2 0 0 2 e r t s e m i r t r e
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6,50 EURO
o i r a m u S
I. TECNICAS
4 El microscopio acústico Calvin F. Quate
14 Microscopios con sonda de barrido H. Kumar Wickramasinghe 24 El microscopio de efecto túnel Gerd Binnig y Heinrich Rohrer 32 Microscopía confocal Jeff W. Lichtman 38 Microscopios de rayos X Malcolm R. Howells, Janos Kirz y David Sayre 46 La física de superficies Rodolfo Miranda 56 Técnicas de microfotografía Jearl Walker
II. OBSERVACIONES
64 Camillo Golgi y la reacción negra Paolo Mazzarello 72 Cajal y la estructura histológica
del sistema nervioso José M. López Piñero
80 Las primeras observaciones Brian J. Ford 84 Representación visual de embriones humanos Bradley R. Smith 90 Aplicaciones biológicas del microscopio de fuerzas Carlos Bustamante y Ricardo García
TECNICAS
N A M D O O G L E A H C I M
El microscopio acústico Este instrumento es hoy un medio de trabajo común en distintas especialidades científicas y actividades industriales. En este artículo de 1979 uno de sus creadores explicaba explicaba los fundamentos en que se basa Calvin F. Quate
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as ondas sonoras que vibran en la atmósfera con frecuencias inferiores a unos 20.000 hertz (oscilaciones por segundo) nos son familiares como medio de comunicación. Por ejemplo, las oscilaciones de la voz humana pertenecen a este grupo. La atmósfera no constituye un medio favorable para la propagación de ondas acústicas de frecuencias más elevadas, ultrasónicas. Estas vibraciones inaudibles se disipan rápidamente en gases tales como el aire. Las ondas de los ultrasonidos pueden propagarse a distancias apreciables con moderada atenuación sólo en líquidos y sólidos. Las ondas acústicas que vibran en esos medios condensados a frecuencias ultrasónicas se emplean para la formación de imágenes y no para la comunicación. Existen dispositivos ultrasónicos basados en la producción y detección de ondas acústicas con frecuencias del orden del megahertz (un millón de oscilaciones por segundo). Se emplean frecuentemente en el estudio de objetos submarinos y en averiguar características estructurales internas de los órganos del cuerpo humano y de materiales. Por ejemplo, un feto en el seno de una mujer preñada puede ser examinado de este modo con completa inocuidad. El microscopio acústico constituye una extensión de la tecnología de formación ultrasónica de imágenes. Sus ondas ultrasónicas tienen frecuencias próximas a un gigahertz (mil millones de oscilaciones por segundo), cerca de mil veces mayores que las frecuencias típicas de los sistemas macroscópicos de formación ultrasónica de imágenes. En términos de las longitudes de onda la comparación es ilustrativa. Se miden en metros las 4
longitudes de onda de los sonidos pro- ultrasónicos de muy alta frecuencia ducidos por la voz humana, en milí- fueron realizados por Hans E. Bömmetros las de los ultrasonidos emplea- mel y Klaus Dransfeld en los Laborados en los dispositiv dispositivos os macroscópicos torios Bell. A finales de ese decenio, de formación de imágenes y en micro- James S. Imai e Isadore Rudnick, de metros las de la mayoría de los micros- la Universidad de California en Los copios acústicos perfeccionados. Es Angeles Ang eles,, se las inge i ngeniar niaron on para pa ra propr odecir, las ondas empleadas en estos ducir en helio líquido ondas acústinuevos dispositivos de formación de cas de una longitud de onda de sólo imágenes son de longitud compara- 0,2 micrometros. ble con la de las ondas electromagnéticas de la luz visible. hora, a finales del decenio de No hay que sorprenderse, por tanto, 1970, varios grupos, con técnicas de que el microscopio acústico empiece algo diferentes, están empeñados en a proporcionar imágenes con una reso- la tarea de intentar desarrollar un sislución que no desdice de la que tie- tema práctico de microscopía acústica. nen las imágenes conseguidas con el En las primeras fases del esfuerzo microscopio óptico ordinario. Lo que tuvieron un papel destacado los inpuede resultar extraño es que los que vestigadores de la Zenith Radio Cortrabajan en este campo se esfuercen, poration, dirigidos por Adrianus Korno en igualar la resolución del micros- pel y Lawrence W. Kessler. (Este último copio óptico, sino en rebasarla. Pero ha pasado a la Sonoscan, Inc., que no se trata solamente de la resolu- fabrica una versión de barrido con láser ción. El origen del contraste en los del microscopio acústico.) Nuestro sistemas acústicos es completamente grupo de la Universidad de Stanford distinto del de los ópticos. Ciertas ha perseguido el objetivo activamente propiedades, hasta ahora inaccesi- durante cinco años. Hemos conseguido bles, de los objetos microscópicos em- reducir la longitud de onda operativa piezan a entrar en consideración en en nuestro dispositivo de cinco microlas imágenes acústicas. Se confía en metros a medio micrometro. que el microscopio acústico encontraMientras tanto, ¿qué es lo que herá su lugar al lado del microscopio mos descubierto? Hemos aprendido óptico, el microscopio electrónico y el que un microscopio acústico puede futuro microscopio de rayos X, for- construirse con un elemento focalimando una línea de dispositivos com- zador más simple que el constituido plementarios para explorar el mundo por las lentes del microscopio óptico de las cosas muy pequeñas. ordinario. Hemos encontrado que la S. Y. Sokolov, de la Unión Soviética, resolución de un microscopio acústuvo en el decenio de 1920 la idea de tico sólo está limitada por la longiutilizar ondas acústicas del orden tud de onda con la que opera y que de los gigahertz en un sistema de mi- las aberraciones no desempeñan un croscopía. Pero la tecnología necesa- papel importante. Hemos demostrado ria para producir tales ondas no es- que los detalles en las micrografías tuvo disponible hasta comienzos del acústicas pueden ser tan finos como decenio de 1960. Gran parte de los en las micrografías ópticas. Hemos primeros trabajos sobre dispositivos confirmado que es fácil medir el espe-
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TEMAS 29
sor de películas de semiconductores y metales con las ondas acústicas y que, por tanto, es posible estudiar la adhesión de tales películas a un substrato. En el caso de muestras biológicas, hemos conseguido imágenes con un elevado contraste de varios tejidos sin necesidad de una tinción previa. Confiamos en que esta cualidad
del microscopio acústico permitirá que pronto pueda emplearse para lograr nueva información de las células vivas. ¿Cómo se forman las imágenes en un microscopio acústico? Al igual que en el microscopio óptico, la base reside en el cambio de la velocidad de propagación de las ondas al atrave-
sar la superficie de separación existente entre dos medios materiales distintos. En las ondas acústicas este cambio es mucho mayor que el que presentan las ondas luminosas. El índice de refracción, que mide las velocidades relativas de la luz entre dos medios, nunca es mayor de 1,9 y usualmente no vale más de 1,5. Por
D R O F N A T S E D D A D I S R E V I N U , R A G U R L E I N A D
1. MICROGRAFIA ACUSTICA de un conjunto de cromosomas huma- mente las señales ultrasonoras registradas para obtener la imagen nos, obtenida por el autor y sus colaboradores, en el departamento de los cromosomas en una pantalla de televisor. Las líneas verticade física aplicada de la Universidad de Stanford, como prueba del les que aparecen en la fotografía obedecen a defectos en el procegrado de resolución alcanzado por el nuevo dispositivo ultrasónico so de barrido. El frotis de cromosomas fue preparado en el laboratode formación de imágenes. Con este fin, tanto el portaobjetos con la rio de Howard M. Cann en la facultad de medicina de la Universidad muestra como la lente del instrumento estaban sumergidos en argón de Stanford. Se eliminó el recubrimiento de proteína de los cromolíquido. Se mantenían a una temperatura de 85 grados kelvin (menos somas y fueron teñidos de la forma habitual para poner de manifies188 grados Celsius) rodeando el recipiente que contenía el argón lí- to en las micrografías ópticas su estructura estructura en bandas. El aumento quido de un baño con nitrógeno líquido. Se analizaron electrónica- es de 3500 diámetros. A T RAV RAVÉS ÉS DEL MICROSCOPIO
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D D O T
RAYO SONORO
N A D
RAYO SONORO RAYO LUMINOSO
LENTE
R RAYO LUMINOSO
2. TANTO LOS RAYOS SONOROS COMO LOS RAYOS LUMINOSOS se refractan, o desvían, al atravesar la superficie de separación entre materiales en los que las velocidades de propagación de las ondas son distintas. El ángulo de desviación es mucho mayor en los rayos sonoros (diagrama de la izquierda). La presencia de una concavidad esférica en el material de mayor índice de refracción (esto es, en el que las ondas se propagan más deprisa) servirá para localizar ambas clases de rayos (diagrama de la derecha). En esta situación, los rayos sonoros convergen más rápidamente que los rayos luminosos y en consecuencia la aberración resultante en la imagen obtenida es menor. Para las ondas sonoras, la distancia local es 1,3 veces mayor que el radio de curvatura de la lente (simbolizado con la letra R ). Para los rayos luminosos, la distancia focal es unas tres veces mayor que el radio de curvatura de la lente. D D O T N A D
ZAFIRO
AGUA
RADIO DE CURVATURA DE LA LENTE (40 MICROMETROS)
DISTANCIA FOCAL (40 MICROMETROS)
TRANSDUCTOR PIEZOELECTRICO (OXIDO DE CINC) CAPAS DESVIADORAS (ORO)
ALAMBRE LENTE DESVIADOR (ORO) PLANO FOCAL LIMITADOR DE RAYOS (DIOXIDO DE SILICIO)
CAPA ANTIRREFLECTORA (VIDRIO)
3. LENTE ACUSTICA diseñada por el grupo del autor en Stanford. Consiste en una superficie cóncava y esférica de separación entre zafiro y agua formada en la punta biselada de una corta varilla de unos 6 milímetros de diámetro (izquierda ). La película piezoeléctrica que se encuentra depositada en la superficie posterior de la lente de zafiro convierte las señales eléctricas en otras acústicas durante el proceso de formación de la imagen. La misma película sirve a continuación para convertir las señales acústicas en señales eléctricas en la fase siguiente de lectura. La parte ampliada de la derecha muestra el perfil aproximado del haz de ultrasonidos localizado en el agua. Las líneas blancas paralelas en ambos esquemas ilus trativos son los frentes de onda acústicos. La superficie lisa de la varilla de zafiro se ha hecho rugosa para dispersar las ondas espurias. Además, se aplica usualmente un elemento antirreflector de vidrio a la superficie frontal de la lente al objeto de reducir las reflexiones acústicas internas. 6
el contrario, la velocidad de las ondas sonoras puede cambiar en un factor diez al atravesar una interfaz (superficie de separación) sólido-líquido adecuada. El elemento focalizador primario del microscopio acústico, desarrollado por nuestro grupo en Stanford, consiste en una interfaz esférica cóncava, de unos 40 micrometros de radio, formada entre zafiro y agua. En tal superficie de separación los rayos sonoros se desvían fuertemente hacia dentro al entrar en el líquido. En nuestro sistema todos los rayos convergen en un estrecho “embudo” próximo al centro de curvatura de la esfera. En dicha interfaz el cambio en la velocidad de la luz sería pequeño y el ángulo de convergencia del haz localizado sólo sería ligero. La aberración resultante debería eliminarse recurriendo a sistemas de lentes con múltiples superficies refringentes. En el caso acústico, una lente esférica con una única superficie refringente resulta casi la hipótesis ideal. La fuerte convergencia hace que la aberración sea mínima. Además, el recubrimiento antirreflector, seme jante al comúnmente empleado en las lentes ópticas, puede aplicarse al zafiro para reducir la reflexión de las ondas acústicas en la interfaz. Sin embargo, las reflexiones residuales no pueden eliminarse completamente y constituyen una pequeña fuente de interferencia. Por fortuna, podemos distinguir las diferentes reflexiones con ayuda de una señal de prueba formada por un pulso momentáneo de ultrasonido. La parte del pulso que viaja a través del líquido se reflejará a partir del objeto y llegará al receptor más tarde que la parte reflejada por la lente. Este procedimiento permite identificar la causa de las ondas reflejadas, pues quedan registradas en distintos momentos.
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as principales componentes del sistema acústico son bastante simples, si se comparan con el prodigioso despliegue de equipo electrónico necesario para producir las señales y prepararlas para conseguir la imagen final. Se ha diseñado nuestro sistema de modo que podamos llevar las señales hacia dentro y hacia fuera de la celda acústica tan pronto como sea posible. La razón de esta manera de proceder reside simplemente en que, en la actualidad, las señales eléctricas son más fáciles de manipular que las acústicas. El primer paso en el proceso d e la obtención de la imagen consiste en convertir una señal eléctrica en otra TEMAS 29
acústica por medio de una película ajustarse fácilmente la razón entre sado por un motor de corriente conpiezoeléctrica depositada en la su- estas traslaciones y con ello la ampli- tinua, es mucho más lento que el perficie posterior de la lente de zafi- ficación de las imágenes puede variar movimiento horizontal. ro. La película está formada por nu- de cien a varios millares. Los visitantes que acuden a nuesmerosos cristalitos, cada uno de los En nuestro sistema actual, el barri- tro laboratorio suelen plantear dos cuales tiene una dirección preferida: do mecánico se consigue de la manera cuestiones: 1. a ¿No introduce, el movisu eje longitudinal, en general, es siguiente. Se fija la muestra a un miento relativo entre la muestra y la perpendicular a la superficie del subs- disco circular unido a un soporte que lente, vibraciones perturbadoras en trato en el que está depositado. Un es impulsado horizontalmente por un la parte sólida del aparato o bien turcampo eléctrico alterno aplicado a lo altavoz. El altavoz vibra con una fre- bulencia en el líquido? 2. a ¿Por qué largo de dicho eje comprimirá y ex- cuencia de 60 hertz y origina corri- no se sustituye el método de barrido pansionará el cristal según vaya va- mientos horizontales de la muestra mecánico por otro electrónico, que riando la polaridad del campo. Desde comprendidos entre 100 y 200 micro- eliminaría la necesidad de mover hace años, se dispone de películas metros. El conjunto puede trasla- todos los componentes y así podría ser piezoeléctricas, las cuales forman ya darse en dirección vertical, pues el más rápido? parte de muchos dispositivos acús- altavoz va montado sobre guías verRespecto a la primera cuestión, alticos comerciales. La película pie- ticales. El movimiento vertical, impul- gunas veces se presentan vibraciones zoeléctrica de óxido de cinc que nosotros empleamos permite convertir la energía electromagnética en energía acústica o mecánica con un renMOTOR DE CONTINUA dimiento que se aproxima al 50 por (MUEVE SEGUN EJE Y ) ciento. La lente acústica localiza el haz de ultrasonidos, producido de este modo, SOPORTE sobre una zona muy pequeña en el MOVIL plano del objeto. La imagen se consigue moviendo dicha zona a lo largo MOVITORNILLO del plano objeto, punto por punto y MIENTO MICROMETRICO línea a línea, realizando un barrido. SEGUN El procedimiento es análogo al de una EJE Y cámara de televisión donde, luego de enfocar la imagen sobre una superficie fotosensible, se registra rastreando la superficie con un haz de electrones. Sin embargo, en el microscopio MOVIMIENTO acústico el barrido se realiza mecáSEGUN EJE X nicamente y su velocidad es mucho menor. Necesita varios segundos para completar el campo, lo cual hace necesario almacenar durante algún tiempo las señales registradas antes de que puedan ser utilizadas para formar una imagen del objeto. Las señales reflejadas por el objeto ALTAVOZ y guardadas en la memoria electróni(MUEVE SEGUN ca terminan amplificándose y moduMUESTRA EJE X ) lan la intensidad del haz de electroPLACA nes en un receptor usual de televisión. GOTITA BASE La imagen se consigue rastreando el DE AGUA haz de electrones a través de la panSOPORTE talla en sincronía con el movimiento DE LA MUESTRA CABLE COAXIAL realizado por el haz acústico al seguir BLOQUE DE LA LENTE el objeto (o, en nuestro modelo actual, ENTRADA SALIDA con el realizado por el objeto respecto DE SEÑALES al punto focal del haz acústico). Se DE SEÑALES mantiene una correspondencia punto por punto entre las posiciones del impacto del haz electrónico sobre el 4. BARRIDO MECANICO de la muestra en dos dimensiones. Se consigue en la versión actual monitor de televisión y la posición del microscopio acústico de Stanford por medio del aparato representado. El disco circular del impacto sobre el objeto del haz que sostiene la muestra se desplaza horizontalmente entre 100 y 200 micrometros por un alacústico. Si el impacto del haz electró- tavoz que vibra con una frecuencia de 60 hertz (oscilaciones por segundo). El corrimiento vernico se traslada un centímetro sobre tical del conjunto muestra-altavoz está gobernado por un motor eléctrico de corriente contila pantalla del televisor mientras el nua. El movimiento vertical es mucho más lento que el horizontal. Las señales acústicas impacto del haz acústico se traslada reflejadas por la muestra se analizan electrónicamente y se destinan a modular la intensidad sobre el objeto diez micrometros, la del haz electrónico de un televisor. La imagen se forma rastreando el haz electrónico sobre la imagen resultante corresponderá a un pantalla sincrónicamente con el movimiento de la muestra relativo al punto focal del haz acúsaumento de mil diámetros. Puede tico. La razón entre corrimientos de los dos haces da el aumento de la imagen final.
D D O T N A D
A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
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en la muestra, pero son muy pequeñas, probablemente debido a que los modos de resonancia mecánica del objeto son de frecuencias muy superiores a los 60 hertz del proceso de barrido. En cuanto a turbulencia en el líquido, hasta el momento no se ha observado. A medida que perfeccioa
nemos el instrumento y observemos detalles más finos, estos factores podrán resultar importantes, pero no es ése el caso por ahora. Las imágenes conseguidas con el instrumento están bien enfocadas con bordes nítidos en todo el campo de visión. La respuesta a la segunda pregunb
ONDA INCIDENTE
INFERIOR AL ANGULO CRITICO
ONDA REFLEJADA REFLECTOR ELASTICO c
d
ANGULO CRITICO
A D A J E L F E R E T N E M A N R E T N I A D N O
SUPERIOR AL ANGULO CRITICO
D D O T N A D
5. ANGULO CRITICO para la reflexión interna. Es un concepto importante para comprender el fundamento físico de las propiedades especiales de las imágenes conseguidas en microscopía acústica. Puede hacerse visible en términos esquemáticos con ayuda de la ilus tración, en la que tanto las ondas incidentes como las reflejadas se han representado como si fueran ondas planas. Cuando una de tales ondas incide perpendicularmente (a) será reflejada en dirección opuesta con una fase idéntica a la de la onda incidente. Los frentes de las ondas planas se han representado alternando líneas blancas de trazo seguido y de trazo interrumpido. Los trazos seguidos designan crestas de las ondas; los interrumpidos, valles. Cuando la dirección de la onda plana incidente se inclina respecto a la normal formando un cierto ángulo (c ), a lo largo de la superficie del material reflector se excita una onda reflejada internamente y se altera la fase de la onda reflejada. (Se ha supuesto que el salto en la fase fue de media oscilación.) Si los ángulos de inclinación son menores o mayores que el crítico (b , d ) las ondas se reflejan en fase. En microscopía acústica las ondas reflejadas in ternamente viajan por todas las superficies. 8
ta va ligada a las posibilidades de invención. Apreciamos ciertamente las ventajas potenciales del barrido electrónico, pero todavía no hemos logrado dar con un método no mecánico eficaz de barrido con un haz bien enfocado.
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l examen de las superficies sólidas con este instrumento se realiza exponiéndolas a las ondas esféricas convergentes que proceden de la lente acústica y luego registrando las ondas divergentes reflejadas con ayuda de la misma lente que ahora actúa en sentido inverso. Las imágenes generadas por las ondas refle jadas muestran propiedades esp eciales. Conviene entender la razón física de las diferencias entre estas imágenes y las producidas por sistemas ópticos. Debido a que es más fácil imaginarse la situación en el caso de ondas planas, describiremos las diferencias esenciales para éstas y después discutiremos el proceso general para ondas esféricas, convergentes y divergentes. Al incidir una onda plana p erpendicularmente sobre una superficie elástica plana se reflejará según la dirección opuesta con una fase idéntica a la de la onda incidente. Sin embargo, cuando la onda incidente avanza en una dirección inclinada respecto a la normal puede excitarse una nueva onda, que aparece pegada a la superficie. Si esto ocurre, la onda reflejada vuelve con un ángulo igual al de incidencia, pero con una fase que es distinta de la correspondiente a la onda incidente. Este fenómeno, denominado reflexión total interna, ha sido intensamente estudiado en las ondas luminosas que inciden en superficies transparentes por P. K. Tien, de los Laboratorios Bell, y otros autores. Forma la base de la nueva tecnología de la óptica de ondas guiadas [ véa se “La óptica de ondas guiadas”, por Amnon Yariv; INVESTIGACIÓN Y CIEN CIA , marzo, 1979].
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n los sistemas acústicos estas ondas especiales viajan a lo largo de las superficies libres y de las interfaces. Pueden ser excitadas ajustando la dirección de las ondas incidentes con el valor del ángulo crítico. Para ángulos menores o mayores que el crítico, la onda se r efleja totalmente en fase con la incidente y no se transmite energía vibratoria hacia el interior del sólido. Para ondas sonoras incidentes en una superficie de separación líquido-sólido, el ángulo crítico puede llegar a ser de sólo diez grados. TEMAS 29
K. W. Andrews y R. I. Keightly, de cambio afectase a la velocidad de las la British Steel Corporation, han ondas sonoras que se propagan a lo empleado la reflexión total interna largo de la superficie del material. de ondas sonoras de alta frecuencia Andr ews y Keightly han demostrado para examinar diversos materiales que el ángulo crítico para la reflesólidos. Es sabido que las propieda- xión total interna varía no sólo con des elásticas de los materiales cam- el esfuerzo aplicado, sino también bian al aumentar los esfuerzos que con la composición del material. En soportan, y sería de esperar que d icho su aparato se determinan los ángua
ZAFIRO
AGUA
los críticos exponiendo la superficie a un haz de ondas sonoras planas, inclinado varios grados respecto a la posición de incidencia perpendicular. El transductor piezoeléctrico, para la recepción de las señales reflejadas, está también inclinado los mismos grados respecto a la perpendicular aunque en dirección opuesta.
b
O N D A I N C I D E N T E
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REFLECTOR ELASTICAMENTE DURO
REFLECTOR IDEAL c
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D A A J E L F E R D A N O
REFLECTOR ELASTICAMENTE BLANDO
6. ONDAS ESFERICAS CONVERGENTES de ultrasonidos formadas por la lente zafiro-agua en el microscopio acústico. Se han representado después de ser reflejadas por cuatro superficies reflectoras dis tintas. En el caso de un reflector ideal (a) los frentes de onda reflejados divergentes coinciden exactamente con los frentes de onda que inciden convergiendo. Las otras tres superficies reflejan en fase las ondas incidentes, excepto en el sector de la onda próximo al ángulo crítico. Debido a la reflexión total interna, en aquel sector las ondas A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
D A A J E L F E R D A N O
REFLECTOR ELASTICAMENTE DURO CON UNA CAPA SUPERPUESTA UNICA
D D O T N A D
salen reflejadas con la fase opuesta. En el caso de un material elás ticamente duro (b ), la transición de ciclo completo en el ángulo crítico es abrupta y los frentes de onda reflejados permanecen aproximadamente esféricos. En un material elásticamente blando (c ), la transición es gradual y los frentes de onda reflejados muestran dis torsión. En un sustrato con una única capa superpuesta (d) , la dis torsión es aún mayor. Las ondas reflejadas se comportan de un modo más complicado que el expuesto. 9
Con este sistema experimental pueden examinarse las faltas de homogeneidad en las propiedades elásticas de los materiales, que resultan, por ejemplo, de los cambios de composición en las aleaciones.
D R O F N A T S E D D A D I S R E V I N U , R A L A T A H A L L U D B A
7. AMPLITUD de la señal reflejada procedente del microscopio acústico. Está mos trada sobre la pantalla de un osciloscopio en función del espaciado entre la lente y la superficie reflectora. En el pico de cada una de estas trazas el reflector está colocado en el punto focal de la lente. A la izquierda del pico, el reflector queda expuesto a un haz convergente. A la derecha está expuesto a un haz divergente. Las diferencias de forma de las porciones oscilantes de estas trazas proceden de diferencias de las propiedades elásticas de las superficies reflectoras. La traza superior corresponde a una superficie de silicio puro. La central pertenece a una superficie de silicio cubierta con una capa de aluminio de un micrometro. La traza inferior está producida por una superficie de silicio con una capa de dos micrometros de aluminio. De este modo, pueden detectarse hasta cambios extraordinariamente pequeños en el espesor. 10
Como ya hemos dicho, en nuestro den oblicuamente, algunas regiones microscopio acústico las ondas ultra- de la película transductora estarán sonoras incidentes son esféricas y expuestas a componentes de la onda convergentes y el contraste que apa- de fase variable que se anularán con rece en las imágenes procede de los otras. La lente convertirá las ondas complejos detalles del proceso de refle- esféricas reflejadas en ondas planas, xión en ondas esféricas. En términos si su centro de curvatura coincide con simples, puede decirse que los fren- el punto local de la lente. Si los frentes de onda se reflejan en fase excepto tes de onda están distorsionados, las en el sector de la onda próximo al ondas planas que llegan al transángulo crítico. A causa de la refle- ductor también lo estarán. Cualquier xión total interna, este sector se re- variación en la forma de los frentes fleja con una fase diferente. Las con- de onda alterará la respuesta del secuencias de este sutil corrimiento transductor. Es esta variación en la de fase son decisivas. señal detectada, debida a las faltas Consideremos los frentes de onda de homogeneidad en las propiedades después de experimentar la reflexión. elásticas del objeto, la que constituye Supongamos que en la transición en la causa del contraste en las imágefase cerca del ángulo crítico para nes acústicas. reflectores elásticos los frentes de Entre la lente y el punto focal, como onda reflejados se trasladen toda una ya hemos indicado, el haz acústico longitud de onda, es decir, de una cres- incidente es esférico y convergente, ta a la siguiente. Para un material mientras más allá de este punto los duro, el zafiro, por ejemplo, la tran- frentes de onda son esféricos y diversición será brusca y los frentes de gentes. La curvatura del frente de onda reflejados permanecerán apro- onda incidente en la superficie del ximadamente esféricos. En un ma- objeto reflector cambia al variar el terial blando la transición será gra- espaciado entre la lente y el objeto. dual y los frentes de la onda reflejada Una onda convergente será reflejada resultarán distorsionados. Mostra- con los cambios de fase que hemos desrán poca relación con las ondas es- crito. En el punto local, la onda inciféricas originales. En el caso de un dente no será ni convergente ni diversubstrato con una sola capa super- gente. Más allá del punto focal, la puesta hay dos interfaces reflectoras onda divergente tendrá un carácter y dos ángulos críticos, el primero diferente de reflexión. Las trazas oscideterminado por el material de la ca- loscópicas procedentes de la respuesta pa superpuesta y el segundo influen- del transductor, en función del espaciado por el material del substrato. ciado entre la lente y el objeto reflec Ya que los frentes de onda reflejada tor, son reveladoras a este respecto. deben trasladarse dos longitudes de Abdullah Atalar, un investigador de onda sucesivas, la distorsión es aún nuestro grupo, ha mostrado que matemayor que con una sola superficie riales con diferentes constantes elásblanda. ticas, por ejemplo, producirán trazas (Para mayor claridad, se ha sim- osciloscópicas notablemente difeplificado la forma de onda en la figu- rentes. La diferencia en el ángulo críra 6. En realidad, la amplitud de la tico para la reflexión total interna onda reflejada nunca es igual a la origina la diferencia en las porciones amplitud de la onda incidente y, en oscilantes de dichas trazas. consecuencia, el comportamiento real La respuesta del transductor para de las ondas se vuelve más compli- un substrato con una única capa sucado. Aunque no hemos medido la perpuesta produce en el osciloscopio forma real de las ondas, estamos se- una traza particularmente intereguros de que este modelo ofrece los sante. Por ejemplo, hay un gran camrasgos esenciales de la cuestión.) bio en la forma de la traza correspondiente a una superficie de silicio ómo detectamos los frentes de puro cuando se deposita sobre ella onda distorsionados? Lo hace una capa de aluminio de un microel transductor piezoeléctrico. Un metro. El cambio es todavía mayor si transductor piezoeléctrico de pelícu- la capa depositada tiene dos microla delgada, con una dimensión trans- metros de espesor ( véase la figura 7 ). versal que sea mucho mayor que la En este ejemplo hay un espaciado longitud de onda, actúa como un de- lente-objeto correspondiente a un pico tector sensible a la fase. Su respuesta en la respuesta para la capa de dos será máxima para ondas planas con micrometros y, en cambio, se prefrentes de onda paralelos al plano del senta un valle en la respuesta para transductor. En esta situación toda una capa de un micrometro. Con este el área del transductor será excitada método son naturalmente fáciles de en fase. Si los frentes de onda inci- acusar pequeños cambios en el espe-
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TEMAS 29
D R O F N A T S E D D A D I S R E V I N U , E T A U Q . F N I V L A C
8. UNA SUPERFICIE DE ACERO, tal y como aparece en una micrografía acústica (derecha). Se obtiene una imagen completamente diferente de la que produce un instrumento óptico (izquierda). El ma-
yor contraste entre los granos cristalinos individuales en la imagen acústica debe ser atribuido a ligeras variaciones en las propiedades elásticas de los granos.
D R O F N A T S E D D A D I S R E V I N U , E T A U Q . F N I V L A C
9. UNA ALEACION DE COBALTO Y TITANIO, tal y como aparece en estas micrografías contrapuestas. Una se ha tomado con el microscopio óptico (izquierda) y la otra con el microscopio acústico
(derecha). Las formas manchadas en la imagen acústica corresponden a regiones en las que la aleación tiene una composición diferente.
sor o en las propiedades elásticas de tud de onda límite hubiera sido de una una película delgada. Por ejemplo, décima de micrometro, la microscoRobert G. Wilson y Rolf D. Weglein, pía acústica habría sido prepondede los Laboratorios de Investigación rante. La importancia de un microsHughes, han encontrado que el pro- copio, por encima de todos los demás ceso acústico da lugar a notables factores, queda definida por la resovariaciones de contraste en imágenes lución límite. En el microscopio acúsde objetos con múltiples capas, tales tico, ¿qué es lo que determina dicho como los circuitos microelectrónicos. límite? Se trata de la absorción del Como hemos mencionado, la lon- sonido a lo largo del camino acústico gitud de onda con la que opera el seguido en el líquido. En alguna forma mejor microscopio acústico es apro- hay que emplear líquidos si el objeto ximadamente de un micrometro, que debe moverse respecto a la lente. no difiere mucho de las longitudes de Aunque los líquido s hacen posible el onda de la luz visible. Hasta cierto uso de longitudes de onda cortas, abpunto puede decirse que se trata de sorben energía. Las moléculas de muuna mera coincidencia. Si la longitud chos líquidos muestran modos de vide onda límite para el sistema sono- bración que son excitados por las ro hubiera sido de diez micrometros, ondas de alta frecuencia. La absorel microscopio acústico hubiera lla- ción para tales líquidos es tan intensa mado poco la atención excepto para que su empleo está excluido. aplicaciones especiales. Si la longiCon mucho, el líquido preferido ha A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
sido el agua. Por fortuna, el agua es compatible con las muestras biológicas vivas. La velocidad de las ondas sonoras en el agua es de unos 1500 metros por segundo y la absorción es menor que en la mayoría de los demás líquidos, aunque aumenta con las frecuencias elevadas. El argón es otro líquido interesante para la microscopía acústica. Sus propiedades acústicas son semejantes a las del agua, excepto en cuanto a la velocidad del sonido, pues el argón tiene una velocidad que es sólo el 60 por ciento de la del agua. El argón tiene otro inconveniente: sólo existe en estado líquido en un estrecho margen de temperaturas en torno a los 85 grados kelvin (menos 188 grados Celsius). Por tanto, es un líquido criogénico y hay que diseñar un equipo especial para los instrumentos que 11
D R O F N A T S E D D A D I S R E V I N U , E T A U Q . F N I V L A C
10. ELEMENTOS DE CIRCUITOS MICROELECTRONICOS construidos sobre la superficie de una pastilla de silicio. Se han reproducido tres veces: una en forma de una micrografía óptica (izquierda ) y dos en forma de micrografías acústicas obtenidas con el objeto en diferen tes posiciones locales (centro y derecha). El dispositivo consta de varios transistores interconectados. Las extensiones semejantes a dedos que conectan los transistores son tiras de películas de aluminio operan con tales líquidos. Así se ha hecho para el microscopio acústico y Daniel Rugar, otro investigador de nuestro grupo, ha obtenido imágenes de elevada calidad con tal sistema. El argón líquido es también importante por constituir un escalón intermedio en el paso de agua a helio líquido. La absorción del sonido en la fase líquida del isótopo helio 4 es tan pequeña que puede considerarse despreciable. La velocidad del sonido en tal medio es la octava parte de la del agua. En nuestro grupo, Joseph E. Heiserman está diseñando un microscopio acústico que emplee helio líquido como medio transmisor del sonido. Tiene la esperanza de conseguir un poder de resolución superior al del microscopio óptico.
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oda esta información de base constituye el prólogo de las imágenes conseguidas. En el pasado, a los visitantes a nuestro laboratorio les eran mostradas, en primer lugar, las imágenes y entonces se les preguntaba si deseaban ver el instrumento. Esta manera de proceder nos ahorraba mucho tiempo. En aquella época las micrografías acústicas poseían una calidad inferior a la de las micrografías ópticas y eran examinadas como una mera curiosidad. Los visitantes rara vez pedían darse una vuelta por el laboratorio y ver el instrumento en funcionamiento. Esto ya no ocurre. La mejora en calidad de las imágenes ha producido un intenso interés por el instrumento y nos vemos obli12
depositadas a partir del vapor. La banda lisa que cruza la parte superior de la imagen es el sustrato de silicio puro; las texturas arenosas están ocasionadas por capas superpuestas de silicio policristalino. La inversión de contraste en las imágenes acústicas ayuda a identificar la estructura detallada sobre la pastilla. El dispositivo fue proporcionado por el doctor Roderick D. Davies, de la Universidad de Stanford.
gados a emplear cierto tiempo en ticidad, divergencia que constituye la explicar los detalles sobre su modo causa del contraste en la imagen acúsde operar. tica ( véase la figura 9 ). Las propiePero la esencia de cualquier pro- dades de estas aleaciones dependen grama de microscopía estriba en con- grandemente del tamaño y la distriseguir las imágenes. Creemos que las bución de sus fases. acústicas que acompañan el presente La circuitería microelectrónica artículo pueden competir con sus opo- constituye otra buena fuente de obnentes ópticas. Las imágenes son de jetos par a la micrografía acústica. tres clases: de materiales, de circui- Los detalles estructurales de tales tos de microelectrónica y de células dispositivos a menudo aparecen con vivas. El elemento común es el tama- mejor contraste que en las microño: todos los objetos tienen detalles grafías ópticas, que se ven más unicuyas dimensiones se miden en micro- formes ( véase la figura 10 ). Además, metros. con el instrumento acústico se pueden A simple vista, metales como el obtener varias imágenes diferentes acero parecen ser uniformes, pero en del mismo objeto, cada una corresrealidad tienen estructuras muy com- pondiente a un espaciado distinto plejas, que consisten en granos crista- entre el objeto y la lente. Cada una linos individuales cementados conjun- de dichas imágenes proporciona un tamente a lo largo de sus bordes. La nuevo nivel de detalle. En nuestra micrografía acústica de una superficie investigación dicha información “en de acero parece completamente dis- profundidad” ha motivado un intetinta de su oponente óptica ( véase la rés más destacado que cualquier otra figu ra 8 ). El mayor contraste en la característica. imagen acústica da una mejor idea En el mundo biológico existen mude la orientación relativa de los cris- chas estructuras celulares en la estales en la superficie. En nuestro caso, cala de los micrometros. De una mala superficie ha sido pulida y atacada nera rutinaria se visualizan con el de manera que los límites de grano microscopio óptico, pero no sin diparecen limpios en la micrografía ficultad. A menudo se presenta una óptica, pero este paso no es necesa- falta de contraste visible. El problerio con el sistema acústico. ma reside en que las estructuras de Las aleaciones presentan otra clase las células son casi completamente de falta de homogeneidad. En una transparentes: sólo absorben una aleación de cobalto y titanio, por ejem- minúscula parte de luz. Se han reaplo, la mezcla puede condensarse en lizado extraordinarios esfuerzos pavarias fases, cada una con una pro- ra compensar tal deficiencia y aumenporción entre cobalto y titanio dis- tar el contraste. El método usual es tinta. Las fases difieren en su elas- el del teñido selectivo de las células. TEMAS 29
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11. CELULA AISLADA. Se trata de un fibroblasto obtenido del tejido conjuntivo de un embrión de pollo. Se ha representado mediante su imagen óptica (izquierda) y la correspondiente imagen acústica (de- recha). La célula se hizo crecer sobre un portaobjetos de vidrio con colágeno y fue fijada con metanol por Randal N. Johnston en Stanford. Ambas micrografías revelan la red de fibras internas que afec-
tan a toda la célula. El contraste en la imagen óptica se obtuvo con una técnica de tinción selectiva. El contraste en la imagen acústica procede de variaciones en las propiedades elásticas de las es tructuras en la célula. El que la técnica acústica no requiera tinción sugiere que podemos llegar a visualizar tales estructuras en células vivas.
Constituye un arte altamente de- acústico puede reducirse dicho coste. sarrollado y añade color a las imá- Tales imágenes se pueden registrar genes, pero requiere tiempo y no pue- directamente en una cinta magnéde ser aplicado a las células vivas. Las tica. El tiempo de reproducción en un técnicas ópticas asociadas con la mi- registrador magnetofónico (a una croscopía de contraste de fase y la cadencia de treinta imágenes por microscopía de luz polarizada per- segundo) para 10.000 glóbulos sería miten introducir cambios sutiles pa- de una hora y el coste, el de la cinta. ra aumentar el contraste, pero todaHasta ahora hemos realizado mivía queda campo para introducir crografías de tres clases principales nuevas mejoras. de entidades biológicas: linfocitos Al empr ender esta parte de la in- (glóbulos blancos de la sangre), fibrovestigación, nuestra ignorancia en- blastos (células de soporte de los tetonces en las cuestiones biológicas jidos) y cromosomas. El hecho de quedará ilustrada con una anécdota. haber obtenido imágenes tan buenas Cuando por primera vez pregunta- de distintas estructuras celulares sin mos la manera de obtener glóbulos necesidad de emplear tinciones indica blancos de la sangre, en un laborato- que podremos observar algunas de rio biológico de Stanford se nos pidió tales estructuras en el interior de las que dijéramos cuántos glóbulos deseá- células vivas. bamos. Ya que queríamos obtener unas pocas imágenes, contestamos as imágenes que hemos elegido que necesitábamos diez glóbulos. Esta para ilustrar el presente artícurespuesta sólo podía proceder de un lo son ideales en muchos aspectos profano en biología. Se nos explicó para la microscopía acústica y deque el número mínimo de glóbulos que muestran lo que todavía puede conpodía aislarse era el de un millón, y seguirse. Son muy diferentes de las todos cabían en un simple portaobje- imágenes que era obvio elegir cuando tos. En muchos casos sería deseable emprendimos este tipo de estudio. estudiar el conjunto de estos glóbu- Cuando echamos una mirada hacia los, pero no es fácil. El coste de la atrás comprobamos que los ejemplos película fotográfica necesaria para primitivos, tales como la unión entre registrar las imágenes de todos estos materiales opacos, fueron simples glóbulos sería exagerado. En los labo- extensiones del trabajo que se venía ratorios de biología es corriente re- haciendo acerca de la formación acúsgistrar unas veinte imágenes de cada tica de imágenes a frecuencias ulglóbulo. Incluso si se limitase el es- trasónicas más bajas. Los ejemplos tudio a sólo el uno por ciento de los que mostramos no estaban incluidos glóbulos, el coste resultaría prohibi- en nuestra lista original. Han evotivo. Con ayuda de circuitos especia- lucionado de una manera tan natules conectados a nuestro instrumento ral como inesperada.
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A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
En una ocasión estábamos seguros de que la reflexión de las ondas sonoras en una superficie de zafiro puro sólo debía venir determinada por el contorno del haz acústico. Se presentaría un máximo al colocar el reflector en el punto local que iría disminuyendo de acuerdo con el perfil del haz a medida que el reflector fuera separado del plano correspondiente. Nada nos hacía suponer que las propiedades elásticas de la superficie reflectora quedaban codificadas en las ondas divergentes. En otra ocasión, trabajamos intensamente para perfeccionar un microscopio acústico del tipo de transmisión. Nunca sospechamos que las imágenes obtenidas por reflexión, particularmente de muestras biológicas blandas, pudieran ser tan vigorosas.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA ACOUSTIC MICROSCOPY: BIOMEDICAL APPLICATIONS. Ross A. Lemons y Calvin F. Quate en Science, vol. 188, n.o 4191, págs. 905-911; 30 de mayo de 1975. ACOUSTIC IMAGING: CAMERAS, MICROSCOPES, PHASED ARRAYS, AND HOLOGRAPHIC SYSTEMS. Dirigido por Glen Wade. Plenum Press, 1976. ACOUSTIC MICROSCOPY AT OPTICAL WAVELENGTHS. V. Jipson y C. F. Quate en Applied Physics Letters, vol. 32, n.o 12, págs. 789-791; 15 de junio de 1978. A N A NGULAR -S PECTRUM A PPROACH TO CONTRAST IN REFLECTION ACOUSTIC MICROSCOPY. Abdullah Atalar en Journal of Applied Physics , vol. 49, n.o 10, págs. 5130-5139; octubre 1978.
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Microscopios con sonda de barrido Estos instrumentos permiten estudiar las características de los cuerpos con un detalle inasequible a los microscopio ordinarios, examinándolos a muy corta distancia con una sonda cuyo espesor puede ser de un solo átomo H. Kumar Wickramasinghe
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os objetos cuyas dimensiones Los nuevos microscopios —represon menores que la longitud de sentados por el microscopio de efecto onda de la luz visible se han túnel, por el cual Gerd Binnig y convertido en un campo fundamen- Heinrich Rohrer, del laboratorio de tal de la ciencia y tecnología con- investigación de la empresa IBM en temporáneas. Los biólogos estudian Zurich, recibieron el premio Nobel las moléculas de las proteínas o el en el año 1986— superaron con facili ADN; los especialistas en ciencia de dad la barrera de Abbe. El principio materiales examinan los defectos ató- rector de su funcionamiento ya había micos de los cristales; los ingenieros sido descrito en 1956. J. A. O’Keefe, microelectrónicos construyen cir- que por entonces trabajaba en el cuitos cuyo espesor es de escasas de- Servicio Cartográfico del Ejército de cenas de átomos. No hace muchos los Estados Unidos, diseñó un microsaños, todo ese mundo diminuto sólo copio en el que la luz atravesaría un podía observarse mediante métodos pequeño orificio para incidir a contimuy complejos y con frecuencia des- nuación sobre una pantalla opaca, tructivos, tales como la microscopía iluminando un objeto situado justo electrónica y la difracción de rayos X, enfrente de dicha pantalla. La luz que alejaban ese estudio fuera del transmitida a través de la muestra o alcance de instrumentos tan sencillos reflejada a través del orificio queday directos como los microscopios óp- ría registrada durante un barrido de ticos ordinarios. la muestra. O’Keefe señaló que la Una nueva familia de microscopios resolución de este “microscopio de abrió este dominio a la observación barrido de campo próximo” estaría directa. Estos dispositivos permiten limitada únicamente por el tamaño cartografiar los cuerpos a escala ató- del orificio y no por la longitud de mica y molecular, estudiar las pro- onda de la luz. En principio, este dispiedades magnéticas y mecánicas de positivo permitiría obtener imágela materia e incluso poner de mani- nes de alta resolución, es decir, imáfiesto las variaciones de temperatura genes con detalles de tamaño mucho con una resolución mucho mayor de menor que la mitad de una longitud la que ha sido posible hasta la actua- de onda. lidad, sin necesidad de alterar las O’Keefe era consciente de que no muestras o exponerlas a radiaciones existía la técnica necesaria para fiperjudiciales de alta energía. Este jar la posición de un objeto o moverlo avance parecía imposible. Al fin y al con la precisión requerida. Sin emcabo, hace más de 100 años, el físico bargo, en el año 1972, Eric A sh, del y óptico alemán Ernst Abbe descri- University College de Londres, adoptó bió una limitación fundamental de la estrategia de O’Keefe para supecualquier microscopio que se base en rar la barrera de Abbe recurriendo a la capacidad de las lentes para loca- una radiación de longitud de onda lizar la luz o cualquier otra radia- larga. Hizo pasar una radiación de ción: la difracción difumina los deta- microondas con una longitud de onda lles de los objetos cuyas dimensiones de tres centímetros a través de un orisean menores que media longitud de ficio de tamaño similar al de una onda de la radiación utilizada. cabeza de alfiler y la dirigió sobre un 14
objeto situado ante él, registrando una imagen con una resolución de 150 micras, es decir, una longitud 200 veces menor que la longitud de onda de la radiación utilizada. Por aquel entonces se disponía ya de medios para controlar la posición y el movimiento de una muestra con la precisión necesaria para superar la resolución de un microscopio óptico ordinario. En el mismo año en que tuvo lugar la demostración de Ash, Rusell Young, de la Oficina Nacional de Pesos y Medidas, consiguió manipular objetos de tres dimensiones con una precisión del orden del nanómetro (la milmillonésima parte de un metro). Para ello se sirvió de cerámicas piezoeléctricas, que cambian de tamaño en una escala ínfima cuando varía el valor del potencial eléctrico a que está sometido el material. El control mediante materiales piezoeléctricos abrió el camino para el desarrollo, en 1981, del exponente máximo de un microscopio de barrido de campo próximo, el denominado STM , o microscopio de efecto túnel [ véase “El microscopio de efecto túnel”, por Gerd Binnig y Heinrich Rohrer, en este mismo número].
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n el microscopio de efecto túnel, la “apertura” es una sonda de tungsteno pequeña. El extremo de la misma, finísimo, puede constar de un solo átomo y medir 0,2 nanómetros de anchura. Los controles piezoeléctricos aproximan la punta hasta una distancia de uno o dos nanómetros de la superficie de una muestra conductora, cercanía en que las nubes electrónicas del átomo del extremo de la sonda y del átomo más próximo de la muestra se solapan. Cuando se aplica un pequeño voltaje a la sonda, TEMAS 29
los electrones atraviesan ese intervalo (efecto túnel) y dan lugar a la aparición de una minúscula corriente. La intensidad de la corriente en cuestión es extraordinariamente sensible al valor de la distancia de separación; de manera característica, la intensidad disminuye en un factor 10 cuando la distancia en cuestión aumenta en 0,1 nanómetros, es decir, la mitad del diámetro de un átomo. Los controles piezoeléctricos X e Y (que gobiernan el movimiento en las dos dimensiones de un plano) mueven la sonda a lo largo y ancho de la superficie de la muestra en un barrido exhaustivo, de forma tal que las sucesivas trayectorias paralelas del barrido están separadas quizá sólo una fracción de nanómetro. Si la sonda se mantuviera a una altura constante, la corriente originada por el efecto túnel variaría de modo espectacular, aumentando cuando la sonda pasara sobre elevaciones del tenor
de los átomos de la superficie de la muestra y disminuyendo hasta anularse cuando cruzara los intervalos existentes entre los átomos. Lo que sucede en realidad es que la sonda se mueve hacia arriba y hacia abajo siguiendo la topografía de la muestra. Un mecanismo de retroalimentación detecta las variaciones que se producen en la corriente originada por efecto túnel y varía el voltaje aplicado a un tercer control Z. El control piezoeléctrico Z mueve la sonda en un sentido vertical en la cuantía necesaria para estabilizar la corriente, lo cual equivale a mantener constante la distancia entre el extremo del microscopio y la superficie de la muestra.
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as variaciones en el voltaje aplicado al control piezoeléctrico Z se traducen electrónicamente en una imagen del relieve de la superficie. Si la agudeza de la sonda, la preci-
sión de los controles y la finura del sistema de barrido son suficientes, las imágenes del STM pueden llegar a resolver átomos individuales, cuyo diámetro es del orden de 0,2 nanómetros. Una resolución, pues, extraordinaria: la longitud de onda mecanicocuántica de los electrones que experimentan el efecto túnel en la sonda —es decir, la “radiación” que da lugar a la imagen— es de aproximadamente un nanómetro. El mapa que levantan estas imágenes no es de naturaleza topográfica en el sentido literal de la palabra; antes bien, representan una superficie de efecto túnel equiprobable. La probabilidad de que se produzca el efecto túnel no queda unívocamente determinada por la topografía de la superficie de la muestra, ya que se ve afectada también por las variaciones en la abundancia y energía de los electrones superficiales. Cuando la muestra que se observa sólo contiene un ele-
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1. SONDA DE SILICIO de un microscopio de fuerza de láser, afilada hasta alcanzar un espesor de pocos átomos; se cierne sobre una superficie. El microscopio, desarrollado en el laboratorio del autor, proporciona imágenes del relieve de una superficie barriéndola con una sonda vibrante muy pequeña, situada a esA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
casos nanómetros (milmillonésimas de metro) por encima de la muestra, desde donde “percibe” débiles fuerzas atractivas provenientes de la superficie. Esta microfotografía de 1300 aumentos muestra una sonda que desarrolló Olaf Wolter en la central alemana IBM en Sindelfingen. 15
mento, la probabilidad de que se produzca el efecto túnel se ajusta estrechamente a su topografía, “topografía” que pone de manifiesto también las variaciones en la composición atómica. Por ejemplo, la presencia de un átomo contaminante en una superficie, en lo demás uniforme, puede dar lugar a una anomalía en forma de protuberancia o de pozo, en función de sus propiedades electrónicas. El éxito del STM renovó la confianza de los investigadores ante la posibilidad de utilizar una sonda para observar una muestra con una precisión del orden del tamaño atómico sirviéndose de controles piezoeléc-
tricos. Desde aquella fecha, este microscopio ha permitido obtener imágenes de la superficie de múltiples sustancias y se han aprovechado incluso sus propiedades para utilizarlo a escala nanométrica: la punta de la sonda de este instrumento nos faculta para aplicar con gran precisión un voltaje capaz de disecar moléculas o de estudiar sus propiedades electrónicas. Más aún, el STM posibilitó el nacimiento de toda una familia de microscopios con sonda de barrido basados en una tecnología similar a la descrita. El primer vástago de esta serie tenía por objetivo superar una de las principales limita-
PANTALLA CONTROL PIEZOELECTRICO
VOLTAJE
ciones de su progenitor: la obtención de imágenes con el STM está restringida fundamentalmente a los conductores eléctricos. Con frecuencia, hasta los materiales conductores o semiconductores, como el silicio, están recubiertos por una capa de óxido aislante. Aunque los materiales biológicos no suelen ser conductores, con el STM se han podido cartografiar ciertas muestras biológicas colocadas en una superficie conductora y sumergidas en un electrolito. En el año 1985, Binnig, junto con Calvin F. Quate, de la Universidad de Stanford, y Christoph Gerber, de la IBM de Zurich, diseñaron el microscopio de fuerza atómica ( AFM ), un dispositivo con sonda de barrido que no requería que la muestra fuera conductora. Al igual que el ST M , este microscopio se basa en el movimiento de una aguja pequeñísima —en este caso, una punta de diamante de dimensiones atómicas montada en una lámina metálica— sobre la muestra sometida al barrido. En lugar de la corriente producida por efecto túnel, el AFM registra los perfiles de la fuerza repulsiva originada por el solapamiento de la nube de electrones de la punta con las nubes de electrones de los átomos superficiales de la muestra. De manera similar a la aguja de un tocadiscos, la punta de la sonda “lee” la superficie de la muestra. La lámina metálica actúa a modo de resorte que mantiene la punta de la sonda en contacto con la superficie durante su recorrido por la topografía atómica, siguiendo una serie de surcos paralelos sucesivos.
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n el diseño original del AFM , la medición de la deflexión de la lámina se llevaba a cabo con la producción de una corriente de túnel entre dicha lámina y la punta de un STM montada sobre ella. Un mecanismo de retroaCORRIENTE limentación respondía a las variaSEÑAL DE REFERENCIA DE TUNEL ciones de la corriente de túnel, ajustando el voltaje aplicado a un control piezoeléctrico Z que movía la muestra verticalmente. La deflexión y, por tanto, la fuerza repulsiva, se mantenía constante; las variaciones en el voltaje aplicado al control piezoeléctrico Z reproducían los rasgos topo2. MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL (STM): percibe la topografía de una superficie a es- gráficos de la muestra y servían de cala atómica por medio de electrones que atraviesan, por efecto túnel, el intervalo entre base para la formación de la corresla sonda y la superficie. Una cerámica piezoeléctrica, cuyo tamaño cambia ligeramente pondiente imagen. De este modo, en respuesta a los cambios en el voltaje aplicado, gobierna la sonda de tungsteno en tres dicha imagen podía resolver átomos dimensiones. Se aplica un voltaje a la punta de la sonda, que se acerca hacia la superfi- individuales. Al igual que en el STM , cie (conductora o semiconductora) hasta que se inicia una corriente de túnel. La punta va el poder de resolución del AFM era peinando la superficie en una serie de surcos sucesivos. La corriente de túnel tiende a muy grande; dicha resolución venía variar con la topografía; un mecanismo de retroalimentación responde moviendo la pun- limitada únicamente por la acuidad ta arriba y abajo, siguiendo el relieve de la superfic ie. Los movimientos de la punta se tra- de la punta de la sonda de diamante y no por ninguna longitud de onda. ducen en una imagen. GENE RAD DE RE OR TROALIME NTAC ION
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3. ALINEACION DE LOS ATOMOS, a modo de cuentas de un rosario, en esta imagen de una muestra de arseniuro de galio, un semiconductor, obtenida con un STM. Esta imagen es compuesta: dado que los átomos de galio (azul ) y de arsénico (rojo ) tienen diferentes propiedades eléctricas, sus imágenes se han obtenido por separado, bajo condiciones diferentes. En el caso de los átomos de galio, la
corriente túnel fluía desde la punta —cargada negativamente— hacia la muestra; para los átomos de arsénico, la punta del STM estaba cargada positivamente y el sentido de la corriente se invertía. Proporcionó esta imagen Randall M. Feenstra, quien la creó en el laboratorio de investigación Thomas J. Watson de la compañía IBM, en Yorktown Heights.
Aunque el primer AFM era capaz efecto sumergiendo punta y muestra en principio de proporcionar imáge- en una gota de agua. nes de cualquier substancia, conducSe reemplazó también el mecanismo tora o no, la presión de la punta de del STM por un nuevo sistema de detecdiamante (del orden de una milloné- ción de la deflexión de la sonda, desima de gramo) era suficiente para sarrollado en el centro de investigadistorsionar o mover muchas de las ción de IBM Thomas J. Watson, en moléculas biológicas. Paul K. Hansma Yorktown Heights, Nueva York; cony sus colaboradores, de la Universidad siste en un haz de láser que la lámina de California, redujeron dicha presión refleja. El movimiento de la lámina en un factor de 10. Un factor que con- altera la trayectoria del haz reflejado, tribuye a aumentar la presión de la de tal forma que una célula fotoelécpunta es la delgada película de agua trica colocada en la trayectoria del y contaminantes que inevitablemente haz, a cierta distancia, es capaz de dese depositan sobre la punta y sobre tectar los pequeños movimientos que la superficie de la muestra. Cuando la experimenta la lámina. La señal propunta se acerca mucho a la superfi- ducida por la célula fotoeléctrica activa cie y las capas de contaminantes el control piezoeléctrico Z para que la entran en contacto, aparecen unas separación se mantenga constante. fuerzas de adhesión que tienden a El sensor óptico proporciona una unir la punta con la muestra, con lo medida más precisa de la deflexión de que se refuerza la presión de barrido. la punta que el sensor basado en el El grupo de Hansma eliminó este efecto túnel y ello hace que el contacA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
to del AFM sea más consistente y suave. Como resultado de todas estas mejoras, Hansma y sus colaboradores llegaron a obtener imágenes de sustancias biológicas con un detalle casi atómico. Tomaron incluso instantáneas de un proceso molecular a medida que va transcurriendo; en concreto: la polimerización de la proteína de fibrina, uno de los componentes principales de los coágulos de la sangre.
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l mismo tiempo que el AFM se iba desarrollando, mi grupo del departamento de investigación de IBM en Yorktown Heights investigaba nuevas formas de controlar la calidad en la fabricación de materiales microelectrónicos. En su esfuerzo por construir ordenadores más rápidos y potentes, los ingenieros disminuyen constantemente el tamaño de los elementos de los circuitos y de los dis17
positivos de almacenamiento de datos. La búsqueda de imperfecciones en los circuitos hace necesario trabajar con resoluciones al menos 10 veces menores que el tamaño del menor de los elementos; las dimensiones de los propios elementos de los circuitos se estaban acercando ya por entonces al límite de resolución teórica de los microscopios ópticos ordinarios, que es del orden de 250 nanómetros. Durante algún tiempo, el microscopio electrónico de barrido ( SEM ) se convirtió en la herramienta microelectrónica habitual: este instrumento permite resolver hasta un detalle de algunos nanómetros. Sin embargo, el SEM requiere que la muestra esté revestida por una capa metálica y que se observe al vacío; su resolución tridimensional es baja. Por otra parte, sus electrones de alta energía pueden dañar o destruir un dispositivo de semiconductor, lo que limita el
valor del SEM en el control de calidad de estos dispositivos. Los microscopios con sonda de barrido —sencillos, directos y potentes— parecían responder a nuestras necesidades. Sin embargo, la utilización del STM exige que la muestra sea conductora, cuando en los dispositivos microelectrónicos se utilizan materiales semiconductores y aislantes además de conductores. El AFM puede proporcionar imágenes de un conjunto más amplio de materiales; ahora bien, el propio AFM avanzado, más suave, contacta con los materiales con fuerza suficiente para contaminar o dañar los elementos delicados de los circuitos. Por eso, mis colegas y yo desarrollamos una nueva familia de microscopios con sonda de barrido, capaces de registrar los perfiles de los dispositivos electrónicos, cualquiera que sea su composición, sin necesidad de rozar su superficie.
El más logrado de ellos fue el microscopio de fuerza de láser ( LFM ), inventado en colaboración con Yves Martin y Clayton C. Williams. La “fuerza” del LFM es la pequeña interacción atractiva que aparece entre una superficie y una sonda situada a una distancia de 2 a 20 nanómetros, un intervalo mucho mayor que en el STM y el AFM . En los materiales semiconductores y aislantes, la fuerza es consecuencia principalmente de la tensión superficial del agua que condensa entre la punta de la sonda y la superficie de la muestra, pero intervienen también las fuerzas de van der Waals (débiles y transitorias interacciones electrostáticas entre los átomos o las moléculas).
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a fuerza atractiva es ínfima, mil veces menor que las repulsiones interatómicas registradas con el AFM . El LFM detecta la existencia de esta fuerza a través de su efecto sobre la dinámica de una sonda vibrante, un afilado alambre de tungsteno de LASER medio milímetro de longitud con una punta vuelta hacia abajo, cuyo diámetro queda reducido a 50 nanóLENTE metros o menos. (Luego se utilizaFOTODIODO ron sondas de silicio cuyo extremo es finísimo, de tamaño atómico.) Un transductor piezoeléctrico situado en la base del alambre transforma la corriente variable en una vibración, La frecuencia base del transductor se halla por encima mismo de la frecuencia de resonancia mecánica más baja del alambre (cifrada en unos 50 kilohertz). Dado que el alambre en cuestión está vibrando con una frecuencia muy próxima a la de resonancia, amplifica la señal de base de forma anáCONTROL PANTALLA loga a la lengüeta de un instrumento PIEZOELECTRICO musical. La punta de la sonda puede oscilar medio nanómetro, aun cuando el transductor del otro extremo sólo se esté desplazando una centésima de nanómetro a lo más. Sin embargo, cuando la punta vibrante se aproGENE RAD xima a la muestra, las débiles fuerDE RE OR TROALIME zas atractivas que percibe “ablandan” NTAC ION el alambre y decae su frecuencia de resonancia, que se aleja entonces de la frecuencia base, con lo cual disSEÑAL DE REFERENCIA minuye la amplitud de la vibración. 4. MICROSCOPIO DE FUERZA ATOMICA (AFM): barre una muestra con un diamante montado Un sensor de láser detecta el camen un delgado brazo metálico. La nube de electrones de la punta del diamante (que puede bio de amplitud. Esta detección se acabar en un solo átomo) interacciona con las nubes de electrones de los distintos átomos lleva a cabo por interferometría, técde la muestra, produciendo una fuerza repulsiva que varía con el relieve de la superficie. Es- nica de uso en la medición precisa de ta fuerza actúa sobre la sonda y los movimientos que produce se recogen mediante un haz distancias con frecuente aplicación, de láser que se refleja en el brazo que la sostiene y que detecta finalmente en un sensor de por citar dos casos, en astronomía y fotodiodo. Un mecanismo de retroalimentación responde a los cambios en la trayectoria del geofísica. Un haz de láser se desdohaz activando un control piezoeléctrico que ajusta la altura de la muestra de tal forma que la bla en un haz de referencia, reflejado deflexión del brazo permanezca constante. Los movimientos de la muestra dibujan el perfil por un espejo o un prisma estaciode la superficie. El AFM proporciona sin problemas imágenes de materiales aislantes. nario, y un haz de exploración, refle-
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jado en la parte posterior de la punta de la sonda. Los dos haces reflejados se recombinan e interfieren entre sí para dar lugar a un haz cuya fase es extremadamente sensible a la longitud recorrida por el haz de exploración. La fase se desplaza en un sentido u otro con cada oscilación de la punta; la cuantía de este desplazamiento pone de manifiesto la amplitud de la vibración. El interferómetro puede así detectar cambios de amplitud mínimos, de sólo 10 –5 nanómetros. La amplitud tiende a disminuir cuando la sonda pasa sobre las protuberancias topográficas de la muestra, donde las fuerzas atractivas son más fuertes, y a aumentar cuando dicha sonda está situada sobre las depresiones. Tal y como sucede en los otros microscopios con sonda de barrido, un mecanismo de retroalimentación responde a los cambios que se producen en el comportamiento de la punta de la sonda variando el voltaje aplicado a un control piezoeléctrico Z con el fin de estabilizar la amplitud de la vibración y, en consecuencia, la separación existente entre la sonda y la superficie de la muestra. Con las fluctuaciones en el voltaje piezoeléctrico se dibuja el perfil de la superficie. Procediendo de este modo, el LFM puede detectar el relieve de la superficie con una precisión del orden de 5 nanómetros (equivalente al espesor de unos 25 átomos), y, dada su capacidad de percibir la topografía de la superficie desde cierta distancia, puede inspeccionar la situación en el interior de grietas profundas y estrechas. Este instrumento es válido, en principio, no sólo para el examen de microcircuitos terminados, sino también para el control de calidad de las superficies de silicio sobre las que se construyen. Habida cuenta del ancho y espesor de las estructuras de los c ircuitos, un sustrato que deje de ser perfectamente liso en una cuantía algo mayor que unos cuantos espesores atómicos puede resultar inaceptable. Por idéntica razón, la densidad cada vez más elevada con que se almacena la información en los discos magnéticos significa que los datos deben escribirse y leerse en una escala más fina, con cabezales menores que se acerquen mucho más a los discos. Para evitar la colisión, tanto los discos como los cabezales tienen que ser tan lisos que deben construirse con una precisión casi atómica. Una variante del LFM , el microscopio de fuerza magnética ( MFM ), nos permite verificar las prestaciones de A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
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5. CADENAS DE POLIMEROS del aminoácido alanina; forman una estructura rugosa en la placa de un microscopio sobre la que se depositó y evaporó una disolución de dicho polímero. En esta imagen de AFM, obtenida por Paul K. Hansma y su equipo de la Universidad de California, cada protuberancia corresponde a un aminoácido. La imagen muestra una superficie de tres nanómetros de ancho. esos cabezales, que se pueden resu- microcircuitos a muy pequeña escala. mir en la definición, uniformidad e Y, así, para modificar las propiedaintensidad del campo magnético que des del silicio, se le suelen añadir producen. En lugar de la aguja de pequeñas cantidades de átomos de tungsteno o silicio, el MFM está pro- impurezas, conocidas con el nombre visto de una sonda imantada de níquel genérico de contaminantes. Estos cono hierro. Cuando la sonda vibrante taminantes proporcionan electrones, se aproxima a una muestra magné- que se mueven con libertad en el seno tica, la punta se ve sometida a una del silicio, o capturan electrones, que fuerza que cambia su frecuencia de dejan “huecos” cargados positivaresonancia y, con ello, su amplitud mente, capaces también de moverse de vibración. El MFM puede perfilar por la red cristalina. la estructura del campo magnético La distribución y concentración originado por los cabezales de regis- de los átomos contaminantes desemtro de datos con una resolución supe- peñan un papel crítico para el buen rior a los 25 nanómetros. Este dis- funcionamiento de una pastilla positivo permite también estudiar la (“chip”). Una forma de esquematizar estructura de las unidades magnéti- la situación de estos átomos contacas (“bits”) de almacenamiento de minantes consiste en aplicar un voltadatos en los discos y en otros medios, je entre la sonda de un microsc opio proporcionando información tanto de fuerza electrostática y la superfisobre el funcionamiento de los cabe- cie de la muestra. El voltaje origina zales como sobre la calidad del medio una migración de los electrones o agude almacenamiento. jeros de conduc ción por debajo de la sonda, apareciendo así una región ves Martin, David Abraham y yo cargada que ejerce una fuerza elecmismo desarrollamos otra ver- trostática sobre dicha sonda. Los mosión especializada del LFM , el micros- vimientos consiguientes de la sonda copio de fuerza electrostática. En este proporcionan una medición muy precaso, la sonda vibrante posee una cisa a pequeña escala de la carga eléccarga eléctrica y la amplitud de vibra- trica y, en consecuencia, de los elección resulta afectada por las fuerzas trones o agujeros involucrados y de electrostáticas que originan las car- las correspondientes concentraciogas de la muestra. Con la ayuda de nes de átomos contaminantes. este microscopio se pueden describir Los microscopios de fuerza maglas propiedades eléctricas de los nética y electrostática son dos de los
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LASER
DIVISOR DEL HAZ
CELULA DE BRAGG
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l microscopio térmico de barrido fue desarrollado en las primeras etapas de nuestra búsqueda de la mejor forma de levantar perfiles de los dispositivos microelectrónicos, antes de la introducción de los AFM GENER ADOR y LFM . En nuestros primeros expeDE RET ROALIMEN rimentos, llevados a cabo en 1985, TACION encontramos que este dispositivo podía servir realmente como una sonda superficial rápida. En primer lugar, se hacía pasar una corriente a través de la punta que calentara la TRANSDUCTOR sonda; cuando la energía desprenPIEZOELECTRICO dida al aire en forma de calor es igual a la energía suministrada en forma de corriente, la temperatura de la MICROPASTILLA punta se estabiliza, alcanzando por regla general un valor de algunos grados por encima de la temperatura del entorno. Cuando la punta calentada se aproxima a una muestra, que por ser un sólido conduce el calor mucho mejor que el aire, la tasa de pérdida de ca lor aumenta. La disminución que experimenta el voltaje en la unión del terCONTROL mopar a consecuencia del enfriaPIEZOELECTRICO miento proporciona una medida de la distancia que separa la punta de la muestra. (Para reducir la sensibili6. EL MICROSCOPIO DE FUERZA DE LASER ofrece una imagen topográfica de una muestra dad del sistema a las fluctuaciones (típicamente un componente microelectrónico) pasando una sonda de tungsteno o silicio a erráticas de la temperatura, lo que una altura de pocos nanómetros sobre la muestra en cuestión. La punta vibra con una fre- hacemos en realidad es conferir una cuencia cercana a su frecuencia de resonancia. Las fuerzas atractivas de van der Waals y vibración a la punta de la sonda de la tensión superficial del agua que condensa entre la sonda y la muestra actúan sobre la son- amplitud menor que el nanómetro, da, modificando su frecuencia de resonancia y reduciendo con ello su amplitud de vibración. con una frecuencia del orden de un La variación de dichas fuerzas y, por tanto, del recorrido de la punta de la sonda responde al kilohertz. El voltaje disminuye cada relieve de la superficie. Una sonda de láser controla la posición de la punta por medio de un vez que la punta se acerca a la mueshaz que se desdobla en dos. Uno de estos haces se refleja en un prisma estacionario; el otro tra y aumenta cuando se separa de atraviesa una célula de Bragg —dispositivo que modifica la frecuencia del haz— y es refle- ella; la amplitud de la fluctuación del jado por la cara posterior de la sonda. Los dos haces se recombinan y su interferencia pro- voltaje aumenta cuando la distancia duce una señal (para la frecuencia de la célula de Bragg) que mide la vibración de la sonda. media que separa la punta vibrante DETEC TOR
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PRISMA
sistemas con sonda de barrido que se han diseñado para registrar otras propiedades superficiales de los materiales distintas de las meramente topográficas. Está también el microscopio térmico de barrido, que desarrollé en colaboración con Williams. La sonda de este microscopio era quizás el termómetro más fino del mundo, sensible a variaciones de temperatura superficial del orden de la diezmilésima de grado a una escala de decenas de nanómetros. La sonda consistía en un alambre de tungsteno rematado en una punta cuya sección mediría unos 30 nanómetros. Un revestimiento de otro metal, níquel, cubría la sonda. El níquel quedaba separado del tungsteno por una capa aislante en toda la extensión de la sonda, salvo en su extremo. La unión níquel-tungsteno se comporta como un termopar, generando un voltaje proporcional a su temperatura.
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TEMAS 29
de la muestra disminuye.) En consecuencia, la pérdida de calor revela los detalles de la topografía de la superficie de dicha muestra conforme la sonda la va barriendo, de forma análoga a como sucede en el caso de la corriente de efecto túnel, la repulsión interatómica o las atracciones de van der Waals en los otros modelos de microscopios con sondas de barrido.
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l proceso de fabricación no permitía obtener sondas termopares cuyas dimensiones bajasen más allá de los 30 nanómetros, lo cual limitaba el poder de resolución de los microscopios térmicos de barrido. La aparición del LFM , cuya resolución es mucho mayor, desvió la sonda térmica hacia otros usos más especializados. Con esa sonda se pueden obtener imágenes que muestren las variaciones de temperatura en las células vivas, proporcionando así datos sobre los mecanismos del metabolismo; puede medir el flujo de una pequeña corriente de líquido o gas mediante el control de las pérdidas de calor que se producen cuando la punta de la sonda se calienta y se coloca en el seno de dicha corriente. Posibilita también la utilización de una técnica analítica conocida por espectroscopía de absorción fototérmica, con un nivel de resolución sin precedentes. La espectroscopía de absorción fototérmica se basa en el hecho de que cada elemento absorbe luz con mayor eficiencia a una longitud de onda específica. El procedimiento consiste en enviar un haz de láser de longitud de onda variable sobre la muestra en estudio. Se toma la temperatura de la muestra conforme se va variando la longitud de onda del láser; una brusca elevación de temperatura
7. RUGOSIDADES NANOMETRICAS en un surco grabado en una superficie de silicio de una micra de anchura. Pierre Levy, que trabajaba entonces en el centro de investigación de la compañía IBM en Yorktown Heights, obtuvo esta imagen utilizando un microscopio de fuerza de láser, instrumento capaz de reproducir los perfiles topográficos de una superficie a pequeña y a gran escala. con una determinada longitud de onda pone de manifiesto la mayor eficiencia de la absorción. Una “huella dactilar” completa de las longitudes de onda de absorción puede revelar la composición de la muestra. La sonda
térmica abría el camino de la espectroscopía a pequeña escala, la posibilidad de cartografiar a pequeña escala las variaciones en la composición superficial. Mi grupo incrementó aún más la
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8. UNIDADES MAGNETICAS O “BITS” de una micra o dos de diáme tro: aparecen en forma de cráteres en estas imágenes obtenidas con un microscopio de fuerza magnética, un microscopio de fuerza de láser equipado con una sonda imantada de hierro o níquel, sensible a los gradientes de fuerza magnética. Los “bits”, que almacenan información en discos magnetoópticos, se forman exponiendo un disco a un campo magnético al mismo tiempo que un láser altamente A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
localizado calienta la superficie, permitiendo de este modo que los dominios magnéticos de la región calentada se reorienten. En estas imágenes, obtenidas por Yves Martin en el centro de investigación Thomas J. Watson de IBM en Yorktown Heights, se puede comparar la estructura magnética de un “bit” normal (izquierda ) con la de otro producido con un láser de baja potencia (centro ) y con un campo magnético muy débil. 21
se realiza una serie de barridos sucesivos sobre una superficie, al tiempo que un interferómetro de láser mide la deflexión del brazo de la lámina. Utilizando esta técnica, los investigadores consiguieron calibrar —por poner un caso— la resistencia que ofrecen las irregularidades atómicas de una superficie de grafito. Su intención era llegar a determinar de este modo la forma en que ese rozamiento afectaba a las propiedades macroscópicas de los materiales.
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CONTROL PIEZOELECTRICO
TUNGSTENO ELECTRONICA NIQUEL
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ntretanto, el grupo de Hansma había desarrollado un microscopio de barrido de conductancia iónica (SICM), que barre una muestra no con AISLANTE una punta de metal o diamante, sino con una micropipeta de vidrio que contiene un pequeño electrodo. Los investigadores sumergen la muestra y la pipeta en un baño electrolítico (verbigracia, una solución salina) y establecen una diferencia de potencial entre el electrodo de la pipeta y otro electrodo del baño. Una corriente de iones tiende a fluir entre los MICROPASTILLA electrodos a través de la abertura de la pipeta, pero cuando la pipeta se acerca a la superficie de la muestra, la corriente se hace más débil. La corriente se anula cuando la pipeta de barrido toca la muestra, dado que 9. SONDAS TERMICAS que registran variaciones de temperatura de hasta la diezmilésima este hecho produce la obturación de de grado en una escala de decenas de nanómetros. La sonda está constituida por un nú- su abertura. cleo de tungsteno recubierto de níquel, pero aislado del mismo en toda su extensión salvo Equipado con un mecanismo de en su punta de 30 nanómetros de espesor. Allí se unen estos dos metales para formar un retroalimentación que mantiene una termopar que genera un voltaje proporcional a su temperatura. Este dispositivo puede car- corriente iónica constante a través tografiar el relieve de una superficie detectando las variaciones en la pérdida de calor des- de la abertura de la pipeta, el SICM de la sonda caliente hacia la muestra que va peinando. perfila la topografía de una muestra. El tamaño de la abertura de la pipeta limita la resolución del SICM hasta resolución que permite esta técnica: secuencia de su proximidad a la super- unas 0,2 micras (podría incluso llehasta el nivel de los átomos indivi- ficie) genera un voltaje cuyo valor es garse a los 10 nanómetros). Este disduales. Para alcanzar este objetivo, proporcional a su temperatura. A su positivo resulta más indicado para prescindimos del termopar, volviendo vez, el valor de la temperatura indica algunas tareas específicas, como a la punta de tungsteno desnuda, cuánta energía se ha absorbido por puede ser el estudio del comportapuntiaguda a escala atómica, propia el átomo sobre el que se encuentra la miento eléctrico de una célula viva. del STM . Esta punta representa el pa- sonda. La absorción puede ser regis- Cuando se estimula una célula, los pel de uno de los dos metales de un trada átomo por átomo para cada lon- canales iónicos de su membrana se termopar; el otro lo es la propia mues- gitud de onda del láser, lo cual per- abren y se cierran, facilitando el paso tra (si se trata de un metal) o un elec- mite discriminar la composición de de pequeñas corrientes de iones por trodo de metal sobre el que se depo- la muestra con la más elevada reso- los mismos. sita dicha muestra. Al principio, el lución. Otro dispositivo de barrido con instrumento opera de forma análoga La mera enumeración de esos avan- micropipeta representa lo que podríaal microscopio de efecto túnel. Se esta- ces que se consiguieron en mi labo- mos considerar un retorno a los oríblece una diferencia de potencial entre ratorio basta para hacerse una idea genes de la microscopía de barrido de la punta de la sonda y el metal y se de la extraordinaria versatilidad de campo próximo. Hace ya más de cuava acercando la punta hacia la super- la técnica de las sondas de barrido. renta años, O’Keefe concibió la estraficie, hasta que empieza a circular En otros centros se desarrollaron más tegia con la que superar la barrera una corriente por efecto túnel. variantes de esta misma técnica. Gary de Abbe y mejorar el poder de reso A continuación, se interrumpe la McClelland y sus colaboradores del lución de los microscopios ópticos; corriente y se calienta la superficie centro de investigación Almadén de pero en aquel tiempo no existía la con la ayuda del láser de longitud de IBM en San José, California, han técnica necesaria para peinar una onda variable. El pequeño termopar modificado el AFM con el fin de poder muestra con la precisión de una fracformado por la superficie calentada medir la fricción a escala atómica. ción de la longitud de onda. Los cony la sonda (que se calienta como con- Con la punta de la sonda de un AFM troles con una precisión del orden del 22
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nanómetro, una innovación adelantada por el STM , abrieron el camino para construir el microscopio óptico de elevado poder de resolución con el que soñaba O’Keefe. Dos grupos de trabajo, uno dirigido por Dieter Pohl, de IBM de Zurich, y el otro por Michael Isaacson, de la Universidad de Cornell, diseñaron microscopios ópticos de barrido de campo próximo. Se ilumina una de las caras de una muestra muy delgada; la otra cara se barre con una micropipeta cuyas paredes están recubiertas por una lámina de aluminio opaca. Un fotodiodo situado en el extremo de la pipeta mide la luz recogida por la punta. Así obtuvieron microfotografías de luz transmitida con una resolución (limitada por el diámetro de la pipeta) del orden de 50 nanómetros, es decir, la décima parte de una longitud de onda. La utilización de pipetas todavía más delgadas puede proporcionar una resolución de 10 nanómetros, multiplicando por 25 la que proporcionan los mejores microscopios ópticos al uso. Lejos de reemplazar a la microscopía óptica, la tecnología con sonda de barrido extiende sus posibilidades. Los microscopistas están ahora en disposición de transferir los refinamientos de los últimos 100 años —técnicas para reforzar el contraste y poner de manifiesto ciertas características específicas, tales como el contraste de polarización, la inmunofluorescencia y el contraste de fase— a la microscopía óptica de barrido de campo cercano. Gracias a los microscopios con sonda de barrido podemos “entrar” en el reino diminuto, nanométrico, de moléculas y microcircuitos. Aplicada esa misma técnica a la microscopía óptica, nos asomamos a ese mundo sutil en los términos familiares de luz, sombras y colores.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA VACUUM TUNNELING: A NEW TECHNIQUE FOR MICROSCOPY. Calvin F. Quate en Physics Today, vol. 39, n.o 8, págs. 26-33; agosto de 1986. TIP TECHNIQUES FOR MICROCHARACTERI ZATION OF MATERIALS. Y. Martin, C. C. Williams y H. K. Wickramasinghe en Scanning Microscopy, vol. 2, n.o 1, páginas 3-8; marzo de 1988. SCANNING TUNNELING MICROSCOPY AND ATOMIC FORCE MICROSCOPY: APPLICATION TO BIOLOGY AND TECHNOLOGY. P. K. Hansma, V. B. Elings, O. Marti y C. E. Bracker en Science, vol. 242, n.o 4876, págs. 209-216; 14 de octubre de 1988.
A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
COLABORADORES DE ESTE NUMERO Asesoramiento y traducción:
José M.ª Vidal: El microscopio acústico; Amando García: Microscopios con sonda de barrido; Rodolfo Miranda: El microscopio de efecto túnel y Microscopios de rayos X ; Luis Bou: Microscopía confocal; J. Myro y A Menéndez: Técnicas de microfotografía; José M.ª Valderas Martínez: Camillo Golgi y la reacción negra; R. Martínez Murillo: Las primeras observaciones; Esteban Santiago: Representación visual de embriones humanos.
Portada:
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El microscopio de efecto túnel Este tipo de microscopio revela las estructuras de las superficies átomo a átomo. Lo describían en Investigación y Ciencia sus propios creadores. Un año después —en 1986— recibían el premio Nobel de física Gerd Binnig y Heinrich Rohrer
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a superficie fue inventada mentos lógicos. El microscopio de La primera exploración con éxito por el diablo”, decía el ilus- efecto túnel probablemente contri- de estructuras atómicas surgió de un tre físico Wolfgang Pauli. buirá también a la comprensión de descubrimiento básico de la mecáLa frustración de Pauli se basaba en otros fenómenos físicos, químicos y nica cuántica: la luz y otras clases de el hecho de que la superficie de un biológicos. energía exhiben características tanto sólido representa la frontera entre La microscopía de efecto túnel es de partículas como de ondas. En 1927, éste y el mundo exterior. Mientras un el producto de una larga evolución. Clinton J. Davisson y Lester H. Gerátomo del interior de un sólido está Se acepta que la microscopía comenzó mer, de los laboratorios de la Bell totalmente rodeado por otros átomos, en el siglo XV cuando se hicieron len- Telephone, confirmaron la naturauno de la superficie puede interac- tes de aumento para observar insec- leza ondulatoria del electrón. Encionar con otros átomos de la misma, tos. A finales del siglo XVII , Antony contraron, asimismo, que un electrón o con los que estén inmediatamente van Leeuwenhoek desarrolló el de alta energía tenía una longitud de debajo de ésta. Por tanto, las pro- microscopio óptico, que reveló la exis- onda más corta que un electrón de bapiedades de la superficie de un sólido tencia de células, agentes patógenos ja energía. Un electrón de suficiente difieren radicalmente de las del inte- y bacterias. Aunque la microscopía energía presentaría, pues, una longirior. Así, los átomos de la superficie óptica se ha desarrollado hasta con- tud de onda comparable al diámetro a menudo se colocan en una ordena- vertirse en una técnica refinada y de un átomo. Este hecho condujo a la ción geométrica diferente de las de versátil, tiene un límite físico: el invención del microscopio electrónico. los otros átomos del sólido para mini- microscopio óptico no puede resolver Con microscopía electrónica se han mizar la energía total del sistema. En estructuras atómicas. La razón es observado proyecciones de filas de virtud de este tipo de procesos, las que la longitud de onda promedio de átomos e incluso orbitales atómicos estructuras superficiales poseen tal la luz visible es unas 2000 veces ma- en delgadas películas cristalinas. complejidad que han resistido hasta yor que el diámetro típico de un átomo, ahora una descripción teórica y expe- que es del orden de unos tres angsor qué inventar otro tipo de rimental suficientemente precisa. trom. (El angstrom es una unidad de microscopio, si el electrónico En el laboratorio de investigación longitud igual a una diez mil milloné- tiene tan alto poder de resolución? La de IBM en Zurich hemos desarrollado sima de metro, 1 Å = 10–10 m). En otras razón para ello es que la microscopía un instrumento que hace posible ca- palabras, intentar visualizar estruc- electrónica, si bien ha demostrado racterizar cuantitativamente las com- turas atómicas con luz visible es co mo ser fructífera para observar estrucplejidades de las superficies: el mi- pretender descubrir grietas del ta- turas de volumen en materiales criscroscopio de efecto túnel. Nuestro maño de un cabello en una pista de talinos, no puede resolver estructuras microscopio permite “ver” los átomos tenis tirando pelotas sobre su super- superficiales excepto en circunstande la superficie uno a uno. Puede ficie y observando su deflexión. cias muy especiales. Un electrón de incluso resolver estructuras que tienen sólo una centésima parte del tamaño del átomo. Una herramienta 1. EL MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL tiene dos secciones, suspendidas de muelles, que así tiene aplicaciones importantes, anidan dentro de un armazón cilíndrico de acero inoxidable. La sección interior contiene el por ejemplo, en la industria microe- mecanismo del microscopio. Si se desea producir imágenes de alta resolución de las eslectrónica. Al disminuir el tamaño tructuras superficiales, el microscopio debe ser apantallado de las pequeñas vibraciones de la pastilla (“chip”) de silicio —que provocadas por los pasos de las personas o por el sonido. Los imanes (sujetos al fondo del es el elemento clave en la arquitec- armazón de acero inoxidable) y las placas de cobre (adheridas al fondo de las secciones extura de los computadores— aumenta terna e interna) amortiguan las vibraciones. Cualquier perturbación hace que las placas se rápidamente su área superficial en muevan hacia arriba y hacia abajo en el campo magnético generado por los imanes. El morelación a su volumen. Por tanto, la vimiento produce corrientes inducidas en las placas. La interacción entre las corrientes insuperficie adquiere creciente impor- ducidas y el campo magnético frena el movimiento de las placas y, por tanto, el de las dos tancia en la operación de la pastilla secciones del microscopio. Para el trabajo en vacío se coloca una campana de acero sobre y en sus interacciones con otros ele- el armazón exterior del microscopio.
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TEMAS 29
R E R H O R H C I R N I E H Y G I N N I B D R E G
R E R H O R H C I R N I E H Y G I N N I B D R E G
PLACA PIEZOELECTRICA
SUJECIONES ELECTROSTATICAS MUESTRA PUNTA
TRIPODE (HECHO DE BARRAS PIEZOELECTRICAS)
E L O P R O W N A I
FUENTE DE VOLTAJE PARA LAS BARRAS PIEZOELECTRICAS
2. CONSTA EL DISPOSITIVO DEL MICROSCOPIO de una muestra y una aguja para barrer la superficie. Materiales piezoeléctricos, que se expanden o contraen al aplicarles voltaje, permiten que el dispositivo resuelva estructuras que tienen tan sólo una centésima parte del tamaño de un átomo. Un portamuestras piezoeléctrico acomoda la muestra sobre una placa metálica horizontal. Un trípode piezoeléctrico barre la punta sobre la superficie de la mues tra, simultaneando alta estabilidad y precisión. 26
alta energía penetra profundamente en la materia y apenas si revela pormenor alguno de la estructura superficial. Un electrón de baja energía se mueve lentamente y lo desvían con facilidad los campos eléctricos o magnéticos de la muestra. En los años cincuenta, Edwin W. Müller daba un gran paso adelante con su invención del microscopio iónico de emisión de campo, un instrumento altamente sensible a las superficies. Por desgracia, su campo de aplicación es muy limitado. La muestra que se desea estudiar debe tallarse como una fina aguja de pocos angstrom de radio y debe ser, también, estable frente a los elevados campos eléctricos característicos de la técnica. El principio de operación del microscopio de efecto túnel permite obviar estas dificultades. La principal diferencia entre el microscopio de efecto túnel y todos los demás es que no utiliza partículas libres; en consecuencia, no se necesitan lentes ni fuentes especiales de electrones o fotones. Su única fuente de radiación son los electrones ligados que ya existen en la muestra sometida a investigación. Para comprender este principio imaginemos que los electrones ligados a la superficie de la muestra son análogos al agua de un lago. Del mismo modo que parte del agua se filtra al terreno circundante formando corrientes subterráneas, algunos electrones de la superficie de la muestra se “fugan” de ésta y originan una nube electrónica alrededor de la muestra. De acuerdo con la física clásica, esta nube no podría existir porque la reflexión en los límites de las superficies confina las partículas dentro de ellas. Sin embargo, esto no es cierto en mecánica cuántica, donde cada electró n se comporta como una onda: su posición no está bien definida, se “difumina”. Se explica así la existencia de electrones allende la superficie de la materia. La probabilidad de encontrar un electrón decae rápidamente —de una manera exponencial— con la distancia de la superficie. Este efecto se conoce tradicionalmente como “efecto túnel” ya que los electrones parecen estar cavando túneles más allá de su frontera clásica.
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a primera verificación experimental del efecto túnel fue llevada a cabo hace un cuarto de siglo por Ivar Giaever, de la General Electric Company. Para ello colocó una capa aislante, rígida y delgada, separando dos placas metálicas llamadas TEMAS 29
electrodos. La distancia entre los electrodos era lo suficientemente pequeña como para que las nubes electrónicas asociadas a ellos se solaparan ligeramente. Una diferencia de potencial entre los electrodos —inducida por ELECTRONICA un voltaje aplicado— hace que algunos electrones fluyan de un electrodo a otro a través del solapamiento entre las nubes de carga. Este flujo equivale al flujo de agua subterránea entre PANTALLA DEL COMPUTADOR dos lagos adyacentes cuando uno está más alto que otro. Hemos construido el microscopio de efecto túnel haciendo algunos cambios básicos en la típica configuración de túnel. En primer lugar, reemPUNTA MOVIL plazamos uno de los electrodos por la muestra que queremos investigar. A continuación, sustituimos el otro electrodo por una punta afilada como una aguja. Y finalmente reemplazamos la capa aislante rígida por otro aislante, no rígido, un líquido, un gas NUBE ELECTRONICA o el vacío, por ejemplo, de modo que fuera posible desplazar la punta de la aguja sobre los contornos de la superficie de la muestra. SUPERFICIE DE LA MUESTRA Para barrer la superficie empujamos la punta hacia la muestra hasta que las nubes electrónicas respecti- 3. EN EL EFECTO TUNEL DE ELECTRONES está basada la operación del microscopio. Una vas se tocan suavemente. La aplica- nube electrónica ocupa el espacio entre la superficie de la muestra y la punta de la aguja ción de un voltaje entre la punta y la (abajo ). La nube es consecuencia de la indeterminación en la localización del electrón (un muestra induce que los electrones resultado de sus propiedades ondulatorias); hay una probabilidad no nula de encontrar al pasen de una a otra a través de un electrón más allá de la frontera superficial de un conductor ya que el electrón está difuestrecho canal en las nubes electró- minado. La densidad de la nube electrónica disminuye exponencialmente con la distan cia. nicas. Este flujo se llama corriente Un flujo de electrones a través de la nube, inducido por una diferencia de potencial, es, por de túnel. Como la densidad de una tanto, extremadamente sensible a la distancia entre la superficie y la punta. Al barrer esnube electrónica decae exponencial- ta última la superficie, un mecanismo de realimentación mide el flujo de electrones (llamente con la distancia, la corriente mado la corriente túnel) y mantiene constante la altura de la punta por encima de los átode túnel es sumamente sensible a la mos de la superficie (arriba). De este modo, la punta sigue los contornos de la superficie. distancia entre la punta y la super- El movimiento de la punta se lee y procesa por un ordenador y aparece en una pantalla o ficie. Un cambio en la distancia en en un registrador. Barriendo con la punta un conjunto de líneas paralelas se obtiene una una cantidad igual al diámetro de un imagen tridimensional de alta resolución de la superficie examinada. solo átomo hace disminuir la corriente de túnel en un factor de 1000. trom en la superficie. Se ha consegui- etapas —de sección triangular— sí pues, nos es dado explotar la do un aumento de 100 millones. están hechas de barras de vidrio. La sensibilidad de la corriente túnel ¿Cómo es posible mover la punta segunda sección se desliza en el intepara realizar mediciones precisas sobre la muestra manteniendo cons- rior de la primera, de la cual está susde la posición vertical de los átomos de tante la distancia entre ella y la super- pendida mediante tres muelles. A su la superficie de la muestra. Mientras ficie, que es de menos de 10 angs- vez, la primera etapa está suspenla punta va barriendo la superficie, trom, con una estabilidad y precisión dida del armazón exterior también un mecanismo electrónico de reali- superior a los 0,1 angstrom? En pri- mediante tres muelles. La segunda mentación mide la corriente de túnel mer lugar, el microscopio debe ser sección lleva el corazón del microsy mantiene la punta a distancia cons- apantallado de las vibraciones exter- copio: la muestra y el dispositivo de tante sobre los átomos de la superfi- nas, como las causadas por el sonido barrido de la punta. cie. De este modo, la punta sigue los en el aire o por la gente que anda por Cuando el conjunto del microscopio contornos de la superficie. El movi- el edificio. En segundo lugar, los movi- está en vacío, la resistencia al movimiento de la punta es leído y proce- mientos de la punta deben ser muy miento es mínima y ambas etapas de sado por un computador y aparece en precisos. Y, por último, la punta será suspensión podrían oscilar casi indeuna pantalla o en un registrador. Se tan afilada cuanto lo permitan los finidamente bajo cualquier perturobtiene una imagen tridimensional límites de rigidez y estabilidad. bación. El fenómeno del amortiguade la superficie obligando a que la Dos etapas, o secciones, suspendi- miento por corrientes de Foucault es punta barra un conjunto de líneas das de unos muelles, anidan en el lo que utilizamos para detener este paralelas entre sí. Una distancia de armazón de acero inoxidable del movimiento. Para ello, se colocan unas 10 centímetros en la imagen viene a microscopio y protegen de las vibra- placas de cobre en la parte inferior de representar una distancia de 10 angs- ciones la distancia de túnel. Ambas ambas secciones que se deslizan entre
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unos imanes permanentes y sujetos al armazón exterior. Al deslizarse las placas arriba o abajo, el campo magnético hace que los electrones de conducción del cobre se muevan induciendo las llamadas corrientes de Foucault. La interacción entre las corrientes inducidas y el campo magnético frena el movimiento de las placas y protege, por tanto, el microscopio hasta de las vibraciones más pequeñas. Una vez eliminadas las vibraciones externas, se acomoda la muestra. Nos servimos para ello de un dispositivo especialmente desarrollado que transporta la muestra a través de una placa metálica horizontal situada en la segunda etapa. El cuerpo del portamuestras consiste en una lámina de material piezoeléctrico que se expande o se contrae al aplicarle un voltaje. El portamuestras posee tres pies metálicos, dispuestos en un triángulo, que están recubiertos de una capa delgada de material aislante. Los pies pueden fijarse a la placa metálica aplicando un voltaje entre ellos y ésta. Movemos el portamuestras de la manera que a continuación detallamos. Supongamos, por ejemplo, que fijamos sólo un pie y aplicamos un vol-
taje al cuerpo del piezoeléctrico, que así se contrae. Los otros dos pies se moverán ligeramente. A continuación, fijamos las otras dos patas, soltamos la tercera y quitamos el potencial aplicado de suerte que el cuerpo se estire de nuevo hasta su tamaño original. El portamuestras se ha movido justamente un paso. El tamaño del paso se puede regular entre 100 y 1000 angstrom. El portamuestras caminará a lo largo de la placa en la dirección deseada, ya que puede girar alrededor de cualquiera de sus patas. Cuando el portamuestras ha llevado la muestra hasta la posición de túnel elegida, empezamos a barrer la superficie de la muestra. Para mover la punta de la aguja de barrido se emplea un trípode rígido hecho de tres barras de material piezoeléctrico. Cuando aplicamos un voltaje para expandir o contraer una de las barritas, las otras dos se tuercen ligeramente. En consecuencia, la punta se mueve en línea recta distancias de hasta 10.000 angstrom. Más aún, el movimiento es muy sensible a la magnitud del voltaje aplicado: un voltaje de 0,1 volt produce un movimiento de 1,0 angstrom. La precisión del movimiento del trípode es finísima, hasta el extremo de que la reso-
lución vertical obtenida hoy sobre la superficie de la muestra queda limitada sólo por las vibraciones. En el momento actual esta resolución se halla en el rango de contadas centésimas de angstrom.
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a resolución lateral del microscopio está limitada por lo afilada que sea la punta. Con respecto a esto, la naturaleza ha sido generosa con el microscopio túnel. Es relativamente fácil hacer una punta afilada que nos dé una resolución lateral de 6 a 12 angstrom: sólo hace falta pulir la punta de una aguja, normalmente de tungsteno. Ahora bien, si se desea una resolución lateral de dos angstrom, la aguja debe tener un solo átomo al final de la punta. Normalmente ese átomo viene de la misma muestra. Lo desplazan de ella altos campos eléctricos producidos al aplicar una diferencia de potencial de entre 2 y 10 volt entre la muestra y la punta. La suerte desempeña un papel importante en este paso final y por eso estamos intentando afilar la punta mediante bombardeo con un haz de iones de alta energía. Así se pueden eliminar átomos de la superficie de un modo muy controlado.
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4. SUPERFICIE DE SILICIO visualizada por el microscopio de efecto túnel; consiste en un conjunto de celdas unidad de forma romboidal. Cada celda mide 27 angstrom (un angstrom es una diezmilmillonésima de metro, 1 Å = 10–10 m) de lado. La celda se llama 7 por 7 porque cada lado mide siete distancias atómicas. Cada 7 por 7 con28
tiene 12 protuberancias en dos grupos de seis. Las protuberancias parecen corresponder a las superficies de los átomos individuales. Se elevan 1,3 angstrom sobre el resto. La imagen se obtuvo aplicando un voltaje para que los electrones pasaran de la punta a la superficie. TEMAS 29
Además de delinear la topografía atómica de la superficie, el micros20 copio de efecto túnel revela la composición atómica. La corriente de túnel depende de la distancia de túnel y de la estructura electrónica de la superficie. Ahora bien, cada elemento atómico posee una estructura electrónica característica. ] La capacidad del microscopio para 1 0 0 resolver tanto la topografía como la [ M 10 estructura electrónica lo hace útil O R T para la investigación en física, quí- S mica o biología. Estudiamos en pri- G N mer lugar un caso simple: las estruc- A turas topográficas de monocristales caracterizados por una estructura superficial homogénea. Los cristales constan de capas atómicas idénticas que se apilan ordenadamente unas sobre otras. Resultados de experi0 mentos de difusión de electrones o 0 10 20 átomos indicaban que la capa supeANGSTROM [110] rior difería de las otras y era más compleja, pero resultaba difícil determinar la estructura detallada de esta [110] capa superficial. La estructura de superficie más Z [001] conocida es la celda unidad de silicio. La celda unidad tiene forma de rombo; cada borde de la celda mide siete distancias atómicas, por lo que la celda se denomina 7 por 7. Cada 7 por 7 contiene 12 protuberancias, que no se habían visualizado antes. Cada protuberancia corresponde manifies[110] tamente a un solo átomo. Aunque de Y [010] estética agradable, la disposición de los átomos de la superficie reviste X suma complejidad. En cambio, las [100] estructuras de las capas interiores [001] del silicio son relativamente simples. Su celda unidad es 49 veces menor que la 7 por 7 y contiene sólo dos átomos. Otra diferencia radica en el hecho de que la capa superficial es mucho más rugosa que cualquier capa del volumen. Aunque ahora se conoce M la estructura superficial y ha sido O R posible obtener una gran cantidad T S de información sobre ella a través de G N otros experimentos, se ignora por qué A 5 , razón la superficie forma esta estruc 3 tura y no otra cualquiera. O M G S T R Otro cristal cuya superficie se com N A 0 5, prende ahora mejor es el de oro. Hemos encontrado que, al cortar el cristal en una dirección paralela a sus capas 5. OXIGENO ADSORBIDO en níquel (arriba) observado en escala atómica. Los átomos de oxígeatómicas, la cara resultante es plana. no (color ) están separados 3,5 angstrom en una dirección, llamada [001], y 0,5 angstrom en la En cambio, un corte en una dirección otra [11-0]. El modelo del cristal de níquel cúbico centrado en las caras (abajo ) sugiere la razón diagonal a las capas atómicas pro- para ello. La geometría del modelo predice que si la distancia entre dos átomos de níquel con-0] duce una superficie más rugosa. Así tiguos a lo largo de la dirección [001] es de 3,5 Å el espaciado a lo largo de la dirección [11 como el estudio actual de la corteza será de 2,5 Å. Sin embargo, la repulsión electrónica entre dos átomos de oxígeno es demasiaterrestre nos ayuda a comprender que do grande para permitirles permanecer establemente en puntos de la red separados tan sólo ésta se formó hace millones de años, 2,5 angstrom. Por tanto, los átomos de oxígeno que caigan a lo largo de la dirección [11-0] disel estudio de las superficies nos permi- tarán entre sí, por lo menos, dos veces el parámetro de red, lo que corresponde a la distancia te entender cómo se modificaron desde observada de 5,0 angstrom. A veces se observan separaciones de cinco veces el parámetro que se cortaran. Las teorías actuales de red, pero nunca de tres o cuatro veces. Habrá que investigar la causa de esta anomalía.
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predicen que la superficie cortada diagonalmente adquiere una estructura dentada porque esa configuración tiene una energía menor que la configuración plana y, consecuentemente, es más estable.
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na rama más exótica de la física, el estudio de la superconductividad, se ha beneficiado también de la aplicación de la microscopía de efecto túnel. El material superconductor se caracteriza por su completa falta de resistencia eléctrica. El uso de cables superconductores libres de pérdidas por calentamiento ahorraría cantidades enormes de energía eléctrica. Así, por ejemplo, el acelerador para la colisión de haces de partículas del Fermilab utiliza imanes superconductores para alcanzar elevados campos magnéticos ahorrando energía. Hay un inconveniente, sin embargo. Se sabe que la superconductividad sólo ocurre en algunos conductores cuando han sido enfria-
dos por debajo de una temperatura crítica, unos pocos grados por encima del cero absoluto (–273,15 grados centígrados). Un grupo de investigadores de la Universidad de Stanford, dirigidos por Calvin F. Quate, ha desarrollado un microscopio de efecto túnel que opera a bajas temperaturas. Usaron su microscopio para visualizar la estructura electrónica de las superficies de varios conductores a temperatura ambiente. Enfriaron luego los conductores por debajo de la temperatura crítica de cada uno y estudiaron los cambios en su estructura electrónica. Este grupo puede presentar pruebas experimentales del crecimiento de las regiones superconductoras en las superficies. El microscopio de efecto túnel ha posibilitado una comprensión más detallada de ciertas reacciones químicas. Nuestro grupo ha observado en una escala atómica la adsorción de oxígeno en níquel ( véase la figu-
ra 5).
Nuestras observaciones confirman resultados previos de experimentos de difusión: la distancia entre los átomos de oxígeno adsorbidos sobre la superficie del níquel varía con la dirección. En particular, los átomos de oxígeno que e stán a lo largo de una cierta dirección, llamada [001], están separados por una distancia igual al parámetro de red; esto es, la distancia entre dos átomos de níquel contiguos a lo largo de esa dirección. En cambio, los átomos de oxígeno a lo largo de la dirección perpendicular, llamada [11 0], están separados dos o cinco parámetros de red, pero nunca uno, tres o cuatro. Sospechamos que esta anomalía la causa algún tipo de efecto de apantallamiento entre las cargas eléctricas del níquel y del oxígeno, pero se requiere una investigación exhaustiva para determinar los detalles de la interacción real. Todas las aplicaciones que hemos examinado hasta ahora se basan en
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6. EL COLLAR DEL VIRUS Ø 29 conecta la cabeza del microorga- tructura del collar. El conocimiento detallado de dicha estructura nismo a su cola. Gracias a micrografías electrónicas sin procesar resulta decisivo para controlar la propagación de ciertas infeccomo ésta ofrecida aquí, se ha logrado poner de manifiesto la es- ciones víricas. 30
TEMAS 29
la capacidad del microscopio para detectar estructuras cuyas dimensiones se miden en fracciones de angstrom. Tan alta resolución no siempre es necesaria. Hay algunos campos de investigación donde, si bien la resolución del microscopio de efecto túnel sea tan sólo de algunas decenas de angstrom, podemos esperar, en virtud de resultados ya obtenidos, que su uso producirá información nueva y valiosa y estimulará progresos significativos. En particular, para muchas aplicaciones, la posibilidad de operar el microscopio de efecto túnel en aire a presión atmosférica compensará con creces la pérdida de resolución que hubiere.
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na de estas aplicaciones se encuentra en el estudio de la fricción. Para minimizar las pérdidas de energía asociadas al rozamiento, los investigadores están interesados en conocer mejor la estructura y las causas de la rugosidad superficial del material industrial. Recientes estudios sugieren que el microscopio de efecto túnel resulta especialmente adecuado para este tipo de trabajo. Nuestro microscopio ha demostrado también su utilidad en biología, aunque sólo alcance hoy resoluciones laterales de unos 10 angstrom. Este es otro caso en que la relativamente baja resolución del microscopio queda más que compensada por su capacidad para suministrar un método directo y no destructivo de visualizar muestras biológicas. Otros microscopios destruyen parcialmente las muestras enfocadas. Así, en microscopía electrónica convencional, las muestras deben recubrirse con una delgada capa metálica y, ya que se estudian en vacío, se secan. Este proceso podría alterar las muestras de un modo indeseable —e incontrolable— pues las moléculas de agua constituyen parte esencial de las substancias biológicas. En el microscopio de efecto túnel puede incluso usarse agua como barrera aislante entre la muestra y la aguja de sondeo. (El agua es un conductor relativamente pobre, a no ser que contenga iones como los que se forman cuando se disuelve cloruro sódico en ella.) Explotando la sensibilidad del microscopio de efecto túnel hemos barrido la superficie del ácido nucleico ADN con la ayuda de E. Courtens, del laboratorio de investigación de IBM en Zurich, y de H. Gross y J. Sogo, del Instituto Politécnico Federal. Hemos observado una serie de zigzags correspondiente a la estructura helicoidal del ADN. A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
En un esfuerzo cooperativo con los físicos españoles Arturo Baró, Nicolás García y Rodolfo Miranda, de la Universidad Autónoma de Madrid, y el biólogo José L. Carrascosa, del Centro de Biología Molecular, hemos confirmado que la cabeza del virus conocido como Ø 29 mide 400 300 200 angstrom. Ha quedado desvelada la estructura de la conexión entre la cabeza y la cola del virus, llamada collar, que parece desempeñar un papel significativo en el proceso de infección. El resultado está de acuerdo con lo que se conocía a partir de microfotografías de microscopio electrónico procesadas. Además de producir imágenes, la punta de sondeo servirá para comprobar circuitos electrónicos. En efecto, las sondas que verifican los componentes electrónicos deben ser miniaturizadas al mismo ritmo que los propios componentes. La punta puede valer de sonda local del voltaje así como de fuente de corriente. En todas las aplicaciones descritas es vital que el proceso de obtención de la imagen no destruya ni altere el objeto. Pero el microscopio de efecto túnel promete también ser una herramienta para estimular procesos químicos específicos. Una de las características notables del microscopio es poseer un haz de electrones de baja energía extremadamente bien focalizado: su corriente túnel. La energía del haz puede estar precisamente en el rango de energías de la mayoría de los procesos químicos. Por tanto, ajustando el haz a energías específicas, los investigadores pueden provocar a voluntad ciertas reacciones. Este modo de operación del microscopio y las otras capacidades del instrumento parecen abrir una gama de posibilidades de investigación completamente nueva. ×
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BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA ENERGY GAP IN SUPERCONDUCTORS MEASURED BY ELECTRON TUNNELING . Ivar Giaever en Physical Review Letters, volumen 5, n.o 4, págs. 147-148; 15 de agosto de 1960. (111) FACE TS AS THE ORIGIN OF RECONSTRUCTED AU(110) SURFACES. G. Binnig, H. Rohrer, Ch. Gerber y E. Weibel en Sur face Science, vol. 131. n.o 1, págs. L379384; agosto, 1983. REAL-SPACE OBSERVATION OF 2 X 1 STRUCTURE OF C HEMISORBED O X YG EN O N NI(110) BY SCANNING TUNNELING MICROSCOPY . A. M. Baró, G. Binnig, 11. Rohrer, Ch. Gerber, E. Stoll, A. Baratoff y F. Salvan en Physical Review Letters, vol. 52, n.o 15, págs. 1304-1307; 9 de abril de 1984.
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Microscopía confocal Esta técnica microscópica no tiene rival para la producción de imágenes nítidas, sean planas o en tres dimensiones Jeff W. Lichtman
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arvin Minsky es el padre de la inteligencia artificial. También es autor de otro importante logro. En los años cincuenta construyó un microscopio óptico revolucionario, que le permitía observar con claridad capas sucesivas de una muestra sin tener que rebanar el espécimen en finos cortes. Minsky no recibió el debido reconocimiento cuando patentó su “microscopio de barrido por etapas, de doble enfoque”. En los diecisiete años de vigencia de la patente no percibió derechos ni royalties, y no se fabricó ningún instrumento de concepción similar. Treinta años después, su método —hoy denominado “microscopía confocal”— ha prendido con fuerza y se ha tomado la revancha, hasta convertirse en uno de los progresos más notables de la microscopía óptica de nuestro siglo. No está claro si el interés que suscita ha sido encendido por
el redescubrimiento de los primeros trabajos de Minsky o por la reinvención de su idea por otros. Sea como fuere, el feliz resultado es que ahora contamos con docenas de tipos de microscopios confocales, en una gama que va desde lo rudimentario hasta lo barroco. Minsky desarrolló la técnica mientras reflexionaba sobre el funcionamiento del cerebro. Razonó que, si fuera posible cartografiar las conexiones entre todas las neuronas, el diagrama circuital revelaría indicios del modo en que opera el cerebro. Por desdicha, al aplicar las técnicas de la
microscopía óptica ordinaria a la identificación de las sutiles interconexiones de las neuronas de un corte cerebral se tropieza con un grave obstáculo técnico. En los microscopios ópticos, cuando el objetivo enfoca luz tomada de planos situados por debajo de la superficie del tejido cerebral (o de cualquier material grueso y translúcido), la imagen se torna rápidamente incomprensible. Tratar de ver elementos nerviosos profundos de tal tejido equivale a tratar de localizar un objeto hundido en una charca cenagosa proyectando sobre el agua una
1. GRANOS DE POLEN de girasol (arriba) y de pino (serie inferior ). Estos “retratos” han sido preparados a partir de imágenes obtenidas con un microscopio confocal de planos sucesivos de cada grano. Un ordenador digitalizó dichas imágenes —llamadas secciones ópticas — y las combinó. Tales reconstrucciones digitales pueden observarse en cualquier orientación; el polen de pino se muestra (de izquierda a derecha) en vista lateral, en vista lateral opues ta, girado 72 grados respecto a la primera posición, y desde arriba.
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2. UNA MICROCAPSULA DE POLIMERO rellena de fluido (esfera grande ), de 0,1 milímetros de diámetro. La imagen se obtuvo a par tir de una pila de secciones ópticas, entre las que se contaban las esferas menores aquí mostradas. Las imágenes fueron preparadas por Matthew H. Chestnut para comparar la integridad estructural linterna: la luz es reflejada por tantas y tan diminutas partículas que resulta imposible distinguir el objeto de su entorno. Para conseguir una representación nítida de un plano individual de una muestra, lo ideal sería recoger luz reflejada del plano de interés y sólo desde él. Pero el material situado por encima y por debajo de ese plano también devuelve luz, creando imágenes borrosas. Al mismo tiempo, el fenómeno de dispersión puede reducir el contraste. La dispersión se produce al incidir la 34
de esta cápsula con la de otras con diferente composición. Se dis tingue la cápsula (en verde ) del fluido que la llena marcando estos componentes con tintes diferentes. El análisis detallado de muchas vistas no reveló roturas en la cápsula, pero sí ciertas fugas del fluido interior.
luz sobre partículas diminutas y reflejarse de ellas, incidiendo de nuevo en otras partículas y así hasta alcanzar la superficie detectora. Las señales producidas por esta luz desviada al azar no aportan información; crean un resplandor difuso que tiende a encubrir la luz procedente del plano de interés.
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on unas pocas modificaciones en el microscopio normal Minsky minimizó la difuminación de la imagen y reforzó el contraste. Evitó que se produjera gran parte de la dis-
persión; para ello hizo pasar la luz de iluminación a través de un objetivo que enfocaba los rayos en un haz bicónico, cuya forma recuerda un reloj de arena. Después llevó el foco de este haz (la angostura en el reloj de arena), que es un punto de luz nítido e intenso, sobre una porción mínima de la muestra, a la profundidad deseada. Tal proceder garantizaba que esa zona sería la más intensamente iluminada del espécimen y, por tanto, la que reflejase más luz. Igual de importante es que, al enfocar un área, Minsky garantizaba que el resto de TEMAS 29
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3. LA RECONSTRUCCION TRIDIMENSIONAL de una neurona es la “estrella” de esta secuencia de fotogramas. La estructura que vemos en los sucesivos cuadros está girada unos 1 0 grados en torno a un eje vertical con respecto a cada cuadro anterior. La se-
cuencia constituye una película de la célula, vista en rotación. Para ver la neurona en tres dimensiones, deberá mirar con los ojos bizcos un par de imágenes; cada ojo tiene que estar enfocado en una imagen diferente.
la muestra apenas recibiría iluminación, suprimiendo con ello la dispersión. La microscopía óptica al uso iluminaría la muestra entera y se desviaría la luz incidente. La estrategia de enfocar la iluminación sobre una región circunscrita limitaba la dispersión total. Pero no impedía que la luz fuese devuelta y dispersada por el tejido iluminado suprayacente e infrayacente a la zona de interés (el tejido que se encuentre dentro de las porciones cónicas del haz iluminador). Gracias a un segundo ajuste Minsky impidió también que gran parte de esta luz espuria alcanzase la superficie detectora; sabía que la luz devuelta era enfocada por el objetivo en un plano situado muy por encima de la muestra. Colocó en ese plano una máscara con una abertura diminuta, que dispuso de modo que la luz de retorno pasara a su través hasta la superficie detectora. El resultado fue impresionante: la señal procedente del punto iluminado pasaba íntegra a través del orificio de la pantalla y alcanzaba la superficie detectora; al propio tiempo, la máscara eliminaba casi toda la luz procedente del tejido exterior al punto. Se formaba así una imagen casi perfecta del punto, esencialmente no pertur- 4. NEURONAS ACTIVAS (objetos coloreados ) resaltadas en este corbada por la dispersión ni te de tejido cerebral de un roedor. La figura es una compilación, gedifuminada por la luz pro- nerada por ordenador, de tres imágenes confocales realizadas, con cedente de zonas no enfo- 12 segundos de diferencia, por Michael E. Dailey y Stephen J. Smith. cadas. Cada punto temporal se codificó mediante un color, rojo primero, verEl problema obvio que de luego y por fin azul. La imagen nos revela que las neuronas se explanteaban las dos prime- citaron en instantes distintos y se mantuvieron activas durante dos ras fases del método de de los pulsos (así la célula amarilla) o durante los tres (blanca). A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
Minsky era que éstas proporcionaban una imagen nítida, sí, pero sólo de un punto diminuto. Para producir una representación del plano entero, añadió una característica más: la exploración secuencial por líneas, o “barrido”. Corrió la muestra poquito a poco, barriendo el plano de enfoque con el punto luminoso a lo largo de líneas paralelas inmediatas. Al final, cada una de las áreas yacentes a una profundidad dada visitaba el haz iluminador fuertemente concentrado, enviando en secuencia una señal clara a través del orificio filtrante hasta el detector. Minsky maniobraba la muestra con dos diapasones electromagnéticos de horquilla. Uno lo desplazaba a lo largo de c ada línea y el otro lo hacía pasar de una línea a la siguiente paralela del plano.
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ara ver la imagen completa de un plano, hacía que la luz que atravesaba el orificio incidiera en un detector fotomultiplicador. Este detector, a su vez, generaba un flujo de señales eléctricas con las que se confeccionaba una imagen en una pantalla de larga persistencia, tomada de un radar. Subiendo o bajando el objetivo y repitiendo el proceso de barrido, aparecía en la pantalla otro plano de la muestra. La elección de una pantalla grande fue un error táctico. Cuando Minsky les pedía a sus colegas que examinaran el artilugio, éstos solían tener dificultad para interpretar la imagen que esta35
) s a í f a r g o t o f ( N A C I L U C N A S U S Y N A M T H C I L . W F F E J , ) s o j u b i d ( D S J / N A M D I E N H C S D E R A J
Así funciona la microscopía confocal
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os microscopios confocales consiguen elevada resolución en un plano seleccionado merced a tres procesos fundamentales. En el primero, se enfoca luz ( amarilla en a ) mediante una lente objetivo, creando un haz bicónico cuyo vértice o foco ilumina una zona de la muestra, a la profundidad deseada. A continuaci ón, la luz reflejada por esa área (azul ) es enfocada y concentrada en un punto, permitiéndosele que pase en su totalidad a través de una abertura de una máscara situada frente a un dispositivo detector. Las regiones opacas que rodean al orific io de filtrado cierran el paso a los rayos reflejados por la regiones suprayacentes
(en rojo en b ) e infrayacentes (en naranja ) del plano de interés. Por último, la luz se traslada de una zona a otra hasta explorar el plano por completo. La nitidez que esta técnica proporciona resulta evidente en las fotografí as al pie, obtenidas, respectivamente, con un microscopio tradicional (izquierda ) y con uno confocal ( derecha ). Ambas imágenes corresponden a un mismo músculo de ratón, marcado por fluorescencia para resaltar los puntos que entran en contacto con una neurona motora. Para acel erar el barrido, se incorpora un disco provisto de cientos de finos orificios, a través de los cuales se envía y recoge la luz (c ).
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DETECTOR
DETECTOR
ORIFICIO FINO
ESPEJO BEAM- DESDOBLADOR SPLITTING DEL MIRROR HAZ FUENTE LIGHT LUMINOSA SOURCE ESPEJO DESDOBLADOR DEL HAZ
FUENTE LUMINOSA
LENTE LENS
b
OBJETIVO
SPINNING DISCO GIRATORIO DISK OBJECTIVE OBJETIVO
PLANO DE ENFOQUE MUESTRA
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SPECIMEN MUESTRA
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5. LA TEXTURA SUPERFICIAL de una pastilla (“chip”), mostrada en dos a tres profundida profundidades. des. El nivel más profundo es verde; el más aluna micrografía óptica normal (izquierda ) y en una imagen confocal to, rojo. rojo. Se obtiene así información información que no es posible posible captar captar en la mimicompuesta (derecha). En esta última se han superpuesto los barri- crofotografía ordinaria. ban viendo. Como Minsky dedujo más tarde, la imagen presentada era excesivamente grande. “Les mostré el microscopio confocal a muchos visitantes, pero nunca parecieron muy impresionados con lo que veían en la pantalla de radar”, cuenta. “No caí en la cuenta hasta mucho de spués de que no basta sólo con que un instrumento posea elevado poder de resolución; es preciso también que la imagen parezca nítida. Tal vez el cerebro humano precise de cierto grado de compresión foveal para aplicar sus facultades visuales más sobresalientes. En cualquier caso, debí haber utilizado película fotográfica ¡o cuando menos, haber instalado una pantalla más pequeña!” Pero Minsky no hizo ni lo uno ni lo otro.
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nvestigadores y fabricantes han ideado muchos métodos para combinar las características esenciales de la microscopía confocal: iluminación de una pequeña porción de la muestra, filtrado de la luz de retorno a través de una abertura alineada con la región iluminada y barrido del espécimen. La muestra suele permanecer quieta; en casi todos los dispositivos es el haz luminoso el que viaja. Para acelerar la velocidad de adquisición de la imagen, algunos microscopios desplazan el haz con espejos oscilantes, que obligan a la luz incidente en ellos a fluir raudamente a través de una muestra, que es barrida como barre el rayo electrónico la pantalla de un televisor. Estos espejos permiten reconstruir una imagen en menos de un segundo. Tales instrumentos exigen fuentes luminosas de más brillo que las que Minsky tenía a su disposición; después de todo, han de producir de cada zona una señal que sea detectable casi instantáneamente. Los láseres, muy intensos y A T RAV RAVÉS ÉS DEL MICROSCOPIO
fáciles de enfocar en zonas pequeñísimas, se utilizan para este propósito. Para ahorrar tiempo se emplean también múltiples puntos de luz que exploren simultáneamente diferentes regiones de la muestra. Algunos de estos dispositivos incorporan discos giratorios provistos de muchas aberturas, a través de las cuales pasa la luz de iluminación y la de retorno. Otros equipos se valen de sistemas de rendija, que abrevian el tiempo de barrido iluminando líneas en vez de puntos. Las técnicas de barrido rápido han permitido la observación de planos completos de un espécimen en tiempo real, muchas veces, directamente a través de un ocular. Casi todos los microscopios confocales modernos sacan partido de otro avance revolucionario: el procesamiento digital de imágenes. Conforme un microscopio confocal barre planos sucesivos de la muestra, produce una pila de imágenes, cada una de las cuales constituye una sección óptica; tales secciones vienen a ser imágenes de finos cortes. Los programas de procesamiento de imágenes no sólo registran el brillo de cada zona de cada sección, sino también la ubicación de esa área en la muestra, o sea, su localización en un plano individual (las coordenadas x e y) así como la profundidad de éste (la coordenada z ). Los lugares definidos mediante la terna de coordenadas se llaman llama n “vóxeles”, “vóxeles”, equivalentes en tres dimensiones de los elementos de imagen, o “píxeles” de una imagen bidimensional. Los programas de procesamiento de imágenes compilan vóxeles y preparan con ellos reconstrucciones tridimensionales de objetos microscópic microscópicos. os. También manipulan vóxeles, lo que permite hacer girar alrededor de un eje las imágenes reconstruidas y
observarlas desde todos los ángulos. Gracias a esta técnica nos es dado efectuar rápidamente observaciones que de otra forma hubieran resultado sumamente caras y laboriosas. Por ejemplo, en investigación cerebral, los sistemas de microscopios confocales conectados a ordenadores han resultado valiosísimos para descubrir la estructura del sistema nervioso, y en ellos se apoya la o bservación de tejidos cerebrales vivos.
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a microscopía confocal se ha convertido en una aglutinación ultrarrefinada de láseres, instrumentos ópticos, sistemas electromecánicos de barrido y de procesamiento informático de imágenes. Ha dado a la microscopía la capacidad de ver el interior de los objetos y de crear, casi a voluntad, imágenes estereoscópicas. El sueño de Minsky —la cartografía microscópica de los circuitos cerebrales— parece estar cobrando realidad.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA VALUA UATIO TION N OF C ONFOCAL VERSUS A N EVAL MAGING ING OF BIOLOGICAL CONVENTIONAL IMAG STRU TRUCT CTUR URES ES BY FLUORESCENCE LIGHT MICROSCOPY. J. G. White, W. B. Amos y M. Fordham, en Journal of Cell Biology, volumen 105, n.o 1, páginas 41-48; julio de 1987. M E MO MO IR IR O N INV NVEN ENTIN TING G TH THE E C ONFOCAL SCANNING MICROSCOPE. M. Minsky en Scanning, vol. 10, n.o 4, páginas 128-138; julio/agosto de 1988. HIGH-RESOLUTION IMA MAGI GING NG OF SYNAPTIC STR TRUC UCTU TURE RE WI WITH TH A SIMPLE CONFOCAL MICROSCOPE. J. W. Lichtman, W. J. Sunderland y R. S. Wilkinson en New Biologist , vol. 1, n.o 1, páginas 75-82; octubre de 1989. CONFOCAL MICROSCOPY. Recopilación de Tony Wilson. Academic Press, 1990.
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Microscopios de rayos X Los trabajos en microscopía de rayos X blandos blandos culminaron en el decenio de 1980 con la construcción de instrumentos cuya resolución decuplicaba la del microscopio óptico. En este artículo de 1991, algunos de sus creadores detallan la historia de ese logro Malcolm R. Howells, Janos Kirz y David Sayre
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ada adelanto en las técnicas microscópicas ha proporcionado a los científicos nuevas perspectivas sobre el funcionamiento de los organismos vivos y la naturaleza de la propia materia. La invención del microscopio de luz visible a finales del siglo XVI mostró un reino antes desconocido de plantas y animales unicelulares. El desarrollo de la cristalografía de rayos X a principios del siglo XX ofreció las primeras imágenes precisas de la materia con “resolución atómica”. Durante las décadas siguientes, los microscopios electrónicos han proporcionado imágenes directas de virus y minúsculas estructuras superficiales. Ahora, otro tipo de microscopio que utiliza rayos X en vez de luz visible o electrones aporta un modo diferente de examinar los detalles diminutos. Los microscopios de rayos X tienen una resolución bastante mejor que la de los microscopios ópticos. Sirven, además, para trazar mapas de la distribución de ciertos elementos químicos. Algunos pueden formar imágenes en tiempos brevísimos, y los hay incluso que prometen capacidades tan especiales como la de obtener imágenes tridimensionales. A diferencia del microscopio electrónico convencional, el microscopio de rayos X permite mantener los especímenes al aire y en agua, lo que significa que las muestras biológicas pueden ser estudiadas bajo condiciones similares a las de su estado natural. La iluminación usada, rayos X “blandos” en el rango de longitud de onda de 20 a 40 angstroms (un angstrom es la diezmilmillonésima parte de un metro), es, además, lo suficientemente penetrante como para producir en muchos casos imágenes de células 38
biológicas sin alterar. Debido a la longitud de onda de los rayos X e mpleados, los microscopios de rayos X blandos nunca alcanzarán una resolución más alta que la posible con microscopios de electrones. Pero sus propiedades especiales harán viables investigaciones que complementen las realizadas con instrumentos basados en la luz visible y en los electrones. El sueño de construir un microscopio de rayos X data de 1895, cuando Wilhelm Röntgen, de la Universidad de Würzburg, descubrió los rayos X. La capacidad de los rayos X para penetrar en objetos sólidos aportó un motivo de peso para utilizarlos en microscopía. Sin embargo, los científicos descubrieron rápidamente que no se podía refractar o reflejar rayos X del mism mismoo modo m odo que se hací hacíaa c on la luz visible. Las primeras imágenes se realizaron, por contra, mediante la proyección de rayos X a través de un espécimen puesto en contacto con una película fotográfica ordinaria. Los rayos X que atravesaban el espécimen impresionaban la película; la imagen resultante podía examinarse con un microscopio óptico. Esta forma de microscopía de rayos X, con conoci ocida da com comoo micr microrr orradi adiogra ografía fía de contacto, se sigue empleando todavía hoy en día. A principio princ ipio s del siglo XX se conocía la naturaleza de los rayos X: ondas electromagnéticas que tan sólo diferían de la luz visible en que tenían una longitud de onda mucho más corta. Este descubrimiento implicaba que la microscopía de rayos X ofrecía un posible camino hacia la alta resolución. La longitud de onda de la luz visible limita la máxima resolución del microscopio óptico a unos
2500 angstrom. Los microscopios ópticos construidos hace más de un siglo ya se aproximaban mucho a ese límite. Los biólogos se dieron cuenta de que, para comprender la organización y función de las células, se necesitaba una mejor resolución y pensaron que los rayos X, con una longitud de onda más corta, podrían servirles. Por desgracia, el gran tamaño de grano de las películas fotográficas ponía un freno a la microrradiografía de contacto. El microscopio óptico utilizado para examinar la película impresionada limitaba aún más esta técnica. Por culpa de estas limitaciones la primitiva microscopía de rayos X no pudo igualar, ni mucho menos superar, la resolución de la microscopía óptica ya existente. Se necesitaba un sistema que pudiera producir una imagen de rayos X focalizada. El desarrollo de tal sistema resultó ser una tarea difícil, que sólo se está consiguiendo actualmente.
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n 1923, Arthur H. Compton mostró que los rayos X podían ser eficientemente reflejados por superficies muy bien pulidas, si los rayos incidían sobre ellas con un ángulo rasante pequeño. Con una superficie de forma apropiada, los rayos X podían focalizarse y, así, producir imágenes ampliadas similares a las obtenidas mediante sistemas ópticos convencionales. A finales de los años cuarenta, Paul H. Kirkpatrick y su grupo de la Universidad de Stanford decidieron construir un microscopio de rayos X de alta resolución basado en este principio, pero su esfuerzo por obtener una resolución mejor que la del microscopio óptico fracasó. Las aberraciones y las pequeñas tolerancias en la manufactura de las TEMAS 29
superficies que este diseño requería planteaban serias limitaciones. Mientras que las prestaciones de los microscopios de rayos X no mejoraban, un competidor —el microscopio electrónico— efectuaba rápidos progresos. Así, durante los años cuarenta, los microscopios electrónicos alcanzaban rutinariamente una resolución mejor que la obtenida con microscopios de luz visible. La comunidad de biólogos,, por su parte, empezó a debiólogos sarrollar las técnicas de preparación de especímenes necesarias para aprovechar las capacidades del microscopio electrónico. Desde entonces, la microscopía electrónica se ha convertido en una herramienta habitual para toda una generación de biólogos, impulsando avances extraordinarios en la comprensión de la función y estructura celulares. El éxito de la microscopía electrónica llevó a
una interrupción temporal en el desarrollo del microscopio de rayos X.
ron las únicas fuentes de rayos X blandos disponibles durante la mayor parte de este siglo. También se ha n los últimos decenios el interés producido un gran progreso en el depor la microscopía de rayos X sarrollo de láseres de rayos X y de resurgió gracias, en gran parte, a va- plasmas emisores de rayos X, que son rios avances técnicos importantes. El capaces de producir pulsos de ramás significativo de ellos ha sido el yos X de intensidad suficiente como desarrollo de nuevas fuentes de ra- para formar una imagen en un nanoyos X. Para lograr imágenes de alta segundo (una milmillonésima de resolución, algunos tipos de micros- segundo) o menos. copios de rayos X necesitan fuentes Los detectores de rayos X también de un brillo sin precedentes. El dece- han experimentado drásticas mejonio de 1980 fue testigo de rápidos ras. Se han introducido detectores progresos en el brillo de las fuentes electrónicos y resinas fotosensibles de rayos X basadas en la radiación (materiales formados por una fina de sincrotrón (radiación emitida por capa de plástico cuya resistencia a partículas cargadas al ser acelera- ataques químicos cambia cuando se das por un campo magnético). expone a la acción de haces de elecComo resultado de lo anterior, el trones o rayos X), que han reemplabrillo disponible hoy en día es millo- zado a la película fotográfica en nes de veces mayor que el obtenido muchas aplicaciones. Las resinas mediante los tubos de rayos X que fue- han demostrado ser detectores de ra-
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N R E K R E T E I D , N O S R E D N A K I R E
1. PLACA ZONAL DE FRESNEL formada por anillos concéntricos de oro sobre una membrana de nitruro de silicio de tan sólo 1200 angs trom de espesor. Los rayos X que atraviesan las zonas zonas interanulares interanulares son difractados y focalizados. Gracias a ello, se pueden construir lenA T RAV RAVÉS ÉS DEL MICROSCOPIO
tes para rayos rayos X análogas análogas a las utilizadas utilizadas en microscop microscopios ios de luz visible. La anchura del menor espaciado entre anillos (que es aproximadamente igual a la resolución máxima alcanzable por el microscopio empleando la placa) es de unos 300 angstrom. 39
yos X baratos, idóneos y con resolución casi 100 veces mejor que la de la película fotográfica. Merece reseñarse otro avance importante: se consiguió finalmente focalizar rayos X con precisión supe-
rior a la óptica mediante el uso de “placas zonales de Fresnel”. Estos dispositivos son redes de difracción circulares formadas por anillos concéntricos, transparentes alternados con opacos, cuyo espaciado disminuye al
MICRORRADIOGRAFIA DE CONTACTO HAZ DE RAYOS X MUESTRA
RESINA (PMMA)
PERFIL DEL RELIEVE DE LA RESINA
2. DIAGRAMA DE DAÑOS producido en la resina como resultado del paso de los rayos X a través de la muestra (izquierda ). Un revelador ataca las regiones dañadas por la radiación (derecha). HAZ DE RAYOS X
MICROSCOPIO DE VISUALIZACION DE RAYOS X MUESTRA PLANO IMAGEN
CONDENSADOR DE PLACA ZONAL
MICROPLACA ZONAL
DETECTOR
3. LAS PLACAS ZONALES DE FRESNEL sirven como objetivo y lente condensadora de rayos X. La primera placa focaliza el haz sobre la muestra; la segunda amplía la imagen sobre un detector. MICROSCOPIO DE BARRIDO DE RAYOS X PLACA ZONAL
MUESTRA
HAZ DE RAYOS X
FUENTE PUNTUAL
DIAFRAGMA DE APERTURA
PORTAMUESTRAS CON BARRIDO EN LAS DIRECCIONES X-Y
CONTADOR DE RAYOS X
4. HAZ DE RAYOS X FOCALIZADO, que barre toda la muestra, de lado a lado y de arriba abajo; los rayos que inciden en cada punto se miden en un detector de rayos X de cómputo proporcional. HOLOGRAFIA DE RAYOS X (TIPO GABOR) GRABACION
S S I K R O B A G
X S E T O Y N A E R R E E H D Z O A C H
RECONSTRUCCION
MUESTRA
DETECTOR DE RESINA
R O T C U Z R A T S H N O C E R
HOLOGRAMA
N L E A G E A R M I
IMAGEN VIRTUAL
5. INTERFERENCIA entre los haces de rayos X incidentes y dispersados. La interferencia graba un holograma en una lámina de resina (izquierda ). La imagen se reconstruye (derecha) iluminando el holograma con luz de láser digitalizando el holograma y tratándolo matemáticamente. 40
aumentar la distancia desde el centro. Las ondas se difractan cuando atraviesan los anillos transparentes. De este modo, cada parte del rayo incidente sufre una deflexión apropiada para que las ondas converjan hacia un punto focal común. Las lentes de placas zonales se han utilizado para focalizar luz, ondas de radio, sonido e incluso neutrones. En 1960, Albert V. Baez, entonces en el Observatorio Astrofísico Smithsoniano de Harvard, propuso que tales placas podrían focalizar también rayos X. La fabricación de placas zonales de alta resolución es un problema técnico complejo. La mejor resolución posible para una placa dada viene a ser igual al tamaño más fino de su espaciado zonal. Para conseguir una resolución mejor que la del microscopio óptico se necesita, por tanto, crear zonas cuyos espaciados sean mucho menores que la longitud de onda de la luz. Las técnicas de fabricación óptica convencionales no están, naturalmente, a la altura de este cometido. Sin embargo, se han construido placas zonales con espaciados de sólo 300 angstrom, en torno a la vigésima parte de la longitud de onda de la luz visible, aplicando métodos desarrollados para la manufactura de microcircuitos. Un método para abordar este problema, iniciado por Gunter Schmahl y Dietbert Rudolph, de la Universidad de Gotinga, consiste en la utilización de técnicas holográficas de ultravioleta (generalización de las técnicas usadas en la creación de hologramas de luz visible) para imprimir un diagrama de placas zonales en una película de resina fotosensible. El método holográfico ha tenido un éxito impresionante, pero está limitado por la difracción de la luz ultravioleta a anchuras de la zona externa de unos 500 angstrom.
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tra técnica, más precisa, consiste en utilizar haces de electrones para “dibujar” el diagrama de placas zonales en la resina. Los métodos de microfabricación posibilitan la transferencia de estos diagramas a estructuras de oro, níquel o germanio. La técnica del haz de electrones fue ya utilizada en 1974 en el laboratorio de Dieter Kern en el Centro de Investigación Thomas J. Watson de IBM, donde todavía se siguen fabricando las mejores placas zonales disponibles (hoy las prepara allí Erik Anderson, del Centro para Optica de rayos X del Laboratorio berkeleyano Lawrence, bajo la dirección de David Attwood). TEMAS 29
) a h c e r e d ( S L L E W . C . O , G N E H C . C . P Y ) o r t n e c ( N A M T T U G . P , ) a d r e i u q z i ( Y E L K C U B . H C , E N I P . J , T R E B L I G . J
Imágenes con resolución superior a la del microscopio óptico obtenidas con tres técnicas de microscopía de rayos X diferentes MICROSCOPIO DE BARRIDO
MICROSCOPIO DE VISUALIZACION
6. IMAGEN DE UNA CELULA DE TEJIDO CONJUNTIVO de un embrión de pollo (izquierda ) obtenida por John Gilbert, Jerome Pine y Christopher Buckley con el microscopio de barrido de rayos X en el Laboratorio Nacional de Brookhaven. En la imagen se aprecian dos núcleos, cada uno con dos nucléolos, así como numerosos gránulos demasiado pequeños para observarse bajo el microscopio óptico. La imagen está tomada manteniendo la célula en ambien te húmedo y sin recurrir al proceso de tinción. Usando el microscopio de visualización de rayos X de Gotinga en el anillo de almaTodas las microfotografías de barrido de rayos X mostradas en este artículo se tomaron usando placas zonales producidas por este equipo. Pambos Charalambous, que trabaja en el grupo de Ronald Burge del King’s College londinense, también ha realizado placas zonales de precisión mediante una técnica afín. Las placas zonales de más alta resolución fabricadas tienen anchos de zona externa entre 200 y 300 angstrom. Las placas zonales para rayos X son bastante pequeñas, alrededor de 0,1 milímetros de diámetro, y de pequeño espesor, para que trabajen me jor con rayos X de longitudes de onda mayores que unos cinco angstrom.
MICRORRADIOGRAFIA DE CONTACTO
cenamiento de BESSY en Berlín, el profesor Peter Guttman y sus colaboradores obtuvieron una imagen de la estructura filamentosa de un cromosoma perteneciente a una larva de mosquito también en ambiente húmedo y sin tinción previa (centro ). P. C. Cheng y O. C. Wells mediante microscopía de contacto (derecha) obtuvieron la imagen de una célula seca de tejido conjuntivo humano, en la que se muestran fibras de sostén fuera del núcleo de la célula. La imagen muestra la superficie de la resina sensible a los rayos X ampliada por un microscopio electrónico.
aspectos importantes. En primer lugar, las resinas fotosensibles empleadas como detectores (generalmente PMMA, la materia prima del plexiglás) permiten una resolución superior a la de las películas fotográficas que se utilizaban en un comienzo. En segundo lugar, la imagen grabada en el material detector es visualizada por instrumentos de más alta resolución, principalmente el microscopio electrónico. Ambos avances surgen de un artículo publicado en 1956 por William A. Ladd y sus colaboradores, de la Columbian Carbon Company de Nueva York.
Los pioneros de la microscopía que utiliza detectores de resinas fueron Ralph Feder y Eberhard Spiller, de IBM. Aunque el método de contacto posee muchas ventajas, incluidas una relativa simplicidad y comodidad, la resolución de las imágenes de contacto está limitada por la fidelidad de los procedimientos de lectura disponibles y por la falta de nitidez de la imagen debido a fenómenos de difracción, auténtico problema a la hora de estudiar especímenes gruesos. El microscopio de visualización de rayos X utiliza óptica de localización para formar una imagen ampliada en
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os avances técnicos han permitido que los microscopios de rayos X alcancen resoluciones que van más allá del límite del microscopio óptico. Cuatro métodos de rayos X que lo logran son la microscopía de contacto, la microscopía de visualización, la microscopía de barrido y la holografía. Cada una tiene sus peculiares ventajas. La microscopía de contacto es la técnica más socorrida. La microscopía de contacto moderna difiere de la primitiva microrradiografía en dos A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
N A M H T O R . S . S Y S L L E W O H . R . M , N E S B O C A J . H C
7. HOLOGRAMA DE RAYOS X (izquierda), que proporciona la información para generar las dos imágenes reconstruida, de un agrupamiento de vacuolas s ecas de almacenamiento de enzimas. Una de ellas muestra la imagen con contraste de intensidad (centro ) y la otra con contraste de fase (derecha). 41
I L A . Y , Y E L K C U B . C
8. TENDON HUMANO ENFERMO estudiado por Christopher Buckley y Yusuf Ali con el microscopio de barrido de rayos X del Laboratorio Nacional de Brookhaven. Las imágenes de secciones del tendón sin teñir fueron tomadas con rayos X de energía justo unos pocos cientos de veces, que puede ser grabada a continuación por un detector de resolución modesta. Los dispositivos de más alta resolución emplean lentes de placas zonales de Fresnel como elemento focalizador. El dispositivo de grabación puede ser una película fotográfica sensible a los rayos X o un detector electrónico. El grupo de Schmahl en Gotinga construyó un microscopio de este tipo que alcanza resoluciones de 550 angstrom, utilizando el tipo de placas zonales creadas holográficamente a las que nos hemos referido antes. Los microscopios de visualización de rayos X ofrecen múltiples venta jas; la principal: toda la muestra es iluminada y visualizada al mismo tiempo. Esto permite tomar la imagen rápidamente, lo que ayuda a eliminar la falta de nitidez de las imágenes que provenga del movimiento y minimiza el daño que la radiación pueda infligir a las muestras biológicas. Se evita, además, la necesidad de fuentes de rayos X avanzadas con un gran grado de coherencia, u organización de fase. Estos microscopios, sin partes móviles, resultan en principio muy fiables y susceptibles de comercialización. Un consorcio de las
por debajo (izquierda) y por encima (centro ) de 350 eV, valor al cual el calcio aumenta bruscamente su absorción de rayos X. Restando la primera imagen de la segunda, obtenemos la imagen diferencia (derecha).
universidades de Gotinga y Aquisgrán, junto con la compañía de óptica Carl Zeiss, desarrolló un instrumento de este tipo ( véase la figura 11 ). El grupo de Gotinga mostró cómo obtener una imagen cuyo nivel de gris fuera proporcional al cambio de fase de los rayos X producido por la transmisión a través del espécimen. Este microscopio de “contraste de fase” permitirá, tarde o temprano, una mayor flexibilidad en la longitud de onda, dosis menores de rayos X y una mayor resolución, quizá. Durante años, los microscopios de visualización y de contacto llevaron ventaja sobre otros diseños en términos del número de microfotografías de rayos X producidas. Pero la situación cambió merced a la aparición en escena de varios nuevos microscopios de rayos X de barrido. En los microscopios de barrido, se forma la imagen elemento (píxel) a elemento, igual que si se tratara de la imagen de una pantalla de televisión. El proceso comienza con el uso de una placa zonal que focaliza el haz de rayos X en un punto iluminado de la muestra. Algunos rayos atraviesan la muestra; la fracción del haz incidente que pasa a través de él d e-
N A M H T O R . S . S , Z C N O G . K
9. VACUOLA DE ALMACENAMIENTO DE ENZIMAS de una célula pancreática. La secuencia de imágenes muestra cambios de tamaño y densidad a medida que la vacuola va descargando su contenido proteínico. Esta secuencia, producida por Kaaren Goncz y Stephen S. Rothman con el microscopio de barrido de rayos X de Brookhaven, da una medida cuantita tiva de dichos cambios. 42
termina el tono de gris asignado a este píxel. El punto localizado barre la muestra en líneas de lado a lado y de arriba abajo, grabando sucesivos píxeles. El tamaño del haz determina la resolución. Aunque parezca lento y laborioso, el método de barrido tiene claras ventajas. La técnica se presta fácilmente a la grabación de imágenes basada en ordenadores y al análisis químico punto a punto. Por otra parte, permite mantener la muestra en aire, mientras que casi todo el recorrido del haz de rayos X se encuentra en vacío. Además, el barrido minimiza el tiempo de exposición del espécimen a la radiación dañina. Sin embargo, este método, cuando se lleva a cabo con una placa zonal de Fresnel, requiere un haz de rayos X blandos coherente, que sólo puede ser suministrado por una gran instalación de radiación de sincrotrón.
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l primer microscopio de barrido de rayos X que alcanzó resolución superior a la del óptico fue construido en 1982 por uno de nosotros (Kirz), Harvey Raback y John Kenney, de la Universidad estatal de Nueva York en Stony Brook. Está emplazado en la Fuente Nacional de Radiación de Sincrotrón ( NSLS), en el Laboratorio Nacional de Brookhaven. Se acaba de reconstruir para mejorar su resolución e incrementar su velocidad en la toma de imágenes, lo que permitirá aprovechar las características de una nueva fuente de rayos X, llamada ondulador. Este dispositivo obliga a seguir a los electrones, mediante campos magnéticos, una trayectoria suavemente ondulada, lo que provoca la emisión de un haz estrecho de gran TEMAS 29
brillo. Con tal haz, el microscopio pro- compleja. Ni la intensidad de las fuenduce imágenes en un tiempo aproxi- tes coherentes de rayos X ni la resomado de un minuto. En su reforma lución de las emulsiones fotográficas intervino un amplio grupo de inves- disponibles estaban a la altura del tigadores; entre otros: Christopher proyecto. Esas limitaciones tecnolóBuckley, Mark Rivers y Deming Shu, gicas se superan a finales de los años así como físicos de Stony Brook, del ochenta; Dennis Joyeux en Francia, NSLS y del Centro para óptica de ra- Sadao Aoki en Japón, James Trebes yos X. Un microscopio similar cons- y Ian McNulty en EE.UU., junto a sus truido por el King’s College opera en respectivos colaboradores, produjeron el laboratorio Daresbury en Cheshire. hologramas de alta resolución meEntre sus metas fundamentales, diante rayos X. la microscopía de rayos X se propuso la de examinar material biológico n 1987, Chris Jacobsen, trabaen condiciones próximas a las de su jando con Kirz y Stephen S. Rothestado natural. Esto requiere que las man del Laboratorio Lawrence de la muestras estén intactas y, por tanto, Universidad de California en Berque posean cierto grosor. En el estu- keley y con uno de nosotros (Howells), dio de tales objetos es apropiada la mostró el primer microscopio holoutilización de rayos X blandos, puesto gráfico con resolución superior a la que tienen aproximadamente el poder del microscopio óptico. Usaron un de penetración adecuado. Persiste el ondulador, como fuente de rayos X, interés en el uso de la holografía y detectores de alta resolución, que mediante rayos X, una técnica rela- inicialmente producían hologramas cionada con el método empleado en tras una hora de exposición proporla fabricación de placas zonales, para cionando una resolución promedio en visualizar tales muestras en tres la imagen mejor que 1000 angstrom. dimensiones. Se redujo el tiempo de exposición La holografía tridimensional con a un minuto y mejoró la resolución rayos X requiere una resolución mejor hasta los 600 angstrom, pero la obtenque la actualmente posible. Pero los ción de imágenes tridimensionales microscopistas consiguen imágenes requiere una resolución proxima a la holográficas bidimensionales deta- resolución intrínseca de la resina, lladas. La holografía presenta la unos 100 angstrom para PMMA. característica adicional, como ocurre Cuando los microscopios de rayos X en la microscopía de contacto, de no son una realidad, la atención se diprecisar mecanismo de enfoque. rigió a sus más fructíferas aplicacioLa visualización holográfica fue pro- nes. Se utilizaron microscopios de puesta en 1948 por Dennis Gabor, de rayos X para examinar una amplia la Compañía Británica Thomson variedad de muestras, desde lombriHouston. Se fundamenta en el hecho ces de tierra contaminadas con metade que la radiación electromagnética, les pesados hasta células humanas ya sea en el rango visible o en otros, cancerosas, desde pelos de la epies un fenómeno ondulatorio sujeto a dermis a carbón, dispositivos semiinterferencia, de manera parecida a la conductores o cemento. Gran parte de producida en las ondas en el agua. las investigaciones se centraron en Cuando dos ondas interfieren, las cres- estudiar la capacidad de los microstas de las ondas coinciden en ciertos copios y su aplicabilidad al estudio lugares (reforzándose entre sí), mien- de diferentes clases de muestras. Ante tras que en otros lugares una cresta la corta historia de los microscopios coincide con un valle (cancelándose de rayos X de alta resolución, había entre sí). El resultado neto es un dia- que mostrarse cauteloso a la hora de grama de máximos y mínimos for- juzgar qué aplicaciones pueden o no mado cuando la onda difundida por beneficiarse de su uso. la muestra se combina con el haz oriLos resultados obtenidos con los ginal que iluminó a ésta. Gabor llamó actuales dispositivos de rayos X conholograma a la grabación de este dia- firmaron, como se esperaba, que las grama. Un holograma almacena infor- imágenes de rayos X y las microfotomación sobre la amplitud y la fase de grafías electrónicas de la misma muesla onda difundida, proporcionando tra no se parecen. Los microscopios datos suficientes para reconstruir una de rayos X son sensibles a la conce nimagen de la muestra con caracte- tración de ciertos elementos, a menudo rísticas tridimensionales. carbono y nitrógeno, mientras que los Baez propuso en 1952 un esque- electrónicos suelen recoger la distrima de microscopio holográfico de bución de grupos químicos en la muesrayos X carente de lentes. El diseño tra que se han enlazado con la tintura era conceptualmente sencillo, pero productora del contraste. Ninguna de su realización técnica resultaba muy las dos imágenes es errónea. Sólo ofre-
cen diferentes aspectos de la estructura de la muestra. En general, los microscopios de rayos X y los electrónicos tienen ventajas complementarias. Los segundos hace mucho tiempo que superaron la resolución de los microscopios ópticos y, para muchas muestras, a DIOXIDO DE SILICIO
ALUMINIO
12,5 MICRAS
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A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
SILICIO DOPADO CON BORO
b
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d
N R E K . D , N O S R E D N A . E , T R E B L U H . S , N O S N H O J . E , Z R I K . J , E D A . H
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10. COMPOSICION QUIMICA de una mues tra microfabricada (a) estudiada por Harald Ade y colaboradores usando un microscopio de barrido de fotoelectrones en el que los fo tones de rayos X arrancan electrones provenientes de los átomos cercanos a la superficie de la muestra. Seleccionando energías de electrones característicos asociados con aluminio (b ), silicio (e ) y oxígeno (d ), podemos identificar y situar espacialmente cada elemento. La imagen (e ) permi te apreciar que el silicio que se encuentra ligado al oxígeno formando dióxido de silicio presenta un desplazamiento en energía al compararlo con la energía correspondiente a la del silicio puro. Así podemos identificar dos estados químicos del Si. 43
) a h c e r e d ( E G E L L O
C S ’ G N I K , ) a d r e i u q z i ( N Á R G S I U Q A Y A G N I T O G E D . V I N U A L E D S A T S I P O C S O R C I M O I D A R
11. MICROSCOPIO COMPACTO de visualización (izquierda) desarrollado en las universidades de Gotinga y Aquisgrán que incorpora una fuente de rayos X de plasma; tiene una resolución comprobada de 1000 a 2000 angstrom. La fotografía de la derecha pueden ahora proporcionar resoluciones de entre 2 y 20 angstrom. Por otra parte, la resolución de los microscopios de rayos X usuales es del orden de unos pocos cientos de angstrom, y el límite fundamental impuesto por la difracción (semilongitud de onda) restringe la posibilidad de futuras mejoras. Los microscopios considerados en este artículo, que usan rayos X blandos, nunca alcanzarán resoluciones por encima de los 10-20 angstrom.
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a principal contribución de los microscopios de rayos X no es la de romper barreras en cuanto a resolución, sino la de realizar medidas cuantitativas de objetos biológicos bajo pequeñas o nulas modificaciones, en condiciones muy próximas a las de su estado natural. Tales muestras no se pueden estudiar mediante microscopía electrónica convencional sin producir alteraciones físicas o químicas considerables. En algunos casos, la preparación y la irradiación con rayos X para tomar la imagen parece ser lo suficientemente inocua como para que la muestra pueda responder a la aplicación de ciertos estímulos. En estos casos se puede tomar una secuencia de imágenes que permita estudiar las respuestas o distinguirlas de los efectos producidos por la iluminación mediante el haz de rayos X. Rasgo peculiar de los microscopios de rayos X es que pueden resal44
muestra el microscopio de rayos X de barrido utilizado por el King’s College de Londres. Este instrumento se encuentra situado en la línea del ondulador de la fuente de radiación de sincrotrón de Daresbury en Cheshire.
tar o suprimir la visibilidad de un elemento particular presente en la muestra. Cada elemento absorbe los rayos X de manera distinta. Para los rayos X de longitud de onda entre 23 y 44 angstrom, el oxígeno, y por añadidura el agua, es mucho más transparente que el material orgánico. Este hecho abre la posibilidad de distinguir estructuras a través del agua que forma alrededor de las 3/4 partes de la masa de las células. Esta zona del espectro de los rayos X se denomina ventana del agua; reviste interés en microscopía biológica. La forma en que los rayos X interaccionan con la materia permite a los microscopios de rayos X realizar medidas cuantitativas de la densidad y composición química de una muestra. Para cada elemento existen ciertas energías críticas de los rayos X, los bordes de absorción, en éstas, los rayos X poseen exactamente la energía suficiente como para liberar un electrón. Sólo los rayos X que tengan al menos la energía crítica serán absorbidos con eficacia por cada elemento dado. Se puede aprovechar esta propiedad haciendo imágenes con energías justo por debajo y por encima mismo del borde de absorción. La diferencia entre ambas imágenes elimina la señal que proviene de todos los elementos, excepto la del que tenga su borde de absorción situado a esa energía particular. De esta forma los microscopios de rayos X pueden trazar mapas de la dis-
tribución espacial de un elemento químico sobre la muestra.
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l problema del daño por radiación limita las aplicaciones tanto de la microscopía de rayos X como de la electrónica. Los cambios introducidos por la irradiación pueden ser importantes desde el punto de vista biológico, aun cuando sólo afectaran a una pequeña porción de moléculas de la célula. Por tanto, en imágenes con resolución superior a la óptica de células inicialmente vivas tomadas por medio de cualquier radiación ionizante, siempre pueden aparecer alteraciones significativas a nivel biológico. Como microscopistas, nuestra visión del daño por radiación difiere de la de los biólogos. Nosotros queremos saber el grado de daño producido a la imagen para una resolución dada, con referencia a lo que esperábamos aprender. Por su parte, los biólogos están interesados primordialmente en el daño infligido sobre el organismo y sus diferentes sistemas (por ejemplo, el sistema reproductor). En cualquiera de los dos enfoques, entender la interacción entre la sonda radiativa y las muestras es un problema complejo. Las imágenes de rayos X pueden alcanzar un mejor contraste (relación señal-ruido) con las técnicas de utilización del borde de absorción y, al contrario que las producidas con microscopios electrónicos, no están TEMAS 29
sujetas a distorsión por ciertos efectos de fondo, como la dispersión múltiple de electrones. La limpieza de la señal obtenida con métodos de rayos X permite que la tarea d e tomar imágenes microscópicas se acometa sin producir tanto daño a la muestra como los métodos de visualización basados en electrones u otras partículas cargadas. La utilización de rayos X es compatible con técnicas de visualización rápida (flash), lo que proporciona otro modo de amortiguar los daños por radiación. Estas ventajas, unidas a los modestos logros en la mejora de la resolución de los microscopios de rayos X con respecto a la microscopía electrónica, permiten que los rayos X sean utilizados para estudios de material biológico en su estado natural, sin proteger. En muchos casos los microscopios de rayos X pueden proporcionar imágenes que no están degradadas por el daño por radiación y que poseen una resolución que trasciende la que se puede obtener con el microscopio óptico. Se puede obtener una resolución que supere los límites impuestos por los detectores PMMA. Supongamos, por ejemplo, que el diagrama de difracción de rayos X se mide sin el uso de una onda de referencia, como se hace en cristalografía de rayos X. En un experimento así, el patrón de intensidad de los haces difractados permitiría al investigador deducir la estructura del objeto que ha dispersado los rayos X. La calidad de la resolución que se puede obtener por este método está determinada por el rango de ángulos en que se puedan medir los haces difractados. En el caso extremo, la medida sobre toda la esfera permitiría una completa visualización tridimensional y una resolución del orden de la semilongitud de onda de los rayos X, que para las radiaciones aquí consideradas significaría una resolución de 10 a 20 angstrom. En experimentos iniciados por uno de los autores, Sayre, junto con Kirz, Wenbing Yun, del Laboratorio Nacional de Argonne, y Mark Sharnoff, de la Universidad de Delaware, se tomaron diagramas de difracción registrando la señal hasta 15 grados fuera de eje con respecto al haz incidente; esto corresponde a una resolución en la imagen de 70 angstrom, valor mejorable con un haz de rayos X de mayor coherencia. La microscopía de rayos X se ha abierto camino más allá de las c iencias de la vida hacia la ciencia de superficies y el análisis de trazas quíA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
micas. En ciencia de superficies no se estudian los rayos X, sino los electrones arrancados por ellos de los átomos que están cerca de la superficie de la muestra. La técnica para medir la energía de los electrones liberados, denominada espectroscopía de fotoelectrones, ha entrado ya en un nivel de rutina. Con la combinación de la espectroscopía e imágenes de alta resolución de microscopía de rayos X cabe en principio identificar, y trazar, la distribución de los diferentes elementos, así como determinar su estado de ligadura química cerca de la superficie de la muestra. Ese es el camino para la investigación en superficies heterogéneas, como las de catalizadores y dispositivos semiconductores. Harald Ade, junto con Erik Johnson y Steven L. Hubert, del NSLS, y en colaboración con Anderson, Kern y Kirz, alcanzaron resolución por debajo de la micra. El y sus colegas del NSLS realizaron los análisis químicos antes citados con un microscopio de fotoelectrones basado en la utilización de lentes de placa zonal. Trabajos similares se realizaron en Hamburgo, Stanford, Wisconsin y en otros lugares del mundo.
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ras casi un siglo de investigación, las técnicas de microfabricación han convertido el sueño de un microscopio de rayos X en realidad. Los estudios con rayos X representan una oportunidad valiosa para ampliar el conocimiento humano sobre el mundo natural. Esperamos con optimismo que el progreso en este campo continúe y que las promesas basadas en el uso de estos instrumentos se satisfagan plenamente.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA X-R AY M ICROSCOPY . Dirigido por G. Schmahl y D. Rudolph. Springer-Verlag, 1984. X-R AY M ICROSCOPY II. Dirigido por D. Sayre, M. Howells, J. Kirz y H. Rarback. Springer-Verlag, 1988. X-RAY MICROSCOPY. A. G. Michette en Reports on Progress in Physics, vol. 51, n.o 12, páginas 1525-1606; diciembre de 1988. MODERN MICROSCOPIES: TECHNIQUES AND APPLICATIONS. Dirigido por P. J. Duke y A. G. Michette. Plenum Press, 1990. SOFT X-RAY IMAGING FOR THE LIFE SCIENCES. M. R. Howells en Synchrotron Radiation and Biophysics. Dirigido por S. S. Hasnain. Ellis Horwood, 1990. X-R AY M ICROSCOPY III. Dirigido por A. Michette, G. Morrison y C. Buckley. Springer-Verlag, 1992.
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La física de superficies Los avances de la física de superficies han producido una avalancha de conocimientos, básicos y aplicados, sobre el comportamiento atómico en el universo en dos dimensiones de las superficies sólidas Rodolfo Miranda
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l ser humano se ha sentido aplicaciones más importantes, todasiempre fascinado por la super- vía hoy, de la ciencia de superficies. ficie de las cosas. Es fácil ras- En 1833, Michael Faraday realizó trear en los antiguos testimonios de unos cuidadosos experimentos que le primitivos científicos, como los adi- permitieron adelantar una explicavinos sumerios o los alquimistas me- ción del misterioso efecto que prodievales, su preocupación por enten- ducía el platino sobre la reacción entre der el papel de las superficies en el el hidrógeno y el oxígeno, induciéncomportamiento cotidiano de las co- dola a temperaturas muy inferiores sas. En el Museo Británico de Lon- a la de combustión. Faraday sentó dres se guarda lo que probablemente así los fundamentos de nuestra comconstituye la prueba escrita más anti- prensión actual de la acción catalígua de esta atávica curiosidad: una tica de las superficies sólidas. En tablilla de la época de Hammurabi, 1873, Karl Ferdinand Braun observó, en la que se encuentra, grabada en por su parte, que la unión entre una escritura cuneiforme, una descrip- punta afilada metálica y cristales ción detallada de las formas cam- de semiconductores compuestos (el biantes de la interfase entre aceite y sulfuro de hierro o plomo) presentaagua que los adivinos sumerios uti- ba propiedades rectificadoras, esto lizaban para predecir el curso futuro es, que la corriente eléctrica circulade campañas guerreras u operacio- ba mejor en una dirección que en la nes comerciales. opuesta. El joven Braun (tenía 24 años Las aplicaciones prácticas de este en ese momento) atribuyó ese comconocimiento empírico son, asimismo, portamiento a la existencia de una antiguas. Ya Plinio describió, con capa delgada en la interfase entre todo pormenor, cómo calmar las olas ambos materiales. Este descubridel mar arrojando pequeñas canti- miento es la base de los diodos y trandades de aceite sobre su superficie. sistores presentes en toda la elecLos primeros ensayos sistemáticos trónica moderna. Braun recibió el que señalaban la importancia de los premio Nobel de física en 1909, junto tratamientos superficiales estaban con Marconi, por el desarrollo de los relacionados con la orfebrería, como rectificadores de estado sólido que la relatada en el manuscrito De pr o- condujo a la telegrafía sin hilos. prie tatibus rerum, redactado aproxi Ya en nuestro siglo se produjeron dos madamente en 1252: “Si se desea unir avances importantísimos en el derígidamente una placa de oro con otra sarrollo de la física de superficies, Phide plata, antes de golpearlas con el lip Lenard puso a punto técnicas esmartillo, debe uno precaverse contra pectroscópicas que aprovechaban el el viento, el polvo y la humedad, por- efecto fotoeléctrico (descubierto por que si alguna de estas tres cosas se Hertz en 1887 y cuya explicación le introdujera entre el oro y la plata, no valió a Einstein el premio Nobel en se podrá juntarlas”. 1921) y Clinton Davisson descubrió la En el curso del enorme avance cien- difracción de electrones (por lo que fue tífico que tuvo lugar en el siglo pasado galardonado con el Nobel en 1937). se pusieron las bases para dos de las Ambos fenómenos están relacionados 46
con notables propiedades de la superficie, como ya sus respectivos descubridores observaron. De hecho, hoy en día, constituyen el fundamento de dos técnicas habituales para determinar la estructura electrónica y geométrica, respectivamente, de las superficies: la espectroscopía de fotoelectrones y la difracción de electrones de baja energía [véase “Estructuras atómicas de superficies sólidas”, por P. M. Echenique y M. H. van Hove; I NVESTIGACIÓN Y CIENCIA , abril de 1979]. Sin embargo, es Irving Langmuir, ilustre físico estadounidense que recibió el premio Nobel en 1932, el que es considerado padre de la física de superficies moderna. En efecto, en las décadas entre las dos guerras mundiales, Langmuir realizó una ingente labor creando los métodos experimentales de alto vacío, los cuales le permitieron abordar problemas básicos, como la reducción en la función de trabajo producida por la absorción de metales alcalinos sobre superficies metálicas, la emisión termoiónica o los mecanismos de quimisorción. Sus amplios intereses científicos le llevaron a brillantes aplicaciones de sus descubrimientos, como las lámparas incandescentes de atmósfera inerte, básicamente idénticas a las que se emplean hoy en día. Suya es la principal responsabilidad de haber elevado la física de superficies a la categoría de disciplina con entidad propia.
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i éste fue el nacimiento de la especialidad, el acontecimiento decisivo que desencadenó un enorme interés por la física fundamental de las superficies de semiconductores recayó en el descubrimiento del transistor de contacto puntual por Bardeen y TEMAS 29
1. NUESTRA APRECIACION de la estructura superficial se modifica drásticamente al observarla a magnificaciones crecientes. Los científicos han desarrollado continuamente instrumentos que nos permiten observar las superficies que nos rodean con un nivel de detalle cada vez mayor. Toda una generación de microscopios han sido los responsables fundamentales de es ta tarea. Una oblea de silicio monocristalina (arriba), utilizada en la industria microelec trónica, presenta a simple vista el aspecto de un espejo perfecto. En el microscopio electrónico de barrido, la superficie de un monocristal de semiconductor (centro ) es una sucesión de terrazas planas de varias micras de tamaño promedio. Por fin, el microscopio de efecto túnel, el más exquisito de los microscopios disponibles, nos mues tra a la escala atómica los detalles estruc turales de una superficie de un monocristal metálico (abajo ) que ha sido recubierta con una sola capa atómica de azufre. En esta imagen se observa una colección asombrosamente regular de átomos. A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
) o j a b a ( M A U S A L , A G R A P E D Z E U Q Z A V . L O E D A M A , ) o r t n e c y a b i r r a ( M I N E C , Z E Ñ A B I N I U Q A O J
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la existencia de campanas de vacío comerciales, en las que, por primera vez, era posible limpiar la superficie y mantenerla en condiciones controladas. En 1969 Harris introdujo la espectroscopía de electrones Auger, que permite determinar la composición química de una superficie con una sensibilidad del orden del 1 por ciento de una capa atómica.
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esde la década de los setenta, la física de superficies ha emergido como un ejemplo emblemático de revolución científica según el conocido arquetipo de Thomas Kuhn, historiador de la ciencia. El cambio en nuestra visión del mundo que comporta toda revolución científica es, en este caso, la aparición de la región material de la interfase entre dos medios como una entidad autónoma. Un es2. SISTEMA DE ULTRAALTO VACIO (UAV) típico. Una serie de bombas de vacío eliminan las tado de la materia con sus propias moléculas del ambiente hasta conseguir una presión en el interior de la campana del or- leyes, composición química, estrucden de 10–13 atmósferas (equivalente a la presión en la superficie de la Luna) de modo que tura geométrica, estados electrónila superficie de la muestra pueda ser mantenida limpia durante el tiempo necesario para cos y dinámica atómica. Este cambio realizar los experimentos. conceptual ha ido acompañado en la década de los ochenta por un altísimo refinamiento de las técnicas experiBrattain, seguido por el del transis- ción de los fenómenos en la unión mentales y un número creciente de tor de unión p- n por Shockley en metal-semiconductor, Nicolás Cabre- investigadores dedicados a ella, por diciembre de 1947. En la posguerra, ra, entonces en la Universidad de la realización de cuantiosas inveratraídos por la indudable importan- Bristol, con la ayuda de su colabora- siones y por la proliferación de especia de las aplicaciones prácticas, los dor W. K. Burton, elaboró en 1949 una cialidades científicas (física de la físicos teóricos del estado sólido tra- teoría refinada del crecimiento cris- materia condensada, ciencia de matetaron de comprender las propieda- talino, todavía utilizada. Pero fue, riales, microelectrónica, optoelecdes de las superficies de los sólidos. sin duda, el desarrollo técnico deri- trónica, catálisis, quimicofísica, elec Así, mientras Nevill Mott (premio vado de la carrera espacial lo que troquímica, etcétera) que se han visto Nobel en 1977) sugería una explica- posibilitó en la década de los sesenta enriquecidas por los desarrollos recientes de la física de superficies. Pero, ¿qué es una superficie? Entre dos medios cualesquiera (sólido-gas, sólido-líquido, sólido-sólido, etcétera) siempre existe una zona superficial o interfacial que los separa. Esta región tiene propiedades mecánicas, de composición o electrónicas distinguibles de los medios que la flanquean. El espesor de la zona que debemos considerar superficie o interfase depende del tipo de propiedades a que nos estemos refiriendo. A veces puede ser estrictamente una sola capa atómica, mientras que en otras ocasiones puede extenderse decenas o incluso cientos de capas. Si nos ce ñimos a la interfase sólido-vacío, de la que poseemos mayor información en la actualidad, es sabido que tanto la disposición geométrica de los átomos de la superficie del sólido como los estados electrónicos pueden diferir notablemente de los del volumen. La 3. MODELO SIMPLIFICADO de una superficie cristalina. En ella pueden encontrarse dis- región de la superficie puede tener tintos tipos de defectos: átomos que faltan (vacantes), escalones de altura atómica que una composición química distinta de flanquean las terrazas planas de tamaño irregular y pequeñas islas en las terrazas. Hay, la del interior del sólido. La superfiademás, átomos y moléculas de contaminantes que se encuentran adsorbidas en la su- cie expuesta a la atmósfera, por ejemplo, está cubierta por capas de conperficie o que están incorporados a la misma.
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taminación debido a las reacciones con los gases y vapores de ésta. Normalmente se forman óxidos y a menudo sulfuros, carbonatos u otros compuestos, según sean el substrato y el ambiente. Además, la superficie puede presentar trazas de materiales que han estado en contacto previo con ella. Así, una superficie ordinaria, aunque esté limpia a simple vista, es, en realidad, un complejo sistema de componentes químicos y restos de impurezas. Por ello, se acostumbra distinguir las superficies “reales” de las “ideales”, atómicamente limpias, en el sentido de no tener material extraño adherido a ellas.
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a naturaleza de las superficies reales reviste un enorme interés práctico. La mayoría de las aplicaciones en que están comprometidas las superficies (lubricación, corrosión o rozamiento) requieren una comprensión de las propiedades de las superficies reales. Con este fin se han desarrollado múltiples métodos no destructivos de análisis químico que permiten obtener la composición ató- 4. EN UN MICROSCOPIO AUGER DE BARRIDO se pueden obtener mapas de composición mica de la superficie de un material química de la superficie de una muestra con excelente resolución lateral. En la figura se sólido con alta resolución lateral muestra la superficie de una oblea monocristalina de silicio, de las empleadas usualmen(véase la figura 4). te en la industria microelectrónica, sobre la que se han evaporado partículas de oro. Se Sin embargo, la explosión de acti- presentan imágenes de la distribución lateral de oro, oxígeno y silicio, así como la imagen vidad en la física de superficies regis- conjunta. Los aglomerados de oro aparecen en la imagen superior derecha como islas britrada desde los años setenta ha tenido llantes. En la imagen inferior derecha se observa una acumulación de oxígeno en las procomo objetivo fundamental el estu- ximidades de las islas de oro, probablemente como resultado de la acción catalítica de esdio de superficies monocristalinas y te metal sobre la oxidación del silicio. atómicamente limpias. ¿Por qué se estudian estas superficies casi ideales? ¿Por qué se ha desarrollado para nuestros modelos teóricos con la rea- mos cuyo papel se desee determinar. ello un amplio abanico de técnicas lidad exterior. En los últimos años, Esto se consigue trabajando en conexperimentales de refinada comple- la física en dos dimensiones nos ha diciones de ultraalto vacío ( UAV ), don jidad? En primer lugar, porque nues- deparado ya algunos descubrimien- de la muestra pueda ser limpiada tra capacidad para preparar super- tos inesperados; entre otros, la natu- adecuadamente y mantenida en este ficies altamente perfectas ha abierto raleza especial de la fusión superfi- estado el tiempo suficiente para reala posibilidad de explorar un universo cial o el efecto Hall cuántico, por el lizar los experimentos planeados. en dos dimensione s . Esto es algo fas- cual Klaus von Klitzing recibió el pre- Habitualmente, la presión necesaria cinante. Según se cree hoy, la dimen- mio Nobel en 1985. es muy reducida, del orden de 10 –13 sionalidad desempeña un papel clave Si sólo fuera ésa la razón para estu- atmósferas, equivalente a la presión en la teoría moderna de muchos fenó- diar superficies de sólidos, nuestra en la superficie de la Luna, y se conmenos colectivos. Por ejemplo, en una especialidad no habría pasado de ser sigue bombeando con una variedad transición de fase continua el com- una curiosidad académica. La razón de dispositivos un recipiente de acero portamiento crítico depende sólo de fundamental del florecimiento de la inoxidable con ventanas y puertas la simetría del sistema, la dimensio- física de superficies reside en su utili- removibles. La limpieza de la muesnalidad del parámetro de orden y la dad práctica en algunos campos tec- tra una vez en UAV se consigue por dimensionalidad del espacio. Esta nológicos de primerísima importancia bombardeo iónico con un gas noble o propiedad se llama universalidad y económica como la microelectrónica, por rotura en vacío. sugiere que pueden suceder cosas la catálisis, los tratamientos superinteresantes en la superficie donde ficiales por implantación iónica o láser etengámonos en las reconstrucla dimensionalidad efectiva es dos, no y la ingeniería atómica de materiaciones superficiales. Lo mismo tres. De hecho, gracias al método del les que permite la fabricación de mate- la posición geométrica de los átomos, grupo de renormalización [ véase “Pro- riales artificiales con propiedades que la distribución energética de los blemas físicos con muchas escalas de ajustadas a nuestros deseos. estados electrónicos en las proximiNVES Para avanzar en nuestro conocidades de la superficie de un cristal, longitud”, por Kenneth Wilson; I TIGACIÓN Y CIENCIA , octubre de 1979], miento de estos complejos procesos, difieren, en general, de su posición y es posible calcular con exactitud los conviene comenzar con una superfi- distribución en el interior del voluexponentes críticos en transiciones de cie ideal y depositar sobre ella, de un men. Débese ello a la rotura de la fase bidimensionales y comparar modo controlado, las impurezas o áto- simetría y a la distinta coordinación
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una superficie semiconductora pueden modificarse depositando átomos de otra especie química sobre ella. Así, al adsorber media monocapa de un metal alcalino , como potasio o cesio, sobre la cara (100) de silicio, se produce una drástica disminución de la función de trabajo. Este fenómeno es esencial para la construcción de detectores de radiación electromagnética en la región de los infrarrojos.
O I S N E S A . C . M Y L E H C I M . G . E , Z E R A V L A . J
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os detectores ópticos han constituido un área de investigación privilegiada ya desde la época de Langmuir. Un detector eficiente de radiación infrarroja es el corazón de RAYOS X cualquier sistema de visión nocturna, X1/2 de detección de tumores o de astronomía infrarroja. Puede fabricarse un detector semejante mediante un SiO2 Si X1/2 substrato semiconductor (silicio o ar106 104 102 100 98 96 seniuro de galio) en el cual se ha hecho ENERGIA DE ENLACE (eV) disminuir la función de trabajo por evaporación de óxidos de metales alcalinos sobre su superficie. La disminución debe ser tal que el nivel de energía del vacío en el exterior de la 106 104 102 100 98 96 superficie se encuentre por debajo de ENERGIA DE ENLACE (eV) la banda de conducción en el volumen. Esto es lo que se conoce como afini5. ESPECTROS DE FOTOEMISION con rayos X del nivel 2p de silicio. El espectro de la parte dad electrónica negativa ( AEN ). En inferior izquierda corresponde al óxido que crece espontáneamente al exponer un cristal de estas condiciones, un fotón de enersilicio a la atmósfera (óxido nativo). El de la parte superior izquierda, a un óxido térmico cre- gía mayor que el intervalo prohibido cido por el procedimiento habitual en la industria. El pico a mayor energía de ligadura se ori- del semiconductor produce, al ser gina en átomos de silicio ligados químicamente a oxígeno, mientras que el de la derecha re- absorbido por el material, un par elecfleja silicio unido a silicio. La distancia en energía entre ambos picos indica que la composición trón-hueco. Los electrones pueden química del óxido es SiO2. La altura relativa de ambos picos indica el espesor del óxido en emitirse al exterior del dispositivo. cada caso. El panel de la izquierda muestra el proceso de crecimiento de un óxido de silicio De este modo, se transforma la ramediante oxidación catalítica promovida por potasio. Los datos prueban que el óxido así pre- diación infrarroja en corriente elécparado tiene una composición química idéntica al industrial. Los espectros han sido obteni- trica, que puede luego manipularse dos por J. Alvarez, E. G. Michel y M. C. Asensio en el LASUANI. de manera conveniente hasta resultar en la imagen visible de la fuente de radiación (véase la figura 8). de los átomos de la superficie con res- encuentran en la superficie se desEn el curso de una investigación pecto a los del volumen. Si nos ima- plazan bastante de las posiciones destinada a aclarar la estructura ginamos un cristal metálico como un equivalentes a las que ocuparían en microscópica de estos fotocátodos, conjunto de bolas de acero unidas con el volumen. En el caso de la superfi- Eva Oellig y Enrique G. Michel, entonmuelles y cortamos éstos a lo largo cie (100) del silicio, los átomos se jun- ces estudiantes de doctorado del labode un plano para formar una super- tan de dos en dos formando dímeros, ratorio de física de superficies de la ficie, no es difícil entender intuiti- lo cual reduce a la mitad el número Universidad Autónoma de Madrid vamente que los átomos de la super- de enlaces insatisfechos. Los enlaces (LASUAM), demostraron que los meficie puedan moverse con respecto a no satisfechos que quedan forman tales alcalinos actuaban como catalas posiciones de equilibrio del volu- estados electrónicos de superficie den- lizadores de la oxidación de semimen, ya que ahora no tienen vecinos tro del intervalo prohibido de ener- conductores, acelerando la cinética y hacia el exterior del cristal. Los cam- gías del semiconductor ( véase la figu- haciendo disminuir la temperatura bios estructurales que ocurren en la ra 6 ). Estos estados de superficie del proceso. Los átomos del catalizaregión superficial pueden implicar a acumulan carga eléctrica e influyen dor podían, además, eliminarse por varias capas atómicas. Se dice que la en el funcionamiento de los d isposi- completo de la superficie mediante un superficie se ha reconstruido. tivos electrónicos. Son, entre otras breve calentamiento a temperatura Este efecto se produce también en cosas, los responsables del fenómeno moderada. Esto ha sugerido la posilas superficies de los semiconducto- de fijación (“pinning”) del nivel de ble aplicación práctica de este nuevo res, aunque por distintas razones. Al Fermi, esto es, la independencia de la método para la producción de óxidos cortar un cristal de un semiconduc- función de trabajo (mínima energía de puerta de espesor controlado en tor para formar una superficie, apa- requerida para extraer un electrón del las próximas generaciones de disporecen enlaces direccionales rotos, que cristal) del silicio con respecto al ni- sitivos microelectrónicos. Para ello, representan una enorme energía. vel de dopado del volumen. es necesario comprobar la composiPara rebajarla, los átomos que se Las propiedades electrónicas de ción y microestructura de los óxidos 106 104 102 100 98 96 ENERGIA DE ENLACE (eV)
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de silicio así producidos y compararlos con los desarrollados por los métodos habituales en la industria. La composición química de estos óxidos, como la de cualquier muestra sólida, puede ser objeto de análisis por espectroscopía de fotoelectrones. En esta técnica, heredera directa del efecto fotoeléctrico, se envía un haz monocromático de rayos X (por ejemplo, la radiación Mg K α con una energía de 1253,6 electronvolt) sobre la muestra, donde arranca electrones de los niveles electrónicos profundos. La energía cinética de los fotoelectrones es la diferencia entre la energía de los fotones y la energía de ligadura de los electrones en el sólido. Estas son características del elemento químico al que pertenece el electrón y de su estado químico. Por tanto, midiendo la energía de los fotoelectrones emitidos al vacío se obtiene un espectro con picos a ciertas energías, cuyas alturas relativas reflejan la composición de la muestra analizada. En el caso que nos ocupa, el óxido de silicio producido por oxidación catalítica tiene una composición química (SiO 2) idéntica a la del óxido térmico preparado a alta temperatura en atmósfera de oxígeno. El microscopio de efecto túnel ( STM), inventado por Binnig y Rohrer (por lo que fueron galardonados con el premio Nobel en 1985) nos ofrece una visión sorprendente de la microestructura de los óxidos preparados por oxidación catalítica. La imagen de la figura 7, tomada por Amadeo L. Vázquez de Parga y Carmen Ocal, sugiere que el óxido de silicio catalítico ha crecido a través de una reacción química de estado sólido entre los óxidos del metal alcalino y el substrato de silicio. La reacción de transferencia del oxígeno entre el metal alcalino y el cristal semiconductor tiene un fuerte carácter local, que da lugar a la aparición de los aglomerados circulares visibles en la imagen del STM . Como consecuencia inesperada del esfuerzo realizado para controlar la activación de fotocátodos, se han hecho recientemente avances muy importantes en nuestra comprensión del proceso de formación de la barrera Schottky en la interfase metal-semiconductor. Esta barrera energética es responsable de la actividad rectificadora de la unión metal-semiconductor descubierta por K. F. Braun hace más de un siglo. La explicación microscópica de la formación de la barrera Schottky se había convertido en una piedra de toque para la física de superficies. En efecto, las pruebas A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
SEMICONDUCTOR
Evac Esup c Ø
Evol c EF
– – – ESTADOS DE SUPERFICIE Esup v +
L L E U G N I M N O G A R A O I N O T N A Y A D N A R I M . R
+ +
Evol v
VACIO
6. LA ENERGIA POTENCIAL DE UN ELECTRON en un semiconductor presenta un intervalo prohibido, donde no existen estados cuánticos permitidos para el electrón. En la figura se indican los bordes de la banda de valencia y de conducción de un semiconductor dopado con impurezas que introducen electrones (tipo n ), así como el nivel de Fermi. La posición de és te en el volumen puede modificarse a voluntad cambiando el dopaje. La presencia de estados electrónicos de superficie en la zona prohibida de energía modifica la distribución de carga. La carga acumulada en estos estados se origina en la zona de vaciado que se extiende hacia el interior del cristal. Como resultado de esta transferencia de carga, las bandas elec trónicas se curvan cerca de la superficie y el nivel de Fermi queda fijado en el centro de la región prohibida. Al variar el dopaje en el volumen, cambia la curvatura de las bandas pero no la posición del nivel de Fermi en la zona prohibida. La función de trabajo (distancia entre el nivel de Fermi y el de vacío) es independiente del dopaje volúmico.
L A C O N E M R A C Y A G R A P E D Z E U Q Z A V . L O E D A M A
7. EL MICROSCOPIO DE EFECTO TUNEL (STM) muestra sorprendentes diferencias entre dos óxidos crecidos sobre una oblea de silicio. Los óxidos tienen el mismo espesor promedio medido por espectroscopía Auger. Ambos no presentan, además, diferencia alguna con respecto a otros contaminantes. La imagen de la izquierda corresponde a un óxido nativo. El otro ha sido preparado mediante oxidación catalítica del silicio a través de un método desarrollado en el laboratorio del autor que consiste en evaporar potasio sobre el substrato, exponer a oxígeno y calentar brevemente el cristal de silicio dentro del sistema de vacío. En tan to que el óxido nativo reproduce, básicamente, la estructura de terrazas del substrato monocristalino, el óxido catalítico presenta un aspecto de núcleos redondeados de unos 50 angstrom de tamaño promedio, propio de una reacción química local. 51
L L E U G N I M N O G A R A O I N O T N A Y A D N A R I M O F L O D O R
Evol c
–
–
Evac
h ν ØB EF Evol v
– – –
+
MIGS
VACIO
Cs+O2+Cs
GaAs TIPO p
8. ORIGEN DE LA BARRERA SCHOTTKY. Algunas superficies de semiconductores , como la cara (110) del AsGa, no tienen estados electrónicos de superficie en la zona prohibida. En este caso las bandas electrónicas son planas hasta la superficie. Al depositar una capa de cesio metálico sobre la superficie, la función de onda de los electrones deslocalizados del metal se extiende al interior de la zona prohibida del semiconductor. Así se inducen estados electrónicos denominados MIGS (siglas de “Metal Induced Gap States”) que fijan el nivel de Fermi aproximadamente en el centro de la zona prohibida con independencia del tipo de dopaje volúmico. Las bandas del semiconductor quedan curvadas, dando origen a una barrera energética para el transporte de carga entre semiconductor y metal que se conoce como barrera Schottky, φB. Si depositamos un aislante que no tenga niveles elec trónicos en ese rango de energías, por ejemplo, óxido de cesio, no aparecen estados en la región prohibida. El nivel de Fermi queda libre dentro del intervalo, “gap” y su posición depende ahora del tipo de dopaje. Una nueva evaporación d e cesio sobre la muestra devuelve el carácter metálico a la interfase, fijando de nuevo el nivel de Fermi en el centro de la zona prohibida y curvando las bandas. La figura ilustra el principio de funcionamiento de un fotocátodo sensible al infrarrojo. experimentales indicaban que una sola capa atómica de metal depositada sobre la superficie del semiconductor bastaba para producir la misma barrera Schottky encontrada en los diodos y dispositivos comerciales. Los investigadores habían concluido que, en la interfase, había unos estados electrónicos, localizados en el intervalo de energía, en el interior de la zona prohibida del semiconductor; éstos fijaban la posición energética del nivel de Fermi, determinando así la altura de la barrera. Ahora bien, ¿cuál era el origen de estos estados? Un largo contencioso se había estado desarrollando entre dos escuelas de pensamiento. Una de ellas, representada por Bill Spicer, de la Universidad de Stanford, consideraba que los estados que fijaban la posición del nivel de Fermi estaban producidos por defectos introducidos en el substrato durante la deposición del metal. La otra escuela se originó en una idea de Volker Heine, de la Universidad de Cambridge, desarrollada y perfeccionada por Fer52
nando Flores, de la UAM . Esta proponía que el simple hecho de tener un metal en contacto con un semiconductor inducía estados electrónicos en el intervalo de energía prohibido. El carácter metálico de la capa absorbida sería, por tanto, determinante.
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n elegante experimento diseñado y realizado por José Enrique Ortega, del LASUAM , en colaboración con Clemens Laubschat, Mario Priestch y Gunter Kaindl, del centro de radiación de sincrotrón BESSY en Berlín, ha arrojado luz sobre la cuestión debatida. Para evitar la formación de defectos, era preciso asegurarse de que la adsorción del metal no dañaba la red del semiconductor; para comprobar el papel de la metalicidad, se requería una capa depositada cuyo carácter metálico pudiera encenderse y apagarse a voluntad. La primera condición se conseguía evaporando cesio a baja temperatura sobre arseniuro de galio; la segunda, adsorbiendo oxígeno sobre la capa metálica, lo que producía óxidos de cesio
de carácter aislante. Los resultados experimentales demostraron que, si bien la presencia de defectos en suficiente densidad podía fijar el nivel de Fermi, éstos no eran necesarios en absoluto para explicar lo que ocurría. El carácter metálico de la capa depositada sobre la superficie semiconductora perfecta era, de hecho, la condición básica requerida. La mayoría de los semiconductores usados en la tecnología moderna son, de hecho, monocristales, razón por la cual la aplicación directa de los descubrimientos de la física básica de superficies resulta casi inmediata. En cambio, la mayoría de los metales de uso cotidiano, desde un tenedor hasta las pistas de metalización de un circuito integrado, son policristales: sus superficies están constituidas, pues, por una variedad de planos cristalinos. A pesar de ello, los investigadores han conseguido desarrollar (“crecer” en el argot) en los laboratorios monocristales metálicos y cortarlos adecuadamente para exponer una sola cara cristalina. La información obtenida de este modo es crucial para comprender el funcionamiento de las superficies reales, incluso en propiedades tan comple jas como la actividad catalítica. Los catalizadores de reacciones heterogéneas están compuestos por pequeños aglomerados metálicos dispersados, para aumentar su superficie, sobre substratos de alúmina o zeolita. En la práctica, los catalizadores son “promovidos” por aditivos que contienen metales alcalinos, especialmente potasio, con el fin de mejorar la selectividad o la reactividad del catalizador. Entre los ejemplos bien conocidos de reacciones así catalizadas citaremos la síntesis FischerTropsch de hidrocarburos a partir de mezclas de CO y H 2, o la eliminación del CO y NO de los gases de los tubos de escape de los automóviles. El papel exacto de los promotores alcalinos ha sido muy debatido en los últimos años. Las técnicas de la física de superficies han hecho algunas importantes aportaciones a nuestra comprensión de los procesos catalíticos. En un trabajo del autor en colaboración con el grupo de Gerhard Ertl, entonces en la Universidad de Munich, se ha desarrollado un método para determinar la orientación de moléculas quimisorbidas sobre substratos metálicos. Para ello es necesario emplear las propiedades únicas de la radiación de sincrotrón [véase “La radiación de sincrotrón” por Herman Winick; I NVESTIGACIÓN Y C IENCIA , enero de 1988]; en particuTEMAS 29
lar, el hecho de que esta radiación se los apropiadamente. Recientemente, de átomos que se han depositado. halle totalmente polarizada en el siguiendo una sugerencia de Félix Cuando el cristal del substrato se ha plano de la órbita de los electrones. Ynduráin, de la UAM , que ha calcu- preparado de una manera cuidadosa, Al enviar fotones de una energía dada lado que la interacción electrónica es posible desarrollar capas bidisobre la muestra, se extraen elec- entre cobalto y cobre es extremada- mensionales de alta perfección estructrones de cada uno de los orbitales mente pequeña, se ha realizado este tural. Así, Juan José de Miguel, del moleculares accesibles. Estos fo- experimento desarrollando epita- LASUAM, en un trabajo conjunto con toelectrones son colectados por un xialmente películas de un material el grupo de J. Kirschner, de la Unianalizador bidimensional que mide magnético (cobalto) sobre un subs- versidad Libre de Berlín, ha detercuántos electrones de cierta energía trato monocristalino de un material minado la temperatura de Curie de cinética se emiten en cada dirección no magnético (cobre). capas ultradelgadas de cobalto de esdel espacio. El número de capas atómicas depo- pesor variable crecidas epitaxialsitadas sobre el substrato se puede mente sobre cobre. Han obtenido unos as reglas cuánticas de selección determinar con precisión exquisita, resultados sorprendentes. La temobligan a que el estado inicial y midiendo la intensidad reflejada de peratura de Curie de películas delfinal del proceso de fotoemisión ten- un haz de átomos de helio que se hace gadas es mucho menor que la del gan una simetría adecuada. Supon- incidir sobre la superficie del cristal, material masivo y, además, varía nogamos una molécula con un eje de si- mientras éste está creciendo. La téc- tablemente con el espesor evaporado. metría (como el monóxido de carbono, nica se muestra extraordinariamente Se necesitan de cinco a seis capas de CO), adsorbida perpendicularmente sensible al orden superficial, ya que átomos para alcanzar la temperatura a la superficie. En ese caso, no se emi- los átomos de helio, al ser neutros, de Curie del volumen. Más sorprentirían fotoelectrones, desde los orbi- no pueden penetrar dentro de la dente aún es el hecho de que una tales moleculares, a lo largo de las superficie y rebotan como bolas de extrapolación lineal de los datos exdirecciones espaciales correspon- billar sobre ella. La intensidad refle- perimentales sugiera que la temdientes al plano perpendicular al vec- jada oscila durante la evaporación, peratura de Curie de una sola capa tor campo eléctrico de la radiación siendo máxima cuando se completa atómica de cobalto sea de cero graincidente. Así se ha determinado que una capa atómica y mínima justo dos Kelvin; esto es, una capa estricel monóxido de carbono se adsorbe cuando se ha depositado media mono- tamente bidimensional no presencon su eje C–O perpendicular a la capa. Basta, pues, contar las oscila- taría orden magnético a ninguna superficie de un cristal de paladio lim- ciones para saber el número de capas temperatura finita. pio. Al depositar potasio sobre la superficie del paladio, las moléculas de CO adsorbidas en las proximidaNUMERO DE CAPAS 1,0 0,4 des de los átomos del promotor se DEPOSITADAS encuentran notablemente inclinadas con su eje formando un ángulo de más de 20 grados con respecto a la normal a la superficie. Estos resultados indican que el papel de los promotores podría ser el de inclinar el eje interatómico de las moléculas adsorbidas, lo cual alarga su distancia internuclear, debilita su enlace y facilita su disociación. Como hemos mencionado antes, cabe esperar que las propiedades co 0 I lectivas (superconductividad, magne / I A 1,0 tismo) de la superficie difieran bastan D A te de las mismas en el volumen. J E L Una de las magnitudes que definen F E las propied ades magnéticas de un só R lido es la temperatura de Curie, T c. D A D Por encima de ella, el material deja I S de comportarse como un imán, esto N E 0,5 T es, la magnetización se hace cero. La N I 0 1 2 temperatura de Curie puede medirse experimentalmente determinando a qué temperatura desaparece el ciclo 9. OSCILACIONES DE LA INTENSIDAD DEL HAZ ESPECULAR de átomos de helio reflej ado por de histéresis característico de un la superficie de un cristal de cobre durante su crecimiento a partir de un vapor de átomos de material ferromagnético. Es posible cobre. El crecimiento del cristal se lleva a cabo por evaporación térmica de cobre sobre el explorar el efecto de la dimensiona- substrato mediante epitaxia de haces moleculares. Las oscilaciones reflejan la perfección lidad en el comportamiento magné- estructural del cristal durante el proceso de crecimiento epitaxial. Cuanto mayor es el orden, tico estudiando las propiedades, por mayor es la intensidad reflejada por la superficie. Dependiendo de la temperatura del subsejemplo la temperatura de Curie, de trato, el cristal crece por propagación de sus escalones naturales (en cuyo caso la intensicapas muy delgadas de material ferro- dad reflejada no oscila) o por nucleación de islas bidimensionales sobre las terrazas. Este magnético en función de su espesor. modo de crecimiento, propuesto por Cabrera y Burton en 1949, ha sido confirmado por los Para ello es preciso seleccionar los datos de dispersión de átomos de helio y por simulaciones de Monte Carlo realizadas por Jumateriales adecuados y preparar- lio Ferrón y José M. Gallego, del laboratorio de superficies de la UAM.
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L L E U G N I M N O G A R A O I N O T N A Y ) M A U S A L ( O G E L L A G . M E S O J Y N O R R E F O I L U J
A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
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Estos resultados nos han permitido explorar un terreno de gran interés práctico. En efecto, la industria que utiliza el almacenamiento magnético de información demanda el desarrollo de soportes materiales que puedan contener cada vez mayor cantidad de información. En particular, sería muy conveniente poder almacenar información magnética en tres dimensiones. Para ello deberíamos disponer de nuevos materiales con alta anisotropía estructural y magnética [ véase “Materiales electrónicos y magnéticos” por Prahaven Chaudhari, INVESTIGACIÓN Y CIENCIA , diciembre de 1986]. Una estrategia extendida en la actualidad consiste en desarrollar, en condiciones de ultraalto vacío, cristales sintéticos de periodicidad artificial: las superredes. Una superr ed metálica está formada por capas delgadas alternadas de dos metales A y B, de distintas propiedades. En el caso que nos ocupa, A se10. ORIENTACION de moléculas adsorbidas; puede ser determinada experimentalmente uti- ría un material magnético y B un melizando las reglas de selección que gobiernan el proceso de fotoemisión desde orbitales mo- tal no magnético. Los átomos de leculares de simetría bien definida. Las moléculas de monóxido de carbono se adsorben per- ambos metales se evaporan cuidapendicularmente a la superficie en un metal limpio, con el átomo de carbono cerca de la dosamente sobre un soporte elegido, superficie. Las moléculas adsorbidas se inclinan fuera de lo normal en las proximidades de para que el crecimiento de ambos sea átomos de metales alcalinos (representados por la bola azul en la figura) como resultado epitaxial y sus periodicidades vertide interacciones electrostáticas de corto alcance. Esta modificación parece ser un paso in- cales bien definidas. De este modo, termedio crucial en el proceso de rotura catalítica de la molécula. se consigue desarrollar cristales con las periodicidades deseadas de fases que no existen en la naturaleza o que son metaestables. La exploración de Co/Cu (100) las propiedades magnéticas de estos nuevos materiales no ha hecho más 1400 que comenzar, y ya nos ha suminisTc VOLUMEN ) trado varias sorpresas, indicio de que N I V algo excitante se esconde en la natu L 1200 E raleza cuando nuestro control sobre K M S ella alcanza este nivel de refina O D 1000 miento. A
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RECUBRIMIENTO DE COBALTO (CAPAS ATOMICAS)
11. LA TEMPERATURA DE CURIE, Tc, de películas delgadas epitaxiales de cobalto crecidas sobre un substrato monocristalino de cobre depende muy fuertemente del espesor de la capa de cobalto. Como muestra la figura, el valor experimental de Tc se ha determinado comprobando a qué temperatura desaparece el ciclo de histéresis característico de un material ferromagnético. Nótese que la extrapolación de los datos indica que tan sólo son necesarias entre cinco y seis capas atómicas para que la película de cobalto se comporte como el volumen. Por otro lado, la extrapolación sugiere que una sola capa atómica de cobalto podría no presentar orden magnético a ninguna temperatura finita. 54
n un esfuerzo reciente del laboratorio de superficies de la UAM , A. Cebollada y J. M. Gallego han desarrollado multicapas cristalinas de cobalto/cobre por evaporación alternada sobre la cara (100) de monocristales de cobre. El espesor de cobalto repetido periódicamente ha superado siempre la cifra de seis capas atómicas, de suerte que cada unidad estructural de la superred alcanzase las propiedades magnéticas del volumen. El número de capas evaporadas y su perfección estructural se han determinado mediante la técnica de oscilaciones en la intensidad reflejada de haces de helio descrita más arriba, Las propiedades magnéticas de estas superredes metálicas, estudiadas en colaboración con J. L. M artínez mediante difracción de neutrones en el Instituto Laue-Langevin, han resulTEMAS 29
L L E U G N I M N O G A R A O I N O T N A Y A D N A R I M O F L O D O R
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LA+LB LB
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12. SUPERRED METALICA compuesta por dos metales distintos, A y B , crecidos alternadamente con una periodicidad LA y LB , respectivamente. La periodicidad cristalina de la superred es LA + LB . Para obtener una superred cristalina es preciso elegir los metales A y B de modo que sus constantes de red no sean muy distintas y evaporarlos en condiciones controladas de ultraalto vacío. En superredes de cobalto y cobre crecidas epitaxialmente se observa que, en ausencia de campo magnético externo, el vector magnetización de las capas de cobalto (flechas ) se alinea antiparalelamente en capas próximas. La superred en su conjunto tiene un orden antiferromagnético y una magnetización nula. Bajo un campo magnético suficientemente elevado, los vectores magnetización de todas las capas de cobalto apuntan en la misma dirección. Para campos intermedios, la magnetización de cada capa de cobalto gira en el plano un cierto ángulo para minimizar su energía, de manera que, a determinados campos magnéticos, aparecen complejos ordenamientos tridimensionales del vector magnetización que sugieren la posibilidad de almacenar información magnética en tres dimensiones. tado ser inesperadas. En ausencia de está abriendo por primera vez un un campo magnético exterior, la su- mundo fascinante a nuestros ojos. perred se comporta como un material Los ejemplos reseñados en este arantiferromagnético, esto es, el vector tículo describen parte del esfuerzo magnetización de las capas de cobalto, realizado en los últimos años en el que se encuentra siempre en el plano laboratorio de superficies de la UAM . de éstas, está ordenado antiparale- Aunque no cubren toda la riqueza de lamente en capas consecutivas ( véase la física de superficies e interfases, la figura 12 ). En estas condiciones, sí pueden considerarse represenla superred en su conjunto no presenta tativos de la fase explosiva de crecimagnetización alguna. miento que ésta atraviesa desde hace Al aplicar un campo magnético unos años en todo el mundo. Benevoexterior de intensidad elevada en la lentemente, podría calificarse la sidirección paralela al plano de las tuación actual de esta disciplina como capas, éstas se ordenan magnética- de adolescencia. Los próximos años mente en la dirección del campo conducirán, con toda probabilidad, a externo y la superred se convierte en una etapa de madurez en la que la ferromagnética. Sin embargo, lo más comprensión y el control de la natuinteresante ocurre cuando el campo raleza, en su nivel atómico, que esexterno se aumenta de una manera tamos alcanzando, fructificará en suave. Para ciertos valores bien defi- nuevos y espectaculares desarrollos nidos de éste, la magnetización de la básicos y aplicados. superred parece crecer de una manera discreta. Esto sugiere que, aplicando un campo magnético exterior de esta magnitud, es posible crear complejos BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA patrones de magnetización en la superred. La aplicación práctica de estos LOW ENERGY ELECTRONS AND SURFACE descubrimientos para el almacenaCHEMISTRY. G. Ertl y J. Küppers. Chemie miento de información no está aún a Verlag, 1987. la vista, pero es indiscutible que nuesPHYSICSAT SURFACES. Andrew Zwangwill. Cambridge Unversity Press, 1988. tra capacidad de explorar la física de sistemas de baja dimensionalidad A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
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Técnicas de microfotografía Con un equipo sencillo y económico se pueden sacar microfotografías claras, brillantes a las que no les falten interés científico y gran belleza Jearl Walker
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l mundo oculto que revela el microscopio ha fascinado a muchos científicos aficionados. Durante los últimos 20 años, varios de estos animosos investigadores han llegado a adquirir una notable habilidad para fotografiar lo que observaban a través del microscopio. Analizaremos aquí algunas técnicas que permiten a los diestros en el uso del microscopio sacar tales imágenes fotográficas. Podemos encontrar información sobre la microfotografía en diferentes fuentes. La mía es James Bell, de Allston, Massachusetts. Nos ha suministrado diversas muestras de lo que su técnica microfotográfica es capaz de conseguir (las hemos reproducido en las dos páginas siguientes). La variedad de especímenes que pueden observarse y fotografiarse es casi infinita, de ahí que los ejemplos de Bell los demos sólo a título de introducción. Aunque los fotógrafos profesionales suelen trabajar con equipos muy complejos y caros, las fotografías realizadas por Bell muestran que hasta con un equipo sencillo y económico pueden hacerse fotografías de sorprendente belleza y de gran interés científico. Bell trabajó con un microscopio monocular Bausch and Lomb fabricado en 1915, equipado con unos vie jos objetivos Leitz de 10 y 100 aumentos y unos oculares con un poder de aumento de 10, 7 y 2,5. Disponía de un espejo para dirigir la luz hacia un condensador, el cual hacía que toda la luz convergiera sobre la muestra. Bell quitó el objetivo de su cámara Asahiflex de 35 milímetros, e incorporó la misma al microscopio con un adaptador especial para microscopio, que se encuentra en las tiendas del ramo y que sirve para evitar el paso de la luz del exterior. Enfocó el microscopio de manera que la imagen se for56
mara sobre el cristal del fondo d e la tras. Bell logra este tipo de iluminacámara. Para evitar los movimientos ción orientando el espejo de manera a la hora de hacer las fotos, Bell accio- que el condensador situado debajo naba la cámara con un cable dis- del soporte del espécimen en el microsparador. Sacó las fotos con veloci- copio haga que toda la luz converja dades de obturación entre 1/500 y en dicha muestra. Obrando así, se 1/25 segundos, empleando películas verá la luz transmitida a través del Ektachrome-X o Ektachrome-64. espécimen. Esta técnica no podrá apliHay que usar luz muy intensa, pues carse, pues, ni con especímenes gruesólo una pequeña parte de ella llega sos ni opacos, e incluso con muestras a la película. Bell se servía para la delgadas no siempre se distinguirá iluminación de un proyector de dia- bien su estructura interna. Por otra positivas normal con una lámpara de parte, los colores naturales de los ele400 watt. Para colimar la luz susti- mentos u organismos a observar, se tuyó el objetivo del proyector por otro pierden frecuentemente con el fondo que concentraba la luz. En caso de tra- claro. De todos modos, esta técnica bajar con menos luz que la empleada puede resultar útil para fotografiar por Bell, es necesario incrementar el muestras finas en blanco y negro. tiempo de exposición en un segundo Si se quiere obtener la mayor reo incluso más. Más difícil resulta obte- solución posible, aspecto crucial en ner fotografías claras con objetos en trabajos de mucho aumento, deben semovimiento; lo más probable es que cundarse las directrices que se indisólo consigamos un borrón. Si para can, respecto a la iluminación Köhler, una fotografía en particular, la luz en el libro Phot ography th rough the es demasiado intensa, Bell la atenúa Mi cr os co pe , auténtica biblia de la colocando filtros de transparencia microfotografía. Dicho libro ha sido uniforme en la trayectoria de los rayos publicado por la Eastman Kodak procedentes del proyector. Dichos fil- Company. El manual le dirá cómo tros pueden comprarse en las casas ajustar el espejo, el colector y el conde artículos fotográficos o pueden ser densador, de manera que el filamento fabricados fotografiando una hoja de de la lámpara esté enfocado sobre el papel blanco y revelando el negativo. condensador y éste a su vez enfoque El componente infrarrojo del rayo la imagen del colector sobre el soporte de luz puede dañar a las muestras, de la muestra. (El colector es la lente sobre todo si se trata de organismos situada entre el espejo y la fuente de vivos. Para eliminar dicho compo- luz.) Con este método de enfoque la nente nocivo de los rayos, puede colo- muestra queda uniformemente ilucarse un recipiente con agua (de caras minada y no se ve la imagen enfocada paralelas para evitar reflexiones) o del filamento. bien diversas piezas de cristal óptico en la trayectoria del rayo de luz. El a fotografía de Bell que aparece proyector puede incorporar un sisen la figura 1 constituye un ejemtema de refrigeración con idéntica plo de la técnica de fondo claro. Bell finalidad práctica. empleó 1100 aumentos para fotoLa iluminación con fondo claro es grafiar células vivas del alga de agua la más común de los diversos tipos de dulce Elodea , poniendo de manifiesto iluminación que se pueden emplear, los distintos cloroplastos. Momentos pero tiene el inconveniente de que después de haber tomado la fotogradestaca poco los detalles de las mues- fía, los cloroplastos comenzaron a
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1. Alga fotografiada con la técnica de campo brillante de James Bell.
2. Cristales de éster de colesterol.
3. Embrión de caracol.
4. Colonia rotífera de Conochilus.
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5. La pulga de agua Simocephalus. A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
6. El copépodo Cyclops. 57
7. Cristal de vitamina C.
8. El mismo cristal visto a través de celofán polarizador.
9. Cristales de ácido hipúrico.
10. Cristales de resorcinol.
11. Cristal líquido nemático.
12. Ala de mariposa.
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TEMAS 29
girar dentro de las células conforme iba produciéndose en ellos la fotosíntesis a partir de la luz procedente del proyector. Aunque algunos detalles salen en la fotografía, la imagen no es tan nítida como en otras fotografías, debido en parte a que ese elevado aumento redujo la profundidad de campo. Puede obtenerse un buen contraste en la foto si colocamos la muestra sobre un fondo negro. Para conseguir dicho fondo mientras el objeto a observar seguía estando iluminado, Bell puso un punto negro en un filtro de cristal blanco, que situó justo debajo del condensador instalado bajo el portaobjetos. Tenía bien abierto el diafragma del condensador de suerte que suministrara un ancho cono de luz. El punto negro tenía por misión proyectar una sombra sobre la muestra a fotografiar. La luz que sobresalía por los bordes del punto iluminaba la muestra con luz blanca, por lo que sus colores naturales seguían viéndose. Cuando el portaobjetos está vacío, los rayos de luz que llegan al objetivo del microscopio han sufrido una divergencia tal que no entra ninguna luz por el tubo; ello determina que ni el observador ni la cámara vean más que un campo obscuro. Con la muestra en el portaobjetos, la luz se dispersa desde él hacia el interior del tubo, permitiendo que el espécimen pueda contemplarse. Esta técnica requiere una intensa fuente luminosa, ya que sólo llegará a la cámara una pequeña parte de la luz inicial. El filtro para producir el fondo negro se construye pegando un pequeño círculo opaco de cartulina negra sobre un filtro de cristal transparente. El diámetro del círculo debe ser de cinco milímetros o algo más. Conviene determinar el tamaño óptimo probando varios en su propio microscopio. El campo debe verse obscuro cuando no haya nada en el portaob jetos, y aparecerá iluminado cuando coloquemos un espécimen para su observación.
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ell domina la técnica de la iluminación con fondo obscuro con sólo su objetivo de bajo aumento (10 diámetros). Un aumento mayor da lugar a fotografías con un contraste menor debido a la dificultad de mantener la lente que hace de objetivo dentro del cono obscuro proyectado por el punto opaco. Para enfocar correctamente, los objetivos de muchos aumentos deben aproximarse bastante a la muestra; la lente empieza luego a interceptar algunos rayos de luz que provienen de los bordes del punto A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
N A M D O O G L E A H C I M
CAMARA
ADAPTADOR AL MICROSCOPIO SEGUNDO POLARIZADOR COLOCADO DEBAJO DEL ADAPTADOR
CABLE DISPARADOR
OBJETIVOS
MUESTRA SITUAR EL PRIMER POLARIZADOR AQUI
CONDENSADOR ESPEJO
CONDENSADOR DEL PROYECTOR
13. Sistema experimental de Bell. opaco. Para trabajar según la técnica rentes de una misma muestra en de Bell con grandes aumentos, habría situaciones diversas, de acuerdo con que comprar un condensador de fondo su comportamiento característico. obscuro, que proporciona un cono de Así, podemos fotografiar una hidr a obscuridad más fino. comiendo. Dándole pequeños gusaCon su técnica de fondo obscuro, nos de agua o bien diminutos trozos Bell fotografió un espécimen de Hydra de carne cruda, se puede conseguir y algunas colonias de Volvox que había que abra la boca y despliegue su s tenencontrado en estanques locales. Se táculos. Headstrom refiere que con puede encontrar una relación com- una pequeña cantidad de ácido acépleta de las muestras útiles para su tico o verde de metilo consigue proobservación en libros especializados vocar que la hidra descargue uno de que suelen venderse en los museos sus nematocistos. Estos tubos llenos de historia natural. (Puede consul- de púas son lanzados con tal fuerza tarse, con provecho, el Atlas de micros- que pueden penetrar incluso en la copía, de J. Bernis Mateu.) presa del animal. Puesto que la técnica fotográfica de Los Volvox forman una colonia esféBell puede aplicarse a organismos rica gelatinosa, constituida por cienvivos, si uno tiene suficiente pacien- tos de organismos flagelados. Si se cia puede obtener fotografías dife- mira desde muy cerca a una de estas 59
colonias, puede apreciarse que su superficie está como bordada por flagelos, que son los apéndices en forma de latiguillo mediante los cuales los individuos flagelados pueden autopropulsarse. Headstrom recomienda recolectar muestras de este tipo con un tubo de cristal. Una vez que haya localizado una muestra en el agua de un estanque o de una charca, par a lo cual quizá sea conveniente ayudarse con una lupa, introduzca el tubo en el agua manteniéndolo tapado con el dedo. Cuando el espécimen esté lo suficientemente cerca de la boca del tubo, quite el dedo; probablemente, la muestra se verá arrastrada hacia el interior del tubo por la corriente de agua que se forma al llenarse. Vuelva a tapar el tubo con el dedo y sáquelo del agua. A continuación, con mucho cuidado, vierta el agua sobre el portaobjetos del microscopio hasta
LUZ NO POLARIZADA
que el espécimen quede depositado sobre el mismo. Para estas operaciones conviene usar portaobjetos especiales que tienen una pequeña concavidad donde queda recogida la muestra con una pequeña cantidad de agua. Algunas muestras contrastan mejor con un fondo de color que con un fondo obscuro. Para conseguir este tipo de colorido (llamado iluminación parcial Rheinberg), Bell sustituyó el punto opaco negro por un punto transparente de color. Por ejemplo, para conseguir un buen contraste con una muestra roja, Bell utilizaba un punto azul o verde, que recortaba de unos filtros de plástico de dichos colores. El espécimen continúa apareciendo con su color natural, ya que es iluminado principalmente por la luz blanca procedente de la zona exterior al punto.
LUZ LINEALMENTE POLARIZADA
Un fondo azul sirvió a Bell para fotografiar unos cristales de un éster de colesterol que habían recristalizado bajo el cubreobjetos. El fondo permite ver la interfase entre los cristales y las grietas provocadas por las tensiones internas dentro de cada cristal. Para fotografiar embriones del caracol de agua dulce cuando aún se encuentran dentro del huevo, Bell empleó un punto verde con un aumento de 80 diámetros. Estos delicadísimos detalles se hubiesen perdido totalmente con una iluminación con fondo brillante. Con una iluminación Rheinberg completa, Bell puede seleccionar cualquier color para iluminar la muestra y puede elegir un color diferente para el fondo. El único cambio que debe sufrir el método es pegar un anillo de plástico ligeramente coloreado alrededor del punto más obscuro. La luz
PORCION DE LA MUESTRA LUZ LINEALMENTE POLARIZADA
PELICULA
CELOFAN LAMPARA DEL PROYECTOR
PRIMER FILTRO POLARIZADOR
EQUIVALENTE A UNA LAMINA DE UNA ONDA A LA LONGITUD DE ONDA CONSIDERADA
SEGUNDO FILTRO POLARIZADOR
LUZ LINEALMENTE POLARIZADA
NO LLEGA LUZ DEL COLOR CONSIDERADO A LA PELICULA
LUZ LINEALMENTE POLARIZADA
EQUIVALENTE A UNA LAMINA DE MEDIA ONDA A LA LONGITUD DE ONDA CONSIDERADA
LUZ ELIPTICAMENTE POLARIZADA
N A M D O O G L E A H C I M
LUZ ELIPTICAMENTE POLARIZADA
EQUIVALENTE A UNA LAMINA DE UN CUARTO DE ONDA A LA LONGITUD DE ONDA CONSIDERADA
14. Cambios de polarización debidos a la birrefringencia. 60
TEMAS 29
que atraviesa el punto da entonces el color del fondo, mientras que la luz procedente del anillo colorea la muestra. A 120 aumentos, Bell fotografió con un punto azul y un anillo amarillo una colonia de rotíferos Conochilus. En una carta que el propio Bell me envió, me decía que los rotíferos habrían sido punto menos que invisibles con una técnica de iluminación de fondo brillante: el contraste de colores resulta fundamental para distinguir sus contornos y su estructura interna.
N A M D O O G L E A H C I M
OBJETIVO DEL MICROSCOPIO
RAYOS DE LUZ DISPERSADOS POR LA MUESTRA
MUESTRA
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ell asegura que la técnica más eficaz para obtener el mejor contraste de colores es hacer las fotografías usando luz polarizada. Esta técnica de trabajo sólo sirve con materiales birrefringentes, tales como los cristales, los músculos y algunos pequeños organismos pluricelulares. Se coloca un filtro polarizador en el proyector de diapositivas (como si fuera una diapositiva normal), con lo que el aparato suministra luz polarizada. Se introduce un segundo filtro en el ocular del microscopio, de manera que se pueda girar hasta que el campo de visión a lo largo del microscopio sea o bien obscuro o brillante, según que el filtro bloquee o deje pasar la dirección de polarización de la luz que viene a través del aparato. Cuando se introduce un material birrefringente en el portaobjetos, la luz polarizada producida por el primer filtro altera su polarización cuando pasa a través del material. Si la alteración es adecuada, parte de la luz puede pasar entonces a través del segundo filtro polarizador, en el ocular, aun cuando el filtro bloquearía la luz. En resumen, la luz se transmite a través de este material cuando parte de la misma está polarizada a lo largo de un eje y la otra polarizada a lo largo de un eje perpendicular. Ambos ejes son perpendiculares al rayo de luz. La velocidad de la luz es mayor en uno de los sentidos de polarización que en el otro. En razón de esta diferencia, los dos sentidos de polarización pueden salir procedentes del material fuera de fase. La polarización emergente está determinada por la combinación de dos sentidos de polarización: en consecuencia, la luz que sale podría estar polarizada de varias formas. Si los dos sentidos de polarización salen con una diferencia de fase de media longitud de onda, la luz que emerge está otra vez linealmente polarizada, pero ahora lo estará a lo largo de un eje perpendicular a la dirección de polarización de la luz A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
AREA ILUMINADA EN EL FILTRO
CIRCULO OPACO NEGRO QUE PROPORCIONA EL FONDO OBSCURO
15. Preparación de un fondo obscuro. incidente. Esta luz que sale puede ser transmitida o bloqueada por el filtro polarizador situado en el ocular, según la orientación de éste. Si la birrefringencia ha obligado a las direcciones de polarización que salen a estar desfasadas un cuarto de longitud de onda, la luz que emerge estará polarizada elípticamente: ello significa que la punta del vector de polarización gira alrededor del rayo de luz, describiendo una elipse. Esta luz pasará por el filtro situado en el ocular, con independencia de la orientación de éste. Si los sentidos de polarización emergentes coinciden, la luz transmitida estará polarizada de la misma forma que la luz incidente. La orientación del segundo filtro determinará entonces si se ve o no luz alguna.
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l que se obtenga un resultado u otro depende del espesor y birrefringencia de la muestra y de la longitud de onda de la luz. Para una región concreta de la muestra, el extremo rojo del espectro de la luz blanca incidente sobre él puede acabar siendo bloqueado por el segundo filtro polarizador, mientras que puede transmitirse el azul. Esta zona aparecerá de color azul para el o bservador. Puede aparecer otra zona de color amarillo cuando estén bloqueados los otros colores de la luz blanca incidente. La ventaja de usar así luz polarizada estriba en que la variación de color que se produce en la muestra,
que de otra forma sería incolora, permite al observador distinguir sus perfiles y su estructura. Bell me ha enviado dos fotografías hechas con luz polarizada. En la primera, tomada a 120 aumentos, se aprecian cristales de ácido hipúrico que se habían disuelto en isopropanol y se recristalizaron luego en la diapositiva. La muestra era lo suficientemente birrefringente y no uniforme como para producir muchos colores. En el otro ejemplo (a 150 aumentos) se había disuelto cristales de resorcinol en acetona, que se quemó después para facilitar la recristalización rápida. Se pueden producir más contrastes de color poniendo uno o más trozos de papel de celofán o de cinta adhesiva transparente en el soporte del filtro por debajo de la muestra. Ambos son materiales birrefringentes que alteran la polarización de la luz. En lugar de celofán podemos usar un trozo de mica fina que puede sacarse fácilmente de un fragmento mayor con una cuchilla. Se supone que cualquiera de estos materiales actúa como filtro retardador, porque obliga a que un sentido de polarización quede detrás del sentido perpendicular. Un filtro de retardo es útil para aumentar la variación de color en un modelo débilmente birrefringente. No todos los tipos de celofán habrán de valer, por lo que será preciso probar varios hasta dar con el adecuado. También 61
podrían usarse hojas de plástico del tipo de las que se emplean para envolver alimentos.
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ell ha presentado algunos otros ejemplos de cómo usa la luz polarizada. Hizo una fotografía de 100 aumentos a una pulga de agua viva con su cría poniendo un punto azul de fondo y con celofán y filtros polarizadores para destacar la estructura interna del animal. La mancha del ojo queda en negro, y el tubo digestivo en naranja. A 50 aumentos, fotografió de una forma similar el copépodo Cyclops , con la diferencia de que usó un punto negro para proporcionar un fondo obscuro. El animal aparece con la mancha de los ojos en rojo, dos bandas musculares en amarillo y el tubo digestivo en marrón. Los dos sacos laterales de forma de pera contienen huevos. Muchos de estos detalles se hubieran perdido en un campo iluminado normalmente. Puede comprobarse el efecto del celofán en dos fotografías de Bell, ambas de ácido ascórbico (vitamina C) recristalizado por él. Las fotografías muestran los dos mismos cristales adyacentes, y se tomaron exactamente igual, con la salvedad de que se utilizó celofán para la segunda fotografía. Adviértase que en la última el color adicional se debe a la birrefringencia del celofán. Bell preparó los cristales disolviendo ácido ascórbico en isopropanol, puso luego un poco de esta solución en un cristal portaobjetos y quemó después el alcohol. Los cristales se formaron a los pocos segundos. Una vez sacada una serie de fotografías, puede volverse a disolver el ácido ascórbico y empezar de nuevo. Esta técnica produce cristales lo suficientemente finos como para que resulten transparentes; por tanto, pueden fotografiarse fácilmente. Otro método de obtención de cristales es dejar que el disolvente se evapore lentamente. El lector puede conseguir también una cristalización fundiendo la sustancia en un portaobjetos sobre una llama. Aquélla cristalizará al enfriarse. Bell no es muy partidario de esta técnica, porque el punto de fusión de algunas sustancias es demasiado alto, y ello hace que se rompan muchos portaobjetos. Sin embargo, señala que, si se quieren estudiar ciertos tipos de cristales líquidos, habrá que recurrir a dicha técnica, enfriando la sustancia lentamente desde su punto de fusión para conseguir el estado de líquido cristalino. La fotografía de Be ll de 62
un cristal líquido nemático se sacó a estas variaciones modifican la lec100 aumentos, a temperatura ambien- tura en el contador de milivolt. Tras te, tras haber disuelto el material en varios experimentos, Bell consiguió acetona. El movimiento en esta recris- construir una tabla de lecturas de talización fue tan rápido que tuvo que manera que fuera posible interpredisparar la fotografía a 1/500 segun- tarlas inmediatamente en función dos para retener la actividad. del tiempo de exposición. (En el Debido a su espesor algunas mues- número de junio de 1977 de la revista tras no pueden fotografiarse con luz Pop ula r Ele ctronic s aparecía disetransmitida; el obstáculo se salva con ñado un medidor de luz simple, aunluz reflejada. Para ello, Bell apoya el que muy sensible, que podía consproyector en unos libros y ajusta el án- truirse sin gran complicación con un gulo de la luz incidente hasta que fotorresistor de sulfuro de cadmio.) obtiene la iluminación adecuada en la muestra. Un ejemplo del resultado i se quiere obtener una buena rees su fotografía del ala de una mariproducción de los colores natuposa. Muchos de los colores que se ven rales de un modelo, conviene atinar en las alas de las mariposas, en los en la elección del tipo de película de élitros de los escarabajos y en las plu- color que se use; debe estar ajustada mas de las aves no se deben a la pig- a la distribución de colores de la lámmentación, sino a la interferencia de para. Todas las lámparas parecen las ondas de luz. Algunas alas de ma- blancas para el ojo humano, pero la riposa están formadas por capas de distribución real de intensidades a cutícula transparente. Cuando se través del espectro visible depende refleja la luz de una de las capas, de la temperatura de la superficie parte de ella procede de la reflexión emisora de la lámpara. Una lámpara en su superficie externa y otra parte de luz blanca, de baja temperatura, proviene de su superficie posterior, tiene menos bajas frecuencias de luz después de haber atravesado la capa visible (es decir, el final azul del especen cuestión. Los dos rayos emergen- tro) que una lámpara de temperates pueden interferir entre sí para tura más alta. Las distintas pelícuproducir colores, como ocurre en las las de color se han ajustado de alguna pompas de jabón. Quizás el observa- forma para compensar esta diferendor quiera ver varios tipos distintos cia de distribución del color de la luz de alas de mariposa. Estas pueden blanca. Sin embargo, puede haber comprarse en casas dedicadas a mues- alguna discrepancia entre los colotras empleadas en prácticas de cien- res reales de un modelo y lo que se cias naturales y en tiendas de obje- ve en una fotografía en color. Se puede tos de regalo de muchas ciudades. remediar la situación poniendo un La interferencia de colores resul- filtro de color delante del proyector taría ser muy débil si el ala estuviera (o cualquier otra fuente de color). El iluminada sólo con la luz transmi- libro de Kodak explica qué filtros tida. Los colores tendrían que apa- deben emplearse. recer, entonces, como consecuencia de Bell tenía una lámpara DAT de 400 la interferencia entre la luz trans- watt en su proyector. La temperamitida por la capa similar a la cutí- tura de la superficie del filamento cula (sin reflexión interna) y la luz emisor es tan alta que la luz semeja doblemente reflejada en el interior de la luz solar en cuanto a la distribula capa, antes de salir. Esta luz será ción de color. Por ello utilizaba petan débil, con relación a la luz no lícula de color especial para la luz reflejada, que producirá poca inter- solar en vez de las películas que tieferencia (y, por tanto, poco color). nen un equilibrio de colores calcuPara encontrar la exposición ideal lado para lámparas de tungsteno que hay que controlar los disparos con funcionen a temperaturas superuna gama de tiempos de exposición ficiales inferiores. o bien incorporar un medidor de luz en el microscopio. Bell usa un medidor de luz casero compuesto por un BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA voltímetro digital capaz de detectar hasta varios milivolt y una fotocéPHOTOGRAPHY THROUGH THE MICROSCOPE. Eastman Kodak Company, 1974 (con relula de silicio. Bell montó la célula ediciones posteriores). en una carcasa de cartón que se encaDVENTURES WITH A MICROSCOPE. Richard A jaba sobre el punto de mira de la Headstrom. Dover Publications, Inc., cámara. A medida que cambia la in1977. tensidad de luz con la muestra y el ATLAS DE MICROSCOPÍA. J. Bernis Mateu. modo de iluminación, la resistencia Jover, D. L., varias ediciones entre 1976 de la fotocélula varía inversamente. y 1986. A través de los circuitos intermedios,
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OBSERVACIONES
S E N O J D R A H C I R
Camillo Golgi y la reacción negra La voluntad y el rigor intelectual estuvieron en el origen de los descubrimientos de este gran médico que le llevaron, desde un hospital provinciano, hasta el reconocimiento internacional y al premio Nobel Paolo Mazzarello
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l 26 de octubre de 1906, Camillo Golgi, a la sazón profesor de histología y patología general de la Universidad de Pavía, recibió un telegrama del director del Instituto Karolinska de Estocolmo donde se le comunicaba la concesión del premio Nobel de medicina y fisiología. Fue el primer italiano que recibía el máximo reconocimiento científico internacional, galardón que coronaba una aventura intelectual iniciada en el Hospital de Beneficencia de Incurables de Abbiategrasso, un nosocomio de enfermos crónicos, lejos del circuito académico. Camillo Golgi nació el 7 de julio de 1843 en Corteno (hoy Corteno Golgi), una aldea de las montañas de la alta Valcamonica. Hijo de médico rural, creció con el ejemplo diario que le brindaba su progenitor, siempre dispuesto a partir en medio de la noche para auxiliar a un enfermo grave o para asistir un parto en una choza perdida en las montañas. Concluidos los estudios primarios y secundarios, Golgi se matriculó en la facultad de medicina de la Universidad de Pavía, sin más ambición que licenciarse para ejercer la profesión paterna. Por aquella época, el de Pavía era el único ateneo de Lombardía y en él encontró Golgi una verdadera efervescencia cultural. Después de la primera fase de la unificación italiana, los estudios en medicina de Pavía se habían transformado y vivificado con elementos didácticos que incluían nuevas materias, como las revolucionarias conquistas de la biología alemana, la patología celular de Rudolf Wirchow o la teoría celular de Mathias Jacob Schleiden y Theodor Schwann, que despertaban el entusiasmo de los estudiantes. De esta forma, las ideas que habían modifi64
cado el mapa de Italia se entrelazaban con las nuevas teorías sobre la constitución de los organismos, sobre los procesos patológicos y sobre la naturaleza de los fenómenos biológicos. En este marco conceptual, la vida, la psíquica incluida, no era sino un
momento de organización y estructuración particulares de la materia, destinada cíclicamente a terminar por transformarse merced al impulso de las fuerzas que actuaban sobre los compuestos químicos. No en vano El ciclo de la vida era el título de uno de los textos fundamentales del posiTEMAS 29
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N I R U T E D L A N I M I R C A I G O L O P O R T N A E D O E S U M , O S S O R G O M O C A I G
1. PALACIO DEL JARDIN BOTANICO de Pavía, donde estaba ubicado el Instituto de Pa tología general dirigido por Giulio Bizzozero (abajo, a la derecha). Arriba, a la izquierda, Camillo Golgi en la época en que se aplicó al estudio de la biología de la infección de malaria. Arriba, a la derecha, retrato de Cesare Lombroso. tivismo científico de la época, escrito por el filósofo materialista holandés Jakob Moleschott y traducido al italiano por Cesare Lombroso, entonces profesor de psiquiatría en la Universidad de Pavía. El 7 de agosto de 1865 fue Lombroso el ponente de la tesina de licenciatura sobre la etiología de A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
las enajenaciones mentales preparada por Golgi. En la mente del joven laureado, el grado constituía el punto de partida para el ejercicio de una honesta profesión médica. Pero la fascinación contagiosa que emanaba de una personalidad tan ecléctica y entusiasta como la de su mentor, co-
nocido ya desde que a los veinte años escribió un ensayo titulado Sobre la locura de Cardano, terminó por decidir la suerte de Camillo Golgi. La atención a los enfermos ya no era el ideal al que sentía debía dedicar su vida. Mucho más fascinante le resultaba el estudio del cerebro y de los fenómenos nerviosos, un campo de investigación clave para la filosofía materialista que reducía la psiquiatría a neuropatología y que no consideraba el cerebro como órgano del alma sino de la psique. Después de un período de incertidumbre profesional, Golgi ingresa como asistente hospitalario en la clínica psiquiátrica de Pavía y empieza a apasionarse por la investigación científica. El meticuloso Golgi bien pronto descubriría en la personalidad de Lombroso todas sus extravagancias y sus deficiencias metodológicas. De hecho sólo en apariencia seguía el axioma epistemológico positivista que oficialmente abrazaba, según el cual una verdad científica es la que se deriva de hechos, a partir de los cuales se establecen leyes mediante inducción. En realidad Lombroso se nutría más de intuiciones repentinas que de sólidas deducciones. Al servicio de estas intuiciones destellantes ponía toda su energía creadora, seleccionando el dato experimental si le convenía y despreciándolo si no se ajustaba a sus teorías. Golgi, insatisfecho por la falta de rigor de Lombroso, comenzó a frecuentar el Instituto de Patología General en el tiempo libre que le dejaba su labor asistencial. El antropólogo Paolo Mantegazza había organizado el instituto pocos años antes en el palacio del jardín botánico; en aquella época lo dirigía Giulio Bizzozero. Tres años más joven que Golgi, Bizzozero era la personalidad emergente de la investigación lombarda. Con el microscopio por emblema, consideraba la ciencia escrita en alemán un espejo en el que mirarse. Se había licenciado en medicina en 1866 a la edad de veinte años; después de breves estancias de estudio en los laboratorios de Heinrich Frey en Zurich y de Rudolf Virchow en Berlín, había pasado directamente del banco estudiantil a la cátedra de patología general. Su estilo de investigador riguroso y de docente eficaz contrastaba con la picaresca de Lombroso. Si al psiquiatra se debe reconocer el haber inflamado el espíritu de Golgi por el estudio del sistema nervioso, es mérito de Bizzozero el haber despejado el camino científico del futuro premio Nobel, la vía histológica hacia 65
la neurobiología. Golgi empezó así a publicar sus primeros trabajos científicos. Entre éstos deben mencionarse un ensayo sobre las causas de las enfermedades mentales y un trabajo notable sobre la estructura de la glía, el tejido que sirve de sostén al sistema nervioso. Un hospital provinciano y un micros copio
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principio de los años setenta, Golgi era ya un virtuoso del microscopio. La investigación histológica era para él la verdadera vocación a la que entregarse. Se empezaba a reconocer su talento, como prueba el hecho de que se le encargara, sin retribución, la docencia de técnicas microscópicas, pero en la Universidad de Pavía escaseaban las posibilidades de encontrar trabajo. El padre de Camillo se impacientaba por que su hijo soñador, que trabajaba mucho y ganaba poco (y además pagaba de su bolsillo la impresión de su labor científica), encontrara finalmente un puesto seguro y bien remunerado. A principios de 1872, se convocó un concurso para un puesto de médico general en el Hospital de Beneficencia de Incurables de Abbiategrasso. Animado por el padre, Golgi vaciló si participar y resultó a la postre el ganador. Llegados a este punto de su vida, nada permitía imaginar un futuro de premio Nobel. El hospital de crónicos carecía de instrumental científico y no estaban contemplados más gastos que los derivados del alojamiento y tratamiento de los pacientes. Para un joven médico que ya había probado el placer de la investigación científica, la situación debía ser, desde cualquier punto de vista, deprimente. En la correspondencia que intercambió por entonces con un amigo oculista, Niccolò Manfredi, Golgi lamenta “las pequeñas molestias”, que le producen “un torpor intelectual tan grande” que le limitan “completamente la capacidad de trabajo”, sumiéndole en una “inercia vergonzosa”. Pero hacia finales del año, Golgi ya se estaba rehaciendo. En la cocina del pequeño apartamento que tenía asignado en el hospital había organizado un rudimentario laboratorio formado básicamente por un microscopio. Utilizando una cuchilla, realizaba finos cortes de tejido nervioso y había reiniciado su trabajo de investigación. El 16 de febrero de 1873, escribe con renovado ánimo a su amigo Manfredi: “Ahora he retomado la labor que había abandonado hace meses. Trabajo muchas horas con el micros66
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copio. Estoy feliz porque he encontrado una reacción nueva que demuestra también las estructuras de la estroma intersticial de la corteza cerebral. Añado nitrato de plata a las muestras de cerebro endurecidas en bicromato potásico. Ya he conseguido resultados muy buenos y espero obtener bastantes más”. Es el primer anuncio conocido de la reacción negra (“reazione nera”) que cambiaría el curso de la neuroanatomía y de la neurohistología de finales del siglo XIX , permitiendo una descripción topográfica precisa de la estructura del sistema nerviosos central. No se conoce qué camino siguió Golgi hasta dar con la reacción (se podría hablar tanto del descubrimiento de un fenómeno bioquímico, como de la invención de una técnica de investigación). A partir de las escasas alusiones contenidas en sus escritos y de algún testimonio, es lícito suponer que durante su período de formación en Pavía había recibido alguna indicación indirecta. De su descubrimiento, Golgi sólo proporciona una frase:
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2. REACCION NEGRA en la médula espinal, en una preparación original del laboratorio de Camillo Golgi. TEMAS 29
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4. MICROSCOPIO utilizado por Camillo Golgi en sus investigaciones.
el mundo, ha sido el único que ha permitido observar a la célula nerviosa en toda su integridad. A pesar de ello, la importancia de este descubrimiento sólo se empezó a reconocer una quincena de años más tarde, cuando hicieron un extenso uso del método el padre de la histología del siglo diecinueve, Albert Kölliker, el neuroanatomista español Santiago Ramón y Cajal y e l biólogo sueco Gustaf Retzius. El axón
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3. GOLGI, en la foto de recuerdo de los dis tinguidos honoris causa por la Universidad de Cambridge (1898), pocos meses después del descubrimiento del aparato reticular in terno (aparato de Golgi). De izquierda a derecha, Étienne-Jules Marey, Anton Dohrn, Camillo Golgi, Ernst Haeckel, Ambrosius Arnold Wilhelm Hubrecht, Wilhelm Kühne, Henry Bowditch, Hugo K. Kronecker. había llegado a él estudiando las impregnaciones metálicas en muestras fijadas de muy diversa manera, tras una larga serie de tentativas. La reacción negra se compone de una primera fase de fijación y endurecimiento de los tejidos en bicromato potásico que dura un período variable, de quince días a más de un mes. A continuación viene un paso por nitrato de plata a lo largo de un tiempo mínimo de veinticuatro a cuarenta y ocho horas (aunque a veces la reacción es observable a las dos o tres horas). Como resultado se obtiene la precipitación de una sal, el cromato de plata, que tiñe de color negro la A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
célula nerviosa, con todas sus prolongaciones y ramificaciones. La ventaja del método reside en que, por motivos aún desconocidos, el precipitado colorea en el campo microscópico sólo un pequeño porcentaje de las células (entre el uno y el cinco por ciento). De esta manera, de la laberíntica complejidad del sistema nervioso emerge la silueta de una sola célula, que aparece como un árbol sacado con todas sus ramas de un bosque inextricable. Durante gran parte de este siglo, el método de Golgi, utilizado en los laboratorios de todo
provechando las enormes posibilidades para la investigación que brindaba la nueva técnica, Golgi hizo algunos descubrimientos que revolucionaron la fisiología celular del sistema nervioso de la época. Según el modelo dominante de Joseph Gerlach, el elemento celular fundamental de la transmisión nerviosa era la dendrita (entonces conocida como proceso protoplasmático). Sus ramificaciones permitían la interrelación compleja entre distintos grupos nerviosos, tal como se suponía dada la variabilidad de las funciones del encéfalo. Las dendritas de las distintas células se fundirían en una red sincitial extendida por todo el sistema nervioso; en ella se originarían las fibras de la sustancia blanca. Golgi demostró que el axón (entonces llamado cilindroeje o prolongación nerviosa) está ramificado y excluyó la posibilidad de que las dendritas de las células nerviosas se fundieran en una red. Quedaba, pues, desmentido el reticularismo de Gerlach: para explicar la complejidad de las uniones nerviosas bastaban las ramificaciones de los axones. Por tanto, era el axón y no las dendritas el elemento por el que viajaba la transmisión nerviosa a distancia. Pero Golgi no abandonó del todo el paradigma reticular. Paul Broca había demostrado en 1861 la localización cortical de la capacidad lingüística humana, pero hacia 1870 la opción holística conservaba aún su influencia, desde que a mediados de siglo Marie-Jean Pierre Flourens formulara su teoría de que las funciones de la corteza cerebral se producían por una actividad cortical global. La hipótesis era terreno abonado para un modelo celular de “vasos comunicantes”, donde cada elemento estaba unido a todos los demás a través de una red sincitial y donde la transmisión nerviosa no fluía a través de vías aisladas sino que se propagaba, por contigüidad, por 67
5. CLAUSTRO DEL ANTIGUO monasterio de Santa Clara, luego habilitado como Hospital de Beneficencia de Incurables, en Abbia tegrasso.
9 7 9 1 8 7 9 1 , 2 . L O V , ” E T A I B A H “ A L
todo el sistema nervioso. Influido por esta interpretación, cuando Golgi se asomaba a sus portaobjetos con la reacción negra, debió pensar que, si la red no estaba formada por las dendritas, debía sostenerse en las ramificaciones de los axones. La compleja arquitectura nerviosa avalaba la teoría reticular como si de un hecho se tratara. Nacía así la teoría de la red nerviosa difusa, una enorme red interaxonal por la cual los impulsos nerviosos se transmitían de forma difusa. La lucha contra la malaria
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n 1874 Golgi descubría ciertas lesiones en el cuerpo estriado en un enfermo de corea que había muerto en Abbiategrasso y publicó trabajos notables sobre la estructura del cerebelo y de los bulbos olfatorios. En 1876 volvía a Pavía primero como profesor extraordinario de histología y luego, tras escasos meses en la cátedra de anatomía de Siena, como profesor ordinario. Dos años más tarde descubría en el espesor de los tendones dos corpúsculos sensitivos: los órganos musculotendinosos, que llevan su epónimo, encargados de la transducción de la tensión muscular, y los corpúsculos de Golgi-Mazzoni, que señalan estímulos de presión. En la ciudad lombarda, organizó un laboratorio que pronto se convirtió en un centro italiano de estudios biológicos de primera magnitud. Allí trabajaron, entre otros, Giovan Battista Grassi, descubridor del vector de la malaria, el mosquito Anopheles , y a quien se distinguiría con la medalla Darwin de la Regia Sociedad de Londres; Emilio Veratti, que identificó el retículo sarcoplasmático; Adelchi Negri, descubridor, en el cerebro infectado por el virus de la rabia, de los cuerpos que llevan su nombre; Antonio Carini, que identificó en Brasil el Pneu mocystis carin ii , responsable hoy en día de infecciones graves en los enfermos de sida; Carlo Martinotti, que descubrió las células con axones ascendentes de la corteza cerebral (células de Martinotti); Aldo Perroncito, que estableció las etapas fundamentales en el mecanismo de regeneración del nervio periférico. Visitaron durante algún tiempo el laboratorio de Golgi también algunos investigadores extranjeros, como el noruego Fritjof Nansen (zoólogo, explorador de las regiones polares y 68
premio Nobel de la paz en 1922), el suizo Albert Kölliker, el ruso Sergej Soukhanoff, el norteamericano Henry Herbert Donaldson (que seleccionó la cepa de los famosos ratones albinos Wistar, empleados en laboratorios de todo el mundo). En 1881, Golgi fue nombrado profesor ordinario de patología celular. Conservaba también la plaza de histología y había asumido la dirección de un pequeño grupo médico en el antiguo hospital de San Mateo de Pavía. En 1885 recogía gran parte de sus investigaciones neuroanatómicas en el libro Sobre la anatomía fina de los órganos centrales del sistema nervioso. Después encauzó su interés
hacia otros asuntos, en particular el mecanismo patogénico de la malaria.
En el hospital del Espíritu Santo de Roma, Ettore Marchiafava y Angelo Celli habían confirmado y ampliado notablemente las observaciones de Alphonse Laveran, médico militar que, en Constantine (Argelia), había descubierto en la sangre de pacientes con malaria un microorganismo y lo había reconocido como agente etiológico de la enfermedad. Golgi pasó algunos días en septiembre de 1885 con Marciafava y Celli y se convenció de lo acertado de sus deducciones y de las de Laveran. Pero las formas de malaria que predominaban en Roma eran irregulares en su presentación y los accesos febriles no se repetían con la precisa cadencia temporal que sí se observaba en Pavía. En la ciudad lombarda se veían TEMAS 29
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6. LA IMAGEN en margarita del parásito de la malaria en el período inmediatamente anterior al acceso febril (a la izquierda ). La anotación es de Golgi. Abajo, el aparato de Golgi en los ganglios espinales, en una preparación original del laboratorio de Camillo Golgi. A la derecha, dibujo realizado por Golgi del aparato reticular interno en células nerviosas de los ganglios espinales de un caballo.
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sobre todo casos de fiebre cuartana (llamada fiebre larga) y de terciana. En la primera los accesos febriles de presentan en ciclos sucesivos de cuatro días, de tres en la segunda. De regreso a Pavía, Golgi estableció la relación de las distintas formas de desarrollo del parásito dentro de los glóbulos rojos con las fases del ciclo febril y diferenció claramente el protozoo de la fiebre terciana del de la cuartana. Aún más importante, estableció la relación de la fase febril con la “esporulación” o multiplicación de los parásitos en la sangre (ley de Golgi). Sus investigaciones sobre la malaria continuaron hasta 1892 con estudios diversos sobre el momento más adecuado para administrar quinina a los enfermos, junto con varias contribuciones sobre el papel de la fagocitosis en el curso de la enfermedad y en la patogénesis de las fiebres irregulares. En aquel período Golgi dio pruebas de su extraordinario talento para la experimentación al deA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
sarrollar también un método de estudio de la nefrona, que le permitió aclarar la histogénesis del glomérulo renal y de identificar la peculiar relación que el túbulo contorneado distal del riñón establece con el polo vascular del corpúsculo de Malpighi. Mientras tanto, sus estudios neurohistológicos empezaban a alcanzar cierta difusión y consideración internacionales. Mucho mayor era la velocidad con la que estaba cambiando el modelo conceptual bajo el que se consideraba el sistema nervioso. Los suizos August-Henri Forel y Wilhelm His propusieron en 1886 y 1887 que también este tejido debía respetar los cánones de la teoría celular: que estuviera compuesto de células individuales y aisladas, no en una red difusa. En 1891 el alemán Wilhelm Waldeyer propuso dar a estas células el nombre de neurona. El español Santiago Ramón y Cajal comenzaba por entonces a trabajar de forma sistemática con la reacción negra y
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lograba notables pruebas indirectas que confirmaban la reciente teoría de la neurona. Golgi, ocupado en la malaria, se sentía incordiado por este oscuro profesor español que, con su mismo método, demolía publicación tras publicación su teoría de la red nerviosa difusa. La polémica entre ambos tuvo su punto álgido en Estocolmo en 1906, cuando por ironía de la fortuna, ambos recibieron de forma simultánea el premio Nobel, indisolublemente unidos “como dos gemelos siameses están unidos por la espalda”, según escribió Ramón y Cajal en su autobiografía. El huidizo aparato de Golgi
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ntre 1892 y principio de 1893 Golgi descubrió, de forma independiente a lo observado por el sueco Eric Müller, los canalículos intracelulares de las células parietales de las glándulas gástricas (canalículos de Müller-Golgi), pocos meses después de ser nombrado rector de la Universidad de Pavía, cargo que mantendría hasta 1896, con el consiguiente retraso en su trabajo de laboratorio. En 1897 volvió a dedicarse con todas sus energías al estudio del sistema nervioso. Con una variante de la reacción negra, descubrió en el c itoplasma de las células de los ganglios nerviosos espinales una red de filamentos claramente separada de la membrana plasmática y del núcleo. El hallazgo 69
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7. MICROFOTOGRAFIA de fluorescencia de un cultivo epitelial en el que se observan los núcleos (verde ) y el aparato de Golgi (rojo ).
aún no era reproducible y Golgi esperó a publicar las observaciones hasta que su colaborador Emilio Veratti logró confirmarla en las células que forman el origen del cuarto nervio craneal. En el ínterin, él mismo reprodujo las observaciones de forma constante en las células de Purkinje. Algunos preparados microscópicos mostraban también un involucro pericelular. Así, en abril de 1898 Golgi describía estas dos particularidades a la sociedad médico-quirúrgica de Pavía: la red intracelular, que por su localización y aspecto denominó aparato reticular interno, y el involucro pericelular. Esta última observación permaneció completamente olvidada hasta hace pocos años y es ahora cuando está adquiriendo una importancia creciente en las investigaciones neurocitológicas modernas. Golgi incitó a sus discípulos a buscar el aparato intracelular (que a partir de 1910 empezó a ser conocido como aparato de Golgi) también fuera del sistema nervioso. De esta forma Antonio Pensa, Adelchi Negri y Edoardo Gemelli lo observaron en varias categorías de células y pronto quedó claro que dicho orgánulo celular no era exclusivo del campo de la neurocitología, sino que se trataba de un elemento fundamental de la célula eucariota. El descubrimiento no fue aceptado de forma unánime por la comunidad científica y no tuvo implicación en la justificación oficial de otorgarle el Nobel. Para muchos citólogos se trataba de un artefacto derivado de la gelificación de los coloides intracelulares. El poder de conocimiento que deriva de la reacción negra es verdadera70
mente extraordinario cuando se desarrolla de forma adecuada. Pero a pesar de los intentos de definirlo en términos fisicoquímicos, el método sigue siendo bastante azaroso. Entre bromas y veras, se atribuían propiedades especiales al agua de Pavía, suponiendo que su composición habría facilitado la reacción en la ciudad lombarda y justificado los errores en medio mundo. En efecto, el agua de Pavía era particularmente rica en sales ferrosas y dióxido de azufre. Cabría, por tanto, la posibilidad de que esta última substancia haya ejercido una acción reductora adicional. Golgi estuvo siempre profundamente convencido de la existencia del orgánulo que descubriera y en 1909 intuía, con gran visión, su implicación en los procesos de secreción celular. La controversia sobre la existencia del aparato de Golgi se resolvió en 1954 con la aparición del microscopio electrónico. El mismo instrumento que, al demostrar la existencia de las sinapsis nerviosas había demolido para siempre la red nerviosa difusa de Golgi, por una curiosa y singular némesis histórica fue también el medio por el que se demostró finalmente la realidad citológica del aparato reticular interno. Gracias a este descubrimiento Golgi tal vez sea el científico más mencionado en la bibliografía biológica internacional y su nombre se ha convertido en sinónimo del orgánulo que descubrió. Después de 1900, Golgi dirigió su atención a temas sociales y de política sanitaria, en particular a la lucha contra la malaria. En 1900 fue nombrado senador del reino y de 1901 a 1909 nuevamente rector de la Universidad de Pavía. Durante la Gran
Guerra dirigió el hospital militar que se organizó cerca del Colegio Borromeo de Pavía y se ocupó de la rehabilitación de los heridos de guerra. En su larga vida obtuvo distinciones honoris causa por las universidades de Cambridge, Ginebra, Atenas, Oslo y París. Luchó duramente contra el proyecto auspiciado por Luigi Mangiagalli por la creación de una segunda universidad lombarda en Milán, porque temía que este nuevo ateneo podría hacer superfluo el de Pavía. Cuando murió el 21 de enero de 1926 este hombre que había alcanzado tan altos honores y gloria había perdido las principales batallas a las que se dedicó la segunda parte de su vida: la lucha contra Ramón y Cajal y los partidarios de la teoría neuronal que estaban triunfando en los tratados de neurología y neurobiología y la que sostuvo contra Mangiagalli, que logró en 1924 fundar la Universidad de Milán.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA LA STRUTTURA NASCOSTA. LA VITADI CAMILLO GOLGI. Paolo Mazzarello. Cisalpino-Monduzzi; Bolonia, 1996. (Edición inglesa revisa y corregida The Hidden Structure. The Life of Camillo Golgi. Oxford University Press, Oxford, 1999.) THE BLACK REACTION. Ennio Pannese, en Brain Research Bulletin, número 41, páginas 343-349; 1996. T HE C ENTENARIAN G OLGI A PPARATUS. Paolo Mazzarello y Marina Bentivoglio, en Nature, vol. 392, págs. 543-544; 1998. G OLGI ’ S S CIENTIFIC B IOGRAPHY . Paolo Mazzarello, en Journal of the History of the Neurosciences, volumen 8, número 2, páginas 121-131; 1999.
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Cajal y la estructura histológica del sistema nervioso La mitificación de Cajal ha conducido a una imagen típica basada en varios supuestos que falsean gravemente la realidad José M. López Piñero
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ajal es todo lo contrario de un “clásico” científico olvidado, tanto en España como en la comunidad científica internacional. En nuestra sociedad se ocupan continuamente de él libros, artículos periodísticos y trabajos de revistas especializadas, ha sido el tema de películas y series de televisión, tiene dedicadas calles en casi todas las poblaciones del país, se le han erigido numerosos monumentos y su mención resulta obligada en cuanto se habla de la investigación en España y de otros temas afines. Su mitificación ha conducido a una imagen tópica del genial neurohistólogo basada en varios supuestos que falsean gravemente la realidad. Uno de ellos es que fue un investigador sin raíces en la historia científica de nuestro país, “surgido por generación espontánea”, como llegó a decir Ortega y Gasset. Ello significa, por un lado, desconocer la tradición micrográfica española y, por otro, ignorar el ambiente, encabezado por Maestre de San Juan, en el que Cajal se inició en la observación microscópica. Otro de los supuestos minimiza la llamada Escuela Histológica Española, surgida en torno a la obra del gran investigador aragonés, y olvida los distintos grupos que la integraban, comenzando por no distinguir entre sus discípulos propiamente dichos y los autores influidos por él de forma menos directa. Por otra parte, la pervivencia de la obra de Cajal en la comunidad científica internacional se debe a una razón muy clara: lo mismo que Darwin, Pasteur, Virchow, Mendel o Claude Bernard, Cajal creó uno de los 72
modelos que hoy sirven de núcleos de cristalización a las ciencias biológicas. Concretamente, formuló el vigente en la actualidad acerca de la estructura del sistema nervioso y los mecanismos básicos de su funcionamiento. De forma directa, la obra cajaliana constituye uno de los fundamentos de los saberes acerca de la anatomía, la fisiología y las enfermedades nerviosas y, de modo indirecto, una de las contribuciones centrales en las que se apoyan la concepción de los organismos vivos y las ciencias de la conducta. Por ello, no resulta extraño que sea una figura familiar para cualquier cultivador de las neurociencias y conocida, en mayor o menor grado, por los que se dedican a otras tareas de la biología, la medicina o la psicología. La tradición micrográfica española
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a la mera recepción libresca de las nuevas corrientes europeas. El paso de esta asimilación puramente libresca a la recuperación de la micrografía práctica, de acuerdo con las nuevas teorías y los nuevos recursos técnicos, se inició en España en los años centrales del siglo XIX y se afianzó en la década siguiente. A dicho proceso contribuyeron notablemente personas y grupos científicos de vanguardia, situados más o menos al margen del mundo académico oficial. Aprovechando la completa libertad docente implantada por la revolución democrática de 1868, algunos de ellos fundaron instituciones privadas que contaron desde el principio con laboratorios o cátedras de anatomía microscópica. Como ejemplos típicos anotaremos el Instituto Biológico de Rafael Martínez Molina, quien fue el primero que apoyó la carrera científica de Cajal, y el Museo Antropológico de Pedro González de Velasco, en cuyo edificio se instalaría a comienzos del siglo XX el laboratorio en el que traba jaron el gran neurobiólogo y sus discípulos.
os primeros micrógrafos españoles fueron varios miembros del movimiento novator que, en el último tercio del siglo XVII , introdujo en España la ciencia moderna. Destacó entre ellos el valenciano Crisóstomo Martínez, coetáneo de Malpighi, Leeuwenhoek y Hooke, el importante “microscopista clásico” de las estructuras óseas. A lo largo del siglo XVIII , la anatomía tex- 1. “ESQUEMA de la estructura del cerebetural y la observación microscópica se lo. Cortes transversal y longitudinal de una cultivaron en nuestro país de modo lámina cerebelosa”. Lámina mural diseñacontinuado, desde los variados enfo- da por Cajal y pintada por R. Padró. Biblioques que expone María Luz Terrada teca y Museo Historicomédicos, Valencia. en su monografía sobre el tema. Por Cajal la diseñó con motivo de la serie de el contrario, el profundo colapso que conferencias que pronunció en marzo de la vida científica española sufrió 1892 en la Academia de Ciencias Médicas, durante la guerra de la Independencia de Barcelona, bajo el título general de y el reinado de Fernando VII (1808- “Nuevo concepto de la histología de los 1833) redujo la actividad en este campo centros nerviosos”. TEMAS 29
A I C N E L A V E D O C I D E M O C I R O T S I H O E S U M Y A C E T O I L B I B
A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
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modo decisivo en la trayectoria de Cajal.
A I C N E L A V E D O C I D E
La obra neurohistológica de Cajal
M O C I R O T S I H O E S U M Y A C E T O I L B I B
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2. RECONSTRUCCION del laboratorio de Cajal instalado en su domicilio de Valencia (1884).
La importancia de los grupos extraoficiales no debe hacer olvidar que algunos profesores de las universidades oficiales participaron tempranamente en el esfuerzo de incorporar de modo práctico las nuevas corrientes histológicas. Sobresalió entre todos ellos Aureliano Maestre de San Juan (18281890), cabeza de la histología universitaria española anterior a Cajal. Maestre de San Juan se consagró a la histología a partir de 1860, fecha en la que pasó a ocupar una de las cátedras de anatomía de la Facultad de Medicina de Granada. Entre 1863 y 1867, completó su formación en diferentes laboratorios de Francia, Alemania y Gran Bretaña. Su prestigio pesó de modo decisivo en la dotación en dicha Facultad de la primera cátedra oficial española de histología (1873). Nombrado titular de la misma por concurso, Maestre realizó desde ella una labor didáctica ejemplar, no solamente doctrinal sino, sobre todo, práctica. En su labora74
torio, tomaron contacto con las técnicas histológicas numerosos médicos españoles, entre ellos, el propio Ramón y Cajal. De los demás cultivadores españoles de la anatomía microscópica coetáneos de Cajal que iniciaron su actividad en esta época, anotaremos únicamente la trayectoria inicial de Luis Simarro Lacabra (1851-1921). Simarro trabajó en el laboratorio micrográfico del Museo Antropológico de González de Velasco y enseñó en su Escuela Libre de Medicina y Cirugía. Más tarde, completó su formación asistiendo a los cursos y a las sesiones de la Sociedad Histológica Española fundada por Maestre. Desde 1880 a 1885 trabajó en París junto a figuras como Charcot y Magnan y se especializó en neuropsiquiatría. Fue entonces también discípulo de Ranvier, que orientó el punto de partida de su labor neurohistológica. De regreso a España, Simarro montó en Madrid un laboratorio histológico que, como vamos a ver, influyó de
acido en la aldea de Petilla de Aragón el año 1852, Santiago Ramón y Cajal fue hijo de un ciru jano rural que con grandes esfuerzos llegó a conseguir el título de médico. Su niñez discurrió en una serie de pequeñas localidades del Alto Aragón. Tras estudiar el bachillerato en Jaca y Huesca, cursó medicina en una modesta “escuela provincial” creada en Zaragoza al amparo de la libertad docente implantada por la revolución democrática de 1868. Poco después de graduarse (1873) ganó unas oposiciones a médico militar y estuvo ocho meses en el ejército que operaba en Cataluña contra los carlistas. A continuación fue trasladado a Cuba, donde participó en la guerra colonial hasta su regreso a la península, a mediados de 1875. Recuperado del paludismo que había contraído en Cuba, la influencia de su padre, que le había ya inclinado a convertirse en médico, pesó también en su decisión de dedicarse a la docencia universitaria de la anatomía. Su primer contacto con la histología se produjo en 1877, con ocasión de cursar en Madrid los estudios de doctorado. “Sugestionado —según el propio Cajal— por las “bellas preparaciones micrográficas” que le enseñaron Maestre de San Juan y López García, decidió dedicarse a la disciplina y, a su regreso a Zaragoza, gastó todos sus ahorros en instalar un modesto laboratorio micrográfico. Contra lo que suele afirmarse con frecuencia, su relación con Maestre y López García no se redujo a este contacto inicial. Volvió varias veces a su laboratorio en el curso de la siguiente década y durante la fase inicial de su obra fue un fiel seguidor de las ideas de Maestre, a quien dedicó en sus memorias un recuerdo muy expresivo. Cajal fracasó en sus primeras oposiciones a cátedra en 1880, en las que sólo tuvo el apoyo de Martínez Molina, pero en 1883 ganó la de anatomía de la Facultad de Medicina de Valencia. Durante los casi cuatro años que estuvo al frente de la misma, Ca jal se orientó en el mundo de la investigación. Publicó trabajos sobre diferentes tejidos, así como un Manual de Histología , cuyo primer fascículo apareció en 1884. Con motivo de la vacunación anticolérica de Jaime Ferrán, se ocupó también de cuestiones bacteriológicas en 1885. No obstante, acabó centrándose en la neurohistología, sobre TEMAS 29
todo después de una estancia en cogiendo bien la fase evolutiva (del Madrid en 1887 como miembro de un embrión), las células nerviosas, relatribunal de oposiciones. Visitó enton- tivamente pequeñas, destacan ínteces los principales laboratorios micro- gras dentro de cada corte; las ramigráficos de la capital, entre ellos el de ficaciones terminales del cilindroeje Luis Simarro, quien le enseñó el mé- dibújanse clarísimas y perfectamente todo de impregnación cromoargénti- libres; los nidos pericelulares, esto ca de Camillo Golgi. es, las articulaciones interneuronaEn el mismo 1887, la histología les, aparecen sencillos, adquiriendo pasó del doctorado a la licenciatura. gradualmente intrincamiento y exSe crearon nuevas cátedras de la tensión; en suma, surge ante nuesmateria y Cajal ocupó la de Barcelona tros ojos, con admirable claridad y prehasta que, en 1892, fue trasladado a cisión, el plan fundamental de la la de Madrid, de la que fue titular composición histológica de la sustanhasta su jubilación. En 1901, cuando cia gris”. ya era una figura de primera imporSobre estas bases, Cajal se dedicó tancia en el mundo científico inter- a la investigación, “no ya con ahínco, nacional, se le encargó la dirección sino con furia”. Su actividad cientídel Laboratorio de Investigaciones fica durante 1888 y 1889 fue tan Biológicas, creado por el peso que intensa que, para dar a conocer sus tuvieron los premios y distinciones trabajos, además de enviar artículos concedidas a su labor en el extran- a diferentes publicaciones periódi jero, que culminarían más tarde en cas, tuvo que editar a su costa una la concesión del premio Nobel con- Re vi st a Tr im es tr al de Hi st ol og ía juntamente con Golgi (1906). Norm al y Pa tológic a , de la que solamente aparecieron tres números. Sin embargo, los diez trabajos que publicó El nuevo concepto en ella abrieron una nueva etapa en de la histología de los centros nerviosos el conocimiento de la estructura del iendo ya catedrático de histolo- sistema nervioso. gía, primero en Barcelona (1888En el trabajo que inició dicha serie, 1892) y después en Madrid, Cajal con- titulado “Estructura de los centros virtió el método de Golgi en la primera nerviosos de las aves”, Cajal demosarma técnica de su obra de investiga- tró por vez primera con datos inedor, sobre todo después de introdu- quívocos que las ramificaciones de cir la modificación que denominó las neuritas no acaban en la sustan“proceder de doble impregnación”, cia gris en una red difusa, sino que permitía obtener tinciones más mediante arborizaciones libres. Lo complejas. Por otra parte, consideró consiguió, en concreto, al estudiar el como “resorte principal” y “causa ver- axón de las llamadas células estredaderamente eficiente” de sus espec- lladas pequeñas de la capa molecutaculares descubrimientos la utili- lar del cerebelo. A esta observación zación del método ontogénico, es decir, crucial añadió, tres meses después, el estudio de los centros nerviosos de otros dos hallazgos de parecida imporembriones de ave y mamíferos, en lu- tancia, en el artículo “Sobre las fibras gar de comenzar directamente con nerviosas de la capa molecular del los animales adultos, como hasta cerebelo”: el primero fue el descuentonces se había hecho. brimiento del axón de los gr an os , Explicó esta alternativa con una diminutas células de la corteza ceremetáfora muy expresiva: “El (medio) belosa, que se divide a diversas altumás natural y sencillo al parecer, ras en ángulo recto, produciendo unas pero en realidad más difícil, consiste larguísimas proyecciones, que denoen explorar intrépidamente la selva minó fibr as paralelas por discurrir adulta, limpiando el terreno de arbus- paralelamente al sentido de la circuntos, plantas parásitas, y aislando cada volución cerebelosa; el segundo, el de especie arbórea tanto de sus parási- las fibr as tr epadoras que, procedentos como de sus congéneres. (...) Mas tes de los ganglios de la protuberansemejante táctica resulta poco apro- cia, cruza sin ramificarse las capas piada en la dilucidación del problema de los granos para contactar con las propuesto, a causa de la enorme lon- células de Purkinje, elementos de gitud y extraordinaria frondosidad grueso soma piriforme descritos por del ramaje nervioso, que inevitable- este gran histólogo checo en 1838. mente aparece mutilado y casi indes- Ambos hallazgos volvieron a confircifrable en cada corte. (...) Puesto que mar que la transmisión de los impulla selva adulta resulta impenetrable sos nerviosos se hacía por contacto, e indefinible, ¿por qué no recurrir al desmintiendo de modo terminante la estudio del bosque joven, como si dijé- teoría reticular. ramos, en estado de vivero? (...). EsCasi simultáneamente, en dos tra-
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bajos aparecidos en mayo y agosto de 1888, Cajal consiguió también reducir a los nuevos supuestos la estructura de la retina, que continuaría después investigando varios años hasta la aparición de su clásica monografía sobre el tema, primero en francés (1892) y luego en alemán (1894). El tercer territorio en el que demostró la individualidad de las células nerviosas y la terminación por contacto de sus prolongaciones fue la médula espinal, en la que concentró sus esfuerzos durante 1889. Cajal se preocupó inmediatamente de difundir internacionalmente los resultados de sus investigaciones, con clara conciencia de que no bastaba enviar ejemplares de su revista o separatas de sus artículos a destacadas figuras científicas europeas. Por ello, a finales de 1889 y comienzos de 1890, publicó traducciones francesas de tres trabajos suyos donde exponía los hallazgos más importantes que había conseguido acerca de la estructura del cerebelo, la retina y la médula espinal. Sin embargo, la acogida que tuvieron estas publicaciones no pudo ser más decepcionante. La condición marginal de la actividad científica española en la biomedicina europea de la época y también las dificultades que la mayoría de los histólogos habían tenido al utilizar el método de Golgi contribuyeron, sin duda, a que los trabajos de Cajal fueran inicialmente recibidos con desconfianza. No obstante, la principal dificultad residía en la misma importancia de sus descubrimientos y en el hecho de que contradijeran frontalmente las ideas generalmente admitidas. Para superar dicha desconfianza, Cajal decidió aprovechar el congreso que la Sociedad Anatómica Alemana iba a celebrar en Berlín a comienzos de octubre de 1889, mostrando en él las preparaciones más claramente demostrativas de sus descubrimientos. En dicho congreso, tras la lectura y discusión de las ponencias y comunicaciones orales, se dedicó un día a las demostraciones prácticas, sección en la que estaba inscrito Cajal. Según el testimonio de Van Gehuchten, Cajal estaba solo, “no suscitando en torno suyo sino sonrisas incrédulas. Todavía creo verlo tomar aparte a Kölliker, entonces maestro incontestable de la histología alemana, y arrastrarlo a un rincón de la sala de demostraciones, para mostrarle en el microscopio sus admirables preparaciones y convencerle al mismo tiempo de la realidad de los hechos que pretendía haber descubierto. La demostración 75
fue tan decisiva que, algunos meses más tarde, el histólogo de Würzburg confirmaba todos los hechos afirmados por Cajal”. El escepticismo inicial de Kölliker se convirtió en vivo interés cuando observó las clarísimas imágenes de las preparaciones del aragonés y éste le explicó —según anota en sus Recuer dos — “en un francés chabacano, menuda y pacientemente, todos los pequeños secretos de manipulación de la reacción cromo-argéntica”. Inmediatamente después, Kölliker realizó una serie de trabajos de confirmación, utilizando la técnica de la doble impregnación, que le hicieron abandonar la teoría reticular y aceptar plenamente las concepciones de Cajal. Los dos primeros, dedicados al cerebelo y la médula espinal, aparecieron en 1890 en su propia revista, una de las más influyentes de la mor fología de la época. Kölliker se encontraba entonces en la cumbre de su prestigio científico, tras casi medio siglo de ejemplar dedicación a la investigación histológica. Su Handbuch der Gew ebe lehre des Menschen —cuya edición original apareció en 1852, el mismo año de l nacimiento de Cajal— fue el primer tratado moderno de la disciplina. En consecuencia, no resulta extraño que su terminante respaldo a las contribuciones del investigador español pesara decisivamente en la trayectoria científica de éste.
Poco después que Kölliker, casi todas las grandes figuras de la neurohistología europea asimilaron los hallazgos de Cajal y aceptaron su nueva concepción de la estructura del sistema nervioso. Estimulado por la acogida que su labor estaba obteniendo, Cajal trabajó de modo casi frenético durante 1890, año en el que publicó nada menos que diecinueve artículos, seis de los cuales aparecieron en francés en diferentes revistas morfológicas europeas. Entre otras aportaciones de menor interés, expuso en ellos sus primeras investigaciones sobre el cerebro de los mamíferos, la demostración de que la estructura de las vías olfatorias se ajustaba a la teoría de la neurona y, sobre todo, una serie de observaciones acerca del desarrollo embrionario de las células y las fibras nerviosas de la médula espinal y el cerebelo. Polarización dinámica
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urante 1891 y los primeros meses de 1892, Cajal continuó realizando trabajos de carácter analítico, principalmente sobre la retina, el cerebro y los ganglios simpáticos. Formuló también entonces la ley de la polarización dinámica de las neuronas —una de sus aportaciones teóricas más perdurables— y ofreció una síntesis de su concepción de la estructura del sistema nervioso que alcanzó difusión internacional.
3. ILUSTRACIONES de la comunicación de Cajal al Congreso Médico Farmacéutico Regional celebrado en Valencia en 1891, en la que expuso por vez primera la ley de la polarización dinámica de las neuronas. 76
El problema de la dirección del impulso nervioso dentro de la neurona lo había examinado ya con anterioridad, pero no llegó a una formulación doctrinal madura hasta 1891, cuando dispuso de sólidas series de datos en que basarla y bajo el estímulo de un comentario de Van Gehuchten a sus opiniones sobre la materia. La expuso por vez primera en una comunicación que presentó al Primer Congreso Médico-Farmacéutico Regional celebrado en Valencia en julio de dicho año y que se publicó después en sus Actas . La tituló “Comunicación acerca de la significación fisiológica de las expansiones protoplasmáticas y nerviosas de las células de la sustancia gris” y es actualmente considerado un texto clásico crucial de las neurociencias contemporáneas. El propio Cajal también le concedió gran relieve dentro de su trayectoria científica y resumió la teoría de la polarización dinámica que se defiende en ella de la siguiente forma: “La transmisión del movimiento nervioso tiene lugar desde las ramas protoplásmicas hasta el cuerpo celular, y desde éste a la expansión nerviosa. El soma y las dendritas representan, pues, un aparato de recepción, mientras que el axón constituye el órgano de emisión y repartición”. La síntesis a la que nos hemos refe rido la ofreció Cajal en una serie de conferencias que pronunció en marzo de 1892 en la Academia de Ciencias Médicas, de Barcelona, bajo el título general de “Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos”. Su texto apareció originalmente en varios números de la Rev ist a de Cie nci as Médicas de Barcelona y luego fue reunido en un folleto. Casi inmediatamente se publicó una traducción alemana por iniciativa de His y con un prefacio suyo. Poco después lo hizo una traducción francesa, precedida de un prólogo de Mathias Duval, que tuvo tal éxito que se agotaron en un trimestre dos copiosas ediciones. El traductor fue en este caso Léon Azoulay, el mismo que se encargaría dos décadas después de la versión de la Textura del sistema nervioso, la principal obra de Cajal. La acogida que tuvo esta primera síntesis fue precisamente uno de los factores que más pesaron en su decisión de escribir el gran tratado. En 1892, el mismo año de su traslado a Madrid, apareció la versión francesa del principal estudio monográfico que Cajal dedicó a la retina. Fue publicado por la revista belga La Cellule con el título de La rétine de s TEMAS 29
vertébrés e incluía, ampliados e ilus-
trados con nuevas figuras, todos los hallazgos sobre el tema que había ido dando a conocer hasta entonces en artículos en castellano. Durante sus cinco primeros años de estancia en la capital continuó investigando con el método de Golgi la estructura de otras zonas del sistema nervioso. El resultado general fue comprobar, en todas ellas, la teoría de la neurona —es decir, el contacto entre somas y arborizaciones nerviosas—, así como la ley de la polarización dinámica. En 1896, un año en el que se dedicó de manera particularmente intensa al trabajo de laboratorio, comenzó a utilizar el método de Ehrlich, técnica que permite teñir en vivo, o casi en vivo, las fibras y células nerviosas. Con las imágenes clarísimas de color azul intenso que obtuvo aplicándolo, consiguió contrarrestar la desconfianza de algunos histólogos escépticos que habían insinuado la posibilidad de que algunas tinciones con el cromato de plata fuesen “artefactos”. Trabajos teóricos
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edactó también entonces algunos trabajos de carácter teórico, el más importante de los cuales fue la comunicación Consideraciones generales sobre la morfología de la célula nerviosa, que envió al Congreso Inter-
nacional de Medicina celebrado en Roma en 1894. Su tesis central es que la ontogenia (o desarrollo embrionario) del sistema nervioso reproduce de modo abreviado, con algunas simplificaciones y saltos, su filogenia (o desarrollo evolutivo de las especies). Se trata, por lo tanto, de una aplicación directa de la ley biogenética fundamental, núcleo de la morfología darwinista. Cajal afirmó que, a lo largo del desarrollo filogénico de los vertebrados, se advierte siempre la presencia simultánea de un sistema nervioso sensorial y otro cerebro-cortical, perfeccionándose este último no sólo por extensión sino por diferenciación estructural y morfológica de sus elementos. De acuerdo con este modelo de progreso morfológico, “la excelencia intelectual (...) no depende de la talla o caudal de las neuronas cerebrales, sino de la copiosidad de sus apéndices de conexión, o en otros términos, de la complejidad de las vías de asociación a cortas y a largas distancias”. Tres años más tarde reelaboró este modelo evolucionista en un artículo titulado “Leyes de la morfología y dinamismo de las células nerviosas”, en el que expuso, además, una A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
nueva formulación de la ley de la polarización dinámica de las neuronas. El propio Cajal consideró en su madurez que, en estos trabajos teóricos, “la elaboración especulativa sigue muy de cerca al hecho de observación” y que los modelos que defienden corresponden a “legítimas inducciones o hipótesis plausibles”. En cambio, se arrepintió de otro artículo suyo de 1895 sobre “el mecanismo histológico de la asociación, ideación y atención”, al que llamó “aventuradísima lucubración en la que campea, muy a su sabor y talante, la loca de la casa”. La obra de Cajal, que había ya alcanzado amplia difusión y prestigio en los ambientes científicos del continente europeo, recibió en 1894 el reconocimiento formal de la comunidad científica británica. A comienzos de dicho año fue invitado a pronunciar la “Croonian Lecture” por la Royal Society. En Londres se hospedó en la casa de Charles Scott Sherrington, que estaba entonces iniciando la labor de investigación que lo convertiría en la máxima figura de la neurofisiología del siglo XX . Sus aportaciones fisiológicas se basaron de modo sistemático en la obra de Cajal acerca de la estructura del sistema nervioso, hasta el punto de que varios términos hoy generalmente utilizados para designar algunas de las concepciones básicas del histólogo aragonés fueron neologismos acuñados por él. El más importante, el de sinapsis , lo propuso inicialmente en 1897, al resumir las ideas de Cajal acerca de la conexión por contacto y no por continuidad entre las células nerviosas. En su madurez, Sherrington reconoció en los siguientes términos el apoyo de la neurofisiología en la obra de Cajal: “¿Sería mucho decir que fue el anatómico del sistema nervioso más grande que se ha conocido? Durante mucho tiempo esa materia fue el tema favorito de los mejores investigadores; antes de Cajal se hicieron descubrimientos, pero éstos a menudo dejaban al médico más confuso que antes, aumentando el desconcierto. Cajal, en cambio, hizo posible, incluso para un bisoño, reconocer con una ojeada la dirección que toma la corriente nerviosa en la célula viva y en la cadena compleja de células nerviosas. Resolvió de una vez el gran problema de la dirección de las corrientes nerviosas en su recorrido a través del cerebro y la médula espinal...”. En su “Croonian Lecture”, Cajal resumió sus hallazgos e ideas en fran-
cés, con el título de La fine structure des centres nerveux. Como solía hacerse con los invitados a esta conferencia, fue nombrado doctor honoris causa por la Universidad de Cambridge. La ceremonia de investidura se hizo de acuerdo con la devoción inglesa por lo tradicional. El elogio del nuevo doctor pronunciado en latín por el orator terminó con un juego de palabras en honor de las tinciones argénticas de Cajal: el poeta hispanorromano Marcial, nacido también en Aragón, ya había “aprendido por experiencia que en la vida no puede hacerse casi nada sin plata” (“ exper tus didici t fer e nihil in vit a sine ar gent o posse per fici ”). La “Textura del sistema nervioso del hombre y de los ver teb rados”
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n 1897, Cajal inició la publicación, por una parte, de la Revi sta Trimestral Micrográfica y, por otra, del gran tratado Textura del sistema nervioso del hombre y de los vertebrados . La primera se convirtió desde
entonces en el principal medio que fue dando a conocer su labor de investigación personal y la de su escuela. Apareció hasta 1901, fecha en la que fue continuada por Trabajos de Laboratorio de Investigaciones Biológicas de la Universidad de Madrid, que se editó con presupuesto oficial a partir de la fundación del centro de este nombre. La Textura del sistema nervioso fue su libro más importante, “mi obra magna”. El proyecto de redactar este libro, tal como adelantamos, fue en buena parte consecuencia de la extraordinaria acogida que tuvieron las ediciones castellana, alemana y francesa de su síntesis de 1892. Concibió entonces el proyecto de “escribir un libro extenso donde se estudiara sistemática y minuciosamente la textura del sistema nervioso de todos los vertebrados y se diera cuenta, con los necesarios desarrollos, de la totalidad de mi obra científica”. La Textura del sistema nervioso del hombre y los vertebrados —principal aporta-
ción de nuestro idioma a los grandes textos clásicos de la ciencia contemporánea— fue publicado en Madrid, entre 1897 y 1904, por la Imprenta y Librería de Nicolás Moya, una de las empresas editoras de libros médicos más importantes de la España de la época. Consta de dos volúmenes, el primero de casi seiscientas páginas y el segundo de más de mil doscientas. Como muchos otros textos científicos de este período, entre ellos el 77
4. ENTRE LOS NUMEROSOS trabajos que Cajal y sus discípulos realizaron con el método del nitrato de plata reducido —que permite ver la estructura interna de las células nerviosas— figura el dedicado a los ganglios terminales del nervio acústico de las aves (1908), al que corresponde este grabado. Dibujado, como de costumbre, por el propio Cajal, es una de las más bellas cromolitografías que aparecieron Manual de Histología del propio Cajal,
fue apareciendo por fascículos desde 1897 a 1904. Cinco años después de esta última fecha comenzó a publicarse en París la traducción francesa de la gran obra de Cajal, con el título de Histologie du syst ème ner veux de l’homme et des vertébrés (1909-1911). Se trataba de un texto “revisado y puesto al día por el autor”, que tradujo Léon Azoulay, quien ya había vertido al francés otras obras del neurohistólogo aragonés, como sabemos. La principal novedad técnica en el lapso de tiempo transcurrido entre ambas ediciones fueron los llamados métodos de tinción neurofibrilares. De su aplicación proceden fundamentalmente los cambios, casi siempre adiciones, que introdujo Cajal en la edición francesa. En esta colosal síntesis de neu78
en su revista: 1, corte frontal de la región acústica bulbar de un embrión de pollo de seis días. 2 , Corte frontal de ganglios cocleares de un gorrión de quince días. 3 , Corte frontal de ganglios acústicos de un gorrión de quince días. 4 , Neuronas del núcleo de grandes células. 5 , Células estrelladas procedentes de la región cefálica de dicho núcleo. 6 , Detalles de plexos terminales en el foco laminar.
rohistología comparada, Cajal continuó fiel a los supuestos básicos de la morfología evolucionista, desarrollando las formulaciones a las que hemos aludido al comentar sus trabajos teóricos anteriores. Como en el caso de John Hughlings Jackson —creador de otro de los paradigmas de las neurociencias del siglo pasado— la fuente intelectual básica del evolucionismo de Cajal es la obra de Herbert Spencer. Entre las ediciones de sus libros que cita figuran, por supuesto, las traducciones castellanas de Miguel de Unamuno. La estructura interna de la célula nerviosa. La degeneración de los nervios
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uando terminó la publicación de su gran obra La text ura del sis-
tema nervioso,
en 1904, Cajal había alcanzado brillantemente la meta que se había propuesto con el examen sistemático de todos los territorios nerviosos con el método de Golgi: demostrar la individualidad de las neuronas, aclarar su comportamiento genético y ofrecer un modelo estructural del funcionamiento del sistema. Sin embargo, se le había planteado poco antes la necesidad de conocer la estructura interna de la célula nerviosa, problema para el que le resultaba necesaria una nueva técnica. Dicha necesidad pasó a primer plano porque se hicieron críticas frontales a la teoría de la neurona, r eformulando la teoría reticular sobre la base de que las neurofibrillas que existían en el seno de las células nerviosas formaban una red continua interneuronal que sería responsable TEMAS 29
de la propagación del impulso nervioso. Aunque desde hacía tiempo se venía hablando de forma imprecisa de tal urdimbre neurofibrilar, la cuestión no se planteó en estos términos hasta los primeros años del siglo pasado, tras los trabajos en invertebrados del húngaro István Apáthy y, sobre todo, a partir de las indagaciones sobre las neurofibrillas del sistema nervioso de los vertebrados realizadas por el profesor de Estrasburgo Albrecht Bethe, quien se convirtió en la cabeza del nuevo reticularismo, con el apoyo algo posterior de Hans Held, traductor de la primera síntesis de Cajal. Muchos neurohistólogos pusieron en duda la teoría de la neurona y algunos la abandonaron abiertamente, situación a la que aludió Golgi en su conferencia Nobel. Convencido de que la solución del problema residía en “contemplar las susodichas neurofibrillas en preparaciones irreprochables”, cosa que en modo alguno habían conseguido Bethe y sus seguidores, Cajal trabajó intensamente en busca de la técnica de tinción apropiada. Tras numerosos ensayos infructuosos la encontró, por fin, en octubre de 1903, partiendo del “proceder fotográfico” original de Luis Simarro, que había conseguido con él impregnar las neurofibrillas mediante las sales fotográficas de plata. Ideó de esta forma el célebre método del nitrato de plata reducido, consistente básicamente en la inmersión directa de los tejidos nerviosos en nitrato de plata, mantenimiento de los mismos en estufa durante cuatro días, y reducción en bloque y en la oscuridad de la sal argéntica mediante un baño de ácido pirogálico. El método del nitrato de plata reducido fue utilizado sistemáticamente durante una década por Cajal y sus discípulos, dando como primer resultado el conocimiento de la disposición de las neurofibrillas en el protoplasma nervioso y en las arborizaciones pericelulares. En el trienio 1905-1907, Cajal lo aplicó asimismo al estudio de la regeneración y la degeneración de los nervios y de las vías nerviosas centrales, tema que había sido una de las principales fuentes de los argumentos de los autores opuestos a la teoría neuronal. Defendían éstos que la regeneración del segmento distal de un nervio seccionado se debe a la transformación de las células de revestimiento del mismo que habían persistido tras la degeneración de sus fibras. Frente a esta hipótesis, Cajal demostró que las fibras nuevas que aparecen en dicho segmento distal A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
son brotes axónicos procedentes del cabo central, cuyas fibras mantienen su vitalidad porque siguen unidas al soma neuronal. Sus investigaciones sobre esta cuestión fueron más tarde recogidas en dos volúmenes titulados Estudio s sobr e la degeneración y regeneración del sistema nervioso
(1913-1914). A partir de 1907, Cajal aplicó su técnica de tinción a investigaciones comparadas de la textura del cerebelo y del bulbo raquídeo, al estudio de la génesis de los nervios motores y sensoriales y las expansiones neuronales en el embrión, así como al análisis de la estructura del núcleo neuronal. Como consecuencia de tan amplia labor, el neuronismo logró superar por completo las críticas que le habían planteado los nuevos defensores del reticularismo. Ultimas aportaciones. Los centros nerviosos de los insectos. Testamento científico
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uando ya había cumplido los sesenta años, en 1912 y 1913, Cajal ideó todavía dos nuevos métodos de tinción: la técnica del formol-urano y la del oro-sublimado. Con la primera consiguió precisar numerosos detalles acerca de la disposición, fases evolutivas y conexiones del aparato de Golgi, retículo endoneuronal que el histólogo italiano había observado por vez primera a finales del siglo XIX . Con la segunda resolvió el problema de la impregnación de un tipo de neuroglía, es decir, del tejido que forma la sustancia de sostén de los centros nerviosos, que era especialmente difícil de teñir con los métodos anteriores: la llamada neuroglía protoplásmica o de radiaciones cortas. Esta innovación resultaría decisiva para las investigaciones que sobre la glioarquitectónica desarrollaron después Nicolás Achúcarro y Pío del Río Hortega, otras dos grandes figuras de la neurohistología española. Entre sus trabajos posteriores destacan las investigaciones que realizó a partir de 1915 en torno al ojo y la retina de los insectos, que realizó en gran parte en colaboración con Domingo Sánchez. Su resultado, junto a la crisis experimentada por el darwinismo durante el período de entreguerras, le condujo a un cierto distanciamiento de la explicación darwinista de las formas anatómicas a lo largo de la serie filogénica: “No debo ocultar —afirmó en sus Recuerdos — que en el estudio de la retina sentí por vez primera flaquear mi fe darwinista (hipótesis de la selección
natural), abrumado y confundido por el soberano ingenio constructor que campea, no sólo en la retina y en el aparato dióptrico de los vertebrados, sino hasta en el ojo más ruin de los insectos”. La principal ilusión científica de Cajal, durante la fase final de su vida fue la publicación de una tercera edición, ampliada y actualizada, de su gran libro Textura del sistema nervioso. Llegó incluso a redactar las condiciones de publicación de la misma, para la que fue reuniendo abundantes materiales y notas que desaparecieron por razones no bien aclaradas, pérdida que aceleró su muerte. Llegó, sin embargo, a redactar un amplio trabajo de conjunto sobre la teoría de la neurona, de casi cien páginas, con destino al primer volumen del Ha nd bu ch de r Neurologie dirigido por O. Bumke y O. Foerster. La publicación de este texto, verdadero testamento científico de Cajal, se retrasó más de lo previsto, con gran contrariedad de su autor. Por ello publicó en 1933 una nueva redacción en castellano en la revista Archivos de Neu rob iologí a, con el título de “¿Neuronismo o reticularismo? Las pruebas objetivas de la unidad anatómica de las células nerviosas”, apareciendo además una versión francesa de la misma al año siguiente en el anuario del Laboratorio de Investigaciones Biológicas. El texto original traducido al alemán, Die Neuronenle hre , lo hizo de forma póstuma en 1935, tal como temía Cajal. En la conclusión de esta síntesis, que coronaba una labor de medio siglo, subrayó que el principal resultado general de la misma era superar el último y más difícil reducto que se oponía al modelo celularista de organismo, a su concepción como “asociación de células relativamente autónomas”: “No temamos, pues, que al embate de los reticularistas, la vieja y genial concepción de Virchow sufra quebrantos”.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA CAJAL Y SU LABOR HISTOLÓGICA . Jorge Francisco Tello. Universidad Central, 1935. SANTIAGO RAMÓNY CAJALOLA PASIÓNPOR E SPAÑA. Agustín Albarracín Teulón. Labor, 1978. CAJAL. A NTOLOGÍA. Edición y estudio introductorio por José M. López Piñero. Península, 1986. RAMÓN Y CAJAL. José M. López Piñero. 2a edición. Salvat, 1988.
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Las primeras observaciones La repetición de los experimentos que realizaron los primeros microscopistas muestra lo que ellos percibieron con sus rudimentarios instrumentos constituidos por una sola lente Brian J. Ford
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n 1674 Antony van Leeuwenhoek descubría, mientras miraba a través del microscopio que había construido, un mundo nuevo, fascinante. Nuestro holandés aficionado a la ciencia se sorprendió cuando, observando la baba que había recogido de la superficie de un lago, halló organismos desconocidos: “Quedé maravillado ante el número de animálculos que se movían raudos por el agua, de aquí para allá, arriba y abajo”. Con Leeuwenhoek, que vivió de 1632 a 1723, se inauguró la microbiología. Antes de que floreciera la ciencia de la óptica, Leeuwenhoek talló con sus manos más de 500 microscopios. Con ellos, registró, además de los “animálculos” o microorganismos, muchas estructuras celulares,
eritrocitos y espermatozoides. Describió bacterias, protozoos, rotíferos, células vegetales y hongos. Pese a todo, muchos contemporáneos le despreciaron y tildaron de diletante y fantasioso. Su perspicacia no prendió. Hasta mediados del siglo XIX —la época de Louis Pasteur— no se aceptó la idea de microorganismo. Incluso hoy no faltan quienes niegan que Leeuwenhoek viera lo que afirmaba haber visto con su rudimentario instrumento de una sola lente. La investigación moderna se ha servido de un microscopio de Leeuwenhoek para aducir que con los aumentos de sus aparatos no podía lograr la finura de detalle a la que arriba en sus notas. Por ejemplo, de los eritrocitos sólo podía ver manchas borrosas.
Los detractores de Leeuwenhoek han esgrimido recriminaciones similares contra Robert Brown. En 1827, el joven cirujano escocés dio testimonio de un fenómeno que hoy lleva su nombre: el movimiento browniano. Observó en el seno celular el movimiento incesante de partículas minúsculas. Unos años después, Brown dio con otro fenómeno inédito mirando por su microscopio monocular. En su viaje a Australia en busca de plantas exóticas se prendó de las orquídeas que herborizaba. Después de examinar una y otra vez diferentes células vegetales, llegó a la conclusión de la existencia de una estructura que se repetía en todas ellas: “En cada célula de la epidermis... aparece una areola circular, más opaca
1. CELULAS LUMINOSAS de Tra- descantia virginiana, traídas a primer plano con un microscopio de Robert Brown, cuando las baña la luz solar (página siguiente, arriba). Con el microscopio de Antony van Leeuwenhoek, que se conserva en la Universidad de Utrecht, se distingue de forma nítida los hematíes (iz- quierda); incluso el núcleo lobulado de un leucocito podría identificarse con ese aparato elemental. Un microscopio monocular moderno ofrece también imágenes impresionantes: células de levadura (centro ) y esporas fúngicas (derecha). 170 ×
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que la membrana”. Brown no tardó en establecer que se trataba de un rasgo común de las células de muchos organismos. Con el tiempo, le impuso el nombre que todavía perdura: “el núcleo celular”. Igual que ocurrió con Leeuwenhoek, los trabajos de Brown no recibieron el aprecio debido. En manuales contemporáneos se lee que Brown observó sólo el movimiento de granos de polen, pero no el movimiento mucho más sutil del interior celular. En una reciente revisión de la capacidad del microscopio de Brown se concluía que ese instrumento pudo haber sido útil
para la disección, pero en ningún caso para resolver estructuras de la parvedad del núcleo. He empleado los microscopios originales de ambos genios y he construido mis propios monoculares. Con ellos, he recreado los experimentos pioneros de Leeuwenhoek y Brown. No es tarea fácil, si tenemos en cuenta que carecemos de cualquier informe detallado sobre los métodos que siguieron; además, debe realizarse con sumo cuidado el ajuste de los microscopios y acomodarse fielmente a su proceder. Pues bien, frente a lo que muchos objetaban, con un microsco-
pio simple se observan bacterias, núcleos celulares y movimiento browniano. Con el microscopio de Brown, reconocí mitocondrias, que son cientos de veces más pequeñas que el núcleo celular. Leeuwenhoek y Brown no engañaron en sus notas. Las imágenes que presentamos no se han manipulado. Revelan la excitación y maravilla que provocaron las primeras observaciones. Y ponen de manifiesto cómo el más humilde de nuestros útiles, aquí microscopios simples del XVII y el XIX , puede cambiar nuestra concepción de la realidad para siempre.
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2. LAS ESPORAS ESPINOSAS de una trufa (Tuber me- lanosporum ) sirven para someter a prueba la calidad de resolución del microscopio de Leeuwenhoek. Las minúsculas esporas son del tamaño de una célula, las espinas del tamaño de bacterias. Pese a su simplicidad, el viejo microscopio de 300 años puede cap tar ambas estructuras con nitidez.
3. LA BELLEZA DE LA CABEZA DE UN PIOJO puede observarse a través de una lente pulida por Horace Dull de Luton, en el marco de una investigación sobre claridad y poder de resolución de un microscopio del siglo XVII. La antena y los ojos oscuros pardos del insecto, enojosamente familiares para los biólogos de entonces, aparecen con nitidez. Estas lentes mantienen al mínimo la aberración cromática.
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4. LOS PRIMEROS MICROSCOPIOS SIMPLES del último tercio del XVII eran como el fabricado por Leeuwenhoek (abajo ), hecho a mano y de latón. Dos tornillos de rosca fijaban y enfocaban la muestra. La lente solitaria de aumento, algo mayor que la cabeza de un alfiler, bastaba para distinguir incluso bac terias. El diseño alcanzó su perfección 150 años después (de- recha) en los talleres de la firma londinense Dollond, suminis tradora de instrumentos de laboratorio. Robert Brown poseyó uno de estos hermosos aparatos. Hay un control de foco fino en la parte superior del cuerpo de la columna; dos tornillos operan una platina mecánica. Entre los accesorios está la lente, de 800x. Ambos prototipos miden unos 7,6 centímetros. BANDEJA DE LENTES MANDO DE FOCO FINO
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TORNILLO PARA MOVER EL PORTAOBJETO
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PLATINA CIRCULAR PORTAOBJETO MECANICO
MANDO DEL PORTAOBJETO MECANICO
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5. PAREDES CELULARES de la raíz del helecho Os- munda regalis , según se aprecian con un microscopio monocular de comienzos del siglo XVIII. La claridad de la imagen ofrecida no tiene nada que envidiar a la alcanzada por la mayoría de los microscopios ópticos modernos.
6. HASTA BACTERIAS VIVAS podían captarse con el microscopio simple de Leeuwenhoek. Es ta imagen del Spirillum , una de las especies descritas por nuestro holandés, pone de manifiesto su destreza investigadora; las bacterias no se ven si no sabemos colocar bien la fuente luminosa y el foco.
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7. LA LABOR MICROSCOPICA realizada por Brown se llevó a cabo con potentes aparatos, de pequeña talla, fabricados por la firma londinense Bancks and Son. Este magnífico ejemplar, de unos 15 centímetros, forma parte de la colección de los Reales Jardines de Kew. Está diseñado con un doble con trol focal (de ajuste aproximado y de ajuste fino), montados en la columna y con un espejo de doble superficie. Con su lente se consiguen de 30 a más de 150 aumentos.
CONTROL DE LA POSICION DE LA LENTE
LENTE PLATINA MOVIL
REGLAJE APROXIMADO REGLAJE FINO
ESPEJO DE DOBLE CARA
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Representación visual de embriones humanos La microscopía de resonancia magnética nos revela los secretos escondidos en los primeros estadios del desarrollo embrionario Bradley R. Smith
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n nuevo horizonte biológico se me abre cada mañana a mi llegada al laboratorio de microscopía in vivo, del hospital clínico de la Universidad de Duke. Me aguarda la contemplación de imágenes tridimensionales, precisas y esclarecedoras, del interior de embriones humanos conservados in vitro, obtenidas mediante microscopía de resonancia magnética (MRM). Este tipo de embriones “virtuales” me permite emprender viajes simulados por ordenador por cualquiera de los sistemas recién pergeñados del cuerpo. Con estas imágenes puedo generar secuencias animadas del desarrollo embrionario, impensables hasta hoy. Aumenta la demanda de información de ese tipo por los biólogos que se afanan en comprender las etapas del desarrollo normal y patológico, así como los factores que indican cada proceso a seguir. Nuestro conocimiento se debe en buena medida al estudio de cortes bidimensionales de embriones de animales normales y de embriones de animales sometidos a manipulación genética. No obstante, la mejora del diagnóstico y del tratamiento de las malformaciones y enfermedades congénitas del hombre requiere que se establezca Microfotografía con luz visible
Feto temprano (64 días)
1. FETO HUMANO de 64 días. Se ha obtenido su representación visual mediante microscopía de resonancia magnética (MRM) y microscopía óptica (recuadro superior ). En esta etapa, el embrión tiene una longitud aproximada de 30 milímetros. Las técnicas de representación por ordenador pueden convertir en translúcidas unas partes del embrión y dejar opacas otras. Al ajustar así la opacidad del espécimen, podemos observar estructuras internas a diferentes profundidades y en su entorno natural sin dañar la muestra (a-c ). Podemos enfocar, girar o alejar la imagen del embrión (d-f ), o usar el método de representación por segmen tación para enfocar órganos específicos, como la formación de los pulmones (g-k ).
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Etapa Carnegie 18 (44 días)
2. TUBO NEURAL de un embrión de 47 días (en su saco amniótico, en la micrografía óptica de la parte inferior izquierda), sometido a examen mediante la técnica de MRM. Al manipular las imágenes digitales podemos crear secuencias de ordenador (evolución interna o “inmersiones”) del tubo neural, precursor del cerebro y la médula espinal. En esta evolución interna se hace girar al embrión (a-c ); el observador parece entrar en el tubo neural (d ) para emprender un viaje virtual por las vesículas craneales, que se convertirán en ven trículos del cerebro. El recorrido continúa por el romboencéfalo, por el techo del cuarto ventrículo y, de ahí, por el mesencéfalo (e-h ), antes de salir del ventrículo (i, j ) y mostrar los hemisferios cerebrales.
Etapa Carnegie 19 (47 días)
3. CORTES DE UNA IMAGEN TRIDIMENSIONAL para mostrar en fino detalle el interior de un embrión de 44 días, correspondiente a la etapa Carnegie 18 (en la parte superior se puede ver una imagen obtenida con microscopía óptica). El embrión, del tamaño de una alubia, aún tiene unidos los dedos de manos y pies. Pero presenta cerebro con dos hemisferios, precursores de vértebras (estructuras con forma de guión a la derecha) y órganos internos. La MRM permite cortar una misma muestra por varios planos diferentes, lo que proporciona una información interna muy valiosa sin tener que destruir el espécimen. a
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una relación entre la información resados en el desarrollo embrionario obtenida de estos modelos animales pueden recurrir al trabajo realizado, y las etapas correspondientes del así como el público curioso, a través desarrollo embrionario humano. de las páginas de Internet, donde Así las cosas, el Instituto Nacional encontrarán las imágenes de la etapa de Salud Infantil y Desarrollo Hu- Carnegie 13 a la 23. mano (NICHD) me ofreció en 1996 un Para crear esas imágenes sin precontrato para crear una base de datos cedentes, coloco cuidadosamente el de embriones virtuales a partir de la embrión en el interior de un tubo, Colección Carnegie de Embriones que después introduzco en un imán Humanos. La Colección Carnegie, de superconductor. La técnica MRM es enorme valor e instalada en el Museo semejante a la de formación de imáNacional de Salud y Medicina del genes por resonancia magnética Instituto de Patología de las Fuerzas (IRM), prueba rutinaria en los hos Armadas (Washington, D.C.), guarda pitales. Ambas técnicas aprovechan embriones humanos de cada etapa la energía en la banda de radiofredel desarrollo, de un día a embriones cuencia para excitar y detectar prode ocho semanas y fetos tempranos tones en el agua del interior de los (un embrión se transforma en feto a tejidos. Sin embargo, la MRM revela las ocho semanas de la concepción). detalles cuya finura trasciende la idóLa muestra más pequeña mide unos nea para el diagnóstico clínico. 0,2 milímetros; la mayor tiene una Aunque la IRM puede producir imálongitud de unos 30 milímetros, el genes con una resolución de vóxel tamaño de una almendra. El grueso (elemento de volumen) de un mililide la Colección Carnegie está for- tro cúbico, la MRM registra vóxeles mado por productos de aborto (espon- que son un millón de veces menores. táneo o provocado) recogidos entre Resoluciones que sólo se consiguen 1887 y 1917 por Franklin Paine Mall. mediante imanes potentes, gradienLa colección ha venido creciendo con tes de perturbación del campo magla inclusión de embriones descubier- nético intensos y bobinas de formatos en autopsias de mujeres encinta. ción de imágenes capaces de acomodar La colección divide el desarrollo muestras diminutas. embrionario en 23 etapas, definidas Las técnicas de MRM, desarrollapor hitos específicos, verbigracia, el das en la Universidad de Duke por momento en que aparece el botón de el grupo de G. Allan Johnson, no una extremidad. La NICHD me dañan a los embriones. Con la microsencargó la creación de imágenes MRM copía tradicional, por contra, hay que de embriones desde la etapa Carne- seccionar las muestras en centenagie 10 (22 días después de la concep- res de cortes finísimos. La MRM geción) —cuando aparece el primer arco nera embriones tridimensionales faríngeo, que después pasa a formar virtuales, sin deformaciones, en una parte de la mandíbula— hasta la pri- fracción del tiempo que haría falta mera semana del desarrollo fetal. para crear reconstrucciones a partir (Dale S. Huff, del Hospital Infantil de la microscopía óptica. Podemos de Filadelfia, revisó la colección para producir datos tridimensionales de escoger los mejores especímenes a un embrión en menos de dos horas, representar.) Biólogos y médicos inte- en comparación con los cientos de
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4. MERCED A TECNICAS DE PSEUDOCOLORACION asignamos colores a las imágenes de MRM para resaltar las estructuras; por ejemplo, los órganos en desarrollo de este embrión de 47 días. En las imágenes coloreadas de esta página, la retina en desarrollo brilla con un naranja amarillento. Los óvalos ámbar marcan los ganglios espinales, de donde emergen los nervios espinales; el hígado luce en el abdomen en color verde intenso, y el oído en desarrollo aparece en un resaltado color verde por encima de los hombros. Las imágenes revelan también la formación de las costillas cartilaginosas debajo del brazo y una pequeña reducción de la membrana interdigital.
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Etapa Carnegie 17 (41 días)
5. EL EMBRION DE 41 DIAS que se muestra arriba, envuelto en el saco vitelino, bajo la luz de un microscopio óptico, posee tejidos diferenciados, que se pueden contemplar en estas imágenes obtenidas mediante tres técnicas de MRM diferentes: Peso-T1, Peso-T2 y Peso-difusión. Técnicas que permiten contemplar el agua de las muestras de tres maneras distintas, según la interacción en tre agua y otras moléculas. (Esta característica es diferente para cada tejido.) Peso-T1 y Peso-T2 reflejan dos modos de detectar el tiempo de relajación, que mide cómo se reajustan los protones del agua después de ser perturbados por la energía de radiofrecuencia que se usa para excitarlos. En la imagen T1, los grandes vasos sanguíneos, las cámaras del corazón y el hígado aparecen des tacados. La imagen T2 refleja tejidos no vasculares, pero sin contraste. La formación de imágenes por difusión aprovecha la difusión selectiva del agua en muchos tejidos; es una técnica particularmente informativa para el estudio de estructuras neurales como la corteza cerebral (finas líneas blancas que perfi- lan la parte superior derecha de la imagen de la derecha). BRADLEY R. SMITH
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horas que se requiere con el microscopio óptico. Aunque la MRM obtiene datos tridimensionales minuciosos, se cuenta con programas informáticos para presentar los resultados. Para crear imágenes como las aquí ofrecidas, nos apoyamos en un programa de representación volumétrica que va superponiendo las imágenes MRM de los cortes —128 en total y cada uno con 256 256 píxeles— hasta formar un cubo de 8,4 millones de vóxeles. En cada vóxel se representa una porción de embrión. El programa nos permite rotar la matriz de vóxeles, retirar capas de ellos e incluso colorear o ajustar la escala de grises de los vóxeles en función de la intensidad de la señal u otros criterios. Mediante algoritmos de ordenador, provocamos el paso de rayos de luz virtuales a tra×
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vés de cada matriz, procediendo de atrás adelante. Los rayos, modificados por los vóxeles que encuentran en su camino, forman una imagen en la pantalla del ordenador. Podemos realizar secciones digitales de las imágenes en cualquier orientación y volver transparente la superficie de la muestra para que nos revele su estructura interna. Y podemos aislar un sistema de órganos para su inspección y medida. El Embrión Humano Multidimensional pone la Colección Carnegie al alcance de los investigadores de cualquier punto del planeta. La disponibilidad de este recurso en Internet ayuda a los clínicos a descubrir defectos congénitos mediante IRM y ultrasonidos. Aporta información gráfica solvente a los laboratorios de investigación que carecen de experiencia
Difusión
en embriología y a las aulas de embriología básica. Y, con el procesamiento de estas imágenes, preservaremos para la posteridad una insólita e insustituible colección de embriones humanos.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA ATLAS OF HUMAN EMBRYOS. Raymond F. Gasser. Harper & Row, 1975. DEVELOPMENTAL STAGES IN HUMAN EMBRYOS: INCLUDING A REVISION OF STREETER’S HORIZONS AND A SURVEY OF THE CARNEGIE COLLECTION . Roman O’Rahilly y Fabiola Müller. Carnegie Institution of Washington, Washington, D.C., 1987. Las páginas de “Multidimensional Human Embryo Web” están disponibles en la ubicación embryo.soad.umich.edu.
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Aplicaciones biológicas del microscopio de fuerzas Como quien se mueve a ciegas, y se sirve del tacto para reconocer las formas de los objetos, este instrumento emplea una punta afilada para sentir y revelar las formas de moléculas biológicas en soluciones acuosas Carlos Bustamante y Ricardo García
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l progreso de la biología ha ido de la mano del avance de la técnica microscópica. Desde su aparición, en el siglo XVII , el microscopio ha sido en buena parte responsable de los grandes descubrimientos biológicos. Robert Hooke advertía en 1655, sirviéndose de un microscopio óptico rudimentario, que la corteza de corcho la formaban en realidad muchas “células”, es decir, celdas pequeñas e independientes. Pero la verdadera observación de los últimos componentes de los tejidos, de las células, no llegaría hasta el primer tercio del siglo XIX , de la mano, también, de dos microscopistas: Matthias Schleiden y Theodore Schwann. En el último tercio de esa centuria, Santiago Ramón y Cajal enunciaba la teoría de la neurona, apoyándose en las observaciones con su microscopio óptico. En 1876, Heinrich Abbé desarrolló la teoría de difracción de imágenes. Demostró que el microscopio óptico no puede resolver objetos menores que la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar la muestra. Usando luz de color verde, cuya longitud de onda es aproximadamente de 0,5 micrometros (µm), el microscopio óptico sólo puede resolver objetos próximos si entre ellos media al menos una distancia de 0,25 µm. Hasta 1931 no se produce otro salto decisivo en el progreso de la microscopía. Se trata de la introducción del microscopio electrónico que extendería la resolución espacial a la escala nanométrica (1 nanómetro equivale a 10 –9 m) y posibilitaría la 90
descripción ultraestructural de la célula. Ello no supuso el arrumbamiento del microscopio óptico, que continuó siendo un instrumento imprescindible en las investigaciones biológicas porque, a diferencia del microscopio electrónico, permite visualizar muestras inmersas en soluciones acuosas. O lo que es lo mismo, posibilita la observación de procesos biológicos en tiempo real. Durante muchos años, los biólogos han tratado de combinar la alta resolución del microscopio electrónico con el funcionamiento en agua del microscopio óptico. La invención en 1981 del microscopio de efecto túnel por Gerd Binnig y Heinrich Rohrer, galardonados ambos con el premio Nobel de física, abrió nuevas rutas para la visualización de moléculas biológicas en medios acuosos. El microscopio de efecto túnel constituye el primer ejemplo de una nueva clase de microscopios de alta resolución, llamados genéricamente microscopios de campo próximo. Los microscopios de este grupo comparten un principio de funcionamiento común: la imagen se obtiene a partir de la interacción entre una punta (sonda en lenguaje técnico) y la muestra. La interacción puede ser, por ejemplo, una fuerza mecánica, la corriente eléctrica, la radiación electromagnética o el flujo de calor. El microscopio de fuerzas, conocido también por microscopio de fuerza atómica, se ha convertido en una herramienta poderosa de la investigación biológica. Hace más de quince años se construyó el primero. Paul
Hansma, que ha trabajado en el desarrollo del microscopio de fuerzas, cuenta una curiosa anécdota. Cierto día en que Binnig se distraía observando el relieve de la pintura de las paredes de su casa, se preguntó por qué todos los microscopios basaban su funcionamiento en la interacción entre un haz de ondas, o partículas (fotones, electrones, o sonido), y la muestra. ¿Podría, se planteó, obtenerse la imagen de una superficie midiendo la fuerza entre los átomos de la superficie y los de una punta muy afilada unida a una palanca elástica, que actuara de muelle?
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eses más tarde, Binnig comentó la idea con su colaborador Christofer Gerber y con Calvin Quate, profesor de física de la Universidad de Stanford. Cuando determinaron el valor de las constantes de fuerza que mantienen unidos a los átomos en un cristal, comprobaron, sorprendidos, que podrían construir palancas elásticas con constantes de fuerza menores que la existente entre dos átomos. En efecto, las frecuencias de vibración de los átomos en superficies sólidas es de unos 10 13 hertz; si se admite una masa de 10 –25 kilogramos por átomo se obtienen constantes de fuerza del orden de 10 newton por metro. En cambio la constante de un trozo de aluminio doméstico de 5 milímetros de largo por 1 milímetro de ancho es sólo de 1 newton por metro. Es decir, requiere diez veces menos fuerza deformar el trozo de aluminio que desplazar los átomos de la superficie del cristal. Ante tales resultados, supusieron que, si añaTEMAS 29
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1. ESQUEMA de un microscopio de fuerzas (izquierda). Se ilustran los componentes básicos: transductor de fuerzas (palanca elás tica), sistema de detección óptico (diodo láser y fotodiodo) y cristal piezoeléctrico para efectuar los desplazamientos en las direcciones espaciales. Arriba se esquematiza una zona de interacción entre átomos de punta y de la muestra. Este dibujo ilustra una propiedad del microscopio de fuerzas, su carácter local. Cada dato de información es el resultado de la interacción de grupos localizados de átomos.
Electromicrografía de una punta usada en el microscopio de fuerzas. Estas puntas suelen tener radios de curvatura entre 10-20 nm.
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focaliza en la parte posterior de la palanca. La luz reflejada se recoge en un fotodiodo de cuatro segmentos. Los cambios en la distribución de luz en cada uno de los segmentos permiten determinar las fuerzas que se aplican. La muestra se coloca sobre un cristal piezoeléctrico que posibilita su desplazamiento con respecto a la punta en las tres dimensiones 2. DOS MODOS DE UTILIZAR EL MICROSCOPIO DE FUERZAS. a) Modo de contacto. La pun- espaciales. El microscopio de fuerzas puede ta se desplaza sobre la muestra manteniendo una deflexión de la palanca constante, es decir, una fuerza entre punta y muestra constante. La fuerza que existe entre los átomos de funcionar en dos modos distintos, llala punta y la muestra provoca la deflexión de la palanca. b ) Modo oscilante. Punta y mues- mados de contacto y oscilante. En el tra se encuentran separadas por una distancia de varios nanómetros. La frecuencia de os- primer modo, la muestra y la punta cilación de la palanca depende de las fuerzas de largo alcance entre punta y muestra, y se hallan en contacto directo mienpor tanto, variará con la topografía. El sistema de retroalimentación se encarga de des- tras se mueve una con respecto a la otra. Los accidentes topográficos de plazar la muestra para mantener constante la frecuencia de resonancia. la muestra producen deflexiones de la palanca, que se detectan midiendo dían una punta de diamante a un de detección óptico y un cristal pie- la reflexión de un rayo láser que incide extremo del trozo de aluminio, éste zoeléctrico. El transductor de fuerzas sobre la parte posterior de la palanca podría funcionar como un transduc- consiste en una palanca elástica en y se recoge sobre un fotodiodo con tor de fuerzas. En contacto con la cuya parte anterior se encuentra una cuatro segmentos. En este modo de superficie, el transductor se defor- punta piramidal. Palanca y punta se funcionamiento, las regiones elevamaría siguiendo la topografía de la fabrican de manera integrada em- das de la muestra producen grandes misma, transformando en movi- pleando técnicas de microelectrónica. deflexiones de la palanca y experimiento la interacción de los átomos Suelen ser de silicio o nitruro de sili- mentan, por tanto, fuerzas más intende la punta con los átomos de la super- cio. Las dimensiones típicas son de sas. Para evitar tales altibajos, existe ficie de la muestra. Así crearon en 100 µm de longitud, 30 µm de ancho un sistema de retroalimentación que 1986 el primer prototipo de un micros- y 3 µm de espesor. La punta sobre- se encarga de acercar o alejar la muescopio de fuerzas, cuya característica sale unos 5 µm de la base de la tra mediante un cristal piezoelécprincipal reside en su versatilidad, palanca. trico, de suerte que la deflexión de la pues opera en vacío, en aire o en un El sistema de detección óptico per- palanca (y, por consiguiente, la fuerza medio líquido. mite medir las deflexiones de la aplicada a la muestra) se mantenga Un microscopio de fuerzas consta palanca y transformar éstas en valo- constante. Se va obteniendo la imade tres componentes básicos. Un res de fuerza. Consta de un diodo gen de la superficie conforme quedan transductor de fuerzas, un sistema láser que emite un haz de luz que se registrados los desplazamientos del
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3. IMAGENES DE RESOLUCION ATOMICA de una superficie de mica. La mica es un material de estructura laminar y muy estable en condiciones ambientales. A la izquierda se ofrecen las posiciones atómicas de la mica obtenidas manteniendo la fuerza entre punta y muestra constante. En el centro las mismas posiciones, aun que mi92
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diendo las fuerzas laterales que los átomos de la superficie de la muestra ejercen sobre la palanca. Estas fuerzas laterales indican que los átomos de la punta se enganchan y desenganchan sucesivamente de los átomos de la muestra. Tal observación permite el estudio de mecanismos de disipación de energía a escala atómica TEMAS 29
cristal piezoeléctrico para mantener constante la deflexión de la palanca en cada posición de la superficie. En este modo las fuerzas que típicamente se detectan entre punta y muestra varían entre 1 nanonewton y 100 nanonewton. Estas fuerzas pueden producir modificaciones irreversibles en muestras blandas. Esto se evita empleando los modos oscilantes.
E
n el segundo modo, la punta sobrevuela la muestra al tiempo que oscila sobre ella. La frecuencia de resonancia del sistema formado por la palanca y la punta no depende solamente de la geometría de la palanca y del material de que está hecha, sino también de las fuerzas existentes entre punta y muestra. Dicho en otros términos, la frecuencia de resonancia variará con la distancia entre punta y muestra, y, por tanto, de acuerdo con el perfil de la superficie. Los cambios operados en la frecuencia de oscilación (o equivalentemente en la am-
plitud de oscilación) se detectan ópticamente mediante la deflexión del rayo láser en la superficie de la palanca. También aquí existe un sistema de retroalimentación, que se emplea, lo mismo que en el caso anterior, para modificar la distancia entre punta y muestra, con el objeto de que se mantenga constante la frecuencia de resonancia. La resolución espacial del microscopio depende de la geometría de la muestra. Se pueden obtener imágenes con resolución atómica a partir de muestras planas, ya sea en aire o sumergidas en agua o etanol. Con muestras biológicas, la resolución está determinada por la relación entre el tamaño de la punta y el objeto y la magnitud de las fuerzas que se aplican. La resolución suele variar entre 5 y 10 nanómetros. El microscopio de fuerzas posee una finísima sensibilidad. Para su correcto funcionamiento se exige, pues, el apantallamiento de las vibra-
A M S N A H . G . H
4. IMAGEN de una molécula de ADN obtenida en contacto en propanol. Se puede dis tinguir una periodicidad conmensurable con la de la doble hélice. La barra representa una longitud de 15 nm. ciones externas (las del edificio o las de personas que deambulan por el laboratorio). Hay un parámetro que mide el grado en que las vibraciones externas dejan de condicionar la operación del microscopio. Se trata de la relación entre la frecuencia de la vibración externa, ν , y la frecuencia de resonancia más baja del instrumento, ν . Así, una vibración de amplitud A o se atenúa en el microscopio de fuerzas por un factor ( ν / ν o)2. Si la frecuencia de resonancia más baja del microscopio es 40 kilohertz, las vibraciones externas menores de 100 hertz (las habituales en los edificios) y con una amplitud de micrometro sólo producirán un movimiento de la punta respecto a la muestra de 0,01 nanómetros. Los microscopios en los que se ha procurado maximizar el rendimiento apantallan las vibraciones externas con una construcción rígida y compacta, especialmente de la cámara que contiene la palanca, la muestra, el láser y el fotodiodo.
E
R E L L E K . D
10
20
30
40
µm
(fricción). La punta y la muestra se mueven solidariamente hasta que la fuerza acumulada en la palanca supera la fricción de la muestra y la punta se suelta de golpe. La fotografía de la derecha, cedida por D. Keller, es una imagen de basófilos de rata obtenida en aire usando el modo de contacto. Estas imágenes ilustran el amplio rango de dimensiones de las muestras accesibles al microscopio de fuerzas. A T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
n la adaptación del microscopio de fuerzas para la observación de biomoléculas han intervenido físicos, químicos y biólogos. Las primeras aplicaciones biológicas del microscopio de fuerzas se centraron en la molécula de ADN. A pesar de que su estructura molecular está perfectamente determinada por difracción de rayos X y por métodos bioquímicos, hay numerosos procesos todavía por desentrañar en los que participa el ADN. Para su observación, las moléculas de ADN han de depositarse sobre una superficie plana a escala atómica, de suerte que la superficie de soporte no enmascare la topografía de la molécula a examinar. El material de mica 93
) . a h c d ( E T N A M A T S U B . C ; ) . a d z i ( A S O C S A R R A C . L . J , E L L A V . M , O Y A M A T . J , A I C R A G . R
m n 0 0 0 4
100 200 300 400 nm
5. IMAGENES de complejos ADN-proteínas obtenidas en modo oscilante en aire. A la izquierda, una topografía tridimensional de un ADN circular ligado a la proteína del conector del bacteriófago φ29, las proteínas aparecen como objetos que sobresalen del filamento de ADN. A la derecha, imágenes de fragmen tos de ADN (681 pares de bases) y la proteína ARN-polimerasa. cumple ese requisito. Sin embargo, fracasaron los primeros intentos de observar ADN depositado en mica. Las imágenes del ADN aparecían borrosas o desaparecían después de sucesivas tomas.
El doblamiento del ADN depende de la secuencia del ADN. Es probable que la deformación de la molécula de ADN por la polimerasa durante la transcripción permita la interacción de es te complejo con otras moléculas de proteínas encargadas de regular la velocidad con la que se mueve la proteína sobre el ADN.
Se demostró más tarde que, además de las fuerzas perpendiculares existentes entre la punta y la muestra (fuerzas que suelen emplearse para formar la imagen), la punta ejercía también fuerzas laterales sobre
la muestra, superiores incluso a las que unen las moléculas a la mica. Si las moléculas no se hallan bien ancladas en la mica, la punta las desplazará. Para obviar ese inconveniente, se han desarrollado varias estrate-
10,0 nm
5,0 nm
m n 0 , 0 2
0,0 nm
400
0 , 0 1
300 200 0
0 E T N A M A T S U B . C
100 100
200
300
400
0 nm
6. IMAGEN obtenida en aire de complejos de ADN-HSF2, usando tura de “lazo” requerida para la activación del proceso de transel método oscilante. Se ilustran dos complejos. Uno de ellos mues- cripción. El otro complejo muestra una HSF2 unida a HSE del ADN, tra que dos HSF2 (flechas ) son necesarios para formar la estruc- sin formar lazo. 94
TEMAS 29
gias. Así, existen tratamientos de la superficie de mica que modifican el signo de la carga superficial y aumentan la densidad de aquélla; este proceso refuerza el enlace electrostático con el ADN, que es una molécula polar. De igual forma, se han desarrollado nuevos modos oscilantes de funcionamiento que minimizan el contacto con la muestra y reducen las fuerzas laterales que la punta ejerce sobre el espécimen. Para aliviar el problema de las fuerzas laterales se procura también reducir la humedad ambiental. En efecto, entre la punta y la muestra se crea un menisco de agua. La fuerza de capilaridad atractiva que de ello resulta puede deformar o desplazar las biomoléculas. Conviene, pues, efectuar los experimentos en líquidos. Cuando así se procede, el microscopio de fuerzas proporciona imágenes con resolución molecular incluso en soluciones fisiológicas. Existe ahora un especial interés por estudiar proteínas y ácidos nucleicos que participan en la formación de complejos moleculares, y que, por sus dimensiones y topología, quedan a menudo fuera del alcance de las técnicas de cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear. Las interacciones ácido nucleicoproteína son la base molecular de procesos celulares relacionados con la síntesis de ADN, la formación de ARN mensajero o la síntesis de proteínas a partir del ARN mensajero. En ese ámbito, el microscopio de fuerzas permite caracterizar la geometría de los complejos de proteína-ADN, los cambios estructurales del ADN y de las proteínas que resultan de la interacción, y la estequiometría de los complejos, es decir, el número de moléculas de proteína por molécula de ADN en el complejo.
ceso de transcripción. La geometría observada resulta coherente con lo que nos dice la bioquímica, a saber, que el movimiento de la polimerasa sobre el ADN no es continuo, sino que semeja el ciclo de extensión y contracción de una oruga. Presumiblemente, durante la fase de contracción de este ciclo la proteína deforma y dobla el ADN. Es posible que estos cambios conformacionales de la polimerasa y el ADN tengan una función importante en los mecanismos de regulación del proceso de transcripción. Un ejemplo del poder del microscopio de fuerzas para determinar la estequiometría de complejos de ADNproteína lo encontramos en el lazo que se forma en la molécula del ácido nucleico por inducción de factor 2 de choque térmico (HSF2), una proteína activadora del proceso de transcripción en células humanas. Estas proteínas activan el proceso de transcripción en un doble paso: se unen al ADN en sec uencias esp ecializadas
del mismo, los denominados elementos de choque térmico (HSE), y se ponen en contacto con el promotor o lugar del ADN en el que se engarza la ARN-polimerasa para iniciar la transcripción. Los HSE pueden encontrarse cerca o lejos del promotor. La máxima activación requiere la interacción de varias proteínas HSF2, proceso que va acompañado a menudo de la formación de lazos. Con los métodos tradicionales de microscopía electrónica no se había podido determinar si la formación de estas estructuras precisan dos secuencias HSE y sendas moléculas de proteína HSF2 unidas a ellas, o si una sola molécula de HSF2 se engarzaba simultáneamente a dos HSE y al promotor. La cuestión se dirimió con el microscopio de fuerzas, cuyas imágenes han revelado que la formación de los complejos de activación implica la unión de dos moléculas de HSF2 a sus respectivos elementos de choque térmico. Una de las principales ventajas del
a
b
c
d
T
omemos, por ejemplo, el conector del virus bacteriófago φ29 y una zona de ADN circular; el polipéptido conector sirve de enlace entre la cabeza del virus (donde se empaqueta el ADN) y el cuello del mismo. Si llevamos el complejo ADN-conector al microscopio de fuerzas, las imágenes nos revelan la geometría de las interacciones entre el conector y el ADN, y de ellas es posible inferir que la interacción del ADN circular con el conector se realiza por el exterior del mismo. En cambio, la interacción con ADN lineal se realiza preferentemente a través de un canal interno. Se sabe gracias al microscopio de fuerzas que la ARN-polimerasa deforma la molécula de ADN durante el proA T RAVÉS DEL MICROSCOPIO
D L O H T U G . M Y E T N A M A T S U B . C
7. IMAGENES DE FRAGMENTOS DE ADN en solución acuosa de positados sobre mica. Las fotografías a y c se han sacado inmediatamente después de que se introdujera una solución de ARN-polimerasa en la celda de fluidos. Las fotografías b y d corresponden a los mismos fragmentos y se obtuvieron unos 45 segundos más tarde. Nótese que una sola molécula de polimerasa se ha unido a cada fragmento (flechas ). El área de las imágenes es 300 nm × 300 nm, dimensiones que semejan las del menor elemento de imagen que cabe obtener con un microscopio óptico. 95
microscopio de fuerzas experimentos han corro0_min_1 6_min_1 reside en su capacidad borado que el microscopio para adquirir imágenes de fuerzas constituye una en líquidos. Existen varios valiosa herramienta para motivos para efectuar los la manipulación mecáexperimentos en líquidos. nica de moléculas indiEn primer lugar, la forviduales. mación de imágenes en El desarrollo de microslíquidos permite reducir copios que no requieren las fuerzas entre la mueslentes para la formación tra y la punta. En segundo de imágenes, como los milugar, si las imágenes se croscopios de campo pró12_min_1 18_min_1 hacen en medios salinos, ximo, ha abierto numerolas moléculas presentan sas y originales vías de estructuras más cercanas investigación en la quía las que muestran en los mica y física de superficies procesos celulares. Por y en la biología. El microsúltimo, los medios líquicopio de fuerzas es capaz dos abren la puerta al de trabajar con muestras estudio de procesos dinásumergidas en medios micos. Los tipos de proceacuosos como el microscosos dinámicos accesibles pio óptico, pero con la resoal microscopio de fuerzas lución del microscopio dependen de los tiempos 8. SECUENCIA DE IMAGENES de la digestión de una molécula de ADN electrónico. En los pocos de adquisición de imáge- con nucleasa de micrococo. La imagen fue obtenida en una solución de años transcurridos desde nes, que suelen variar en- p H 7,6, usando el modo oscilante. La imagen muestra que la deposición su invención, esta técnica tre 10 y 200 segundos; es de las moléculas sobre la superficie de mica no obstaculiza la inte- ha dejado de ser un insdecir, puede abordar pro- racción bioquímica entre la enzima y el substrato. Area de los recua- trumento exótico en el cesos rápidos como la for- dros: 300 nm × 300 nm. laboratorio de biología y mación de complejos molese está convirtiendo poco culares o lentísimos como a poco en una herramienla división celular. tener también imágenes de proteí- ta necesaria. Un ejemplo de ensamblaje de com- nas de la membrana celular en soluSin embargo, los ejemplos anteplejo biomolecular que podemos ciones salinas. riores no son las únicas aportaciones seguir y caracterizar a través de imáLa interacción del microscopio de que estas técnicas pueden ofrecer a genes obtenidas con el microscopio de fuerzas con la muestra es de carác- la biología. Unos experimentos donde fuerzas es el de la unión de una molé- ter local. Gracias a esa propiedad, el se combinaron luz y un microscopio cula de ARN-polimerasa a una mo- control de la posición de la punta per- de fuerzas han demostrado que es polécula de ADN. Así, ha sido posible mite introducir micromodificacio- sible obtener simultáneamente imáobservar primero el fragmento suelto nes, fabricar dispositivos a escala genes de biomoléculas, así como intede ADN y, luego, la unión de éste con nanométrica o determinar fuerzas rrogar espectroscópicamente y de la enzima polimerasa. Asimismo, el intermoleculares. Así ha ocurrido, forma individual a las mismas. A tramicroscopio de fuerzas ha permitido por ejemplo, con la determinación de vés de estos desarrollos es posible seguir procesos bioquímicos como la la fuerza necesaria para separar el que el investigador del siglo XXI disdigestión de un fragmento de ADN complejo de una pr oteína, la avidina, ponga de nuevas herramientas para por una nucleasa de restricción. Y ob- cuando se une a una molécula de vi- explorar procesos biológicos en tiempo tamina B 12 (biotina). Para ello, un real y con resolución espacial y especgrupo de científicos alemanes, en- troscópica molecular. cabezado por Hermann Gaub, recubrió la punta con moléculas de avidina y la puso en contacto con una superficie recubierta por biotina. El BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA acercamiento de la punta y la muestra promovió la formación de enlaATOMIC FORCE MICROSCOPY. D. Rugar, P. ces no covalentes avidina-biotina. K. Hansma, en Physics Today, vol. 43, Luego, alejando la muestra de la pág. 23, 1990. punta, se determinó la fuerza neceSCANNING FORCE MICROSCOPY. D. Sarid. saria para romper estos enlaces. Un Oxford University Press, Nueva York, histograma de las fuerzas medidas 1991. muestra distintos picos con periodiBIOCHEMICAL AND STRUCTURAL APPLICATIONS OF SCANNING FORCE MICROSCOPY. cidad de 160±20 piconewton. Este 30 nm C. Bustamante, D. A. Erie, D. Keller, en valor se ha identificado, por tanto, Current Opinions in Structural Biology, como la fuerza requerida para romvol. 4, pág. 750, 1994. 9. IMAGEN DE LA SUPERFICIE extracelu- per un solo enlace molecular biotinaS CANNING FORCE M ICROSCOPY IN BIO lar de un desmosoma aislado de la superfi- avidina. Siguiendo un procedimiento LOGY. C. Bustamante, D. Keller, en Phycie de una célula de hígado de rata. La ima- similar, ha sido posible también detersics Today, vol. 48, n. o 12, página 32, 1995. gen fue obtenida en una solución salina de minar la fuerza que une las cadenas complementarias del ADN. Estos fosfato, usando el modo de contacto. D L O H T U G . M Y E T N A M A T S U B . C
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