SNI 2354.10:2016
Standar Standar Nasional Nasion Nasio nal al Indonesia Indon Indo nesia esia
Cara Cara uji uji kimia kimi kimia a – Bagi Ba Bagian gian an 10 : Penent Pen Penentua Pene entuan ntuan uan n kadar kada kadar kadarr histamin histam histamin in dengan dengan Spektroflo Spektrof Spekt Spektroflorom rofloromet lorometri rometri etri ri dan Kromat Kro Kromatogr Kroma matogr tografi ografi afi Cair Cair Kinerja Kinerja Tinggi Tinggi (KCK (K (KCKT) (KC CKT) KT) T) pada pad pada a produk pro prod duk uk perikanan perikanan
ICS 67.050
Badan Standardis Standardisa Standardisasi asi si Nasional Nasion Nasional al
© BSN 2016 Hak Hak ci pta pta dil dil indu indung ngii unda undang ng-u -und ndan ang. g. Dila Dila rang rang meng mengum umum umka kan n d an memp memper erba bany nya a k sebag sebagia ian n atau atau seluru seluruh h isi dokume dokumen n ini dengan dengan cara cara dan dalam dalam bentu bentuk k apapun apapun serta serta dilara dilarang ng mendis mendistri tribus busika ikan n doku dokume men n ini ini baik baik seca secarae rae lekt lektro roni nik k maupu maupun n terc tercet eta a k tanpaizi tanpaizin n tert tertul ulii s dari dari BSN BSN BSN Email: Email: dokinfo@b
[email protected] sn.go.id .id www.bsn.go.id
Dite Diterb rbit itka ka n di Jakar Jakarta ta
SNI 2354.10:2016 2354.10 2354.10:20 :2016
Daftar isi
Daftar isi............................................... isi........................................................................ ................................................... ................................................... ................................... .......... i Prakata ................................................... ............................................................................. ................................................... ................................................... ............................... ..... ii Pendahuluan........................................................ Pendahuluan.............................. ................................................... ................................................... ........................................... ................. iii 1
Ruang lingkup....................................................................................... .................................................................................................................... ............................. 1
2
Istilah dan definisi ........................................................................................ .............................................................................................................. ...................... 1
3
Prinsip metode pengujian ...................................................................................... .................................................................................................. ............ 1
4
Penentuan histamin secara spektroflorometri spektroflorometri ................................................................... ................................................................... 2
5
Penentuan histamin secara KCKT.............................................................................. KCKT..................................................................................... ....... 4
6
Pelaporan ..................................................................................... .......................................................................................................................... ..................................... 7
7
Keamanan dan keselamatan kerja .................................................................................... .................................................................................... 7
Lampiran A (informatif) (informatif) Validasi metode penentuan histamin dengan KCKT .......................... 8
Tabel A.1 Hasil uji LOD dan LOQ............................................................................................ LOQ............................................................................................ 9 Tabel A.2 A.2 - Data uji akurasi akurasi spike spike sampel 50 mg/kg mg/kg (50 g + 2,5 mL larutan larutan standar histamin histamin 1000 mg/L)..................................... mg/L)............................................................... ................................................... ................................................... ....................................... ............. 9 Tabel A.3 A.3 - Data uji akurasi akurasi spike spike sampel 100 mg/kg mg/kg (50 g + 5 ml Standar Baku Histamine Histamine 1000 mg/l)........................................................................................ mg/l).............................................................................................................................. ...................................... 10 Tabel A.4 Data uji akurasi spike sampel sampel Spike Sampel 150 150 mg/kg (50 g + 7,5 mL Standar Baku Histamine 1000 mg/L) ................................................ ......................................................................... .................................................. ......................... 11 Tabel A.5 - Nilai minimum recovery metode .......................................................................... .......................................................................... 11 Tabel A.6 - Horwitz Value .................................................. ........................................................................... .................................................. ........................... .. 12 Gambar A.1 - Kurva kalibrasi larutan standar histamin ........................................................... ........................................................... 8 Gambar A.2 - Kurva kalibra kalibrasi si spike spike sampel........................ sampel............................................................................. ..................................................... 8
© BSN BSN 2016 2016
i
SNI 2354.10:2016 2354.10: 2354.10:20 2016
Prakata
Dalam rangka memberika memberikan n jaminan mutu dan keamanan keamanan pangan komoditas komoditas hasil perikanan perikanan yang akan akan dipasark dipasarkan an di dalam dan luar luar negeri, negeri, maka perlu perlu disusu disusun n suatu suatu Standar Standar Nasional Nasional Indonesia Indonesia (SNI) metode uji yang dapat memenuhi memenuhi jaminan tersebut. tersebut. Standarini Standarini merupak merupakanrevis anrevisii dari dari SNI 2354.10 2354.10:20 :2009,Ca 09,Cara ra uji uji kimi kimia a - Bagian Bagian 10 : Penent Penentuan uan kadar histamin histamin dengan dengan spektro spektroflorom florometri etri dan Kromatogr Kromatografi afi Cair Cair Kinerja Kinerja Tinggi Tinggi (KCKT) (KCKT) pada produk perikanan. perikanan. Perubahanyang Perubahanyang mendasar mendasar pada standar standar ini antara antara lain: 1. Prepar Preparasi asi cont contoh oh pada uji uji histamin histamin metod metode e KCKT, KCKT, 2. Penambah Penambahan an perhit perhitunga ungan n hasil, hasil, 3. Penamba Penambahan han Lampir Lampiran an inform informati atif. f. Standar Standar ini disus disusun un oleh Komi Komite te Teknis Teknis 65-05: 65-05: Produk Produk Perika Perikanan, nan, yang yang telah telah dirumus dirumuskan kan melalui melalui rapat rapat teknis, teknis, dan rapat rapat konsensus konsensus pada tanggal tanggal 17 September September 2015 di di Bogor dihadiri dihadiri oleh anggota Komite Teknis 65-05: Produk Perikanan Perikanan sebagai upaya untuk meningkatkan meningkatkan jaminan mutu dan keamanan pangan. Standar Standar ini telah telah mela melalui lui proses proses jajak jajak pendapat pendapat pada tanggal tanggal 10 Dese Desember mber 2015 sampai sampai dengan 10 Februari 2016 dengan hasil akhir RASNI.
© BSN BSN 2016 2016 2016
ii
SNI 2354.10:2016 2354.10 2354.10:20 :2016
Pendahuluan Penyus Penyusunan unan SNI SNI ini, ini, memperh memperhati atikan kan keten ketentua tuan n dalam dalam Peratu Peraturan ran Mente Menteri ri Kelaut Kelautan an dan Perikanan Perikanan RI Nomor PER.19/MEN/ PER.19/MEN/2010 2010 tentang tentang Pengendal Pengendalian ian Sistem Sistem Jaminan Jaminan Mutu Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan .
© BSN BSN 2016 2016
iii
SNI 2354.10:2016 2354.10 2354.10:20 :2016
Cara uji uji kimia kimia - Bagian Bagian 10 : Penentuan Penentuan kadar histamin hista histami min n dengan spektroflo spekt spektroflorometri roflorometri rometri dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi(KCKT) Tinggi(KCKT) (KCKT) pada produk perikanan perikanan
1
Ruang lingkup lingkup
Standar Standar ini digunakan digunakan untuk menentukan menentukan kadar histamin histamin pada produk perikanan. perikanan.
2
Istilah Istila Istilah h dan definisi definisi
2.1 histamin merupakan merupakan senyawa senyawa turunan dari asam asam amino histidin histidin yang terbentuk terbentuk karena tindakan tindakan bakteri bakteri yang memilikienzym memiliki enzym dekarboksil dekarboksilase ase 2.2 fluorometri metode analisa yang didasarkan pada pengukuran fluorosensi 2.3 metode metode analisa analisa secara secara KCKT suat suatu u tekn teknik ik anal analis isa a kuant kuantit itat atif if dan kual kualit itat atif if yang yang dida didasa sark rkan an pada pada pemi pemisa sahan han zat zat tela telaru rutt oleh suatu proses migrasi igrasi deferensi deferensial al dinamis dinamisdalam sistem sistem yangterdir yangterdirii dari dua fase. fase. Salah satunya satunya adalah adalah fase cair yang bergera bergerak k secara secara berkesinam berkesinambungan bungan dalam arah tertent tertentu u dan didala didalamny mnya a zat-za zat-zatt terpis terpisah ah menunju menunjukka kkan n perbeda perbedaan an mobilit mobilitas as karena karena perbeda perbedaan anabsorbsi absorbsi, partisi, partisi, kelarutan, kelarutan, tekanan uap, ukuran ukuran molekul molekul dan muatan muatan ion
3 3.1
Prinsip Prinsip metode metode pengujian Secara spektroflorome spektroflorometri tri
Histamin Histamin diekstrak diekstrak dari jaringan jaringan daging contoh menggunakan menggunakan metanol dan sekaligus sekaligus meng mengko konv nver ersi si hist histam amin in ke dala dalam m bent bentuk uk OH. OH. ZatZat-za zatt hist histam amin in sela selanj njut utny nya a dimu dimurn rnik ikan an melalu melaluii resin resin penukar penukar ion dan dan diubah diubah ke bentuk bentuk deriva derivatny tnya a dengan dengan senyawa senyawa OrtoOrtoptalatdikar ptalatdikarbosild bosildehid ehid (OPT). (OPT). Besarnya Besarnya flouresensi flouresensi histamin histamin diukur secara secara flourometri flourometri pada panjang gelombang gelombang exitasi exitasi 350 nm dan emisi 444 nm. 3.2
Secara KCKT
Histamin Histamin diekstrak diekstrak dari jaringan jaringan daging contoh menggunakan menggunakan TCA 10% selanjutnya selanjutnya diderivatisa diderivatisasi si dengan senyawa senyawa orto-ftalal orto-ftalaldehid dehid (OPA). (OPA). Besarnya Besarnya histamin histamin diukur secara secara KCKT KCKT dengan dengan dete detekto ktorr fluore fluoresen sens s pada panjang panjang gelomba gelombang ng eksi eksitas tasii 350 350 nm dan emisi emisi 450 nm dengan menggunakan menggunakan fase gerak campuran campuran asetonitril asetonitril : larutan larutan dapar dapar monosodium monosodium fosfat fosfat (30 : 70) dan kolom kolom C-18. C-18. Respon Respon KCKT KCKT berupa berupa puncakpuncak-punc puncak ak kromat kromatogr ogram am yang memp mempuny unyai ai wakt waktu u tambat tambat (RT) (RT) yang yang spesi spesifi fik. k. Iden Identi tifi fika kasi si punc puncak ak dilak dilakuk ukan an denga dengan n memband membanding ingkan kan RT sampel sampel terhada terhadap p RT standa standar. r. Luas puncak puncak sebandi sebanding ng dengan dengan jumlah analit tersebut. tersebut.
© BSN BSN 2016 2016 2016
1 dari dari 12
SNI 2354.10:2016 2354.10: 2354.10:20 2016
4 4.1 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) 4.2 a) b) c) d) e) f)
g)
h) i)
j)
Penentuan Penentuan histamin hista histamin min secara spektroflorometri Peralatan Corong Corong dan boto botoll filtr filtrat at contoh contoh;; Homo Homogen geniz izer er (ble (blende nder) r);; Kert Kertas as sarin aring g kasa kasar, r, plas plasti tik, k, kare karett pengi pengika kat; t; Kolo Kolom m resi resin n 20 cm cm x 0,8 cm, cm, rese reserv rvoa oarr 2 cm cm x 5 cm; cm; Labu taka takar 25 mL, mL, 50 mL, mL, 100 mL dan dan 1.000 1.000 mL; mL; Pipe Pipett volu volume metr tric ic;; Spektr Spektrofl oflour ourome ometer ter;; Stirer - plate; plate; Tabung Tabung reaksi reaksi 50 mL mL bert bertutu utup; p; Timb Timbang angan an anali analiti tis; s; Waterbath. Waterbath. Pereaksi Meta Metano noll; Aqua Aquade des s; Glas Glassw swoo ool; l; NaOH 1 N; Larutkan Larutkan 4 g NaOH dalam 100 mL aquades. HCl 0,1 0,1 N; N; Encerkan Encerkan 8 mL HCl 12,5 12,5 N (37%) (37%) dalam 1.000 mL aquades. aquades. Orto-p Orto-ptal talatdi atdikar karb bosildeh osildehid id (OPT) (OPT) 0,1%; 0,1%; Larutkan Larutkan 0,1 g OPT OPT dalam 100 mL metanol, metanol, larutan larutan ini disiapkan disiapkan pada pada kondisi kondisi segar segar dalam setiap setiap analisa. analisa. Asam Asam Phos Phospa patt (H3P (H3PO4 O4)) 3,57 3,57 N; Encerkan Encerkan 121,8 mL H3PO4 H3PO4 (85%) (85%) menjadi 1.000 1.000 mL aquades, aquades, standarkan standarkan larutan larutan ini dengan mengambil 5 mL dan titrasi dengan NaOH 1 N dengan indikator fenolftalin. Resin Resin penuka penukarr ion jenisD jenisDowe owex x 1 – X8 50 – 100 mesh; mesh; Pembuat Pembuatan an larutan larutan standar standar histam histamin: in: Larutan Larutan stok 1 mg/mL (1.000 (1.000 ppm) Timbang teliti 169,1 mg histamin histamin 2 HCl (Histamin (Histamin dihidroklorid), larutkan dan tepatkan menggunakan menggunakan HCl 0,1 0,1 N dalam labu takar takar 100mL sampai batas batas volume. volume. Siapkan Siapkan larutan ini dalam kondisi kondisi segar setiap setiap minggu dan disimpan dalam refrigerat refrigerator. or. larutan larutan stok 10 µg/mL (10 ppm) ppm) Pipe Pipett 1 mL lar larut utka kan n stoc stock k (1.0 (1.000 00 ppm) ppm) masu masukk kkan an ke ke dalam dalam labu labu taka takarr 100 mL mL dan tambahkan tambahkan larutan larutan HCl 0,1 sampai batas volume. volume. Siapkan Siapkan larutan larutan ini dalam kondisi kondisi segar setiap minggu minggu dan disimpan disimpan dalam dalam refrigerat refrigerator. or. Laru Laruta tan n ker kerja ja;; Buat larutan larutan kerja 0,1 µg/mL µg/mL (0,1ppm); (0,1ppm); 0,2 µg/mL (0,2 (0,2 ppm) dan 0,3 µg/mL µg/mL (0,3 ppm). Siapkan larutan kerja kerja ini setiap setiap hari (setiap (setiap akan digunakan). Apabila larutan kerja kerja tersebut tersebut menghasilkan menghasilkan fluorese fluoresensinya nsinya yang yang maksimal maksimal pada pembacaan pembacaan dengan dengan instrumen, instrumen, maka larutan larutan kerja kerja tersebut tersebut dapat diencerkan diencerkan sesuai sesuai dengan keperlu keperluan. an.
4.3
Prosedur analisis
a) Blende Blenderr contoh contoh hingga hingga homogen. homogen. b) Timbang Timbang seksama lebih kurang 10 g contoh contoh dalambeak dalambeaker er glass glass 250 mL dan tambahkan 50 mL mL metanol, metanol, blender hingga homogen.
© BSN BSN 2016 2016 2016
2 dari dari 12
SNI 2354.10:2016 2354.10 2354.10:20 :2016
c) Pana Panask skan an diata diatas s waterbath selama 15 menit menit pada suhu 60 °C dijaga dijaga sampel sampel dalam kondisi tertutup, dinginkan hingga suhu kamar. d) Tuangkan Tuangkan contoh ke dalam labu takar 100 mL dan tepatkan hingga hingga volume labu dengan dengan metanol. e) Saring Saring menggunak menggunakan an kertassari kertassaring ng dan filtra filtratny tnya a ditampu ditampung ng dalam dalam botol botol cont contoh. oh. Pada Pada tahap ini filtrat filtrat contoh dapat dapat disimpan disimpan dalam refrigerato refrigerator. r.
4.3.1 Persiapan resin g resin untuk untuk setiap setiap kolom kolom dalam dalambeaker beaker glass glass250 250 mL. a) Timbang 3 gresin Tambahkan 15 mL NaOH 2 N/g resin untuk mengubah mengubaresin h menjadi bentuk OH. b) Tambahkan c) Aduk Aduk meng menggu guna naka kan nstirer-plateselama stirer-plate selama 30 menit. d) Tuang cairan pada bagian atas dan ulangi penambahan NaOH 2 N dengan jumlah jumlah yang sama. e) Cuci Cuci/b /bil ilas as resi resin ndengan aquadessebanyak3 aquadessebanyak3 kali. f) Sari Saring ng mela melalu luiikertas kertas saring saringNo. No. 588 atau yangsetara setara dan cuci kembali kembalidengan aquades. g) Siapkan Siapkan resin setiap minggu dan simpan dalam aquades. aquades. 4.3.2
Persiapan Persiapan kolom kolom resin
a) Masu Masukk kkan an glasswoolke glasswool ke dalam dalam kolom kolomresin resin seting setinggi gi ± 1,5 cm. cm. b) Masukk Masukkan an resin resin dalam medium mediumair ke kolom kolom resin resin setinggi setinggi± 8 cm, cm, pertaha pertahanka nkan n volume volume air yang berada diatas resin ± 1 cm, cm, jangan dibiarkan dibiarkan kering. kering. c) Leta Letakk kkan an lab labu u takar 50 mL yang sudah berisi 5 mL HCl 1 N di bawah kolom resin guna menampungelusi menampung elusi contoh yang dilewat dilewatkan kan pada pada kolom kolom resin. resin. Diperlihatk Diperlihatkan an dalam dalam Gamba Gambarr 1.
Gambar 1 – Persiapan kolom resin
4.3.3
Pemurnian Pemurnian contoh contoh
a) Pipe Pipett 1 mL mL fil filtr trat at cont contoh, oh, masu masukk kkan an dala dalam m kolo kolom m resi resin, n, kran kran kolo kolom m res resin dalam dalam posi posisi si terbuka terbuka biarkan aliran aliran menetes menetes (hasil elusi) elusi) ditampung ditampung dalam labu takar takar 50 mL.
© BSN BSN 2016 2016 2016
3 dari dari 12
SNI 2354.10:2016 2354.10: 2354.10:20 2016
b) Tamb Tambahk ahkan an aquad aquades es pada pada saat saat tingg tinggii cair cairan an ± 1cm di atas resin resin dan biarkan biarkan caira cairan n terelusi. terelusi. Lakukan Lakukan seterusnya seterusnya hingga hingga hasil hasil elusi elusi dalam labu takar takar tepat 50 mL. Hasil elusi (contoh) (contoh) dapat disimpan disimpan dalam refrigerat refrigerator. or.
4.3.4
Pembentukan Pembentuk Pembentukan an senyawa senyawa turunan turunan (derivatisas (deri (derivatisasi) vatisasi) i)
Siapkan Siapkan tabung reaksi reaksi 50 mL masing-masing masing-masing untuk contoh, contoh, standar standar dan blanko. a) Pipet masing-masi masing-masing ng 5 mL filtrat filtrat contoh, contoh, larutan larutan standar standar kerja dan dan blanko blanko (HCl (HCl 0.1 N) N) b) Tambahkan Tambahkan kedalam tabung reaksi reaksi diatas diatas berturu berturut-tur t-turut: ut: kocok. 10 mL HCl 0,1 N, kocok. kocok, dalam dalam waktu waktu 5 menit menit harus harus sudah sudah ditam ditambah bah 1 mL OPT OPT 0,1%, 0,1%, 3 mL NaOH 1 N, kocok, kocok dan biarkan selama selama 4 menit. 3 mL H3PO4 3,57 N, kocok. c) Lakukan Lakukan pengukur pengukuran an fluor fluorose osence nce terh terhadap adap conto contoh, h, standar standar dan blank blanko o sesege sesegera ra mungkin mungkin dengan alat alat spektrofluor spektrofluorometer ometer pada panjang panjang gelombang gelombang exsitas exsitasi: i: 350 nm dan emisi: 444 nm dalam jangka waktu 90 menit. 4.4
Perhitungan
a) Masukkan Masukkan harga harga konsentrasi konsentrasi dan fluoresen fluoresensi si dari dari larutan larutan standar standar kerja ke dalam progra program m linier linier kalkul kalkulato ator. r. Nilai: Nilai: koefis koefisien ien korelas korelasii regresi regresi (r), (r), slope slope (b) dari dari intersep intersep (a) digunakan untuk menghitung konsentrasi contoh. Masukkan harga fluoresensi contoh ke persamaan regresi standar: y=a +bx keterangan: y : fluore fluoresen sensi si contoh; contoh; a : intersep; intersep; b: slop slope; e; x : konsentrasi konsentrasi contoh yang yang akan dihitung dihitung.. b) Setelah Setelah didapat didapat harga harga x, kalika kalikan n dengan dengan faktor faktor pengenc pengencera eran n dan kembal kembalika ikan n ke berat berat contoh. contoh. Nyatakan Nyatakan kandungan kandungan histamin histamin dalam (µg/g) (µg/g) atau mg/kg contoh. Konsentr Konsentrasi asi histam histamin in (µg/g (µg/g)) contoh contoh = A ×
volu volume me akhir akhir (mL) (mL) - fp
gram gram contoh contoh
Keterangan: A : Konsen Konsenttrasi rasi (X) yang yang didapatdala didapatdalam m perhit perhitunga ungan(µg n(µg/mL /mL))
5 5.1 a) b) c) d) e) f)
Penentuan Penentuan histamin hista histamin min secara KCKT Peralatan Homogenizer; Membran fifilter 0,45 µm µm; Pera Perala lata tan n gela gelas. s. Gela Gelas s pial piala, a, tabu tabung ng rea reaks ksii 50 mL, mL, pipe pipet, t, labu labu tak takar ar;; Sepe Sepera rang ngka katt peral peralat atan an KCKT KCKT dile dilengk ngkapi api denga dengan n det detek ekto torr fluor fluores esen en;; Sentrifugal; Timbangan analitik;
© BSN BSN 2016 2016 2016
4 dari dari 12
SNI 2354.10:2016 2354.10 2354.10:20 :2016
g) h) 5.2
Ultrasonic Ultrasonick k bath; Vortex. Vortex. Pereaksi
a) Laru Laruta tan n Asam Asam Trik Triklo loro roas aset etat at (TCA (TCA)) 10% untu untuk k mengek mengekst stra raks ksii cont contoh oh,, 100 g TCA TCA larutkan larutkan dengan dengan 1 L aquabides (sedikit (sedikit demi sedikit sedikit hingga larut larut sempurna); sempurna); b) Laruta Larutan n Asam Asam Trikl Triklo oroaset roasetat at (TCA) (TCA) 10% dalam dalam air pro KCKT; KCKT; Larutkan Larutkan 10 g TCA TCA dalam 100 mL air pro KCKT KCKT kemudian kemudian saring saring dengan dengan membran membran filter filter 0,45 0,45 µm. Larutan Larutan ini ini diguna digunakan kan untuk untuk membuat membuat dan mengen mengencer cerkan kan larut larutan an baku baku histamin. c) Air Air pro pro KC KCKT; KT; d) Laruta Larutan n OPA (orto(orto-fta ftalal laldeh dehid) id);; Larutkan Larutkan 20 mg OPA dalam 2 mL metanol, dalam setiap analisa analisa larutan larutan ini dibuat segar. e) NaOH aOH 1 N, N, larutkan larutkan 4 g NaOH NaOH dalam dalam 100 mL air air pro KCKT; KCKT; f) HCl 3 N; Encerkan Encerkan 12 mL HCl HCl 12,5 N (37%) (37%) dalam labu takar takar 50 mL. g) Asetonitri Asetonitrill pro KCK KCKT saring dengan membran membran filter filter PTFE; PTFE; h) Laruta Larutan n Natrium Natrium dihidr dihidrogen ogen fosfa fosfatt (NaH2 (NaH2PO4 PO4); ); Larutkan Larutkan 0,3449 0,3449 g NaH2PO NaH2PO4.H2O 4.H2O dalam 300 mL air pro KCKT KCKT saring saring dengan dengan membran membran filter filter 0,45 µm, µm, dalam setiap analisa analisa larutan larutan ini ini dibuat dibuat segar. i) Meta Metano noll pro pro KCKT KCKT;; j) Laru Laruta tan n baku baku hist histami amin; n; k) Larutan Larutan stok histami histamin n 1 mg/mL (1.000 (1.000 ppm); Timbang seksama lebih kurang kurang 169,1 mg histamin 2HCl (histamin dihidroklorid) larutkan dan tepatkan tepatkan menggunakan menggunakan larutan larutan TCA 10% dalam dalam labu takar takar 100 mL sampai batas. Simpan dalam refrigerato refrigerator. r. l) Laru Laruta tan n bak baku u 10 10 µg/ µg/mL mL;; Pipet Pipet 1 mL mL laru larutka tkan n stok stok (1.000 (1.000 ppm) ppm) masukk masukkan an ke dalam dalam labu labu taka takarr 100 mL dan tambahkan tambahkan larutan TCA TCA 10% sampai batas. batas. Larutan Larutan ini dapat digunakan digunakan maksimal maksimal satu minggu setelah dibuat. m) Larutan Larutan baku kerja. kerja. Buat larutan larutan kerja kerja 2,5 µg/mL, µg/mL, 5 µg/mL, µg/mL, 10 µg/mL µg/mL dan 20 µg/mL; µg/mL; Siapkan larutan baku kerja kerja ini dalam keadaan segar setiap akan digunakan. 5.3
Prosedur analisis
a) Blende Blenderr contoh contoh hingga hingga homogen. homogen. b) Timbang Timbang seks seksama ama leb lebih kurang kurang 50 g contoh contoh ke dala dalam m gelas gelas piala, piala, tambah tambahkan kan 100 100 mL TCA 10% kemudian blender. blender. c) Pindahkan Pindahkan kedalam kedalam tabung reaksi 50 mL, sentrif sentrifugal ugal pada pada 3.500 rpm selama selama 10 menit. Saring supernatan supernatan dengan membran membran filter filter 0,45 µm kemudian kemudian simpan simpan pada pada suhu suhu refrig refrigera erator tor (± 4 °C). °C). d) Deri Deriva vati tisa sasi si.. e) Pipet masing-ma masing-masing sing 135 µL larutan larutan baku baku kerja kerja dan filtrat filtrat contoh, contoh, masukkan masukkan kedalam kedalam tabung reaksi 10 mL. f) Tambahkan Tambahkan masing-masi masing-masing ng kedalam kedalam larutan larutan baku baku kerja dan filtrat filtrat contoh berturut-tur berturut-turut: ut: 1,86 mL air pro KCKT kemudian kemudian divortex. divortex. N, biarkan selama 1 menit. 0,4 mL NaOH 1 N, 0,1 mL larutan larutan OPA, vortex dan biarkan selama 4 menit. menit. HCl 3 N, vortex. vortex. 0,2 mL HCl g) Masukkan Masukkan ke ke vial dan siap siap untuk diinjeksika diinjeksikan n ke kromatogr kromatograf. af. h) Lakukan Lakukan penger pengerjaan jaan blanko blanko 135 µL Laruta Larutan n Asam Asam Triklo Trikloroa roaset setat at (TCA) (TCA) 10%penggant penggantii contoh dan dikerjakan seperti pengerjaan contoh. © BSN BSN 2016 2016 2016
5 dari dari 12
SNI 2354.10:2016 2354.10: 2354.10:20 2016
i)
Injeks Injeksika ikan n kedala kedalam m kromat kromatogr ograf af seca secara beruruta berurutan n larutan larutan blanko blanko baku, baku, baku baku kerja kerja dari konsentrasi konsentrasi terendah, terendah, blanko pereaksi pereaksi dan contoh. Rekam area puncak kromatogram kromatogram utama dari masing-masing larutan yang diinjeksikan.
5.4
Kondisi Kondisi KCKT
a) b) c) d) e) f) g) h)
Dete Detekt ktor or : fluo fluore rese sens ns (hig (high h pre press ssur ure e xeno xenon n lam lamp) p).. Eksitasi : 350 nm. Emisi : 450 nm. Kolo Kolom m : C-18 C-18 (4,6 (4,6 mm x 220 220 mm) mm) terk terkem emas as deng dengan an ukur ukuran an part partik ikel el 5 µm. µm. Fase Fase ger gerak ak : aset asetoni onitr tril il : Natr Natriu ium m dihid dihidro rogen gen fosf fosfat at 50 mmo mmol/ l/ll (30 (30 : 70). 0). Laju alir : 0,7 mL/menit. Volu Volume me inje injeks ksi: i: 20 µl. Pastik Pastikan an peralat peralatan an KCKT KCKT berfun berfungsi gsi deng dengan an baik baik dan lakuk lakukan an uji kese kesesua suaian ian sist sistem em
5.5
Perhitungan
5.5.1
Perhitungan menggunakan menggun menggunakan akan 1 (satu) titik konsentrasi konsentras konsentrasii standar standar ( AC - ABPr )
Kandung Kandungan an hist histami amin n ( g/g) g/g)=
( AS - A ABS )
x Cstd x V A W
Keterangan: AC : Area contoh; contoh; ABPr : Area blanko blanko pereaksi; pereaksi; AS : Area Area baku; baku; A ABS Cstd V A W 5.5.2
: Area blanko baku; : Konsentrasi Konsentrasi baku (µg/mL); (µg/mL); : Volume Volume akhi akhirr (mL); (mL); : Be Berat co contoh (g).
Perhitungan menggunakan menggun menggunakan akan kurva standar
Masukkan Masukkan harga harga konsentras konsentrasii dan luas luas area dari dari larutan larutan standar standar kerja ke dalam dalam program program linear. linear. Nilai koefisien koefisien korelasi korelasi regresi regresi (r), (r), kemiringan kemiringan (slope) (slope) (b) dan inters intersep ep (a) (a) digunakan digunakan untuk menghitung menghitung konsentra konsentrasi si contoh. contoh. Masukkan Masukkan luas luas area contoh contoh ke persamaan persamaan regresi regresi standar: y = a +b +b x Keterangan: y: area area contoh contoh a: intersep; intersep; b: kemiringan kemiringan (slope); x: konsentrasi contoh yang akan dihitung (µg/mL). (µg/mL). Setelah Setelah didap didapat at nilai nilai x, kalika kalikan n dengan dengan volume volume akhir akhir dan kemba kembalik likan an ke berat berat contoh contoh.. Nyatakan Nyatakan kandungan kandungan histamin histamin dalam (µg/g) (µg/g) atau (mg/kg) contoh. contoh.
Kandungan Kandungan histamin histamin (mg/kg) (mg/kg) =
© BSN BSN 2016 2016 2016
6 dari dari 12
A x V A 1000 × W 1000
SNI 2354.10 2354.10: 2354.10:2016 .10:20 :2016 2016 16
Keterangan: A : Konsen tr trasi (x) yang di did ap apat dalam perhitungan (µ (µg/mL) V A : Volume Volume akhi akhirr (mL); (mL); W : Be Berat co contoh (g).
6
Pelaporan
a) Jika angka desimal desimal kurang kurang dari 5 maka pembulatan pembulatan kebawah, kebawah, tetapi bila bila lebih dari5 pembulatan keatas. CONTOH: 14,454 dibulatkan menjadi 14,45 14,466 dibulatkan menjadi 14,47 b) Jika angka ke tiga di belakang belakang koma 5, dan angka kedua genap, genap, makaangka 5 tersebut tersebut menjadi hilang tetapi bila angka kedua ganjil maka pembulatan keatas. CONTOH: 14,765 dibulatkan menjadi 14,76 14,475 dibulatkan menjadi 14,48
7
Keamanan Keamanan dan keselamatan keselamatan kerja kerja
Untuk menjaga keamanan keamanan dan keselamatan kerja kerja selama melakukan melakukan analisa maka perlu diperhatikan hal-hal sebagai berikut: a) Cuci tangan tangan sebelum sebelum dan sesudah sesudah melakukan melakukan analisa. analisa. b) Gunakan Gunakan jas laboratoriu laboratorium m selama bekerja. bekerja.
© BSN BSN 2016 2016 2016
7 dari dari 12
SNI 2354.10:2016 2354.10: 2354.10:20 2016
Lampiran Lampiiran Lamp ran A (informatif) Validasi Validasi metode metode penentuan penen penentua penentuan tuan n histamin hista hist amin min dengan dengan KCKT
A.1 A.1.1
Uji linearitas linearitas Linearitas Kurva Standar
Gambar Gambar A.1 - Kurva kalibrasi larutan larutan standar standar histamin histamin Kurva standar standar menunjukkan linearitas dengan koefisien korelasi regresi 0,9938 – 0,9993. A.1.2
Linearitas Spike sampel
Uji linieritas dilakukan dari data spike sampel yang berasal dari data tabel uji akurasi, selanju selanjutny tnya a dibuat dibuat kurva kurva antara antara kons konsent entras rasii spike spike (0; (0; spike spike lod; lod; 0,5 MRL; MRL; 1 MRL dan dan 1,5 MRL) versus versus area sampel. sampel. Nilai koefisien koefisien korelasi korelasi regresi regresi adalah 0,9913 – 0,9957 seperti pada gambar gambar kurva linearitas linearitas dibawah ini:
Gambar Gambar A.2 - Kurva kalibrasi spike spike sampel sampel
© BSN BSN 2016 2016 2016
8 dari dari 12
SNI 2354.10:2016 2354.10 2354.10:20 :2016
A.2
Uji batas batas deteksi deteksi histamin histamin Tabel Tabel A.1 Hasil Hasil uji LOD LOD dan LOQ LOQ LOQ
No.
Luas Area
Uraian
1
Spiked 10 µg/g
1 1884200
2
Blanko Sampel
196567
2 1886056
3 2000579
4 1732191
5 1807526
6 1769741
7 1917759
203321
193708
198069
200348
194063
197922
Kadar Spiked Sampel (µg/g) dan Kadar Blanko Sampel (µg/g)
3
Kadar Spiked Sampel
9,96
9,97
10,58
9,16
9,55
9,35
10,13
4
Kadar Blanko Sampel
1,42
1,46
1,40
1,43
1,44
1,40
1,43
5
Rerata Luas Area Blanko Sempel
197714,000
6 7
Rerata Luas Area Spiked 10 µg/g Rerata Kadar Spiked Sampel
1856864,571 9,81 µg/g
8
Rerata Kadar Blanko Sampel
9
SD Blanko Sampel
10
SD Spiked Sampel
0,490
11
3 SD
0,073 0,146
1,43
µg/g
0,024
12
6 SD
13
LOD
1,50
µg/g
14
LOQ
1,57
µg/g
Uji batas deteksi dilakukan dengan pengujian terhadap blanko sampel sebanya tujuh kali ulangan (replikat), (replikat), menghasilkan rata-rata konsentrasi 1,43 mg/kg dengan standar deviasi 0,024. 0,024. Dari Dari rata-rat rata-rata a tersebut tersebut maka maka dapat ditent ditentukan ukan batas batas detek deteksi si (LOD (LOD = 1,50 1,50 mg/kg) mg/kg) dan batas determinasi determinasi (LOQ = 1,57 mg/kg). mg/kg). A.3
Uji akurasi aku akuras rasii (% recovery ) dan presisi presisi (standar (standar deviasi) dev deviasi) iasi)
Uji akurasi dilakukan dengan pengujian terhadap blanko sampel yang telah diperkaya (dispike) (dispike) larutan larutan standar standar histamin histamin 50 µg/g µg/g (2,5 (2,5 mL dari dari 1000 mg/L) mg/L) dilakukan dilakukan 7 ulangan ulangan (replikat) (replikat),, disajikan disajikan dalam Tabel A.2: Tabel Tabel A.2 - Data Dat Data a uji uji akuras aku akurasi rasii spike spike sampel sam sampe sampel pell 50 mg/kg mg/kg (50 g + 2,5 mL larut lar laruta utan an n stand sta standa ndar ar r histamin hista hist amin min 1000 mg/L) Standar Baku µg/mL 0 2.5 5 10 25 Intercept (a) Slope (b) R2 No.
Nama Sampel Sampel
Bobot (g)
Luas Area
Luas Area 0 737250 1211639 2594909 6249436 42387,361 248971,699 0,9993 Volume akhir (mL)
Konsentrasi sampel (µg/mL)
Kadar Histamine awal (µg/g)
1 2
Blanko Blanko Spike Sampel-1
50,0528 50,0528 50,0874
244875 244875 5786452 5786452
100 100 100 100
0,8133 0,8133 23,0712 23,0712
46,06
3
Spike Sampel-2
50,0265
5743353 5743353
100 100
22,8980 22,8980
45,77
4
Spike Sampel-3
50,0632
5780865 5780865
100 100
23,0487 23,0487
46,04
5
Spike Sampel-4
50,0155
5244522 5244522
100 100
20,8945 20,8945
6
Spike Sampel-5
50,0537
5689004 5689004
100 100
7
Spike Sampel-6
50,0187
5368548 5368548
8
Spike Sampel-7
50,0259
5600049 5600049
Kadar Blanko Blanko (µg/g) 1,62 -
44,44
88,87
-
44,15
88,29
-
44,41
88,83
41,78
-
40,15
80,30
22,6798 22,6798
45,31
-
43,69
87,37
100 100
21,3926 21,3926
42,77
-
41,14
82,29
100 100
22,3225 22,3225
44,62
-
43,00
Rata-rata Rata-rata
© BSN BSN 2016 2016 2016
Kadar Recovery Histamine (%) (µg/g)
9 dari dari 12
85,99
43,00 43,00
85,99 85,99
SD
1,7034 1,7034
3,4069 3,4069
% RSD
3,96
3,96
SNI 2354.10:2016 2354.10: 2354.10:20 2016
Dari hasil uji akurasi diperoleh % recovery rata – rata 85,99%. Uji akurasi dilakukan dengan pengujian terhadap blanko sampel yang telah diperkaya (dispike) (dispike) larutan larutan standar standar histamin histamin 100 µg/g µg/g (5 mL dari dari 1000 mg/L) mg/L) dilakukan dilakukan 7 ulangan ulangan (replikat) (replikat),, disajikan disajikan dalam Tabel A.3 Tabel Tab Tabe ell A.3 - Data Data uji uj ujii akuras aku akurasi rasii spike spike sampel sam sampe sampel pell 100 mg/k mg/kg g (50 g + 5 mL Standar Stand Standar ar Baku Baku Histamine 1000 mg/L) Standar B Baku aku µg/mL 0 5 10 25 50 Intercept (a) Slope (b) R2
No.
Nama Sampel
1 2
Blanko Sampel Spike Sampel-1
3 4
Bobot (g) 50,0714
Luas Luas Area 0 1793099 3510049 7224836 12968622 525564,521 254097,593 0,9938 Volume Akhir (mL)
Luas Area 353310
Kadar Konsentrasi Histamine Histamine Sampel (µg/mL) Awal (µg/g) 0,9083 0,9083
Kadar Blanko (µg/g)
Kadar Recovery Histamine Histamine (%) (µg/g)
1,81
-
-
45,1402 45,1402
90,19 90,19
-
88,37
88,37
100 100
42,5609 42,5609
85,07 85,07
-
83,25
83,25
100 100
44,0558 44,0558
88,08 88,08
-
86,26
86,26
12103712 12103712 12087635 12087635
100 100 100 100
45,5658 45,5658 45,5025 45,5025
91,04 91,04 90,95 90,95
-
89,23
-
89,13
89,23 89,13
50,0701 50,0701
11586797 11586797
100 100
43,5314 43,5314
86,94 86,94
-
85,13
85,13
50,0417 50,0417
11159326 11159326
100 100
41,8491 41,8491
83,63 83,63
-
81,81
81,81
50,0528 50,0528
11995583 11995583
100 100 100
Spike Sampel-2
50,0314 50,0314
11340199 11340199
Spike Sampel-3
50,0207 50,0207
11720046 11720046
5 6
Spike Sampel-4 Spike Sampel-5
50,0502 50,0502 50,0318 50,0318
7
Spike Sampel-6
8
Spike Sampel-7
Rata-rata
86,17 86,17
86,17
SD
2,9306 2,9306
2,9306 2,9306
% RSD
3,40
3,40
Dari hasil uji akurasi diperoleh % recovery rata – rata 86,17%. Uji akurasi dilakukan dengan pengujian terhadap blanko sampel yang telah diperkaya (dispike) (dispike) larutan larutan standar standar histamin histamin 150 µg/g µg/g (7,5 mL dari dari 1000 mg/L) mg/L) dilakukan dilakukan 7 ulangan ulangan (replikat) (replikat),, disajikan disajikan dalam Tabel A.4.
© BSN BSN 2016 2016 2016
10 dari dari 12
SNI 2354.10:2016 2354.10 2354.10:20 :2016
Tabel Tabel A.4 Data Data uji akurasi akurasi spike spike sampel sam sampe pell Spike Spike Sam Sampel 150 mg/kg mg/ mg/k mg/kg kg g (50 g + 7,5 7,5 mL Standar Baku Histamine 1000 mg/L) Standar Baku µg/mL 0 10 25 50
Luas Area 0 3891751 7127640 13928487
75 Intercept (a (a) Slope (b) R2 No.
Nama Sampel Sampel
1 2
Blanko Blanko Spike Spike Sampel-1 Sampel-1
3 4
Volume Akhir (mL)
Luas Area
Bobot (g) 50,0473
19694147 674900,786 257922,007 0,9956
315746
Konsentrasi Sampel (µg/mL)
Kadar Histamine Histamine awal (µg/g)
Kadar Blanko Blanko (µg/g) 1,83
Kadar Histamine Histamine (µg/g)
Recovery (%)
50,0237 50,0237
19201838 19201838
100 100 100
0.9168 0.9168 71.8315 71.8315
143,60 143,60
-
141,76
94,51
Spike Sampel-2 Sampel-2
50,0721 50,0721
18222093 18222093
100 100
68.0329 68.0329
135,87 135,87
-
134,04
89,36
Spike Sampel-3 Sampel-3
50,0320 50,0320
19822754 19822754
100 100
74.2389 74.2389
148,38 148,38
-
146,55
97,70
5
Spike Sampel-4 Sampel-4
50,0529 50,0529
18960982 18960982
100 100
70.8977 70.8977
141,65 141,65
-
139,81
93,21
6
Spike Sampel-5 Sampel-5
50,0296 50,0296
17738536 17738536
100 100
66.1581 66.1581
132,24 132,24
-
130,41
86,94
7
Spike Sampel-6 Sampel-6
50,0652 50,0652
19118505 19118505
100 100
71.5085 71.5085
142,83 142,83
-
141,00
94,00
8
Spike Sampel-7 Sampel-7
50,0613 50,0613
18124113 18124113
100 100
67.6531 67.6531
135,14 135,14
-
133,31
88,87
Rata-rata
-
138,13 138,13
-
92,08
SD
5,6983 5,6983
3,7989 3,7989
% RSD
4,13
4,13 4,13
Dari hasil uji akurasi diperoleh % recovery rata – rata 92,08%. Hasil uji akurasi (% recovery) memenuhi kriteria persyaratan keberterimaan recovery untuk metode kuantitatif (CD 96/23/2002 dan CD 2002/657/EC) 2002/657/EC) yaitu 80% sampai 120%. Tabel Tabel A.5 - Nilai minimum minimum recovery recovery metode metode Konsentrasi
50% - 80% 80%
> 1 µg/kg µg/kg - 10 µg/kg µg/kg
70% - 80%
≥ 10 µg/kg Sumber Sumber : CD 2002/65 2002/657/E 7/EC. C.
© BSN BSN 2016 2016 2016
Kisaran
≤ 1 µg/kg
11 dari dari 12
80% - 120% 120%
SNI 2354.10:2016 2354.10: 2354.10:20 2016
Nilai presisi (relative (relative standard deviation/RSD deviation/RSD)) memenuhi persyaratan persyaratan keberterimaa keberterimaan n sesuai dalam Tabel Horwitz Horwitz Value dibawah dibawah ini. Tabel A.6 - Horwitz Horwitz Value Value Kisaran K Konsentrasi Konsen onsenttrasi rasi 1 (100%)
2
0,1
2,8
0,01 (%)
4
0,001 (g/kg)
5,6
0,00001
8
0,00001
11
1 mg/kg (ppm)
16
50 mg/kg
8,88
100 mg/kg
8
150 mg/kg
7,52
0,1 mg/kg
2,3
0,01 mg/kg
32
µg/kg (ppb) Sumber Sumber : CD 2002/65 2002/657/E 7/EC C (1-0,5lo (1-0,5log g C)
Rumus Rumus CV Horv Horvit itz z =2
© BSN BSN 2016 2016 2016
RSD RSD (%)
12 dari dari 12
45
