar qué aplicaciones pueden o no beneficiarse de su uso. Los resultados obtenidos con los actuales dispositivos de rayos X confirmaron, como se esperaba, que las imágenes de rayos X y las microfotografías electrónicas de la misma muestra no se parecen. Los microscopios de rayos X son sensibles a la conce ntración de ciertos elementos, a menudo carbono y nitrógeno, mientras que los electrónicos suelen recoger la distribución de grupos químicos en la muestra que se han enlazado con la tintura productora del contraste. Ninguna de las dos imágenes es errónea. Sólo ofre-

SILICIO DOPADO CON BORO

b

c

d

N R E K . D , N

O S R E D N A . E , T R E B L U H . S , N

e

O S N H O J . E , Z R I K . J , E D A . H

10. COMPOSICION QUIMICA de una muestra microfabricada (a) estudiada por Harald Ade y colaboradores usando un microscopio de barrido de fotoelectrones en el que los fotones de rayos X arrancan electrones provenientes de los átomos cercanos a la superficie de la muestra. Seleccionando energías de electrones característicos asociados con aluminio (b), silicio (e) y oxígeno (d), podemos identificar y situar espacialmente cada elemento. La imagen e( ) permite apreciar que el silicio que se encuentra ligado al oxígeno formando dióxido de silicio presenta un desplazamiento en energía al compararlo con la energía correspondiente a la del silicio puro. Así podemos identificar dos estados químicos del Si. 43

) a h c e r e d ( E G E L L O C ’S G IN K ,) a d r ie u q i(z N Á R G S I U Q A

Y A G IN T O G E D . V I N U A L E D S A T S I P O C S O R C I M IO D A R

11. MICROSCOPIO COMPACTO de visualización ( izquierda ) desarrollado en las universidades de Gotinga y Aquisgrán que incorpora una fuente de rayos X de plasma; tiene una resolución comprobada de 1000 a 2000 angstrom. La fotografía de la derecha pueden ahora proporcionar resoluciones de entre 2 y 20 angstrom. Por otra parte, la resolución de los microscopios de rayos X usuales es del orden de unos pocos cientos de angstrom, y el límite fundamental impuesto por la difracción (semilongitud de onda) restringe la posibilidad de futuras mejoras. Los microscopios considerados en este artículo, que usan rayos X blandos, nunca alcanzarán resoluciones por encima de los 10-20 angstrom.

L

a principal contribución de los microscopios de rayos X no es la de romper barreras en cuanto a resolución, sino la de realizar medidas cuantitat ivas de objetos biológicos bajo pequeñas o nulas modificacione s, en condiciones muy próximas a las de su estado natural. Tales muestras no se pueden estudiar mediante microscopía electrónica convencional sin producir alteraciones físicas o químicas considerables. En algunos casos, la preparación y la irradiación con rayos X para tomar la imagen parece ser lo suficientemente inocua como para que la muestra pueda responder a la aplicación de ciertos estímulos. En estos casos se puede tomar una secuencia de imágenes que permita estudiar las respuestas o distinguirlas de los efectos producidos por la iluminación mediante el haz de rayos X. Rasgo peculiar de los microscopios de rayos X es que pueden resal44

muestra el microscopio de rayos X de barrido utilizado por el King’s College de Londres. Este instrumento se encuentra situado en la línea del ondulador de la fuente de radiación de sincrotrón de Daresbury en Cheshire.

tar o suprimir la visibilidad de un elemento particular presente en la muestra. Cada elemento absorbe los rayos X de manera distinta. Para los rayos X de longitud de onda entre 23 y 44 angstrom, el oxígeno, y por añadidura el agua, es mucho más transparente que el material orgánico. Este hecho abre la posibilidad de distinguir estructuras a través del agua que forma alrededor de las 3/4 partes de la masa de las células. Esta zona del espectro de los rayos X se denomina ventana del agua; reviste interés en microscopía biológica. La forma en que los rayos X interaccionan con la materia permite a los microscopios de rayos X realizar medidas cuantitativas de la densidad y composición química de una muestra. Para cada elemento existen ciertas energías críticas de los rayos X, los bordes de absorción, en éstas, los rayos X poseen exactamente la energía suficiente como para liberar un electrón. Sólo los rayos X que tengan al menos la energía crítica serán absorbidos con eficacia por cada elemento dado. Se puede aprovechar esta propiedad haciendo imágenes con energías justo por debajo y por encima mismo del borde de absorción. La diferencia entre ambas imágenes elimina la señal que proviene de todos los elementos, excepto la del que tenga su borde de absorción situado a esa energía particular. De esta forma los microscopios de rayos X pueden trazar mapas de la dis-

tribución espacial de un elemento químico sobre la muestra.

E

l problema del daño por radiación limita las aplicaciones tanto de la microscopía de rayos X como de la electrónica. Los cambios introducidos por la irradiación pueden ser importantes desde el punto de vista biológico, aun cuando sólo afectaran a una pequeña porción de moléculas de la célula. Por tanto, en imágenes con resolución superior a la óptica de células inicialmente vivas tomadas por medio de cualquier radiación ionizante, siempre pueden aparecer alteraciones significativas a nivel biológico. Como microscopistas, nuestra visión del daño por radiación difiere de la de los biólogos. Nosotros queremos saber el grado de daño producido a la imagen para una resolución dada, con referencia a lo que esperábamos aprender. Por su parte, los biólogos están interesados primordialmente en el daño infligido sobre el organismo y sus diferentes sistemas (por ejemplo, el sistema reproductor). En cualquiera de los dos enfoques, entender la interacción entre la sonda radiativa y las muestras es un problema complejo. Las imágenes de rayos X pueden alcanzar un mejor contraste (relación señal-ruido) con las técnicas de utilización del borde de absorción y, al contrario que las producidas con microscopios electrónicos, no están TEMAS 29

sujetas a distorsión por ciertos efectos de fondo, como la dispersión múltiple de electrones. La limpieza de la señal obtenida con métodos de rayos X permite que la tarea d e tomar imágenes microscópicas se acometa sin producir tanto daño a la muestra como los métodos de visualización basados en electrones u otras partículas cargadas. La utilización de rayos X es compatible con técnicas de visualización rápida (flash), lo que proporciona otro modo de amortiguar los daños por radiación. Estas ventajas, unidas a los modestos logros en la mejora de la resolu-

micas. En ciencia de superficies no se estudian los rayos X, sino los electrones arrancados por ellos de los átomos que están cerca de la superficie de la muestra. La técnica para medir la energía de los electrones liberados, denominada espectroscopía de fotoelectrones, ha entrado ya en un nivel de rutina. Con la combinación de la espectroscopía e imágenes de alta resolución de microscopía de rayos X cabe en principio identificar, y trazar, la distribución de los diferentes elementos, así como determinar su estado de ligadura química cerca de la superficie de la muestra.

con respecto ción de los microscopios a la microscopía de rayos elecX trónica, permiten que los rayos X sean utilizados para estudios de material biológico en su estado natural, sin proteger. En muchos casos los microscopios de rayos X pueden proporcionar imágenes que no están degradadas por el daño por radiación y que poseen una resolución que trasciende la que se puede obtener con el microscopio óptico. Se puede obtener una resolución que supere los límites impuestos por los detectores PMMA. Supongamos, por ejemplo, que el diagrama de difracción de rayos X se mide sin el uso de una onda de referencia, como se hace en cristalografía de rayos X. En un experimento así, el patrón de intensidad de los haces difractados permitiría al investigador deducir la estructura del objeto que ha dispersado los rayos X. La calidad de la resolución que se puede obtener por este método está determinada por el rango de ángulos en que se puedan medir los haces difractados. En el caso extremo, la medida sobre toda la esfera permitiría una completa visualización tridimensional y una resolución del orden de la semilongitud de onda de los rayos X, que para las radiaciones aquí consideradas significaría una resolución de 10 a 20 angstrom. En experimentos iniciados por uno de los autores, Sayre, junto con Kirz, Wenbing Yun, del Laboratorio Nacional de Argonne, y Mark Sharnoff, de la Universidad de Delaware, se tomaron diagramas de difracción registrando la señal hasta 15 grados fuera de eje con respecto al haz incidente; esto corresponde a una resolución en la imagen de 70 angstrom, valor mejorable con un haz de rayos X de mayor coherencia. La microscopía de rayos X se ha abierto camino más allá de las c iencias de la vida hacia la ciencia de superficies y el análisis de trazas quí-

ción Ese enes superficies el caminoheterogéneas, para la investigacomo las de catalizadores y dispositivos semiconductores. Harald Ade, junto con Erik Johnson y Steven L. Hubert, del NSLS , y en colaboración con Anderson, Kern y Kirz, alcanzaron resolución por debajo de la micra. El y sus colegas del NSLS realizaron los análisis químicos antes citados con un microscopio de fotoelectrones basado en la utilización de lentes de placa zonal. Trabajos similares se realizaron en Hamburgo, Stanford, Wisconsin y en otros lugares del mundo.

A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

T

ras casi un siglo de investigación, las técnicas de microfabricación han convertido el sueño de un microscopio de rayos X en realidad. Los estudios con rayos X representan una oportunidad valiosa para ampliar el conocimiento humano sobre el mundo natural. Esperamos con optimismo que el progreso en este campo continúe y que las promesas basadas en el uso de estos instrumentos se satisfagan plenamente.

BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA X-R AY M ICROSCOPY . Dirigido por G. Schmahl y D. Rudolph. Springer-Verlag, 1984. X-R AY M ICROSCOPY II. Dirigido por D. Sayre, M. Howells, J. Kirz y H. Rarback. Springer-Verlag, 1988. X-R AY MICROSCOPY . A. G. Michette en Reports on Progress in Physics, vol. 51, n.o 12, páginas 1525-1606; dicie mbre de 1988. ECHNIQUES AND MAODERN MICROSCOPIES : Tpor PPLICATIONS . Dirigido P. J. Duke y A. G. Michette. Plenum Press, 1990. SOFT X-RAY IMAGING FOR THE LIFE SCIENCES. M. R. Howells en Synchrotron Radiation and Biophysics . Dirigido por S. S. Hasnain. Ellis Horwood, 1990. X-R AY M ICROSCOPY III. Dirigido por A. Michette, G. Morrison y C. Buckley. Springer-Verlag, 1992.

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La física de superficies Los avances de la física de superficies han producido una avalancha de conocimientos, básicos y aplicados, sobre el comportamiento atómico en el universo en dos dimensiones de las superficies sólidas Rodolfo Miranda

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l ser humano se ha sentido siempre fascinado por la superficie de las cosas. Es fácil rastrear en los antiguos testimonios de primitivos científicos, como los adivinos sumerios o los alquimistas medievales, su preocupación por entender el papel de las superficies en el comportamiento cotidiano de las cosas. En el Museo Británico de Londres se guarda lo que probablemente constituye la prueba escrita más antigua de esta atávica curiosidad: una tablilla de la época de Hammurabi, en la que se encuentra, grabada en escritura cuneiforme, una descripción detallada de las formas cambiantes de la interfase entre aceite y agua que los adivinos sumerios utilizaban para predecir el curso futuro de campañas guerreras u operaciones comerciales. Las aplicaciones prácticas de este conocimiento empírico son, asimismo, antiguas. Ya Plinio describió, con todo pormenor, cómo calmar las olas del mar arrojando pequeñas cantidades de aceite sobre su superficie. Los primeros ensayos sistemáticos que señalaban la importancia de los tratamientos superficiales estaban relacionados con la orfebrería, como la relatada en el manuscrito De pr oprie tatibus rerum , redactado aproximadamente en 1252: “Si se desea unir rígidamente una placa de oro con otra de plata, antes de golpearlas con el martillo, debe uno precaverse contra el viento, el polvo y la humedad, porque si alguna de estas tres cosas se introdujera entre el oro y la plata, no se podrá juntarlas”. En el curso del enorme avance científico que tuvo lugar en el siglo pasado se pusieron las bases para dos de las 46

aplicaciones más importantes, todavía hoy, de la ciencia de superficies. En 1833, Michael Faraday realizó unos cuidadosos experimentos que le permitieron adelantar una explicación del misterioso efecto que producía el platino sobre la reacción entre el hidrógeno y el oxígeno, induciéndola a temperaturas muy inferiores a la de combustión. Faraday sentó así los fundamentos de nuestra comprensión actual de la acción catalítica de las superficies sólidas. En 1873, Karl Ferdinand Braun observó, por su parte, que la unión entre una punta afilada metálica y cristales de semiconductores compuestos (el sulfuro de hierro o plomo) presentaba propiedades rectificadoras, esto es, que la corriente eléctrica circulaba mejor en una dirección que en la opuesta. El joven Braun (tenía 24 años en ese momento) atribuyó ese comportamiento a la existencia de una capa delgada en la interfase entre ambos materiales. Este descubrimiento es la base de los diodos y transistores presentes en toda la electrónica moderna. Braun recibió el premio Nobel de física en 1909, junto con Marconi, por el desarrollo de los rectificadores de estado sólido que condujo a la telegrafía sin hilos. Ya en nuestro siglo se produjeron dos avances importantísimos en el desarrollo de la física de superficies, Philip Lenard puso a punto técnicas espectroscópicas que aprovechaban el efecto fotoeléctrico (descubierto por Hertz en 1887 y cuya explicación le valió a Einstein el premio Nobel en 1921) y Clinton Davisson descubrió la difracción de electrones (por lo que fue galardonado con el Nobel en 1937). Ambos fenómenos están relacionados

con notables propiedades de la superficie, como ya sus respectivos descubridores observaron. De hecho, hoy en día, constituyen el fundamento de dos técnicas habituales para determinar la estructura electrónica y geométrica, respectivamente, de las superficies: la espectroscopía de fotoelectrones y la difracción de electrones de baja energía [ véase “Estructuras atómicas de superficies sólidas”, por P. M. Echenique y M. H. van Hove; I NVESTIGACIÓN Y CIENCIA , abril de 1979]. Sin embargo, es Irving Langmuir, ilustre físico estadounidense que recibió el premio Nobel en 1932, el que es considerado padre de la física de superficies moderna. En efecto, en las décadas entre las dos guerras mundiales, Langmuir realizó una ingente labor creando los métodos experimentales de alto vacío, los cuales le permitieron abordar problemas básicos, como la reducción en la función de trabajo producida por la absorción de metales alcalinos sobre superficies metálicas, la emisión termoiónica o los mecanismos de quimisorción. Sus amplios intereses científicos le llevaron a brillantes aplicaciones de sus descubrimientos, como las lámparas incandescentes de atmósfera inerte, básicamente idénticas a las que se emplean hoy en día. Suya es la principal responsabilidad de haber elevado la física de superficies a la categoría de disciplina con entidad propia.

S

i éste fue el nacimiento de la especialidad, el acontecimiento decisivo que desencadenó un enorme interés por la física fundamental de las superficies de semiconductores recayó en el descubrimiento del transistor de contacto puntual por Bardeen y TEMAS 29

1. NUESTRA APRECIACION de la estructura superficial se modifica drásticamente al observarla a magnificaciones crecientes. Los científicos han desarrollado continuamente instrumentos que nos permiten observar las superficies que nos rodean con un nivel de detalle cada vez mayor. Toda una generación de microscopios han sido los responsables fundamentales de esta tarea. Una oblea de silicio monocristalina (arriba), utilizada en la industria microelectrónica, presenta a simple vista el aspecto de un espejo perfecto. En el microscopio electrónico de barrido, la superficie de un monocristal de semiconductor (centro) es una sucesión de terrazas planas de varias micras de tamaño promedio. Por fin, el microscopio de efecto túnel, el más exquisito de los microscopios disponibles, nos muestra a la escala atómica los detalles estructurales de una superficie de un monocristal metálico (abajo) que ha sido recubierta con una sola capa atómica de azufre. En esta imagen se observa una colección asombrosamente regular de átomos. A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

) jo a b a ( M A U S A L , A G R A P E D Z E U Q Z A V . L O E D A M A ,) o rt n e c y a irb r a ( M I N E C , Z E Ñ A B I N I U Q A O J

47

la existencia de campanas de vacío comerciales, en las que, por primera vez, era posible limpiar la superficie y mantenerla en condiciones controladas. En 1969 Harris introdujo la espectroscopía de electrones Auger, que permite determinar la composición química de una superficie con una sensibilidad del orden del 1 por ciento de una capa atómica.

M A U S A L

D

esde la década de los setenta, la física de superficies ha emergido como un ejemplo emblemático de revolución científica según el conocido arquetipo de Thomas Kuhn, historia-

2. SISTEMA DE ULTRAALTO VACIO (UAV) típico. Una serie de bombas de vacío eliminan las moléculas del ambiente hasta conseguir una presión en el interior de la campana del orden de 10–13 atmósferas (equivalente a la presión en la superficie de la Luna) de modo que la superficie de la muestra pueda ser mantenida limpia durante el tiempo necesario para realizar los experimentos. Brattain, seguido por el del transistor de unión p- n por Shockley en diciembre de 1947. En la posguerra, atraídos por la indudable importancia de las aplicaciones prácticas, los físicos teóricos del estado sólido trataron de comprender las propiedades de las superficies de los sólidos. Así, mie ntras Nevill Mott (premio Nobel en 1977) sugería una explica-

ción de los fenómenos en la unión metal-semiconductor, Nicolás Cabrera, entonces en la Universidad de Bristol, con la ayuda de su colaborador W. K. Burton, elaboró en 1949 una teoría refinada del crecimiento cristalino, todavía utilizada. Pero fue, sin duda, el desarrollo técnico derivado de la carrera espacial lo que posibilitó en la década de los sesenta

M A U S A L

3. MODELO SIMPLIFICADO de una superficie cristalina. En ella pueden encontrarse distintos tip os de defectos: átomos que faltan (vacantes), escalones de altura atómica que flanquean las terrazas planas de tamaño irregular y pequeñas islas en las terrazas. Hay, además, átomos y moléculas de contaminantes que se encuentran adsorbidas en la superficie o que están incorporados a la misma. 48

tra de dor visión la ciencia. del mundo El cambio que comporta en nuestoda revolución científica es, en este caso, la aparición de la región material de la interfase entre dos medios como una entidad autónoma. Un estado de la materia con sus propias leyes, composición química, estructura geométrica, estados electrónicos y dinámica atómica. Este cambio conceptual ha ido acompañado en la década de los ochenta por un altísimo refinamiento de las técnicas experimentales y un número creciente de investigadores dedicados a ella, por la realización de cuantiosas inversiones y por la proliferación de especialidades científica s (física de la materia condensada, ciencia de materiales, microelectrónica, optoelectrónica, catálisis, quimicofísica, electroquímica, etcétera) que se han visto enriquecidas por los desarrollos recientes de la física de superficies. Pero, ¿qué es una superficie? Entre dos medios cualesquiera (sólido-gas, sólido-líquido, sólido-sólido, etcétera) siempre existe una zona superficial o interfacial que los separa. Esta región tiene propiedades mecánicas, de composición o electrónicas distinguibles de los medios que la flanquean. El espesor de la zona que debemos considerar superficie o interfase depende del tipo de propiedades a que nos estemos refiriendo. A veces puede ser estrictamente una sola capa atómica, mientras que en otras ocasiones puede extenderse decenas o incluso cientos de capas. Si nos ce ñimos a la interfase sólido-vacío, de la que poseemos mayor información en la actualidad, es sabido que tanto la disposición geométrica de los átomos de la superficie del sólido como los estados electrónicos pueden diferir notablemente de los del volumen. La región de la superficie puede tener una composición química distinta de la del interior del sólido. La superficie expuesta a la atmósfera, por ejemplo, está cubierta por capas de conTEMAS 29

taminación debido a las reacciones con los gases y vapores de ésta. Normalmente se forman óxidos y a menudo sulfuros, carbonatos u otros compuestos, según sean el substrato y el ambiente. Además, la superficie puede presentar trazas de materiales que han estado en contacto previo con ella. Así, una superficie ordinaria, aunque esté limpia a simple vista, es, en realidad, un complejo sistema de componentes químicos y restos de impurezas. Por ello, se acostumbra distinguir las superficies “reales” de las “ideales”, atómicamente limpias, en el sentido de no tener material extraño adherido a ellas. a naturaleza de las superficies reales reviste un enorme interés práctico. La mayoría de las aplicaciones en que están comprometidas las superficies (lubricación, corrosión o rozamiento) requieren una comprensión de las propiedades de las superficies reales. Con este fin se han desarrollado múltiples métodos no destructivos de análisis químico que permiten obtener la composición atómica de la superficie de un material sólido con alta resolución lateral (véase la figura 4 ). Sin embargo, la explosión de actividad en la física de superficies registrada desde los años setenta ha tenido como objetivo fundamental el estudio de superficies monocristalinas y atómicamente limpias. ¿Por qué se estudian estas superficies casi ideales? ¿Por qué se ha desarrollado para ello un amplio abanico de técnicas experimentales de refinada complejidad? En primer lugar, porque nuestra capacidad para preparar superficies altamente perfectas ha abierto la posibilidad de explorar un universo en dos dim ensione s. Esto es algo fascinante. Según se cree hoy, la dimensionalidad desempeña un papel clave en la teoría moderna de muchos fenómenos colectivos. Por ejemplo, en una transición de fase continua el comportamiento crítico depende sólo de la simetría del sistema, la dimensionalidad del parámetro de orden y la dimensionalidad del espacio. Esta propiedad se llama universalidad y sugiere que pueden suceder cosas interesantes en la superficie donde la dimensionalidad efectiva es dos, no tres. De hecho, gracias al método del grupo de renormalización [ véase “Problemas físicos con muchas escalas de longitud”, por Kenneth Wilson; INVESTIGACIÓN Y C IENCIA , octubre de 1979], es posible calcular con exactitud los exponentes críticos en transiciones de fase bidimensionales y comparar

R E B I R

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A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

4. EN UN MICROSCOPIO AUGER DE BARRIDO se pueden obtener mapas de composición química de la superficie de una muestra con excelente resolución lateral. En la figura se muestra la superficie de una oblea monocristalina de silicio, de las empleadas usualmente en la industria microelectrónica, sobre la que se han evaporado partículas de oro. Se presentan imágenes de la distribución lateral de oro, oxígeno y silicio, así como la imagen conjunta. Los aglomerados de oro aparecen en la imagen superior derecha como islas brillantes. En la imagen inferior derecha se observa una acumulación de oxígeno en las proximidades de las islas de oro, probablemente como resultado de la acción catalítica de este metal sobre la oxidación del silicio. nuestros modelos teóricos con la realidad exterior. En los últimos años, la física en dos dimensiones nos ha deparado ya algunos descubrimientos inesperados; entre otros, la naturaleza especial de la fusión superficial o el efecto Hall cuántico, por el cual Klaus von Klitzing recibió el premio Nobel en 1985. Si sólo fuera ésa la razón para estudiar superficies de sólidos, nuestra especialidad no habría pasado de ser una curiosidad académica. La razón fundamental del florecimiento de la física de superficies reside en su utilidad práctica en algunos campos tecnológicos de primerísima importancia económica como la microelectrónica, la catálisis, los tratamientos superficiales por implantación iónica o láser y la ingeniería atómica de materiales que permite la fabricación de materiales artificiales con propiedades ajustadas a nuestros deseos. Para avanzar en nuestro conocimiento de estos complejos procesos, conviene comenzar con una superficie ideal y depositar sobre ella, de un modo controlado, las impurezas o áto-

mos cuyo papel se desee determinar. Esto se consigue trabajando en condiciones de ultraalto vacío ( UAV ), donde la muestra pueda ser limpiada adecuadamente y mantenida en este estado el tiempo suficiente para realizar los experimentos planeados. Habitualmente, la presión necesaria es muy reducida, del orden de 10 –13 atmósferas, equivalente a la presión en la superficie de la Luna, y se consigue bombeando con una variedad de dispositivos un recipiente de acero inoxidable con ventanas y puertas removibles. La limpieza de la muestra una vez en UAV se consigue por bombardeo iónico con un gas noble o por rotura en vacío. etengámonos en las reconstrucciones superficiales. Lo mismo la posición geométrica de los átomos, que la distribución energética de los estados electrónicos en las proximidades de la superficie de un cristal, difieren, en general, de su posición y distribución en el interior del volumen. Débese ello a la rotura de la simetría y a la distinta coordinación

D

49

una superficie semiconductora pueden modificarse depositando átomos de otra especie química sobre ella. Así, al adsorber media monocapa de un metal alcalino , como potasio o cesio, sobre la cara (100) de silicio, se produce una drástica disminución de la función de trabajo. Este fenómeno es esencial para la construcción de detectores de radiación electromagnética en la región de los infrarrojos.

O I S N E S A . C . M Y L E H C I M . G . E , Z E R A V L A . J

L

os detectores ópticos han constituido un área de investigación privilegiada ya desde la época de Langmuir. Un detector eficiente de

106 104 102 100 98 96 ENERGIA DE ENLACE (eV)

cualquier sistema radiación infrarroja dees visión el corazón nocturna, de de detección de tumores o de astronomía infrarroja. Puede fabricarse un detector semejante mediante un SiO2 Si X1/2 substrato semicondu ctor (silicio o ar106 104 102 100 98 96 seniuro de galio) en el cual se ha hecho ENERGIA DE ENLACE (eV) disminuir la función de trabajo por evaporación de óxidos de metales alcalinos sobre su superficie. La disminución debe ser tal que el nivel de energía del vacío en el exterior de la 106 104 102 100 98 96 superficie se encuentre por debajo de ENERGIA DE ENLACE (eV) la banda de conducción en el volumen. Esto es lo que se conoce como afini5. ESPECTROS DE FOTOEMISION con rayos X del nivel p2 de silicio. El espectro de la parte dad electrónica negativa ( AEN ). En inferior izquierda corresponde al óxido que crece espontáneamente al exponer un cristal de estas condiciones, un fotón de enersilicio a la atmósfera (óxido nativo). El de la parte superior izquierda, a un óxido térmico cre-gía mayor que el intervalo prohibido cido por el procedimiento habitual en la industria. El pico a mayor energía de ligadura se ori- del semiconductor produce, al ser gina en átomos de silicio ligados químicamente a oxígeno, mientras que el de la derecha re- absorbido por el material, un par elecfleja silicio unido a silicio. La distancia en energía entre ambos picos indica que la composición trón-hueco. Los electrones pueden química del óxido es SiO. La altura relativa de ambos picos indica el espesor del óxido en emitirse al exterior del dispositivo. cada caso. El panel de la2 izquierda muestra el proceso de crecimiento de un óxido de silicio De este modo, se transforma la ramediante oxidación catalítica promovida por potasio. Los datos prueban que el óxido así pre- diación infrarroja en corriente elécparado tiene una composición química idéntica al industrial. Los espectros han sido obteni- trica, que puede luego manipularse dos por J. Alvarez, E. G. Michel y M. C. Asensio en el LASUANI. de manera conveniente hasta resultar en la imagen visible de la fuente de radiación ( véase la figura 8 ). de los átomos de la superficie con resencuentran en la superficie se desEn el curso de una investigación pecto a los del volumen. Si nos imaplazan bastante de las posiciones destinada a aclarar la estructura ginamos un cristal metálico como un equivalentes a las que ocuparían en microscópica de estos fotocátodos, conjunto de bolas de acero unidas con el volumen. En el caso de la superfiEva Oellig y Enrique G. Michel, entonmuelles y cortamos éstos a lo largo cie (100) del silicio, los átomos se junces estudiantes de doctorado del labode un plano para formar una supertan de dos en dos formando dímeros, ratorio de física de superficies de la ficie, no es difícil entender intuitilo cual reduce a la mitad el número Universidad Autónoma de Madrid vamente que los átomos de la superde enlaces insatisfechos. Los enlaces ( LASUAM ), demostraron que los meficie puedan moverse con respecto a no satisfechos que quedan forman tales alcalinos actuaban como catalas posiciones de equilibrio del voluestados electrónicos de superficie den- lizadores de la oxidación de semimen, ya que ahora no tienen vecinos tro del intervalo prohibido de enerconductores , acelerando la cinética y hacia el exterior del cristal. Los camgías del semiconductor ( véase la figu- haciendo disminuir la temperatura bios estructurales que ocurren en la del proceso. Los átomos del catalizara 6 ). Estos estados de superficie región superficial pueden implicar a acumulan carga eléctrica e influyen dor podían, además, eliminarse por varias capas atómicas. Se dice que la en el funcionamiento de los d isposi- completo de la superficie mediante un superficie se ha reconstruido. tivos electrónicos. Son, entre otras breve calentamiento a temperatura Este efecto se produce también en cosas, los responsables del fenómeno moderada. Esto ha sugerido la posilas superficies de los semiconductode fijación (“pinning”) del nivel de ble aplicación práctica de este nuevo res, aunque por distintas razones. Al Fermi, esto es, la independencia de la método para la producción de óxidos cortar un cristal de un semiconducde puerta de espesor controlado en función de trabajo (mínima energía tor para formar una superficie, aparequerida para extraer un electrón del las próximas generaciones de disporecen enlaces direccionales rotos, que cristal) del silicio con respecto al ni- sitivos microelectrónicos. Para ello, representan una enorme energía. vel de dopado del volumen. es necesario comprobar la composiPara rebajarla, los átomos que se Las propiedades electrónicas de ción y microestructura de los óxidos RAYOS X

X1/2

50

TEMAS 29

de silicio así producidos y compararlos con los desarrollados por los métodos habituales en la industria. La composición química de estos óxidos, como la de cualquier muestra sólida, puede ser objeto de análisis por espectroscopía de fotoelectrones. En esta técnica, heredera directa del efecto fotoeléctrico, se envía un haz monocromático de rayos X (por ejemplo, la radiación Mg K α con una energía de 1253,6 electronvolt) sobre la muestra, donde arranca electrones de los niveles electrónicos profundos. La energía cinética de los fotoelectrones es la diferencia entre deenergía la ligadura dede loslos fotones electrones y la energía en el sólido. Estas son características del elemento químico al que pertenece el electrón y de su estado químico. Por tanto, midiendo la energía de los fotoelectrones emitidos al vacío se obtiene un espectro con picos a ciertas energías, cuyas alturas relativas reflejan la composición de la muestra analizada. En el caso que nos ocupa, el óxido de silicio producido por oxidación catalítica tiene una composición química (SiO 2) idéntica a la del óxido térmico preparado a alta temperatura en atmósfera de oxígeno. El microscopio de efecto túnel (STM), inventado por Binnig y Rohrer (por lo que fueron galardonados con el premio Nobel en 1985) nos ofrece una visión sorprendente de la microestructura de los óxidos preparados por oxidación catalítica. La imagen de la figura 7, tomada por Amadeo L. Vázquez de Parga y Carmen Ocal, sugiere que el óxido de silicio catalítico ha crecido a través de una reacción química de estado sólido entre los óxidos del metal alcalino y el substrato de silicio. La reacción de transferencia del oxígeno entre el metal alcalino y el cristal semiconductor tiene un fuerte carácter local, que da lugar a la aparición de los aglomerados circulares visibles en la imagen del STM . Como consecuencia inesperada del esfuerzo realizado para controlar la activación de fotocátodos, se han hecho recientemente avances muy importantes en nuestra comprensión del proceso de formación de la barrera Schottky en la interfase metal-semiconductor. Esta barrera energética es responsable de la actividad rectificadora de la unión metal-semiconductor descubierta por K. F. Braun hace más de un siglo. La explicación microscópica de la formación de la barrera Schottky se había convertido en una piedra de toque para la física de superficies. En efecto, las pruebas A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

SEMICONDUCTOR

Evac Esup c Ø

Evol c EF

– – – ESTADOS DE SUPERFICIE Esup v +

L L E U G N I M N O G A R A O I N O T N A Y A D N A IR M . R

+ +

Evol v

VACIO

6. LA ENERGIA POTENCIAL DE UN ELECTRON en un semiconductor presenta un intervalo prohibido, donde no existen estados cuánticos permitidos para el electrón. En la figura se indican los bordes de la banda de valencia y de conducción de un semiconductor dopado con impurezas que introducen electrones (tipon), así como el nivel de Fermi. La posición de éste en el volumen puede modificarse a voluntad cambiando el dopaje. La presencia de estados electrónicos de superficie en la zona prohibida de energía modifica la distribución de carga. La carga acumulada en estos estados se srcina en la zona de vaciado que se extiende hacia el interior del cristal. Como resultado de esta transferencia de carga, las bandas electrónicas se curvan cerca de la superficie y el nivel de Fermi queda fijado en el centro de la región prohibida. Al variar el dopaje en el volumen, cambia la curvatura de las bandas pero no la posición del nivel de Fermi en la zona prohibida. La función de trabajo (distancia entre el nivel de Fermi y el de vacío) es independiente del dopaje volúmico.

L A C O N E M R A C Y A G R A P E D Z E U Q Z A V . L O E D A M A

7. EL MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL STM ( ) muestra sorprendentes diferencias entre dos óxidos crecidos sobre una oblea de silicio. Los óxidos tienen el mismo espesor promedio medido por espectroscopía Auger. Ambos no presentan, además, diferencia alguna con respecto a otros contaminantes. La imagen de la izquierda corresponde a un óxido nativo. El otro ha sido preparado mediante oxidación catalítica del silicio a través de un método desarrollado en el laboratorio del autor que consiste en evaporar potasio sobre el substrato, exponer a oxígeno y calentar brevemente el cristal de silicio dentro del sistema de vacío. En tanto que el óxido nativo reproduce, básicamente, la estructura de terrazas del substrato monocristalino, el óxido catalítico presenta un aspecto de núcleos redondeados de unos 50 angstrom de tamaño promedio, propio de una reacción química local. 51

L L E U G IN M N O G A R A O I N O T N A Y A D N A R I M O F L O D O R

Evol c

–

–

Evac

hν ØB EF Evol v

– – –

+

MIGS

VACIO

Cs+O2+Cs

GaAs TIPO p

8. ORIGEN DE LA BARRERA SCHOTTKY. Algunas superficies de semiconductores , como la cara (110) del AsGa, no tienen estados electrónicos de superficie en la zona prohibida. En este caso las bandas electrónicas so n planas hasta la superficie. Al depositar una capa de cesio metálico sobre la superficie, la función de onda de los electrones deslocalizados del metal se extiende al interior de la zona prohibida del semiconductor. Así se inducen estados electrónicos denominados MIGS (siglas de “Metal Induced Gap States”) qu e fijan el nivel de Fermi aproximadamente en el centro de la zona prohibida con independencia del tipo de dopaje volúmico. Las bandas del semiconductor quedan curvadas, dando srcen a una barrera energética para el transporte de carga entre semiconductor y metal que se conoce como barrera Schottky, φB. Si depositamos un aislante que no tenga niveles electrónicos en ese rango de energías, por ejemplo, óxido de cesio, no aparecen estados en la región prohibida. El nivel de Fermi queda libre dentro del intervalo, “gap” y su posición depende ahora del tipo de dopaje. Una nueva evaporación d e cesio sobre la muestra devuelve el carácter metálico a la interfase, fijando de nuevo el nivel de Fermi en el centro de la zona prohibida y curvando las bandas. La figura ilustra el principio de funcionamiento de un fotocátodo sensible al infrarrojo. experimentales indicaban que una sola capa atómica de metal depositada sobre la superficie del semiconductor bastaba para producir la misma barrera Schottky encontrada en los diodos y dispositivos comerciales. Los investigadores habían concluido que, en la interfase, había unos estados electrónicos, localizados en el intervalo de energía, en el interior de la zona prohibida del semiconductor; éstos fijaban la posición energética del nivel de Fermi, determinando así la altura de la barrera. Ahora bien, ¿cuál era el origen de estos estados? Un largo contencioso se había estado desarrollando entre dos escuelas de pensamiento. Una de ellas, representada por Bill Spicer, de la Universidad de Stanford, consideraba que los estados que fijaban la posición del nivel de Fermi estaban producidos por defectos introducidos en el substrato durante la deposición del metal. La otra escuela se srcinó en una idea de Volker Heine, de la Universidad de Cambridge, desarrollada y perfeccionada por Fer52

nando Flores, de la UAM . Esta proponía que el simple hecho de tener un metal en contacto con un semiconductor inducía estados electrónicos en el intervalo de energía prohibido. El carácter metálico de la capa absorbida sería, por tanto, determinante.

U

n elegante experimento diseñado y realizado por José Enrique Ortega, del LASUAM , en colaboración con Clemens Laubschat, Mario Priestch y Gunter Kaindl, del centro de radiación de sincrotrón BESSY en Berlín, ha arrojado luz sobre la cuestión debatida. Para evitar la formación de defectos, era preciso asegurarse de que la adsorción del metal no dañaba la red del semiconductor; para comprobar el papel de la metalicidad, se requería una capa depositada cuyo carácter metálico pudiera encenderse y apagarse a voluntad. La primera condición se conseguía evaporando cesio a baja temperatura sobre arseniuro de galio; la segunda, adsorbiendo oxígeno sobre la capa metálica, lo que producía óxidos de cesio

de carácter aislante. Los resultados experimentales demostraron que, si bien la presencia de defectos en suficiente densidad podía fijar el nivel de Fermi, éstos no eran necesarios en absoluto para explicar lo que ocurría. El carácter metálico de la capa depositada sobre la superficie semiconductora perfecta era, de hecho, la condición básica requerida. La mayoría de los semiconductore s usados en la tecnología moderna son, de hecho, monocristales, razón por la cual la aplicación directa de los descubrimientos de la física básica de superficies resulta casi inmediata. les de En cambio, uso cotidiano, la mayoría desde de los unmetatenedor hasta las pistas de metalización de un circuito integrado, son policristales: sus superficies están constituidas, pues, por una variedad de planos cristalinos. A pesar de ello, los investigadores han conseguido desarrollar (“crecer” en el argot) en los laboratorios monocristales metálicos y cortarlos adecuadamente para exponer una sola cara cristalina. La información obtenida de este modo es crucial para comprender el funcionamiento de las superficies reales, incluso en propiedades tan complejas como la actividad catalítica. Los catalizadores de reacciones heterogéneas están compuestos por pequeños aglomerados metálicos dispersados, para aumentar su superficie, sobre substratos de alúmina o zeolita. En la práctica, los catalizadores son “promovidos” por aditivos que contienen metales alcalinos, especialmente potasio, con el fin de mejorar la selectividad o la reactividad del catalizador. Entre los ejemplos bien conocidos de reacciones así catalizadas citaremos la síntesis FischerTropsch de hidrocarburos a partir de mezclas de CO y H 2, o la eliminación del CO y NO de los gases de los tubos de escape de los automóviles. El papel exacto de los promotores alcalinos ha sido muy debatido en los últimos años. Las técnicas de la física de superficies han hecho algunas importantes aportaciones a nuestra comprensión de los procesos catalíticos. En un trabajo del autor en colaboración con el grupo de Gerhard Ertl, entonces en la Universidad de Munich, se ha desarrollado un método para determinar la orientación de moléculas quimisorbidas sobre substratos metálicos. Para ello es necesario emplear las propiedades únicas de la radiación de sincrotrón [véase “La radiación de sincrotrón” por Herman Winick; I NV EST IGA CIÓ N Y C IENCIA , enero de 1988]; en particuTEMAS 29

lar, el hecho de que esta radiación se halle totalmente polarizada en el plano de la órbita de los electrones. Al enviar fotones de una energía dada sobre la muestra, se extraen electrones de cada uno de los orbitales moleculares accesibles. Estos fotoelectrones son colectados por un analizador bidimensional que mide cuántos electrones de cierta energía cinética se emiten en cada dirección del espacio.

L

as reglas cuánticas de selección obligan a que el estado inicial y final del proceso de fotoemisión tengamos gan unauna simetría molécula adecuada. con un eje Suponde simetría (como el monóxido de carbono, CO), adsorbida perpendicularmente a la superficie. En ese caso, no se emitirían fotoelectrones, desde los orbitales moleculares, a lo largo de las direcciones espaciales correspondientes al plano perpendicular al vector campo eléctrico de la radiación incidente. Así se ha determinado que el monóxido de carbono se adsorbe con su eje C–O perpendicular a la superficie de un cristal de paladio limpio. Al depositar potasio sobre la superficie del paladio, las moléculas de CO adsorbidas en las proximidades de los átomos del promotor se encuentran notablemente inclinadas con su eje formando un ángulo de más de 20 grados con respecto a la normal a la superficie. Estos resultados indican que el papel de los promotores podría ser el de inclinar el eje interatómico de las moléculas adsorbidas, lo cual alarga su distancia internuclear, debilita su enlace y facilita su disociación. Como hemos mencionado antes, cabe esperar que las propiedades colectivas (superconductividad, magnetismo) de la superficie difieran bastante de las mismas en el volumen. Una de las magnitudes que definen las propied ades magn éticas de un sólido es la temperatura de Curie, T c. Por encima de ella, el material deja de comportarse como un imán, esto es, la magnetización se hace cero. La temperatura de Curie puede medirse experimentalmente determinando a qué temperatura desaparece el ciclo de histéresis característico de un material ferromagnético. Es posible explorar el efecto de la dimensionalidad en el comportamiento magnético estudiando las propiedades, por ejemplo la temperatura de Curie, de capas muy delgadas de material ferromagnético en función de su espesor. Para ello es preciso seleccionar los materiales adecuados y prepararA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

los apropiadamente. Recientemente, siguiendo una sugerencia de Félix Ynduráin, de la UAM , que ha calculado que la interacción electrónica entre cobalto y cobre es extremadamente pequeña, se ha realizado este experimento desarrollando epitaxialmente películas de un material magnético (cobalto) sobre un substrato monocristalino de un material no magnético (cobre). El número de capas atómicas depositadas sobre el substrato se puede determinar con precisión exquisita, midiendo la intensidad reflejada de un haz de átomos de helio que se hace

de átomos que se han depositado. Cuando el cristal del substrato se ha preparado de una manera cuidadosa, es posible desarrollar capas bidimensionales de alta perfección estructural. Así, Juan José de Miguel, del LASUAM , en un trabajo conjunto con el grupo de J. Kirschner, de la Universidad Libre de Berlín, ha determinado la temperatura de Curie de capas ultradelgadas de cobalto de espesor variable crecidas epitaxialmente sobre cobre. Han obtenido unos resultados sorprendentes. La temperatura de Curie de películas delgadas es mucho menor que la del

mientras incidir sobre éstelaestá superficie creciendo. del cristal, La técnica se muestra extraordinariamente sensible al orden superficial, ya que los átomos de helio, al ser neutros, no pueden penetrar dentro de la superficie y rebotan como bolas de billar sobre ella. La intensidad reflejada oscila durante la evaporación, siendo máxima cuando se completa una capa atómica y mínima justo cuando se ha depositado media monocapa. Basta, pues, contar las oscilaciones para saber el número de capas

tablemente material masivo con ely,espesor además,evaporado. varía noSe necesitan de cinco a seis capas de átomos para alcanzar la temperatura de Curie del volumen. Más sorprendente aún es el hecho de que una extrapolación lineal de los datos experimentales sugiera que la temperatura de Curie de una sola capa atómica de cobalto sea de cero grados Kelvin; esto es, una capa estrictamente bidimensional no presentaría orden magnético a ninguna temperatura finita.

NUMERO DE CAPAS DEPOSITADAS

1,0

0,4

L L E U G N I M N O G A R A IO N O T N A Y ) M A U S A (L O G E L L A G . M E S O J Y N O R R E F IO L U J

I/0 I A D A J E L F E R D A ID S N E T N I

1,0

0,5 0

1

2

9. OSCILACIONES DE LA INTENSIDAD DEL HAZ ESPECULAR de átomos de helio reflej ado por la superficie de un cristal de cobre durante su crecimiento a partir de un vapor de átomos de cobre. El crecimiento del cristal se lleva a cabo por evaporación térmica de cobre sobre el substrato mediante epitaxia de haces moleculares. Las oscilaciones reflejan la perfección estructural del cristal durante el proceso de crecimiento epitaxial. Cuanto mayor es el orden, mayor es la intensidad reflejada por la superficie. Dependiendo de la temperatura del substrato, el cristal crece por propagación de sus escalones naturales (en cuyo caso la intensidad reflejada no oscila) o por nucleación de islas bidimensionales sobre las terrazas. Este modo de crecimiento, propuesto por Cabrera y Burton en 1949, ha sido confirmado por los datos de dispersión de átomos de helio y por simulaciones de Monte Carlo realizadas por Julio Ferrón y José M. Gallego, del laboratorio de superficies de la UAM. 53

Estos resultados nos han permitido explorar un terreno de gran interés práctico. En efecto, la industria que utiliza el almacenamiento magnético de información demanda el desarrollo de soportes materiales que puedan contener cada vez mayor cantidad de información. En particular, sería muy conveniente poder almacenar información magnética en tres dimensiones. Para ello deberíamos disponer de nuevos materiales con alta anisotropía estructural y magnética [ véase “Materiales electrónicos y magnéticos” por Prahaven Chaudhari, I NVESTIGACIÓN Y CIENCIA ,

M A U S A L

extendida en diciembre de 1986]. la actualidad Una estrategia consiste en desarrollar, en condiciones de ultraalto vacío, cristales sintéticos de periodicidad artificial: las superredes. Una superr ed metálica está formada por capas delgadas alternadas de dos metales A y B, de distintas propiedades. En el caso que nos ocupa, A se10. ORIENTACION de moléculas adsorbidas; puede ser determinada experimentalmente uti- ría un material magnético y B un melizando las reglas de selección que gobiernan el proceso de fotoemisión desde orbitales mo- tal no magnético. Los átomos de leculares de simetría bien definida. Las moléculas de monóxido de carbono se adsorben per- ambos metales se evaporan cuidapendicularmente a la superficie en un metal limpio, con el átomo de carbono cerca de la dosamente sobre un soporte elegido, superficie. Las moléculas adsorbidas se inclinan fuera de lo normal en las proximidades de para que el crecimiento de ambos sea átomos de metales alcalinos (representados por la bola azul en la figura) como resultado epitaxial y sus periodicidades vertide interacciones electrostáticas de corto alcance. Esta modificación parece ser un paso in- cales bien definidas. De este modo, termedio crucial en el proceso de rotura catalítica de la molécula. se consigue desarrollar cristales con las periodicidades deseadas de fases que no existen en la naturaleza o que son metaestables. La exploración de Co/Cu (100) las propiedades magnéticas de estos nuevos materiales no ha hecho más 1400 que comenzar, y ya nos ha suminisTc VOLUMEN ) trado varias sorpresas, indicio de que IN V algo excitante se esconde en la natuL 1200 E raleza cuando nuestro control sobre K M S ella alcanza este nivel de refinaO D1000 miento. A R (G E I R U C E D A R U T A R E P M E T

E

n un esfuerzo reciente del laboratorio de superficies de la UAM , A. Cebollada y J. M. Gallego han desarrollado multicapas cristalinas de 600 cobalto/cobre por evaporación alternada sobre la cara (100) de moH nocristales de cobre. El espesor de 400 cobalto repetido periódicamente ha superado siempre la cifra de seis ca200 pas atómicas, de suerte que cada unidad estructural de la superred alcanzase las propiedades magnéticas del volumen. El número de capas evapo0123456 radas y su perfección estructural se RECUBRIMIENTO DE COBALTO (CAPAS ATOMICAS) han determinado mediante la técni11. LA TEMPERATURA DE CURIE, Tc, de películas delgadas epitaxiales de cobalto crecidas ca de oscilaciones en la intensidad sobre un substrato monocristalino de cobre depende muy fuertemente del espesor de la ca- reflejada de haces de helio descrita pa de cobalto. Como muestra la figura, el valor experimental decTse ha determinado com- más arriba, probando a qué temperatura desaparece el ciclo de histéresis característico de un material Las propiedades magnéticas de ferromagnético. Nótese que la extrapolación de los datos indica que tan sólo son necesarias estas superredes metálicas, estudiaentre cinco y seis capas atómicas para que la película de cobalto se comporte como el vo- das en colaboración con J. L. M artínez lumen. Por otro lado, la extrapolación sugiere que una sola capa atómica de cobalto podría mediante difracción de neutrones en no presentar orden magnético a ninguna temperatura finita. el Instituto Laue-Langevin, han resul-

L L E U G N I M N O G A R A IO N O T N A Y A D N A IR M O F L O D O R

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800

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TEMAS 29

L L E U G N I M N O G A R A O I N O T N A Y A D N A IR M O F L O D O R

LA

LA+LB LB

Cu

Co

12. SUPERRED METALICA compuesta por dos metales distintos, A y B, crecidos alternadamente con una periodicidad LA y LB, respectivamente. La periodicidad cristalina de la superred es LA + LB. Para obtener una superred cristalina es preciso elegir los metales A y B de modo que sus constantes de red no sean muy distintas y evaporarlos en condiciones controladas de ultraalto vacío. En superredes de cobalto y cobre crecidas epitaxialmente se observa que, en ausencia de campo magnético externo, el vector magnetización de las capas de cobalto (flechas) se alinea antiparalelamente en capas próx imas. La superred en su conjunto tiene un orden antiferromagnético y una magnetización nula. Bajo un campo magnético suficientemente elevado, los vectores magnetización de todas las capas de cobalto apuntan en la misma dirección. Para campos intermedios, la magnetización de cada capa de cobalto gira en el plano un cierto ángulo para minimizar su energía, de manera que, a determinados campos magnéticos, aparecen complejos ordenamientos tridimensionales del vector magnetización que sugieren la posibilidad de almacenar información magnética en tres dimensiones. tado ser inesperadas. En ausencia de un campo magnético exterior, la superred se comporta como un material antiferromag nético, esto es, el vector magnetización de las capas de cobalto, que se encuentra siempre en el plano de éstas, está ordenado antiparalelamente en capas consecutivas ( véase la figura 12 ). En estas condiciones, la superred en su conjunto no presenta magnetización alguna. Al ap lica r un ca mpo ma gnético exterior de intensidad elevada en la dirección paralela al plano de las capas, éstas se ordenan magnéticamente en la dirección del campo externo y la superred se convierte en ferromagnética. Sin embargo, lo más interesante ocurre cuando el campo externo se aumenta de una manera suave. Para ciertos valores bien definidos de éste, la magnetización de la superred parece crecer de una manera discreta. Esto sugiere que, aplicando un campo magnético exterior de esta magnitud, es posible crear complejos patrones de magnetización en la superred. La aplicación práctica de estos descubrimientos para el almacenamiento de información no está aún a la vista, pero es indiscutible que nuestra capacidad de explorar la física de sistemas de baja dimensionalidad A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

está abriendo por primera vez un mundo fascinante a nuestros ojos. Los ejemplos reseñados en este artículo describen parte del esfuerzo realizado en los últimos años en el laboratorio de superficies de la UAM . Aunque no cubren toda la riqueza de la física de superficies e interfases, sí pueden considerarse representativos de la fase explosiva de crecimiento que ésta atraviesa desde hace unos años en todo el mundo. Benevolentemente, podría calificarse la situación actual de esta disciplina como de adolescencia. Los próximos años conducirán, con toda probabilidad, a una etapa de madurez en la que la comprensión y el control de la naturaleza, en su nivel atómico, que estamos alcanzando, fructificará en nuevos y espectaculares desarrollos básicos y aplicados.

BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA LOW ENERGY ELECTRONS AND SURFACE CHEMISTRY. G. Ertl y J. Küppers. Chemie Verlag, 1987. PHYSICSAT SURFACES. Andrew Zwangwill. Cambridge Unversity Press, 1988.

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Técnicas de microfotografía Con un equipo sencillo y económico se pueden sacar microfotografías claras, brillantes a las que no les falten interés científico y gran belleza Jearl Walker

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l mundo oculto que revela el microscopio ha fascinado a muchos científicos aficionados. Durante los últimos 20 años, varios de estos animosos investigadores han llegado a adquirir una notable habilidad para fotografiar lo que observaban a través del microscopio. Analizaremos aquí algunas técnicas que permiten a los diestros en el uso del microscopio sacar tales imágenes fotográficas. Podemos encontrar información sobre la microfotografía en diferentes fuentes. La mía es James Bell, de Allston, Massachusetts. Nos ha suministrado diversas muestras de lo que su técnica microfotográfica es capaz de conseguir (las hemos reproducido en las dos páginas siguientes). La variedad de especímenes que pueden observarse y fotografiarse es casi infinita, de ahí que los ejemplos de Bell los demos sólo a título de introducción. Aunque los fotógrafos profesionales suelen trabajar con equipos muy complejos y caros, las fotografías realizadas por Bell muestran que hasta con un equipo sencillo y económico pueden hacerse fotografías de sorprendente belleza y de gran interés científico. Bell trabajó con un microscopio monocular Bausch and Lomb fabricado en 1915, equipado con unos viejos objetivos Leitz de 10 y 100 aumentos y unos oculares con un poder de aumento de 10, 7 y 2,5. Disponía de un espejo para dirigir la luz hacia un condensador, el cual hacía que toda la luz convergiera sobre la muestra. Bell quitó el objetivo de su cámara Asahiflex de 35 milímetros, e incorporó la misma al microscopio con un adaptador especial para microscopio, que se encuentra en las tiendas del ramo y que sirve para evitar el paso de la luz del exterior. Enfocó el microscopio de manera que la imagen se for56

mara sobre el cristal del fondo d e la cámara. Para evitar los movimientos a la hora de hacer las fotos, Bell accionaba la cámara con un cable disparador. Sacó las fotos con velocidades de obturación entre 1/500 y 1/25 segundos, empleando películas Ektachrome-X o Ektachrome-64. Hay que usar luz muy intensa, pues sólo una pequeña parte de ella llega a la película. Bell se servía para la iluminación de un proyector de diapositivas normal con una lámpara de 400 watt. Para colimar la luz sustituyó el objetivo del proyector por otro que concentraba la luz. En caso de trabajar con menos luz que la empleada por Bell, es necesario incrementar el tiempo de exposición en un segundo o incluso más. Más difícil resulta obtener fotografías claras con objetos en movimiento; lo más probable es que sólo consigamos un borrón. Si para una fotografía en particular, la luz es demasiado intensa, Bell la atenúa colocando filtros de transparencia uniforme en la trayectoria de los rayos procedentes del proyector. Dichos filtros pueden comprarse en las casas de artículos fotográficos o pueden ser fabricados fotografiando una hoja de papel blanco y revelando el negativo. El componente infrarrojo del rayo de luz puede dañar a las muestras, sobre todo si se trata de organismos vivos. Para eliminar dicho componente nocivo de los rayos, puede colocarse un recipiente con agua (de caras paralelas para evitar reflexiones) o bien diversas piezas de cristal óptico en la trayectoria del rayo de luz. El proyector puede incorporar un sistema de refrigeración con idéntica finalidad práctica. La iluminación con fondo claro es la más común de los diversos tipos de iluminación que se pueden emplear, pero tiene el inconveniente de que destaca poco los detalles de las mues-

tras. Bell logra este tipo de iluminación orientando el espejo de manera que el condensador situado debajo del soporte del espécimen en el microscopio haga que toda la luz converja en dicha muestra. Obrando así, se verá la luz transmitida a través del espécimen. Esta técnica no podrá aplicarse, pues, ni con especímenes gruesos ni opacos, e incluso con muestras delgadas no siempre se distinguirá bien su estructura interna. Por otra parte, los colores naturales de los elementos u organismos a observar, se pierden frecuentemente con el fondo claro. De todos modos, esta técnica puede resultar útil para fotografiar muestras finas en blanco y negro. Si se quiere obtener la mayor resolución posible, aspecto crucial en trabajos de mucho aumento, deben secundarse las directrices que se indican, respecto a la iluminación Köhler, en el libro Phot ograph y th rou gh the Mi cr os co pe , auténtica biblia de la microfotografía. Dicho libro ha sido publicado por la Eastman Kodak Company. El manual le dirá cómo ajustar el espejo, el colector y el condensador, de manera que el filamento de la lámpara esté enfocado sobre el condensador y éste a su vez enfoque la imagen del colector sobre el soporte de la muestra. (El colector es la lente situada entre el espejo y la fuente de luz.) Con este método de enfoque la muestra queda uniformemente iluminada y no se ve la imagen enfocada del filamento. a fotografía de Bell que aparece en la figura 1 constituye un ejemplo de la técnica de fondo claro. Bell empleó 1100 aumentos para fotografiar células vivas del alga de agua dulce Elod ea , poniendo de manifiesto los distintos cloroplastos. Momentos después de haber tomado la fotografía, los cloroplastos comenzaron a

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TEMAS 29

1. Alga fotografiada con la técnica de campo brillante de James Bell.

2. Cristales de éster de colesterol.

3. Embrión de caracol.

4. Colonia rotífera de Conochilus.

L L E B

S E M A J

5. La pulga de agua Simocephalus. A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

6. El copépodo Cyclops. 57

7. Cristal de vitamina C.

8. El mismo cristal visto a través de celofán polarizador.

9. Cristales de ácido hipúrico.

10. Cristales de resorcinol.

11. Cristal líquido nemático.

12. Ala de mariposa.

L L E B S E M A J

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TEMAS 29

girar dentro de las células conforme iba produciéndose en ellos la fotosíntesis a partir de la luz procedente del proyector. Aunque algunos detalles salen en la fotografía, la imagen no es tan nítida como en otras fotografías, debido en parte a que ese elevado aumento redujo la profundidad de campo. Puede obtenerse un buen contraste en la foto si colocamos la muestra sobre un fondo negro. Para conseguir dicho fondo mientras el objeto a observar seguía estando iluminado, Bell puso un punto negro en un filtro de cristal blanco, que situó justo debajo taobjetos. del condensador Tenía instalado bien abierto bajoeleldiaporfragma del condensador de suerte que suministrara un ancho cono de luz. El punto negro tenía por misión proyectar una sombra sobre la muestra a fotografiar. La luz que sobresalía por los bordes del punto iluminaba la muestra con luz blanca, por lo que sus colores naturales seguían viéndose. Cuando el portaobjetos está vacío, los rayos de luz que llegan al objetivo del microscopio han sufrido una divergencia tal que no entra ninguna luz por el tubo; ello determina que ni el observador ni la cámara vean más que un campo obscuro. Con la muestra en el portaobjetos, la luz se dispersa desde él hacia el interior del tubo, permitiendo que el espécimen pueda contemplarse. Esta técnica requiere una intensa fuente luminosa, ya que sólo llegará a la cámara una pequeña parte de la luz inicial. El filtro para producir el fondo negro se construye pegando un pequeño círculo opaco de cartulina negra sobre un filtro de cristal transparente. El diámetro del círculo debe ser de cinco milímetros o algo más. Conviene determinar el tamaño óptimo probando varios en su propio microscopio. El campo debe verse obscuro cuando no haya nada en el portaobjetos, y aparecerá iluminado cuando coloquemos un espécimen para su observación.

B

ell domina la técnica de la iluminación con fondo obscuro con sólo su objetivo de bajo aumento (10 diámetros). Un aumento mayor da lugar a fotografías con un contraste menor debido a la dificultad de mantener la lente que hace de objetivo dentro del cono obscuro proyectado por el punto opaco. Para enfocar correctamente, los objetivos de muchos aumentos deben aproximarse bastante a la muestra; la lente empieza luego a interceptar algunos rayos de luz que provienen de los bordes del punto A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

N A M D O O G L E A H IC M

CAMARA

ADAPTADOR AL MICROSCOPIO SEGUNDO POLARIZADOR COLOCADO DEBAJO DEL ADAPTADOR

CABLE DISPARADOR

OBJETIVOS

MUESTRA SITUAR EL PRIMER POLARIZADOR AQUI

CONDENSADOR ESPEJO

CONDENSADOR DEL PROYECTOR

13. Sistema experimental de Bell. opaco. Para trabajar según la técnica de Bell con grandes aumentos, habría que comprar un condensador de fondo obscuro, que proporciona un cono de obscuridad más fino. Con su técnica de fondo obscuro, Bell fotografió un espécimen de Hydra y algunas colonias de Volvox que había encontrado en estanques locales. Se puede encontrar una relación completa de las muestras útiles para su observación en libros especializados que suelen venderse en los museos de historia natural. (Puede consultarse, con provecho, el Atlas de microscopía , de J. Bernis Mateu.) Puesto que la técnica fotográfica de Bell puede aplicarse a organismos vivos, si uno tiene suficiente paciencia puede obtener fotografías dife-

rentes de una misma muestra en situaciones diversas, de acuerdo con su comportamiento característico. Así, podemos fotografiar una hidra comiendo. Dándole pequeños gusanos de agua o bien diminutos trozos de carne cruda, se puede conseguir que abra la boca y despliegue su s tentáculos. Headstrom refiere que con una pequeña cantidad de ácido acético o verde de metilo consigue provocar que la hidra descargue uno de sus nematocistos. Estos tubos llenos de púas son lanzados con tal fuerza que pueden penetrar incluso en la presa del animal. Los Volvox forman una colonia esférica gelatinosa, constituida por cientos de organismos flagelados. Si se mira desde muy cerca a una de estas 59

colonias, puede apreciarse que su superficie está como bordada por flagelos, que son los apéndices en forma de latiguillo mediante los cuales los individuos flagelados pueden autopropulsarse. Headstrom recomienda recolectar muestras de este tipo con un tubo de cristal. Una vez que haya localizado una muestra en el agua de un estanque o de una charca, par a lo cual quizá sea conveniente ayudarse con una lupa, introduzca el tubo en el agua manteniéndolo tapado con el dedo. Cuando el espécimen esté lo suficientemente cerca de la boca del tubo, quite el dedo; probablemente,

que el espécimen quede depositado sobre el mismo. Para estas operaciones conviene usar portaobjetos especiales que tienen una pequeña concavidad donde queda recogida la muestra con una pequeña cantidad de agua. Algunas muestras contrastan mejor con un fondo de color que con un fondo obscuro. Para conseguir este tipo de colorido (llamado iluminación parcial Rheinberg), Bell sustituyó el punto opaco negro por un punto transparente de color. Por ejemplo, para conseguir un buen contraste con una muestra roja, Bell utilizaba un punto

Un fondo azul sirvió a Bell para fotografiar unos cristales de un éster de colesterol que habían recristalizado bajo el cubreobjetos. El fondo permite ver la interfase entre los cristales y las grietas provocadas por las tensiones internas dentro de cada cristal. Para fotografiar embriones del caracol de agua dulce cuando aún se encuentran dentro del huevo, Bell empleó un punto verde con un aumento de 80 diámetros. Estos delicadísimos detalles se hubiesen perdido totalmente con una iluminación con fondo brillante. Con una iluminación Rheinberg

el muestra la interior del se verá tuboarrastrada por la corriente hacia de agua que se forma al llenarse. Vuelva a tapar el tubo con el dedo y sáquelo del agua. A continuación, con mucho cuidado, vierta el agua sobre el portaobjetos del microscopio hasta

filtroso verde, azul de plástico que recortaba de dichos colores. de unos El espécimen continúa apareciendo con su color natural, ya que es iluminado principalmente por la luz blanca procedente de la zona exterior al punto.

quier colorBell completa, para puede iluminar seleccionar la muestra cualy puede elegir un color diferente para el fondo. El único cambio que debe sufrir el método es pegar un anillo de plástico ligeramente coloreado alrededor del punto más obscuro. La luz

LUZ NO POLARIZADA

LUZ LINEALMENTE POLARIZADA

PORCION DE LA MUESTRA LUZ LINEALMENTE POLARIZADA

PELICULA

CELOFAN LAMPARA DEL PROYECTOR

PRIMER FILTRO POLARIZADOR

EQUIVALENTE A UNA LAMINA DE UNA ONDA A LA LONGITUD DE ONDA CONSIDERADA

SEGUNDO FILTRO POLARIZADOR

LUZ LINEALMENTE POLARIZADA

NO LLEGA LUZ DEL COLOR CONSIDERADO A LA PELICULA

LUZ LINEALMENTE POLARIZADA

EQUIVALENTE A UNA LAMINA DE MEDIA ONDA A LA LONGITUD DE ONDA CONSIDERADA

LUZ ELIPTICAMENTE POLARIZADA

N A M D O O G L E A H C I M

LUZ ELIPTICAMENTE POLARIZADA

EQUIVALENTE A UNA LAMINA DE UN CUARTO DE ONDA A LA LONGITUD DE ONDA CONSIDERADA

14. Cambios de polarización debidos a la birrefringencia. 60

TEMAS 29

que atraviesa el punto da entonces el color del fondo, mientras que la luz procedente del anillo colorea la muestra. A 120 aumentos, Bell fotografió con un punto azul y un anillo amarillo una colonia de rotíferos Conochilus . En una carta que el propio Bell me envió, me decía que los rotíferos habrían sido punto menos que invisibles con una técnica de iluminación de fondo brillante: el contraste de colores resulta fundamental para distinguir sus contornos y su estructura interna.

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N A M D O O G L E A H IC M

OBJETIVO DEL MICROSCOPIO

RAYOS DE LUZ DISPERSADOS POR LA MUESTRA

MUESTRA

ell asegura que la técnica más eficaz para obtener el mejor con-

grafíasde traste usando colores luzespolarizada. hacer las Esta fototécnica de trabajo sólo sirve con materiales birrefringentes, tales como los cristales, los músculos y algunos pequeños organismos pluricelulares. Se coloca un filtro polarizador en el proyector de diapositivas (como si fuera una diapositiva normal), con lo que el aparato suministra luz polarizada. Se introduce un segundo filtro en el ocular del microscopio, de manera que se pueda girar hasta que el campo de visión a lo largo del microscopio sea o bien obscuro o brillante, según que el filtro bloquee o deje pasar la dirección de polarización de la luz que viene a través del aparato. Cuando se introduce un material birrefringente en el portaobjetos, la luz polarizada producida por el primer filtro altera su polarización cuando pasa a través del material. Si la alteración es adecuada, parte de la luz puede pasar entonces a través del segundo filtro polarizador, en el ocular, aun cuando el filtro bloquearía la luz. En resumen, la luz se transmite a través de este material cuando parte de la misma está polarizada a lo largo de un eje y la otra polarizada a lo largo de un eje perpendicular. Ambos ejes son perpendiculares al rayo de luz. La velocidad de la luz es mayor en uno de los sentidos de polarización que en el otro. En razón de esta diferencia, los dos sentidos de polarización pueden salir procedentes del material fuera de fase. La polarización emergente está determinada por la combinación de dos sentidos de polarización: en consecuencia, la luz que sale podría estar polarizada de varias formas. Si los dos sentidos de polarización salen con una diferencia de fase de media longitud de onda, la luz que emerge está otra vez linealmente polarizada, pero ahora lo estará a lo largo de un eje perpendicular a la dirección de polarización de la luz A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

AREA ILUMINADA EN EL FILTRO

CIRCULO OPACO NEGRO QUE PROPORCIONA EL FONDO OBSCURO

15. Preparación de un fondo obscuro. incidente. Esta luz que sale puede ser transmitida o bloqueada por el filtro polarizador situado en el ocular, según la orientación de éste. Si la birrefringencia ha obligado a las direcciones de polarización que salen a estar desfasadas un cuarto de longitud de onda, la luz que emerge estará polarizada elípticamente: ello significa que la punta del vector de polarización gira alrededor del rayo de luz, describiendo una elipse. Esta luz pasará por el filtro situado en el ocular, con independencia de la orientación de éste. Si los sentidos de polarización emergentes coinciden, la luz transmitida estará polarizada de la misma forma que la luz incidente. La orientación del segundo filtro determinará entonces si se ve ono luz alguna.

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l que se obtenga un resultado u otro depende del espesor y birrefringencia de la muestra y de la longitud de onda de la luz. Para una región concreta de la muestra, el extremo rojo del espectro de la luz blanca incidente sobre él puede acabar siendo bloqueado por el segundo filtro polarizador, mientras que puede transmitirse el azul. Esta zona aparecerá de color azul para el o bservador. Puede aparecer otra zona de color amarillo cuando estén bloqueados los otros colores de la luz blanca incidente. La ventaja de usar así luz polarizada estriba en que la variación de color que se produce en la muestra,

que de otra forma sería incolora, permite al observador distinguir sus perfiles y su estructura. Bell me ha enviado dos fotografías hechas con luz polarizada. En la primera, tomada a 120 aumentos, se aprecian cristales de ácido hipúrico que se habían disuelto en isopropanol y se recristalizaron luego en la diapositiva. La muestra era lo suficientemente birrefringente y no uniforme como para producir muchos colores. En el otro ejemplo (a 150 aumentos) se había disuelto cristales de resorcinol en acetona, que se quemó después para facilitar la recristalización rápida. Se pueden producir más contrastes de color poniendo uno o más trozos de papel de celofán o de cinta adhesiva transparente en el soporte del filtro por debajo de la muestra. Ambos son materiales birrefringentes que alteran la polarización de la luz. En lugar de celofán podemos usar un trozo de mica fina que puede sacarse fácilmente de un fragmento mayor con una cuchilla. Se supone que cualquiera de estos materiales actúa como filtro retardador, porque obliga a que un sentido de polarización quede detrás del sentido perpendicular. Un filtro de retardo es útil para aumentar la variación de colo r en un modelo débilmente birrefringente. No todos los tipos de celofán habrán de valer, por lo que será preciso probar varios hasta dar con el adecuado. También 61

podrían usarse hojas de plástico del tipo de las que se emplean para envolver alimentos. ell ha presentado algunos otros ejemplos de cómo usa la luz polarizada. Hizo una fotografía de 100 aumentos a una pulga de agua viva con su cría poniendo un punto azul de fondo y con celofán y filtros polarizadores para destacar la estructura interna del animal. La mancha del ojo queda en negro, y el tubo digestivo en naranja. A 50 aumentos, fotografió de una forma similar el copépodo Cyclops ,

un cristal líquido nemático se sacó a 100 aumentos, a temperatura ambiente, tras haber disuelto el material en acetona. El movimiento en esta recristalización fue tan rápido que tuvo que disparar la fotografía a 1/500 segundos para retener la actividad. Debido a su espesor algunas muestras no pueden fotografiarse con luz transmitida; el obstáculo se salva con luz reflejada. Para ello, Bell apoya el proyector en unos libros y ajusta el ángulo de la luz incidente hasta que obtiene la iluminación adecuada en la muestra. Un ejemplo del resultado es su fotografía del ala de una mari-

negro con la diferencia para proporcionar de que usóun un fondo punto obscuro. El animal aparece con la mancha de los ojos en rojo, dos bandas musculares en amarillo y el tubo digestivo en marrón. Los dos sacos laterales de forma de pera contienen huevos. Muchos de estos detalles se hubieran perdido en un campo iluminado normalmente. Puede comprobarse el efecto del celofán en dos fotografías de Bell, ambas de ácido ascórbico (vitamina C) recristalizado por él. Las fotografías muestran los dos mismos cristales adyacentes, y se tomaron exactamente igual, con la salvedad de que se utilizó celofán para la segunda fotografía. Adviértas e que en la última el color adicional se debe a la birrefringencia del celofán. Bell preparó los cristales disolviendo ácido ascórbico en isopropanol, puso luego un poco de esta solución en un cristal portaobjetos y quemó después el alcohol. Los cristales se formaron a los pocos segundos. Una vez sacada una serie de fotografías, puede volverse a disolver el ácido ascórbico y empezar de nuevo. Esta técnica produce cristales lo suficientemente finos como para que resulten transparentes; por tanto, pueden fotografiarse fácilmente. Otro método de obtención de cristales es dejar que el disolvente se evapore lentamente. El lector puede conseguir también una cristalización fundiendo la sustancia en un portaobjetos sobre una llama. Aquélla cristalizará al enfriarse. Bell no es muy partidario de esta técnica, porque el punto de fusión de algunas sustancias es demasiado alto, y ello hace que se rompan muchos portaobjetos. Sin embargo, señala que, si se quieren estudiar ciertos tipos de cristales líquidos, habrá que recurrir a dicha técnica, enfriando la sustancia lentamente desde su punto de fusión para conseguir el estado de líquido cristalino. La fotografía de Be ll de

en lasMuchos posa. alas dede laslosmariposas, colores queen selos ven élitros de los escarabaj os y en las plumas de las aves no se deben a la pigmentación, sino a la interferencia de las ondas de luz. Algunas alas de mariposa están formadas por capas de cutícula transparente. Cuando se refleja la luz de una de las capas, parte de ella procede de la reflexión en su superficie externa y otra parte proviene de su superficie posterior, después de haber atravesado la capa en cuestión. Los dos rayos emergentes pueden interferir entre sí para producir colores, como ocurre en las pompas de jabón. Quizás el observador quiera ver varios tipos distintos de alas de mariposa. Estas pueden comprarse en casas dedicadas a muestras empleadas en prácticas de ciencias naturales y en tiendas de objetos de regalo de muchas ciudades. La interferencia de colores resultaría ser muy débil si el ala estuviera iluminada sólo con la luz transmitida. Los colores tendrían que aparecer, entonces, como consecuencia de la interferencia entre la luz transmitida por la capa similar a la cutícula (sin reflexión interna) y la luz doblemente reflejada en el interior de la capa, antes de salir. Esta luz será tan débil, con relación a la luz no reflejada, que producirá poca interferencia (y, por tanto, poco color). Para encontrar la exposición ideal hay que controlar los disparos con una gama de tiempos de exposición o bien incorporar un medidor de luz en el microscopio. Bell usa un medidor de luz casero compuesto por un voltímetro digital capaz de detectar hasta varios milivolt y una fotocélula de silicio. Bell montó la célula en una carcasa de cartón que se encajaba sobre el punto de mira de la cámara. A medida que cambia la intensidad de luz con la muestra y el modo de iluminación, la resistencia de la fotocélula varía inversamente. A través de los circuitos intermedios,

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estas variaciones modifican la lectura en el contador de milivolt. Tras varios experimentos, Bell consiguió construir una tabla de lecturas de manera que fuera posible interpretarlas inmediatamente en función del tiempo de exposición. (En el número de junio de 1977 de la revista Pop ula r Ele ctronic s aparecía diseñado un medidor de luz simple, aunque muy sensible, que podía construirse sin gran complicación con un fotorresistor de sulfuro de cadmio.)

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i se quiere obtener una buena reproducción de los colores natu-

en la elección rales de un modelo, del tipo conviene de película atinar de color que se use; debe estar ajustada a la distribución de colores de la lámpara. Todas las lámparas parecen blancas para el ojo humano, pero la distribución real de intensidades a través del espectro visible depende de la temperatura de la superficie emisora de la lámpara. Una lámpara de luz blanca, de baja temperatura, tiene menos bajas frecuencias de luz visible (es decir, el final azul del espectro) que una lámpara de temperatura más alta. Las distintas películas de color se han ajustado de alguna forma para compensar esta diferencia de distribución del color de la luz blanca. Sin embargo, puede haber alguna discrepancia entre los colores reales de un modelo y lo que se ve en una fotografía en color. Se puede remediar la situación poniendo un filtro de color delante del proyector (o cualquier otra fuente de color). El libro de Kodak explica qué filtros deben emplearse. Bell tenía una lámpara DAT de 400 watt en su proyector. La temperatura de la superficie del filamento emisor es tan alta que la luz semeja la luz solar en cuanto a la distribución de color. Por ello utilizaba película de color especial para la luz solar en vez de las películas que tienen un equilibrio de colores calculado para lámparas de tungsteno que funcionen a temperaturas superficiales inferiores.

BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA PHOTOGRAPHY THROUGH THE MICROSCOPE. Eastman Kodak Company, 1974 (con reediciones posteriores). ADVENTURES WITH A MICROSCOPE. Richard Headstrom. Dover Publications, Inc., 1977. ATLAS DE MICROSCOPÍA. J. Bernis Mateu. Jover, D. L., varias ediciones entre 1976 y 1986.

TEMAS 29

OBSERVACIONES

S E N O J D R A H IC R

Camillo Golgi y la reacción negra La voluntad y el rigor intelectual estuvieron en el srcen de los descubrimientos de este gran médico que le llevaron, desde un hospital provinciano, hasta el reconocimiento internacional y al premio Nobel Paolo Mazzarello

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l 26 de octubre de 1906, Camillo Golgi, a la sazón profesor de histología y patología general de la Universidad de Pavía, recibió un telegrama del director del Instituto Karolinska de Estocolmo donde se le comunicaba la concesión del premio Nobel de medicina y fisiología. Fue el primer italiano que recibía el máximo reconocimiento científico internacional, galardón que coronaba una aventura intelectual iniciada en el Hospital de Beneficencia de Incurables de Abbiategrasso, un nosocomio de enfermos crónicos, lejos del circuito académico. Camillo Golgi nació el 7 de julio de 1843 en Corteno (hoy Corteno Golgi), una aldea de las montañas de la alta Valcamonica. Hijo de médico rural, creció con el ejemplo diario que le brindaba su progenitor, siempre dispuesto a partir en medio de la noche para auxiliar a un enfermo grave o para asistir un parto en una choza perdida en las montañas. Concluidos los estudios primarios y secundarios, Golgi se matriculó en la facultad de medicina de la Universidad de Pavía, sin más ambición que licenciarse para ejercer la profesión paterna. Por aquella época, el de Pavía era el único ateneo de Lombardía y en él encontró Golgi una verdadera efervescencia cultural. Después de la primera fase de la unificación italiana, los estudios en medicina de Pavía se habían transformado y vivificado con elementos didácticos que incluían nuevas materias, como las revolucionarias conquistas de la biología alemana, la patología celular de Rudolf Wirchow o la teoría celular de Mathias Jacob Schleiden y Theodor Schwann, que despertaban el entusiasmo de los estudiantes. De esta forma, las ideas que habían modifi64

cado el mapa de Italia se entrelazaban con las nuevas teorías sobre la constitución de los organismos, sobre los procesos patológicos y sobre la naturaleza de los fenómenos biológicos. En este marco conceptual, la vida, la psíquica incluida, no era sino un

momento de organización y estructuración particulares de la materia, destinada cíclicamente a terminar por transformarse merced al impulso de las fuerzas que actuaban sobre los compuestos químicos. No en vano El ciclo de la vida era el título de uno de los textos fundamentales del posiTEMAS 29

nocido ya desde que a los veinte años escribió un ensayo titulado Sobre la locura de Cardano , terminó por decidir la suerte de Camillo Golgi. La atención a los enfermos ya no era el ideal al que sentía debía dedicar su vida. Mucho más fascinante le resultaba el estudio del cerebro y de los fenómenos nerviosos, un campo de investigación clave para la filosofía materialista que reducía la psiquiatría a neuropatología y que no consideraba el cerebro como órgano del alma sino de la psique. Después de un período de incertidumbre profesional, Golgi ingresa como asistente

A I V A P E D D A D I S R E IV N U A L E D L A R E N E G IA G O L O T A P E D O T U T I T S IN

N I R U T E D L A N I IM R C IA G O L O P O R T N A E D O E S U M , O S S O R G O M O C IA G

1. PALACIO DEL JARDIN BOTANICO de Pavía, donde estaba ubicado el Instituto de Patología general dirigido por Giulio Bizzozero (abajo, a la derecha). Arriba, a la izquierda, Camillo Golgi en la época en que se aplicó al estudio de la biología de la infección de malaria. Arriba, a la derecha, retrato de Cesare Lombroso. tivismo científico de la época, escrito por el filósofo materialista holandés Jakob Moleschott y traducido al italiano por Cesare Lombroso, entonces profesor de psiquiatría en la Universidad de Pavía. El 7 de agosto de 1865 fue Lombroso el ponente de la tesina de licenciatura sobre la etiología de A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

las enajenaciones mentales preparada por Golgi. En la mente del joven laureado, el grado constituía el punto de partida para el ejercicio de una honesta profesión médica. Pero la fascinación contagiosa que emanaba de una personalidad tan ecléctica y entusiasta como la de su mentor, co-

de Pavía y empieza hospitalario en la clínica a apasionarse psiquiátrica por la investigación científica. El meticuloso Golgi bien pronto descubriría en la personalidad de Lombroso todas sus extravagancias y sus deficiencias metodológicas. De hecho sólo en apariencia seguía el axioma epistemológico positivista que oficialmente abrazaba, según el cual una verdad científica es la que se deriva de hechos, a partir de los cuales se establecen leyes mediante inducción. En realidad Lombroso se nutría más de intuiciones repentinas que de sólidas deducciones. Al servicio de estas intuiciones destellantes ponía toda su energía creadora, seleccionando el dato experimental si le convenía y despreciándolo si no se ajustaba a sus teorías. Golgi, insatisfecho por la falta de rigor de Lombroso, comenzó a frecuentar el Instituto de Patología General en el tiempo libre que le dejaba su labor asistencial. El antropólogo Paolo Mantegazza había organizado el instituto pocos años antes en el palacio del jardín botánico; en aquella época lo dirigía Giulio Bizzozero. Tres años más joven que Golgi, Bizzozero era la personalidad emergente de la investigación lombarda. Con el microscopio por emblema, consideraba la ciencia escrita en alemán un espejo en el que mirarse. Se había licenciado en medicina en 1866 a la edad de veinte años; después de breves estancias de estudio en los laboratorios de Heinrich Frey en Zurich y de Rudolf Virchow en Berlín, había pasado directamente del banco estudiantil a la cátedra de patología general. Su estilo de investigador riguroso y de docente eficaz contrastaba con la picaresca de Lombroso. Si al psiquiatra se debe reconocer el haber inflamado el espíritu de Golgi por el estudio del sistema nervioso, es mérito de Bizzozero el haber despejado el camino científico del futuro premio Nobel, la vía histológica hacia 65

la neurobiología. Golgi empezó así a publicar sus primeros trabajos científicos. Entre éstos deben mencionarse un ensayo sobre las causas de las enfermedades mentales y un trabajo notable sobre la estructura de la glía, el tejido que sirve de sostén al sistema nervioso. Un hospital provinciano y un mic ros cop io

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principio de los años setenta, Golgi era ya un virtuoso del microscopio. La investigación histológica era para él la verdadera vocación a la que entregarse. Se empezaba a rehecho desu conocer quetalento, se le encargara, como prueba sin retriel bución, la docencia de técnicas microscópicas, pero en la Universidad de Pavía escaseaban las posibilidades de encontrar trabajo. El padre de Camillo se impacientaba por que su hijo soñador, que trabajaba mucho y ganaba poco (y además pagaba de su bolsillo la impresión de su labor científica), encontrara finalmente un puesto seguro y bien remunerado. A principios de 1872, se convocó un concurso para un puesto de médico general en el Hospital de Beneficencia de Incurables de Abbiategrasso. Animado por el padre, Golgi vaciló si participar y resultó a la postre el ganador. Llegados a este punto de su vida, nada permitía imaginar un futuro de premio Nobel. El hospital de crónicos carecía de instrumental científico y no estaban contemplados más gastos que los derivados del alojamiento y tratamiento de los pacientes. Para un joven médico que ya había probado el placer de la investigación científica, la situación debía ser, desde cualquier punto de vista, deprimente. En la correspondencia que intercambió por entonces con un amigo oculista, Niccolò Manfredi, Golgi lamenta “las pequeñas molestias”, que le producen “un torpor intelectual tan grande” que le limitan “completamente la capacidad de trabajo”, sumiéndole en una “inercia vergonzosa”. Pero hacia finales del año, Golgi ya se estaba rehaciendo. En la cocina del pequeño apartamento que tenía asignado en el hospital había organizado un rudimentario laboratorio formado básicamente por un microscopio. Utilizando una cuchilla, realizaba finos cortes de tejido nervioso y había reiniciado su trabajo de investigación. El 16 de febrero de 1873, escribe con renovado ánimo a su amigo Manfredi: “Ahora he retomado la labor que había abandonado hace meses. Trabajo muchas horas con el micros66

IA V A P E D D A D I S R E V I N U A L E D L A R E N E G A I G O L O T A P E D O T U IT T N S I

copio. Estoy feliz porque he encontrado una reacción nueva que demuestra también las estructuras de la estroma intersticial de la corteza cerebral. Añado nitrato de plata a las muestras de cerebro endurecidas en bicromato potásico. Ya he conseguido resultados muy buenos y espero obtener bastantes más”. Es el primer anuncio conocido de la reacción negra (“reazione nera”) que cambiaría el curso de la neuroanatomía y de la neurohistología de finales del siglo XIX, permitiendo una descripción topográfica precisa de la estructura del sistema nerviosos central. No se conoce qué camino siguió Golgi hasta dar con la reacción (se podría hablar tanto del descubrimiento de un fenómeno bioquímico, como de la invención de una técnica de investigación). A partir de las escasas alusiones contenidas en sus escritos y de algún testimonio, es lícito suponer que durante su período de formación en Pavía había recibido alguna indicación indirecta. De su descubrimiento, Golgi sólo proporciona una frase:

A I V A P E D D A D I S R E IV N U A L E D L A R E N E G IA G O L O T A P E D O T U IT T S N I

2. REACCION NEGRA en la médula espinal, en una preparación srcinal del laboratorio de Camillo Golgi. TEMAS 29

A I V A P , D A ID S R E V I N U A L E D IA R O T S I H A L

4. MICROSCOPIO utilizado por Camillo Golgi en sus investigaciones.

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el mundo, ha sido el único que ha permitido observar a la célula nerviosa en toda su integridad. A pesar de ello, la importancia de este descubrimiento sólo se empezó a reconocer una quincena de años más tarde, cuando hicieron un extenso uso del método el padre de la histología del siglo diecinueve, Albert Kölliker, el neuroanatomista español Santiago Ramón y Cajal y e l biólogo sueco Gustaf Retzius. El axón

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provechando las enormes posibilidades para la investigación

3. GOLGI, en la foto de recuerdo de los distinguidos honoris causa por la Universidad de Cambridge (1898), pocos meses después del descubrimiento del aparato reticular interno (aparato de Golgi). De izquierda a derecha, Étienne-Jules Marey, Anton Dohrn, Camillo Golgi, Ernst Haeckel, Ambrosius Arnold Wilhelm Hubrecht, Wilhelm Kühne, Henry Bowditch, Hugo K. Kronecker. había llegado a él estudiando las impregnaciones metálicas en muestras fijadas de muy diversa manera, tras una larga serie de tentativas. La reacción negra se compone de una primera fase de fijación y endurecimiento de los tejidos en bicromato potásico que dura un período variable, de quince días a más de un mes. A continuación viene un paso por nitrato de plata a lo largo de un tiempo mínimo de veinticuatro a cuarenta y ocho horas (aunque a veces la reacción es observable a las dos o tres horas). Como resultado se obtiene la precipitación de una sal, el cromato de plata, que tiñe de color negro la A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

célula nerviosa, con todas sus prolongaciones y ramificaciones. La ventaja del método reside en que, por motivos aún desconocidos, el precipitado colorea en el campo microscópico sólo un pequeño porcentaje de las células (entre el uno y el cinco por ciento). De esta manera, de la laberíntica complejidad del sistema nervioso emerge la silueta de una sola célula, que aparece como un árbol sacado con todas sus ramas de un bosque inextricable. Durante gran parte de este siglo, el método de Golgi, utilizado en los laboratorios de todo

hizobrindaba que algunos descubrimientos la nueva técnica, que Golgi revolucionaron la fisiología celular del sistema nervioso de la época. Según el modelo dominante de Joseph Gerlach, el elemento celular fundamental de la transmisión nerviosa era la dendrita (entonces conocida como proceso protoplasmático). Sus ramificaciones permitían la interrelación compleja entre distintos grupos nerviosos, tal como se suponía dada la variabilidad de las funciones del encéfalo. Las dendritas de las distintas células se fundirían en una red sincitial extendida por todo el sistema nervioso; en ella se srcinarían las fibras de la sustancia blanca. Golgi demostró que el axón (entonces llamado cilindroeje o prolongación nerviosa) está ramificado y excluyó la posibilidad de que las dendritas de las células nerviosas se fundieran en una red. Quedaba, pues, desmentido el reticularismo de Gerlach: para explicar la complejidad de las uniones nerviosas bastaban las ramificaciones de los axones. Por tanto, era el axón y no las dendritas el elemento por el que viajaba la transmisión nerviosa a distancia. Pero Golgi no abandonó del todo el paradigma reticular. Paul Broca había demostrado en 1861 la localización cortical de la capacidad lingüística humana, pero hacia 1870 la opción holística conservaba aún su influencia, desde que a mediados de siglo Marie-Jean Pierre Flourens formulara su teoría de que las funciones de la corteza cerebral se producían por una actividad cortical global. La hipótesis era terreno abonado para un modelo celular de “vasos comunicantes”, donde cada elemento estaba unido a todos los demás a través de una red sincitial y donde la transmisión nerviosa no fluía a través de vías aisladas sino que se propagaba, por contigüidad, por 67

5. CLAUSTRO DEL ANTIGUO monasterio de Santa Clara, luego habilitado como Hospital de Beneficencia de Incurables, en Abbiategrasso.

9 7 9 -1 8 7 9 1 , 2 . L O V ”, E T A I B A H “ A L

todo el sistema nervioso. Influido por esta int erpretación, cuando Golgi se asomaba a sus portaobjetos con la reacción negra, debió pensar que, si la red no estaba formada por las dendritas, debía sostenerse en las ramificaciones de los axones. La compleja arquitectura nerviosa avalaba la teoría reticular como si de un hecho se tratara. Nacía así la teoría de la red raxonal por nerviosa difusa, la cual una losenorme impulsos rednerinteviosos se transmitían de forma difusa. La lucha contra la malaria

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n 1874 Golgi descubría ciertas lesiones en el cuerpo estriado en un enfermo de corea que había muerto en Abbiategrasso y publicó trabajos notables sobre la estructura del cerebelo y de los bulbos olfatorios. En 1876 volvía a Pavía primero como profesor extraordinario de histología y luego, tras escasos meses en la cátedra de anatomía de Siena, como profesor ordinario. Dos años más tarde descubría en el espesor de los tendones dos corpúsculos sensitivos: los órganos musculotendinosos, que llevan su epónimo, encargados de la transducció n de la tensión muscular, y los corpúsculos de Golgi-Mazzoni, que señalan estímulos de presión. En la ciudad lombarda, organizó un laboratorio que pronto se convirtió en un centro italiano de estudios biológicos de primera magnitud. Allí trabajaron, entre otros, Giovan Battista Grassi, descubridor del vector de la malaria, el mosquito Anopheles , y a quien se distinguiría con la medalla Darwin de la Regia Sociedad de Londres; Emilio Veratti, que identificó el retículo sarcoplasmático; Adelchi Negri, descubridor, en el cerebro infectado por el virus de la rabia, de los cuerpos que llevan su nombre; Antonio Carini, que identificó en Brasil el Pneu mocystis carin ii , responsable hoy en día de infecciones graves en los enfermos de sida; Carlo Martinotti, que descubrió las células con axones ascendentes de la corteza cerebral (células de Martinotti); Aldo Perroncito, que estableció las etapas fundamentales en el mecanismo de regeneración del nervio periférico. Visitaron durante algún tiempo el laboratorio de Golgi también algunos investigadores extranjeros, como el noruego Fritjof Nansen (zoólogo, explorador de las regiones polares y 68

premio Nobel de la paz en 1922), el suizo Albert Kölliker, el ruso Sergej Soukhanoff, el norteamericano Henry Herbert Donaldson (que seleccionó la cepa de los famosos ratones albinos Wistar, empleados en laboratorios de todo el mundo). En 1881, Golgi fue nombrado profesor ordinario de patología celular. Conservaba también la plaza de histología y había asumido la dirección de un pequeño grupo médico en el antiguo hospita l de San Mateo de Pavía. En 1885 recogía gran parte de sus investigaciones neuroanatómicas en el libro Sobre la anatomía fina de los órganos centrales del sistema nervioso . Después encauzó su interés

hacia otros asuntos, en particular el mecanismo patogénico de la malaria.

En el hospital del Espíritu Santo de Roma, Ettore Marchiafava y Angelo Celli habían confirmado y ampliado notablemente las observaciones de Alphonse Laveran, médico militar que, en Constantine (Argelia), había descubierto en la sangre de pacientes con malaria un microorganismo y lo había reconocido como agente etiológico de la enfermedad. Golgi pasó algunos días en septiembre de 1885 con Marciafava y Celli y se convenció de lo acertado de sus deducciones y de las de Laveran. Pero las formas de malaria que predominaban en Roma eran irregulares en su presentación y los accesos febriles no se repetían con la precisa cadencia temporal que sí se observaba en Pavía. En la ciudad lombarda se veían TEMAS 29

IA V A P , D A ID S R E V I N U A L E D IA R O T S I H A L E D O E S U M

6. LA IMAGEN en margarita del parásito de la malaria en el período inmediatamente anterior al acceso febril a( la izquierda ). La anotación es de Golgi. Abajo, el aparato de Golgi en los ganglios espinales, en una preparación original del laboratorio de Camillo Golgi. A la derecha, dibujo realizado por Golgi del aparato reticular interno en células nerviosas de los ganglios espinales de un caballo.

3 0 9 1 , N A L I M ,I L P E O H , A I N M O A R E P O ,I G L O G O L IL M A C E D

A I V A P

E D D A D I S R E V I N U A L E D L A R E N E G IA G O L O T A P E D

O T U T I T S IN

sobre todo casos de fiebre cuartana (llamada fiebre larga) y de terciana. En la primera los accesos febriles de presentan en ciclos sucesivos de cuatro días, de tres en la segunda. De regreso a Pavía, Golgi estableció la relación de las distintas formas de desarrollo del parásito dentro de los glóbulos rojos con las fases del ciclo febril y diferenció claramente el protozoo de la fiebre terciana del de la cuartana. Aún más importante, estableció la relación de la fase febril con la “esporulación” o multiplicación de los parásitos en la sangre (ley de Golgi). Sus investigaciones sobre la malaria continuaron hasta 1892 con estudios diversos sobre el momento más adecuado para administrar quinina a los enfermos, junto con varias contribuciones sobre el papel de la fagocitosis en el curso de la enfermedad y en la patogénesis de las fiebres irregulares. En aquel período Golgi dio pruebas de su extraordinario talento para la experimentación al deA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

sarrollar también un método de estudio de la nefrona, que le permitió aclarar la histogénesis del glomérulo renal y de identificar la peculiar relación que el túbulo contorneado distal del riñón establece con el polo vascular del corpúsculo de Malpighi. Mientras tanto, sus estudios neurohistológi cos empezaban a alcanzar cierta difusión y consideración internacionales. Mucho mayor era la velocidad con la que estaba cambiando el modelo conceptual bajo el que se consideraba el sistema nervioso. Los suizos August-Henri Forel y Wilhelm His propusieron en 1886 y 1887 que también este tejido debía respetar los cánones de la teoría celular: que estuviera compuesto de células individuales y aisladas, no en una red difusa. En 1891 el alemán Wilhelm Waldeyer propuso dar a estas células el nombre de neurona. El español Santiago Ramón y Cajal comenzaba por entonces a trabajar de forma sistemática con la reacción negra y

lograba notables pruebas indirectas que confirmaban la reciente teoría de la neurona. Golgi, ocupado en la malaria, se sentía incordiado por este oscuro profesor español que, con su mismo método, demolía publicación tras publicación su teoría de la red nerviosa difusa. La polémica entre ambos tuvo su punto álgido en Estocolmo en 1906, cuando por ironía de la fortuna, ambos recibieron de forma simultánea el premio Nobel, indisolublemente unidos “como dos gemelos siameses están unidos por la espalda”, según escribió Ramón y Cajal en su autobiografía. El huidizo aparato de Golgi

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ntre 1892 y principio de 1893 Golgi descubrió, de forma independiente a lo observado por el sueco Eric Müller, los canalículos intracelulares de las células parietales de las glándulas gástricas (canalículos de Müller-Golgi), pocos meses después de ser nombrado rector de la Universidad de Pavía, cargo que mantendría hasta 1896, con el consiguiente retraso en su trabajo de laboratorio. En 1897 volvió a dedicarse con todas sus energías al estudio del sistema nervioso. Con una variante de la reacción negra, descubrió en el c itoplasma de las células de los ganglios nerviosos espinales una red de filamentos claramente separada de la membrana plasmática y del núcleo. El hallazgo 69

N IG A P M A H -C A N A B R U N E S I O N I L IL E D D A D I S R E V I N U

7. MICROFOTOGRAFIA de fluorescencia de un cultivo epitelial en)ely el que se observan los núcleos (verde aparato de Golgi (rojo).

aún no era reproducible y Golgi esperó a publicar las observaciones hasta que su colaborador Emilio Veratti logró confirmarla en las células que forman el srcen del cuarto nervio craneal. En el ínterin, él mismo reprodujo las observaciones de forma constante en las células de Purkinje. Algunos preparados microscópicos mostraban también un involucro pericelular. Así, en abril de 1898 Golgi describía estas dos particularidades a la sociedad médico-quirúrgica de Pavía: la red intracelular, que por su localización y aspecto denominó aparato reticular interno, y el involucro pericelular. Esta última observación permaneció completamente olvidada hasta hace pocos años y es ahora cuando está adquiriendo una importancia creciente en las investigaciones neurocitológicas modernas. Golgi incitó a sus discípulos a buscar el aparato intracelular (que a partir de 1910 empezó a ser conocido como aparato de Golgi) también fuera del sistema nervioso. De esta forma Antonio Pensa, Adelchi Negri y Edoardo Gemelli lo observaron en varias categorías de células y pronto quedó claro que dicho orgánulo celular no era exclusivo del campo de la neurocitología, sino que se trataba de un elemento fundamental de la célula eucariota. El descubrimiento no fue aceptado de forma unánime por la comunidad científica y no tuvo implicación en la justificación oficial de otorgarle el Nobel. Para muchos citólogos se trataba de un artefacto derivado de la gelificación de los coloides intracelulares. El poder de conocimiento que deriva de la reacción negra es verdadera70

mente extraordinario cuando se desarrolla de forma adecuada. Pero a pesar de los intentos de definirlo en términos fisicoquímicos, el método sigue siendo bastante azaroso. Entre bromas y veras, se atribuían propiedades especiales al agua de Pavía, suponiendo que su composición habría facilitado la reacción en la ciudad lombarda y justificado los errores en medio mundo. En efecto, el agua de Pavía era particularmente rica en sales ferrosas y dióxido de azufre. Cabría, por tanto, la posibilidad de que esta última substancia haya ejercido una acción reductora adicional. Golgi estuvo siempre profundamente convencido de la existencia del orgánulo que descubriera y en 1909 intuía, con gran visión, su implicación en los procesos de secreción celular. La controversia sobre la existencia del aparato de Golgi se resolvió en 1954 con la aparición del microscopio electrónico. El mismo instrumento que, al demostrar la existencia de las sinapsis nerviosas había demolido para siempre la red nerviosa difusa de Golgi, por una curiosa y singular némesis histórica fue también el medio por el que se demostró finalmente la realidad citológica del aparato reticular interno. Gracias a este descubrimiento Golgi tal vez sea el científico más mencionado en la bibliografía biológica internacional y su nombre se ha convertido en sinónimo del orgánulo que descubrió. Después de 1900, Golgi dirigió su atención a temas sociales y de política sanitaria, en particular a la lucha contra la malaria. En 1900 fue nombrado senador del reino y de 1901 a 1909 nuevamente rector de la Universidad de Pavía. Durante la Gran

Guerra dirigió el hospital militar que se organizó cerca del Colegio Borromeo de Pavía y se ocupó de la rehabilitación de los heridos de guerra. En su larga vida obtuvo distinciones honoris causa por las universidades de Cambridge, Ginebra, Atenas, Oslo y París. Luchó duramente contra el proyecto auspiciado por Luigi Mangiagalli por la creación de una segunda universidad lombarda en Milán, porque temía que este nuevo ateneo podría hacer superfluo el de Pavía. Cuando murió el 21 de enero de 1926 este hombre que había alcanzado tan altos honores y gloria había perdido las principales batallas a las que se dedicó la segunda parte de su vida: la lucha contra Ramón y Cajal y los partidarios de la teoría neuronal que estaban triunfando en los tratados de neurología y neurobiología y la que sostuvo contra Mangiagalli, que logró en 1924 fundar la Universidad de Milán.

BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA LA STRUTTURA NASCOSTA. LA VITADI CAMILLO GOLGI. Paolo Mazzarello. Cisalpino-Monduzzi; Bolonia, 1996. (Edición inglesa revisa y corregida The Hidden Structure. The Life of Camillo Golgi. Oxford University Press, Oxford, 1999.) THE BLACK REACTION . Ennio Pannese, en Brain Research Bulletin , número 41, páginas 343-349; 1996. T HE C ENTENARIAN G OLGI A PPARATUS . Paolo Mazzarello y Marina Bentivoglio, en Nature, vol. 392, págs. 543-544; 1998. G OLGI ’ S S CIENTIFIC B IOGRAPHY . Paolo Mazzarello, en Journal of the History of the Neurosciences, volumen 8, número 2, páginas 121-131; 1999.

TEMAS 29

Cajal y la estructura histológica del sistema nervioso La mitificación de Cajal ha conducido a una imagen típica basada en varios supuestos que falsean gravemente la realidad José M. López Piñero

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ajal es todo lo contrario de un “clásico” científico olvidado, tanto en España como en la comunidad científica internacional. En nuestra sociedad se ocupan continuamente de él libros, artículos periodísticos y trabajos de revistas especializadas, ha sido el tema de películas y series de televisión, tiene dedicadas calles en casi todas las poblaciones del país, se le han erigido numerosos monumentos y su mención resulta obligada en cuanto se habla de la investigación en España y de otros temas afines. Su mitificación ha conducido a una imagen tópica del genial neurohistólogo basada en varios supuestos que falsean gravemente la realidad. Uno de ellos es que fue un investigador sin raíces en la historia científica de nuestro país, “surgido por generación espontánea”, como llegó a decir Ortega y Gasset. Ello significa, por un lado, desconocer la tradición micrográfica española y, por otro, ignorar el ambiente, encabezado por Maestre de San Juan, en el que Cajal se inició en la observación microscópica. Otro de los supuestos minimiza la llamada Escuela Histológica Española, surgida en torno a la obra del gran investigador aragonés, y olvida los distintos grupos que la integraban, comenzando por no distinguir entre sus discípulos propiamente dichos y los autores influidos por él de forma menos directa. Por otra parte, la pervivencia de la obra de Cajal en la comunidad científica internacional se debe a una razón muy clara: lo mismo que Darwin, Pasteur, Virchow, Mendel o Claude Bernard, Cajal creó uno de los 72

modelos que hoy sirven de núcleos de cristalización a las ciencias biológicas. Concretamente, formuló el vigente en la actualidad acerca de la estructura del sistema nervioso y los mecanismos básicos de su funcionamiento. De forma directa, la obra cajaliana constituye uno de los fundamentos de los saberes acerca de la anatomía, la fisiología y las enfermedades nerviosas y, de modo indirecto, una de las contribuciones centrales en las que se apoyan la concepción de los organismos vivos y las ciencias de la conducta. Por ello, no resulta extraño que sea una figura familiar para cualquier cultivador de las neurociencias y conocida, en mayor o menor grado, por los que se dedican a otras tareas de la biología, la medicina o la psicología. La tradición micrográfica española

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os primeros micrógrafos españoles fueron varios miembros del movimiento novator que, en el último tercio del siglo XVII, introdujo en España la ciencia moderna. Destacó entre ellos el valenciano Crisóstomo Martínez, coetáneo de Malpighi, Leeuwenhoek y Hooke, el importante “microscopista clásico” de las estructuras óseas. A lo largo del siglo XVIII , la anatomía textural y la observación microscópica se cultivaron en nuestro país de modo continuado, desde los variados enfoques que expone María Luz Terrada en su monografía sobre el tema. Por el contrario, el profundo colapso que la vida científica española sufrió durante la guerra de la Independencia y el reinado de Fernando VII (18081833) redujo la actividad en este campo

a la mera recepción libresca de las nuevas corrientes europeas. El paso de esta asimilación puramente libresca a la recuperación de la micrografía práctica, de acuerdo con las nuevas teorías y los nuevos recursos técnicos, se inició en España en los años centrales del siglo XIX y se afianzó en la década siguiente. A dicho proceso contribuyeron notablemente personas y grupos científicos de vanguardia, situados más o menos al margen del mundo académico oficial. Aprovechando la completa libertad docente implantada por la revolución democrática de 1868, algunos de ellos fundaron instituciones privadas que contaron desde el principio con laboratorios o cátedras de anatomía microscópica. Como ejemplos típicos anotaremos el Instituto Biológico de Rafael Martínez Molina, quien fue el primero que apoyó la carrera científica de Cajal, y el Museo Antropológico de Pedro González de Velasco, en cuyo edificio se instalaría a comienzos del siglo XX el laboratorio en el que trabaja ro n el gran ne urobió logo y sus discípulos.

1. “ESQUEMA de la estructura del cerebelo. Cortes transversal y longitudinal de una lámina cerebelosa”. Lámina mural diseñada por Cajal y pintada por R. Padró. Biblioteca y Museo His toricomédicos, Valencia . Cajal la diseñó con motivo de la serie de conferencias que pronunció en marzo de 1892 en la Academia de Ciencias Médicas, de Barcelona, bajo el título general de “Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos”. TEMAS 29

A I C N E L A V E D O C I D E

M O IC R O T IS H O E S U M Y A C E T O I L B I B

A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

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IA C N E L A V E D O IC D E M O C I R O T S I H O E S U M Y A C E T IO L B I B

modo decisivo en la trayectoria de Cajal. La obra neurohistológ ica de Cajal

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acido en la aldea de Petilla de Aragón el año 1852, Santiago Ramón y Cajal fue hijo de un cirujano rural que con grandes esfuerzos llegó a conseguir el título de médico. Su niñez discurrió en una serie de pequeñas localidades del Alto Aragón. Tras estudiar el bachillerato en Jaca y Huesca, cursó medicina en una modesta “escuela provincial” creada en Zaragoza al amparo de la libertad

democrática docente implantada de 1868. porPoco la revolución después de graduarse (1873) ganó unas oposiciones a médico militar y estuvo ocho meses en el ejército que operaba en Cataluña contra los carlistas. A continuación fue trasladado a Cuba, donde participó en la guerra colonial hasta su regreso a la península, a mediados de 1875. Recuperado del paludismo que había contraído en Cuba, la influencia de su padre, que le había ya inclinado a convertirse en médico, pesó también en su decisión de dedicarse a la docencia universitaria de la anatomía. Su primer contacto con la histología se produjo en 1877, con ocasión de cursar en Madrid los estudios de doctorado. “Sugestionado —según el propio Cajal— por las “bellas preparaciones micrográficas” que le enseñaron 2. RECONSTRUCCION del laboratorio de Cajal instalado en su domicilio de Valencia (1884). Maestre de San Juan y López García, decidió dedicarse a la disciplina y, a su regreso a Zaragoza, gastó todos sus La importancia de los grupos extra- torio, tomaron contacto con las técahorros en instalar un modesto labooficiales no debe hacer olvidar que nicas histológicas numerosos médiratorio micrográfico. Contra lo que algunos profesores de las universicos españoles, entre ellos, el propio suele afirmarse con frecuencia, su reladades oficiales participaron temRamón y Cajal. ción con Maestre y López García no se pranamente en el esfuerzo de incorDe los demás cultivadores esparedujo a este contacto inicial. Volvió porar de modo práctico las nuevas ñoles de la anatomía microscópica varias veces a su laboratorio en el corrientes histológicas. coetáneos de Cajal que iniciaron su curso de la siguiente década y durante Sobresalió entre todos ellos Aureactividad en esta época, anotaremos la fase inicial de su obra fue un fiel liano Maestre de San Juan (1828únicamente la trayectoria inicial de seguidor de las ideas de Maestre, a 1890), cabeza de la histología uniLuis Simarro Lacabra (1851-1921). quien dedicó en sus memorias un versitaria española anterior a Cajal. Simarro trabajó en el laboratorio recuerdo muy expresivo. Maestre de San Juan se consagró a micrográfico del Museo Antropológico Cajal fracasó en sus primeras opola histología a partir de 1860, fecha de González de Velasco y enseñó en siciones a cátedra en 1880, en las que en la que pasó a ocupar una de las su Escuela Libre de Medicina y sólo tuvo el apoyo de Martínez Molina, cátedras de anatomía de la Facultad Cirugía. Más tarde, completó su forpero en 1883 ganó la de anatomía de de Medicina de Granada. Entre 1863 mación asistiendo a los cursos y a las la Facultad de Medicina de Valencia. y 1867, completó su formación en disesiones de la Sociedad Histológica Durante los casi cuatro años que ferentes laboratorios de Francia, AleEspañola fundada por Maestre. Desde estuvo al frente de la misma, Ca jal se mania y Gran Bretaña. Su prestigio 1880 a 1885 trabajó en París junto a orientó en el mundo de la investigapesó de modo decisivo en la dotación figuras como Charcot y Magnan y se ción. Publicó trabajos sobre diferenen dicha Facultad de la primera cáespecializó en neuropsiquiatría. Fue tes tejidos, así como un Manual de Histedra oficial española de histología entonces también discípulo de Rantología , cuyo primer fascículo apareció (1873). Nombrado titular de la misvier, que orientó el punto de partida en 1884. Con motivo de la vacunación ma por concurso, Maestre realizó de su labor neurohistológica. De reanticolérica de Jaime Ferrán, se ocupó desde ella una labor didáctica ejemgreso a España, Simarro montó en también de cuestiones bacteriológiplar, no solamente doctrinal sino, Madrid un laboratorio histológico cas en 1885. No obstante, acabó censobre todo, práctica. En su laboraque, como vamos a ver, influyó de trándose en la neurohistología, sobre 74

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todo después de una estancia en Madrid en 1887 como miembro de un tribunal de oposiciones. Visitó entonces los principales laboratorios micrográficos de la capital, entre ellos el de Luis Simarro, quien le enseñó el método de impregnación cromoargéntica de Camillo Golgi. En el mismo 1887, la histología pasó del doctorado a la licenciatura. Se crearon nuevas cátedras de la materia y Cajal ocupó la de Barcelona hasta que, en 1892, fue trasladado a la de Madrid, de la que fue titular hasta su jubilación. En 1901, cuando ya era una figura de primera impor-

cogiendo bien la fase evolutiva (del embrión), las células nerviosas, relativamente pequeñas, destacan íntegras dentro de cada corte; las ramificaciones terminales del cilindroeje dibújanse clarísimas y perfectamente libres; los nidos pericelulares, esto es, las articulaciones interneuronales, aparecen sencillos, adquiriendo gradualmente intrincamiento y extensión; en suma, surge ante nuestros ojos, con admirable claridad y precisión, el plan fundamental de la composició n histológica de la sustancia gris”. Sobre estas bases, Cajal se dedicó

bajos aparecidos en mayo y agosto de 1888, Cajal consiguió también reducir a los nuevos supuestos la estructura de la retina, que continuaría después investigando varios años hasta la aparición de su clásica monografía sobre el tema, primero en francés (1892) y luego en alemán (1894). El tercer territorio en el que demostró la individualidad de las células nerviosas y la terminación por contacto de sus prolongaciones fue la médula espinal, en la que concentró sus esfuerzos durante 1889. Cajal se preocupó inmediatamente de difundir internacionalmente los

nacional, tancia en se el mundo le encargó científico la dirección interdel Laboratorio de Investigaciones Biológicas, creado por el peso que tuvieron los premios y distinciones concedidas a su labor en el extranjero, que culminarían más tarde en la concesión del premio Nobel conjuntamente con Golgi (1906).

asino la investigación, con furia”. Su“no actividad ya con ahínco, científica durante 1888 y 1889 fue tan intensa que, para dar a conocer sus trabajos, además de enviar artículos a diferentes publicaciones periódicas, tuvo que editar a su costa una

con clara conciencia resultados de sus investigaciones, de que no bastaba enviar ejemplares de su revista o separatas de sus artículos a destacadas figuras científicas europeas. Por ello, a finales de 1889 y comienzos de 1890, publicó traducciones francesas de tres trabajos suyos donde exponía los hallazgos más importantes que había conseguido acerca de la estructura del cerebelo, la retina y la médula espinal. Sin embargo, la acogida que tuvieron estas publicaciones no pudo ser más decepcionante. La condición marginal de la actividad científica española en la biomedicina europea de la época y también las dificultades que la mayoría de los histólogos habían tenido al utilizar el método de Golgi contribuyeron, sin duda, a que los trabajos de Cajal fueran inicialmente recibidos con desconfianza. No obstante, la principal dificultad residía en la misma importancia de sus descubrimientos y en el hecho de que contradijeran frontalmente las ideas generalmente admitidas. Para superar dicha desconfianza, Cajal decidió aprovechar el congreso que la Sociedad Anatómica Alemana iba a celebrar en Berlín a comienzos de octubre de 1889, mostrando en él las preparaciones más claramente demostrativas de sus descubrimientos. En dicho congreso, tras la lectura y discusión de las ponencias y comunicaciones orales, se dedicó un día a las demostraciones prácticas, sección en la que estaba inscrito Cajal. Según el testimonio de Van Gehuchten, Cajal estaba solo, “no suscitando en torno suyo sino sonrisas incrédulas. Todavía creo verlo tomar apart e a Kölliker, entonces maestro incontestable de la histología alemana, y arrastrarlo a un rincón de la sala de demostraciones, para mostrarle en el microscopio sus admirables preparaciones y convencerle al mismo tiempo de la realidad de los hechos que pretendía haber descubierto. La demostración

El nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos

S

iendo ya catedrático de histología, primero en Barcelona (18881892) y después en Madrid, Cajal convirtió el método de Golgi en la primera arma técnica de su obra de investigador, sobre todo después de introducir la modificación que denominó “proceder de doble impregnación”, que permitía obtener tinciones más complejas. Por otra parte, consideró como “resorte principal” y “causa verdaderamente eficiente” de sus espectaculares descubrimientos la utilización del método ontogénico, es decir, el estudio de los centros nerviosos de embriones de ave y mamíferos, en lugar de comenzar directamente con los animales adultos, como hasta entonces se había hecho. Explicó esta alternativa con una metáfora muy expresiva: “El (medio) más natural y sencillo al parecer, pero en realidad más difícil, consiste en explorar intrépidamente la selva adulta, limpiando el terreno de arbustos, plantas parásitas, y aislando cada especie arbórea tanto de sus parásitos como de sus congéneres. (...) Mas semejante táctica resulta poco apropiada en la dilucidación del problema propuesto, a causa de la enorme longitud y extraordinaria frondosidad del ramaje nervioso, que inevitablemente aparece mutilado y casi indescifrable en cada corte. (...) Puesto que la selva adulta resulta impenetrable e indefinible, ¿por qué no recurrir al estudio del bosque joven, como si dijéramos, en estado de vivero? (...). EsA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

Re vi st a Tr im es tr al de Hi st ol og ía Norm al y Pa tológic a , de la que sola-

mente aparecieron tres números. Sin embargo, los diez trabajos que publicó en ella abrieron una nueva etapa en el conocimiento de la estructura del sistema nervioso. En el trabajo que inició dicha serie, titulado “Estructura de los centros nerviosos de las aves”, Cajal demostró por vez primera con datos inequívocos que las ramificaciones de las neuritas no acaban en la sustancia gris en una red difusa, sino mediante arborizaciones libres. Lo consiguió, en concreto, al estudiar el axón de las llamadas células estrelladas pequeñas de la capa molecular del cerebelo. A esta observación crucial añadió, tres meses después, otros dos hallazgos de parecida importancia, en el artículo “Sobre las fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo”: el primero fue el descubrimiento del axón de los gr an os , diminutas células de la corteza cerebelosa, que se divide a diversas alturas en ángulo recto, produciendo unas larguísimas proyecciones, que denominó fibr as paralelas por discurrir paralelamente al sentido de la circunvolución cerebelosa; el segundo, el de las fibr as tr epadoras que, procedentes de los ganglios de la protuberancia, cruza sin ramificarse las capas de los granos para contactar con las células de Purkinje, elementos de grueso soma piriforme descritos por este gran histólogo checo en 1838. Ambos hallazgos volvieron a confirmar que la transmisión de los impulsos nerviosos se hacía por contacto, desmintiendo de modo terminante la teoría reticular. Casi simultáneamente, en dos tra-

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fue tan decisiva que, algunos meses más tarde, el histólogo de Würzburg confirmaba todos los hechos afirmados por Cajal”. El escepticismo inicial de Kölliker se convirtió en vivo interés cuando observó las clarísimas imágenes de las preparacione s del aragonés y éste le explicó —según anota en sus Recuer dos — “en un francés chabacano, menuda y pacientemente, todos los pequeños secretos de manipulación de la reacción cromo-argéntica”. Inmediatamente después, Kölliker realizó una serie de trabajos de confirmación, utilizando la técnica de la

Poco después que Kölliker, casi todas las grandes figuras de la neurohistología europea asimilaron los hallazgos de Cajal y aceptaron su nueva concepción de la estructura del sistema nervioso. Estimulado por la acogida que su labor estaba obteniendo, Cajal trabajó de modo casi frenético durante 1890, año en el que publicó nada menos que diecinueve artículos, seis de los cuales aparecieron en francés en diferentes revistas morfológicas europeas. Entre otras aportaciones de menor interés, expuso en ellos sus primeras investigacion es sobre el

abandonar doble impregnación, la teoría reticular que le hicieron y aceptar plenamente las concepciones de Cajal. Los dos primeros, dedicados al cerebelo y la médula espinal, aparecieron en 1890 en su propia revista, una de las más influyentes de la mor fología de la época. Kölliker se encontraba entonces en la cumbre de su prestigio científico, tras casi medio siglo de ejemplar dedicación a la investigación histológica. Su Han dbu ch der Gew ebe leh re des Menschen —cuya edición srcinal apareció en 1852, el mismo año de l nacimiento de Cajal— fue el primer tratado moderno de la disciplina. En consecuencia, no resulta extraño que su terminante respaldo a las contribuciones del investigador español pesara decisivamente en la trayectoria científica de éste.

tración de cerebro deque los mamíferos, la estructuralade demoslas vías olfatorias se ajustaba a la teoría de la neurona y, sobre todo, una serie de observaciones acerca del desarrollo embrionario de las células y las fibras nerviosas de la médula espinal y el cerebelo.

El problema de la dirección del impulso nervioso dentro de la neurona lo había examinado ya con anterioridad, pero no llegó a una formulación doctrinal madura hasta 1891, cuando dispuso de sólidas series de datos en que basarla y bajo el estímulo de un comentario de Van Gehuchten a sus opiniones sobre la materia. La expuso por vez primera en una comunicación que presentó al Primer Congreso Médico-Farmacéutico Regional celebrado en Valencia en julio de dicho año y que se publicó después en sus Actas . La tituló “Comunicación acerca de la significación

plasmáticas fisiológica deylas nerviosas expansiones de lasprotocélulas de la sustancia gris” y es actualmente considerado un texto clásico crucial de las neurociencias contemporáneas. El propio Cajal también le concedió gran relieve dentro de su trayectoria científica y resumió la teoría de la polarización dinámica Polarización dinámica que se defiende en ella de la siguienurante 1891 y los primeros meses te forma: “La transmisión del movide 1892, Cajal continuó realimiento nervioso tiene lugar desde las zando trabajos de carácter analítico, ramas protoplásmicas hasta el cuerprincipalmente sobre la retina, el po celular, y desde éste a la expancerebro y los ganglios simpáticos. sión nerviosa. El soma y las dendriFormuló también entonces la ley de tas representan, pues, un aparato de la polarización dinámica de las neurecepción, mientras que el axón consronas —una de sus aportaciones teótituye el órgano de emisión y rericas más perdurables— y ofreció una partición”. síntesis de su concepción de la estrucLa síntesis a la que nos hemos refe tura del sistema nervioso que alcanzó rido la ofreció Cajal en una serie de difusión internacional. conferencias que pronunció en marzo de 1892 en la Academia de Ciencias Médicas, de Barcelona, bajo el título general de “Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos”. Su texto apareció srcinalmente en varios números de la Rev ist a de Cie nci as Médicas de Barcelona y luego fue reunido en un folleto. Casi inmediatamente se publicó una traducción alemana por iniciativa de His y con un prefacio suyo. Poco después lo hizo una traducción francesa, precedida de un prólogo de Mathias Duval, que tuvo tal éxito que se agotaron en un trimestre dos copiosas ediciones. El traductor fue en este caso Léon Azoulay, el mismo que se encargaría dos décadas después de la versión de la Textura del sistema nervioso , la principal obra de Cajal. La acogida que tuvo esta primera síntesis fue precisamente uno de los factores que más pesaron en su decisión de escribir el gran tratado. En 1892, el mismo año de su traslado a Madrid, apareció la versión francesa del principal estudio mono3. ILUSTRACIONES de la comunicación de Cajal al Congreso Médico Farmacéutico Regional gráfico que Cajal dedicó a la retina. celebrado en Valencia en 1891, en la que expuso por vez primera la ley de la polarización di- Fue publicado por la revista belga La námica de las neuronas. Cellule con el título de La rétine de s

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D

TEMAS 29

vertébrés

e incluía, ampliados e ilustrados con nuevas figuras, todos los hallazgos sobre el tema que había ido dando a conocer hasta entonces en artículos en castellano. Durante sus cinco primeros años de estancia en la capital continuó investigando con el método de Golgi la estructura de otras zonas del sistema nervioso. El resultado general fue comprobar, en todas ellas, la teoría de la neurona —es decir, el contacto entre somas y arborizaciones nerviosas—, así como la ley de la polarización dinámica. En 1896, un año en el que se dedicó de manera particularmente intensa

nueva formulación de la ley de la polarización dinámica de las neuronas. El propio Cajal consideró en su madurez que, en estos trabajos teóricos, “la elaboración especulativa sigue muy de cerca al hecho de observación” y que los modelos que defienden corresponden a “legítimas inducciones o hipótesis plausibles”. En cambio, se arrepintió de otro artículo suyo de 1895 sobre “el mecanismo histológico de la asociación, ideación y atención”, al que llamó “aventuradísima lucubración en la que campea, muy a su sabor y talante, la loca de la casa”.

cés, con el título de La fin e structure des centres nerveux . Como solía hacerse con los invitados a esta conferencia, fue nombrado doctor honoris causa por la Universidad de Cambridge. La ceremonia de investidura se hizo de acuerdo con la devoción inglesa por lo tradicional. El elogio del nuevo doctor pronunciado en latín por el orator terminó con un juego de palabras en honor de las tinciones argénticas de Cajal: el poeta hispanorromano Marcial, nacido también en Aragón, ya había “aprendido por experiencia que en la vida no puede hacerse casi nada sin plata”

utilizar al trabajo el método de laboratorio, de Ehrlich, comenzó técnicaa que permite teñir en vivo, o casi en vivo, las fibras y células nerviosas. Con las imágenes clarísimas de color azul intenso que obtuvo aplicándolo, consiguió contrarrestar la desconfianza de algunos histólogos escépticos que habían insinuado la posibilidad de que algunas tinciones con el cromato de plata fuesen “artefactos”.

alcanzado La obra amplia de Cajal, difusión que había y prestiya gio en los ambientes científicos del continente europeo, recibió en 1894 el reconocimiento formal de la comunidad científica británica. A comienzos de dicho año fue invitado a pronunciar la “Croonian Lecture” por la Royal Society. En Londres se hospedó en la casa de Charles Scott Sherrington, que estaba entonces iniciando la labor de investigación que lo convertiría en la máxima figura de la neurofisiología del siglo XX . Sus aportaciones fisiológicas se basaron de modo sistemático en la obra de Cajal acerca de la estructura del sistema nervioso, hasta el punto de que varios términos hoy generalmente utilizados para designar algunas de las concepciones básicas del histólogo aragonés fueron neologismos acuñados por él. El más importante, el de sinapsis , lo propuso inicialmente en 1897, al resumir las ideas de Cajal acerca de la conexión por contacto y no por continuidad entre las células nerviosas. En su madurez, Sherrington reconoció en los siguientes términos el apoyo de la neurofisiología en la obra de Cajal: “¿Sería mucho decir que fue el anatómico del sistema nervioso más grande que se ha conocido? Durante mucho tiempo esa materia fue el tema favorito de los mejores investigadores; antes de Cajal se hicieron descubrimientos, pero éstos a menudo dejaban al médico más confuso que antes, aumentando el desconcierto. Cajal, en cambio, hizo posible, incluso para un bisoño, reconocer con una ojeada la dirección que toma la corriente nerviosa en la célula viva y en la cadena compleja de células nerviosas. Resolvió de una vez el gran problema de la dirección de las corrientes nerviosas en su recorrido a través del cerebro y la médula espinal...”. En su “Croonian Lecture”, Cajal resumió sus hallazgos e ideas en fran-

tus did ici t fer nih sin e ar gent o posse perefici (“ exper ”).il in vit a

Trabajos teóricos

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edactó también entonces algunos trabajos de carácter teórico, el más importante de los cuales fue la comunicación Consideraciones generales sobre la morfología de la célula nerviosa , que envió al Congreso Inter-

nacional de Medicina celebrado en Roma en 1894. Su tesis central es que la ontogenia (o desarrollo embrionario) del sistema nervioso reproduce de modo abreviado, con algunas simplificaciones y saltos, su filogenia (o desarrollo evolutivo de las especies). Se trata, por lo tanto, de una aplicación directa de la ley biogenética fundamental, núcleo de la morfología darwinista. Cajal afirmó que, a lo largo del desarrollo filogénico de los vertebrados, se advierte siempre la presencia simultánea de un sistema nervioso sensorial y otro cerebro-cortical, perfeccionándose este último no sólo por extensión sino por diferenciación estructural y morfológica de sus elementos. De acuerdo con este modelo de progreso morfológico, “la excelencia intelectual (...) no depende de la talla o caudal de las neuronas cerebrales, sino de la copiosidad de sus apéndices de conexión, o en otros términos, de la complejidad de las vías de asociación a cortas y a largas distancias”. Tres años más tarde reelaboró este modelo evolucionista en un artículo titulado “Leyes de la morfología y dinamismo de las células nerviosas”, en el que expuso, además, una A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

La “Textura del sistema nervioso del hombre y de los ver teb rad os”

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n 1897, Cajal inició la publica-

ción, por una parte, de la Revi sta Trimestral Micrográfica y, por otra, del gran tratado Textura del sistema nervioso del hombre y de los vertebrados . La primera se convirtió desde

entonces en el principal medio que fue dando a conocer su labor de investigación personal y la de su escuela. Apareció hasta 1901, fecha en la que fue continuada por Trabajos de Laboratorio de Investigaciones Biológicas de la Universidad de Madrid, que se editó con presupuesto oficial a partir de la fundación del centro de este nombre. La Textura del sistema nervioso fue su libro más importante, “mi obra magna”. El proyecto de redactar este libro, tal como adelantamos, fue en buena parte consecuencia de la extraordinaria acogida que tuvieron las ediciones castellana, alemana y francesa de su síntesis de 1892. Concibió entonces el proyecto de “escribir un libro extenso donde se estudiara sistemática y minuciosamente la textura del sistema nervioso de todos los vertebrados y se diera cuenta, con los necesarios desarrollos, de la totalidad de mi obra científica”. La Textura del sistema nervioso del hombre y los vertebrad os —principal aporta-

ción de nuestro idioma a los grandes textos clásicos de la ciencia contemporánea— fue publicado en Madrid, entre 1897 y 1904, por la Imprenta y Librería de Nicolás Moya, una de las empresas editoras de libros médicos más importantes de la España de la época. Consta de dos volúmenes, el primero de casi seiscientas páginas y el segundo de más de mil doscientas. Como muchos otros textos científicos de este período, entre ellos el 77

4. ENTRE LOS NUMEROSOS trabajos que Cajal y sus discípulos realizaron con el método del nitrato de plata reducido —que permite ver la estructura interna de las células nerviosas— figura el dedicado a los ganglios terminales del nervio acústico de las aves (1908), al que corresponde este grabado. Dibujado, como de costumbre, por el propio Cajal, es una de las más bellas cromolitografías que aparecieron Manual de Histología del propio Cajal,

fue apareciendo por fascículos desde 1897 a 1904. Cinco años después de esta última fecha comenzó a publicarse en París la traducción francesa de la gran obra de Cajal, con el título de Histologie du syst ème ner veu x de l’homme et des vertébrés (1909-1911). Se trataba de un texto “revisado y puesto al día por el autor”, que tradujo Léon Azoulay, quien ya había vertido al francés otras obras del neurohistólog o aragonés, como sabemos. La principal novedad técnica en el lapso de tiempo transcurrido entre ambas ediciones fueron los llamados métodos de tinción neurofibrilares. De su aplicación proceden fundamentalmente los cambios, casi siempre adiciones, que introdujo Cajal en la edición francesa. En esta colosal síntesis de neu78

en su revista: 1, corte frontal de la región acústica bulbar de un embrión de pollo de seis días.2, Corte frontal de ganglios cocleares de un gorrión de quince días.3, Corte frontal de ganglios acústicos de un gorrión de quince días. 4, Neuronas del núcleo de grandes células. 5, Células estrelladas procedentes de la región cefálica de dicho núcleo. 6, Detalles de plexos terminales en el foco laminar.

rohistología comparada, Cajal continuó fiel a los supuestos básicos de la morfología evolucionista, desarrollando las formulaciones a las que hemos aludido al comentar sus trabajos teóricos anteriores. Como en el caso de John Hughlings Jackson —creador de otro de los paradigmas de las neurociencias del siglo pasado— la fuente intelectual básica del evolucionismo de Cajal es la obra de Herbert Spencer. Entre las ediciones de sus libros que cita figuran, por supuesto, las traducciones castellanas de Miguel de Unamuno. La estructura interna de la célula nerviosa. La degeneració n de los nervios

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uando terminó la publicación de su gran obra La text ura del sis-

, en 1904, Cajal había alcanzado brillantemen te la meta que se había propuesto con el examen sistemático de todos los territorios nerviosos con el método de Golgi: demostrar la individualidad de las neuronas, aclarar su comportamiento genético y ofrecer un modelo estructural del funcionamiento del sistema. Sin embargo, se le había planteado poco antes la necesidad de conocer la estructura interna de la célula nerviosa, problema para el que le resultaba necesaria una nueva técnica. Dicha necesidad pasó a primer plano porque se hicieron críticas frontales a la teoría de la neurona, r eformulando la teoría reticular sobre la base de que las neurofibrillas que existían en el seno de las células nerviosas formaban una red continua interneuronal que sería responsable tema nervioso

TEMAS 29

de la propagación del impulso nervioso. Aunque desde hacía tiempo se venía hablando de forma imprecisa de tal urdimbre neurofibrilar, la cuestión no se planteó en estos términos hasta los primeros años del siglo pasado, tras los trabajos en invertebrados del húngaro István Apáthy y, sobre todo, a partir de las indagaciones sobre las neurofibrillas del sistema nervioso de los vertebrados realizadas por el profesor de Estrasburgo Albrecht Bethe, quien se convirtió en la cabeza del nuevo reticularismo, con el apoyo algo posterior de Hans Held, traductor de la primera sínte-

son brotes axónicos procedentes del cabo central, cuyas fibras mantienen su vitalidad porque siguen unidas al soma neuronal. Sus investigaciones sobre esta cuestión fueron más tarde recogidas en dos volúmenes titulados Estudio s sobr e la degeneración y

pusieron sis de Cajal. en duda Muchos la teoría neurohistólogos de la neurona y algunos la abandonaron abiertamente, situación a la que aludió Golgi en su conferencia Nobel. Convencido de que la solución del problema residía en “contemplar las susodichas neurofibrillas en preparaciones irreprochables ”, cosa que en modo alguno habían conseguido Bethe y sus seguidores, Cajal trabajó intensamente en busca de la técnica de tinción apropiada. Tras numerosos ensayos infructuosos la encontró, por fin, en octubre de 1903, partiendo del “proceder fotográfico” srcinal de Luis Simarro, que había conseguido con él impregnar las neurofibrillas mediante las sales fotográficas de plata. Ideó de esta forma el célebre método del nitrato de plata reducido, consistente básicamente en la inmersión directa de los tejidos nerviosos en nitrato de plata, mantenimiento de los mismos en estufa durante cuatro días, y reducción en bloque y en la oscuridad de la sal argéntica mediante un baño de ácido pirogálico. El método del nitrato de plata reducido fue utilizado sistemáticamente durante una década por Cajal y sus discípulos, dando como primer resultado el conocimiento de la disposición de las neurofibrillas en el protoplasma nervioso y en las arborizaciones pericelulares. En el trienio 1905-1907, Cajal lo aplicó asimismo al estudio de la regeneración y la degeneración de los nervios y de las vías nerviosas centrales, tema que había sido una de las principales fuentes de los argumentos de los autores opuestos a la teoría neuronal. Defendían éstos que la regeneración del segmento distal de un nervio seccionado se debe a la transformación de las células de revestimiento del mismo que habían persistido tras la degeneración de sus fibras. Frente a esta hipótesis, Cajal demostró que las fibras nuevas que aparecen en dicho segmento distal

neuronal. lisis de laComo estructura consecuencia del núcleo de tan amplia labor, el neuronismo logró superar por completo las críticas que le habían planteado los nuevos defensores del reticularismo.

A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

regeneración del sistema nervioso

(1913-1914). A partir de 1907, Cajal aplicó su técnica de tinción a investigaciones comparadas de la textura del cerebelo y del bulbo raquídeo, al estudio de la génesis de los nervios motores y sensoriales y las expansiones neuronales en el embrión, así como al aná-

Ultimas aportaciones. Los centros nerviosos de los insectos. Testamento científico

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uando ya había cumplido los sesenta años, en 1912 y 1913, Cajal ideó todavía dos nuevos métodos de tinción: la técnica del formol-urano y la del oro-sublimado. Con la primera consiguió precisar numerosos detalles acerca de la disposición, fases evolutivas y conexiones del aparato de Golgi, retículo endoneuronal que el histólogo italiano había observado por vez primera a finales del siglo XIX . Con la segunda resolvió el problema de la impregnación de un tipo de neuroglía, es decir, del tejido que forma la sustancia de sostén de los centros nerviosos, que era especialmente difícil de teñir con los métodos anteriores: la llamada neuroglía protoplásmica o de radiaciones cortas. Esta innovación resultaría decisiva para las investigaciones que sobre la glioarquitectónica desarrollaron después Nicolás Achúcarro y Pío del Río Hortega, otras dos grandes figuras de la neurohistología española. Entre sus trabajos posteriores destacan las investigaciones que realizó a partir de 1915 en torno al ojo y la retina de los insectos, que realizó en gran parte en colaboración con Domingo Sánchez. Su resultado, junto a la crisis experimentada por el darwinismo durante el período de entreguerras, le condujo a un cierto distanciamiento de la explicación darwinista de las formas anatómicas a lo largo de la serie filogénica: “No debo ocultar —afirmó en sus Recuerdos — que en el estudio de la retina sentí por vez primera flaquear mi fe darwinista (hipótesis de la selección

natural), abrumado y confundido por el soberano ingenio constructor que campea, no sólo en la retina y en el aparato dióptrico de los vertebrados, sino hasta en el ojo más ruin de los insectos”. La principal ilusión científica de Cajal, durante la fase final de su vida fue la publicación de una tercera edición, ampliada y actualizada, de su gran libro Textura del sistema nervioso . Llegó incluso a redactar las condiciones de publicación de la misma, para la que fue reuniendo abundantes materiales y notas que desaparecieron por razones no bien muerte. Llegó, aclaradas, pérdida sin embargo, que aceleró a redacsu tar un amplio trabajo de conjunto sobre la teoría de la neurona, de casi cien páginas, con destino al primer volumen del Ha nd bu ch de r Neu rologie dirigido por O. Bumke y O. Foerster. La publicación de este texto, verdadero testamento científico de Cajal, se retrasó más de lo previsto, con gran contrariedad de su autor. Por ello publicó en 1933 una nueva redacción en castellano en la revista Archivos de Neu rob iologí a , con el título de “¿Neuronismo o reticularismo? Las pruebas objetivas de la unidad anatómica de las células nerviosas”, apareciendo además una versión francesa de la misma al año siguiente en el anuario del Laboratorio de Investigaciones Biológicas. El texto srcinal traducido al alemán, Die Neu ron enle hre , lo hizo de forma póstuma en 1935, tal como temía Cajal. En la conclusión de esta síntesis, que coronaba una labor de medio siglo, subrayó que el principal resultado general de la misma era superar el último y más difícil reducto que se oponía al modelo celularista de organismo, a su concepción como “asociación de células relativamente autónomas”: “No temamos, pues, que al embate de los reticularistas, la vieja y genial concepción de Virchow sufra quebrantos”.

BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA C AJAL

Y SU

LABOR HISTOLÓGICA . Jorge

Francisco Tello. Universidad Central, 1935. SANTIAGO RAMÓNY CAJALOLA PASIÓNPOR E SPAÑA . Agustín Albarracín Teulón. Labor, 1978. CAJAL. A NTOLOGÍA. Edición y estudio introductorio por José M. López Piñero. Península, 1986. RAMÓN Y CAJAL. José M. López Piñero. 2a edición. Salvat, 1988.

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Las primeras observaciones La repetición de los experimentos que realizaron los primeros microscopistas muestra lo que ellos percibieron con sus rudimentarios instrumentos constituidos por una sola lente Brian J. Ford

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n 1674 Antony van Leeuwenhoek descubría, mientras miraba a través del microscopio que había construido, un mundo nuevo, fascinante. Nuestro holandés aficionado a la ciencia se sorprendió cuando, observando la baba que había recogido de la superficie de un lago, halló organismos desconocidos: “Quedé maravillado ante el número de animálculos que se movían raudos por el agua, de aquí para allá, arriba y abajo”. Con Leeuwenhoek, que vivió de 1632 a 1723, se inauguró la microbiología. Antes de que floreciera la ciencia de la óptica, Leeuwenhoek talló con sus manos más de 500 microscopios. Con ellos, registró, además de los “animálculos” o microorganismos, muchas estructuras celulares,

eritrocitos y espermatozoides. Describió bacterias, protozoos, rotíferos, células vegetales y hongos. Pese a todo, muchos contemporáneos le despreciaron y tildaron de diletante y fantasioso. Su perspicacia no prendió. Hasta mediados del siglo XIX —la época de Louis Pasteur— no se aceptó la idea de microorganismo. Incluso hoy no faltan quienes niegan que Leeuwenhoek viera lo que afirmaba haber visto con su rudimentario instrumento de una sola lente. La investigación moderna se ha servido de un microscopio de Leeuwenhoek para aducir que con los aumentos de sus aparatos no podía lograr la finura de detalle a la que arriba en sus notas. Por ejemplo, de los eritrocitos sólo podía ver manchas borrosas.

Los detractores de Leeuwenhoek han esgrimido recriminaciones similares contra Robert Brown. En 1827, el joven cirujano escocés dio testimonio de un fenómeno que hoy lleva su nombre: el movimiento browniano. Observó en el seno celular el movimiento incesante de partículas minúsculas. Unos años después, Brown dio con otro fenómeno inédito mirando por su microscopio monocular. En su viaje a Australia en busca de plantas exóticas se prendó de las orquídeas que herborizaba. Después de examinar una y otra vez diferentes células vegetales, llegó a la conclusión de la existencia de una estructura que se repetía en todas ellas: “En cada célula de la epidermis... aparece una areola circular, más opaca

1. CELULAS LUMINOSAS de Tradescantia virginiana, traídas a primer plano con un microscopio de Robert Brown, cuando las baña la luz solar (página siguiente, arriba). Con el microscopio de Antony van Leeuwenhoek, que se conserva en la Universidad de Utrecht, se distingue de forma nítida los hematíes (izquierda de un leucocito ); inclusopodría el núcleo identificarse lobulado con ese aparato elemental. Un microscopio monocular moderno ofrece también imágenes impresionantes: células de levadura (centro) y esporas fúngicas (derecha). 170×

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D R O F .J N A I R B

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que la membrana”. Brown no tardó en establecer que se trataba de un rasgo común de las células de muchos organismos. Con el tiempo, le impuso el nombre que todavía perdura: “el núcleo celular”. Igual que ocurrió con Leeuwenhoek, los trabajos de Brown no recibieron el aprecio debido. En manuales contemporáneos se lee que Brown observó sólo el movimiento de granos de polen, pero no el movimiento mucho más sutil del interior celular. En una reciente revisión de la capacidad del microscopio de Brown se concluía que ese instrumento pudo haber sido útil

para la disección, pero en ningún caso para resolver estructuras de la parvedad del núcleo. He empleado los microscopios originales de ambos genios y he construido mis propios monoculares. Con ellos, he recreado los experimentos pioneros de Leeuwenhoek y Brown. No es tarea fácil, si tenemos en cuenta que carecemos de cualquier informe detallado sobre los métodos que siguieron; además, debe realizarse con sumo cuidado el ajuste de los microscopios y acomodarse fielmente a su proceder. Pues bien, frente a lo que muchos objetaban, con un microsco-

pio simple se observan bacterias, núcleos celulares y movimiento browniano. Con el microscopio de Brown, reconocí mitocondrias, que son cientos de veces más pequeñas que el núcleo celular. Leeuwenhoek y Brown no engañaron en sus notas. Las imágenes que presentamos no se han manipulado. Revelan la excitación y maravilla que provocaron las primeras observaciones. Y ponen de manifiesto cómo el más humilde de nuestros útiles, aquí microscopios simples del XVII y el XIX , puede cambiar nuestra concepción de la realidad para siempre.

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2. LAS ESPORAS ESPINOSAS de una trufaTuber ( melanosporum) sirven para someter a prueba la calidad de resolución del microscopio de Leeuwenhoek. Las minúsculas esporas son del tamaño de una célula, las espinas del tamaño de bacterias. Pese a su simplicidad, el viejo microscopio de 300 años puede captar ambas estructuras con nitidez.

3. LA BELLEZA DE LA CABEZA DE UN PIOJO puede observarse a través de una lente pulida por Horace Dull de Luton, en el marco de una investigación sobre claridad y poder de resolución de un microscopio del siglo XVII. La antena y los ojos oscuros pardos del insecto, enojosamente familiares para los biólogos de entonces, aparecen con nitidez. Estas lentes mantienen al mínimo la aberración cromática.

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4. LOS PRIMEROS MICROSCOPIOS SIMPLES del último tercio del XVII eran como el fabricado por Leeuwenhoekabajo ( ), hecho a mano y de latón. Dos tornillos de rosca fijaban y enfocaban la muestra. La lente solitaria de aumento, algo mayor que la cabeza de un alfiler, bastaba para distinguir inclu so bacterias. El diseño alcanzó su perfección 150 años después (derecha) en los talleres de la firma londinense Dollond, suministradora de instrumentos de laboratorio. Robert Brown poseyó uno de estos hermosos aparatos. Hay un control de foco fino en la parte superior del cuerpo de la columna; dos tornillos operan una platina mecánica. Entre los accesorios está la lente, de 800x. Ambos prototipos miden unos 7,6 centímetros. BANDEJA DE LENTES MANDO DE FOCO FINO

MANDO DE ENFOQUE

TORNILLO PARA MOVER EL PORTAOBJETO

SOPORTE DE LA MUESTRA

LENTE

PLATINA CIRCULAR PORTAOBJETO MECANICO

MANDO DEL PORTAOBJETO MECANICO

ESPEJO CONCAVO

LENTE TORNILLO PARA SITUAR LA MUESTRA

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5. PAREDES CELULARES de la raíz del helechoOsmunda regalis, según se aprecian con un microscopio monocular de comienzos del sigloXVIII. La claridad de la imagen ofrecida no tiene nada que envidiar a la alcanzada por la mayoría de los microscopios ópticos modernos.

6. HASTA BACTERIAS VIVAS podían captarse con el microscopio simple de Leeuwenhoek. Esta imagen del Spirillum, una de las especies descritas por nuestro holandés, pone de manifiesto su destreza investigadora; las bacterias no se ven si no sabemos colocar bien la fuente luminosa y el foco.

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7. LA LABOR MICROSCOPICA realizada por Brown se llevó a cabo con potentes aparatos, de pequeña talla, fabricados por la firma londinense Bancks and Son. Este magnífico ejemplar, de unos 15 centímetros, forma parte de la colección de los Reales Jardines de Kew. Está diseñado con un doble control focal (de ajuste aproximado y de ajuste fino), montados en la columna y con un espejo de doble superficie. Con su lente se consiguen de 30 a más de 150 aumentos.

CONTROL DE LA POSICION DE LA LENTE

LENTE PLATINA MOVIL

REGLAJE APROXIMADO REGLAJE FINO

ESPEJO DE DOBLE CARA S E N O J D R A H IC R

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Representación visual de embriones humanos La microscopía de resonancia magnética nos revela los secretos escondidos en los primeros estadios del desarrollo embrionario Bradley R. Smith

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n nuevo horizonte biológico se me abre cada mañana a mi llegada al laboratorio de microscopía in vivo, del hospital clínico de la Universidad de Duke. Me aguarda la contemplación de imágenes tridimensionales, precisas y esclarecedoras, del interior de embriones humanos conservados in vitro , obtenidas mediante microscopía de resonancia magnética (MRM). Este tipo de embriones “virtuales” me permite emprender viajes simulados por ordenador por cualquiera de los sistemas recién pergeñados del cuerpo. Con estas imágenes puedo generar secuencias animadas del desarrollo embrionario, impensables hasta hoy. Aumenta la demanda de información de ese tipo por los biólogos que se afanan en comprender las etapas del desarrollo normal y patológico, así como los factores que indican cada proceso a seguir. Nuestro conocimiento se debe en buena medida al estudio de cortes bidimensionales de embriones de animales normales y de embriones de animales sometidos a manipulación genética. No obstante, la mejora del diagnóstico y del tratamiento de las malformaciones y enfermedades congénitas del hombre requiere que se establezca Microfotografía con luz visible

Feto temprano (64 días)

1. FETO HUMANO de 64 días. Se ha obtenido su representación visual mediante microscosuperior). En esta etapía de resonancia magnética (MRM) y microscopía ópticarecuadro ( pa, el embrión tiene una longitud aproximada de 30 milímetros. Las técnicas de representación por ordenador pueden convertir en translúcidas unas partes del embrión y dejar opacas otras. Al ajustar así la opacidad del espécimen, podemos observar estructuras internas a diferentes profundidades y en su entorno natural sin dañar la muestraa-c ( ). Podemos enfocar, girar o alejar la imagen del embrión d-f ( ), o usar el método de representación por segmentación para enfocar órganos específicos, como la formación de los pulmones (g-k).

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Etapa Carnegie 18 (44 días)

2. TUBO NEURAL de un embrión de 47 días (en su saco amniótico, en la micrografía óptica de la parte inferior izquierda ), sometido a examen mediante la técnica de MRM. Al manipular las imágenes digitales podemos crear secuencias de ordenador (evolución interna o “inmersiones”) del tubo neural, precursor del cerebro y la médula espinal. En esta evolución interna se hace girar al embrión a-c ( ); el observador parece entrar en el tubo neural (d) para emprender un viaje virtual por las vesículas craneales, que se convertirán en ventrículos del cerebro. El recorrido continúa por el romboencéfalo, por el techo del cuarto ventrículo y, de ahí, por el mesencéfalo (e-h), antes de salir del ventrículo (i, j ) y mostrar los hemisferios cerebrales.

Etapa Carnegie 19 (47 días)

3. CORTES DE UNA IMAGEN TRIDIMENSIONAL para mostrar en fino detalle el interior de un embrión de 44 días, correspondiente a la etapa Carnegie 18en( la parte superior se puede ver una imagen obtenida con microscopía óptica). El embrión, del tamaño de una alubia, aún tiene unidos los dedos de manos y pies. Pero presenta cerebro con dos hemisferios, precursores de vértebras (estructuras con forma de guión a la derecha ) y órganos internos. La MRM permite cortar una misma muestra por varios planos diferentes, lo que proporciona una información interna muy valiosa sin tener que destruir el espécimen. a

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una relación entre la información obtenida de estos modelos animales y las etapas correspondientes del desarrollo embrionario humano. Así las cosas, el Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD) me ofreció en 1996 un contrato para crear una base de datos de embriones virtuales a partir de la Colección Carnegie de Embriones Humanos. La Colección Carnegie, de enorme valor e instalada en el Museo Nacional de Salud y Medicina del Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas (Washington, D.C.), guarda embriones humanos de cada etapa

resados en el desarrollo embrionario pueden recurrir al trabajo realizado, así como el público curioso, a través de las páginas de Internet, donde encontrarán las imágenes de la etapa Carnegie 13 a la 23. Para crear esas imágenes sin precedentes, coloco cuidadosamente el embrión en el interior de un tubo, que después introduzco en un imán superconductor. La técnica MRM es semejante a la de formación de imágenes por resonancia magnética (IRM), prueba rutinaria en los hospitales. Ambas técnicas aprovechan la energía en la banda de radiofre-

de ocho del desarrollo, semanas de un y fetos día a tempranos embriones (un embrión se transforma en feto a las ocho semanas de la concepción). La muestra más pequeña mide unos 0,2 milímetros; la mayor tiene una longitud de unos 30 milímetros, el tamaño de una almendra. El grueso de la Colección Carnegie está formado por productos de aborto (espontáneo o provocado) recogidos entre 1887 y 1917 por Franklin Paine Mall. La colección ha venido creciendo con la inclusión de embriones descubiertos en autopsias de mujeres encinta. La colección divide el desarrollo embrionario en 23 etapas, definidas por hitos específicos, verbigracia, el momento en que aparece el botón de una extremidad. La NICHD me encargó la creación de imágenes MRM de embriones desde la etapa Carnegie 10 (22 días después de la concepción) —cuando aparece el primer arco faríngeo, que después pasa a formar parte de la mandíbula— hasta la primera semana del desarrollo fetal. (Dale S. Huff, del Hospital Infantil de Filadelfia, revisó la colección para escoger los mejores especímenes a representar.) Biólogos y médicos inte-

tones enpara cuencia el agua excitar del yinterior detectar deprolos tejidos. Sin embargo, la MRM revela detalles cuya finura trasciende la idónea para el diagnóstico clínico. Aunque la IRM puede producir imágenes con una resolución de vóxel (elemento de volumen) de un mililitro cúbico, la MRM registra vóxeles que son un millón de veces menores. Resoluciones que sólo se consiguen mediante imanes potentes, gradientes de perturbación del campo magnético intensos y bobinas de formación de imágenes capaces de acomodar muestras diminutas. Las técnicas de MRM, desarrolladas en la Universidad de Duke por el grupo de G. Allan Johnson, no dañan a los embriones. Con la microscopía tradicional, por contra , hay que seccionar las muestras en centenares de cortes finísimos. La MRM genera embriones tridimensionales virtuales, sin deformaciones, en una fracción del tiempo que haría falta para crear reconstrucciones a partir de la microscopía óptica. Podemos producir datos tridimensionales de un embrión en menos de dos horas, en comparación con los cientos de

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4. MERCED A TECNICAS DE PSEUDOCOLORACION asignamos colores a las imágenes de MRM para resaltar las estructuras; por ejemplo, los órganos en desarrollo de este embrión de 47 días. En las imágenes coloreadas de esta página, la retina en desarrollo brilla con un naranja amarillento. Los óvalos ámbar marcan los ganglios espinales, de donde emergen los nervios espinales; el hígado luce en el abdomen en color verde intenso, y el oído en desarrollo aparece en un resaltado color verde por encima de los hombros. Las imágenes revelan también la formación de las costillas cartilaginosas debajo del brazo y una pequeña reducción de la membrana interdigital.

TEMAS 29

Etapa Carnegie 17 (41 días)

5. EL EMBRION DE 41 DIAS que se muestra arriba, envuelto en el saco vitelino, bajo la luz de un microscopio óptico, posee tejidos diferenciados, que se pueden contemplar en estas imágenes obtenidas mediante tres técnicas de MRM diferentes: Peso-T1, Peso-T2 y Peso-difusión. Técnicas que permiten contemplar el agua de las muestras de tres maneras distintas, según la interacción entre agua y otras moléculas. (Esta característica es diferente para cada tejido.) Peso-T1 y Peso-T2 reflejan dos modos de detectar el tiempo de relajación, que mide cómo se reajustan los protones del agua después de ser perturbados por la energía de radiofrecuencia que se usa para excitarlos. En la imagen T1, los grandes vasos sanguíneos, las cámaras del corazón y el hígado aparecen destacados. La imagen T2 refleja tejidos no vasculares, pero sin contraste. La formación de imágenes por difusión aprovecha la difusión selectiva del agua en muchos tejidos; es una técnica particularmente informativa para el estudio de estructuras neurales como la corteza cerebralfinas ( líneas blancas que perfilan la parte superior derecha de la imagen de la derecha ). BRADLEY R. SMITH

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horas que se requiere con el microscopio óptico. Aunque la MRM obtiene datos tridimensionales minuciosos, se cuenta con programas informáticos para presentar los resultados. Para crear imágenes como las aquí ofrecidas, nos apoyamos en un programa de representación volumétrica que va superponiendo las imágenes MRM de los cortes —128 en total y cada uno con 256 256 píxeles— hasta formar un cubo de 8,4 millones de vóxeles. En cada vóxel se representa una porción de embrión. El programa nos permite rotar la matriz de vóxeles, retirar capas de ellos e incluso colorear o ajustar la escala de grises de los vóxeles en función de la intensidad de la señal u otros criterios. Mediante algoritmos de ordenador, provocamos el paso de rayos de luz virtuales a tra×

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vés de cada matriz, procediendo de atrás adelante. Los rayos, modificados por los vóxeles que encuentran en su camino, forman una imagen en la pantalla del ordenador. Podemos realizar secciones digitales de las imágenes en cualquier orientación y volver transparente la superficie de la muestra para que nos revele su estructura interna. Y podemos aislar un sistema de órganos para su inspección y medida. El Embrión Humano Multidimensional pone la Colección Carnegie al alcance de los investigadores de cualquier punto del planeta. La disponibilidad de este recurso en Internet ayuda a los clínicos a descubrir defectos congénitos mediante IRM y ultrasonidos. Aporta información gráfica solvente a los laboratorios de investigación que carecen de experiencia

Difusión

en embriología y a las aulas de embriología básica. Y, con el procesamiento de estas imágenes, preservaremos para la posteridad una insólita e insustituible colección de embriones humanos.

BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA ATLAS OF HUMAN EMBRYOS. Raymond F. Gasser. Harper & Row, 1975. EVELOPMENTAL STAGES IN HUMAN EMDBRYOS : INCLUDING A REVISION OF STREETER’S HORIZONS AND A SURVEY OF THE CARNEGIE COLLECTION . Roman O’Rahilly y Fabiola Müller. Carnegie Institution of Washington, Washington, D.C., 1987. Las páginas de “Multidimensional Human Embryo Web” están disponibles en la ubicación embryo.soad.umich.edu.

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Aplicaciones biológicas del microscopio de fuerzas Como quien se mueve a ciegas, y se sirve del tacto para reconocer las formas de los objetos, este instrumento emplea una punta afilada para sentir y revelar las formas de moléculas biológicas en soluciones acuosas Carlos Bustamante y Ricardo García

E

l progreso de la biología ha ido de la mano del avance de la técnica microscópica. Desde su aparición, en el siglo XVII, el microscopio ha sido en buena parte responsable de los grandes descubrimientos biológicos. Robert Hooke advertía en 1655, sirviéndose de un microscopio óptico rudimentario, que la corteza de corcho la formaban en realidad muchas “células”, es decir, celdas pequeñas e independientes. Pero la verdadera observación de los últimos componentes de los tejidos, de las células, no llegaría hasta el primer tercio del siglo XIX , de la mano, también, de dos microscopistas: Matthias Schleiden y Theodore Schwann. En el último tercio de esa centuria, Santiago Ramón y Cajal enunciaba la teoría de la neurona, apoyándose en las observaciones con su microscopio óptico. En 1876, Heinrich Abbé desarrolló la teoría de difracción de imágenes. Demostró que el microscopio óptico no puede resolver objetos menores que la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar la muestra. Usando luz de color verde, cuya longitud de onda es aproximadamente de 0,5 micrometros (µm), el microscopio óptico sólo puede resolver objetos próximos si entre ellos media al menos una distancia de 0,25 µm. Hasta 1931 no se produce otro salto decisivo en el progreso de la microscopía. Se trata de la introducción del microscopio electrónico que extendería la resolución espacial a la escala nanométrica (1 nanómetro equivale a 10 –9 m) y posibilitaría la 90

descripción ultraestructural de la célula. Ello no supuso el arrumbamiento del microscopio óptico, que continuó siendo un instrumento imprescindible en las investigaciones biológicas porque, a diferencia del microscopio electrónico, permite visualizar muestras inmersas en soluciones acuosas. O lo que es lo mismo, posibilita la observación de procesos biológicos en tiempo real. Durante muchos años, los biólogos han tratado de combinar la alta resolución del microscopio electrónico con el funcionamiento en agua del microscopio óptico. La invención en 1981 del microscopio de efecto túnel por Gerd Binnig y Heinrich Rohrer, galardonados ambos con el premio Nobel de física, abrió nuevas rutas para la visualización de moléculas biológicas en medios acuosos. El microscopio de efecto túnel constituye el primer ejemplo de una nueva clase de microscopios de alta resolución, llamados genéricamente microscopios de campo próximo. Los microscopios de este grupo comparten un principio de funcionamiento común: la imagen se obtiene a partir de la interacción entre una punta (sonda en lenguaje técnico) y la muestra. La interacción puede ser, por ejemplo, una fuerza mecánica, la corriente eléctrica, la radiación electromagnética o el flujo de calor. El microscopio de fuerzas, conocido también por microscopio de fuerza atómica, se ha convertido en una herramienta poderosa de la investigación biológica. Hace más de quince años se construyó el primero. Paul

Hansma, que ha trabajado en el desarrollo del microscopio de fuerzas, cuenta una curiosa anécdota. Cierto día en que Binnig se distraía observando el relieve de la pintura de las paredes de su casa, se preguntó por qué todos los microscopios basaban su funcionamiento en la interacción entre un haz de ondas, o partículas (fotones, electrones, o sonido), y la muestra. ¿Podría, se planteó, obtenerse la imagen de una superficie midiendo la fuerza entre los átomos de la superficie y los de una punta muy afilada unida a una palanca elástica, que actuara de muelle?

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eses más tarde, Binnig comentó la idea con su colaborador Christofer Gerber y con Calvin Quate, profesor de física de la Universidad de Stanford. Cuando determinaron el valor de las constantes de fuerza que mantienen unidos a los átomos en un cristal, comprobaron, sorprendidos, que podrían construir palancas elásticas con constantes de fuerza menores que la existente entre dos átomos. En efecto, las frecuencias de vibración de los átomos en superficies sólidas es de unos 10 13 hertz; si se admite una masa de 10 –25 kilogramos por átomo se obtienen constantes de fuerza del orden de 10 newton por metro. En cambio la constante de un trozo de aluminio doméstico de 5 milímetros de largo por 1 milímetro de ancho es sólo de 1 newton por metro. Es decir, requiere diez veces menos fuerza deformar el trozo de aluminio que desplazar los átomos de la superficie del cristal. Ante tales resultados, supusieron que, si añaTEMAS 29

FOTODIODO

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LASER

UNIDAD DE CONTROL

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1. ESQUEMA de un microscopio de fuerzas (izquierda). Se ilustran los componentes básicos: transductor de fuerzas (palanca elástica), sistema de detección óptico (diodo láser y fotodiodo) y cristal piezoeléctrico para efectuar los desplazamientos en las direcciones espaciales. Arriba se esquematiza una zona de interacción entre átomos de punta y de la muestra. Este dibujo ilustra una propiedad del microscopio de fuerzas, su carácter local. Cada dato de información es el resultado de la interacción de grupos localizados de átomos.

Electromicrografía de una punta usada en el microscopio de fuerzas. Estas puntas suelen tener radios de curvatura entre 10-20 nm.

100 nm 20 Kv

17 mm U H Z . X

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2. DOS MODOS DE UTILIZAR EL MICROSCOPIO DE FUERZAS. a) Modo de contacto. La punta se desplaza sobre la muestra manteniendo una deflexión de la palanca constante, es decir, una fuerza entre punta y muestra constante. La fuerza que existe entre los átomos de la punta y la muestra provoca la deflexión de la palanca. b) Modo oscilante. Punta y muestra se encuentran separadas por una distancia de varios nanómetros. La frecuencia de oscilación de la palanca depende de las fuerzas de largo alcance entre punta y muestra, y por tanto, variará para con la topografía. El sistema de retroalimentación se encarga de desplazar la muestra mantener constante la frecuencia de resonancia. dían una punta de diamante a un extremo del trozo de aluminio, éste podría funcionar como un transductor de fuerzas. En contacto con la superficie, el transductor se deformaría siguiendo la topografía de la misma, transformando en movimiento la interacción de los átomos de la punta con los átomos de la superficie de la muestra. Así crearon en 1986 el primer prototipo de un microscopio de fuerzas, cuya característica principal reside en su versatilidad, pues opera en vacío, en aire o en un medio líquido. Un microscopio de fuerzas consta de tres componentes básicos. Un transductor de fuerzas, un sistema

de detección óptico y un cristal piezoeléctrico. El transductor de fuerzas consiste en una palanca elástica en cuya parte anterior se encuentra una punta piramidal. Palanca y punta se fabrican de manera integrada empleando técnicas de microelectrónica. Suelen ser de silicio o nitruro de silicio. Las dimensiones típicas son de 100 µm de longitud, 30 µm de ancho y 3 µm de espesor. La punta sobresale unos 5 µ m de la base de la palanca. El sistema de detección óptico permite medir las deflexiones de la palanca y transformar éstas en valores de fuerza. Consta de un diodo láser que emite un haz de luz que se

focaliza en la parte posterior de la palanca. La luz reflejada se recoge en un fotodiodo de cuatro segmentos. Los cambios en la distribución de luz en cada uno de los segmentos permiten determinar las fuerzas que se aplican. La muestra se coloca sobre un cristal piezoeléctrico que posibilita su desplazamiento con respecto a la punta en las tres dimensiones espaciales. El microscopio de fuerzas puede funcionar en dos modos distintos, llamados de contacto y oscilante. En el primer modo, la muestra y la punta se hallan en contacto directo mienotra.se tras Los mueve accidentes una con topográficos respecto ade la la muestra producen deflexiones de la palanca, que se detectan midiendo la reflexión de un rayo láser que incide sobre la parte posterior de la palanca y se recoge sobre un fotodiodo con cuatro segmentos. En este modo de funcionamiento, las regiones elevadas de la muestra producen grandes deflexiones de la palanca y experimentan, por tanto, fuerzas más intensas. Para evitar tales altibajos, existe un sistema de retroalimentación que se encarga de acercar o alejar la muestra mediante un cristal piezoeléctrico, de suerte que la deflexión de la palanca (y, por consiguiente, la fuerza aplicada a la muestra) se mantenga constante. Se va obteniendo la imagen de la superficie conforme quedan registrados los desplazamientos del

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m n 0 0 ,6 0

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6 8 nm

3. IMAGENES DE RESOLUCION ATOMICA de una superficie de mica. La mica es un material de estructura laminar y muy estable en condiciones ambientales. A la izquierda se ofrecen las posiciones atómicas de la mica obtenidas manteniendo la fuerza entre punta y muestra constante. En el centro las mismas posiciones, aun que mi92

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0 nm

diendo las fuerzas laterales que los átomos de la superficie de la muestra ejercen sobre la palanca. Estas fuerzas laterales indican que los átomos de la punta se enganchan y desenganchan sucesivamente de los átomos de la muestra. Tal observación permite el estudio de mecanismos de disipación de energía a escala atómica TEMAS 29

cristal piezoeléctrico para mantener constante la deflexión de la palanca en cada posición de la superficie. En este modo las fuerzas que típicamente se detectan entre punta y muestra varían entre 1 nanonewton y 100 nanonewton. Estas fuerzas pueden producir modificaciones irreversibles en muestras blandas. Esto se evita empleando los modos oscilantes. n el segundo modo, la punta sobrevuela la muestra al tiempo que oscila sobre ella. La frecuencia de resonancia del sistema formado por la palanca y la punta no depende sola-

plitud de oscilación) se detectan ópticamente mediante la deflexión del rayo láser en la superficie de la palanca. También aquí existe un sistema de retroalimentación, que se emplea, lo mismo que en el caso anterior, para modificar la distancia entre punta y muestra, con el objeto de que se mantenga constante la frecuencia de resonancia. La resolución espacial del microscopio depende de la geometría de la muestra. Se pueden obtener imágenes con resolución atómica a partir de muestras planas, ya sea en aire o sumergidas en agua o etanol. Con

y del material mente de la geometría de que está de la hecha, palanca sino también de las fuerzas existentes entre punta y muestra. Dicho en otros términos, la frecuencia de resonancia variará con la distancia entre punta y muestra, y, por tanto, de acuerdo con el perfil de la superficie. Los cambios operados en la frecuencia de oscilación (o equivalentemente en la am-

está determinada muestras biológicas, por la relación resolución entre el tamaño de la punta y el objeto y la magnitud de las fuerzas que se aplican. La resolución suele variar entre 5 y 10 nanómetros. El microscopio de fuerzas posee una finísima sensibilidad. Para su correcto funcionamiento se exige, pues, el apantallamiento de las vibra-

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4. IMAGEN de una molécula de ADN obtenida en contacto en propanol. Se puede distinguir una periodicidad conmensurable con la de la doble hélice. La barra representa una longitud de 15 nm. ciones externas (las del edificio o las de personas que deambulan por el laboratorio). Hay un parámetro que mide el grado en que las vibraciones externas dejan de condicionar la operación del microscopio. Se trata de la relación entre la frecuencia de la vibración externa, ν, y la frecuencia de resonancia más baja del instrumento, amplitud A ν . Así, una vibración de o se atenúa en el microscopio de fuerzas por un factor ( ν /ν o) 2 . Si la frecuencia de resonancia más baja del microscopio es 40 kilohertz, las vibraciones externas menores de 100 hertz (las habituales en los edificios) y con una amplitud de micrometro sólo producirán un movimiento de la punta respecto a la muestra de 0,01 nanómetros. Los microscopios en los que se ha procurado maximizar el rendimiento apantallan las vibraciones externas con una construcción rígida y compacta, especialmente de la cámara que contiene la palanca, la muestra, el láser y el fotodiodo.

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(fricción). La punta y la muestra se mueven solidariamente hasta que la fuerza acumulada en la palanca supera la fricción de la muestra y la punta se suelta de golpe. La fotografía de la derecha, cedida por D. Keller, es una imagen de basófilos de rata obtenida en aire usando el modo de contacto. Estas imágenes ilustran el amplio rango de dimensiones de las muestras accesibles al microscopio de fuerzas. A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

n la adaptación del microscopio de fuerzas para la observación de biomoléculas han intervenido físicos, químicos y biólogos. Las primeras aplicaciones biológicas del microscopio de fuerzas se centraron en la molécula de ADN. A pesar de que su estructura molecular está perfectamente determinada por difracción de rayos X y por métodos bioquímicos, hay numerosos procesos todavía por desentrañar en los que participa el ADN. Para su observación, las moléculas de ADN han de depositarse sobre una superficie plana a escala atómica, de suerte que la superficie de soporte no enmascare la topografía de la molécula a examinar. El material de mica 93

.) a h c (d E T N A M A T S U B . C ;) . a d z (i A S O C S A R R A C . L . J , E L L A V . M , O Y A M A T .J , IA C R A G . R

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100 200 300 400 nm

5. IMAGENES de complejos ADN-proteínas obtenidas en modo oscilante en aire. A la izquierda, una topografía tridimensional de un ADN circular ligado a la proteína del conector del bacteriófago φ29, las proteínas aparecen como objetos que sobresalen del filamento de ADN. A la derecha, imágenes de fragmentos de AD N (68 1 pa res d e ba ses ) y la pro teín a ARN -pol imer asa . cumple ese requisito. Sin embargo, fracasaron los primeros intentos de observar ADN depositado en mica. Las imágenes del ADN aparecían borrosas o desaparecían después de sucesivas tomas.

El doblamiento del ADN depende de la secuencia del ADN. Es probable que la deformación de la molécula de ADN por la polimerasa durante la transcripción permita la interacción de este comp lej o con otra s molé cul as de pro teín as enc arga das de regular la velocidad con la que se mueve la proteína sobre el ADN.

Se demostró más tarde que, además de las fuerzas perpendiculares existentes entre la punta y la muestra (fuerzas que suelen emplearse para formar la imagen), la punta ejercía también fuerzas laterales sobre

la muestra, superiores incluso a las que unen las moléculas a la mica. Si las moléculas no se hallan bien ancladas en la mica, la punta las desplazará. Para obviar ese inconveniente, se han desarrollado varias estrate-

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6. IMAGEN obtenida en aire de complejos de ADN-HSF2, usando el método oscilante. Se ilustran dos complejos. Uno de ellos muestra que dos HSF 2 ( flechas ) son necesarios para formar la estruc94

400

0 nm

tura de “lazo” requerida para la activaci ón del proceso de trans cripción. El otro complejo muestra una HSF2 unida a HSE del ADN, sin formar lazo. TEMAS 29

gias. Así, existen tratamientos de la superficie de mica que modifican el signo de la carga superficial y aumentan la densidad de aquélla; este proceso refuerza el enlace electrostático con el ADN, que es una molécula polar. De igual forma, se han desarrollado nuevos modos oscilantes de funcionamiento que minimizan el contacto con la muestra y reducen las fuerzas laterales que la punta ejerce sobre el espécimen. Para aliviar el problema de las fuerzas laterales se procura también reducir la humedad ambiental. En efecto, entre la punta y la muestra se crea

ceso de transcripción. La geometría observada resulta coherente con lo que nos dice la bioquímica, a saber, que el movimiento de la polimerasa sobre el ADN no es continuo, sino que semeja el ciclo de extensión y contracción de una oruga. Presumiblemente, durante la fase de contracción de este ciclo la proteína deforma y dobla el ADN. Es posible que estos cambios conformacionales de la polimerasa y el ADN tengan una función importante en los mecanismos de regulación del proceso de transcripción. Un ejemplo del poder del micros-

del mismo, los denominados elementos de choque térmico (HSE), y se ponen en contacto con el promotor o lugar del ADN en el que se engarza la ARN-polimerasa para iniciar la transcripción. Los HSE pueden encontrarse cerca o lejos del promotor. La máxima activación requiere la interacción de varias proteínas HSF2, proceso que va acompañado a menudo de la formación de lazos. Con los métodos tradicionales de microscopía electrónica no se había podido determinar si la formación de estas estructuras precisan dos secuencias HSE y sendas

pilaridad un menisco atractiva de agua.que Lade fuerza ello de resulta capuede deformar o desplazar las biomoléculas. Conviene, pues, efectuar los experimentos en líquidos. Cuando así se procede, el microscopio de fuerzas proporciona imágenes con resolución molecular incluso en soluciones fisiológicas. Existe ahora un especial interés por estudiar proteínas y ácidos nucleicos que participan en la formación de complejos moleculares, y que, por sus dimensiones y topología, quedan a menudo fuera del alcance de las técnicas de cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear. Las interacciones ácido nucleicoproteína son la base molecular de procesos celulares relacionados con la síntesis de ADN, la formación de ARN mensajero o la síntesis de proteínas a partir del ARN mensajero. En ese ámbito, el microscopio de fuerzas permite caracterizar la geometría de los complejos de proteína-ADN, los cambios estructurales del ADN y de las proteínas que resultan de la interacción, y la estequiometría de los complejos, es decir, el número de moléculas de proteína por molécula de ADN en el complejo.

estequiometría copio de fuerzasde para complejos determinar de ADNla proteína lo encontramos en el lazo que se forma en la molécula del ácido nucleico por inducción de factor 2 de choque térmico (HSF2), una proteína activadora del proceso de transcripción en células humanas. Estas proteínas activan el proceso de transcripción en un doble paso: se unen al ADN en secuencias esp ecializadas

a ellas, o si de moléculas una proteína sola molécula HSF2 unidas de HSF2 se engarzaba simultáneament e a dos HSE y al promotor. La cuestión se dirimió con el microscopio de fuerzas, cuyas imágenes han revelado que la formación de los complejos de activación implica la unión de dos moléculas de HSF2 a sus respectivos elementos de choque térmico. Una de las principales ventajas del

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omemos, por ejemplo, el conector del virus bacteriófago φ29 y una zona de ADN circular; el polipéptido conector sirve de enlace entre la cabeza del virus (donde se empaqueta el ADN) y el cuello del mismo. Si llevamos el complejo ADN-conector al microscopio de fuerzas, las imágenes nos revelan la geometría de las interacciones entre el conector y el ADN, y de ellas es posible inferir que la interacción del ADN circular con el conector se realiza por el exterior del mismo. En cambio, la interacción con ADN lineal se re aliza preferentemente a través de un canal interno. Se sabe gracias al microscopio de fuerzas que la ARN-polimerasa deforma la molécula de ADN durante el proA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO

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7. IMAGENES DE FRAGMENTOS DE ADN en solución acuosa de positados sobre mica. Las fotografías a y c se han sacado inmediatamente después de que se introdujera una solución de ARN-polimerasa en la celda de fluidos. Las fotografías b y d corresponden a los mismos fragmentos y se obtuvieron unos 45 segundos más tarde. Nótese que una s ola molécula de polimerasa se ha unido a cada fragmento ( flechas). El área de las imágenes es 300 nm × 300 nm, dimensiones que semejan las del menor elemento de imagen que cabe obtener con un microscopio óptico. 95

microscopio de fuerzas reside en su capacidad para adquirir imágenes en líquidos. Existen varios motivos para efectuar los experimentos en líquidos. En primer lugar, la formación de imágenes en líquidos permite reducir las fuerzas entre la muestra y la punta. En segundo lugar, si las imágenes se hacen en medios salinos, las moléculas presentan estructuras más cercanas a las que muestran en los

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experimentos han corroborado que el microscopio de fuerzas constituye una valiosa herramienta para la manipulación mecánica de moléculas individuales. El desarrollo de microscopios que no requieren lentes para la formación de imágenes, como los microscopios de campo próximo, ha abierto numerosas y srcinales vías de investigación en la química y física de superficies

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último, los procesos celulares. medios líquiPor y en lade copio biología. fuerzasElesmicroscapaz dos abren la puerta al de trabajar con muestras estudio de procesos dinásumergidas en medios micos. Los tipos de proceacuosos como el microscosos dinámicos accesibles pio óptico, pero con la resoal microscopio de fuerzas lución del microscopio dependen de los tiempos 8. SECUENCIA DE IMAGENES de la digestión de una molécula de ADN electrónico. En los pocos de adquisición de imágecon nucleasa de micrococo. La imagen fue obtenida en una solución de años transcurridos desde nes, que suelen variar en- pH 7,6, usando el modo oscilante. La imagen muestra que la deposición su invención, esta técnica tre 10 y 200 segundos; es de las moléculas sobre la superficie de mica no obstaculiza la inte- ha dejado de ser un insdecir, puede abordar proracción bioquímica entre la enzima y el substrato. Area de los recua- trumento exótico en el cesos rápidos como la forlaboratorio de biología y dros: 300 nm × 300 nm. mación de complejos molese está convirtiendo poco culares o lentísimos como a poco en una herramienla división celular. tener también imágenes de proteíta necesaria. Un ejemplo de ensamblaje de comnas de la membrana celular en soluSin embargo, los ejemplos anteplejo biomolecular que podemos ciones salinas. riores no son las únicas aportaciones seguir y caracterizar a través de imáLa interacción del microscopio de que estas técnicas pueden ofrecer a genes obtenidas con el microscopio de fuerzas con la muestra es de carácla biología. Unos experimentos donde fuerzas es el de la unión de una molé- ter local. Gracias a esa propiedad, el se combinaron luz y un microscopio cula de ARN-polimerasa a una mocontrol de la posición de la punta perde fuerzas han demostrado que es polécula de ADN. Así, ha sido posible mite introducir micromodifica cio- sible obtener simultáneamente imáobservar primero el fragmento suelto nes, fabricar dispositivos a escala genes de biomoléculas, así como intede ADN y, luego, la unión de éste con nanométrica o determinar fuerzas rrogar espectroscópicamente y de la enzima polimerasa. Asimismo, el intermoleculares. Así ha ocurrido, forma individual a las mismas. A tramicroscopio de fuerzas ha permitido por ejemplo, con la determinación de vés de estos desarrollos es posible seguir procesos bioquímicos como la la fuerza necesaria para separar el que el investigador del siglo XXI disdigestión de un fragmento de ADN complejo de una pr oteína, la avidina, ponga de nuevas herramientas para por una nucleasa de restricción. Y obcuando se une a una molécula de viexplorar procesos biológicos en tiempo tamina B 12 (biotina). Para ello, un real y con resolución espacial y especgrupo de científicos alemanes, entroscópica molecular. cabezado por Hermann Gaub, recubrió la punta con moléculas de avidina y la puso en contacto con una superficie recubierta por biotina. El BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA acercamiento de la punta y la muestra promovió la formación de enlaATOMIC FORCE MICROSCOPY. D. Rugar, P. ces no covalentes avidina-biotina. K. Hansma, en Physics Today, vol. 43, Luego, alejando la muestra de la pág. 23, 1990. punta, se determinó la fuerza neceSCANNING FORCE MICROSCOPY. D. Sarid. saria para romper estos enlaces. Un Oxford University Press, Nueva York, histograma de las fuerzas medidas 1991. BIOCHEMICAL AND STRUCTURAL APPLICAmuestra distintos picos con periodiTIONS OF SCANNING FORCE MICROSCOPY. cidad de 160±20 piconewton. Este 30 nm C. Bustamante, D. A. Erie, D. Keller, en valor se ha identificado, por tanto, Current Opinions in Structural Biology, como la fuerza requerida para romvol. 4, pág. 750, 1994. 9. IMAGEN DE LA SUPERFIC IE extrac elu- per un solo enlace molecular biotinaS CANNING F ORCE M ICR OSCOPY IN B IO lar de un desmosoma aislado de la superfi- avidina. Siguiendo un procedimiento LOGY. C. Bustamante, D. Keller, en Phycie de una célula de hígad o de rata. La ima- similar, ha sido posible también detersics Today , vol. 48, n. o 12, página 32, 1995. gen fue obtenida en una solución salina de minar la fuerza que une las cadenas complementarias del ADN. Estos fosfato, usando el modo de contacto.

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