ANALISIS FASE PREANALITICA
FASE ANALITICA
FASE POSTANALITICA
Recolección Identificación Volumen Alícuotas Preservación Transporte Conservación Tratamiento
Reactivos Estándares Medición de volúmenes Recipientes Mezclado Tiempo de reacción Temperatura de incubación Instrumentos Analista
Cálculos Transcripción Transmisión Interpretación
TÉCNICAS ANALÍTICAS MÁS FRECUENTEMENTE FRECUENTEMENTE UTILIZADAS UTILIZADAS EN QUIMICA CLÍNICA
2
Conceptos del proceso •
•
•
Un análisis es un proceso que proporciona información física o química sobre los cons consti titu tuy yent entes de un espé espéci cime men n. Una medida es la determinación experimental de las propiedades físicas o químicas de una sustancia. Una técnica es cualquier principio fisico o químico que que pue puede util utiliz izar arse se par para estu estudi diar ar una una sus sustanci ancia. a. 3
Conceptos del proceso •
•
•
Un método es la aplicación de una técnica para determinar una sustancia específica en una determinada matriz. Un procedimiento es un conjunto escrito de instrucciones que detalla la aplicación de un método. Un protocolo es un conjunto de instrucciones escritas estrictas que concretan el procedimiento que debe seguirse. 4
Fase analítica
Análisis Químico
Análisis Instrumental
Resultado
5
Ejemplos de Instrumentos Analíticos
Balanza
Espectrofotómetro
IR
pHmetro
GC
HRMN
Microondas
Refractómetro
HPLC
Turbidimetro
AA
Fluorómetro
TÉCNICAS ANALÍTICAS MÁS FRECUENTEMENTE UTILIZADAS EN QUIMICA CLÍNICA
1. Técnicas espectroscópicas 2. Técnicas electroquímicas 3. Técnicas de separación 4. Radiactividad 5. Biología molecular
7
Técnicas espectroscópicas •
Espectroscopia de absorción molecular Uvvis.
•
Espectroscopia de fluorescencia.
•
Espectroscopia de luminiscencia.
•
Espectroscopia de dispersión.
•
Espectroscopia atómica
8
Espectroscopia de absorción molecular Uv-vis •
•
•
En los laboratorios clínicos se utilizan las técnicas espectroscópicas para la determinación cuantitativa de muchas sustancias en los medios biológicos. Más del 90% de las determinaciones que se realizan en Química Clínica tienen como paso final la lectura de una absorbancia o una transmitancia. Los métodos de análisis de espectroscopia de absorción molecular miden la concentración de las sustancias en disolución por la absorción de luz que presentan estas o sus derivados a determinadas longitud de onda. (Ley de Lambert-Beer )
A acl 21
Fase analítica
Análisis Químico
Análisis Instrumental
Resultado
22
Espectroscopia de absorción molecular Uv-vis •
•
•
Para determinar la concentración de un compuesto se mide su absorbancia, si el compuesto absorbe, transformándolo en otro que absorba o haciéndolo que forme parte de una reacción por medio de su reacción con los reactivos adecuados (reactivos químicos o sistemas enzimáticos en combinación con los primeros). A + B → C+ D
Reacción auxiliar
D+P→Q+R
Reacción indicadora
La reacción en que se transforma la sustancia que se determina se denomina auxiliar. La reacción utilizada para la medida se denomina indicadora. 23
Fase Analítica
Análisis Químico
Reacción auxiliar Subsiguiente Reacción indicadora Precedente
24
Espectroscopia de absorción molecular Uv-vis •
•
Las reacciones indicadoras pueden ser subsiguientes o precedentes: Reacción subsiguiente: se mide un producto de la reacción auxiliar. A + B → C+ D D+P→Q+R
Reacción auxiliar Reacción indicadora
Ejemplo: Acido úrico, método de la uricasa uricasa
Acido úrico 2 H O alantoína CO2 H 2O2 2
peroxidasa
H 2O2 cromógeno compuesto coloreado 4 H 2O 25
Espectroscopia de absorción molecular Uv-vis •
Reacciones precedentes son aquellas en las que la reacción proporciona una sustancia que a su vez reacciona de forma estequiométrica con la sustancia que quiere analizarse en la reacción auxiliar, lo cual da lugar a un producto medible. U + V → X+ Y
A+Y
•
Reacción indicadora
→B+C
Reacción auxiliar
Ejemplo: Urea, método de diacetilmonoxima Diacetilmonoxima
H
H 2O Diacetilo Hidroxilamina H
Diacetilo Urea Derivado diazínico
26
Espectroscopia de absorción molecular Uv-vis •
•
•
La medida de la concentración se realiza con 2 tipos de métodos: punto final y cinéticos. Métodos de Punto Final (método de equilibrio): se incuba la disolución reaccionante con la muestra, el tiempo necesario para que se complete la reacción o se alcance el equilibrio. En los métodos cinéticos o de medida de la velocidad de reacción, la variación de la absorbancia se determina con el tiempo, que se relaciona con la concentración.
27
Fase analítica
Técnica Química
Técnica Instrumental
Resultado
28
Fotocolorimetría: - Incide un haz de luz monocromático perpendicularmente a un tubo de solución coloreada. - Parte de energía incidente (I0) es absorbida por la solución y otra transmitida (I1) - I1 depende de c= concentración solución(moles / L) l= distancia atravesada por la luz ε = coeficiente de absortividad molar del mensurando
-Según la ley de Lambert-Beer: I0 = I1 x 10-εx ℓ x c I0 = 10-εx ℓ x c I1 Log I0 = ε x ℓ x c I1
ε x ℓ x c= A
A= absorbancia ε y ℓ = cte
A=k x c Ec. de una recta que pasa por origen. A = acl
Así se puede determinar la concentración de la solución problema.
29
Fuente: Dra. Yania Suárez Pérez
MAESTRIA LABORATORIO CLINICO
Espectrofotómetro Es un instrumento que se usa para medir la absorbancia de una muestra en función de la longitud de onda de la radiación electromagnética. El espectrofotómetro consta de los siguientes componentes clave: fuente, dispositivo de dispersión, área de muestra y uno o más detectores.
Fuente genera radiación electromagnética: Puede que genere luz de longitudes de onda entre 400-700 nm, o bien para la zona ultravioleta (200-400 nm). El dispositivo de dispersión: selecciona una determinada longitud de onda. El área de muestra es donde se contiene el material bajo estudio. El detector sirve para medir la intensidad de la radiación. 31
Fuente: Dra. Yania Suárez Pérez
MAESTRIA LABORATORIO CLINICO
VIS
Lámpara de W
UV-VIS
Lámpara de W y D2
Filtros para la dispersión de la luz
Cubetas de vidrio, plástico o cuarzo
Cromadores (prismas y redes de difracción)
Cubetas de cuarzo
Fuente: Dra. Yania Suárez Pérez
MAESTRIA LABORATORIO CLINICO
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35
36
37
38
39
40
Hitachi 704
Hitachi 717
Fase Analítica
Con estandard Técnica Instrumental
Absorbancia Sin estándar
Curva de calibración Factor de calibración Coeficiente de extinción molar
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Métodos de punto final •
Estándar: es una preparación que contiene una concentración conocida de un elemento o sustancia específica.
•
Usualmente son sólidos que cumplen con las siguientes características: – – – – – –
–
Tienen composición conocida Deben tener elevada pureza. Debe ser estable a temperatura ambiente. Debe ser posible su secado en estufa. No debe absorber gases. Debe reaccionar rápida y estequiométricamente con el titulante. Debe tener un peso equivalente grande.
43
Standard – Soluciones standar •
•
•
•
Estándar primario: la masa puede exactamente pesando la sustancia pura.
determinarse
Solución estándar primario: solución estándar de concentración conocida. Se prepara pesando el estándar primario y disolviendo en un solvente adecuado. Standard secundario: la masa sólo puede determinarse por medio de análisis químicos. Soluciones estándar secundario: se prepara disolviendo un estándar secundario en un solvente apropiado.
44
Curva de calibración •
La concentración también puede obtenerse construyendo una curva patrón con soluciones de concentración conocida, llamada Curva de Calibración. ¿ Qué es una curva de calibración? Se trata de una curva de referencia construida a partir de la respuesta de cantidades conocidas de un analito ante una reacción. •
45
Se utiliza para determinar la cantidad del analito (ej. proteínas) presente en una muestra incógnita. •
Se relaciona la concentración del analito con la intensidad de color que genera una reacción. •
La relación mientras sea lineal cumple con la ley de LambertBeer. •
La intensidad del color se puede determinar por el método fotocolorimétrico. •
46
Construcción de la curva de calibración: Preparar varias concentraciones lo más exactas posibles (soluciones calibradoras) de lo que se desea analizar, a partir de una solución patrón o estándar. (ej. ONF 5x 10-4 M). •
Para la preparación de los calibradores (sustancias químicas de certificada pureza) se debe utilizar un diluyente puro el cual debe ser medido con exactitud. •
A cada tubo se le agrega la solución patrón ( ej. : estándar de glicógeno 0.025% p/v) en diferentes concentraciones dependiendo del rango del método, excepto el blanco. •
Todos los tubos deberán tener el mismo volumen final, por lo que hay que diluir con agua destilada, y agitar. •
Luego se agrega el reactivo: ej. reactivo de Biuret.
•
47
Se mide la variación de color en el espectrofotómetro , ajustando a cero la maquina con el blanco antes de medir la absorbancia. •
Al final se obtienen las absorbancias para las diferentes concentraciones de los patrones y se puede hacer la curva de calibración. Así se puede obtener el factor de calibración. •
¿Cuándo no se cumple la ley de L-B?
•
A partir de concentraciones 0.01M hay desviaciones de linealidad. •
radiación no monocromática.
•
Existencia de otros equilibrios en la solución (acido-base, formación de complejos) ya que se modifican la concentración de la sustancia estudiada. •
48
Validación de la Curva de Calibración Para validar los resultados obtenidos de un experimento se deben tener en cuenta los siguientes factores: Los cálculos que se realizan para las mediciones deben inclui luir la menor cantidad de pipetas y micropipetas.
Preparar por lo menos 3 concentraciones de la sustancia de int interés erés.. La construcción de la curva debe incluir los intervalos de confianza.
49
50
Regresión lineal : Método para obtener la relación más precisa entre la variable independiente y los múltiples valores que puede tomar la variable dependiente.
Permite encontrar la ecuación de la recta que mejor asocia los valores de las mediciones experimentales presentes en la curva de calibración.
Y = señal medida X = variable independiente a = coeficiente lineal b = coeficiente angular 51
Ejemplo: DETERMINACION DE LA GLICEMIA Solución patrón de glucosa 0.2 mg/ml
rango :0.01- 0.2mg
Se preparan 4 tubos con diferentes concentraciones de glucosa a partir de la solución patrón. Entonces si: 0.2 mg1ml x=0.25ml 0.05mg X -Se hace lo mismo para todas las concentraciones, quedando: •
•
Tubo Glucosa 0.2
1
2
3
4
blanco
Muestra problema
0.25
0.5
0.75
1
-
-
0.05
0.1
0.15
0.2
-
-
-
-
-
-
-
1
0.75
0.5
0.25
1
1
-
mg/ml (ml) Mg glucosa Muestra problema (ml) H 2O
Después se mezclan y se ponen a hervir por 10 minutos, luego se sacan y sin agitar se enfrían. Se agregan 1 ml de reactivo de somogyi a todos los tubos. 52
Se mezcla nuevamente y se agregan 7 ml de agua destilada Mezclar y determinar absorbancia a 540 nm, y se obtiene: mg de Glucosa
Absorbancia (540 nm)
1
0,0
0
2
0,05
0,27
3
0,1
0,56
4
0,15
0,79
5
0,2
1,11
Muestra problema
-
Tubos
Como la ec. es y = 5.4667x Pendiente= 5.4667= k= factor de calibración. Como la muestra problema tiene una A de 0.41, y como k= 5.4667 podemos calcular la concentración del analito:
0,41
Curva de Calibración )
y = 5,4667x
A
b
s
o
br
a
n
c
ai
5(
4
0
n
m
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
c=A/k c= 0.41/ 5.4667 c= 0.0749 mg/ ml
0
0,05
0,1
0,15
mg de Glucosa
0,2
0,25
53
54
Uso de soluciones standard •
La concentración del espécimen viene dada por
ce Donde:
Ae Ast
cst
ce
=
concentración del analito
Ae
=
absorbancia del desconocido
Ast
=
absorbancia del estándar
cst
=
concentración del estándar
55
Uso de soluciones standard
ce
ce •
Ae Ast
Constante = F
cst
Ae F
F = factor de calibración
Es una buena práctica de laboratorio correr el standard periódicamente. 56
Sin soluciones standard •
Alternativamente puede obtenerse la concentración sin utilizar soluciones estándar, conociendo el coeficiente de extinción molar del compuesto (ε): A =
ce •
donde ce ε Ae
εcl
1
l
* Ae
= concentración del analito = coeficiente de extinción molar del compuesto = absorbancia del desconocido
ce
K Ae 57
Espectroscopia de absorción molecular Uv-vis K =factor por el que hay que multiplicar la absorbancia y que debe incluir la dilución:
K
1
V t
l V e
Pe
Donde: Vt = Ve = Pe =
volumen total de la mezcla de reacción volumen del espécimen peso molecular del espécimen. 58
Ejercicio 1
59
Ejercicio 2
60
Soluciones blanco •
Los orígenes de dicha absorbancia son: –
–
–
•
•
Contaminación de los reactivos. Presencia de sustancias que reaccionan de igual forma a la muestra. Color de los reactivos
Conocidas también como Blancos de reactivo. Tienen como finalidad determinar la absorbancia de la solución final derivada de los reactivos. 61
Soluciones blanco •
Usos de los blancos: –
Ajuste a 100 % T u O.000 de absorbancia con agua destilada/solvente. Aproblema = Aleída – Ablanco
–
Ajuste a 100 % T u 0.000 de absorbancia con el reactivo.
62
Métodos cinéticos •
•
•
En los métodos cinéticos o de medida de la velocidad de reacción, la variación de la absorbancia se determina con el tiempo, que se relaciona con la concentración. Los métodos de medida pueden ser enzimáticos y no enzimáticos. Las reacciones de primer orden o de seudoprimer orden son las más empleadas en las determinaciones cinéticas de la concentración de las sustancias.
63
Métodos cinéticos •
•
•
Se caracterizan siempre por presentar curvas de concentración/tiempo exponenciales. La variación de la absorbancia es directamente proporcional a la concentración inicial del sustrato, si se mantienen constantes los tiempos de medida t1 y t2. Los analizadores automáticos son sistemas muy adecuados para los análisis cinéticos. Son rápidos y menos sensibles a interferencias externas (turbidez y color del espécimen) que los de punto final. 64
Medida de las actividad enzimática •
•
•
Como las enzimas están presentes en cantidades tan bajas y mezcladas con otras sustancias en el plasma, se aprovecha su propiedad de catalizar reacciones químicas para medir la actividad enzimática y no la concentración. La medición de la actividad de una enzima implica siempre medidas de la velocidad de reacción.
Se mide mediante la formación de productos o el agotamiento de sustratos durante un intervalo de tiempo.
65
Medida de la actividad enzimática
66
Medida de la actividad enzimática Al efectuar la determinación de la actividad enzimática se obtiene una curva progreso con tres fases: 1.
retraso,
2.
velocidad inicial,
3.
velocidad reducida.
La reacción exponencial.
sigue
un
curva
67
Medida de la actividad enzimática •
Una vez mezclados la enzima sus sustratos y cofactores, la velocidad de reacción aumenta rápidamente ( fase de retraso), hasta alcanzar un valor en el que permanece constante (velocidad inicial ) y la concentración del producto aumenta en forma lineal. Esta es la fase en la cual debe determinarse la actividad de la enzima.
•
68
Medida de la actividad enzimática •
Posteriormente la velocidad disminuye y el tiempo es mayor (velocidad reducida) , la proporcionalidad no se mantiene debido a diversos factores que incluyen la disminución de la concentración del sustrato, efectos de la inhibición del producto, desnaturalización de la enzima, entre otros.
69
Métodos de medición de la actividad enzimática Tiempo fijo (punto final, análisis en 2 puntos) •
•
Se incuba la enzima con el sustrato un tiempo determinado y se mide la variación de la absorbancia durante éste. Se supone que la medida se la realiza en la parte lineal de la reacción, donde la velocidad y , por tanto, la actividad enzimática son proporcionales al tiempo de medición.
70
Métodos de medida de la actividad enzimática Velocidad de reacción (puntos múltiples) •
•
Se mide la variación de la absorbancia en la unidad de tiempo, para lo cual se toman varias lecturas en el curso de la reacción. Es más práctico ya que cualquier desviación de la linealidad es detectable.
71
Medida de las actividades enzimáticas
Factor de conversión 1 mol/l = 10 6 U/l = 106 mU/ml 72
Medida de la actividad enzimática
73
74
75
Ejercicio 3 3.
A partir de los siguientes datos obtenidos en un laboratorio al procesar una muestra de suero de un paciente para determinar ALP, determine la actividad de la enzima. Datos
Valor
Absorbancia inicial
0.100
Absorbancia (1 min)
0,135
Absorbancia (2 min)
0,167
Absorbancia (3 min)
0,201
Volumen total de la mezcla de reacción
1,020 ml
Volumen de muestra
0,020 ml
ε
Longitud de paso de luz
18.50 x 10 3 L.mol-1.cm-1 1 cm 76
Ejercicio 3
77
Ejercicio 3
78
Expresión de resultados •
•
•
Se ha expresado de muchas maneras: g/l, mg/l, mg/ml, g %, mg/100 ml, mg/dl, ppm. Durante muchos años las determinaciones enzimáticas recibieron valores basados en unidades arbitrariamente elegidas. La IUB recomendó el uso de la Unidad enzimática (U) que presenta desventajas: los valores obtenidos por un método no son generalmente convertibles.
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Expresión de resultados •
Todos los procesos químicos de los organismos biológicos están gobernados por las leyes fundamentales de la química.
1.0 mmol de Hb + 4.0 mmol de O 2 que contiene 40 mmol de Fe bilirrubina
•
•
34.0 mmol de
Los resultados de las mediciones deben expresarse con magnitudes y unidades relacionadas con átomos, iones o moléculas. La OMS adoptó la resolución WHA 30.39 que recomendaba el uso del Sistema Internacional de Unidades (SI). 80
Expresión de resultados •
•
La norma emitida por el Instituto Ecuatoriano de Normalización INEN, indica la aplicación del Sistema Internacional de Unidades (SI). El item 5.8.3 de la Norma 15189 “Laboratorios Clínicos. Requisitos particulares relativos a la calidad y la competencia” establece que el Informe de laboratorio debe incluir: –
h) los resultados del análisis expresados en unidades SI o unidades trazables al SI. 81
Expresión de resultados •
Ventajas: –
–
–
•
Proporciona un lenguaje común entre varias disciplinas científicas. Numerosas revistas científicas exigen el uso del sistema SI para expresar las mediciones en los trabajos publicados en ellas. En los protocolos de análisis que se adjuntan a los kits comerciales, ya se incluye esta forma de expresión de resultados.
Desventajas: –
Reemplazar o revisar instrumentos.
–
Proporcionar nuevas tabla de valores de referencia.
–
Adaptación del médico a nuevas cifras.
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Magnitudes y unidades Magnitud Cantidad de sustancia (n) Concentración de cantidad de sustancia Actividad catalítica (z) Concentración de actividad catalítica (b)
Concentración de cantidad de sustancia
Concentración de actividad catalítica
Unidad
Abreviatura
Mol
-
Mol/Litro
mol /L
Katal
kat
Katal/Litro
kat/L
cantidad de sustancia
volumen de muestra
actividad catalítica volumen de muestra
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Informe de laboratorio •
•
•
•
Debe contener para cada determinación una información exhaustiva y no ambigua. Debe incluir datos: sistema (tipo de muestra primaria), componente que se determina, magnitud usada o medida, valor numérico, unidad SI. Pueden agregarse datos: estado del paciente, valores de referencia. Los componentes deben designarse con propiedad para evitar confusiones (estado de la sustancia en el fluido o sistema.) 84
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87
