SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS Y DETERMINACIÓN DE PESOS MOLECULARES Secuenciación de proteínas La secuenciación de una cadena polipeptídica es imprescindible para comprender la base estructural de la función de las proteínas, ya que es precisamente la naturaleza de los aminoácidos componentes la que determina la estructura tridimensional de las mismas y, consecuentemente, sus propiedades. El análisis de la secuencia de una proteína o cadena polipeptídica se lleva a cabo, por lo general, según los pasos siguientes:
Rotura de todos los puentes disulfuro: Cys-S-S-Cys. Separación y purificación de las cadenas polipeptídicas individuales, si la proteína tuviera más de una. Análisis de la composición de aminoácidos. Identificación de los aminoácidos N-terminal y C-terminal. Fragmentación de la cadena polipeptídica nativa por rotura, especifica o no especifica, en puntos internos, y posterior separación y secuenciación de los distintos fragmentos. Ordenación de los fragmentos peptídicos pequeños y establecimiento de la secuencia del polipéptido original. Localización de los puentes disulfuro tanto en como entre las cadenas polipeptídicas.
En estos estudios se utilizan básicamente técnicas cromatográficas y electroforéticas, así como la reacción de identificación de aminoácidos con ninhidrina.
Rotura de puentes disulfuro Los puentes disulfuro, con frecuencia entrecruzados, deben romperse antes de proceder al análisis de aminoácidos de una proteína. Para ello se reducen con un tiol y posteriormente se alquilan para impedir, por una parte, la reasociación al azar de los distintos grupos -SH formados y, por otra, estabilizar los residuos de cisteína durante la hidrólisis ácida de las cadenas polipeptídicas. La rotura de dichos puentes procede así:
De esta forma el residuo de cisteína queda alquilado, en forma de S-carboxi-metilcisteína. Otros agentes utilizados en la alquilación de grupos -SH son la iodoacetamida y la etilenimina. Otra forma de romper los puentes disulfuro intercatenarios consiste en la oxidación con acido perfórmico, desarrollada por Sanger: 1
Una vez escindidas, las cadenas se separan por cromatografia de cambio iónico, o electroforesis. En el caso de que una proteína tuviera una sola cadena polipeptídica, pero existieran puentes disulfuro intracatenarios, habría que romperlos y alquilar las correspondientes cisteínas, antes de proceder a la hidrólisis de dicha cadena.
Separación y purificación de cadenas polipeptídicas Antes de analizar la secuencia de aminoácidos de una proteína se ha de determinar previamente el número de cadenas polipeptídicas que la integran. Si la unión entre las cadenas es covalente, se procede como hemos visto en el apartado anterior. Por otra parte, si las cadenas no están unidas por enlaces covalentes, se pueden separar por tratamiento con ácidos o bases, alta concentración de sales, calor y agentes desnaturalizantes, altas concentraciones de urea o guanidina, etc.
Determinación de la composición de aminoácidos La composición de aminoácidos de una cadena polipeptídica se determina después de hidrolizar totalmente los enlaces peptídicos. Esta hidrólisis normalmente se efectúa en medio ácido, con HCI 6 N, en una ampolla cerrada al vacío, y calentando a 110 °C durante 24 h, como mínimo. Los aminoácidos resultantes se separan y se miden cuantitativamente en un analizador automático. EI tratamiento ácido presenta diversos inconvenientes:
Hidroliza totalmente la glutamina y asparraguina, a glutámico y aspártico, respectivamente, más NH3, por lo que el Glu resultante indica (Glu + Gln) y el Asp indica (Asp + Asn) de la proteína nativa. Si cuantificamos el amoniaco obtenido podemos deducir la cantidad original de glutamina y asparraguina. La serina y treonina se destruyen parcialmente durante la hidrólisis, por lo que se suelen realizar tres hidrolizados con HCI, 6 N, durante 24, 48 y 72 horas, determinándose el contenido de estos aminoácidos por extrapolación a tiempo cero. También se destruyen por el tratamiento ácido la cisteína y el triptófano; por ello, la cisteína se determina como ácido cisteico, después de oxidar la muestra con acido perfórmico, según el método descrito por Moore (l963). EI triptófano se determina espectrofotométricamente, por el método de Edelhoch (l967).
Identificación de los aminoácidos terminales EI aminoácido N-terminal de una cadena polipeptídica, convencionalmente el primer aminoacido, se señala haciendo reaccionar la cadena polipeptídica con 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (FDNB) o reactivo de Sanger. EI 2,4-dinitrofenil-derivado resultante se somete a la hidrólisis ácida, en presencia de HCI 6N, durante la que se hidrolizan los enlaces peptídicos de la cadena, mientras que permanece intacto el enlace del primer aminoácido con el grupo 2,4-dinitrofenilo. EI derivado correspondiente al primer aminoácido, de color amarillo, se separa fácilmente del resto de los aminoácidos del hidrolizado, y se identifica por cromatografía, utilizando como patrones los dinitrofenil-derivados sintéticos de los diferentes aminoácidos. Las reacciones químicas mencionadas transcurren de la siguiente manera: 2
EI método de Sanger, históricamente importante por el establecimiento de la secuencia de la insulina, está siendo sustituido por otros métodos de marcado más sensibles y eficaces. Uno de ellos es el que emplea cloruro de I-dimetil-amino-naftalen-5-sulfonilo o cloruro de dansilo, que es un reactivo fluorescente que permite detectar y medir pequeñas cantidades del aminoácido N-terminal. Se trata de un reactivo cien veces más sensible que el FDNB, y las etapas básicas de la obtención del dansil-derivado del aminoácido N-terminal de una cadena polipeptídica se indican a continuación:
La degradación de Edman es el método más utilizado actualmente para identificar el primer aminoácido. Utiliza fenil-isotiocianato (reactivo de Edman) que al reaccionar con la cadena polipeptídica da el derivado feniltiohidantoínico correspondiente al aminoácido N-terminal de la cadena, el cual puede separarse e identificarse cromatográficamente, dejando intacto el resto de la cadena polipeptídica. La reacción procede así:
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El polipéptido resultante puede hacerse reaccionar de nuevo con el reactivo de Edman para identificar el siguiente aminoácido, y así sucesivamente, con lo que se pueden identificar completamente secuencias de pequeños péptidos. En l967, P. Edman y G. Begg diseñaron un secuenciador de proteínas, instrumento que realiza automáticamente los distintos pasos de la degradación de Edman y que puede secuenciar completamente, aminoácido a aminoácido, polipéptidos de 30-40 residuos. Hay casos en que el aminoácido N -terminal de una proteína está situado en el interior de la molécula, o bien bloqueado por la unión covalente de otros grupos, con lo que resulta inaccesible a este tratamiento. La identificación del aminoacido C-terminal de una cadena polipeptídica se lleva a cabo enzimáticamente, usando carboxipeptidasas A o B, que catalizan la hidrólisis secuencial del aminoácido final, que se separa del resto de la cadena y se identifica por cromatografía. La especificidad de estas enzimas está recogida en la tabla al final del tema. El aminoácido C-terminal también se puede determinar por reducción con borohidruro de litio al correspondiente aminoalcohol. Posteriormente se hidroliza la cadena polipeptídica, se separan los aminoácidos por cromatografía, y el único α-aminoalcohol presente se debe al aminoácido Cterminal. Otro método para determinar el último aminoácido consiste en la hidrazinolisis de la cadena polipeptídica, que rompe todos los enlaces peptídicos, formándose las aminoacilhidrazidas correspondientes a todos los aminoácidos, excepto del C-terminal, que se identifica fácilmente por cromatografía. Dicha reacción procede así:
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Fragmentación de la cadena polipeptídica: separación e identificación de los fragmentos resultantes Una vez identificados los aminoácidos terminales de una cadena se procede a su fragmentación en trozos de diez a quince residuos, mediante el uso de distintos agentes enzimáticos o químicos, que rompen más o menos específicamente los enlaces peptídicos. El tratamiento con bromuro de cianógeno, que rompe aquellos enlaces peptídicos en los que el grupo carbonilo procede de un residuo de metionina, es el procedimiento más específico de rotura interna de un péptido, y se desarrolla de la siguiente manera:
El reactivo rompe el enlace peptídico detrás del grupo carbonilo y convierte a la metionina en homoserín-lactona. El siguiente tratamiento más especifico es la digestión de la cadena polipeptídica con tripsina, que hidroliza los enlaces peptídicos en los que el grupo carbonilo procede de un aminoácido básico, como lisina o arginina. Una cadena polipeptídica con seis residuos de lisina o arginina producirá siete fragmentos polipeptídicos, después de su incubación con tripsina. La especificidad de rotura de la tripsina se puede alterar por modificación química del polipéptido. Los residuos de lisina se pueden bloquear con anhídrido maleico, y esto hace que la tripsina rompa sólo el enlace peptídico donde se encuentra una arginina. Efectuando el tratamiento de los residuos de cisteína con etilenimina se obtiene aminoetilcisteína, análogo de lisina, y la tripsina rompe los enlaces peptídicos adyacentes al carbonilo de este 5
grupo amino-etilado. Estos tratamientos se pueden representar mediante las fórmulas que pueden verse a continuación:
Otras enzimas utilizadas en estos tratamientos, como quimotripsina, termolisina, pepsina, etc., son menos especificas en la rotura de los enlaces peptídicos internos, como se recoge en la tabla al final del tema. Los fragmentos resultantes se separan por cromatografía o electroforesis, determinándose la composición de aminoácidos de cada uno de ellos. Los péptidos de más de treinta residuos se someten a un segundo tratamiento de rotura, separación y análisis de aminoácidos. La separación de los fragmentos peptídicos es el paso más laborioso en la secuenciación de una proteína.
PROBLEMAS RESUELTOS 1.- Dedúzcase la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica, a partir de la siguiente información: a) La hidrólisis ácida completa dio la siguiente composición de aminoácidos: 1 Pro, 2 Glu, 1 Asp, 1 Arg, 1 Ile, 1 Phe, 1 Trp. b) Por tratamiento con quimotripsina se produce Ile, un tripéptido y un tetrapéptido. c) El tripéptido tiene carga neutra, a pH 7,5, y al tratado con cloruro de dansilo, seguido de hidrólisis ácida, se aislaron el derivado dansílico de Pro y cantidades equimoleculares de Glu y Trp. d) Al tratar el tetrapéptido con tripsina se obtuvo Phe y un tripéptido con carga negativa, a pH 7,5, que al ser tratado con fenilisotiocianato, seguido de hidrólisis ácida, daba el derivado correspondiente del ácido glutámico.
Solución: a) Se trata de un octapéptido. b) Las únicas secuencias posibles compatibles con este apartado son: aa1-aa2-aa arom.-aa4-aa5-aa6-aa arom.-Ile
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O bien aa1-aa2-aa3-aa arom.-aa4-aa5-aa arom.-Ile c) El primer aminoácido (N-terminal) del tripéptido es Pro. De acuerdo con 1, el último aminoácido (C-terminal) del tripéptido es Trp, y el otro aminoácido será Gln, ya que, a pH7,5, la carga global del tripétido es neutra. Luego tenemos: Pro-Gln-Trp d) En el tetrapéptido, Phe debe aportar el grupo carboxilo terminal, ya que este aminoácido se libera al tratarlo con tripsina, y Arg es el aminoácido precedente dada la especificidad de la tripsina. Como la molécula tiene carga negativa, a pH 7,5, deben existir dos grupos ácidos, además de la Arg. El primer aminoácido es el Glu, luego tenemos: Glu-Asp-Arg-Phe Como la quimotripsina no hidroliza el enlace peptídico con R x = aminoácido aromático si R x + 1 = Pro, la secuencia final del octapéptido será, sin duda: Pro-Gln-Trp-Glu-Asp-Arg-Phe-Ile 2.- La hidrolisis parcial de una proteína dio un cierto número de polipéptidos. Se purificó uno de ellos. Deducir la secuencia de aminoácidos de este polipéptido a partir de los siguientes datos: a) La hidrolisis acida total dio ala + arg + 2 ser + Iys + phe + met + trp + pro. b) EI tratamiento con fluordinitrobenceno (FDNB, reactivo de Sanger) seguido de hidrólisis ácida total, dio dinitrofenilalanina (DNP-ala) y ε-dinitrofenillisina (ε-DNP-Iys) como únicos DNP-derivados. c) Ni la carboxipeptidasa A ni la B liberaron el aminoacido C-terminal. d) EI tratamiento con bromuro de cianógeno (CNBr) dio dos péptidos. Uno contenía ser + trp + pro. EI otro contenía todos los aminoácidos restantes (incluyendo la segunda ser). e) EI tratamiento con quimotripsina dio tres péptidos. Uno contenía solo ser + pro. Otro contenía solo met + trp. EI tercero contenía phe + Iys + ser + arg + ala. f) EI tratamiento con tripsina dio tres péptidos. Uno contenía solo ala + arg. Otro solo Iys + ser. EI tercero contenía phe + trp + met + ser + pro.
Solución (a) El FDNB reacciona con los grupos amino libres dando el derivado DNP-aminoácido por hidrólisis. Así, el aminoacido N-terminal es alanina. La lisina está en el interior de la cadena y tiene su grupo εamino libre. Por tanto, el péptido es lineal, no circular. (b) La carboxipeptidasa A romperá todos Ios aminoácidos C-terminal excepto arginina, lisina y prolina. La carboxipeptidasa B romperá solo cuando el C-terminal sea arginina o lisina. Ninguna de las dos actuará sobre el C-terminal si el penúltimo aminoácido es prolina. La falta de productos con ambas enzimas nos dice que la prolina es el último o el penúltimo residuo. Nota. Las carboxipeptidasas continuarán rompiendo los sucesivos aminoacidos C-terminal si es posible. Por tanto, lo que realmente analizamos es la identidad del aminoácido que se libera más rápidamente. (c) El bromuro de cianógeno rompe específicamente la unión del grupo carboxilo de los residuos de metionina. (La metionina se convierte en homoserina.) Los datos, por tanto, nos dicen que el tripéptido liberado por el bromuro de cianógeno es el C-terminal (contiene prolina). Así, los cuatro últimos residuos incluyen a la metionina seguida de triptófano, serina y prolina (pero la secuencia de los tres últimos no se conoce). (d) La quimotripsina rompe el grupo carboxilo de la fenilalanina, tirosina, triptófano y leucina, con tal de que el siguiente residuo (el del grupo amino) no sea prolina. La composición de uno de los 7
dipeptidos de la quimotripsina confirma que el extremo C-terminal del péptido original es met-trp-serpro. El aminoácido que precede a la metionina debe ser fenilalanina (el único residuo que queda capaz de ser hidrolizado por la quimotripsina). Así, la secuencia terminal es phe-met-trp-ser-pro. (e) La tripsina rompe el grupo carboxilo de la lisina y arginina con tal de que el siguiente aminoácido (el que da el grupo amino) no sea prolina. Ya que la alanina es N-terminal, el principio de la secuencia debe ser ala-arg-ser-lys. La secuencia total será: FDNB
Tripsina
Quimotripsina
ala---arg---ser---lys---Phe---met---trp---ser---pro CNBr
REACTIVOS Y ENZIMAS MÁS CORRIENTES UTILIZADOS PARA ROTURA Y ANÁLISIS DE PÉPTIDOS Reactivos y enzimas
Sitio de acción
Especificidad
Observaciones
I. Generales HCl 6 N
Enlace peptídico
Todos
Al vacío, 110ºC
Ac. perfórmico
‐ ‐ ‐
SS
Todos
Produce –SO3H
Fluorodinitrobenceno
R1
H2N‐R1
Color amarillo
R1
H2N‐R1
Fluorescente
(FDNB) Cloruro de dansilo
II. Rotura terminal Degradación de Edman
Lado C de R1
Todos los Aa
No actúa si el N‐terminal es bloqueado
Carboxipeptidasa‐A
Lado N de Rn
Rn ≠ Arg, Lys, Pro
Separa 1‐4 Aa secuencialmente
Carboxipeptidasa‐B
Lado N de Rn
Rn = Arg, Lys, AECys
Separa 1‐4 Aa secuencialmente
Rn 1 ≠ Pro ‐
Hidrazinolisis
Enlaces peptídicos
Solo se usa en ausencia de carboxipeptidasas
Libera Rn Leucina aminopeptidasa
R1
H2N‐R1 R2 ≠ Pro
Ataque más rápido si R1 = alquilo o arilo
III. Roturas internas BrCN (Bromuro de
Lado C de Rx
Rx = Met
Muy específico
Lado C de Rx
Rx = Met, Trp
Muy específico
cianógeno) BrCN anhidro
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Tripsina
Lado C de Rx
Rx = Lys, Arg
Muy específico
Rx+1 ≠ Pro Tripsina (después del
Lado C de Rx
tratamiento con
Lado C de Rx
tratamiento con
Rx = Lys, Arg, AECys
Muy específico
Rx+1 ≠ Pro
etilenimina) Quimiotripsina
Muy específico
Rx+1 ≠ Pro
anhídrido maleico) Tripsina (después del
Rx = Arg
Lado C de Rx
Rx = Phe, Tyr, Trp, Leu
A veces efectivo
Rx+1 ≠ Pro
Rx = Asn, Met
Fosfatasa ácida
Lado C de Rx
Rx = Asp, Glu
Muy específica
Papaína
Lado C de Rx
Rx = Arg, Lys, Gly, Gln, His, Tyr, Ser, Ala
No actúa sobre R ácidos
Subtilisina
Lado C de Rx
Rx = Tyr, Phe, Trp, Leu
A veces Rx = Ala
Proteasa estafilocócica
Lado C de Rx
Rx = Glu
A veces Rx = Asp
Clostripaína
Lado C de Rx
Rx = Arg
Muy específica
Pepsina
Lado N de Rx
Rx = Leu, Asp, Glu, Phe, Tyr, Trp
Poco específica Rx 1 ≠ Pro ‐
Termolisina
Lado N de Rx
Rx = Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Val
Poco específica
R1 = Primer aminoácido; Rn = ‐Último aminoácido; Rx = residuo intermedio; AECys = Aminoetil cisteína
PROBLEMAS NO RESUELTOS Secuenciación de proteínas 1. A partir del siguiente polipéptido: Val-Phe-Cys-Glu-Phe-Pro-Thr-Trp-Arg-Glu-Ser-Tyr-Asp-LysGly indíquese: a) los péptidos que se obtendrían al tratarlo con fosfatasa ácida b) los productos que se obtendrían al tratar los péptidos resultantes del apartado anterior con quimotripsina. 2. Determínese la secuencia de un péptido sabiendo que: a) Su reacción con fenil-isotiocianato produce el derivado tiohidantoínico de la Ala y un tetrapéptido b) el tratamiento del tetrapéptido anterior con tripsina produce dos dipéptidos A y B c) Cuando el dipéptido A se reduce con BH4Li y se hidroliza se obtiene el aminoalcohol derivado de un aminoácido que da color amarillo al reaccionar con ninhidrina y glicina d) Al hidrolizar el dipéptido B se obtienen cantidades equimoleculares de Val y Arg. Dato complementario: dado que aún no se han realizado las prácticas, hay que aclarar que el aminoácido que da color amarillo con la ninhidrina es la prolina. 3. Dedúzcase la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica a partir de los siguientes datos: a) la hidrólisis ácida completa produjo: 1 Ala, 1 Arg, 2 Ser, 1 Lys, 1 Phe, 1 Met, 1 Trp, 1 Pro b) el tratamiento con el reactivo de Sanger seguido de hidrólisis ácida completa produjo dinitrofenil-alanina c) el tratamiento con BrCN produjo 2 péptidos, uno conteniendo Ser, Pro, Trp y el otro los demás aminoácidos d) el tratamiento con quimotripsina dio 3 péptidos: un dipéptido con Ser y Pro; un dipéptido con Met y Trp; un pentapéptido con 9
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Phe, Ser, Lys, Arg, Ala e) por digestión tríptica se obtuvieron 3 péptidos: un dipéptido con Ala y Arg; otro con Lys y Ser; y un pentapéptido con Phe, Met, Ser, Pro, Trp. Deduzca la secuencia de aminoácidos de un péptido a partir de los siguientes datos: a) Al tratarlo con carboxipeptidasa A se obtiene Val. b) Al tratarlo con fosfatasa ácida se produce Glu, un hexapéptido y un decapéptido. c) El tratamiento con BrCN conlleva la obtención de un dipéptido Glu-Met, y un péptido de 15 aminoácidos. d) Al someter el péptido de 15 aminoácidos a digestión con quimotripsina se obtiene un residuo de Tyr, y tras tratamiento con etilenimina y digestión con tripsina se obtienen los péptidos: Ala-Leu-Pro-Gly-Gly-Gly-Arg; Asp-Cys; Tyr-Ser-His-Lys y Gly-Val. Un pentapéptido que contiene cantidades equimoleculares de Met, Phe, Asp, Ser y Thr, se trató con BrCN liberándose Met. El tratamiento del péptido con quimotripsina rindió dos nuevos péptidos, uno claramente más ácido que el otro. El fragmento ácido contenía Met. El tratamiento del péptido original con carboxipeptidasa A dio rápidamente Ser, seguido de Thr. Dedúzcase la secuencia de aminoácidos del péptido original. Deduzca la secuencia de aminoácidos de un péptido a partir de la siguiente información: a) Composición: 1Phe:1Pro:1Glu:2Lys. b) El tratamiento con reactivo de Edman produce PTH-Glu. c) Ni la tripsina ni las carboxipepetidasas A y B liberan ningún péptido pequeño ni aminoácido. Un péptido natural tratado con cloruro de dansilo y posterior hidrólisis rindió el derivado dansilado de la lys junto con una mezcla de aminoácidos libres en la que se identificaron 3Ala:1Arg:1Met:2Phe:1Ser. El tratamiento con quimotripsina produjo Arg y 2 péptidos, denominados X e Y. El péptido X, al reaccionar con FDNP y posterior hidrólisis, produce DNPLys, y el tratamiento con BrCN produjo el péptido Z, que hidrolizado con tripsina rindió un tripéptido cuyo N-terminal era la Ala. El péptido Y es un tripéptido en el cual, mediante tratamiento con FDNP y posterior hidrólisis, se determinó DNP-Ser. Deducir la secuencia del péptido original. Determínese la estructura de un péptido aislado del plasma bovino a partir de la siguiente información a) el peso molecular determinado por filtración en gel es aproximadamente 1000 y contenía cantidades equimoleculares de Tyr, Arg, Pro b) la quimotripsina no afectó c) la hidrólisis tríptica liberó del péptido únicamente Tyr d) el tratamiento con el reactivo de Sanger produjo dinitrofenil-arginina. (PM Tyr = 181,2, Arg = 174,2, Pro = 115,1).
PROBLEMAS RESUELTOS Secuenciación de proteínas 1. A partir del siguiente polipéptido: Val-Phe-Cys-Glu-Phe-Pro-Thr-Trp-Arg-Glu-Ser-Tyr-Asp-LysGly indíquese: a) los péptidos que se obtendrían al tratarlo con fosfatasa ácida b) los productos que se obtendrían al tratar los péptidos resultantes del apartado anterior con quimotripsina. a) La fosfatasa ácida rompe por el lado C de R x, cuando Rx = Asp o Glu. Los péptidos resultantes de esta rotura, a partir del polipéptido del problema, serán: Lugares de acción de la fosfatasa ácida
Val-Phe-Cys-Glu-Phe-Pro-Thr-Trp-Arg-Glu-Ser-Tyr-Asp-Lys-Gly Fragmentos: Val-Phe-Cys-Glu
Phe-Pro-Thr-Trp-Arg-Glu
Ser-Tyr-Asp
Lys-Gly 10
b) La quimotripsina puede romper por el lado C de Rx, cuando Rx = Phe, Tyr, Trp o Leu, siempre que Rx+1 ≠ Pro; por tanto, los productos de la rotura serán: Lugares de acción de la quimotripsina
Val-Phe-Cys-Glu
Phe-Pro-Thr-Trp-Arg-Glu
Ser-Tyr-Asp
Lys-Gly (no se rompe)
Fragmentos: Val-Phe
Cys-Glu
Phe-Pro-Thr -Trp
Arg-Glu
Ser-Tyr
Asp
Lys-Gly
2. Determínese la secuencia de un péptido sabiendo que: a) Su reacción con fenil-isotiocianato produce el derivado tiohidantoínico de la Ala y un tetrapéptido b) el tratamiento del tetrapéptido anterior con tripsina produce dos dipéptidos A y B c) Cuando el dipéptido A se reduce con BH4Li y se hidroliza se obtiene el aminoalcohol derivado de un aminoácido que da color amarillo al reaccionar con ninhidrina y glicina d) Al hidrolizar el dipéptido B se obtienen cantidades equimoleculares de Val y Arg. Dato complementario: dado que aún no se han realizado las prácticas, hay que aclarar que el aminoácido que da color amarillo con la ninhidrina es la prolina. Se trata de un pentapéptido que tiene como aminoácido N-terminal a la Ala, ya que el reactivo empleado (fenil isotiocianato) sirve para identificar aminoácidos N-terminales: Ala
La tripsina rompe por el lado C de Rx, cuando Rx = Lys, Arg o AECys. Como el tetrapéptido contiene Arg, y se producen dos dipéptidos por la acción de la tripsina, la Arg debe estar en la tercera posición: Ala
Arg
Dado que al hidrolizar el péptido B se obtiene Val y Arg, la valina debe ocupar el segundo lugar en el péptido: Ala
Val
Arg
El aminoácido que da color amarillo con la ninhidrina es la prolina. Dado que la tripsina no puede romper cuando Rx+1 = Pro, este aminoácido deberá estar situado en la última posición, por lo que queda la cuarta para la Gly: Ala
Val
Arg
Gly
Pro
3. Dedúzcase la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica a partir de los siguientes datos: a) la hidrólisis ácida completa produjo: 1 Ala, 1 Arg, 2 Ser, 1 Lys, 1 Phe, 1 Met, 1 Trp, 1 Pro b) el tratamiento con el reactivo de Sanger seguido de hidrólisis ácida completa produjo dinitrofenil-alanina c) el tratamiento con BrCN produjo 2 péptidos, uno conteniendo Ser, Pro, Trp y el otro los demás aminoácidos d) el tratamiento con quimotripsina dio 3 péptidos: un dipéptido con Ser y Pro; un dipéptido con Met y Trp; un pentapéptido con 11
Phe, Ser, Lys, Arg, Ala e) por digestión tríptica se obtuvieron 3 péptidos: un dipéptido con Ala y Arg; otro con Lys y Ser; y un pentapéptido con Phe, Met, Ser, Pro, Trp. Se trata de un nonapéptido en el que el aminoácido N-terminal es la alanina, ya que el reactivo de Sanger sirve para determinar los aminoácidos N-terminales: Ala
Puesto que el CNBr rompe por el lado C de la Met, y dada la composición de los péptidos resultantes, la Met debe ocupar el sexto lugar: Ala
Met
La quimotripsina puede romper por el lado C cuando Rx = Phe, Tyr, Trp o Leu, siempre que Rx+1 ≠ Pro. Como el pentapéptido tiene alanina, dicho pentapéptido ocupará las primeras cinco posiciones de la cadena del nonapéptido y deberá acabar en Phe: Ala
Phe
Met
Uno de los dipéptidos contine Met y Trp, luego dicho dipéptido irá a continuación del pentapéptido y contendrá Met y Trp, por ese orden: Ala
Phe
Met
Trp
El tercer dipéptido estará al final, y dado que la prolina no puede ir después del Trp, ya que no habría podido actuar la quimotripsina, el orden sería Ser-Pro: Ala
Phe
Met
Trp
Ser
Pro
La tripsina rompe cuando Rx = Lys, Arg o AECys y Rx+1 ≠ Pro, por lo que uno de los péptidos lleva Ala y Arg, luego el segundo aminoácido es la Arg: Ala
Arg
Phe
Met
Trp
Ser
Pro
La otra rotura de la tripsina será por la Lys; por tanto, el siguiente pétido tendrá Ser y Lys, por ese orden. Por consiguiente, la secuencia del nonapéptido será: Ala
Arg
Ser
Lys
Phe
Met
Trp
Ser
Pro
Comprobación: Reactivo de Sanger
Ala
Arg
Tripsina
Ser
Lys
Quimotripsina
Phe
Met
Trp
Ser
Pro
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Bromuro de cianógeno 4. Deduzca la secuencia de aminoácidos de un péptido a partir de los siguientes datos: a) Al tratarlo con carboxipeptidasa A se obtiene Val. b) Al tratarlo con fosfatasa ácida se produce Glu, un hexapéptido y un decapéptido. c) El tratamiento con BrCN conlleva la obtención de un dipéptido Glu-Met, y un péptido de 15 aminoácidos. d) Al someter el péptido de 15 aminoácidos a digestión con quimotripsina se obtiene un residuo de Tyr, y tras tratamiento con etilenimina y digestión con tripsina se obtienen los péptidos: Ala-Leu-Pro-Gly-Gly-Gly-Arg; Asp-Cys; Tyr-Ser-His-Lys y Gly-Val. Como se puede deducir fácilmente, el péptido tiene 17 aminoácidos. De esos 17 aminoácidos el último es la valina (tramiento con carboxipeptidasa A), y el primero es Glu, ya que la fosfatasa ácida rompe por el lado C de Rx, cuando Rx = Glu o Asp y para que libere solo Glu debe estar el primero: Glu
Val
El CNBr rompe por la Met, luego el segundo es precisamente la Met al ir acompañado del Glu: Glu Met
Val
Al tratarlo con quimotripsina se desprende Tyr; Dado que la quimotripsina rompe por el lado C de Rx cuando Rx = Phe, Tyr, Trp o Leu, siempre que R x+1 ≠ Pro, quiere decir que la Tyr es el primer aminoácido del péptido de 15 y el tercero del de 17:
Glu Met Tyr
Val
La tripsina puede romper por el lado C, cuando R x = Lys o Arg, y si se trata previamente el péptido con etilenimina también podrá romper por el sitio de la Cys (amino etilcisteína o AECys). Por tanto, el primer péptido, del péptido mayor de 15 aminoácidos, será Tyr-Ser-His-Lys, ya que contiene a la Tyr, y el último Gly-Val, por contener Val: Glu Met Tyr Ser His Lys
Gly Val
Como el tratamiento con fosfatasa ácida produce, además de Glu, un hexapéptido y un decapéptido, y tiene que romper por Asp, la única manera de combinar esto con los dos péptidos que quedan de la digestión tríptica es la siguiente: Glu Met Tyr Ser His Lys Asp Cys Ala Leu Pro Gly Gly Gly Arg Gly Val
Comprobación: Fosfatasa Quimotripsina ácida Glu
Fosfatasa ácida
Carboxipeptidasa A
Met Tyr Ser His Lys Asp Cys Ala Leu Pro Gly Gly Gly Arg Gly Val
CNBr
Tripsina 13
5. Un pentapéptido que contiene cantidades equimoleculares de Met, Phe, Asp, Ser y Thr, se trató con BrCN liberándose Met. El tratamiento del péptido con quimotripsina rindió dos nuevos péptidos, uno claramente más ácido que el otro. El fragmento ácido contenía Met. El tratamiento del péptido original con carboxipeptidasa A dio rápidamente Ser, seguido de Thr. Dedúzcase la secuencia de aminoácidos del péptido original. Como al tratar el pentapéptido con CNBr se libera metionina, y dado que este reactivo corta por el lado C de la Met, esto quiere decir que el primer aminoácido es la Met: Met
El tratamiento con quimotripsina, que rompe por el lado C de la Phe, da dos péptidos.; el que contiene Met es el ácido, luego este péptido tiene Met, Asp y Phe, por ese orden: Met
Asp
Phe
Como el tratamiento con carboxipeptidasa A produce primero Ser y luego Thr, la secuencia del péptido debe ser: Met
Asp
Phe
Thr
Ser
Comprobación: CNBr Met
Quimotripsina Asp
Phe
Thr
Ser
2º 1º Carboxipeptidasa A 6. Dedúzcase la secuencia de aminoácidos de un péptido a partir de la siguiente información: d) Composición: 1Phe:1Pro:1Glu:2Lys. e) El tratamiento con reactivo de Edman produce PTH-Glu. f) Ni la tripsina ni las carboxipepetidasas A y B liberan ningún péptido pequeño ni aminoácido. Se trata de un pentapéptido, y como el reactivo de Edman permite identificar el primer aminoácido, este es el Glu: Glu
Si ni la tripsina ni la carboxipeptidasa A pueden producir cortes, quiere decir que la prolina va en un lugar en el que puede estorbar la actuación de ambas enzimas; es decir, en el lado amino del último aminoácido y en el lado carboxilo de la Lys. Además, como hay dos Lys, una de ellas debe ser la última, ya que si fuesen juntas sí se podría producir el corte por la tripsina. Luego la secuencia tiene que ser la siguiente: Glu
Phe
Lys
Pro
Lys
14
7. Un péptido natural tratado con cloruro de dansilo y posterior hidrólisis rindió el derivado dansilado de la Lys junto con una mezcla de aminoácidos libres en la que se identificaron 3Ala:1Arg:1Met:2Phe:1Ser. El tratamiento con quimotripsina produjo Arg y 2 péptidos, denominados X e Y. El péptido X, al reaccionar con FDNP y posterior hidrólisis, produce DNPLys y el tratamiento con BrCN produjo el péptido Z, que hidrolizado con tripsina rindió un tripéptido cuyo N-terminal era la Ala. El péptido Y es un tripéptido en el cual, mediante tratamiento con FDNP y posterior hidrólisis, se determinó DNP-Ser. Deducir la secuencia del péptido original. Se trata de un nonapéptido en el que el primer aminoácido es la Lys, ya que el cloruro de dansilo sirve para identificar aminoácidos N-terminales: Lys
Para que con el tratamiento con quimotripsina se libere Arg esta debe ocupar la posición Rx+1 de un aminoácido compatible con el corte, es decir, Phe y, además ser el último aminoácido de la cadena: Lys
Phe
Arg
El péptido X es el que ocupa las primeras posiciones del nonapéptido ya que lleva Lys, y debe acabar con Phe. Como el péptido Y es un tripéptido, este debe estar al final, y puesto que el primer aminoácido del tripéptido es Ser (el FDNB reconoce los aminoácidos N-terminales), y que en el punto de corte con el péptido X debe haber Phe, podemos deducir la siguiente secuencia: Lys
Phe
Ser
Ala
Phe
Arg
Como el CNBr rompe por el lado C de la Met, la digestión tríptica lo hace por el lado C de la Lys y el tripéptido que queda empieza por Ala, podemos deducir que la secuencia final será: Lys
Ala
Ala
Met
Phe
Ser
Ala
Phe
Arg
Comprobación: Cloruro de dansilo Lys
Ala
Ala
Péptido X Péptido X: Tripsina
Quimotripsina Met
Phe
Ser
Ala
Phe
Arg
Péptido Y Péptido Y:
CNBr 15
Lys-Ala-Ala-Met-Phe
Ser-Ala-Phe-Arg
FDNB
FDNB
8. Determínese la estructura de un péptido aislado del plasma bovino a partir de la siguiente información a) el peso molecular determinado por filtración en gel es aproximadamente 1000 y contenía cantidades equimoleculares de Tyr, Arg, Pro b) la quimotripsina no afectó c) la hidrólisis tríptica liberó del péptido únicamente Tyr d) el tratamiento con el reactivo de Sanger produjo dinitrofenil-arginina. (PM Tyr = 181,2, Arg = 174,2, Pro = 115,1). Si dividimos el peso molecular del péptido (1000) por la suma de los pesos moleculares de los tres aminoácidos (460,5) nos dá aproximadamente 2. Como hay cantidades equimoleculares de cada uno de ellos quiere decir que se trata de un hexapéptido con dos representantes de cada aminoácido (2 Arg, 2 Pro y 2 Tyr). Si la quimotripsina no afectó quiere decir que la Tyr va seguida de Pro o que tiene una posición final. Como hay dos Tyr una debe estar al principio o en medio de la cadena seguida de una prolina y la otra estará al final. Puesto que la hidrólisis tríptica libera Tyr esta debe estar al final de la cadena, y como la tripsina rompe por Rx = Lys o Arg, siempre que R x+1 ≠ Pro, la Tyr debe estar precedida por la Arg y la otra Arg debe estar al principio o en el interior de la cadena seguida por una Pro. Como el reactivo de Sanger detecta el aminoácido N-terminal y este es Arg, podemos escribir la secuencia del hexapéptido: Arg
Pro
Tyr
Pro
Arg
Tyr
Arg
Tyr
Comprobación: Reactivo Quimotripsina de Sanger
X
Arg
Pro
Tyr
Pro
X Tripsina
Tripsina
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