Las técnicas de preconcentración
Determinación de melanina utilizando polímeros impresos moleculares magnéticos y cromatografía líquida de alto rendimiento Miao Wang , Yong - xin Ella , Xin Wei Du, Yu- Ting Huang Xiao -Mei Shi , Mao -jun Jin, Jin Fen , Shao Hua y Wang Jing Clave Laboratorio de Seguridad y Calidad Agroalimentaria del Ministerio de Agricultura, PR China, Instituto de Estándares de Calidad y Testing Technology for Agriproducts del CAAS, Beijing, China Un nuevo método utilizando polímeros de impronta molecular magnéticos (MMIP) específicos para el reconocimiento, separación, y extracción de la melamina en la leche bovina se desarrolló con un aditivo estante magnético externo en el presente documento. El MMIP se sintetizó con Fe3O4 nanopartículas y la tecnología de síntesis de polímeros de impresión molecular. Con la ayuda de una etapa de elución con metanol / ácido acético mezcla de elución, la melamina se puede recogió y se concentró. Mediante el uso de cromatografía líquida de alto rendimiento combinado con esta técnica de tratamiento previo, los analitos se eluyeron a partir de los polímeros magnéticos pueden ser determinados. Este método de extracción fue validado por el análisis de la matriz de la leche de vaca que se incurren. El método propuesto simplifica los procedimientos del método de extracción en fase sólida clásica y mejora la fiabilidad del método. Las recuperaciones obtenidas de este método estaban en el rango de 85,04 a 105,2 % en muestras de leche con púas. El límite de detección (LOD) fue inferior a 29,2 ng g - 1. Palabras clave: cromatografía líquida de alta eficacia, polímero impreso molecular magnética; melamina ; Pre tratamiento
INTRODUCCIÓN La melamina es una triazina heterocíclico que contiene nitrógeno con un contenido de nitrógeno de 66,7 %. Se ha añadido ilegalmente a los productos lácteos y leche cruda para hacer que los productos parecen tener un alto contenido de proteína (Li et al . 2010 ) . Hay muchos métodos de detección de melamina , incluyendo la cromatografía líquida de alto rendimiento ( HPLC ) , HPLC - espectrometría de masas ( Ding et al 2008 . ; Recibido el 24 de mayo de 2012; aceptado el 23 de junio de 2012. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (N º 31171890, 30771425). Correspondencia: Jing Wang, de la Academia de Ciencias Agrícolas, Instituto de Estándares de Calidad y Tecnología de Ensayos para la agro -productos, Zhongguancun South Street No.12, Haidian District, Beijing 100081, China chino.
NUEVO MÉTODO PARA PROBAR MELAMINA EN LA LECHE Filigenzi et al. 2008) , cromatografía de gases- espectrometría de masas ( Miao et . Al 2009), la superficie mejorada espectroscopia Raman (Lin et al. 2008) , y la electroforesis capilar ( Yan et . Al 2009). La impresión molecular es un método popular desarrollado en los últimos años que se basa en la hipótesis de cerradura y llave (Pauling 1940). En un disolvente adecuado, con la ayuda de las fuerzas intermoleculares, la molécula plantilla y el monómero funcional puede formar un complejo hospedador-huésped. La adición de un agente de reticulación y el iniciador puede iniciar la formación de polímeros estables. Después de la elución de la molécula molde, las cavidades que actúan como sitios de unión específicos para los analitos se forman en el polímero. Estos polímeros de impresión molecular (MIP) tienen selectividad estable y específica para las moléculas diana. ( Wulff , Sarhan , y Zabrocki 1973 ) En comparación con anticuerpos biológicos , MIP tener mejor estabilidad física y química , son menos costosos , más fáciles de preparar , y podrían utilizarse en una amplia variedad de separaciones cromatográficas , sensores biomiméticos , extracciones en fase sólida , y muchas otras áreas ( Koohpaei et al. 2008 ) . Los Fe3O4 nanopartículas son nanomateriales funcionales que se utilizan en el análisis , el diagnóstico clínico de ácido nucleico , la focalización de medicamentos , enzima y la inmovilización de células , y muchos otros c ampos
debido a sus características magnéticas , superpara - magnetismo, y la capacidad de ser funcionalizado para obtener actividad bioquímica ( Gubin 2009 ) . Síntesis de MIP en la superficie de las nanopartículas de Fe3O4 sería combinar su adsorción selectiva y propiedades magnéticas. Las p erlas magnéticas con AMIP cáscara se podrían utilizar en muchas aplicaciones para la detección de residuos ( Ansell y Mosbach 1998 ) . En el presente estudio, las partículas magnéticas se recubrieron con MIP capaces de reconocer específicamente la melamina . Estos MIP magnética ( MMIPs ) se utilizaron para detectar la melamina en la leche bovina .
EXPERIMENTAL Productos Químicos El FeC13 - 6H2O, FeC12 - 4H2O, azobisisobutironitrilo y NaOH fueron adquiridos de Beijing Chemical Co. (Beijing, China). El PEG6000, PVA, y el ácido oleico se obtuvieron de Sinopharm Reactivo Co. melamina fue adquirido de ácido Alfa Aesar Co. Meth acrílico ( MAA) y dimetacrilato de etilenglicol ( EGDMA ) se obtuvieron en Acros Organics , y acetonitrilo y metanol fueron de Thermo Fisher Scientific .
Síntesis de nanopartículas magnéticas Una solución de FeCl3 - 6H2O ( 5,4 g) y FeCl2 - 4H2O ( 1,99 g ) ( relación molar 2:1) se preparó en 80 ml de H2O destilada dos veces , y luego se transfirió a un matraz de tres bocas y se agitó a 600 rpm . La mezcla se calentó a 70º C, y se burbujeó N2 a través de la solución durante 30 minutos para eliminar O2. Una cantidad de 20 ml de una solución acuosa de NaOH (16 g = ml) solución que se había burbujeado con N2 y luego se añadió rápidamente a la mezcla. Después, la mezcla se agitó bajo atmósfera de N2 durante 2 h para asegurar la reacción llegó a la finalización. Cuando la reacción llegó a la finalización, se observaron negro Fe3O4 nanopartículas en el matraz de tres bocas. Luego 1 g ofPEG6000 y 2 ml de ácido oleico se añadieron al matraz para modificar la superficie de las nanopartículas . Las nanopartículas se lavaron después con cada uno de los siguientes disolventes en secuencia: doble - H2O destilada, metanol, y acetonitrilo . Las partículas magnéticas se recogieron con una rejilla de separación magnética, y se secaron en un horno de vacío a 60 º C durante 30 minutos (Harris et al. 2003) .
Síntesis de MMIPs de melamina Melamina ( 0,25 mmol , 31.5mg ) , MAA ( 1 mmol , 0.085mL ) , DMSO ( 2 ml ) , y el glicol ( 5 ml ) se añadieron a un 0
matraz de fondo redondo de 100 ml . La mezcla fue vórtice se mezcla y se calentó a 60 C hasta que la melamina completamente disuelto. Se añadió acetonitrilo (40 ml) , y la mezcla se agitó a temperatura ambiente , y después se 0
almacenó en el refrigerador ( 4 C ) durante la noche . Se añadieron las partículas de Fe3O4 magnéticos ( 100 mg ) , EGDMA ( 5 mmol , 0.95mL ) , y azobisisobutironitrilo ( 10 mg ) , y la solución se burbujeó con N2 durante 10 min 0
para eliminar O2 . El matraz se cerró herméticamente y se calentó a 60 C durante 12 h , y después se enfrió en hielo a temperatura ambiente . Polímeros eran visibles en el matraz después de la refrigeración, y estos se aislaron después de tratamiento con ultrasonidos durante 10 min y centrifugación a 5000 r = min durante 5 min. ThemagneticMIPs se secaron en un horno de vacío a 60 º C durante 30min (M. Ding et al. 2011) . Después de la polimerización, las moléculas de plantilla necesarios para ser t rasladados de las cavidades de los polímeros. En este caso, los polímeros magnéticas se lavaron con metanol al 95% = 5 % de ácido acético glacial en un extractor de Medias dejó durante 12 h para eliminar la plantilla de melamina a partir de la MIP. Los MMIPs se lavaron hasta que la melamina ya no se detectó en el sobrenadante. Después de la separación de los MMIPs con la rejilla magnética, que se secaron en un horno de v acío a 60 º C durante 2 h. (Li Et al . 2010 )
Microesferas de polímero Caracterización Las estructuras de la superficie y tamaños de partícula de las microesferas de polímero se analizaron por microscopía electrónica. El MIP también se analizaron por rayos infrarrojos de Fourier (FT-IR) espectrometría como pastillas de KBr .
Los experimentos de adsorción con el microesferas de polímero Para investigar el efecto del tiempo de reacción sobre la absorción de melamina , MMIPs (2 mg ) se colocaron en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, y se añadió una solución en acetonitrilo de melamina ( 60 mmol = L ) . La mezcla se 0
colocó en un agitador oscilante a 28 C, y se agitó durante diversos períodos de tiempo. El MIP se aislaron a
continuación, utilizando la separación magnética y el sobrenadante se analizó por HPLC. Para cada tiempo de agitación, se calculó la capacidad de unión por unidad de masa de polímero adsorbido. La MIP (2 mg) se colocaron en tubos de centrífuga de 1,5 ml, y se añadió una solución en acetonitrilo de la melamina (1 ml, 0,1 - 64mg = L ) . La 0
mezcla se colocó en un agitador oscilante, y se agita durante 12 horas a 28 C. Se calculó la capacidad de unión por unidad de masa de polímero, y las isotermas de adsorción de la melamina polímero impreso microesferas se obtuvieron.
La selectividad de los MMIPs Atrazina, una estructura analógica de melamina , y el cloranfenicol , que es otro producto químico prohibido en la leche , se utilizaron para investigar la selectividad de los MMIPs . Las estructuras de estos productos químicos se muestran en la figura. 1. Soluciones estándar (1 mmol = L) de cada compuesto se prepararon en etanol: agua (9:1, v = v). Una alícuota (1 ml) de cada solución estándar se añadió a MMIPs (2,0 mg) en un tubo Eppendorf. Los tubos se mezclaron vigorosamente durante 15 min a temperatura ambiente, y luego se eliminaron los MMIPs a partir del sobrenadante con un imán externo. La cantidad residual de cada compuesto en el sobrenadante se determinó por HPLC.
Análisis HPLC Una solución madre de patrón de melamina (1,000 g = L ) se preparó disolviendo una cantidad exactamente pesada de estándar de melamina en un disolvente de metanol y agua ( 04:01 ) . La solución madre de patrón se diluyó para preparar una serie de soluciones patrón de trabajo de melamina (0,1 - L = 256 mg) , que se utilizaron para construir una curva de calibración . La HPLC se realizó en una columna Waters 2475 = 2998 ( Waters Corporation , Milford , MA ) con una columna polar HILIC - 100 SEPAX ( SEPAX , Newark, DE ) . La fase móvil fue acetonitrilo y agua ultra - pura con 3 mmol = L de acetato de amonio (09:01), y el caudal de la fase móvil fue de 1,0 ml = min. La melamina se detectó a 240 nm usando un detector de matriz de diodos.
Detección de melamina por HPLC en leche bovina Muestras de leche de vaca ( 2 ml ) se enriquecieron con melamina ( 2,5 mg = ml ) , y después se transfirieron en tubos de centrífuga de 50 ml . Un reactivo de extracción (18 ml ) se añadió a cada tubo . Se evaluaron los siguientes regentes de extracción para la extracción de melamina a partir de la leche : ( a) 18 ml de acetonitrilo puro ; ( b ) 18 ml de acetonitrilo con 0,8 gMgSO4 y 0,2 g de Na2SO4 como agentes de secado , y (c ) 13,5 ml de ácido trifluoroacético al 1 % ( TFA ) y 4,5 ml de acetonitrilo . Cada tubo fue mezclado por ultrasonidos durante 10 min y se dejó reposar durante 1 minuto, y después 30 mg de MMIPs se añadió. Los tubos fueron mezclados vórtice durante 5 min, se centrifugaron durante 10 min a 8000 r = min, y se dejaron reposar durante 1 min, que se separó la mezcla en un líquido claro sobrenadante y sedimento blanco. TheMMIPs se transfirieron entonces a un tubo de 10 ml limpio, y prelavados y acondicionados con metanol. El sobrenadante de la última etapa fue entonces pipeta en el tubo, y el tubo se agitó por lo melamina entró en contacto directo con los PIM y se transfiere a ellos desde la matriz de la muestra. Un imán externo se utiliza para retener los MMIPs en el tubo mientras que se lavaron dos veces para eliminar las impurezas. La melamina en los MMIPs se eluyó después con 1,5 ml de metanol: ácido acético (95:5, v = v) tres veces. Los eluatos se combinaron y se evaporaron a sequedad bajo una corriente de N2. El residuo se resuspendió en acetonitrilo puro de grado HPLC, se filtró a través de un filtro de membrana de 0,2 2 mm y se inyectó en la HPLC ( Chen 2009 ) .
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Caracterización de las partículas magnéticas y MMIPs Las partículas de Fe3O4 se sintetizaron y se revistieron con ácido oleico y PEG 6000 para formar una cáscara hidrófobo y añadir algunos grupos químicos necesarios. El Fe3O4 recubierto entonces unido fácilmente a MAA y EGDMA, que se utiliza como un monómero funcional y cruzar enlazador para sintetizar los MMIPs . El diámetro medio de las nanopartículas fue de aproximadamente 10 nm .
La Figura 1 muestra el espectro de FT - IR de las nanopartículas modificadas Fe3O4. El pico a 560 cm - 1 es un pico característico de Fe3O4, y se puede atribuir a Fe -O estiramiento y flexión vibraciones. También se observaron picos a 580 y 400 cm - 1 debido al desplazamiento causado por el efecto de tamaño de las nano partículas. La banda de absorción ancha cerca de 3400 cm - 1 corresponde a enlaces de hidrógeno, y los picos a 2920 y 3024 cm - 1 se puede atribuir a las vibraciones de CH - 2. Los picos a 1500 cm - 1 y 1150 cm - 1 son de OH - flexión y el estiramiento de la CO hidroxilo alcohólico, respectivamente, en PEG6000. Los dos picos a 1700 cm - 1 (tramo CO) y 3444 cm - 1 (O- H estiramiento) indican grupos carboxílicos están presentes en el polímero. En el espectro de FT - IR de la MMIPs (Fig. 2 ) , se observaron picos a 1700 cm - 1 ( tramo CO) y 3444 cm - 1 ( tramo OH ) de los grupos carboxílicos en la superficie del polímero . Los picos en 1601, 1492, y 1452 cm - 1 se pueden atribuir a benceno, y picos a 700 y 750 cm - 1 corresponden a los picos de mono - sustituidos de benceno. Los picos a 2923 y 3025 cm - 1 son de metileno y CH. El pico a 554 cm - 1 es de Fe -O. Estos resultados muestran los MMIPs tienen los picos de absorción característicos de Fe3O4, lo que confirma que contienen las nanopartículas magnéticas.
Características de adsorción, estudios de fijación y análisis Scatchard La absorción de melamina por MMIP aumentó a medida que aumentó el tiempo de agitación, pero la mayor parte de la absorción se produjo en la primera 30min ( fig. 3 ) . La absorción de melamina por MMIPs y MNIPs aumentó a medida que la concentración de melamina aumentó. La cantidad de melamina adsorbida por los PIM fue mayor que la de los PIN , debido a la capacidad de unión específica de los PIM para la melamina ( fig. 4 ) . El análisis de Scatchard es un método para estudiar caracteres de sitios de unión de polímeros de impresión molecular. En esta ecuación, Q significa la capacidad de absorbancia ; C se refiere a la concentración del sustrato de melamina ( mg = L ) ; Qmáx significa la capacidad máxima de unión aparente ; mientras Kd es la constante de disociación en el sitio de unión . Por trazado Q = C vs Q y la búsqueda de los números de las curvas de regresión, un número de tipos de sitios de unión podría ser asegurado. Análisis Scatchard (Fig. 5 ) indicó que había dos tipos de sitios de unión en las MMIPs . Sitio de u nión 1 trabajó en una gama apropiada de concentraciones de sustrato, con Qmax1 ¼ 1,3857 y Kd1 ¼ 6,8611 según Scatchard ecuación q = C ½ melamina ¼ ðQmax QÞKd : El otro sitio de unión, con Qmax2 ¼ 61.7047 y Kd2 ¼ 0,0149, trabajó principalmente en concentraciones muy bajas o altas de sustrato. Esto podría explicarse por el número relativamente bajo de sitio de unión 1 y su afinidad relativamente alta en comparación con el sitio de unión 2. Sitio de unión 2 sería funcional cuando había muy bajas concentraciones de melamina o en soluciones con concentraciones muy altas de melamina , lo que conduciría a la saturación del sitio de unión 1 .
La selectividad de los MMIPs Incluso en la presencia de la atrazina y el cloranfenicol , la melamina se adsorbió selectivamente por el MMIPs ( fig. 6).
El análisis de muestras auténticas leche bovina El método fue validado mediante el análisis de muestras de leche bovina auténticos para la melamina . Los procedimientos de extracción y limpieza se han simplificado en un solo paso.
Efecto Matrix Los ingredientes complejos en matrices de muestras pueden aumentar en gran medida el ruido de fondo y afectar a la sensibilidad analítica. Algunos estudios han informado de que las técnicas de extracción selectiva se pueden utilizar para reducir o incluso eliminar los efectos de la matriz (M. Ding et al. 2011). Los cromatogramas (Fig. 7) se obtuvieron de la melamina en muestras de leche con púas que se extrajeron con los MMIPs. Se observó una ligera mejora de iones para la melamina usando las MMIPs. Estos resultados muestran los MMIPs eliminan el efecto de la matriz.
Rendimiento analítico Los cromatogramas de melamina extraídos de muestras de leche bovina con púas se muestran en la figura. 7. La Columna HILIC Polar- 100 dio buenos modelos de picos y alta sensibilidad para la melamina. Para las muestras adicionadas (256 mg = 0,1 - L), el análisis por HPLC de la melamina en la leche enriquecida bovina mostró una buena linealidad con coeficientes de correlación (r) entre 0.995 y 0.999. El límite de detección , determinado como la cantidad mínima de cada analito en la matriz de la muestra que proporciona una relación señal - a - ruido de tres, fue 29,2 ng = ml . Las recuperaciones de melamina variados con los tres reactivos de extracción diferentes. Para acetonitrilo puro y acetonitrilo con los agentes de secado las recuperaciones de melamina fueron 99,2 % y 105,2 %, respectivamente. Con TFA þ acetonitrilo se recuperó ninguna melamina , a pesar de que esta mezcla de disolventes es ampliamente utilizado en otros métodos de extracción de melamina . La razón de esto puede ser que los MMIPs no pudieron capturar eficazmente melamina en el ácido fuerte ( 1 % de TFA ) , ya que puede dañar los sitios de unión de la MIP . Las recuperaciones en acetonitrilo fueron> 90 %, lo que es satisfactorio para el análisis de trazas. Los resultados del método de extracción propuesto se compararon con los de otros métodos de análisis, incluyendo MIP - microextracción en fase sólida ( Hu et al . 2008 ) y la extracción en fase sólida - MIP ( Caro et al . 2005 ) . El método propuesto es más sencillo que estos otros métodos, ya que no requiere centrifugación o filtración adicional. En su lugar, los analitos se extraen fácilmente, limpiada, y se separan de la matriz de la muestra con un imán externo. Esto podría reducir el tiempo de análisis. Para evitar el problema de la molécula plantilla de fugas, el uso de una molécula de plantilla artificial con una estructura química similar a la melamina podría ser investigada en el futuro. Una molécula de plantilla artificial sería asegurar la plantilla y de los picos de sustrato fueron bien separados en el cromatógrafo , y esto sería eliminar la interferencia de las moléculas de plantilla filtrados .
El análisis de muestras auténticas Muestras de leche fresca se compraron de un supermercado local, y se analizaron usando el método descrito anteriormente (Selectividad de la sección MMIPs ) . La melamina no se detectó en estas muestras.
CONCLUSIONES En este estudio, se sintetizaron los granos MMIPs con núcleo de nanopartícula magnética y melamina específica MIP cáscara. Los MMIPs se utilizaron con éxito para separar melamina a partir de muestras de leche. En lugar de utilizar centrifugación y filtración como en la extracción en fase sólida convencional, la melamina se adsorbió selectivamente y se recogió rápidamente por los MMIPs con la ayuda de un imán externo. En comparación con los procedimientos de preparación de muestras convencionales, tales como extracción con disolventes, centrifugación, la limpieza, y la concentración por extracción en fase sólida, esta técnica es eficiente, simple y rápida. Los polímeros magnéticos pueden ser reciclados y reutilizados muchas veces. Este método es prometedor para la determinación de residuos de plaguicidas, contaminantes, medicamentos veterinarios y aditivos prohibidos en muestras de alimentos. En comparación con los métodos convencionales, este método tiene requisitos más bajos de disolvente y es menos costoso.