Berbagai metode dikembangkan dalam mempersiapkan jaringan agar dapat dipelajari dan mirip dengan keadaan alaminya (Gartner dan Hiatt 2007). Salah satu metode metode yang yang banyak banyak diguna digunakan kan adalah adalah metode metode parafi parafin. n. etode etode parafin parafin merupa merupakan kan suatu suatu !ara !ara pembua pembuatan tan prepar preparat at permane permanen n dengan dengan menggu menggunak nakan an parafin sebagai media embedding (Gunarso (Gunarso "#$%). &arafin meresap ke jaringan dalam dalam bent bentuk uk !air !air dan dan membe membeku ku deng dengan an !epat !epat ketik ketikaa didi diding ngin inka kan. n. Hal Hal ini ini men!eg men!egah ah peruba perubahan han struktu strukturr jaringa jaringan n selama selama di mikrot mikrotom. om. etode etode parafin parafin memberikan memberikan pemotongan pemotongan yang berkualitas berkualitas dan !o!ok dengan sebagaian besar pe'arnaan baik umum ataupun pe'arnaan khusus khusus (Suarna et al. 200$). al. 200$). ahapa ahapan n dalam dalam pembua pembuatan tan sediaan sediaan histol histologi ogi meliput meliputii sampling * fiksasi fiksasi** dehidr dehidrasi asi dan clearing * infiltras infiltrasi* i* embedding * sectioning, dan dan stainning. stainning. +iksasi adalah proses pemeliharaan jaringan menggunakan agen kimia yang bertujuan untuk menghambat perubahan jaringan menuju kematian (setelah di keluarkan dari tubuh) dan juga untuk mempertahankan mempertahankan arsitektur normalnya normalnya (Gartner (Gartner dan Hiatt 2007). Setelah difiksasi* organ dimasukkan ke dalam alkohol bertingkat (dehidrasi) (dehidrasi) untuk menarik !airan jaringan. ,emudian ,emudian dilakukan dilakukan clearin clearing g untuk menggantikan tempat alkohol dalam jaringan (-ray 200#). eagen dalam proses clearing bereak bereaksi si interm intermedie ediett diantar diantaraa /at pengde pengdehid hidrasi rasi dan pengin penginfilt filtrasi rasi.. eag eagen en clear clearin ing g seharu seharusny snyaa larut larut di dalam dalam kedua kedua /at terseb tersebut ut (Suar (Suarna na et al. 200$ 200$). ). Sete Setela lah h di clearing * orga organ n diin diinfi filtr ltrasi asi dan di embedding menggunakan parafin* sehingga memudahkan organ untuk dipotong. Setelah didapatkan potongan seperti yang diharapkan* selanjutnya dilakukan pe'arnaan (aynard et al. 20"). al. 20"). -ntu -ntuk k dapa dapatt memb membuat uat sediaa sediaan n histo histolo logi gi maka maka dila dilaku kuka kan n prak prakti tiku kum m pembuatan sediaan histologi pankreas menggunakan metode parafin. 1engan praktikum ini juga diharapkan agar praktikan dapat memahami serangkaian proses pembuatan sediaan histologi dengan baik dan mampu mampu menganalisis hasil sayatan.
Tujuan
ujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut ". embua embuatt sediaan sediaan histolo histologi gi dari organ organ pankr pankreas eas tikus tikus ( Rattus norvegicus 3.) menggunakan 2 larutan fiksatif berbeda yaitu Bouin dan &araformadehid. 2. engan enganalis alisis is sediaan sediaan histol histologi ogi dari dari organ organ pankreas pankreas tikus tikus ( Rattus norvegicus 3.)
2
2 METODE Waktu dan Tempat
&raktikum teknik histologi dilaksanakan dari bulan 4oember 20"5 sampai bulan 6anuari 20"%. &raktikum ini dilakukan di 3aboratorium Histologi 1epartemen natomi +isiologi dan +armakologi +akultas ,edokteran He'an* 8nstitut &ertanian Bogor. Alat dan Bahan
lat yang digunakan pada praktikum ini adalah mikrotom* balok holder* tutup pagoda* tissue cassette* inkubator* ka!a objek* cover glass* sarung tangan* masker* alat bedah* kertas label* gelas ukur* pipet tetes* spatula* bunsen* nera!a digital* kamera digital* dan alat tulis. Bahan yang digunakan adalah 2 ekor tikus putih betina Sprague Dawley* larutan Bouin* larutan paraformaldehid* 4a9l fisiologis* larutan dehidrasi (alkohol 70:* alkohol $0:* alkohol #0:* alkohol #5 :* dan alkohol absolut)* larutan penjernih (;ylol)* parafin* hematoksilin* eosin* Distiled Water, entelan (perekat)* ketamine dan ;yla/ine* kertas tissu.
Cara erja Pengam!"lan #ampel Organ atau Sampling ikus dibius menggunakan ketamine dan ;yla/ine. &enginduksian ketamine dan ;yla/ine dilakukan se!ara intraperitoneal. -jung
3
Penjern"han atau Clearing &roses ini dilakukan dengan menggunakan larutan ;ylol* yaitu dimulai dari memasukkan pankreas kedalam ;ylol 8 selama " jam* kemudian ;ylol 88 selama " jam* ;ylol 888 dengan suhu kamar selama >0 menit* dan selama >0 menit berikutnya di dalam inkubator suhu >7?. Penanaman &ar"ngan dalam Para'"n atau Embeding ahapan ini terdiri dari tiga proses yaitu infiltrasi parafin* penanaman jaringan* dan pembuatan blok jaringan. &roses pertama dilakukan dengan memasukkan organ ke dalam parafin 8 selama " jam* parafin 88 selama " jam* dan ke dalam parafin 888 selama " jam. &roses infiltrasi parafin dilakukan di dalam inkubator. &roses selanjutnya adalah penanaman jaringan ke dalam parafin menggunakan alat Tissue Embedding Console. &roses ini di mulai dengan mengolesi tutup pagoda dengan gliserin dalam kondisi hangat di atas hotplate bersuhu %7?9* kemudian parafin !air dituangkan ke dalam tutup pagoda se!ara perlahan hingga permukaan parafin !embung. 6aringan dengan segera diletakkan ke dalam parafin dengan menggunakan pinset se!ara hati7? untuk menghilangkan
4
kerutan* lalu diletakkan pada gelas objek untuk dilihat hasilnya di ba'ah mikroskop. Gelas objek yang terlekat oleh jaringan diberi label sesuai dengan kode sampel dan dikeringkan. Sediaan disimpan di inkubator dengan suhu >7?9 selama untuk dilanjutkan dengan proses pe'arnaan. Pe)arnaan atau Stainning 6aringan di'arnai dengan pe'arnaan Hematoksilin osin. 6aringan yang akan di'arnai diletakkan di dalam inkubator %7? 9 selama > menit. 6aringan kemudian dikelurkan dan diletakkan dalam suhu ruang selama 5 menit. &roses selanjutnya adalah deparafinisasi dengan ;ylol yang bertujuan untuk menghilangkan parafin pada jaringan. 1imulai dari memasukkan jaringan ke ;ylol 888 selama > menit* ;ylol 88 selama > menit* dan ;ylol 8 selama 5 menit. 3angkah berikutnya adalah proses rehidrasi yang bertujuan mengembalikan !airan kedalam jaringan dengan menggunakan larutan alkohol. &roses rehidrasi yang pertama adalah memasukkan jaringan ke dalam alkohol absolut 888* 88* 8 masing menit* kemudian jaringan dimasukkan ke dalam alkohol #5:* #0:* $0: se!ara bergantian dan masing menit* kemudian dimasukkan dalam alkohol 70: selama 5 menit. Setelah dimasukkan kedalam alkohol bertingkat* langkah yang selanjutnya dilakukan adalah memasukkan jaringan kedalam air kran selama 5<"0 menit dan terakhir kedalam akuades selama "0 menit. Setelah masuk kedalam larutan akuades selama "0 menit* hematoksilin dipipetkan ke jaringan selama " menit sampai pe'arna berhasil me'arnai intisel. Sediaan jaringan kembali direndam dalam air kran selama "0 menit dan di dalam akuades selama minimal 5 menit. &e'arnaan kembali dilanjutkan dengan memipetkan pe'arna eosin selama > menit untuk me'arnai sitoplasma jaringan. Sediaan jaringan kembali direndam dalam akuades selama 5 menit. ahapan berikutnya adalah dehidrasi yang bertujuan menarik air dari jaringan agar tetap a'et dan tidak !epat rusak. Sediaan jaringan di!elupkan 2<> kali se!ara berurutan kedalam larutan alkohol 70:* $0:* #0:* #5:* absolut 8 dan absolut 88* kemudian di dalam absolut 888 selama " menit. &roses terakhir adalah penjernihan atau clearing yaitu dimulai dengan men!elupkan jaringan 2<> kali kedalam larutan ;ylol 8 dan ;ylol 88* kemudian dimasukkan ke dalam ;ylol 888 selama " menit. Setelah melakukan pe'arnaan* maka proses selanjutnya adalah mounting * yaitu penutupan sediaan dengan menggunakan entelan sebagai perekat.
5
* HA#+L DAN PEMBAHA#AN 8.&embuatan Sediaan Histologi. 1alam praktikum ini &roses fiksasi menggunakan 2 larutan yang berbeda* yaitu larutan paraformaldehid dan bouin. 3arutan paraformaldehid terdiri dari formalin* 4a9l* Auades dan ,=H sebagai penjernih. 3arutan Bouin terdiri dari sam pi!rat* formalin* dan a!eti! a!id gla!ial. 9airan fiksasi dialirkan dengan menggunakan 2 metode. etode pertama adalah dengan nekropsi yang dilakukan segera setelah he'an !oba sudah terbius sempurna agar men!egah perubahan jaringan yang disebabkan autolisis sel. Sedangkan metode kedua adalah perfusi. &erfusi merupakan metode pada teknik histologi untuk mengalirkan !airan fiksasi ke dalam jaringan dengan 'aktu yang relatif !epat* sehingga gambaran histologi yang diperoleh me'akili keadaan sesaat sebelum kematian. etode ini membutuhkan peran pembuluh darah yang akan menyalurkan dan memberikan akses ke setiap jaringan dalam 'aktu yang !epat. Sel akan memulai proses autolisis segera setelah proses anoksia (kekurangan oksigen) terjadi. 6adi* semakin !epat larutan fiksatif sampai ke setiap sel* maka proses autolisis pun semakin !epat berhenti.
b a
,am!ar 1. etode perfusi pada he'an !oba. ,eterangan a. Centrikel kiri* b. trium kanan.
&erfusi dia'ali dengan menyayat bagian atas abdomen dari tikus yang sudah dibius. &enyayatan dilanjutkan ke sekitaran daerah jantung tanpa mengenai organ. trium kanan disayat sedikit dan entrikel kiri segera dialiri dengan garam fisiologi 4a9l agar jantung tetap berdenyut dan darah yang hilang digantikan dengan 4a9l. 6ika darah yang keluar dari atrium kanan telah bening maka !airan 4a9l digantikan dengan larutan fiksatif* sehingga larutan fiksatif ini dapat mengalir ke seluruh tubuh melalui pembuluh darah tikus. ahapan fiksasi berdasarkan Gage et. (20"2) adalah dimulai dengan insisi pada lateral mele'ati integument dan dinding abdomen* dilanjutkan insisi pada diafragma dan daerah tersebut dipotong untuk mengekspos jantung. ,emudian potongan paralel dibuat pada kedua sisi tulang iga (!ostae) hingga tulang s!apulae.
6arum perfusi diletakkan melalui potongan entrikel menuju aorta asendens. " set hemostat yang lain dapat digunakan untuk klem aorta* yaitu kira
,am!ar *. etode perfusi pada he'an !oba (sumber Gage et al. 20"2).
Setelah difiksasi berdasarkan 'aktu yang telah ditentukan* organ dimasukkan ke dalam alkohol 70: sebagai stopping point* dan dilanjutkan dengan dehidrasi. 1ehidrasi merupakan proses penarikan !airan jaringan dengan menggunakan alkohol bertingkat. ,emudian dilakukan perjernihan atau clearing * yaitu proses menggantikan alkohol dalam jaringan. ,emudian organ di infiltrasi dan ditanam dalam parafin. =rgan kemudian siap dipotong dan di'arnai. &e'arnaan dengan menggunakan hematoksilin dan eosin merupakan metode yang paling banyak digunakan dalam pembuatan preparat histologis. &e'arnaan ini terdiri dari 2 jenis /at 'arna* yaitu hematoksilin yang fungsinya untuk me'arnai inti sel menjadi biru. Sedangkan eosin fungsinya untuk me'arnai sitoplasma menjadi merah.
7
88. Sediaan Histologi =rgan &ankreas ikus Hasil pengamatan pada sediaan histologi pankreas dengan pe'arnaan Hematoksilin osin (H) dapat dilihat pada gambar . Hal utama yang dapat dilihat dari sediaan pada gambar tersebut adalah pulau langerhans yang dikelilingi oleh sel).
&3
&3
A
B
&3
C
,am!ar -. Histologi organ pankreas tikus pada pe'arnaan H. ,eterangan D dan B Histologi pankreas ikus difiksasi menggunakan paraformaldehid* 9 Histologi pankreas tikus B difiksasi menggunakan Bouin. &ulau langerhan (&3).
1alam proses pembuatan sediaan histologi* terdapat beberapa kesalahan sehingga sediaan yang didapat menjadi tidak sempurna. Hal tersebut dapat dilihat dari gambar 2.
8
L P
A
B
C
,am!ar .. Hasil potongan yang kurang bagus. ,eterangan 3& D 3ipatan
1ari gambar 2 dapat dilihat hasil kesalahan dalam pengerjaan sediaan histologi pankreas. Gambar dan B menunjukkan potongan yang tebal sehingga inti sel tidak ter'arnai dengan baik. &ada gambar B juga terdapat lipatan yang menunjukkan ketidaksempurnaan dalam proses merentangkan jaringan di dalam air hangat ataupun kesalahan ketika proses pemindahan jaringan dari mikrotom yang mengakibatkan lipatan tidak dapat dihilangkan. &ada gambar 9 diduga jaringan terlalu lama dipanaskan sehingga mengakibatkan jarak diantara lobus a!inar lebih lebar.
9
- E#+MPULAN DAN #A/AN e%"mpulan
1ari praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan ". &embuatan sediaan histologi pankreas tikus terdiri dari beberapa tahapan yaitu sampling, fiksasi dan stopping point, dehidrasi* clearing * infiltrasi dan embedding, pemotongan atau sectioning * pe'arnaan. 2. Beberapa kesalahan yang mungkin terjadi dalam pembuatan sediaan histologi adalah pemanasan jaringan yang berlebihan* sayatan yang terlalu tebal* lipatan karena proses perentangan yang tidak sempurna* pe'arnaan yang tidak pas.
#aran
1isarankan untuk melakukan pemotongan jaringan dengan lebih tipis dan menanggulangi kesalahan
10
DA$TA/ PU#TAA Banks E6. "##>. Applied eterinary !istology. d ke<>. -S osby. Gage G6* ,ipke 1* Shain E. 20"2. Ehole animal perfusion fi;ation for rodents. ". is. E#p. e>5%(%5)"<# Gartner 3&* Hiatt 63. 2007 0 Color Te#tboo$ o% !istology. d ke<>. &hiladelphia lseier 8n!. Gunarso E. "#$%. &engaruh Dua "enis Cairan 'i$sati% yang (erbeda pada &embuatan &reparat dari "aringan !ewan Dalam )etoda )i$rote$ni$ &ara%in. Bogor 8&B &ress aynard * 1o'nes 4* +inney B. 20". !istological Techni*ues an +ntroduction %or (eginners in To#icology. -, he oyal So!iety of !hemistry 9ambridge. Suarna S,* 3ayton 9* Ban!roft 61. 200$. (ancro%ts Theory and &ractice o% !istological Techni*ues. d ke<7. 3ondon 9hur!hill 3iingstone. -ray 1. 200#. &rofil sel F pulau langerhans jaringan pankreas tikus diabetes mellitus yang diberi irgin !o!onut oil (C9=) Skripsi. Bogor (81) 8nstitut &ertanian Bogor.
