Szabó Gábor - Sejtbiológia (2003, 73 oldal)

Forrás: http://www.doksi.hu

SEJTBIOLÓGIA Szerkesztette

SZABÓ GÁBOR



SEJTBIOLÓGIA Szerkesztette

SZABÓ GÁBOR

MEDICINA KÖNYVKIADÓ RT. " BUDAPEST, 2004


A könyv az Oktatási Minisztérium támogatásával, a Felsôoktatási Pályázatok Irodája által lebonyolított Felsôoktatási Tankönyv- és Szakkönyvtámogatási Pályázat keretében jelent meg. Technikai szerkesztô BACSÓ ZSOLT

 Dr. Szabó Gábor, 2004

E könyv szövege, ábraanyaga és mindenféle tartozéka szerzôi jogi oltalom és a kizárólagos kiadói felhasználási jog védelme alatt áll. Csak a szerzôi jog tulajdonosának és a könyv kiadójának elôzetes írásbeli engedélye alapján jogszerû a mû egészének vagy bármely részének felhasználása, illetve többszörözése akár mechanikai, akár fotó-, akár elektronikus úton. Ezen engedélyek hiányában mind a másolatkészítés, mind a sugárzás vagy a vezeték útján a nyilvánossághoz való közvetítés, mind a digitalizált formában való tárolás, mind a számítógépes hálózaton átvitt mû anyagi formában való megjelenítése jogszerûtlen.

ISBN 963 242 773 4

MEDICINA A kiadásért felel a Medicina Könyvkiadó Rt. igazgatója Felelôs szerkesztô: dr. Bargár Ilona Mûszaki szerkesztô: Bede Tamásné Ábrákat rajzolta: Dr. Bodor Zoltán Borítót tervezte: Varsányi György Terjedelem: (A/5) ív Azonosító szám: 1754


A könyv szerzôi

BACSÓ ZSOLT

KOVÁCS JÁNOS

DAMJANOVICH SÁNDOR

KOZMA-BOGNÁR LÁSZLÓ

DUDA ERNÔ

KRASZNAI ZOLTÁN

FALUS ANDRÁS

MADARÁSZ EMÍLIA

GÁSPÁR REZSÔ

MATKÓ JÁNOS

GODA KATALIN

MÁTYUS LÁSZLÓ

KERESZTES ÁRON

MICZÁK ANDRÁS

KISS ANNA

MÓDIS LÁSZLÓ


NAGY FERENC

SZABÓ GÁBOR

NAGY LÁSZLÓ

SZATHMÁRY EÖRS

NAGY PÉTER

SZEBERENYI JÓZSEF

PAKU SÁNDOR

SZEKANECZ ZOLTÁN

PÁLÓCZI KATALIN

SZÖLLÔSI JÁNOS

PANYI GYÖRGY

TIMAR JÓZSEF

PÁRDUCZ ÁRPÁD

UDVARDY ANDOR

RÖHLICH PÁL

VEREB GYÖRGY

SASS MIKLÓS

VITÁLIS SÁNDOR

SIPICZKI MÁTYÁS


Elôszó

A könyv sokszerzôs volta. Az olvasó az elsô sokszerzôs, hazai sejtbiológia-tárgyú könyvet tartja a kezében. Több, mint harminc különbözô hátterû, tudományos érdeklôdésû szakember, egyetemi oktató vett részt a könyv megírásában. A sokszerzôs jelleg remélt kamatai között az egyik legfontosabb az, hogy a könyv ezáltal országos vállalkozássá, a szakma közös ügyévé lett. Ennek eredményeként - egy íróasztal (számítógép) helyett - egy virtuális mûhelyben született ez a könyv, az együttgondolkodás pozitív élményében részesítve a szerzôket. A munkamegosztás csökkentette az egy szerzôre jutó anyag terheit, és a munka örömteli szellemi erôfeszítés maradhatott. Kinek szól a könyv? A graduális képzésben résztvevô egyetemi hallgatóknak, orvosi és tudományegyetemeken egyaránt, posztgraduális kurzusok résztvevôinek és a biológiai tudományok területén dolgozó kutatóknak, kutató orvosoknak, szakterületük ismeretanyagának tágabb háttereként. Feltételezett elôismeretek. Elsô éves egyetemi hallgatók számára - más tárgyak elôzetes ismerete nélkül is – tanulható a könyv. A sejtbiológia legfontosabb fejezeteit áttekintô bevezetés elolvasása után a további fejezetek középiskolás biológia, fizika, kémia tudás birtokában megérthetôek. A nagy, angol nyelvû sejtbiológia könyvekben szokásos részletes molekuláris biológiai bevezetõ helyett mi egy rendkívül tömör áttekintésre vállalkoztunk, mely több, mint egy szó- ill. fogalom-magyarázat („Glossary”), mert összefüggôen írja le a legfontosabb és a késôbbiekben visszaköszönô molekuláris fogalmakat, de meghagyja a molekuláris biológia részletes tárgyalását annak a tárgynak. Hogyan használható a graduális képzésben? Könyvünk bôvebb és mélyebb, részletesebb, mint ami egy-egy sejtbiológia-tárgyú graduális kurzus céljaira elegendô lehet. A Debreceni Egyetem Általános Orvosi Karán pl. a féléves sejtbiológia tárgy keretében a könyvnek kb. a fele tekinthetô törzsanyagnak, kb. a harmada olvasmány, melyeket a hallgatók önálló feldolgozásában szemináriumokon beszélünk meg - a fennmaradó részek más felsôoktatási intézmények kurzusai számára relevánsak. Tanulhatóság. A könyv nagyobb fejezetei számos alfejezetet tartalmaznak, melyek közül az elsô – komplikált anyagrész esetén – a továbbiak részletes anyagát röviden és könnyen érthetôen áttekinti, a molekuláris részleteket elnagyolva. A további alfejezetekkel az átfedések szándékosak, mert elôsegítik a könnyebb tanulhatóságot. Bár az egyes alfejezetek egymásra épülnek, minden (al)fejezet önállóan is tanulható, olvasható. Próbaképpen egy-egy fejezetet a bonyolultabbak közül kiadtunk 10-10 hallgatónak a Debreceni Egyetemen, szemináriumi kiselôadás anyagaként. Tanulhatónak, áttekinthetônek bizonyultak. A fejezetek tagolása. A fejezetek többsége egységes tagolású és a sejtbiológia tárgyának alapvetôen kísérletes beállítódását, mentalitását tükrözi – az ismeretátadás induktív jellegû. A legtöbb fejezet egy biológiai jelenség, kísérleti megfigyelés leírásával indul, melyet – ahol ennek értelme van – a jelenség felmerülô lehetséges magyarázatai követnek. Ezt a ma igaznak vélt magyarázat, interpretáció követi, majd az anyag tételes ismertetése („kapcsolódó ismeretek”). A „Kitekintés” c. részben a mai kutatási tren-


8

ELÔSZÓ

dekre ill. a közeljövôben várható fejleményekre történik rövid utalás. A fejezeteket ajánlott olvasmányok rövid listája, összefoglalás és ellenôrzô kérdések zárják le. A könyv felépítése. A sejt külseje felôl haladunk a belsô organellumok felé, a részfunkciók felôl a komplexebbek irányában, az összefüggô ismeretek taglalása megelôzi a függetleníthetô anyagrészekét. Számos olyan fejezet található könyvünkben, mely az eddig megjelent nagy, angol nyelvû kompendiumokból még hiányzik. (Ilyen pl. a cirkadián ritmusokról, az ABC transzporterekrôl, a sejten belüli diffúziós viszonyokról, a nukleáris organizáció egyes fejleményeirôl, az evolúció-kutatás alapelveirôl szóló fejezetek, az ionmiliôvel kapcsolatos átfogó ismertetés, stb.) Könyvünk szellemisége. Könyvünknek, több célkitûzését, számos remélt jellemzôjét és fôleg sokszerzôs mivoltát tekintve, írásos hazai elôzménye nemigen lelhetô fel. Természetesen a korábbi kiváló hazai sejtbiológia könyvek és egyetemi jegyzetek tudásanyaga továbbérlelôdve bennünk hozzáadódtak könyvünk szellemiségéhez, melynek gyökerei leginkább abból a talajból táplálkoznak, amelyben ott vannak a klasszikus morfológiai megközelítés soha feleslegessé nem váló pedantériája, a molekuláris biológus és genetikus mára bôséges önigazolást nyert szemlélete és az általános biológus tágabb horizontú szempontjai egyaránt: az egyik fejezetben egyik, a másikban egy másik szempont dominál. Pedagógiai alapelvek. - Végtelen a tudás birodalma, hasznosabb iránytût adni és megtanítani annak használatát, mintsem leltárba venni minden fa, domb nevét és helyét. – Nem a konkrét tények, akár összefüggések maradandóak, hanem az ismeretek elsajátításának élménye, metodikája, igénye és egy minél bôvebb szótár („vocabulary”), amely segít ebben a tájékozódásban. - Félpasszív tudás, mely elegendô ahhoz, hogy a választ egy kérdésre a megismert anyagon belül megtaláljuk, a számonkérés jövôje. - A tanulást nagyban megkönnyítik a már megszerzett ismeretek: ezért az összefüggô alfejezetek röviden megismétlik a korábbiak legfontosabb állításait és ezekre építik saját mondandójukat. Üzenet a könyvet olvasóknak, tanulóknak. A könyvben megtalálhatóak az összes szerzô elérhetôségi paraméterei. Az összes hasznos javaslatra, ill. szakmai kérdésre igyekszünk válaszolni és az elkövetkezô, javított kiadásokban ezeket figyelembe venni. Így bôvülhet virtuális mûhelyünk igazivá, melynek szellemi produktumában az anyagot elôször olvasók és az egyes területeken saját tapasztalatokkal rendelkezô szakmabeliek – szerzôk és a szerzôk listáján egyelôre nem szereplô kollégák – gondolatai, keze nyoma mind fellelhetôk lesznek. Köszönetnyílvánítás. A könyv számos fejezetének írásakor, ábráinak szerkesztésekor figyelembe vettük az alábbi sejtbiológiai tematikájú kézikönyvek, tankönyvek ismeretanyagát: Lodish, H., Matsudaria, P., Baltimore, D., Berk, A., Zipursky, S.L., Darnell, J., Molecular Cell Biology (Scientific American Books, New York, 1999); Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Watson, J.D., Molecular Biology of the Cell (Garland Publishing Inc. 1994); B. Alberts, D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walker, Essential Cell Biology (Garland Publishing, Inc., 1997). Mikroszkópos felvételeket bocsátottak rendelkezésünkre Dean A. Jackson (Department of Biomolecular Sciences, UMIST, Manchester, Nagy-Britannia) és Pavel Hozak (Dept. of Cell Ultrastructure and Molecular Biology, Institute of Experimental Medicine, Prága, Csehország), melyeket a Company of Biologists LTD. engedélyével a megfelelô fejezetben felhasználtunk, a források feltüntetésével – segítségüket ezúton is köszönjük. Végül: köszönöm a szerzôtársaknak, hogy megtiszteltek együttmûködésükkel, és nevükben is kívánom, hogy sokan, haszonnal és kedvvel olvassák-tanulják könyvünket. A könyvet édesapám emlékének ajánlom. Szabó Gábor


Rövid tartalom

1.

Bevezetés a sejtbiológiába (RÖHLICH PÁL)

2.

A sejt legfontosabb anyagi összetevõi és alapvetô molekuláris mechanizmusai. A sejtbiológia molekuláris biológiai eszköztára (SZABÓ GÁBOR és NAGY LÁSZLÓ)

3. 3.1. 3.2.

Sejtmembrán és anyagtranszport A sejtmembrán felépítése és transzportmechanizmusai (MATKÓ JÁNOS) Hidrofób anyagok passzív és aktív transzportja. ABC-transzporterek (GODA KATALIN és SZABÓ GÁBOR) A membránpotenciál eredete és sejtbiológiai szerepe. Ioncsatornák és farmakológiai vonatkozásaik (GÁSPÁR REZSÔ) Ionmiliô - intracelluláris kalcium, ozmotikus viszonyok, pH szabályozása (PANYI GYÖRGY) A membrán laterális organizációja (DAMJANOVICH SÁNDOR)

3.3. 3.4. 3.5. 4. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8. 4.9. 4.10. 5. 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5.

Citoplazmatikus membránrendszerek és organellumok, intracelluláris transzportfolyamatok Endocitotikus és exocitotikus folyamatok, vezikuláris transzport: áttekintés (KOVÁCS JÁNOS) Az endocitotikus/exocitotikus folyamatokat vezérlô molekuláris történések (NAGY PÉTER) Kaveolák (KISS ANNA) Endoplazmás retikulum (NAGY PÉTER) Golgi-apparátus (NAGY PÉTER) Lizoszómák (NAGY PÉTER) Peroxiszómák (NAGY PÉTER) Fehérjék szelektív célba juttatása. Fehérjeszorting. Vezikulaszortírozás (NAGY PÉTER) A sejtmûködés energiaforrása: mitokondrium, kloroplasztisz (SZÖLLÔSI JÁNOS) Diffúziós viszonyok a sejtben (BACSÓ ZSOLT) Citoszkeleton: struktúrák és funkciók A mikrotubulus, a mikrofilamentum és az intermedier filamentum rendszer (MÁTYUS LÁSZLÓ) Sejtközpont (KOVÁCS JÁNOS) Csillók, ostorok (KOVÁCS JÁNOS) Molekuláris motorok (KOVÁCS JÁNOS) Sejtmotilitás, kemotaxis (PAKU SÁNDOR és TIMÁR JÓZSEF)


10

RÖVID TARTALOM

6. 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 7. 7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 7.5. 7.6.

8. 8.1.

Sejtmag A sejtmag felépítése és funkciói (SZABÓ GÁBOR) A nukleocitoplazmatikus makromolekulatranszport (UDVARDY ANDOR) Kromatinszerkezet és a génexpresszió szabályozása: molekuláris biológiai mechanizmusok sejtbiológiai kontextusban (UDVARDY ANDOR) A maghártya permeabilitási viszonyai (DAMJANOVICH SÁNDOR) Sejtosztódás Sejtciklus (SZABÓ GÁBOR) A mitózis és citokinezis fázisai. A sejtorganellumok sorsa az osztódás során. A centriólumciklus (SZEBERÉNYI JÓZSEF) A sejtosztódás mechanikája (SZEBERÉNYI JÓZSEF) Meiózis (SIPICZKI MÁTYÁS) Gametogenezis, fertilizáció (KRASZNAI ZOLTÁN) A sejciklus szabályozása: biokémiai mechanizmusok sejtbiológiai kontextusban (UDVARDY ANDOR)

8.2. 8.3. 8.4.

A változó sejt A sejt tulajdonságainak megváltozása külsõ jelek hatására: jelátviteli folyamatok (VEREB GYÖRGY) Jelátviteli jelenségek idegsejteken (PÁRDUCZ ÁRPÁD) Jelátvitel fotoreceptorsejtekben (RÖHLICH PÁL) Napi ritmusok: az idõ mint jel (KOZMA-BOGNÁR LÁSZLÓ és NAGY FERENC)

9. 9.1. 9.2. 9.3. 9.4. 9.5.

Sejt és környezete Az extracelluláris mátrix (MÓDIS LÁSZLÓ) Multicelluláris szervezõdés: sejtek közötti és sejt-mátrix kapcsolatok (SZÖLLÔSI JÁNOS) Sejt-vírus interakciók sejtbiológia vonatkozásai (DUDA ERNÔ) Sejt-baktérium interakciók sejtbiológiai vonatkozásai (MICZÁK ANDRÁS) Sejt-sejt kommunikáció és jelátvitel összefüggései immunsejtekben (FALUS ANDRÁS)

10. 10.1 10.2. 10.3. 10.4.

Sejtsorsok és sorsfordulók Sejtsorsok (SZABÓ GÁBOR) Sejtsorsok és differenciálódás (DUDA ERNÔ) Differenciálódás és szöveti regeneráció: vérképzô sejtek (PÁLÓCZI KATALIN) Mikroorganizmusok differenciálódási jelenségei: bacillusok spórázása (VITÁLIS SÁNDOR)

11. 11.1. 11.2. 11.3.

A multicelluláris szervezôdés fejlôdésbiológiai vonatkozásai (SASS MIKLÓS) Az egyedfejlôdés szabályozásának legfontosabb mozzanatai. A programozott sejthalál fejlõdésbiológiai vonatkozásai. Sejtadhéziós mechanizmusok szerepe az egyedfejlôdés szabályozásában.


RÖVID TARTALOM

12.

Az élôvilág kialakulása, evolúció. Prokarióták és eukarióták (SZATHMÁRY EÖRS)

13. 13.1 13.2. 13.3. 13.4.

A növényi sejt sajátosságai (KERESZTES ÁRON) A növényi sejt litikus apparátusa A növényi sejtváz A sejtfal A növényi sejtosztódás

14. 14.1 14.2.

Sejtbiológia az orvostudományban Sejtbiológiai ismeretek haszna az orvosi gyakorlatban (SZEKANECZ ZOLTÁN) Az érelmeszesedés sejtbiológiai mozzanatai (NAGY LÁSZLÓ)

15. 15.1. 15.2.

A sejtbiológia gyakorlata Sejt- és szövettenyésztés: módszertani alapismeretek (MADARÁSZ EMILIA) Sejtalkotók fluoreszcenciás jelölése és detektálása (VEREB GYÖRGY)

Rövidítésjegyzék Tárgymutató

11



Részletes tartalom

1.

Bevezetés a sejtbiológiába (RÖHLICH PÁL)

1.1. 1.2. 1.3. 1.3.1. 1.3.1.1. 1.3.1.1.1. 1.3.1.1.2. 1.3.1.1.3. 1.3.1.1.4. 1.3.1.2. 1.3.1.2.1. 1.3.1.2.2. 1.3.1.2.3. 1.3.1.2.4. 1.3.1.2.5. 1.3.1.2.6. 1.3.1.2.7. 1.3.1.2.8. 1.3.1.2.9. 1.3.1.3. 1.3.1.4. 1.3.2.

A sejtbiológia kialakulása Nagyságrendek Az élô szervezetek alapvetô kategóriái: pro- és eukarióta sejtek A prokarióták és eukarióták legfontosabb tulajdonságai A prokarióta sejt szerkezete Sejtburok Sejtmembrán Citoplazma Nukleoid. A bakteriális DNS Az eukarióta sejt szerkezete Sejtmembrán Sejtmag Riboszómák Endoplazmatikus retikulum Golgi-apparátus Lizoszóma Peroxiszóma Mitokondrium Sejtváz (citoszkeleton) A növényi sejt specifikumai Az egysejtû eukarióták specifikumai Az élet peremén

2.

A sejt legfontosabb anyagi összetevôi és alapvetô molekuláris mechanizmusai. A sejtbiológia molekuláris biológiai eszköztára (SZABÓ GÁBOR és NAGY LÁSZLÓ)

2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.1.3. 2.1.4.

A sejt legfontosabb anyagi összetevôi és alapvetô molekuláris mechanizmusai A fehérjék A sejtek energiaforgalmának kulcsszereplôje: az ATP A DNS szerkezete DNS-replikáció


14

RÉSZLETES TARTALOM

2.1.5. 2.1.6. 2.1.7. 2.1.8. 2.1.9. 2.1.10. 2.1.11. 2.2. 2.2.1. 2.2.2.

DNS-repair DNS -> mRNS (transzkripció), mRNS -> fehérje (transzláció) A naszcens RNS mRNS-sé érése A fehérjék posztranszlációs módosításai és célba juttatása A génexpresszió szabályozása Általános szabályozási alapelvek A DNS heterogenitása A sejtbiológia molekuláris biológiai eszköztára Módszerek Modellélôlények

3.

Sejtmembrán és anyagtranszport

3.1.

A sejtmembrán felépítése és transzportmechanizmusai (MATKÓ JÁNOS)

3.1.1. 3.1.1.1. 3.1.1.2. 3.1.1.3. 3.1.1.4. 3.1.1.5. 3.1.2. 3.1.2.1. 3.1.2.2. 3.1.2.2.1. 3.1.2.2.2. 3.1.2.2.3. 3.1.2.2.4. 3.1.2.2.5. 3.1.2.2.6.

A sejtmembrán szerkezete A lipid kettôs réteg Membránfehérjék A membránfehérjék azonosítása, a szerkezet és funkció vizsgálati lehetôségei A membránfehérjék laterális mobilitása, a "folyékony mozaik" membránmodell Membránmikrodomének Anyagtranszport a sejtmembránon keresztül Molekuláris diffúzió a lipid kettôs rétegen keresztül A membrán-transzportfehérjék fôbb típusai Egy jellegzetes uniport: a glukóztranszporter A Na+ /K+-ATP-áz pumpafehérjék mûködése és funkcionális jelentôsége A Ca2+ -pumpa-fehérjék mûködési mechanizmusa A H+ -ATP-ázok mûködése és jelentôsége eukarióta sejtekben ABC-transzporterek Szimport és antiport típusú kotranszportrendszerek

3.2.

A hidrofób vegyületek transzportja. ABC-kazettás transzporterek (SZABÓ GÁBOR és GODA KATALIN)

3.2.1. 3.2.2. 3.2.2.1. 3.2.2.2. 3.2.2.2.1. 3.2.2.2.2.

Hidrofób molekulák passzív transzportja Aktív transzport: ABC-transzporterek Prokarióták, alacsonyabb rendû eukarióták és növények ABC-transzporterei Emberi sejtek ABC-transzporterei Pumpamûködésû emberi ABC-fehérjék Csatorna- vagy csatornaszabályozó emberi ABC-fehérjék


RÉSZLETES TARTALOM

3.3.

A membránpotenciál eredete és sejtbiológiai szerepe. Ioncsatornák és farmakológiai vonatkozásaik (GÁSPÁR REZSÔ)

3.3.1. 3.3.1.1. 3.3.1.2. 3.3.1.3. 3.3.2. 3.3.3. 3.3.4. 3.3.4.1. 3.3.4.2.

A membránpotenciál eredete Egyensúlyi potenciál: Nernst-egyenlet Diffúziós potenciál: Goldman-Hodgkin-Katz-egyenlet A membránpotenciál kialakulása élô sejt esetében Az ioncsatornák sokfélesége A membránpotenciál és az ioncsatornák szerepe Az ioncsatornák farmakológiai vonatkozásai Ioncsatorna-aktivitás farmakológiai szeparálása csatornablokkolókkal A gyógyszerek, toxinok és az ioncsatornák kölcsönhatásának mechanizmusa

3.4.

Ionmiliô - intracelluláris kalcium, ozmotikus viszonyok, pH szabályozása (PANYI GYÖRGY)

3.4.1. 3.4.1.1. 3.4.1.2. 3.4.1.3. 3.4.1.4. 3.4.1.5. 3.4.1.6. 3.4.1.7. 3.4.1.8. 3.4.1.9. 3.4.1.10. 3.4.2. 3.4.2.1. 3.4.2.2. 3.4.2.3. 3.4.3. 3.4.3.1. 3.4.3.2.

Intracelluláris Ca2+-homeosztázis Sejtmembrán Intracelluláris Ca2+-raktárak: gyorsan reagáló kalciumraktárak Rianodinreceptor IP3-receptor Intracelluláris Ca2+-raktárak: mitokondrium Intracelluláris raktárak: lassan reagáló kalciumraktárak A citoszol tulajdonságai Ca2+-oszcilláció A kalciumoszcillációk jelentôsége A kalciumjel dekódolása: kalmodulin A sejtek ozmo- és volumenszabályozása Sejtek reakciói nem izotóniás közegben Szabályzó térfogat csökkenés (RVD) Szabályzó térfogat növekedés (RVI) Intracelluláris pH-homeosztázis A citoszol savasodását elôidézô fontosabb mechanizmusok összefoglalása A citoszol lúgosodását elôidézô fontosabb mechanizmusok összefoglalása

3.5.

A membrán laterális organizációja (DAMJANOVICH SÁNDOR)

3.5.1. 3.5.2. 3.5.3.

A Fluid Mozaik Membrán Modell Sapkaképzôdés Receptor-szuperstruktúrák

15


16

RÉSZLETES TARTALOM

4.

Citoplazmatikus membránrendszerek és organellumok, intracelluláris transzportfolyamatok

4.1.

Endocitotikus és exocitotikus folyamatok, vezikuláris transzport: áttekintés (KOVÁCS JÁNOS)

4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.1.3.1. 4.1.3.2. 4.1.3.3. 4.1.4. 4.1.5. 4.1.6. 4.1.7.

Az exo- és endocitotikus folyamatok közös jellemzôi A válogatás általános molekuláris alapjai A vezikuláris transzport A vezikulaképzôdés és membránfúzió A vezikulák válogatása és irányított transzportja Az egyensúly és a kompartimentumok közötti különbségek Az endocitózis Fagocitózis Makropinocitózis Klatrinfüggetlen endocitózis

4.2.

Az endocitotikus/exocitotikus/vezikuláris transzportfolyamatokat vezérlô molekuláris történések (NAGY PÉTER)

4.2.1. 4.2.1.1. 4.2.1.2. 4.2.1.3. 4.2.1.4. 4.2.1.5. 4.2.1.6. 4.2.1.7. 4.2.1.8. 4.2.2. 4.2.2.1. 4.2.2.2. 4.2.2.3. 4.2.3. 4.2.4. 4.2.5. 4.2.6.

Burkolt vezikulumok képzôdése a receptormediált endocitózis során A vezikulumok képzôdésének néhány általános jellemzôje Burkolt gödör (coated pit) szerepe a receptormediált endocitózisban A klatrinburkú vezikulum lefûzôdése a donormembránról A klatrinburok kapcsolódása a sejtmembránhoz és a citoszkeletonhoz A klatrinburok leválása a vezikulum felszínérôl Az alacsony denzitású lipoprotein receptormediált endocitózisa A transzferrin receptormediált endicitózisa Az epidermális növekedési faktor receptor mediált endocitózisa Nem klatrinburkú vezikulumok A nem klatrinból felépülô burok szerepe A COP-burok polimerizációja A COP-burok leválása a vezikulum felszínérôl A szállítandó fehérjék kiválasztásának molekuláris mechanizmusa A vezikulumok transzportja: a citoszkeleton és a molekuláris motorok szerepe Egyalegységes G-fehérjék szerepe a vezikuláris transzportban Vezikulumok fúziója a célorganellum membránjával

4.3.

Kaveolák (KISS ANNA)

4.3.1. 4.3.2.

Morfológiai jellemzés Biokémiai jellemzés


RÉSZLETES TARTALOM

4.3.3. 4.3.4. 4.3.5. 4.3.5.1. 4.3.5.1.1. 4.3.5.1.2. 4.3.5.1.3. 4.3.5.1.4. 4.3.5.2.

A kaveolák biogenezise A kaveolák lefûzôdése, internalizációja A kaveolák funkciója A kaveolák szerepe a transzportfolyamatokban Potocitózis Transzcitózis Endocitózis Transzcelluláris transzport, lipidszortírozódás A kaveolák szerepe a jelátvitelben, szignáltranszdukcióban

4.4.

Az endoplazmatikus retikulum (NAGY PÉTER)

4.4.1.

Az eukarióta sejt legkiterjedtebb intracelluláris membránrendszere az endoplazmatikus retikulum A sima felszínû endoplazmatikus retikulum A durva felszínû endoplazmatikus retikulum szerepe a fehérjeszintézisben A riboszómák a szignálszekvencia segítségével kötôdnek az endoplazmatikus retikulum felszínéhez A fehérjék poszttranszlációs modifikációjának fontos lépése a glikoziláció A glikoziláció jelentôsége A fehérjék az endoplazmatikus retikulumban veszik fel háromdimenziós szerkezetüket A membránfehérjék egy csoportja glikozil-foszfatidil-inozitol-csoporttal kötôdik a membránhoz

4.4.2. 4.4.3. 4.4.3.1. 4.4.3.2. 4.4.3.3. 4.4.3.4. 4.4.3.5.

4.5.

A Golgi-apparátus (NAGY PÉTER)

4.5.1. 4.5.2. 4.5.3. 4.5.4. 4.5.5.

A Golgi-apparátus felépítése A Golgi-apparátusban a fehérjék glikozilálódnak Fehérjék továbbítása a Golgi-apparátuson belül A Golgi-apparátus cisz- és transz-hálózatának szerepe a vezikuláris transzportfolyamatokban A dinamikus Golgi-apparátus

4.6.

Lizoszómák (NAGY PÉTER)

4.6.1. 4.6.2. 4.6.3. 4.6.4.

A lizoszómák bontóenzimeket tartalmazó savas pH-jú intracelluláris vezikulumok Hogyan jutnak a lebontandó anyagok a lizoszómákba? Hogyan jutnak a lebontást végzô savas hidrolázok a lizoszómákba? Tárolási betegségek

4.7.

Peroxiszómák (NAGY PÉTER)

17


18

RÉSZLETES TARTALOM

4.7.1. 4.7.2. 4.7.3.

A peroxiszómák oxidatív bontófolyamatok helyszínei A peroxiszómák eredete A peroxiszomális fehérjék szintézise

4.8.

Fehérjék szelektív célba juttatása. Vezikulaszortírozás (NAGY PÉTER)

4.8.1. 4.8.2. 4.8.3.

A nukleáris DNS által kódolt fehérjék szintézist követô transzportja A szignálszekvenciák általános jelentôsége Bizonyos sejtek plazmamembránja eltérô lipid- és fehérje-összetételû doméneket tartalmaz

4.9.

A sejtmûködés energiaforrása: mitokondrium, kloroplasztisz (SZÖLLÔSI JÁNOS)

4.9.1. 4.9.1.1. 4.9.1.2. 4.9.1.3. 4.9.1.4. 4.9.1.5. 4.9.2. 4.9.2.1. 4.9.2.2.

Mitokondrium Az ATP elôállítása aerob sejtekben A mitokondrium szerkezete Kemiozmózis ATP-szintézis A mitokondrium biogenézise Kloroplasztisz és fotoszintézis A kloroplasztisz szerkezete A fotoszintézis reakciói

4.10.

Diffúziós viszonyok a sejtben (BACSÓ ZSOLT)

4.10.1. 4.10.1.1. 4.10.1.2. 4.10.2. 4.10.3. 4.10.4. 4.10.4.1. 4.10.4.2. 4.10.4.3. 4.10.5.

Az intracelluláris diffúzió jelentôsége A citoplazmában zajló, diffúziófüggô események A citoplazmatikus szabad diffúziót befolyásoló tényezôk Ionok, kis méretû molekulák diffúziója a citoplazmában Makromolekulák diffúziója a citoplazmában Sejtorganellumokon belüli szabad diffúzió Mitokondriumok Endoplazmatikus retikulum Sejtmag Intracelluláris diffúzió mérési lehetôségei: FRAP, FCS

5.

Citoszkeleton: struktúrák és funkciók

5.1.

A mikrotubulus, a mikrofilament és az intermedier filament rendszer (MÁTYUS LÁSZLÓ)

5.1.1.

Mikrotubulusok


RÉSZLETES TARTALOM

5.1.2. 5.1.2.1. 5.1.3. 5.1.3.1.

Mikrofilamentumok Mikrofilament-asszociált/aktinkötô fehérjék Intermedier filamentumok Intermedier filamentum alosztályok

5.2.

A sejtközpont (KOVÁCS JÁNOS)

5.2.1. 5.2.2.

A sejtközpont szerkezete és funkciói A centroszómák viselkedése az ivarsejtek kialakulása és a fertilizáció során

5.3.

Csillók, ostorok (KOVÁCS JÁNOS)

5.3.1.

A csillók és ostorok szerkezete, funkciói és keletkezése

5.4.

Molekuláris motorok - a sejtváz motorfehérjéi (KOVÁCS JÁNOS)

5.4.1. 5.4.2. 5.4.2.1. 5.4.2.2.

Az aktinvázhoz kapcsolódó motorfehérjék: a miozinok A mikrotubulusokhoz kapcsolódó motorfehérjék A kinezinek A dineinek

5.5.

Sejtmotilitás, kemotaxis (TIMÁR JÓZSEF és PAKU SÁNDOR)

5.5.1. 5.5.1.1. 5.5.1.1.1. 5.5.1.1.2. 5.5.1.2.1.1. 5.5.1.2.1.2. 5.5.1.2. 5.5.2. 5.5.3. 5.5.4. 5.5.4.1. 5.5.4.2. 5.5.4.3. 5.5.4.4. 5.5.4.5.

A sejtek vándorlásának szabályozása Parakrin mechanizmusok Aspecifikus parakrin mechanizmusok Specifikus parakrin mechanizmusok Kemokinek és kemokin receptorok. Motogén citokinek és receptoraik Autokrin szabályozás: az autokrin citokinek és receptoraik A sejtek mozgásának mechanikája és biokémiai mechanizmusa A sejtek mozgása és az extracelluláris matrix: integrinek, invadopódia és proteázok Az egyes sejttípusok mozgásának sajátosságai Leukociták Limfoid sejtek Fibroblasztok és hámsejtek: regeneráció Endotélsejtek, angiogenezis Daganatsejtek, tumoros progresszió

19


20

RÉSZLETES TARTALOM

6.

Sejtmag

6.1.

A sejtmag felépítése és funkciói (SZABÓ GÁBOR)

6.1.1. 6.1.2. 6.1.2.1. 6.1.2.2. 6.1.2.3. 6.1.2.4. 6.1.2.5. 6.1.2.6. 6.1.2.7. 6.1.2.8. 6.1.3. 6.1.3.1. 6.1.3.2. 6.1.4.

Magmátrix A kromatin A kromatin szerkezeti hierarchiája Eukromatin, heterokromatin Az interfázisos kromoszómák térbeli elhelyezkedése A „rendfenntartás” eszközei A metafázisos kromoszóma szerkezete Az interfázisos kromatin és a metafázis-kromoszóma szerkezete közötti összefüggés Kromatinszerkezet és génkifejezôdés Kromatinszerkezet és replikáció Intranukleáris szuborganellumok Csavarulatos test, PML-test, speckle A sejtmagvacska Maghártya

6.2.

A nukleocitoplazmatikus makromolekula transzport (UDVARDY ANDOR)

6.2.1. 6.2.2. 6.2.3. 6.2.4.

A nukleocitoplazmatikus transzport jelentôsége A citoplazma és a sejtmag közötti fehérjetranszport mechanizmusa RNS-ek exportja A nukleocitoplazmatikus transzport szabályozása

6.3. 6.3.1. 6.3.2. 6.3.3. 6.3.4. 6.3.4.1. 6.3.4.2. 6.3.5. 6.3.6. 6.3.6.1.

Kromatinszerkezet és a génexpresszió szabályozása: molekuláris biológiai mechanizmusok sejtbiológiai kontextusban (UDVARDY ANDOR) A kromatin elemi szerkezeti egysége a nukleoszóma A nukleoszómák elrendezôdése a DNS mentén Magasabb rendû kromatinstruktúrák A transzkripcionálisan aktív kromatin szerkezete DNáz I hiperszenzitív kromatinstruktúrák Hisztonacetiláció szerepe a transzkripcionálisan aktív kromatinszerkezet kialakításában Represszív kromatinkomplexek A kromatinszerkezet szerepe a génexpresszió szabályozásában A magasabb rendû kromatinstruktúra szerepe a génexpresszió szabályozásában

6.4.

A maghártya permeabilitási viszonyai (DAMJANOVICH SÁNDOR)

6.4.1.

A maghártya átjárhatósága makromolekulák és ionok számára: passzív transzportfolyamatok


RÉSZLETES TARTALOM

6.4.2. 6.4.3.

Aktív transzportfolyamatok: energetikai megfontolások Szabályozott ionáramlás a magmembránon keresztül: a kalcium-„puffok”

7.

Sejtosztódás

7.1.

Sejtciklus (SZABÓ GÁBOR)

7.1.1. 7.1.2. 7.1.2.1. 7.1.2.2. 7.1.2.3. 7.1.3. 7.1.3.1. 7.1.3.2. 7.1.3.3. 7.1.3.4.

Alapfogalmak A sejtciklus vizsgálati lehetôségei Áramlási citometriás analízis Sejtek szinkronizálása Radioaktív nukleozidanalóg inkorporáció A sejtciklus-szabályozás alapvetô vonásai A szabályozás fôszereplôi Belépés a ciklusba A ciklus elhagyása A szabályozás ellenôrei

7.2.

A mitózis fázisai (SZEBERÉNYI JÓZSEF)

7.2.1. 7.2.2. 7.2.3. 7.2.3.1. 7.2.3.2. 7.2.3.3. 7.2.3.4. 7.2.3.5. 7.2.3.6.

A sejtciklus: interfázis és M-fázis A centroszóma ciklus Az M-fázis eseményei Profázis Prometafázis Metafázis Anafázis Telofázis Citokinézis

7.3.

A sejtosztódás mechanikája (SZEBERÉNYI JÓZSEF)

7.3.1. 7.3.2. 7.3.2.1. 7.3.2.2. 7.3.3. 7.3.4. 7.3.5. 7.3.6.

A mitotikus apparátusban fellépô mozgások típusai A centroszóma megkettôzôdése Az utód centroszómák felkészülése a szétválásra A centroszómák szétválása A metafázikus lemez kialakulása Kromatidvándorlás az anafázis A-ban Az osztódási orsó megnyúlása az anafázis B-ben Az osztódási orsó eltûnése

7.4.

A meiózis (SIPICZKI MÁTYÁS)

21


22

RÉSZLETES TARTALOM

7.4.1. 7.4.2. 7.4.2.1. 7.4.2.2. 7.4.3. 7.4.4. 7.4.5. 7.4.6.

Az ivaros szaporodás haploid és diploid nemzedékek váltakozására épül A meiózis a sejtosztódás speciális formája A meiózis I A meiózis II A nôi szervezetben a meiózis szakaszokban megy végbe A citoplazma aszimmetrikusan osztódik a petesejt képzése során Az MPF kulcsszerepet játszik a meiózis szabályozásában Az anyai és apai eredetû kromoszómák megoszlása a meiózis során

7.5.

Gametogenezis, fertilizáció (KRASZNAI ZOLTÁN)

7.5.1. 7.5.1.1. 7.5.1.2. 7.5.1.2.1. 7.5.1.2.2. 7.5.2. 7.5.2.1. 7.5.2.2. 7.5.2.3. 7.5.3.

Gametogenezis Spermatogenezis Oogenezis Az oogenezis fázisai A zona pellucida kialakulása és szerkezete Szaporodás, fertilizáció Az ovuláció A spermiumok útja a hüvelybôl a petevezetôig A termékenyítés folyamata A meiozis II befejezôdése

7.6.

A sejtciklus szabályozása: biokémiai mechanizmusok sejtbiológiai kontextusban (UDVARDY ANDOR)

7.6.1. 7.6.2. 7.6.3. 7.6.4. 7.6.4.1. 7.6.4.2. 7.6.4.3. 7.6.4.4. 7.6.4.5. 7.6.5.

A sejtciklus szabályozásának általános elve A ciklinfüggô kinázok általános tulajdonságai Szabályozott intracelluláris fehérjebontás A sejtciklus szabályozása Saccharomyces cerevisiae-ben G1-fázis S-fázis G2-fázis M-fázis A sejtciklus ellenôrzési pontjai Sejtciklus-szabályozás magasabb rendû eukariótákban

8.

A változó sejt

8.1.

A sejt tulajdonságainak megváltozása külsô jelek hatására: jelátviteli folyamatok (VEREB GYÖRGY)

8.1.1.

A sejtek közötti jelátvitel szakaszai


RÉSZLETES TARTALOM

8.1.2. 8.1.3. 8.1.4. 8.1.5. 8.1.5.1. 8.1.5.1.1. 8.1.5.1.2. 8.1.5.1.3. 8.1.5.2.

8.1.6.3. 8.1.6.4. 8.1.7. 8.1.8. 8.1.9.

A jelmolekulák útja változó hosszúságú lehet A jelátvitel specificitásának alapja. A receptor-ligand kölcsönhatás. Az intracelluláris receptorok A sejtfelszíni receptorok fô kategóriái G-proteinhez kapcsolt receptorok 7 transzmembrán doménnel A cAMP mint másodlagos hírvivô Gátló és serkentô G-proteinek G-proteinek serkentése és gátlása A Gsα- és a Ras fehérje az intracelluláris kapcsoló fehérjék GTP-áz szupercsaládjába tartoznak Tirozinkináz aktivitással bíró receptorok A sejtmagba vezetô jelátvételi utak Az aktivált Ras jele egy kináz kaszkádon át a sejtmagba jut A citokinreceptorokhoz kapcsolt JAK kinázok közvetlenül aktiválják a transzkripciós faktorokat A G-fehérjék is indukálhatnak génátírást Élet és halál jelei A kalcium és a foszfatidil-inozitol rendszer, mint másodlagos hírvivô A membránreceptorok szabályozása Onkogének és a jelátviteli folyamatok

8.2.

Jelátviteli jelenségek idegsejteken (PÁRDUCZ ÁRPÁD)

8.2.1. 8.2.2. 8.2.3.

Elektromos szinapszis Kémiai szinapszis Egy nem hagyományos neurotranszmitter: a nitrogén-oxid (NO).

8.3.

Jelátvitel fotoreceptorsejtekben (fototranszdukció) (RÖHLICH PÁL)

8.3.1. 8.3.2. 8.3.3. 8.3.4. 8.3.5. 8.3.6. 8.3.7. 8.3.8.

A gerincesek retinális fotoreceptorsejtjének szerkezete Pálcikák és csapok A fotoreceptor-molekula A sötétáram és a cGMP-függô kationcsatorna Jelátvitel a fotopigmenttôl a kationcsatornáig A fototranszdukciós lánc visszatérése a nyugalmi állapotba (relaxáció) Jelerôsítés és adaptáció Nagy fényerôhöz való alkalmazkodás, a kalcium szerepe

8.4.

Napi ritmusok: az idô mint jel (KOZMA-BOGNÁR LÁSZLÓ és NAGY FERENC)

8.4.1. 8.4.2.

A biológiai ritmusokról A cirkadián ritmusok jellemzôi, kritériumai

8.1.5.3. 8.1.6. 8.1.6.1. 8.1.6.2.

23


24

RÉSZLETES TARTALOM

8.4.2.1. 8.4.2.2. 8.4.3. 8.4.4. 8.4.4.1. 8.4.4.2. 8.4.4.3.

A cirkadián ritmusok fenntartói a cirkadián órák A cirkadián órák általános felépítése, az óra elemei, definíciók A cirkadián óra szerkezete és mûködése prokariótákban (Synechococcus fajok) A cirkadián óra szerkezete és mûködése eukarióta modellszervezetekben Gombák: a Neurospora crassa FRQ/WC-1,2 rendszere Ecetmuslica: a TIM/PER rendszer Egér: hasonlóságok és különbségek a muslica TIM/PER rendszerhez képest

9.

Sejt és környezete

9.1.

Az extracelluláris mátrix (MÓDIS LÁSZLÓ)

9.1.1. 9.1.2. 9.1.2.1. 9.1.2.2. 9.1.2.3. 9.1.2.4. 9.1.3.

Az extracelluláris mátrix definíciója, szerepe, jelentôsége Az ECM fôbb komponensei Kollagének Elasztin Glukózaminoglikánok és proteoglikánok Glikoproteidek ECM-sejt kölcsönhatások

9.2.

Multicelluláris szervezôdés: sejtek közötti és sejt-mátrix kapcsolatok (SZÖLLÔSI JÁNOS)

9.2.1. 9.2.2. 9.2.3. 9.2.3.1. 9.2.3.2.

A sejtek közötti és a sejt-extracelluláris mátrix kapcsolatok szerepe, jelentôsége Sejt-mátrix kapcsolatok. Multiadhéziós fehérjék és receptoraik Sejt-sejt adhézió Adhéziós fehérjék Sejtkapcsolatok (junkciók)

9.3.

Sejt-vírus interakciók sejtbiológia vonatkozásai. (DUDA ERNÔ)

9.3.1. 9.3.2. 9.3.3. 9.3.4.

A vírusok mint a sejtbiológiai kutatás eszközei A vírusok bejutása a sejtbe Sejtpusztító és sejtkímélô vírusok A vírusok hatása a sejtek differenciálódási folyamataira

9.4.

Sejt-baktérium interakciók (MICZÁK ANDRÁS)

9.4.1. 9.4.2. 9.4.3. 9.4.4. 9.5.

A baktériumok bejutása A baktériumok túlélési stratégiái A gazdasejtek apoptózisára gyakorolt hatás Egyéb kölcsönhatások Sejt-sejt kommunikáció és jelátvitel összefüggései immunsejtekben (FALUS ANDRÁS)


RÉSZLETES TARTALOM

9.5.1. 9.5.2. 9.5.3. 9.5.3.1. 9.5.3.2. 9.5.4. 9.5.4.1. 9.5.4.1.1. 9.5.4.1.2. 9.5.4.1.3. 9.5.4.1.4. 9.5.4.2. 9.5.4.3. 9.5.4.3.1. 9.5.4.4.

Mire jó az immunválasz? Milyennek kell lennie a jól mûködô immunrendszernek? Kihívások és válaszok Mit ismer fel az immunrendszer? Antigének Antigénfelismerés A limfocitaaktiváció sémája Antigénreceptorok felépítése és felismerési mintázata B-sejt-receptor- (BCR-) komplex T-sejt-receptor-komplex Az „immunológiai szinapszis” Az intracelluláris jelátvitel sémája BCR és TCR komplexeken át Kostimulációs kölcsönhatások Citokinek és citokinreceptorok kölcsönhatása Citokinek által kiváltott jelátviteli folyamatok A „kimenô” jel

10.

Sejtsorsok és sorsfordulók

10.1.

Sejtsorsok (SZABÓ GÁBOR)

10.1.1. 10.1.2. 10.1.3. 10.1.4. 10.1.5.

Sejtsorsok in vivo és in vitro Differenciáció Proliferáció Sejtöregedés és immortalitás Sejthalál

10.2.

Sejtsorsok és differenciálódás (DUDA ERNÔ)

10.2.1. 10.2.2. 10.2.2.1. 10.2.2.2. 10.2.2.3. 10.2.3. 10.2.4. 10.2.5. 10.2.6. 10.3. 10.3.1. 10.3.2. 10.3.3. 10.3.4.

Sorsdöntô lépések A sejtdifferenciálódás molekuláris fôszereplôi Növekedési és differenciálódási faktorok és receptoraik Transzkripciós faktorok A sejt környezetének molekuláris tényezôi Sejtdifferenciálódás mesterséges körülmények között A differenciálódási folyamat egyirányúsága A differenciálódás ritkán a genom változásaival jár együtt. A differenciálódás zsákutcái és a daganatok keletkezése Differenciálódás és szöveti regeneráció: A vérképzô sejtek (PÁLÓCZI KATALIN) A vérképzô rendszer kialakulása - vérképzés az embrionális és felnôtt szervezetben A vörösvértest-regeneráció A fehérvérsejtrendszer regenerációja A thrombocitaregeneráció

25


26

RÉSZLETES TARTALOM

10.3.5.

A hemopoetikus regeneráció modellje: a csontvelô-átültetés

10.4.

Mikroorganizmusok differenciálódási jelenségei: bacillusok spórázása (VITÁLIS SÁNDOR)

10.4.1. 10.4.2. 10.4.3. 10.4.3.1. 10.4.3.2. 10.4.3.3. 10.4.3.4.

A sporuláció folyamata Csírázás A sporuláció szabályozása Sporulációs σ-faktorok A transzkripció modulációja Az idôbeli szabályozás legfontosabb jellemzôi Az alakzatok térbeli formálódásának szabályozása

11.

A multicelluláris szervezôdés fejlôdésbiológiai vonatkozásai (SASS MIKLÓS)

11.1.

Az egyedfejlôdés szabályozásának legfontosabb mozzanatai

11.1.1. 11.1.1.1. 11.1.1.2. 11.1.2. 11.1.2.1. 11.1.2.2. 11.1.2.3. 11.1.2.3.1. 11.1.2.3.2. 11.1.2.3.3. 11.1.2.3.4. 11.1.2.4. 11.1.2.4.1. 11.1.2.4.2. 11.1.2.4.3. 11.1.2.5. 11.1.2.5.1. 11.1.2.5.2. 11.1.3. 11.1.3.1. 11.1.4.

A petesejtek fejlôdésének elméletei A mozaikos petesejtek fejlôdése A regulatív petesejtek fejlôdése A Xenopus laevis fejlôdésének szabályozása A fejlôdést meghatározó üzenetek a petesejt felépítésében A test hossztengelyének determinációja A mezoderma kialakulása kétéltûembrióban Az embrionális indukció mechanizmusa Specifikus mRNS-ek a vegetatív térfélben A mezoderma térbeli mintázatát kialakító indukciós hatások A morfogének és hatásmechanizmusuk A gasztruláció folyamata A szürke félhold szerepe a gasztruláció során Sejtátrendezôdések a gasztruláció ideje alatt A gasztruláció szabályozásában szerepet játszó gének A központi idegrendszer fejlôdése A neuruláció szabályozásának klasszikus modellje A velôcsô érzô- és mozgatóterületeinek kialakulása A sejtöröklôdés fogalma Az embrionális determináció A Drosophila melanogaster mutánsok tanulmányozásának lehetôsége és jelentôsége az embriológiában Az ugráló gének (mozgó genetikai elemek) és kísérleti felhasználásuk A petesejt elülsô pólusának (feji részének) determinációja A hátulsó pólus meghatározottsága

11.1.4.1. 11.1.4.2. 11.1.4.3.


RÉSZLETES TARTALOM

11.1.4.4. 11.1.4.5.

A dorzoventrális testtengely kialakulása A dorzoventrális testtengely mentén aktiválódó gének hatása a csíralemezek kialakulására 11.1.4.6. Az anyai hatású gének és a zigotikus gének fogalma 11.1.4.6.1. A homonom szelvényezettség kialakulásának szabályozása, a fejlôdést irányító gének hierarchiája 11.1.4.6.2. A heteronom szelvényezettség létrejöttének molekuláris mechanizmusa 11.1.4.6.2.1. A HOM-komplex tagjainak elôfordulása és szerepe az emlôsök és az ember egyedfejlôdésében 11.2.

A programozott sejthalál fejlodésbiológiai vonatkozásai

11.2.1. 11.2.1.1. 11.2.1.2. 11.2.1.2.1. 11.2.2. 11.2.2.1. 11.2.2.2. 11.2.2.3. 11.2.2.3.1. 11.2.2.3.2.

A sejtpusztulás két fô, jól megkülönböztethetô formája Nekrózis Programozott sejthalál A programozott sejthalálnak két fô sejttani mechanizmusát ismerjük A programozott sejtpusztulás szerepe az ontogenezis során Gerinctelen állatok A programozott sejthalál és szabályozása rovarokban Sejtpusztulás a gerincesek fejlôdése során A végtagfejlôdés Sejtpusztulás az idegrendszer kialakulása során

11.3.

Sejtadhéziós mechanizmusok szerepe az egyedfejlôdés szabályozásában.

11.3.1. 11.3.1.1. 11.3.1.2. 11.3.2. 11.3.2.1. 11.3.2.2. 11.3.2.3. 11.3.2.4. 11.3.3. 11.3.4.

A soksejtûség kialakulásának feltételei A differenciális génaktiválódás A soksejtûség kialakulásának egyéb feltételei A sejtadhéziós molekulák szerepe a multicellularitás kialakulásában A barázdálódás kezdetén sejtadhézió nem figyelhetô meg Az elsô sejtkapcsoló fehérjék megjelenése a barazdálódás idején A tight junction és a gap junction megjelenése és funkciója a blasztula állapotban A sejtadhéziós molekulák funkciója a gasztruláció során A sejtátrendezôdés mechanizmusai A sejtadhéziós molekulák szerepe a csíralemezek kialakulásában és sejtátrendezôdésekben Kísérleti eredmények in vitro rendszerekben A sejtadhéziós molekulák szövetspecifikus megoszlása az embrionális szervezetben A kalciumtól független sejtadhéziós molekulák szerepe az egyedfejlôdésben Az N-CAM hatása in vitro kísérleti rendszerekben Az egyedfejlôdés zavarai CAM hiányos mutánsokban Az integrinek funkciója az embriogenesisben

11.3.4.1. 11.3.4.2. 11.3.4.3. 11.3.4.4. 11.3.4.5. 11.3.4.6.

27


28

RÉSZLETES TARTALOM

11.3.5. 11.3.5.1. 11.3.5.2. 11.3.5.3. 11.3.5.4.

A sejtvándorlások és szabályozásuk az egyedfejlôdési folyamatokban A sejtvándorlás nyomon követése a végtagbimbó fejlôdése alatt A velôsánc sejtjeinek útja és megtapadása a szervezet különbözô helyein A sejtvándorlás néhány megoldatlan kérdése A sejtvándorlás mechanizmusát magyarázó hipotézisek

12.

Az élôvilág kialakulása, evolúció. Prokarióták és eukarióták (SZATHMÁRY EÖRS)

12.1. 12.1.1. 12.1.2. 12.1.3. 12.1.4. 12.1.5. 12.1.6. 12.2. 12.2.1. 12.2.2. 12.2.3. 12.2.4.

A nagyléptékû evolúciós kép átalakulása A kis rRNS klasszikus törzsfája A molekuláris törzsfák szerkesztése A törzsfa „gyökereztetése” paralóg génekkel A laterális géntranszfer (LGT) zavaró hatása Inszerciók és deléciók a filogenetika szolgálatában Az utolsó közös ôs Az eukarióta sejt eredete A sejtmag és a mitokondriumok eredete A fagocitózis fontossága Genetikai membránok és az organelláris protein import Organelláris eredetû gének a magban: hasznosulás a citoszolban és az organellumban

13.

A növényi sejt sajátosságai (KERESZTES ÁRON)

13.1.

A növényi sejt litikus apparátusa

13.1.1. 13.1.2. 13.1.2.1. 13.1.2.2. 13.1.2.3. 13.1.2.4.

A vakuólum keletkezése A vakuólum funkciói Litikus funkció Raktározás Ozmoreguláció A fehérjetest és a lipidtest keletkezése és lebomlása

13.2.

A növényi sejtváz

13.2.1. 13.2.2. 13.3.

A mikrotubulusok elrendezôdése A mikrofilamentális rendszer és a sejten belüli mozgások A sejtfal

13.3.1. 13.3.2. 13.3.3. 13.3.4.

A sejtfal kialakulása a sejtosztódás során A sejtfal fô komponensei A sejtfal növekedése A sejtfal, mint kémiai szignálok forrása


RÉSZLETES TARTALOM

13.3.5. 13.3.6. 13.3.6.1. 13.3.6.2. 13.3.6.3.

Adhéziós molekulák Transzport-szabályozó sejtfal-sejtmembrán komplexek Hidrofób sejtfal-sejtmembrán komplex Sejtfal-protuberanciák Plazmodezmák

13.4.

A növényi sejtosztódás

14.

Sejtbiológia az orvostudományban

14.1.

Sejtbiológiai ismeretek haszna az orvosi gyakorlatban (SZEKANECZ ZOLTÁN)

14.1.1. 14.1.2. 14.1.3. 14.1.4. 14.1.5.

Rheumatoid arthritis: a gyulladás sejtjei és mediátorai Sejtadhézió, adhéziós molekulák A gyulladás mediátorai Angiogenezis Sejtes és molekuláris kölcsönhatások és ezek lehetséges terápiás befolyásolása

14.2.

Az érelmeszesedés sejtbiológiai mozzanatai (NAGY LÁSZLÓ)

14.2.1. 14.2.2. 14.2.3. 14.2.4. 14.2.5.

A korai érelmeszesedéses elváltozás (lézió) kialakulása A gyulladás szerepe Zsírral teli habos sejtek kialalkulása Fibrotikus plakk kialakulása Komplex elváltozás (lézió) és trombózis

15.

A sejtbiológia gyakorlata.

15.1.

Sejt- és szövettenyésztés: módszertani alapismeretek (MADARÁSZ EMILIA)

15.1.1. 15.1.2. 15.1.2.1. 15.1.2.2. 15.1.2.3. 15.1.2.3.1. 15.1.2.3.2. 15.1.3.

A sejt- és szövettenyészetek típusai Sejttenyészetek készítése Primer sejttenyészetek Sejtvonaltenyészetek indítása Felszíni sejttenyészetek A sejtek folyadékkörnyezete A sejtek „szilárd” környezete Sejtszámváltozás a sejttenyészetekben

15.2. 15.2.1. 15.2.1.1.

Sejtalkotók fluoreszcenciás jelölése és detektálása (VEREB GYÖRGY) Fehérjék és nukleinsavak jelölése specifikusan kötôdô molekulák segítségével Jelölés antitestek segítségével

29


30

RÉSZLETES TARTALOM

15.2.1.2. 15.2.1.3. 15.2.1.4. 15.2.1.5. 15.2.1.6. 15.2.1.7. 15.2.2. 15.2.3. 15.2.4. 15.2.5.

Jelölés toxinokkal és más bioaktív vegyületekkel Jelölés szubsztráttal és liganddal DNS-festékek Szekvenciaspecifikus nukleinsav-próbák Indirekt jelölési módszerek Egyéb, ex vivo jelölési módszerek A próbák eljuttatása a célmolekulákhoz Stratégia sejtalkotók jelölésére: PDGF-receptorok, F-aktin és a sejtmag egyidejû megfigyelése A fluoreszcenciás mikroszkópia néhány alkalmazása A feloldóképesség határai és azok átlépése

Rövidítésjegyzék Tárgymutató


1.

Bevezetés a sejtbiológiába RÖHLICH PÁL

1.1. 1.2. 1.3. 1.3.1. 1.3.1.1. 1.3.1.1.1. 1.3.1.1.2. 1.3.1.1.3. 1.3.1.1.4. 1.3.1.2.

A sejtbiológia kialakulása Nagyságrendek Az élô szervezetek alapvetô kategóriái: pro- és eukarióta sejtek A prokarióták és eukarióták legfontosabb tulajdonságai A prokarióta sejt szerkezete Sejtburok Sejtmembrán Citoplazma Nukleoid. A bakteriális DNS Az eukarióta sejt szerkezete

1.1. A sejtbiológia kialakulása A sejt méreténél fogva szabad szemmel nem látható, ezért felfedezése, valamint a sejtelmélet kialakulása szoros kapcsolatban volt az optikai lencsék és azok kombinációjából kialakított mikroszkópok fejlôdésével. A sejt elnevezés a XVII. sz.-ra nyúlik vissza, amikor Robert Hooke elhalt növényi szövetet (parafát) vizsgálva abban kis kamrácskákat figyelt meg. Ma már tudjuk, hogy ezek a kis üregek (latinul cella, kicsinyítve cellula, görögül kytos vagy cyta) a növényi sejteket körülvevô cellulózfal által képzett kamrácskák, ô tehát nem a valódi sejteket, hanem azok helyét látta. Még abban az évszázadban Antony van Leewenhoek (ejtsd: Lôvenhuk) az általa szerkesztett egyszerû mikroszkóp segítségével valódi, szabad sejteket (pl. magvas vörösvértesteket, egysejtûeket, spermiumokat) is meg tudott figyelni. Ezek a megfigyelések abban az idôben kuriózumok vol-

1.3.1.2.1. 1.3.1.2.2. 1.3.1.2.3. 1.3.1.2.4. 1.3.1.2.5. 1.3.1.2.6. 1.3.1.2.7. 1.3.1.2.8. 1.3.1.2.9. 1.3.1.3. 1.3.1.4. 1.3.2.

Sejtmembrán Sejtmag Riboszómák Endoplazmatikus retikulum Golgi-apparátus Lizoszóma Peroxiszóma Mitokondrium Sejtváz (citoszkeleton) A növényi sejt specifikumai Az egysejtû eukarióták specifikumai Az élet peremén

tak, néhány kiváncsi ember kedvtelésének számítottak, és az idô még nem érett meg arra, hogy az élet mibenlétérôl döntô kérdéseket tegyenek fel. Az a felismerés, hogy mind a növényi, mind az állati szervezetek sejtekbôl és azok termékeibôl épülnek fel, a XIX. sz. elsô feléig váratott magára. A sejtelmélet végleges formájában a botanikus Matthias Schleiden és a zoológus Theodor Schwann nevéhez fûzôdik (1838 és 1839). Bár kezdetben még sokan gondolták úgy, hogy sejtek spontán módon, pocsolyákban, szerves anyagok bomlásából is kialakulhatnak, a XIX. sz. közepére nyilvánvalóvá vált, hogy új sejtek csak már meglévô sejt osztódásából keletkeznek („omnis cellula e cellula”, Rudolf Virchow, 1855). Élesszemû kutatók az egyre tökéletesedô mikroszkópokkal és preparációs eljárásokkal a XIX. sz. végéig a sejtek egyre több komponensét fedezték fel, a sejtmagot, a magvacskát, a mitózis során kialakuló kromoszómákat, a centriolumot, a mitokondriumo-


32

BEVEZETÉS A SEJTBIOLÓGIÁBA

kat és a Golgi-apparátust. Louis Pasteur és Robert Koch munkássága nyomán fény derült arra is, hogy számos fertôzô betegség, elhalt szervezetek lebomlásának hátterében „csírák”, a mikroszkópban még éppen látható baktériumok állnak, és ezzel a prokarióta sejtet is felfedezték. Kiderült, hogy a petesejt és a spermium egyesülésébôl keletkezô új egyed sejtek osztódásából és specializálódásából fejlôdik ki, továbbá, hogy a szervezet kóros mûködése is sejtek hibás mûködésére vezethetô vissza. Egyre nyilvánvalóbbá vált, hogy a legtöbb biológiai probléma hátterében sejtes folyamatok állnak, és az élet alapvetô jelenségeit magának a sejtnek a megismerésével érthetjük meg. Az így létrejövô tudomány, a sejttan vagy citológia a XX. sz. elején még nagyrészt elölt és megfestett sejtek, szövetek morfológiai megfigyeléseire alapozódott. Fokozatosan nôtt azonban az érdeklôdés az élô sejtek megfigyelése iránt, ami nemcsak szabadon élô egysejtûek tanulmányozásával vált lehetôvé, hanem azáltal is, hogy soksejtû szervezetek szöveteibôl a sejteket sikerült kiszabadítani és az életfeltételek biztosításával üvegben (in vitro) akár hetekig, hónapokig életben tartani (sejttenyésztés). Élô sejtek megfigyelése vezetett a különbözô mozgástípusok, így a növényi sejtekben található körkörös citoplazmaáramlás (ciklózis), az amöboid mozgás, a csillós és ostoros mozgás és az izom-összehúzódás alapos megismerésére. Lényeges metodikai elôrelépést jelentett, amikor a fáziskontraszt-mikroszkóp bevezetésével az élô sejtek körvonalai, belsô szerkezete a nagyobb optikai kontraszt következtében jobban elôtûntek. Ez egyben igazolta, hogy az addig leírt sejtkomponensek többsége nem preparációs mûtermék, hanem az élô sejtben valóságosan létezô struktúráknak felel meg. Az élô sejtekbe kísérletesen, „sebészileg” is sikerült beavatkozni (egyes sejtkomponenseket eltávolítani vagy átültetni) igen fínomra húzott üvegtûk segítségével, amelyeket precíziós mûszerekkel (mikromanipulátorokkal) a mikroszkóp ellenôrzése mellett mozgattak. A sejttudománynak a máig tartó forradalmi fejlôdése a XX. sz. ötvenes éveiben kezdôdött meg az elektronmikroszkópiának és a biokémiának a

citológiába való bevonulásával. Azáltal, hogy az elektronmikroszkóp feloldóképessége 2-3 nagyságrenddel jobb, mint a legjobb fénymikroszkópé, 100-1000-szeresen kisebb struktúrák váltak láthatóvá, és így feltárult a sejtek belsô szerkezetének bonyolult világa („szubmikroszkópos citológia”, „ultrastruktúra-kutatás”). Minthogy az elektronmikroszkópban az elektronoknak az áthatolóképessége csak igen vékony (30-100 nm) preparátumot tesz lehetôvé, ki kellett dolgozni azokat a módszereket, melyekkel ilyen vékony minták voltak készíthetôk. Az esetek többségében kémiailag fixált, mûgyantába ágyazott sejtekbôl készítenek igen vékony („ultravékony”) metszeteket különleges mikrotomok (ultramikrotomok) segítségével, de gyakran használtak feltárt sejtekbôl izolált sejtkomponenseket is. Teljesen új dimenziók nyíltak meg: feltárult a már ismert sejtorganellumok (mitokondriumok, centriolum, Golgi-apparátus, csillók, maghártya stb.) belsô, sokszor a makromolekuláris nagyságrendig terjedô szerkezete, de ezen túlmenôen egy sor egészen új sejtkomponenst fedeztek fel. Ilyenek: a riboszómák, az endoplazmatikus retikulum, a sejtváz egyes komponensei (mikrofilamentumok, intermedier filamentumok, mikrotubulusok), szállító vezikulák, szinaptikus vezikulák, mikrobolyhok, peroxiszómák, lizoszómák stb. De láthatókká váltak egyes makromolekuláris komplexek is, mint a DNS, ribonukleoprotein-részecskék, fehérje- és egyéb makromolekulák, melyek már átvezetnek a biokémia, molekuláris biológia világába. Míg az elektronmikroszkóp a sejt szerkezetét az egyre kisebb dimenziók, makromolekulák világába bontotta le, az egyre gyorsabban fejlôdô biokémia viszont az egyedi szerves molekulák felôl építkezett az egyre komplexebb makromolekuláris dimenziók, kölcsönhatások felé. A biokémia és a sejttan kapcsolata akkor vált szorosabbá, mikor az egyes sejtkomponensek molekuláris szerkezetét, az azokban zajló kémiai folyamatokat kívánták megvizsgálni. Ehhez arra volt szükség, hogy egyes sejtkomponenseket minél nagyobb tisztaságban és mennyiségben sikerüljön élô sejtek tömegébôl kinyerni. Ez a cél a sejtek mechanikai feltárása, majd az egyes komponenseknek az


NAGYSÁGRENDEK

ultracentrifugában való ülepedési sebessége, ill. anyagsûrûsége révén való elválasztásával vált lehetôvé. Jellegzetes példája ennek az irányzatnak az a felismerés, hogy a sejtes légzés a mitokondriumokhoz kötôdik, és hogy a mitokondriumnak a belsô membránja ebben kulcsszerepet játszik. Ugyancsak átütô eredményt hoztak a membránok molekuláris szerkezetére és funkcióira vonatkozó vizsgálatok. Az igazi forradalmi fejlôdést azonban a molekuláris biológia kialakulása és ennek a sejttannal való ötvözôdése jelentette. Bár a XX. sz. huszas-harmincas éveiben már ismert volt, hogy a sejtmag DNS-t tartalmaz, a DNS kettôs hélix szerkezete és a nukleotid-triplet kódoló szerepe a XX. sz. közepén derült ki. Innen rohamosan vezetett az út a génkifejezôdés sejttani vonatkozásainak, a kromatin molekuláris szerkezetének, a gének szabályozásának, az egyes géneknek a sejt mûködésében betöltött szerepének a megismeréséhez. Már az ötvenes évek végén nyilvánvalóvá vált, hogy a sejtekkel foglalkozó tudomány nem maradhat a klasszikus sejttan keretei között, hanem integrálnia kell mindazokat az alapvetô ismereteket, amelyeket egyéb alaptudományok (biokémia, molekuláris biológia, biofizika, genetika, mikrobiológia, fejlôdéstan, élettan stb.) a sejtre vonatkozólag szolgáltatnak. Az így létrejött integratív, szintetizáló tudomány sokkal átfogóbb és sokoldalúbb a sejttannál, és ezért megkülönböztetésül a sejtbiológia elnevezést kapta.

1.2. Nagyságrendek A sejtek és azok belsô szerkezete a fény- és elektronmikroszkópok segítségével tehetôk láthatóvá. A laikus számára szokatlan dimenziókban való eligazodás nem könnyû, és némi tapasztalatot igényel, ezt kívánja az 1/1. ábrán látható nagyságrendi skála megkönnyíteni. A leggyakrabban használt mértékegységek a mikrometer (µm) és a nanometer (nm), ahol a µm a millimeter ezredrésze (10-3 mm) és a nm a µm ezredrésze (10-3 µm, ill. 10-6 mm). Idônként használják még

szabad szem 1 cm FM EM 1 mm 100 mm 10 mm

szöveti struktúrák átlagos sejt (10–20 mm) vörösvértest (7,5 mm)

1 mm 100 nm

kromoszómák (1–5 mm) baktériumok (0,1–1 mm) vírusok (10–100 nm)

10 nm

riboszómák (23–25 nm) globuláris fehérjék (2–15 nm

1 nm 1Å

aminosavak (0,33 nm) +

proton (H )

1/1. ábra. Nagyságrendi skála. A függôleges nyilak a szabad szemmel, fénymikroszkóppal (FM) és az elektronmikroszkóppal (EM) látható struktúrák nagyságterjedelmét mutatják.

az elektronmikroszkópiában korábban bevezetett mértékegységet, az angströmöt (Å), mely a nm tizedrésze (10-1 nm). Az atomáris és molekuláris dimenzióktól a sejtes nagyságrendig haladva a következô fôbb irányértékeket lehet megadni. A H-atom átmérôje 0,1 nm, az aminosavaké, cukormolekuláké 0,3 nm, a nukleotidoké 0,5 nm, a legtöbb fehérje nagysága 2 és 15 nm között mozog, a DNSmolekula vastagsága 2 nm körül van, a vírusok átmérôje 10 és 100 nm között van, a riboszómák nagysága 25 nm, a baktériumok, mitokondriumok 0,1-1 µm, a sejtmag átlagos átmérôje 5 µm körül van, a legtöbb eukarióta sejt nagysága 6 és 50 µm közé esik. Az emberi vörösvértest átlagos átmérôje 7,5 µm, az emberi spermiumfejé 6 µm, a legnagyobb emberi sejt a petesejt (150 µm), de a madaraké (madártojás) 50 mm vagy annál nagyobb is lehet. Ugyancsak nagy sejtek találhatók az idegsejtek között, ahol pl. a gerincvelôi mozgatóneuron hossza az 1 métert is elérheti.

33


34


Tekintve, hogy a szabad szem feloldóképessége 0,3 mm, a fénymikroszkópé 0,2 µm, míg a legjobb elektronmikroszkópé 0,3 nm, a sejteket és a nagyobb sejtorganellumokat fénymikroszkóppal tehetjük láthatóvá, míg a kisebb organellumok, valamint a nagyobbak finomabb szerkezete és a makromolekuláris komplexek vizsgálatának megfelelô vizsgálóeszköze az elektronmikroszkóp. Mind a fény-, mind az elektronmikroszkóp különbözô változatait fejlesztették ki (pl. fluoreszcenciás, polarizációs, fáziskontraszt, interferenciakontraszt, lézer pásztázó konfokális stb. fénymikroszkópok, valamint a transzmissziós és pásztázó elektronmikroszkóp, ezeket l. a biofizika- és a szövettankönyvekben). A feloldóképesség nem feltétlenül jelenti, hogy minden ilyen nagyságrendû struktúra látható is a mikroszkópokban, a láthatóvá tételhez legtöbbször hozzátartoznak a vizsgálandó sejtet vagy sejtkomponenseket megôrzô, kontrasztjukat fokozó vagy ôket szelektíve kimutató speciális preparatív módszerek is.

1.3. Az élô szervezetek alapvetô kategóriái: pro- és eukariótasejtek 1.3.1. A prokarióták és eukarióták legfontosabb tulajdonságai A sejtek szervezôdési fokuk, bonyolultságuk szerint két alapvetô csoportra oszthatók (1/2-3. ábra). Az egyik ezek közül a prokarióta sejt, amely aránylag egyszerû felépítésû, kisméretû sejt (többnyire 0,1-1 µm), mégis rendelkezik mindazokkal az alapvetô struktúrákkal és mechanizmusokkal, amelyek az élethez nélkülözhetetlenek. Elnevezése onnan származik, hogy nem található benne igazi, maghártyával rendelkezô, a citoplazmától elkülönülô sejtmag, hanem csak a mag elôfutára (pro = elô, karyon = mag, gör.) egy DNS-t tartalmazó terület formájában (nukleoid). A maghár-

baktérium

1/2. ábra. A prokariota és eukariota sejt méretének összehasonlítása. Az elektronmikroszkópos felvételen baktériumokat fagocitált makrofág sejtet látunk (3200x, Röhlich P. felv.).

tya hiánya mellett számos más intracitoplazmatikus membrán, sejtorganellum is hiányzik az ilyen sejtbôl, ennek megfelelôen felépítése igen egyszerû. Az alapvetô molekuláris folyamatok a DNShez, a citoplazmához vagy a sejtmembránhoz kötötten zajlanak le. A prokarióta sejtek legfontosabb képviselôje a baktériumsejt. A sejtek másik nagy csoportját alkotják az eukarióták. Ezek a sejtek jóval nagyobbak (6-50 µm) és összetettebbek (1/4-5. ábra) a prokariótáknál, funkcióik is sokkal szerteágazóbbak, teljesítôképességük jóval magasabb szintû. Ez jóval több gént és ennek megfelelôen jóval nagyobb DNSállományt, genomot igényel, melynek elhelyezése és a sejtosztódás alkalmával való szétosztása igen nagy feladat elé állítja a sejtet. A megoldás: az igen hosszú DNS egyedi darabokra (kromoszómákra) való tagolása, a DNS összecsomagolása hisztonfehérjékhez való kötés által (kromatin) és mindennek a citoplazmától való elhatárolása maghártyával. Az eukarióta sejt tehát valódi sejtmagot tartalmaz (eu = valódi, karyon = mag, gör.). Az eukarióta sejt másik fontos jellegzetessége a kompartmentalizáció, ami membránokkal körülhatárolt belsô terek (kompartmentek), rekeszek megjelenését jelenti. A terek belsô tartalma kü-


AZ ÉLÔ SZERVEZETEK ALAPVETÔ KATEGÓRIÁI: PRO- ÉS EUKARIÓTASEJTEK

sejtmembrán

magvacska

maghártya

mitokondrium

peptidoglikán réteg komplex membrán külsô membrán mezoszóma

DNS

pílus

nyákburok

muraminburok (szakkulusz)

flagellum

1/3. ábra. Idealizált baktériumsejt vázlata a fontosabb sejtalkotók bemutatására. Az ábra bal felén Gram-pozitív baktérium burkát, jobb felén pedig Gram-negatív baktérium komplex membránját látjuk.

lönbözik a citoplazmától, összetételét az ôket határoló membrán fehérjekészlete határozza meg, aminek következtében a sejten belül bizonyos funkciók kis helyre koncentrálódva sokkal hatékonyabbak. Az intracelluláris membránok aránylag nagy felülete számos enzim és egyéb fontos fehérje elhelyezésére ad lehetôséget, amelyek a sejt fontos anyagcsere-folyamataiban játszanak szerepet. Különbözô feladatokra különbözô felépítésû kompartmentek jöttek létre, ezeket membránnal

sötét szemcse

1/4. ábra. Eukarióta sejt fénymikroszkópos képe. A fáziskontraszt-mikroszkópos felvételen üvegfelszínhez letapadt élô makrofág sejtet látunk, amelyben a sejtmag, maghártya, magvacska, mitokondriumok és különbözô nagyságú sötét szemcsék különböztethetôk meg (950x, Röhlich P. felv.).

határolt sejtorganellumoknak nevezzük (mitokondrium, kloroplasztisz, endoplazmatikus retikulum, Golgi-apparátus, lizoszóma, peroxiszóma, vakuólum stb.). A sejtnek a prokariótáéhoz viszonyított lényegesen nagyobb tömege miatt szükséges az alaktartás, ill. annak változtatása, amihez az eukarióta sejt egy fonalas elemekbôl álló belsô vázat fejlesztett ki (sejtváz vagy citoszkeleton). Eukarióta sejt minden olyan sejt, amely nem prokarióta, tehát idetartoznak a protozoonok, az algák, a gombák, a növényi és az állati sejtek. A pro- és eukarióta sejtek között az élôvilágban nem ismertek átmenetek, a kétféle sejttípus tehát az evolúció két elkülönülô fejlôdési irányát jelenti.

35


36


1/5. ábra. Idealizált eukarióta (állati) sejt vázlata a fontosabb sejtkomponensek bemutatására.

1.3.1.1. A prokarióta sejt szerkezete

1.3.1.1.1. Sejtburok

A legtöbb baktérium kisméretû sejt (0,1-1 µm), felépítése lényegében egy membránnal körülvett citoplazmatömegnek felel meg. Az utóbbiban különálló struktúrákként ismerjük fel az elektronmikroszkópban a fehérjeszintézisben fontos szerepet játszó riboszómákat és a sejt genomját (örökítô állományát) képezô DNS-t, többnyire a sejt központi részében (nukleoid). A baktériumsejtet határoló sejtmembrán felszínét különbözô szerkezetû burok borítja be, amely a sejt mechanikai stabilitását, ozmotikus erôkkel szembeni ellenállóképességét biztosítja. A baktériumsejt általános felépítését az 1/3. ábra mutatja be. Az egyes komponenseket kívülrôl befelé haladva tárgyaljuk.

A sejt felszínét fedô burok az egyes baktériumfajtáknál eltérô szerkezetû lehet. Aszerint, hogy egy hagyományos festési módszerrel (Gram-festés) festôdnek-e vagy sem, a baktériumok két nagy csoportját szokás megkülönböztetni, a Gram-pozitív, ill. -negatív sejteket. A festôdés minden bizonnyal a baktérium burkának a szerkezeti sajátosságaitól függ. A Gram-festés lényege, hogy a vizsgálandó készítményt elôször egy bázikus festékkel (gentiana-ibolyával) festik meg, majd jód-káliumjodid oldattal kezelik, és alkohollal differenciálják. A kezelés után egyes baktériumfajták elszíntelednek (Gram-negatív), míg mások megtartják kékesfekete festôdésüket (Gram-pozitív).



a) Muraminsacculus. Általában a Gram-pozitív baktériumok sejtfelszínét aránylag vastag (2080 nm) fal borítja be, amely hosszú szénhidrátláncokból és rövid összekötô peptidszakaszokból épül fel. Ezek egymásra fekvô kétdimenziós rétegeket alkotnak, melyek mélységben egymáshoz is kötôdnek, és így a burok lényegében egyetlen óriási molekulából áll, amely zsákszerûen veszi körbe a sejtet. A szénhidrátláncok váltakozva N-acetil-glukózaminból és annak tejsavat is tartalmazó származékából, az N-acetil-muraminsavból épülnek fel. Ezeket a hosszú láncokat L- és D-aminosavakból álló tetrapeptidek és az azokhoz kapcsolódó glicin-oligopeptidek kötik keresztbe.

gia felhasználásával. Figyelem: a bakteriális ostor szerkezetileg és a mozgás mechanizmusát illetôen merôben különbözik az eukarióta sejtek csillóitól, ostorától (l. ott)!

b) Komplex membrán. A burok másik elterjedt változatában a sejtmembránon kívül, azzal párhuzamosan egy másik membránszerû lipid kettôs réteg helyezkedik el. Ennek a külsô membránnak a felszínét sokszor egy fehérjékbôl álló szabályos szerkezetû réteg (S-réteg) fedi, a membránba félig beépítve pedig lipidbôl és szénhidrátból álló ún. lipopoliszacharid (LPS) molekulák találhatók. A sejtmembrán és a külsô membrán közötti igen vékony (2-3 nm) rést (periplazmatikus rés) a muraminburokhoz hasonló szerkezetû, de annál lényegesen vékonyabb peptidoglikánréteg tölti ki. Az ebbe a csoportba tartozó baktériumok általában Gram-negatívak.

1.3.1.1.2. Sejtmembrán

Egyéb felszíni struktúrák. a) Nyákburok. Egyes baktériumokban a burkot még egy további burok fedi, amely külsô végükön szabadon álló, fonálszerû, szénhidrátot tartalmazó makromolekulákból tevôdik össze. Ez a réteg a baktérium felszínének nyákos, viszkózus jelleget ad. b) Ostor, csilló (flagellum). Bizonyos baktériumok aktív mozgásra is képesek, a membránba beépített ostor mozgatásával. Az ostor fehérjébôl (flagellin) felépülô, hosszú, dugóhúzószerûen csavarodó, fonálszerû képzôdmény, melynek forgatásával a sejt elôrehaladó mozgást tud létrehozni. Az ostort a tövénél, a membránba beépített makromolekuláris motor (rotorlemez) forgatja, ener-

c) Pilusok. Fehérjébôl (pilin) felépülô, vékony (7–10 nm), tûszerû csövek, melyek a baktérium felszínérôl nyúlnak ki. Segítségükkel a baktérium eukarióta sejtek szénhidrátburkát ismeri fel, és ahhoz kapcsolódhat. A pilusok alagútján keresztül DNS is kicserélôdhet egyes baktériumok között (konjugáció), ami egyfajta primitív szexuális eredetû genetikai változékonyságot is eredményez.

A citoplazmát kívülrôl borító membrán, a sejtmembrán, a baktérium egyetlen membránja (a Gram-negatívak külsô membránját leszámítva). Vastagsága, molekuláris felépítési elve hasonlít az eukarióta sejt membránjához (l. ott). Azonkívül, hogy anyagok felvételében és leadásában, valamint a sejtnek a külvilág felé való elhatárolásában igen fontos szerepe van, a bakteriális membránban vannak jelen azok a legfontosabb molekuláris mechanizmusok is, amelyek az eukarióta sejt intracelluláris membránjaira lokalizálódnak. Intracelluláris membránok a baktériumokban nincsenek, kivételt csupán a mezoszóma és a cianobaktériumok fotoszintetikus membránjai képeznek. Mezoszóma. A hosszúkás sejt közepe táján a sejtmembrán begyûrôdhet a sejt belsejébe, és így membránkettôzetet alkot, amely néha kissé fel is csavarodik. Ez a mezoszómának nevezett kettôzet tehát nem valódi intracelluláris membrán, hanem lényegében a sejtmembrán része. Jelentôségét abban látják, hogy ide rögzül a bakteriális DNS, és ennek replikációja után a mezoszóma a két DNS-nek a két utódsejtbe való szétosztásában játszik szerepet. Egyes fotoszintetikus baktériumok intracelluláris membránjai. A filogenetikailag ôsi cianobaktériumokban a fotoszintézis molekuláris komponensei

37


38


intracelluláris membránokban mûködnek. Ennek megfelelôen ezen sejtek széli citoplazmájában párhuzamosan elrendezôdött membránokat találunk.

1.3.1.1.3. Citoplazma Elektronmikroszkóppal a bakteriális citoplazma tömött szerkezetû és finoman szemcsézett. A nagyobb szemcsék a sejt riboszómái, melyek ribonukleinsavból és fehérjébôl állnak, és a fehérjeszintézisben játszanak fontos szerepet. Valamivel kisebbek és egyszerûbbek az eukarióta sejt riboszómáinál. A közöttük levô teret az anyagcsere különbözô, nem membránhoz kötött enzimei és termékei töltik ki. A citoplazmából hiányzanak az eukarióta sejt jellegzetes sejtorganellumai, így a mitokondriumok, az endoplazmatikus retikulum, a Golgi-apparátus, a centriolum, a sejtváz stb.

1.3.1.1.4. Nukleoid. A bakteriális DNS A prokarióta DNS olyan kétszálú DNS, amelynek nincs két szabad vége, hanem gyûrûszerûen visszatér önmagába (cirkuláris DNS). Többnyire a sejt közepén található meg, elektronmikroszkóppal fonalas gombolyag (nukleoid) formájában. A sejtbôl kiszabadítva a gyûrûszerû alak elektronmikroszkópban láthatóvá tehetô. A gyûrûszerû DNS-t bakteriális kromoszómának is szokás nevezni, bár az eukarióta kromoszómáktól mind alakilag (nem lineáris, hanem cirkuláris), mind pedig szerkezetének molekuláris részletei miatt eléggé távol áll. Ezen cirkuláris „kromoszóma” mellett a prokarióta sejtben további kis cirkuláris DNS-ek lehetnek (plazmidok), melyek beépülhetnek a nagy kromoszómába, de abból ki is válhatnak. Kis tömegarányuk (2% körül) ellenére fontos információkat hordozhatnak (pl. Rfaktor, F-faktor stb.). Szemben az eukarióta sejttel, a DNS-t maghártya nem veszi körül, hiszton, egyéb csomagoló fehérjék és így kromatin sincs, hiányzik a magvacska is.

Tekintve, hogy a DNS-t a citoplazmától maghártya nem választja el, továbbá, hogy a sejt kis mérete miatt minden kis helyre koncentrálódik, a génexpresszió két lépése: a transzkripció és a transzláció sem különül el a térben és idôben, mint ahogyan az az eukarióta sejtben ismert. Ennek megfelelôen a génexpresszió folyamán olyan komplex szerkezetek jönnek létre, ahol a DNS mentén átíródó RNS-en már közvetlenül zajlik a fehérjeszintézis is. Ezek a sejtbôl izolálva elektronmikroszkóppal láthatóvá is tehetôk. A baktériumok, amilyen egyszerûek, olyan gyorsan szaporodnak. Kedvezô táplálkozási és környezeti feltételek között 20 percenként osztódnak, ez azt jelenti, hogy 12 óra alatt egyetlen egyedbôl sok milliárd baktérium keletkezik. Ez a gyors szaporodási képesség a prokarióta sejt legfontosabb életben maradási stratégiája. Amennyiben ez jelentôs genetikai változékonysággal párosul, a baktériumsejt még a környezet drasztikus változásait is képes kivédeni. Bár a tenyészet legnagyobb része elpusztul, a genetikailag alkalmasabb, jobban adaptálódó néhány baktérium igen gyorsan elszaporodik, és új, túlélô populációt alkot. A genetikai változékonyságot nemcsak DNS-mutációk biztosítják, hanem egyes baktériumokban a párosodás (konjugáció) folyamán a plazmidok cseréje a piluson keresztül, a fágfertôzés folyamán a bakteriális DNS-nek idegen DNS-darabokkal való „szennyezôdése” (transzdukció), továbbá a környezetbôl szabad DNS-töredékeknek a sejtbe való felvétele (transzformáció) is jelentôsen hozzájárul a DNS változatosságához. A sejt osztódása meglehetôsen egyszerû. Elôször a cirkuláris DNS-nek kell replikációval megkettôzôdnie, majd a sejt befûzôdéssel kettéosztódik. A két cirkuláris DNS-t a mezoszóma osztja szét a két különváló utódsejtbe.



1.3.1.2. Az eukarióta sejt szerkezete Bevezetôként egy idealizált állati sejten vázlatosan bemutatjuk az eukarióta sejt felépítését (l. 1/4. ábra), majd sorra vesszük az egyes sejtkomponenseket, végül azokat a különlegességeket említjük meg, amelyek a növényi sejtet, ill. az egysejtûeket az állati sejttôl megkülönböztetik. A sejtet a külvilágtól vékony hártya, a sejtmembrán (vagy plazmamembrán) határolja el. A sejt tartalmát a hagyományos citológiai elnevezéssel protoplazmának nevezzük, ez a DNS-t tartalmazó és maghártyával határolt sejtmagból, valamint az azt körülvevô citoplazmából áll. Az utóbbi komplex felépítésû, mert benne számos, fényvagy elektronmikroszkóppal látható sejtkomponens, ún. sejtorganellum foglal helyet. Az organellumok nagy része membránnal van körülhatárolva, ezek lehetnek egyszerû membránok (endoplazmatikus retikulum, Golgi-apparátus, vakuólum, lizoszóma, peroxiszóma, transzportvezikulák esetében) vagy kettôs membránok (mitokondriumokban, növényi sejtekben a kloroplasztiszokban). A citoplazma további organellumai még a sejtvázat alkotó mikrofilamentumok, intermedier filamentumok és mikrotubulusok, továbbá a nagyszámú riboszóma. Bizonyos sejtekben raktározott anyagokat, pl. glikogént, zsírcseppeket is találunk. Az elôbb említett organellumok és tartalékanyagok a citoplazma folyékony állományába (alapplazma vagy citoszol) beágyazva foglalnak helyet. A sejtek felszíne különleges ujjszerû nyúlványokat mutathat, ezek a sejtmembránból és az ahhoz társuló sejtvázból jönnek létre, és merevek vagy mozgékonyak lehetnek (mikrobolyhok, ill. csillók).

1.3.1.2.1. Sejtmembrán A sejtmembrán (más néven sejthártya, plazmamembrán, felszíni membrán, (1/6-7. ábra) a sejt felszínét borítja be, és ezzel elhatárolja a környezetétôl. Olyan vékony, hogy a régi citológusok a fénymikroszkóppal közvetlenül nem láthatták,

és csak egyéb jelekbôl következtethettek a jelenlétére. Elôször az elektronmikroszkóp tette láthatóvá, amikor is a sejtmembrán keresztmetszetben egy kb. 8–10 nm vastag vonalnak látszott. Nagyobb elektronmikroszkópos nagyítás az egyetlen vonalat három rétegre: két szélsô sötét és egy közbülsô világos rétegre tudja felbontani. Ez a 8-10 nm vastag háromrétegû (trilamináris) szerkezet jól megfelel annak az elképzelésnek, hogy a membrán alapszerkezetét lipid kettôs réteg alkotja, amelyben a hidrofób zsírsavláncok egymás felé fordulnak. A középsô, világos réteg ennek megfelelôen a zsírsavláncokat reprezentálja, míg a két szélsô sötét réteg a foszfolipidek fejcsoportjainak felel meg (az elektronmikroszkópos preparatív technika során alkalmazott nehézfém atomok, pl. ozmium, urán, ólom itt rakódik le, ezért ad elektronárnyékot). A membránfehérjék jelentôs része (karrierek, ioncsatornák, receptorok, adhéziós molekulák, integrinek stb.) a lipid kettôs rétegbe van beépítve, többnyire úgy, hogy teljesen átéri a membrán vastagságát. Ezeknek az ún. integráns membránfehérjéknek a helyzete annyira stabil, hogy a membránból csak igen drasztikus eszközökkel, a lipid kettôs réteg teljes megbontásával nyerhetôk ki. Az integráns membránfehérjéknek a membránon áthaladó része az elektronmikroszkópos képen nem látszik, mivel hidrofób tulajdonságú (hidrofób kölcsönhatás a lipidek zsírsavláncaival!), és így a membrán középsô, világos rétege a metszeti képen folyamatosnak tûnik. Az integráns membránfehérjék, különösen a nagyobb tömegûek azonban mégis láthatóvá tehetôk egy speciális elektronmikroszkópos preparatív módszerrel, a fagyasztva töréssel. A jégkristálymentesen lefagyasztott szövetdarabot eltörjük, és a törésfelületrôl árnyékolt replikát készítünk, majd ezt vizsgáljuk az elektronmikroszkópban. A membránok ezzel az eljárással hidrofób belsô síkjukban hasadnak, és az így szabaddá váló hasadási felületen az integráns membránfehérjék kis, szemcseszerû részecskékként (intramembrán részecskék) jelennek meg. A membránhoz egyéb fehérjék is tartoznak, melyek a membrán külsô vagy belsô oldalá-

39


40

BEVEZETÉS A SEJTBIOLÓGIÁBA membrán

sejtburok, alatta a membrán

B

A

1/6. ábra. A sejtmembrán keresztmetszeti képe nagy nagyítású elektronmikroszkópos felvételeken (Röhlich P. felv.). A) A membrán két szélsô sötét és az általuk közrefogott világos rétegbôl áll (trilamináris szerkezet, 287 000x). B) A ruténiumvörössel elôkezelt sejten a sejtburok is láthatóvá válik, mert a ruténiumvörös a sejtburok negatív töltéseihez kötôdik (300 000x).

perifériás membránfehérje oligoszacharidlánc

sejtburok extracelluláris felszín

a membrán elektronmikroszkópos képe

lipid kettôs réteg

integráns membránfehérjék

citoplazmatikus felszín

1/7. ábra. A membrán molekuláris szerkezetének modellje.

hoz asszociálódnak, többnyire egy-egy integráns fehérjéhez kapcsolódnak vagy egy hozzájuk kapcsolt zsírsavlánccal lehorgonyzódnak a lipid kettôs rétegbe (perifériás membránfehérjék). A sejtmembránnak az extracelluláris tér felé nézô felszíne gazdag szénhidrátokban. Ezt a szénhidrátdús, sokszor a membrán vastagságát is elérô vagy jóval meghaladó vastagságú réteget sejtburoknak vagy glikokalixnak nevezzük. A szénhidrátok általában oligoszacharidláncok formájában fordulnak elô, és a membránfehérjékhez vagy a lipidekhez kapcsolódnak (glikoproteinek, glikoli-

pidek). Szénhidrátok glukózaminoglikánokként is elôfordulhatnak, fehérjéhez kötve (membránproteoglikánok). A sejtburoknak a sejtmembrán külsô oldalán való elhelyezkedése azzal magyarázható, hogy a glikoziláció nagyrészt a Golgi-apparátus ciszternáinak belsô oldalán zajlik, majd miután az innen leváló transzportvezikulák a sejtmembránnal fuzionáltak, a vezikula kinyílásával a membránnak ezen glikozilált része az extracelluláris tér felé fordul (l. késôbb). A sejtburkot szénhidrátokban és savi csoportokban (szialinsav) való gazdagsága miatt elektronmikroszkópos



hisztokémiával (jelzett, szénhidrátkötô tulajdonságú fehérjék, un. lektinek, ill. pozitív töltésû fémkolloidok kötése a negatív töltésû savi csoportokhoz) tudjuk láthatóvá tenni. A sejtmembrán jelenléte biztosítja azt a diffúziós gátat, amely a sejtet elkülöníti a külvilágtól, és megakadályozza a kontrollálatlan, szabad diffúziót a citoplazma és az extracelluláris tér között. Ugyanakkor a membránfehérjék teszik lehetôvé a sejtnek a külvilággal való kapcsolatát, így anyagoknak ellenôrzött felvételét vagy leadását, a sejt sajátos belsô környezetének a biztosítását, ingerek, külsô információk felvételét, más sejtekkel való társulását stb. Mindezek révén érthetô, hogy a sejtmembrán eltávolítása, nagy részének porózussá tétele a sejt pusztulásához vezet.

1.3.1.2.2. Sejtmag A DNS-t tartalmazó (1/8-9. ábra) sejtmag (nukleusz), aránylagos nagyságánál és jellegzetes festôdési sajátságainál fogva a sejt legfeltûnôbb komponense, amelyet már korán, a XIX. sz. elsô felében leírtak (Boveri, 1831). Alakja szabadon mozgó sejtekben többnyire gömbölyû, de gyakran követi a sejt alakját is, pl. simaizomsejtben pálcika alakú, laphámsejtben lelapult, hengerhámsejtben megnyúlt. A mellette elhelyezkedô centriolum benyomhatja a mag felszínét, miáltal a mag vese alakúvá válik, egyes speciális sejtekben pedig a mag több helyen befûzôdhet, és így lebenyezett, karéjozott magvú sejtek alakulnak ki. A mag állománya bázikus (pozitív töltésû) festékekkel festhetô, tehát ún. bazofil festôdési sajátságot mutat. Ennek oka a DNS (neutrális pH-n mutatott) savi jellege a sok negatív töltésû foszfátcsoport miatt. A festôdô állomány, melyet a régi citológusok kromatinnak neveztek el, lehet finoman elosztott, laza szerkezetû (eukromatin), de alkothat nagy, tömött, erôsen festôdô tömböket is (heterokromatin). A kromatinnak ez a kissé régies jellegû fogalma új értelmet kapott a DNS-állomány tömörítésével kapcsolatos molekuláris felfogás révén. Tekintettel arra, hogy egy átlagosan 5-10 µm nagyságú sejtmagban óriási hosszúságú

(emberi sejt esetében kb. 2 m hosszú) DNS-t kell elhelyezni, szükség van a DNS „összecsomagolására”, tömörítésére. A tömörítés elsô szintjét egy 8 db hisztonfehérjébôl álló kis (csak elektronmikroszkóppal látható) részecskére való felcsavarodás jelenti (nukleoszóma). Így gyöngysorszerû képzôdmény jön létre, egy 10 nm vastag láncot alkotva, ahol a gyöngyöknek a nukleoszómák, a fonálnak a DNS fel nem tekeredett közti szakasza felel meg. Ezt a laza láncot egy újabb hisztonfehérje húzza össze hosszában, miáltal a nukleoszómák szorosan egymás mögé kerülnek. Ez a fonál tovább tekeredik spirális formában, ennek révén egy kb. 30 nm vastag kromatinfonál jön létre, mely hurkokat alkotva tovább csomagolja a DNS-t. A kromatinnak a fény- és elektronmikroszkópban látható szerkezete a kromoszómák különbözô fokban szét- vagy összetekeredett állapotától, azok térbeli elhelyezkedésétôl függ. A lazább szerkezetû (eukromatinban gazdag) sejtmag a DNS kevésbé tömör csomagolása miatt nagyobb térfogatú, míg az erôsen heterokromatikus magállomány kisebb sejtmagban is elhelyezhetô. A heterokromatin tömött szerkezete akadályozza a gének átírását a DNS-rôl. Az ilyen, a génexpresszió szempontjából inaktív területek a sejt élete során végig megmaradhatnak (konstitutív heterokromatin). Lehetnek azonban olyan heterokromatikus területek is, amelyek idôszakosan fellazulnak, és ezzel lehetôvé teszik az ennek megfelelô DNSszakaszokon a génkifejezôdést (fakultatív heterokromatin). A sejtmagnak egyik jellegzetes komponense a magvacska (nukleólusz), amely egy vagy több, tömött szerkezetû rögöcske formájában fordul elô. A kromatinhoz hasonlóan szintén bazofil festôdésû, ez azonban elsôsorban nem a DNS, hanem az itt felhalmozott RNS következménye. Ma már ismert, hogy ez az RNS a riboszómákba beépülô RNS-nek (rRNS) felel meg, ezzel a magvacska a riboszómák képzôdésének a központja. Az emberi haploid kromoszómakészletben 5 olyan kromoszóma található, amelynek bizonyos szakaszán riboszomális gének fordulnak elô (ez a kromoszóma nukleólusz organizátor régiója, NOR). Az ilyen

41


42

BEVEZETÉS A SEJTBIOLÓGIÁBA maghártya

magvacska

eukromatin

széli heterokromatin durva ER

1/8. ábra. Májsejt magjának elektronmikroszkópos képe. A laza kromatinszerkezetû (eukromatikus) sejtmag közepén dominál a magvacska, a kevés heterokromatikus részlet a maghártya belsô felszínéhez tapad hozzá (11 600x, Röhlich P. felv.).

citoplazma külsô membrán

belsô membrán kromatin

1/9. ábra. Maghártya és magpórusok. A maghártya a külsô és belsô membránból és az általuk közrezárt térbôl áll. A pórusokra nyilak mutatnak rá. A pórus szélén a két membrán áthajlik egymásba, az így létrejött kerek nyílásba póruskomplex van beépítve. Elektronmikroszkópos felvétel (38 000x, Röhlich P. felv.).



kromoszómák NOR-szakaszuk mentén sokszor egymáshoz társulnak, és az ott termelôdô rRNS, valamint riboszóma-elôalakok körülöttük felhalmozódva egyetlen nagy tömeget alkotnak, ez a fénymikroszkóppal látható magvacska. Elôfordul azonban, hogy nem mindegyik kromoszóma társul, hanem külön állva több magvacskát hoz létre. Az elektronmikroszkóp a magvacska állományában finoman granuláris, ill. filamentáris területeket tud láthatóvá tenni. A magvacska tömege a riboszómaképzés intenzitását tükrözi, ezért olyan sejtekben, ahol erôs fehérjeszintézis folyik, és nagy a riboszómák iránti igény, egy vagy több nagy nukleóluszt figyelhetünk meg. Az ilyen sejteket nagy magvacska mellett (a citoplazma riboszómagazdagsága miatt) bazofil festôdésû citoplazma jellemzi. Eltûnik a magvacska a sejtosztódás profázisában, amikor a kromoszómák kompakttá válnak, viszont újra megjelenik a sejtosztódás végén a kromoszómák fellazulásakor. A magvacska nem könnyen különíthetô el a mag heterokromatikus területeitôl, ezért felismerésére olyan festéseket alkalmazunk, amelyek a DNS-t és az RNS-t különbözô színben tüntetik fel (pl. a metilzöld a DNS-t zöldre, a pironin az RNS-t vörösre festi meg). A patológiában rákos sejtek vizsgálatában alkalmaznak még speciális ezüstimpregnációkat, de a nukleólusz szelektív kimutatására a legmegbízhatóbb eljárás az immuncitokémia, melynek során a magvacskában elôforduló fehérjéket mutatnak ki specifikus ellenanyagokkal. Az eukarióta sejtben a sejtmagot a citoplazmától maghártya (magmembrán, magburok) választja el. A fénymikroszkópban egyszerû vonalnak látszó maghártya az elektronmikroszkópban két, egymással párhuzamosan futó membránra bontható, melyek keskeny rést (perinukleáris rés) zárnak közre. A maghártya tehát a kromatint körülvevô lapos zsáknak (ciszternának) felel meg, hasonlóan az endoplazmatikus retikulum és a Golgi-apparátus ciszternáihoz. A durva felszínû endoplazmatikus retikulummal (durva ER) ez a ciszterna egyes helyeken közlekedik is, sôt a citoplazma felé esô felszínéhez riboszómák is tapad-

nak. A maghártyának tartást a belsô (a mag belsô tere felé nézô) oldalhoz rögzülô vékony rostos réteg ad (lamina fibrosa, nukleáris lamina). Ez a réteg a citoszkeleton 10 nm-es filamentumaihoz tartozó, ún. laminfehérjékbôl (lamin-A, -B, -C) álló filamentumokból épül fel. A maghártya csak a sejtosztódás profázisában tûnik el, amikor a rostos réteg (a laminok foszforilációjára) lebomlik, és a magmembrán egyedi kis hólyagocskákra, vezikulákra esik szét. Az új maghártya a telofázisban ezekbôl a vezikulákból áll össze ismét. A mag és a citoplazma között állandó kommunikáció szükséges, melynek révén a magból mRNS, tRNS és rRNS, valamint a magvacskában összeszerelôdött riboszómák jutnak ki a citoplazmába, onnan viszont különbözô magfehérjék (hiszton és egyéb DNS-csomagoló fehérjék, valamint a DNS replikációjában, transzkripciójában, az RNS megkötésében és továbbalakításában szerepet játszó fehérjék stb.) és riboszomális fehérjék szállítódnak be a magba. Ezt a nukleocitoplazmatikus kétirányú transzportot a maghártya kerek nyílásai, a magpórusok teszik lehetôvé (l. 1/9. ábra). A pórus nyílásába sokféle fehérjébôl felépülô, óriási molekuláris komplex illeszkedik be (póruskomplex), ez biztosítja, hogy a magba csak az odatartozó (a maglokalizációs jellel rendelkezô) fehérjék jussanak be, és teszi lehetôvé az RNS-ek, riboszómák kijutását a citoplazmába. A maghártyát többnyire sok száz ilyen pórus lyuggatja át, melyek száma sejttípusonként és a sejt funkcionális állapotától függôen erôsen változhat.

1.3.1.2.3. Riboszómák 25 nm nagyságú és ezért csak elektronmikroszkóppal látható részecskék a citoplazmában. A riboszómák nagy feloldású elektronmikroszkóppal vizsgálva egy nagyobb és egy kisebb alegységbôl tevôdnek össze. Kémiai szerkezetüket illetôleg mindkét alegység ribonukleinsavból (rRNS) és fehérjébôl áll, a nagyobb alegység 3 ribonukleinsav-molekulát és kb. 50 fehérjét, a kisebb alegység pedig egy ribonukleinsavat és kb. 35 fehérjét tartalmaz.

43


44


Ez az óriási nukleinsav–fehérje komplex a fehérjeszintézis (transzláció) központi eleme, amelynek legfôbb funkciója az aminosavak peptidkötésekkel való összekötése, és ezzel a polipeptidlánc kialakítása. Az (aminosavspecifikus) tRNS-ek által odaszállított aminosavak közül az mRNS bázissorendjének megfelelôen a soron következôt kiválasztja, és vele a polipeptidláncot továbbépíti. Mindez a molekuláris összetevôk (tRNS, tRNS-transzferáz enzim, mRNS) riboszóma általi térbeli összerendezôdését, szabályozott kölcsönhatásait igényli. A riboszómák a legtöbb sejtben nagy számban vannak jelen, részben szabadon fordulnak elô a citoplazmában (szabad riboszómák), részben kötôdhetnek az endoplazmatikus retikulum membránjához (membránhoz kötött riboszómák, l. durva felszínû endoplazmatikus retikulum). Különösen sok van belôlük olyan sejtekben, melyek intenzív fehérjeszintézist folytatnak (pl. gyorsan szaporodó sejtekben, fehérjét szecernáló mirigysejtekben stb.), az ilyen sejtek a fénymikroszkópban a riboszómák nukleinsav-tartalma miatt bazofil festôdést mutatnak, tehát bázikus (pozitív töltésû) festékekkel festôdnek.

1.3.1.2.4. Endoplazmatikus retikulum Ez a membránnal rendelkezô organellum csövecskék (tubulusok) és lelapult zsákszerû elemek (ciszternák) egymással közlekedô labirintikus rendszerébôl áll. Az így létrejövô hálózatot (retikulum) elektronmikroszkópos vizsgálattal a XX. sz. ötvenes éveiben írták le, és mivel elôször csak a citoplazma belsô, maghoz közeli részében (endoplazma) találták meg, endoplazmatikus retikulumnak (rövidítve ER) nevezték el. Az ER tehát egy membránnal határolt labirintikus üregrendszer, mely behálózza a citoplazma jelentôs részét (1/10-13. ábra). Kiterjedése a különbözô sejttípusokban igen változó, de az ER általában mindig megtalálható. Aszerint, hogy külsô felszínéhez tapadnak-e riboszómák vagy nem, az elektronmikroszkópban az ER felszíne durva vagy sima lehet („durva felszínû” ER, ill.

„sima felszínû” ER). Bár a kettô többnyire kapcsolatban van egymással, a kétféle megjelenési forma egyben nagyrészt eltérô molekuláris szerkezetet és sejtbiológiai funkciót is takar. Durva felszínû endoplazmatikus retikulum. Az üregrendszert határoló membrán külsô (citoplazmatikus) felszínéhez egymáshoz közel, azonos távolságban riboszómák kötôdnek, melyek kis sötét granulumok formájában látszanak, és az endoplazmatikus retikulum felszínét durvává teszik (röviden durva ER vagy rER az angolszász nevezéktan szerint, l. 1/10-11. ábra). A hálózatos üregrendszert elágazó, majd újra egyesülô csôszerû elemek, más helyeken pedig lelapult zsákszerû képzôdmények, ún. ciszternák alkotják. Az utóbbiak különösen olyan sejtekben fordulnak elô nagyobb mennyiségben, amelyekben intenzív fehérjeszintézis zajlik. Ilyenkor a ciszternák egymással párhuzamosan rendezôdnek, és a sejt citoplazmájának jelentôs térfogatát foglalják el. Az ilyen rendezett szerkezetû, nagy tömegû durva ER-t (a XIX. sz.-ban alkotott és az elektronmikroszkópos citológiában újra felhasznált szóval) ergasztoplazmának nevezzük. A citoplazmának ez a területe a nagyszámú riboszóma miatt (ribonukleinsav!) a fénymikroszkópban bázikus festékekkel festôdik (bazofil), az ergasztoplazma elnevezést is eredetileg e tulajdonsága miatt kapta. Különösen fejlett ergasztoplazmát találunk intenzív fehérjeszintézisre specializált sejtekben (fehérjeszekrétumot termelô mirigysejtekben, mint pl. a hasnyálmirigy, a nyálmirigyek mirigysejtjeiben, a kötôszövet fibroblasztjaiban, fiatal porc- és csontsejtekben, a fog dentinjét termelô odontoblasztokban, stb.). A durva ER-ben a riboszómák jelenléte utal fô funkciójára, a fehérjeszintézisre. Csak a fehérjéknek bizonyos csoportja termelôdik itt, mégpedig azok, amelyeket a sejt majd vagy az extracelluláris térbe ad le (export vagy szekréciós fehérjék), vagy egy membránnal határolt organellumban, a lizoszómában tárol (lizoszomális fehérjék), illetve amelyek a sejtmembránba épülnek be (membránfehérjék). Mindegyik esetben a sejt a szintézis során keletkezô naszcens, még nem feltekeredett


AZ ÉLÔ SZERVEZETEK ALAPVETÔ KATEGÓRIÁI: PRO- ÉS EUKARIÓTASEJTEK burkos gödör (coated pit)

1/10. ábra. Közepesen fejlett durva felszínû endoplazmatikus retikulum. A néhány ciszterna egymással közlekedve hálózatot alkot. Elektronmikroszkópos felvétel petefészek tüszôhámsejtjébôl (22 670x, Röhlich P. felv.).

mitokondrium

sejtmag

intermedier filamentumokból álló köteg

1/11. ábra. Fejlett durva felszínû endoplazmatikus retikulum. A párhuzamosan rendezett ciszternák felszínéhez riboszómák tapadnak. Elektronmikroszkópos felvétel prostata hámsejtjébôl (22 000x, Röhlich P. felv.).

sejtmag

ER ciszternák

ER ciszterna

45


46

BEVEZETÉS A SEJTBIOLÓGIÁBA sima ER

polipeptidláncot juttatja át a membránon (teljes egészében: export, ill. lizoszomális fehérjék, illetve részlegesen: membránfehérjék esetében). Az itt szintetizálódó fehérjék tehát keresztben, a membrán síkjára merôlegesen „csúsznak át” a transzláció közben a membránon (vektoriális transzláció). A termelôdô fehérje kezdeti szakaszán található meghatározott aminosavsorrend (szignálszekvencia) szabja meg, hogy melyek ezek a fehérjék. A szignálszekvenciát felismerô mechanizmus a riboszómát a durva ER membránjához irányítja. A durva ER-ben a termelt fehérjének kialakul a majdnem végleges térbeli alakzata, és már kezdeti módosulásokon (pl. az ún. N-glikoziláció kezdeti szakasza) is keresztülesik. A durva ER különlegesen átalakult ciszternájának tekinthetô a maghártya (ezért perinukleáris ciszternaként is emlegetik). Ennek a citoplazma felé nézô oldalán még megtalálhatók a riboszómák, a sejtmag ürege felôli oldalán azonban nem, helyette itt a maghártya rostos rétege (nukleáris lamina) kötôdik a membránhoz. Sima felszínû endoplazmatikus retikulum. A sima felszínû endoplazmatikus retikulum (sima ER vagy sER) elágazó, majd újra egyesülô, 30-100 nm átmérôjû tubulusok szövevényes hálózatából áll (l. 1/12-13. ábra). A sejtek többségében aránylag kevéssé fejlett, ilyenkor az elektronmikroszkópos metszeti képen csak néhány kerek vagy hosszúkás, membránnal határolt metszeti képét láthatjuk. Bizonyos sejttípusokban azonban igen erôs fejlettséget érhet el, amikor is a citoplazma jelentôs területét a sima ER foglalja el, sokszor olyan mértékben, hogy a többi sejtorganellumot úgyszólván kiszorítja magából. A sima ER nagy membránfelszíne révén egy sor, membránhoz kötött enzim funkciójához biztosítja a szükséges intracelluláris membránfelületet. Itt helyezkednek el pl. a lipidek szintéziséhez szükséges enzimek, és ezzel a sima ER többek között a membránok lipid kettôs rétegének a kialakításában mûködik közre. Ezen általános funkcióján túl a sima ER különbözô egyéb folyamatokban is szerepet játszik. A szteroidhormon-szintézis egyes enzimei pl. a sima ER membránjához kötöt-

mitokondrium durva ER maghártya

sejtmag

1/12. ábra. Sima felszínû endoplazmatikus retikulum. A kép felsô felét a retikulum egymással kapcsolatban álló szabálytalan csövecskéi töltik ki. Elektronmikroszkópos felvétel májsejtbôl (16 000x, Röhlich P. felv.).

tek, és ezért a szteroidhormon-termelô sejtekben (mellékvese-kéregállomány sejtjei, a here Leydig-sejtjei, a petefészek sárgatestsejtjei) igen kiterjedt sima ER-t találhatunk. De a szteroidhormonokkal rokon koleszterin szintézise is a sima ER-hez kötött, ennek megfelelôen a szintézis legfontosabb helyén, a májsejtben, fejlett a sima ER. Ezen túlmenôen a máj méregtelenítô funkciójáért felelôs enzimek is a sima ER membránjában lokalizálódnak, sôt a glikogén-anyagcsere egyes enzimei (pl. glukóz-6-foszfatáz) szintén a sima ER membránjában foglalnak helyet. Az a tény, hogy az izomsejt sima ER-je (az ún. szarkoplazmatikus retikulum) fontos Ca2+-tároló hely, ahonnan a Ca2+ adott ingerre szabályozottan áramlik ki a citoszol-


AZ ÉLÔ SZERVEZETEK ALAPVETÔ KATEGÓRIÁI: PRO- ÉS EUKARIÓTASEJTEK sima ER

durva ER

1/13. ábra. A sima és durva felszínû endoplazmatikus retikulum kapcsolata (rövid nyilak). A sima ER itt elsôsorban párhuzamosan rendezett ciszternákból áll. Elektronmikroszkópos felvétel petefészek sárgatest sejtjébôl (17 200x, Röhlich P. felv.).

ba, aránylag régóta ismert. Újabban kiderült, hogy nem izomsejtek sima ER-je hasonló feladatot láthat el.

1.3.1.2.5. Golgi-apparátus Ezt a sejtmag közelében elhelyezkedô organellumot Camillo Golgi olasz neuroanatómus írta le a XIX/XX. sz. fordulóján. Az idegsejtek feltüntetésére használható ezüstimpregnációs módszerek kidolgozása közben az idegsejt magja körül a citoplazmában ezüsttel sötétre festôdô hálózatot figyelt meg („apparato reticolare interno”), melyrôl kiderült, hogy más sejtféleségekben is elôfordul. Ezt az organellumot felfedezôjérôl a késôbbiekben Golgi-apparátusnak (Golgi-készüléknek) nevezték el. A XX. sz. elsô felében többen kétségbe vonták a Golgi-apparátus létezését, mivel preparációs mûterméknek tartották, létét az elektronmikroszkópia igazolta véglegesen, és egyben írta le finomabb felépítését (1/14-15. ábra). A Golgi-apparátus fénymikroszkóppal megfigyelt hálózata kisebb egyedi egységekbôl áll össze,

ezeket diktioszómáknak nevezzük. Elektronmikroszkóppal vizsgálva minden diktioszóma párhuzamosan egymásra rakódó lapos zsákokból (ciszternákból) épül fel, melyek száma 3 és 10 között van. A Golgi-ciszternák falát membrán alkotja, amely a ciszterna belsô terét elhatárolja a citoplazmatikus állománytól. A diktioszómát alkotó ciszternák (az azokban lokalizálódó enzimek révén) fontos szerepet játszanak az endoplazmatikus retikulumban szintetizált fehérjéknek a módosításaiban. Ehhez természetesen az szükséges, hogy ezek a fehérjék a durva ER-bôl eljussanak a Golgi-apparátusba, ami az ER-bôl lefûzôdô hólyagocskák révén történik. Ezek a transzportvezikulák a diktioszóma sejtmaghoz legközelebb esô ciszternájával (cisz-ciszterna) fúzionálva, majd onnan újra lefûzôdve és az ER-be visszatérve ideoda ingáznak a durva ER és a diktioszóma között, és a fehérjéket átszállítják a Golgi-apparátusba. Bonyolult molekuláris rendszer szabályozza ezt a folyamatot és biztosítja azt, hogy valóban csak a módosítandó fehérjék kerüljenek át. Az egymásra rakódó ciszternák enzimkészlete és ennek megfelelôen a funkciója is különbözô. A fehérje a ciszciszterna felôl fokozatosan áthalad az egyes közbülsô ciszternákon egészen a legutolsó (transzciszterna), miközben fokozatos módosulásokon (mint pl. az N-glikoziláció végsô szakasza, továbbá az O-glikolizáció, hidroxilálás, szulfatálás, célzott fehérjehasítás, stb.) esik keresztül. Megoszlanak a vélemények arról, hogy a fehérje milyen mechanizmus révén továbbítódik a diktioszómán keresztül. Az egyik nézet szerint a ciszternák között az anyagtovábbítást ide-oda ingázó transzportvezikulák végzik, a másik vélemény szerint viszont maguk a ciszternák tolódnak a cisz oldal felôl a transz oldal felé, azáltal, hogy a cisz oldalon újak keletkeznek, míg a transz oldalon a ciszternák leválnak. A diktioszóma legutolsó, transz-ciszternája, ill. az ehhez csatlakozó, csövecskékbôl és szabálytalan zsákszerû elemekbôl álló hálózat (transz-Golgi-hálózat, TGN) az a hely, ahonnan a különbözô módosult fehérjék végsô helyükre elosztódnak. Az innen lefûzôdô vezikulák többsége a sejtmembrán felé halad, majd azzal összeolvadva (exocitózis) a szekréciós

47


48

BEVEZETÉS A SEJTBIOLÓGIÁBA lizoszóma

mitokondrium

Polarizált felépítésû, szekréciós hámsejtekben a Golgi-apparátus helyzete is irányított, mégpedig a sejtmagnak azon az oldalán helyezkedik el, amelyik irányban a szekréció történik. Így pl. hasnyálmirigyben a mag és az apikális (a mirigyvégkamra lumene felé esô) sejtmembrán között, májsejtben pedig a sejtmagnak az epekapilláris felé esô oldalán található meg.

1.3.1.2.6. Lizoszóma Golgi-apparátus

sejtmag

1/14. ábra. Golgi-apparátus mellékhere hámsejtjébôl. Elektronmikroszkópos felvétel (15 000x, Röhlich P. felv.).

fehérjéket leadja az extracelluláris térbe, ill. a fúzió révén a vezikula membránja felvevôdik a sejtmembránba, és ezzel a membránfehérjék is végsô helyükre, a sejtmembránba jutnak. A durva ER–Golgi útvonalon haladó fehérjék harmadik csoportját, a lizoszomális fehérjéket külön vezikulák szállítják végsô helyükre, a lizoszómába. A lizoszómába való eltérítésért a lizoszomális fehérjéket jelölô mannóz-6-foszfát jel és az azt felismerô és a vezikulák membránjába beépített receptor felelôs.

Többnyire a Golgi-apparátus környékén található organellumok (1/16. ábra), melyeket membrán határol el a citoszol felé, belsejüket pedig szemcsés, sötét állomány tölti ki. Az utóbbiról a lizoszómák felfedezése után rövidesen kiderült, hogy savi pH-n mûködô hidrolitikus enzimek tömege. Mivel ezek az enzimek a sejteket felépítô szerves molekulák lebontásában játszanak döntô szerepet, az elektronmikroszkópban látható sötét testecskét lizoszómának nevezték el (gör. lysein: oldani, soma: testecske). A lizoszómák nagysága tág határok között változik (0,1-1 µm, sejttípustól és a sejt funkcionális állapotától függôen). Leginkább gömbölyded képzôdmények, de szabálytalan alakú, csôszerûen megnyúlt lizoszómák is ismeretesek. Egyszerû felépítésük miatt nem mindig könnyû ôket az elekt-

szekréciós vakuólum kondenzáló vakuólum transz-ciszterna cisz-ciszterna durva ER ciszterna

1/15. ábra. Golgi-apparátus szekréciós sejtben. A képen egy diktioszómát látunk, amely 7-8 párhuzamosan rendezett ciszternából áll. A diktioszóma konkáv oldalán, a transz-ciszterna mellett sûrûsödô váladékot tartalmazó, ún. kondenzáló vakuólumokat találunk. Elektronmikroszkópos felvétel (28 700x, Röhlich P. felv.).



A

lizoszómák

lizoszóma

B

1/16. ábra. Lizoszómák elektronmikroszkópos képe (L. Kiss Anna felv.). A) A Golgi-apparátus környékén a mitokondriumnál többnyire kisebb, egyszerû membránnal határolt, sötét tartalmú képletek formájában láthatók a lizoszómák (makrofág, 14 600x). B) Lizoszómák kimutatása savas foszfatáz hisztokémiai reakcióval (a reakciótermék a lizoszómák belsejében sötét csapadék formájában látható, makrofág, 30 000x).

ronmikroszkópos képen egyértelmûen azonosítani, biztos felismerésüket az ôket jellemzô enzimek enzimcitokémiai vagy immuncitokémiai kimutatása teszi lehetôvé. A lizoszómákat kitöltô enzimek igen sokfélék lehetnek, gyakorlatilag minden, a sejtet felépítô szerves polimer molekulát képesek építôköveire bontani. Így vannak köztük nukleázok (DNáz, RNáz), proteázok, glikozidázok, lipázok, foszfatázok, szulfatázok, lizozim stb. Ezek a hidrolitikus enzimek savi pH-n mûködnek optimálisan (savi hidrolázok), az ehhez szükséges 5-5,5 pH-értéket

a lizoszóma membránjába épített lizoszomális protonpumpa (proton-ATP-áz) biztosítja, amely a lizoszóma belsejébe H+-ionokat juttat be ATPbôl származó energia segítségével. A lizoszóma bontóenzimei a sejt számára potenciális veszélyt jelentenek. A sejtet a lizoszómák révén való önemésztôdéstôl (autolízis) részben a lizoszómát a citoszoltól elválasztó lizoszómamembrán, részben pedig a citoplazma közel semleges pH-ja menti meg. A lizoszóma enzimraktár, amely készenlétben áll, hogy a sejt számára idegen szerves anyagokat,

49


50


makromolekulákat lebontson. Ezek az anyagok (elhalt sejtek vagy azok maradványai, baktériumok, makromolekulák) többnyire kívülrôl jutnak a citoplazmába azáltal, hogy a sejtmembránhoz tapadnak, majd a membrán e részletének a betüremkedésével és lefûzôdésével felvevôdnek a sejtbe (endocitózis). A felvett részecskéket membrán határolja el a citoplazma többi részétôl, mely az endocitózis során lefûzôdött sejtmembránnak felel meg. Ennek révén két membránnal határolt kompartmentum áll rendelkezésre, az egyik a felvett és lebontandó anyagot tartalmazza (fagoszóma), a másik a lizoszóma, mely a bontó enzimek raktára. A két kompartmentum membránjának a fúziójával1 kommunikáció jön létre azok belsô tartalma között, a két kompartmentum egyetlen kompartmentummá olvad össze, és a lizoszomális enzimek megkezdhetik a felvett anyag lebontását. Ennek a mechanizmusnak az a nagy elônye, hogy a bontó enzimek úgy jutnak a lebontandó anyaggal kapcsolatba, hogy egyetlen pillanatra sem érintkeznek a citoplazma saját anyagával. Az emésztési folyamat során a felvett anyag építôköveire bontódik, majd ezek a lizoszómamembránon transzportálódva bejutnak a citoszolba, és ott újra felhasználódnak. A lizoszómát abban az állapotában, mikor még fagoszómával nem fuzionált, primer lizoszómának nevezzük, míg az összeolvadás után keletkezô képlet neve szekunder lizoszóma vagy fagolizoszóma. Bár az idegen részecske vagy anyag többnyire maradéktalanul lebontódik a szekunder lizoszómában, egyes esetekben a lebontás nem tökéletes. Különösen hosszú élettartamú sejtekben fordul elô, hogy a sejtben ilyen emészthetetlen anyagot tartalmazó maradványtestek halmozódnak fel. Ezek sokszor lipideket is tartalmazó, sárgásbarnás színû granulumok formájában láthatók a fénymikroszkópos készítményben (lipofuszcin granulumok, „öregedési pigment”). A lizoszóma egyéb, kívülrôl felvett anyagok végsô állomását is jelenti. Az ún. receptorfüggô endocitózis révén fehérjetermészetû hormonok,

1

Nem eldöntött, hogy közvetlen összeolvadás történik, vagy közvetítô vezikulák révén kerül a fagoszóma tartalma a lizoszómába.

glikoproteinek, lipoproteinrészecskék is felvevôdnek a sejtbe, majd az így kialakult vezikulák egymással összeolvadva nagyobb vezikulákat (endoszómák) hoznak létre, amelyek végül szintén lizoszómával fuzionálnak. Végül a lizoszómák arra is jók, hogy a sejt saját citoplazmájának egy részét lebontsák, amelyre többnyire akkor kerül sor, ha a sejt kedvezôtlen körülmények közé kerül. Ehhez arra van szükség, hogy a lebontásra kerülô citoplazmarészlet köré határoló membrán alakuljon ki. Ezt a membránnal körülvett részletet (autofagoszóma) a lizoszóma már idegenként ismeri fel, és a továbbiakban ugyanúgy kezeli, mint a kívülrôl felvett anyagot tartalmazó fagoszómát, tehát fuzionál vele és lebontja (autofágia). A fagocitózisra specializálódott sejtek a lizoszómák segítségével a soksejtû szervezetben fontos feladatokat látnak el. Az intracelluláris emésztés révén megtisztítják a környezetet az elöregedett sejtektôl és az elhalt sejtek maradványaitól, fontos szerepük van az antibakteriális védekezésben, részben a baktériumok elölésével, részben a félig lebontott molekuladaraboknak a sejtfelszínre juttatásával és azoknak az immunsejtek számára való bemutatásával. Ezen túlmenôen bizonyos sejtekben a lizoszómák bontó tevékenységükkel biológiailag aktív molekulákat (tiroxint a tireoglobulinból, koleszterint az LDL-részecskékbôl) tárnak fel.

1.3.1.2.7. Peroxiszóma A lizoszómákkal azonos méretû vagy némileg kisebb sejtorganellumok, amelyek morfológiailag is hasonlítanak a lizoszómákra (1/17. ábra). Membránnal határolt képletek, szemcsés szerkezetû, néha kristályt is tartalmazó beltartalommal. A hasonlóság abban is megmutatkozik, hogy a szemcsés szerkezet enzimeknek felel meg, ezek azonban teljesen különböznek a lizoszomális enzimektôl és túlnyomórészt oxidatív folyamatokat katalizálnak. Az egyik jellegzetes enzime a peroxidáz, amelynek eredményeként a szubsztrátmolekula oxidálódik, és melléktermékként hidrogénperoxid keletkezik. A másik jellegzetes enzim a


AZ ÉLÔ SZERVEZETEK ALAPVETÔ KATEGÓRIÁI: PRO- ÉS EUKARIÓTASEJTEK glikogénszemcsék

mitokondrium peroxiszóma

fehérjekristály

kataláz, amely az erôsen mérgezô hidrogén-peroxidot tovább bontja vízre és oxigénre. Biztos azonosításuk is ezeknek az enzimeknek enzim- vagy immuncitokémiai kimutatásán alapszik. Jelentôségük még ma sem ismert eléggé. Részt vesznek többek között zsírsavak oxidatív lebontásában, alkohol oxidációjában, hiányuk végzetes lehet a szervezetre. Különbözô sejttípusokban különbözô gyakorisággal fordulnak elô, leggyakrabban máj- és vesehámsejtekben találhatjuk meg ôket. A bennük jelenlévô enzimek és az általuk katalizált folyamatok alapján egyesek úgy vélik, hogy az ôsi eukarióta sejt méregtelenítô organellumáról lehet szó.

1.3.1.2.8. Mitokondrium A sejt számos energiaigényes feladatot (bioszintetikus, ozmotikus, mechanikai munka) lát el, amelyhez a szükséges energiát a környezetbôl felvett tápanyagok tartalmazzák. Az energiának a tápanyagokból a sejt számára használható formában való való kinyerése bonyolult folyamat, ezért a sejt arra rendezkedett be, hogy az így kinyert energiát egy könnyen felhasználható formában tárolja. Az energiatároló molekula (a folyamatok többségében) az adenozin-trifoszfát (ATP), ahol az utolsó két foszfátcsoport kötése energiában gazdag. Az utolsó foszfátcsoport leválasztása (ATP-hasítás) felhasználható energiát szabadít fel, míg rákötése (ATP-

1/17. ábra. Peroxiszómák májsejtben. A peroxiszómát egyszerû membrán határolja, belsejét finoman szemcsés anyag tölti ki, amelybe itt sötét fehérjekristály (urát-oxidáz) van beágyazva. A peroxiszómák felületes megtekintésre összetéveszthetôk a mitokondriumokkal, a mitokondriumok azonban általában nagyobbak, kettôs membrán határolja ôket, és a mátrixtérben kriszták vehetôk ki. Elektronmikroszkópos felvétel májsejtjbôl (17 500x, Röhlich P. felv.).

szintézis) energiát tárol. Ezáltal az ATP a legtöbb energiaigényes munkához felhasználható „akkumulátorként” mûködik, melyet újra és újra fel kell tölteni energiával. Ezt a feladatot a sejtben egy igen fontos organellum, a mitokondrium látja el. A mitokondriumok többnyire pálcika alakú organellumok, melyek vastagsága néhány tized µm, hossza akár több µm is lehet (1/18. ábra). Ez a méret a mitokondriumokat már a fénymikroszkópban is láthatóvá teszi, belsô, finomabb szerkezetüket azonban csak az elektronmikroszkóp tudta feltárni. A mitokondriumot két, párhuzamosan elrendezôdô membrán és az általuk közrezárt terek építik fel. A két membrán közül a mitokondrium specifikus funkciójához az ún. belsô membrán az elengedhetetlen, amely lényeges felületnagyobbításon is keresztülesik azáltal, hogy lemezszerûen több helyen betüremkedik (mitokondriális kriszták formájában) az általa bezárt térbe. Az utóbbit, az ôt kitöltô sötét, szemcsés szerkezetû anyag (mátrix) után mátrixtérnek nevezzük, míg a két membrán közötti lapos rést intermembranális térnek hívjuk. Ettôl az általános sémától morfológiai eltérések elôfordulhatnak, pl. egyes sejtekben a belsô membrán nem lapos redôk, hanem csövek formájában türemkedik be (ún. tubuláris szerkezetû mitokondriumok), a mitokondrium alakja nem pálcikaszerû, hanem gömbölyû (pl. egyes májsejtek esetében), a mitokondrium elágazódhat stb. Számuk a néhánytól több ezerig terjedhet egyetlen

51


52


tubulus

kriszta

mátrix-tér

A

B belsô membrán

külsô membrán

1/18. ábra. Két különbözô típusú mitokondrium elektronmikroszkópos felvétele (Röhlich P. felv.). A) A belsô mitokondriummembrán lemezszerû kettôzeteket bocsát a mitokondrium belsejébe (kriszta típusú mitokondrium, 60 000x). B) A belsô membrán finom csövecskék formájában nyúlik bele a mitokondrium belsejébe (tubulus típusú mitokondrium, mellékvese kéregállományából, 33 000x)

sejtben, többnyire a sejt energiaigényének megfelelôen Egyes sejttípusokban az energiafelhasználás helyéhez közel rendezôdnek (pl. a spermium mitokondriális hüvelye, vesehámsejtek ún. bazális csíkolata formájában). A mitokondriumban lezajló folyamatoknak az ADP-bôl és foszfátból való ATP-szintézis csupán legvégsô, bár egyben legfontosabb mozzanata. Ezt azonban egy sor fontos elôkészítô lépés elôzi meg, amelyek során a tápanyagokból az energia felszabadul, majd tárolódik. A citoszolban indul meg a glikogén és a zsír lebontása cukrokká, ill. zsírsavakká. A cukorbontás (glikolízis) végén három szénatomos molekula, a piruvát (piroszôlôsav) keletkezik, mely a zsírsavakkal együtt a két mitokondriális membránon keresztül belép a mitokondrium belsejébe. A kétféle molekula oxidációs folyamatok révén két szénatomos ecetsavvá bontódik tovább, amely bekerül az

ugyancsak oxidációs folyamatokból álló ún. citrátkörbe. Az oxidációk révén a szénatomok széndioxiddá égnek el (melléktermék), ami azonban fontosabb, a szénatomokról a hidrogénatomokat hidrogénszállító molekulák (NAD, FAD) viszik a belsô mitokondriummembránhoz. Ezután következik az energia tárolása a mitokondriummembránba épített ún. elektrontranszportlánc közremûködésével. A lánc egymás után kapcsolt fehérjekomplexekbôl áll, amelyek közül az elsô a hidrogént protonra és elektronra bontja. A nagy energiájú elektront egyik komplex továbbadja a másiknak, miközben az elektron energiájának egy részét arra használja fel, hogy a membránon protont pumpáljon ki. A lánc végén az elektron végsô akceptora az oxigén, amely protonokkal együtt (melléktermékként) vizet képez. A protonpumpálás következtében a membrán külsô oldalán lényegesen több proton gyûlik össze, mint a belsô oldalon,



és ez a protongrádiens potenciális energiaraktárként szerepel. A grádiens olyan víztoronyhoz hasonlítható, ahová energiával vizet szivattyúzunk fel, és ahonnan a vizet leeresztve ismét mozgási energiához jutunk (pl. egy turbinát hajthatunk). Ugyanígy a protonoknak a membránon keresztül való ellenôrzött visszaengedésével ebbôl az energiaraktárból energia szabadítható fel, ami felhasználható az ATP-szintézishez. Ez az utolsó lépés olyan, a membránba épített fehérjekomplexen keresztül megy végbe, amelyen ioncsatorna vezet keresztül, és amely egyben adenozin-difoszfátból és foszfátból a felszabadult energia segítségével adenozin-trifoszfátot szintetizál (ATP-szintetáz). Az elektrontranszportlánc, az általa létrehozott protongrádiens és az ATP-szintézis egyaránt azt igényli, hogy a belsô mitokondriummembrán erôsen impermeábilis legyen, és rajta csak ellenôrzött módon jussanak ionok, molekulák keresztül. Mitokondriális transzporterek felelôsek azért, hogy a piruvát, a zsírsavak, az ADP, a foszfát bejussanak, míg a kész ATP kijusson a mitokondriumból. A belsô membránnal ellentétben a mitokondrium külsô membránja nem jelent komoly diffúziós gátat, mert a külsô membránba csatornafehérjék (mitokondriális porinok) vannak beépítve, amelyek egy bizonyos molekulatömegig mindent átengednek. Ha meghúzzuk a mitokondriális folyamatok végsô egyenlegét, akkor azt mondhatjuk, hogy a mitokondrium szerves molekulákat használ fel, ezek oxidációjával (oxigénigény!) széndioxidot és vizet képez, a felszabaduló energiát pedig az ATP-be építi be. Pontosan az ellenkezôje zajlik ezzel szemben a növényi kloroplasztiszban: a növény a nap energiájának a felhasználásával széndioxidból és vízbôl szerves anyagokat szintetizál, miközben melléktermékként oxigén keletkezik. Meglepô felfedezés volt, amikor a mitokondrium-mátrix terében DNS, tRNS és riboszómák jelenlétét írták le, ami arra utal, hogy ennek az organellumnak saját genetikai információja és génexpressziós rendszere van. Kiderült azonban, hogy ez csak a mitokondriális proteinek mindössze kb. 5%-át állítja elô, míg a maradék 95%-ot illetôleg a mitokondrium a sejtmag DNS-ének és

génexpressziós rendszerének a függvénye. A citoplazmában szintetizált fehérjék mitokondriális lokalizációs jellel rendelkeznek, és ennek segítségével ismerik fel a mitokondriumot, majd jutnak át a két membránon vagy maradnak az egyik, ill. másik membránban. A mitokondrium tehát csak részben független a sejttôl, amelyre nagyrészt rá van utalva, és ezért önálló életre képtelen (szemiautonóm organellum). A saját DNS és expressziós rendszer felvetette annak a gyanúját, hogy a mitokondrium az eukarióta sejt evolúciója során kívülrôl felvett prokarióta sejt volt. Valóban, a mitokondrium molekuláris összetevôi között számos olyan vonás van, amely a prokariótákra jellemzô. Ezért ma már egyre elfogadottabbá válik az a nézet, hogy a mitokondrium valaha prokarióta sejt lehetett, amelynek DNS-állománya nagyrészt integrálódott a gazdasejt nukleáris DNS-ébe, és így sejten belüli szimbiózis jött létre (endoszimbiózis-elmélet).

1.3.1.2.9. Sejtváz (citoszkeleton) Az eukarióta sejtekben vékony fonálszerû struktúrákból álló belsô támaszték van (1/19-21. ábra), amelyet sejtváznak vagy citoszkeletonnak

mikrotubulusok

intermedier

mikrofilamentum-

filamentuok

köteg

1/19. ábra. A sejtváz (citoszkeleton) elemei. Elektronmikroszkópos felvétel fibroblasztsejtbôl (23 200x, Röhlich P. felv.).

53


54

BEVEZETÉS A SEJTBIOLÓGIÁBA sejtmag

MTOC

mikrotubulusok

1/20. ábra. A citocentrum. A két centriolum finoman szemcsés állományba (MTOC) van beágyazva, amelybôl mikrotubulusok sugárzanak ki minden irányba. Elektronmikroszkópos felvétel fibroblasztsejtbôl (19 900x, Röhlich P. felv.).

centriolum

sejtmag

keresztmetszete

1/21. ábra. Centriolum keresztmetszetben. Figyeljük meg a 9x3 elrendezôdést. Elektronmikroszkópos felvétel thymus-limfocitából (46 000x, Röhlich P. felv.).

nevezünk. Ez a váz biztosítja a sejt mechanikai ellenálló-képességét, stabilizálja jellegzetes formájú

sejtekben a sejt alakját, de módot ad arra is, hogy a sejt változtassa az alakját, mozogjon, összehúzódjék, a sejten belül aktív mozgások jöjjenek létre. A fehérjetermészetû fonalak három csoportba oszthatók, ezek a mikrotubulusok, mikrofilamentumok és az intermedier filamentumok. A felosztás eredetileg elektronmikroszkópos megjelenésük alapján készült: a mikrotubulusok csôszerû struktúrák 25 nm-es vastagsággal, a mikrofilamentumok vékony (5-7 nm vastagságú) fonalak, míg az intermedier filamentumok szintén fonálszerû struktúrák, amelyek vastagsága (10 nm) az elôbbi kettô közé esik, innen nyerték az intermedier nevet. Az eltérô morfológiához eltérô fehérjetípus és molekuláris szerkezet is tartozik. A háromféle sejtvázkomponens tulajdonságait összehasonlítva a legtöbb hasonlóságot a mikrotubulusok és mikrofilamentumok között találjuk. Mindkettô esetében a csô- vagy fonálszerû elemek globuláris fehérjék (monomerek) összerendezôdésébôl jönnek létre (polimerizáció), az így létrejött struktúrák azonban újra széteshetnek építôelemeikre (depolimerizáció), tehát ezek a sejtvázkomponensek dinamikus struktúrák. Mivel a polimerizáció és depolimerizáció lényeges következményekkel jár, ezek pontos szabályozása rendkívül fontos, ami egy sor járulékos fehérjének köszönhetô (mikrotubulushoz, ill. mikrofilamentumhoz társult fehérjék). Egy további fontos hasonlóság a kétféle elem között, hogy azokhoz motorfehérjék társulhatnak: pl. a mikrofilamentumokhoz a különbözô miozinok, míg a mikrotubulusokhoz a dineinek és kinezinek. E fehérjék jellegzetessége az, hogy ATP-hasításból származó energia felhasználásával alakváltozáson esnek keresztül, és ezzel két fix struktúra között elmozdulást tesznek lehetôvé. Ennek az elvnek alapján mozognak a sejtfelszín csillói, halad elôre a spermium az ostor csapkodó mozgásai révén, húzódik össze az izomsejt, jutnak el anyagok a sejt legtávolabbi részébe az intracelluláris transzport révén, osztódik ketté a citoplazma a sejtosztódás végén stb. Mind a mikrotubuláris, mind a mikrofilamentáris rendszer ôsi képzôdmény, az ôket felépítô fehérjék keveset változtak az evolúció folyamán (konzervatív fehérjék).



Az intermedier filamentumok ezzel szemben filamentózus fehérjék kötegekbe rendezôdésébôl jönnek létre, csak ritkán bontódnak le, motor fehérjékkel nem társulnak, és ezzel a sejtváz tisztán mechanikai támasztékot jelentô stabil elemei. Az evolúció során jelentôsen változtak, sôt egyes sejttípusokra jellemzô változatai is kialakultak.

1.3.1.2.9.1. Mikrotubulusok

A mikrotubulusok (25 nm átmérôjû, nem elágazó csôszerû struktúrák) a tubulinfehérjébôl épülnek fel. A gobuláris fehérje egymástól kissé eltérô formában (α- és β-tubulin) fordul elô, melyek egymással heterodimert képeznek, ez alkotja a mikrotubulus alapegységét. A dimerek egymás végéhez kapcsolódva hosszú láncokat (protofilamentumokat) hoznak létre, 13 db ilyen protofilamentum pedig egy hengerpalást mentén egymáshoz párhuzamosan kapcsolódva hozza létre a mikrotubulust. A mikrotubulusok labilis, az egyik végükön könnyen lebomló képzôdmények, stabilizálásukhoz kémiai módosítások és speciális fehérjék (mikrotubulushoz asszociált proteinek: MAPok) járulnak hozzá, le- és felépülésüket kalciumés magnéziumionok és GTP szabályozzák. A mikrotubulusok párhuzamosan rendezôdve valódi vázszerû struktúrát hozhatnak létre, amely stabilizálja a sejt alakját. Ha mikrotubulusokat ún. mikrotubulusmérgekkel lebontjuk, a sejt elveszti az eredeti alakját, legömbölyödik. A mikrotubulusok egyik funkciója tehát az alaktartás. Fontosabb ennél azonban, hogy a mikrotubulusok a citoplazmában olyan „pályákat” képeznek, amelyek mentén a motorproteinek anyagokat, vezikulákat, esetleg organellumokat mozgatnak. A motorfehérjék egyik végükön a szállítandó rakományhoz tapadnak, másik, mozgékony végükkel pedig a mikrotubulus mentén vándorolnak, mindezt természetesen ATP-hasításból származó energia segítségével. A mikrotubulusok további fontos szerepe, hogy komplex struktúrákat, organellumokat hoznak létre, ilyenek a centriolumok, a csillók és az ostorok, ill. az utóbbiak ún. bazális testje. A cent-

riolum a sejt közepén, a sejtmag mellett elhelyezkedô organellum, a citocentrum (sejtközpont) központjában elhelyezkedô hengerded testecske, amely 9 db, körben rendezôdô mikrotubulustripletbôl áll (l. 1/20-21. ábra). Többnyire két centriolum található a citocentrum közepén egymás mellett (diploszóma), mégpedig egymásra merôleges állásban. A centriolum kialakulása, sejtbiológiai szerepe még ma sem tisztázott. Az azonban biztos, hogy az ôt körülvevô és γ-tubulint tartalmazó ún. pericentrioláris állomány a citoplazmatikus mikrotubulusok kiindulóhelye (mikrotubulusorganizáló centrum, MTOC), ahonnan egyre hosszabbra nôve a sejt széli része felé sugárzanak szét. Különösen feltûnô ez a jelenség a sejtosztódásban, amikor az osztódási orsó létrejöttekor a mikrotubulusok a sejt két pólusán elhelyezkedô citocentrumokból sugárzanak ki. Úgy tûnik, hogy a citocentrumnak a mikrotubulusorganizáló funkciójához a centriolum nem okvetlenül szükséges, mert egyes növényi sejtekben a centriolum hiányzik, mikrotubulusorganizáló centrum mégis létezik – ehhez a pericentrioláris anyag elegendônek látszik. A mikrotubulusokból felépülô másik komplex struktúra a csilló (cilium, kinocilium (1/22. ábra), valamint a hozzá hasonló szerkezetû, de hosszabb ostor (flagellum). Ezek egyes sejttípusok felszínérôl kinyúló, hengeres nyúlványok, amelyek jellegzetes csapkodó vagy kígyózó mozgást végeznek. A mozgás hátterében a mikrotubulusok és a hozzájuk társuló dinein motor molekulák állnak. Elektronmikroszkópban a csilló (és az ostor) keresztmetszetén körben kilenc mikrotubuluspár keresztmetszete látható, míg középen szintén két mikrotubulus helyezkedik el (9x2+2 mintázat). A mikrotubuluspárok közötti résben dineinkomplexek („dineinkarok”) találhatók, ezek talpa az egyik mikrotubulushoz tapad, míg mozgékony feji része a szomszédos mikrotubulust mozdítja el hosszanti irányban. A két szomszédos mikrotubuluspár így elcsúszik egymás mellett, ami a csilló meggörbüléséhez vezet. Ehhez a mechanikai munkához természetesen ATP-hasításból származó energia is szükséges. A csillót kívülrôl sejtmembrán borítja be, tövénél pedig a centriolum-

55


56


sejtmembrán középsô két mikrotubulus

dineinkar

perifériás

1/22. ábra. Csillók keresztmetszeti képe. Egy-egy csillón belül jól látszik a középsô két mikrotubulus, a sugaras „küllôk”, a 9 széli mikrotubuluspár, egyik oldalukon a dineinkarokkal. A csillót a sejtmembrán borítja be. Elektronmikroszkópos felvétel (122 000x, Röhlich P. felv.).

mikrotubuluspár

„küllô˝

mal azonos szerkezetû testecske, az ún. bazális test található. A csilló és az ostor által keltett mozgás kétféleképpen hasznosul, aszerint, hogy a sejt szabadon mozog vagy rögzített. Szabad sejt esetében a csilló az elôremozgást szolgálja (pl. csillós és ostoros egysejtûek, spermiumok), míg egy hámrétegbe épített csillós sejt a hámréteg felszínét borító folyadék áramlását biztosítja (a légcsô és a petevezeték csillós hámja).

1.3.1.2.9.2. Mikrofilamentumok

Az 5-7 nm vastag mikrofilamentumok globuláris fehérjébôl, az aktinmolekulából (G-aktin) épülnek fel úgy, hogy azok egymás végéhez kapcsolódva hosszú láncot alkotnak (F-aktin). Két ilyen lánc egymás körül csavarodva alkot egy mikrofilamentumot. Aktin-mikrofilamentumok jelentôs mennyiségben vannak a citoplazmában, és gyakran alkotnak kötegeket vagy sûrû szövedéket. Az utóbbit szinte rendszeresen megtalálhatjuk a sejtek széli, sejtmembrán alatti zónájában (sejtkortex), ahol a sejtmembránnak ad támasztékot, mechanikai ellenállóképességet. Az aktinmikrofilamentumok szövedéke a citoplazmát viszkózussá teszi (a kolloidikai gél-álla-

pothoz hasonló állapotúvá), míg a filamentumok gyors lebomlása, depolimerizációja a citoplazma folyékonyabbá válását idézi elô (szol-állapot). Így a citoplazma konzisztenciája nagymértékben függ az aktin polimerizációjától vagy depolimerizációjától. A mikrofilamentumok felépülésében és lebomlásában, a mikrofilamentum-szövedékek, -kötegek stabilizációjában, a membránhoz kötésében egy sor fehérje játszik szerepet (aktinhoz társult fehérjék). Tekintve hogy a szol–gél átalakulás adott jelekre helyileg is létre tud jönni a citoplazmában, miáltal egyes területek viszkózusabbá, mások folyósabbá válnak, a sejt alakját tudja változtatni, és a citoplazmában áramlások jöhetnek létre. Egy felszínhez letapadt sejt helyváltoztatásában, kúszó, vándorló mozgásában (amôboid mozgás) ez a lokális szol–gél átalakulás lényeges szerepet játszhat. A mikrofilamentumoknak e dinamikus sajátságai mellett fontos formakonzerváló szerepük is van. Tipikus példái ennek a sok sejt felszínérôl kiálló, pálcikaszerû nyúlványok, az ún. mikrobolyhok (1/23. ábra). Egy-egy ilyen mikroboholy vázát 30-40 mikrofilamentumból álló köteg képezi, amelyben a filamentumokat keresztkötô fehérjék rögzítik egymáshoz és a mikroboholy felszínét képezô sejtmembránhoz. A párhuzamosan álló, me-



1/23. ábra. Mikrobolyhok keresztmetszetben. A mikrobolyhokat sejtmembrán borítja, belsejükben 8-10 mikrofilamentum pontszerû keresztmetszeteit látjuk. Elektronmikroszkópos felvétel vékonybélhámsejt kefeszegélyébôl (57 500x, Röhlich P. felv.).

rev mikrobolyhok rendszere a sejtmembrán felszínét jelentékenyen (10-20-szorosára) megnövelheti, ami olyan sejttípusokban jelentôs, ahol a membránba fontos enzimek vagy transzportfehérjék vannak beépítve (a vékonybél hámja, proximális vesetubulus hámja). A sejt szabad felszínét ilyenkor a mikrobolyhok százai-ezrei boríthatják igen szabályos rendszert alkotva, ahol a mikrobolyhok a kefe szôrszálaihoz hasonlóan sûrûn egymás mellett helyezkednek el („kefeszegély”). A mikroboholyhoz hasonlóan épülnek fel, de annál nagyobbak az ún. sztereociliumok (nem mozgékony nyúlványok!), ezeket fôként egyes érzéksejtek szabad felszínén találjuk meg (a halló- és egyensúlyozó-szerv szôrsejtjei, ízlelôbimbók érzéksejtjei). Az aktinmikrofilamentumoknak azonban nemcsak formatartó, vázszerû funkciójuk van, hanem a filamentumok a sejtek dinamikus, aktív mozgásfolyamataiban is igen jelentôs szerepet játszanak. Az aktinhoz ugyanis mozgató (motor-) fehérje, a miozin kötôdhet, ami energiafüggô alakváltozásával elmozdulásokat tesz lehetôvé. A miozinnak különbözô hosszúságú farki és mozgékony feji része van, mely utóbbi az aktin-mikrofilamentumhoz tud kötôdni. A feji rész konformációváltozással begörbül, és a mikrofilamentumot

ezzel kissé elcsúsztatja. Majd ATP kötésével a feji rész leválik az aktinról, ATP-hasításra kissé kiegyenesedik, és újra a mikrofilamentumhoz kötôdik, miáltal a ciklus újrakezdôdik. A miozin és aktin egymáshoz viszonyított elmozdulását a sejtek kétféleképen hasznosítják. Az egyik lehetôség az, mikor a mikrofilamentum rögzített és a miozin a mozgékony: ilyenkor ATP jelenlétében a miozin vándorol az aktinmikrofilamentum, mint pálya mentén. Amennyiben a miozin más, mozgatható képlet (pl. vezikulák) felszínéhez kötôdik, a miozin (V. tip. miozin) ugyanúgy részt vehet ezek intracelluláris szállításában, mint ahogy azt a mikrotubulusok és a hozzájuk tartozó motor molekulák (dinein, kinezin) esetében láttuk. A másik lehetôség, amikor a miozin-molekulák (II. tip. miozin) hosszú, farki részük révén asszociálódnak, és hosszan megnyúlt, virágcsokorszerû kötegeket alkotnak. Két ilyen köteg szimmetrikus összekapcsolódásával jönnek létre az izomsejt ún. vastag (miozin-) filamentumai. Az utóbbiak, az aktinmikrofilamentumok között elhelyezkedve (a miozinfejek begörbülésével) az aktinmikrofilamentum-rendszert a vastag filamentumokhoz képest elcsúsztatják, és így a két filamentumfélébôl álló együttes köteg megrövidül (kontrakció). Az így létrejövô kontrakciós rendszer a legnagyobb fejlettséget a harántcsíkolt izomban éri el, ott is fedezték fel, majd tanulmányozták a legrészletesebben, azonban nem izomsejtekben is elôfordul, természetesen sokkal egyszerûbb formában. Ennek egyik tipikus példája az állati sejtek osztódásának utolsó fázisában kialakuló ún. kontrakciós gyûrû. Ez az aktinmikrofilamentumokból és miozinból álló köteg körkörös gyûrût képez a sejtmembrán alatt, majd fokozatosan rövidülve kettéválasztja a citoplazmát. 1.3.1.2.9.3. Intermedier filamentumok

A 10 nm vastag intermedier filamentumok (1/24. ábra) fibrózus fehérjemolekulák egymás mellé és egymás végeihez való illeszkedésébôl jönnek létre. Kifejezetten mechanikai szerepük van, sejtek alakját stabilizálják, vagy a sejteknek

57


58


1.3.1.3. A növényi sejt specifikumai Az elôbbiekben az eukarióta sejt jellegzetességeit egy állati sejt példáján mutattuk be. A növényi sejt felépítése alapjaiban hasonló az állati sejtéhez, mégis néhány jellegzetes különbséget mutat (1/25. ábra). A legfontosabb különbség a sejt energiaforgalmában rejlik, mert a növény a nap energiáját hasznosítja, és épít fel ezzel széndioxidból és vízbôl szerves anyagokat (fôként szénhidrátokat) egy speciális organellumban, a kloroplasztiszban. Ugyanakkor rendelkezik az állati sejt lehetôségeivel is, mert szerves anyagokat lebontva a mitokondriumokban ATP-t tud szintetizálni. sejtmag

intermedier

mitokondrium

filamentumok

1/24. ábra. Intermedier filamentumokból álló köteg. Elektronmikroszkópos felvétel makrofág sejtbôl (18 800x, Röhlich P. felv.).

nagy mechanikai ellenállóképességet adnak. Különbözô sejttípusokban ugyanannak a molekulacsaládnak különbözô változatait találjuk meg. Így pl. a mechanikai hatásoknak leginkább kitett bôrhám sejtjei nagy mennyiségben tartalmazzák az itt keratinfehérjékbôl álló intermedier filamentumokat, az idegsejtekben a neurofilamentumfehérjébôl álló intermedier filamentumok biztosítják a sejt nyúlványos alakjának a megôrzését, az idegrendszer támasztósejtjeiként ismert gliasejtekben ugyanezt a feladatot egy másik fehérjébôl (GFAP) felépülô intermedier filamentumrendszer látja el. Az intermedier filamentumok egy fajtája azonban minden sejtféleségben megtalálható, mégpedig a sejtmagot körülvevô maghártyának a mag belseje felé esô oldalán. Itt a laminfehérjékbôl felépülô intermedier filamentumok egy vékony rostos réteget (nukleáris lamina) alkotnak, amely a maghártya rugalmas mechanikai ellenállóképességét biztosítja.

A kloroplasztisz a mitokondriumhoz bizonyos mértékig hasonló szerkezetû, de annál jóval nagyobb sejtorganellum, melynek fô feladata szerves molekulák szintézise a fény energiájának felhasználásával (fotoszintézis). Hasonlóan a mitokondriumhoz, a kloroplasztiszt is két membrán határolja. Ezek közül a külsô membrán könnyen átjárható számos anyag számára, a belsô membrán ezzel szemben gátat képez a szabad diffúzióval szemben, és rajta csak ellenôrzötten (transzportmolekulák segítségével) juthatnak át kiválasztott anyagok. A belsô membrán a mitokondrium mátrixához hasonlóan egy sztrómának nevezett anyagot határol körbe, ez különbözô enzimeket, a plasztisz saját génexpressziós rendszerének egyes elemeit (DNS, tRNS, riboszómák), valamint a plasztisz által szintetizált anyagokat, elsôsorban keményítôt tartalmaz. Ezenkívül a sztrómába beágyazva lelapult zsákok, ún. tilakoidok találhatók, melyek áthúzódhatnak az egész sztrómán, helyenként pedig korongokat alkotva pénztekercsszerûen egymásra rendezôdnek (ún. granumok, tsz.: grana). A tilakoidok belsô tere (tilakoidtér) nem közlekedik a kloroplasztisz külsô és belsô membránja közötti térrel (intermembranális tér), viszont az egyes tilakoidok belsô tere egymással igen. A tilakoidmembrán igen fontos a kloroplasztisz mûködésében, mert ez tartalmazza a fotoszintézist lebonyolító molekuláris mechanizmus számos elemét.



1/25. ábra. Magasabb rendû növényi sejt, vázlat.

A kloroplasztiszban lezajló folyamatokat úgy összegezhetjük, hogy fényenergia felhasználásával vízbôl és szén-dioxidból szénhidrátok szintetizálódnak, ennek során melléktermékként oxigén keletkezik. Ez a folyamat sok tekintetben a mitokondriumban lezajló történések fordítottjaként fogható fel. Lényegében két részre bontható. Az elsô rész hasznosítja a fény energiáját víz felhasználásával, ennek során a szénhidrátok késôbbi (a sötétszakaszban lezajló) szintéziséhez szükséges ATP (energia) és NADPH (redukáló erô) termelôdik. Ezen ún. fényszakaszhoz tehát fényenergia szükséges, amelynek hasznosítását két, klorofillt és fehérjéket tartalmazó komplex (fotoszisztéma I és II) végzi. A foton által a fotoszisztéma II klorofilljából kiütött nagy energiájú elektron egy (a tilakoidmembránba épített) elektrontranszport-láncon vezetôdik keresztül, és

protongrádiens létrehozásával ugyanolyan mechanizmuson át vezet ATP-szintézishez, mint a mitokondriumban. A klorofillból kiütött elektron helyét a vízmolekula bontásából származó elektron foglalja el (2H2O → 4e– + 4 H+ + O2). Az elektrontranszport-lánc végén a csökkent energiájú elektron bevezetôdik a fotoszisztéma I be, ahol egy másik foton abszorpciójával a klorofillból kiütött nagy energiájú elektron helyére esik be. A nagy energiaszintre emelt elektron energiáját egy enzim, a NADP-reduktáz használja fel arra, hogy proton segítségéval H keletkezzék és az a H-transzporter NADP-molekulára kötôdjék (NADPH). A fényszakasz végterméke tehát ATP, NADPH és oxigén. A fotoszintézis második részéhez már nem kell fény (sötétszakasz). Ez a széndioxid-asszimiláció folyamata, melynek során széndioxidból és vízbôl,

59


60


a fényszakasz folyamán termelôdött energia (ATP) és redukáló erô (NADPH) felhasználásával 3 C-atomos szénhidrát-molekula, a glicerinaldehid-3-foszfát jön létre. A széndioxid ciklusosan egy anyagcserekör mentén (Calvin-kör) asszimilálódik, ahol kiindulásként egy 5 C-atomos molekula, a ribulóz-1,5-biszfoszfát szerepel. A glicerinaldehid-3-foszfát a növényi szénhidrát-anyagcsere központi molekulája, amelybôl még a kloroplasztiszon belül, a sztrómában különbözô cukrok keletkeznek. A keletkezô glukóz keményítôvé polimerizálódik, és akkora tömeget érhet el, hogy a sztromában mint keményítôszemcse fény- és elektronmikroszkóposan is láthatóvá válik. A növényi sejt szívesen használja transzportcukorként a glukózból és fruktózból álló diszacharidot, a szacharózt is, és exportálja fotoszintézissel nem rendelkezô sejteknek. A glicerinaldehid-3-foszfát visszacsatolódhat még a Calvin-körbe vagy átalakulhat piruváttá, amikor is a mitokondriumban az ATP-szintézist táplálja. Itt jegyzendô meg, hogy a növényi sejt az energiaigényes folyamatokhoz nem a fényszakasz során termelôdött ATP-t használja fel, hanem az ATP-t az állati sejthez hasonlóan a mitokondriális ATP-szintézisbôl nyeri (amihez természetesen oxigént használ fel). Végül a fotoszintézis révén termelt szénhidrátot a sejt kiindulópontként használja egyéb molekulák (zsírsavak, aminosavak stb.) szintéziséhez is. A kloroplasztisz a fenti szerkezeti és bizonyos mértékû funkcionális hasonlóságok mellett abban is hasonlít a mitokondriumhoz, hogy saját génexpressziós rendszere van. A sztrómában található gyûrû alakú DNS a kloroplasztisz saját fehérjéinek kb. 30%-át kódolja, ezek az ugyancsak itt található tRNS-ek és riboszómák segítségével a kloroplasztisz belsejében szintetizálódnak. Az összes többi fehérjét a sejtmagban lévô DNS kódolja, és ezek a citoszolban szintetizált fehérjék a rajtuk lévô lokalizációs jel segítségével másodlagosan jutnak be a kloroplasztiszba. A mitokondriumhoz hasonlóan a kloroplasztisz esetében is feltételezhetô, hogy az evolúció során a plasztisz a sejtbe felvett és azzal szimbiózisba lépett prokarióta sejtbôl származik, ami ebben az esetben valószínûleg egy fotoszintetizáló cianobaktérium volt.

A kloroplasztiszon kívül a növényi sejt egyéb jellegzetességeket is mutat. Az egyik ezek közül a sejtet körülvevô merev sejtfal. Anyagát maga a sejt termeli és választja ki maga köré. A sejtfal nagy részét cellulózrostok képezik, melyek egy poliszacharidból és fehérjékbôl álló alapanyagba vannak beágyazva. A merev falból álló kamra biztosítja a sejt alakját, védi a sejtet a mechanikai hatásoktól és az ozmotikus duzzadástól. Ez a kamra volt az, amit Robert Hooke a XVII. sz.-ban egyszerû mikroszkópjával felfedezett, ennek alapján nevezte ezt el cellának, amelyrôl a sejt késôbb a nevét kapta. A növényi sejtet jellemzi még a sejt közepén található, membránnal határolt üreg, az ún. centrális vakuólum. A benne uralkodó savi pH és a lizoszomális enzimek jelenléte miatt a növényi sejt lizoszómájának is tekinthetjük, egyben azonban a növényi sejt „lerakóhelye” is, ahol sók, az anyagcsere melléktermékei és egyéb anyagok tárolódnak. A növényi sejt peroxiszómái különleges feladatokat láthatnak el, ilyen a kloroplasztiszban lezajló szénasszimiláció egyik melléktermékének a feldolgozása vagy a csírázás alatt a mag zsírtartalékainak átalakítása cukorrá. Növényi sejtek, az ôket körülvevô sejtfal miatt nem érintkezhetnek közvetlenül egymással, mint az az állati sejteknél gyakran megszokott. Magasabb rendû növényekben a kapcsolatot a szomszédos sejtek között a sejtfalon keresztülfúródó citoplazmahidak (plazmodezmák) tartják fenn, melyek révén a két sejt citoplazmája folytonos kapcsolatban áll egymással.

1.3.1.4. Az egysejtû eukarióták specifikumai Olyan eukarióta sejtek, amelyek nem szervezôdnek soksejtes szervezetekbe, hanem önálló életre képesek. Életben maradásukhoz különbözô stratégiákat használnak, ami a sejt felépítésében is sokszor tükrözôdik. Itt csupán két képviselôjüket említjük meg. Az élesztôsejt az egyik legegyszerûbb eukarióta sejt, amelyet egysejtû gombának tekinthetünk.



Az ovális sejt nagysága a 6 µm-t nem haladja meg, alakját az aránylag merev sejtfal biztosítja. A sejt citoplazmája tartalmazza mindazokat az organellumokat, amelyek az eukarióta sejt mûködéséhez szükségesek, így az endoplazmatikus retikulumot, a Golgi-apparátust, a lizoszómát, a mitokondriumot, a riboszómákat stb. Szénhidrátban gazdag környezetben gyorsan szaporodnak (hasadással vagy bimbózással), számuk néhány óra alatt megkettôzôdik. Aránylag egyszerû felépítésük, gyors szaporíthatóságuk kiváló kísérleti modellé teszik ôket az alapvetô sejtbiológiai mechanizmusok felderítésére. Meglepô, hogy az élesztô funkciókieséses mutánsai segítségével felfedezett fehérjék közül milyen soknak felelnek meg pl. emlôsállatokban hasonló szerkezetû és funkciójú fehérjék. Amennyiben egy fontos élesztôfehérje génje ismertté válik, aránylag könnyû feladat molekuláris biológiai módszerekkel az emlôs- (akár emberi) sejtben a megfelelô homológ gént, majd génterméket megtalálni. Az itt megemlítendô másik egysejtû az amôba, amely az élesztôsejttel ellentétben igen nagy sejt, hossza ellapult állapotában az egy millimétert is meghaladhatja, és térfogata az élesztôsejtének akár ötezerszerese is lehet. Maga a sejtmag is óriási, több száz kromoszómával és több tucat magvacskával. Az amôba nagysága jó alkalmat nyújtott a sejtbiológusok számára, hogy mikrosebészi beavatkozásokkal (pl. a sejtmag eltávolítása) egyes sejttani mechanizmusokat tanulmányozzanak. A sejt táplálékát élô baktériumok, algák és egyéb egysejtûek fagocitózisával nyeri, ezért benne a fagocitózis és az intracelluláris emésztés különösen fejlett. Ennek érdekében a sejtmembrán külsô felszínét egy tapadós, szénhidrátokban gazdag réteg borítja, a citoplazmában pedig nagyszámú lizoszóma várakozik arra, hogy a bekebelezett táplálékot tartalmazó ún. táplálékvakuólummal fúzionáljon, és ezzel azt lebontsa. Az amôba egy másik, a fagocitózissal rokon tulajdonsága, hogy szilárd felszínhez letapadva azon vándorolni képes. Sejtnyúlványok (állábak, görögül pszeudopódiumok) kibocsátásával vándorol, amibe a citoplazma többi része fokozatosan átömlik, és ezzel a sejt a helyét változtatja. Ilyen sejtvándorlás ma-

gasabb rendû állati szervezetekben is fontos szerepet játszik (pl. makrofágok, fehérvérsejtek esetében), a mozgásnak ezt a típusát az amôbáról amôboid mozgásnak nevezték el. Az édesvizi amôba a citoplazmába jutott felesleges víztôl ún. kontraktilis vakuólum segítségével szabadul meg. A vakuólum vizet tartalmazó vezikulák összeolvadásából alakul ki, majd a vakuólum kellô nagyságot elérve fúzionál a sejthártyával, és összehúzódva kiüríti tartalmát a környezetbe.

1.3.2. Az élet peremén A legkisebb és egyben legegyszerûbb prokarióta sejtek a mikoplazmák. Átmérôjük nem több, mint 0,1 µm, tehát eléri a nagy vírusok nagyságát, és így a legtöbb baktérium-szûrôn is képesek átjutni. Burokkal nem rendelkeznek, DNS-ük kb. 700 különbözô fehérjét kódol, és ez még éppen elegendô, hogy számukra önálló létezést biztosítson. Citoplazmájukban a riboszómák számát 400-ra becsülik. Ezek az élet alsó határán élô sejtek a legkisebb létezô autonóm élô rendszerek, és így a legprimitívebb sejteknek (minimum sejt) tekinthetôk. Talajban élô szaprofiták (azaz nem élô szervezetekbôl szerzik táplálékukat), de kórokozóként tüdôgyulladást, nyálmirigy-gyulladást is okozhatnak. A vírusok és fágok valamilyen nukleinsavat (DNS vagy RNS) tartalmazó és többnyire fehérjeburokkal rendelkezô részecskék, melyekhez egyes esetekben membránburok is társulhat. Önálló életre képtelenek, mivel sem a szaporodásukhoz, sem az anyagcseréhez szükséges apparátussal nem rendelkeznek, önmagukban életjelenséget nem mutatnak. Szaporodni mégis képesek, mégpedig úgy, hogy valódi sejtekbe (fágok esetében prokariótákba, virusok esetén eukarióta sejtekbe) hatolnak be, és az ilyen ún. gazdasejt nukleinsavés fehérje-szintetizáló rendszerét használják fel önmaguk újratermelésre. A virusok és fágok tehát nem valódi sejtek, hanem csak parazita-jellegû, szemi-autonóm makromolekuláris komplexek, melyek egyes elképzelések szerint valódi sejtekbôl kiszakadva jöttek létre az evolúció során.

61


2.

A sejt legfontosabb anyagi összetevôi és alapvetô molekuláris mechanizmusai. A sejtbiológia molekuláris biológiai eszköztára. SZABÓ GÁBOR ÉS NAGY LÁSZLÓ

2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.1.3. 2.1.4. 2.1.5. 2.1.6.

A sejt legfontosabb anyagi összetevôi és alapvetô molekuláris mechanizmusai A fehérjék A sejtek energiaforgalmának kulcsszereplôje: az ATP A DNS szerkezete DNS-replikáció DNS-repair DNS → mRNS (transzkripció), mRNS → fehérje (transzláció)

2.1. A sejt legfontosabb anyagi összetevôi és alapvetô molekuláris mechanizmusai 2.1.1. A fehérjék Egy baktériumsejt fô makromolekuláris összetevôit és azok szintéziséhez szükséges kismoleku-

2.1.7. 2.1.8. 2.1.9. 2.1.10. 2.1.11. 2.2. 2.2.1. 2.2.2.

A naszcens RNS mRNS-sé érése A fehérjék poszttranszlációs módosításai és célba juttatása A génexpresszió szabályozása Általános szabályozási alapelvek A DNS heterogenitása A sejtbiológia molekuláris biológiai eszköztára Módszerek Modellélôlények

lákat mutatja a 2/1A ábra. A sejtek életmûködéseiben a legalapvetôbb szerepet a fehérjék töltik be, mint strukturális feladatokat ellátó molekulák (struktúrfehérjék) vagy mint folyamatok katalizálását végzô enzimek. Térszerkezetük kialakulása (2/1B ábra) elsôsorban az aminosavszekvencia által meghatározott (elsôdleges szerkezet). Az egydimenziós aminosavlánc, szekvenciájának megfelelôen kialakuló hidrogénhidak révén vagy helikális (ún. alfa-helikális), vagy ún. redôzött (merev, lemezszerû elemekbôl hajtogatott, „pleatedsheat”) másodlagos szerkezeti szintet alkot. Az alfa-


64 A SEJT LEGFONTOSABB ANYAGI ÖSSZETEVÔI ÉS ALAPVETÔ MOLEKULÁRIS MECHANIZMUSAI. A SEJTBIOLÓGIA MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI ESZKÖZTÁRA.

A baktériumsejt

ionok és kismolekulák (4%) foszfolipidek (2%)

30% szerves és szervelen vegyületek

a sejtet felépítô anyagok

a sejtet alkotó nagyobb egységek

cukrok

poliszaharidok

zsírsavak

zsírok/lipidek/membránok

aminosavak

fehérjék

nukleotidok

nukleinsavak

DNS (1%)

makromolekulák

RNS (6%)

NH2

70%

C

fehérjék (15%)

H2 O

N

C

HC

C

adenozin trifoszfát (ATP) O

O –

O

P

P

O

O–

CH

O O

O–

N

P

O

CH2

O H

C

H

antigének

az amjnosavakból felépülô polipeptidlánc a fehérje elsôdleges szerkezete

β-lemez

α-hélix

antigén a fehérjék másodlagos szerkezetét az aminosavak között kialakuló H-kötések hozzák létre

antigénkötô fragment

β-lemez a fehérjék harmadlagos szerkezetét az α-hélixek és β-lemezek között létrejövô kémiai hatások alakítják ki

α-hélix a fehérjék negyedleges szerkezetét több polipeptidlánc alakítja ki

antitest

2/1. ábra. A sejt legfontosabb anyagi összetevôi (A). A fehérjék szerkezete (B, C).

1’

H

H OH

B

N

O–

poliszaharidok (2%)

aminosavak

N

OH


A SEJT LEGFONTOSABB ANYAGI ÖSSZETEVÔI ÉS ALAPVETÔ MOLEKULÁRIS MECHANIZMUSAI

helikális vagy redôzött másodlagos konformációt felvett elemek együtt hozzák létre a fehérje ún. harmadlagos struktúráját. Több ilyen alegység (független polipeptidlánc) kapcsolódása révén negyedleges szerkezet jöhet létre, melynek egy példája az idegen anyagokat (antigéneket) felismerô antitest (immunoglobulin, 2/1C ábra). Az utóbbi könnyû és nehéz lánca végei által képzett felismerô hely rendkívül sokféle lehet, az antitest képzôdését kiváltó testidegen molekuláknak („antigéneknek”) megfelelôen. Az enzimatikus mûködésû fehérjék az általuk átalakítandó anyagcseretermékeket (szubsztrátokat) aktív centrumukban megkötik, és a reakciót azáltal katalizálják, hogy azt új útra terelve annak végbementeléhez szükséges aktivációs energiahegyet lecsökkentik. Ezáltal már a környezet termikus energiája is elég ahhoz, hogy a – reaktánsok számára energetikailag kedvezô, mélyebb energiaszintet eredményezô – reakció végbe is menjen. Egy enzimnek egy másik fehérje is lehet szubsztrátja, pl. foszforilálhat egy másik fehérjét, mint szubsztrátját. Az enzimmûködést befolyásolhatják kisebb szabályozó anyagok is, melyek a fehérje egy másik részén, az ún. alloszterikus kötôhelyen megkötôdve modulálják az enzim konformációs állapotát.

2.1.2. A sejtek energiaforgalmának kulcsszereplôje: az ATP Az állati (heterotróf) sejtek életmûködéseik energiaigényét táplálkozásuk során felvett szerves anyagok, elsôsorban glukóz elégetésébôl nyerik. Ez a folyamat sok, enzimek katalizálta lépésben megy végbe, mely lépések során adenozin-trifoszfát (ATP) keletkezik (l. 2/1A ábra). Az ATP végállású foszfátcsoportjának lehasadása az anyagcsere-folyamatok energiaigényével összemérhetô energiát mobilizál, ezért az ATP-t a sejt univerzális energiahordozóként használja. A cukor elégetése növényi sejtekben is hasonló módon és céllal megy végbe, a növényeknek azonban nincs

szükségük glukóz felvételére a külvilágból, hiszen fotoszintézis révén maguk szintetizálják a nap fényenergiáját felhasználva, CO2-ból és vízbôl (autotrófok).

2.1.3. A DNS szerkezete A sejtmagba csomagolt örökítôanyag, a DNS cukor-foszfát vázból és ahhoz kapcsolódó bázisokból álló dupla-helikális struktúra, melynek két fele az egymás felé nézô bázisok közötti H-kötések által kapcsolódik egymáshoz (2/2A ábra). Négyféle bázis van a DNS-ben, adenin (A), guanin (G), timin (T) és citozin (C). A DNS által preferenciálisan felvett konformációs állapotban a lehetséges párosodások: A-T (két H-híddal) és G-C (3 H-híddal). A DNS bizonyos körülmények között ettôl az (ún. B-) konfigurációtól eltérô módon is tekeredhet (ez az ún. Z-DNS), sôt többszálú konformációk, hajtûszerû képzôdmények keletkezése és különbözô DNS-molekulák közötti bonyolult, összefüggô struktúrát eredményezô kapcsolódások is lehetségesek – ezen alternatív állapotok fiziológiás (élôben betöltött) szerepe még nem tisztázott. Az eukarióta genomon (kromoszómákon) kívül a mitokondriumokban és a kloroplasztiszokban is van (kör alakú) DNS, ill. ún. episzóm alakban, önállóan replikálódó, extrakromoszomális elemekként fordulhat elô, pl. daganatos sejtekben vagy virális fertôzés kapcsán. A baktériumok egyetlen kromoszómája szintén kör alakú DNS, mely egy ponton a membránhoz rögzül. A baktériumok belsejében is találhatók extrakromoszomális DNS-elemek, pl. a gyógyszerrezisztenciagéneket hordozó plazmidok.

2.1.4. DNS-replikáció A sejt osztódása során a DNS úgy replikálódik (2/2B ábra), hogy a széttekeredô láncokhoz azokkal komplementer új DNS-szál szintetizálódik. Ezt a mechanizmust szemikonzervatív replikációnak nevezzük, mert az új dupla-hélix egyik szála korábbi

65


66 A SEJT LEGFONTOSABB ANYAGI ÖSSZETEVÔI ÉS ALAPVETÔ MOLEKULÁRIS MECHANIZMUSAI. A SEJTBIOLÓGIA MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI ESZKÖZTÁRA. A DNS molekula

foszfátcsoport

cukor

adenin vagy guanin

citozin vagy timin bázisok

B

új szál DNS-polimeráz

5’ egyszálú DNS-hez kötôdô fehérjék

3’ vezetô templát

3’

helikáz késlekedô templát szülôi DNS 5’

5’ DNS-polimeráz

Okasaki fragment

RNS primer

2/2. ábra. A DNS szerkezete (A) és replikációja (B).

DNS-primáz

5’



DNS-molekulából származik (öregebb, mint a másik szál). A DNS két szála részben eltérô biokémiai mechanizmussal szintetizálódik. Ennek az az oka, hogy a DNS polimerizációját végrehajtó DNS-polimeráz enzim a cukor-foszfát váz ribózának ötös (ún. 5’) szénatomjához kapcsolódó foszfáthoz tudja csak a következô bázis-cukor-foszfát alegységet csatlakoztatni, tehát az új lánc 5’ > 3’ irányban tud csak nôni. Az ún. vezetô lánc (leading strand) folyamatosan szintetizálódik, ahogy – helikáz enzim segítségével – tekeredik szét az anya-DNS. A másik láncon folyó szintézis szakaszos, ti. ellenkezô irányban zajlik (ún. lagging strand, késlekedô szál), és rövid RNS-láncok (primerek) beépítése elôzi meg magát a DNS-szintézist. Utólag az RNS-láncok lebomlanak, DNS-szakaszok (Okasaki-fragmentumok) öszszekötôdésével (enzimatikus ligációjával) helyreáll a DNS folytonossága.

2.1.5. DNS-repair A Darwin által sokrétûen és maradandó hitelességgel bizonyított evolúciós alaptörvény, a változékonyság + szelekció elve sejtpopulációk viselkedését is vezérli, in vitro és in vivo egyaránt. A sejt genetikai stabilitása pontosan szabályozott, egyrészt a DNS-szintetizáló enzimapparátusok hibaszázaléka szintjén, másrészt a statisztikailag elôforduló beépülési hibákat és a környezeti feltételek által elôidézett (sugárzás, reaktív oxigéngyökök) bázissorend-változásokat, mutációkat kijavító mechanizmusok révén. A sejt hatékony mechanizmusokkal rendelkezik mindenféle DNS-szerkezet-módosulás kijavítására (repair). Folytonossághiányok, egy vagy mindkét szálon bekövetkezôk, perceken belül a reparációban részt vevô fehérjék helyszínre vándorlását, odakötôdését váltják ki. E fehérjék egy része in vitro is szabadvég-kötô tulajdonságú, másoknak, pl. a nukleáznak enzimatikus (DNS-hasító) aktivitásuk van, egyes fehérjék más résztvevôket foszforilálni képesek. A soklépéses folyamatot fehérje–fehérje kapcsolatok integrálják.

2.1.6.DNS → mRNS (transzkripció), mRNS → fehérje (transzláció) A DNS-ben rejlô információ kifejezôdése, expressziója úgy történik, hogy elôször a kifejezôdô szakasz (pl. egy fehérjét kódoló gén) bázissorrendjével komplementer RNS-molekula szintetizálódik RNS-polimeráz enzim(ek) által – ezt a folyamatot nevezzük átírásnak, transzkripciónak (2/3A ábra). Ez az elsôdleges (naszcens) RNSmolekula bizonyos, a 2/3B ábrán demonstrált átalakítás (érés, processzálás) után már mint messenger RNS (mRNS, küldönc RNS) a magból a citoplazmába transzportálódik, ahol a riboszómákhoz kapcsolódik. A riboszómák, hatalmas, fehérjékbôl és rRNS- (a riboszómák struktúrájához tartozó, riboszomális RNS) molekulákból álló enzimkomplexek, melyek a mRNS-molekulák bázissorrendje alapján fehérjét szintetizálnak. Ez úgy történik (2/3C ábra), hogy minden egymást követô bázishármasnak (kodon) egy-egy aminosav felel meg. Pl. az UCG (az RNS-ben uridin helyettesíti a DNS timinbázisát) a szerin nevû aminosavnak felel meg. A megfeleltetést az egyes aminosavak és bázishármasok között az biztosítja, hogy ugyanazon enzim hordozza a megfelelô aminosavat és azt a transzfer-RNS-t (tRNS), mely megfelelô bázishármassal komplementer bázisokat (antikodon) tartalmaz. Így a tRNS a megfelelô mRNS-bázishármashoz vezeti ezt az enzimet. Ezáltal minden mRNS-bázishármashoz, az enzim közbeiktatásával, egy adott aminosav kapcsolódik. Az aminosavakból, peptidkötések révén, polipeptidlánc keletkezik. Az utóbbi aminosavszekvenciája tükrözi tehát az mRNS, ill. a DNS bázissorrendjét. Az egész élôvilágra kiterjedô, univerzális, bázishármas – aminosav megfeleltetés a „genetikai kód” (2/3C ábra).

67



1. transzkripció DNS

RNS-polimeráz tRNS aminosavak mRNS rRNS

RNS nukleotidok

fehérjék

antikodon

polipeptidlánc magmembrán

2. transzláció

riboszóma kodon

mRNS

A

B PROKARIÓTÁK

DNS

tyr

ser

C

tRNS

TRANSZKRIPCIÓ mRNS TRANSZLÁCIÓ fehérje

citoplazma sejtmag DNS

intronok

exonok

5’

U C A A G U

antikodon kodon

A U G U A C

mRNS

a második bázis a kodonban

RNS sapka mRNS

mRNS

TRANSZKRIPCIÓ 5’ sapka és poli-A farok képzôdése AAAA RNS-érés AAAA EXPORT

AAAA TRANSZLÁCIÓ

fehérje

U C A G

U

C

Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val

Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala ala

2/3. ábra. A fehérjék szintézisének legfontosabb lépései (A, B) és a genetikai kód (C).

A

G

Cys Tyr Cys Tyr STOP STOP STOP Trp Arg His Arg His Arg Hln Arg Gln Ser Asn Ser Asn Arg Lys Arg Lys Gly Asp Gly Asp Gly Glu Gly Glu

U C A G U C A G U C A G U C A G

a harmadik bázis a kodonban

gén

elsôdleges RNS transzkriptum

az elsô bázis a kodonban

EUKARIÓTÁK

3’



2.1.7. A naszcens RNS mRNS-sé érése A szintetizálódott RNS további átalakulásokon megy keresztül (l. 2/3B. ábra). Elsônek beépült 5’ végét biokémiai folyamatok módosítják (5’ cap), 3’ végéhez sok azonos A-ból poliA farok szintetizálódik. Mivel a gének kódoló (exon) és ezeket elválasztó nem kódoló (intron) szakaszokból épülnek fel, a nem kódoló (de átírt) mRNSszekvenciák utólag kivágódnak, enzimatikusan kicsípôdnek (splicing) az mRNS-molekulákból. Ezt a funkciót proteinkomplexek („splicesomes”) látják el, melyek alegységei kis, a nukleoplazmában szétszóran kimutatható RNS–protein komplexek („snRNP”-k) formájába mutathatók ki. Lehetôség van egy gén különbözô exonjainak alternatív felhasználására is (alternatív splicing). Ennek révén egy gén többféle fehérjét is kódolhat. (Egyes géntermékek esetében az mRNS bázissorrendjének utólagos megváltozása is elôfordul – ez az „RNS-editálás” jelensége, mely eddigi ismereteink szerint nem tartozik a sejt alapvetô szabályozási folyamatai közé.) A jelenlévô mRNSkoncentráció részben a termelôdéséhez vezetô lépések sebességmeghatározó mozzanatától, részben lebomlása szabályozott ütemétôl függ.

2.1.8. A fehérjék posztranszlációs módosításai és célba juttatása Az újonnan szintetizált fehérjék a szekvenciájukat képezô – késôbb enzimatikusan kivágott vagy a célba juttatott fehérje által is hordozott – elemek és az ezekkel kapcsolatba lépô célzó mechanizmusok kölcsönhatása révén kerülnek felhasználásuk helyére („targeting”). Jelenlévô mennyiségüket termelôdésük és szabályozott lebomlásuk egyensúlya állítja be, enzimatikus mûködésüket posztszintetikus modifikációk és más fehérjékkel való változatos kölcsönhatások, oli-

gomerizációs viszonylatok befolyásolják. A posztszintetikus modifikációk között igen jelentôs a foszforiláció: az ún. kináz enzimek negatív töltésû foszfátcsoport kovalens felkötôdését katalizálják egy másik fehérjére, mely abban jelentôs konformációváltozást idéz elô. Ez a változás azonban reverzibilis, mert egy megfelelô foszfatáz enzim a foszfátcsoport lehasadásának kedvezô reakcióutat nyithat. Egy másik jelentôs posztszintetikus reakció a ubikvitináció, melynek során egy proteinbontó enzimek (proteázok) általi degradációra szánt fehérje egy kis méretû fehérjével, az ubikvitinnal konjugálódik bonyolult enzimapparátus által.

2.1.9. A génexpresszió szabályozása A génexpresszió elsôsorban az átírás szintjén szabályozódik, és egyrészt az aktuális anyagcsere státusznak és külsô körülményeknek megfelelô pillanatnyi alkalmazkodást, másrészt komplex sejtállapot-módosulásokat tesz lehetôvé. Az utóbbira akkor van szükség, amikor a sejt szöveti sajátosságai változnak, egy adott szövetféleségre jellemzô génexpressziós mintázat alakul ki. Ez megtörténhet in vitro („üvegben”, vagyis kísérleti körülmények között) és in vivo (az élôben); általában ezeket a komplex folyamatokat differenciációnak nevezzük. A sejt in vivo differenciálódik az egyedfejlôdés (a kifejlett élôlény sokféle szövetének egyetlen megtermékenyített petesejtbôl való kialakulása; ontogenezis) során vagy a kifejlett élôlényben zajló regenerációs és szöveti differenciációs mûködések kapcsán. A kialakult komplex funkciók sejtgenerációról generációra való megôrzését a génexpressziós mintázat propagálódása (epigenetikus öröklôdése) biztosítja. Az eukarióta gének RNS-be való átírása a génnel összefüggô DNS-területen elhelyezkedô ún. cisz-elemektôl, ill. ezekhez kapcsolódó fehérjéktôl, valamint a kizárólag az érintett génszakaszhoz kapcsolódó fehérjefaktoroktól függ – az

69



2/4. ábra. A génkifejezôdés szabályozása a transzkripció szintjén.

utóbbiakat „transz”-faktoroknak nevezzük. A cisz-elemek közé tartozik a promóter, amely a gén mRNS-t kódoló szakaszától 5’ irányban helyezkedik el, kb. 100-200 bp hosszú, és DNS-kötô fehérjék számára biztosít kötôhelyet. A promóter vezérli a transzkripciót (az mRNS átírását) az mRNS-t szintetizáló RNS-polimeráz enzim kötôdése és elindulása feltételeinek biztosításával. A legtöbb promóterben elôforduló promóterelem az ún. TATA box. Ez egy T-A-T-A nukleotidsorrendû szakasz, ami 35 bp-nyira (–35) helyezkedik el a transzkripció starthelyétôl (+1). Ehhez kötôdik a TATA-kötô fehérje (TBP), amelyhez további általános transzkripciós faktorok [pl. a TFIIDkomplex = TBP + TAFok (TBP Associated Factors)] kapcsolódnak. Ezek együttesen biztosítják az RNS-polimeráz mûködését és a transzkripció elindulását. (Az általános transzkripciós faktorok az RNS-polimerázzal együtt (ami maga is több fehérjébôl áll) alkotják az alaptranszkripciós apparátust.) A génexprésszió szabályozásának* további fontos cisz-elemei az ún. enhanszerek (2/4. ábra). Ezek a gén kódoló szakaszától akár 5’ akár 3’ irányban helyezkedhetnek el, és transzkripciós faktorok kötôhelyeibôl, az ún. válaszadó elemekbôl állnak. Az enhanszerek általában 10-50 bp hosszúságú, mindkét orientációban mûködôképes

szakaszok. Igen távol, akár több ezer bázispárnyira is elhelyezkedhetnek a befolyásolt géntôl. Az enhanszerekhez kapcsolódó transzkripciós faktorok pozitív és/vagy1 negatív irányban tudják befolyásolni a promóter mûködését (az utóbbi esetben silencer a nevük). A specifikus transzkripciós faktorok DNS-kötô doménjükön2 kívül rendelkeznek egy aktiváló és/vagy gátló doménnel is. Mivel ezek a fehérjék általában nem lépnek direkt kapcsolatba a promóterhez kapcsolódó fehérjékkel, közvetítô fehérjékre van szükség a mûködésükhöz. Ezeket kofaktoroknak nevezzük: koaktivatoroknak vagy korepresszoroknak, attól függôen, hogy aktiváló vagy gátló szerepet töltenek be. Ezek általában egy nagyobb fehérjekomplex részeként biztosítják a fizikai kapcsolatot az enhanszerhez kapcsolódó, szekvenciaspecifikus transzkripciós faktor és a promóterhez kötôdô általános transzkripciós faktorok között. Ezeknek a komplexeknek többféle enzimatikus aktivitásuk is van, így hiszton-acetiláz, deacetiláz és esetleg metiláz, demetiláz vagy kináz és ATP-függô ún. kromatin „remodelling” aktivitással, mellyel hozzájárulnak a kromatinszerkezet átalakításához és a transzkripció sebességének növeléséhez vagy éppen csökkentéséhez. A 2/4. ábra az eukarióta transzkripció szabályozásának alapelveit mutatja 1

*

Kis, duplaszálú RNS-ek génexpresszió-szabályozásban betöltött szerepérôl egyre több adat lát napvilágot. Ezen újfajta szabályozás mechanizmusáról még nincsenek biztos ismereteink.

Pl. a magreceptorok ligand (hormon) hiányában gátolnak, jelenlétében aktiválnak.

2

A domén egy fehérje körülhatárolható szerkezeti és funkcionális részlete.



vázlatosan. A TATA boxszal bíró promóterhez kapcsolódik az alap transzkripciós apparátus. Ez biztosítja az RNS átíródását. Ezt az aktivitást modulálják enhancerek-silencerek a hozzájuk kapcsolódó specifikus transzkripciós faktorokon keresztül. Az ábrán kofaktorokat és hozzájuk kapcsolódó fehérjéket nem tüntettünk fel.

E. coli 10

BT

a

20

b

30 40 50

c

60

2.1.10. Általános szabályozási alapelvek

70 80 90

Az anyagcsere-folyamatok, ill. a differenciáció szabályozásának egyik fontos alapelve a visszacsatolás (feed-back). Ennek fôleg negatív visszacsatolásként ismert változata gyakori, pl. amikor egy keletkezett termék gátolja az ôt létrehozó folyamatot. Az enzimatikus reakciók sorbakapcsolásuk révén kaszkádfolyamatokká rendezôdhetnek, melyek során egy-egy enzim továbbiak sokaságát aktiválva robbanásszerû változásokat hozhat létre a végsô szubsztrát szintjén. Gyakori szabályozási megoldás a trigger-elv: egy folyamatsor mintegy ugrásra készen várja azt a stimulust, mely, mint a ravasz meghúzása a golyó kirepülését (melynek gyorsasága nem függ a ravasz meghúzásának erejétôl), idézi elô a reakciólánc beindulását.

2.1.11. A DNS heterogenitása A kromoszómaméretû DNS „értelmes” száláról átírásra kerülô, a diploid genomban két allélban elôforduló egyedi géneket (2/5. ábra, c) és különbözô mértékben (a, b) ismétlôdô, a genomban tandem és szétszórtan, sok-sok másolatban jelenlévô szekvenciákat tartalmaz. A különbözô szekvenciák száma a genom ún. komplexitása, mely nagymértékben különbözik a fajok között. A gének (és a repetitív elemek egyaránt) egyedi (nem ismétlôdô), nem kódoló szakaszokkal (spacerekkel) határolódnak el egymástól. A spacerek, valamint a gének intronjai, és az ún. pszeudogének (RNS-rôl „visszafelé”, DNS-be írt szekvenci-

100 -3

10

-2

10

-1

10

0

10

1

10

2

10

3

10

4

C0 t

2/5. ábra. A prokarióták (E. coli) és emlôs- (borjú thymus, BT) DNS reasszociációs viselkedése.

ák) nem kódolnak fehérjét. A denaturált (>8090 oC-on egyszálúvá váló) DNS reasszociációs kinetikája tükrözi ezt a heterogenitást. Mint az ábrán látható, a bakteriális, ill. eukarióta (borjú csecsemômirigy, thymus, BT) DNS reasszociációs viselkedése kevesebb, ill. több (a teljes DNS-állománynak jelentôsebb részét alkotó) ismétlôdô szekvenciaarányra utal. A C 0t érték a DNS (nukleotidokra számolt) moláris koncentrációjának és az eltelt idônek a szorzata, melynek függvényében a reasszociáció %-os mértékét ábrázoljuk. A genom DNS-szekvenciái bázisösszetételük (AT/GC arányuk) szerint is több különbözô alosztályt alkotnak. Az utóbbi arány szempontjából élesen elkülönülnek a gének és a transzkripció szempontjából inaktív területek. Ezek váltakozása az eddig ismertté vált hosszabb, egybefüggô DNS-szekvenciák alapján nagyjából hurokméretû periodicitást mutat. Az ismétlôdés foka szerint háromféle szekvenciakategóriát különböztetnek meg: erôsen repetitív (egyszerû, tandem ismétlôdô, rövid szekvenciákból álló nagyobb szakaszok, mint pl. a kromoszómák ún. centromerikus régióinak ún. szatellita DNS-e), a közepesen repetitív és a nem ismétlôdô (egyedi) szakaszokból álló genomhá-

71


72 A SEJT LEGFONTOSABB ANYAGI ÖSSZETEVÔI ÉS ALAPVETÔ MOLEKULÁRIS MECHANIZMUSAI. A SEJTBIOLÓGIA MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI ESZKÖZTÁRA. nyad (pl. gének többsége). A repetitív szekvenciák alkotják a genom több mint felét, jelentôségükre nincs meggyôzô magyarázat3. Kiemelendô a DNS saját „mobilitásának” ténye: olyan rövid szekvenciaelemek léteznek, melyek révén hoszszabb DNS-szakaszok is önálló „útra kelhetnek” a magon (sejten, ill. populáción) belül, és eredeti helyükhöz képest máshova épülhetnek be (inszertálódhatnak)

2.2. A sejtbiológia molekuláris biológiai eszköztára A molekuláris biológia és módszereinek gyors fejlôdése nagy hatással volt és van a sejtbiológiára. Az alábbiakban röviden ismertetjük, a teljesség igénye nélkül, azokat a molekuláris biológiai módszereket, melyek döntôen hozzájárultak a sejtek mûködésének megismeréséhez.

2.2.1. Módszerek A nukleinsavak kémiai természetébôl adódó tulajdonsága, hogy a komplementaritás elve alapján párosíthatóak: hibridizálnak (l. a 2/5. ábrán a DNS reasszociációs viselkedését). Ezt jó néhány technika kihasználja. A Southern hibridizáció esetén (2/6. ábra) az agarózgélen méretük szerint elválasztott DNS-molekulákat szilárd hordozóra transzferálják, azon rögzítik, és radioaktívan jelölt szondával4 hibridizáltatják (DNS-DNS hibridizáció). A Northern hibridizáció a Southernhez hasonló, de RNS-molekulák szétválasztásán és DNS-szondával való jelölésén alapszik. Segítségével meghatározható például egy adott gén 3 Ez az ún. C-érték paradoxon (a C-érték a haploid genom – kódolt génekét meghaladó – DNS-tartalma).

4

Angolul probe, ezért magyarul sokszor próbának fordítják.

mRNS-szintje különbözô sejtekben és szövetekben. Gyorsan törnek elôre a szintén hibridizáción alapuló miniatürizált ún. chiptechnikák. Ilyen a DNS-mikroarray, melynek során több ezer gént jellemzô DNS-molekula kerül felvitelre egy kicsiny tárgylemezre, és ehhez hibridizálják egy adott sejt teljes RNS-készletének megfelelôen jelölt DNS másolatát (komplementer DNS, cDNS). Ezáltal egyetlen kísérletben több ezer gén expressziós szintje határozható meg. A fehérjék esetében a primer szekvencián alapuló hibridizációra nincs lehetôség. Ezzel szemben jól kihasználhatók a specifikus antigén–antitest kölcsönhatások fehérjék kimutatására és jelölésére. A fentiekhez hasonló, de fehérjék kimutatására alkalmas az ún. Western blot technika: ennek során sejtekbôl, szövetekbôl nyert fehérjéket választunk el méret szerint gélelektroforézissel. Szilárd hordozó membránra transzferáljuk (blottoljuk) a szétválasztott fehérjéket, és egy adott fehérje ellen termeltetett specifikus antitesttel kimutatjuk. Ez általában úgy történik, hogy az antitesthez egy enzimet rögzítenek, és az enzim által katalizált színreakció jeleníti meg a fehérjét. Ezzel a módszerrel adott fehérje jelenléte és szintje határozható meg sejt- vagy szövetkivonatokban. A sejtbiológusok számára azonban ennél általában fontosabb egy fehérje sejten belüli (intracelluláris) elhelyezkedésének meghatározása. Erre is jól használható az immunhisztokémia. Ekkor szintén egy adott fehérjére specifikus antitestet használunk, de ebben az esetben izolált sejteken vagy szöveti metszeteken vizsgáljuk az adott fehérje elhelyezkedését. Az antitesteket gyakran fluoreszcens anyagokkal jelölik, és megjelenítésükhöz fluoreszcens mikroszkópiát használnak. Ez a módszer kiválóan alkalmas fehérjék sejten, illetve szöveten belüli elhelyezkedésének vizsgálatára. Fehérjemolekulák kölcsönhatásait, adott fehérjékhez kapcsolódó fehérjéket lehet kimutatni a szintén antitestek használatán alapuló immunprecipitációs technikával. Ebben az esetben általában sejtkivonatokból csapjuk ki és gyûjtjük össze az antitestekkel kapcsolódni képes fehérjéket. Ezek minôsége és mennyisége további vizsgá-


A SEJTBIOLÓGIA MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI ESZKÖZTÁRA

papírtörölközô-köteg

restrikciós endonukleázzal emésztett jelöletlen DNS

jelölt, ismert méretû DNS-darabok

nitrocellulóz membrán

a nitrocellulóz filter eltávolítása a szorosan hozzákötött DNS-sel

agarózgél alkalikus oldat

szivacs DNS-fragmentek elválasztása agarózgél-elektroforézissel

az elválasztott DNS-fragmentek blottolása nitrocellulóz filterre

pufferben oldott jelölt DNS-próba lezárt plasztikzacskó

jelölt sávok

jelölt DNS próba hibridizálása az elválasztott DNS-fragmentekhez

a jelölt markerek elhelyezkedése

a komplementer DNS sávokhoz hibridizált jelölt DNS próba detektálása autoradiográfiával

2/6. ábra. A Southern-blot technika.

latokkal (pl. Western blottal) meghatározható. A módszer kiválóan alkalmas fehérjék partnereinek tisztítására, illetve fehérjekomplexek tanulmányozására.

2.2.2. Modellélôlények A sejtbiológiai folyamatok megértéséhez elengedhetetlen egyszerûbb modellszervezetek használata. Ilyen az egyik legegyszerûbb eukarióta szervezet, a kenyér- vagy sörélesztô (Saccharomyces cerevisiae), egy egysejtû gomba, ami legalább annyira közeli rokona a növényeknek, mint az ál-

latoknak. Kedvezô körülmények között olyan gyorsan szaporodik, mint a baktériumok. Mivel DNS-tartalma csak két és félszer nagyobb mint az Escherichia coli (E. coli) baktériumé, kiválóan használható genetikai kísérletekre is. Az élesztô kiválóan alkalmas olyan alapvetô intracelluláris folyamatok vizsgálatára, mint a sejtorgaellumok mûködése, sejtciklus, szignáltranszdukció, génátíródás szabályozása, DNS-replikáció és repair, anyagcsere-folyamatok. Természetesen az élesztô nem alkalmas a soksejtû élôlények sajátságainak modellezésére (sejt–sejt kommunikáció, differenciálódás). Ez utóbbiak tanulmányozására az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) és egy nematodák közé tartozó féreg, a Caenorrhabditis elegans

73


74 A SEJT LEGFONTOSABB ANYAGI ÖSSZETEVÔI ÉS ALAPVETÔ MOLEKULÁRIS MECHANIZMUSAI. A SEJTBIOLÓGIA MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI ESZKÖZTÁRA. vált a legkiterjedtebben használt kísérleti objektummá. Az ecetmuslica a genetikusok egyik kedvelt kísérleti állata, és nagyban hozzájárult olyan alapvetô biológiai folyamatok megértéséhez, mint a differenciálódás folyamata, a test szelvényezettségének kialakulása és annak szabályozása. A C. elegans petesejtje óramûpontossággal alakul a megtermékenyítés után egy pontosan 959 sejtbôl álló soksejtû szervezetté. E folyamat pontos megfigyelése és leírása, valamint az ehhez kapcsolódó genetikai vizsgálatok sokat adtak az idegrendszerrôl, differenciálódásról, apoptózisról meglévô ismereteinkhez. Kitüntetett szerepet játszik a biológiai kutatásokban az egér (Mus musculus). Az egér a legtöbbet tanulmányozott emlôs az ember mellett. Viszonylag rövid reprodukciós ideje (21 nap), beltenyésztett, genetikailag identikus törzseinek genetikai manipulálhatósága és egyszerû tenyésztése teszi vonzó kutatási célponttá. Két technológia, mellyel könnyen és specifikusan megváltoztathatóvá vált az egér genomja, forradalmasította a biológiai megismerés folyamatát. Az egyik eljárás segítségével ún. transzge-

nikus állatokat lehet létrehozni a megtermékenyített petesejtbe való DNS-injektálással. Ebben az esetben az injektált DNS beépül a genomba, és ott kifejezôdik. Az ilyen módon létrehozott állatok propagálják a stabilan integrálódott DNS-t nemzedékrôl nemzedékre. Ilyen módon in vivo tanulmányozhatóvá válik egy kivülrôl bevitt gén hatása. Ezt a technológiát kiegészíti a nullmutáció létrehozásának technikája (knock out technika). Ebben az esetben egy adott, vizsgálni kívánt gén kicserélése történik meg homológ rekombináció (szekvenciahomológián alapuló DNS-szakasz-kicserélôdés) segítségével embrionális ôssejtekben (ES) in vitro. Ezekbôl az ôssejtekbôl – amennyiben azokat blasztocisztákba ültetik (pl. mikroinjektálják) – olyan kiméraegerek születnek, melyek egyes sejtjei vagy szövetei a manipulált ESsejtekbôl származnak. Ezekbôl, ha a kimérizmus az ivarsejteket is érinti, keresztezéssel létrehozható homozigóta null mutáns, melynek minden sejtje tartalmazza a mutációt. A transzgén és knock out technikával jól vizsgálható egy-egy gén szerepe az organizmus fejlôdése és élete során.

Szabó Gábor - Sejtbiológia (2003, 73 oldal)

Recommend Documents