ÍNDIC IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN PROTEINAS E DE PROTEINAS RESUMEN_______________________________________________________1 INTRODUCCIÓN_________________________________________________1 OBJETIVOS______________________________________________________1 MATERIALES____________________________________________________1 MUESTRAS O REACTIVOS:_______________________________________2 ¡Error! Marcador no definido. INSTRUMENTOS__________________________ ¡Error! PRUEBAS A REALIZAR:__________________________________________2 METODOLOGIA_________________________________________________2 Reacción de plomo (aminoácidos azufrados)___________________________________ azufrados)_____________________________________________________2 __________________2 Reacción con ninhidrina________________ ninhidrina_______________________________________________________ _____________________________________________________2 ______________2 Reacción de millón____________________________________________________ millón_________________________________________________________________________3 _____________________3 Reacción xanoproeica______________________________________________________________________3 Reacción de "iure_______________ "iure___________________________ _______________________ ______________________ ______________________ ______________________ ______________3 ___3
RESULTADOS____________________________________________________4 DISCUSIÓN______________________________________________________4 CONCLUSIÓN.___________________________________________________4 EVIDENCIAS______________________________ EVIDENCIAS_________________ ___________________________ ______________________5 ________5 BIBLIOGRAFÍA__________________________________________________6 IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ENZIMAS ENZIMAS ______ _________ ______ ______ ______ ____7 _7 RESUMEN_______________________________________________________ INTRODUCCION_________________________________________________ OBJETIVOS______________________________________________________ MATERIAL______________________________________________________ REACTIVOS_____________________________________________________! METODOLOGÍA_________________________________________________!
DISCUSIÓN______________________________________________________" RESULTADOS____________________________________________________" CONCLUSIÓN___________________________________________________" EVIDENCIAS___________________________________________________1# BIBLIOGRAFÍA_________________________________________________1# ELECTROFORESIS DE ADN EN GEL DE AGAROSA ______________________12 RESUMEN______________________________________________________12 INTRODUCCION________________________________________________12 OBJETIVOS_____________________________________________________1$ E%UIPO________________________________________________________1$ MATERIAL_____________________________________________________1$ REACTIVOS____________________________________________________1$ METODOLOGÍA________________________________________________1$ #reparación del $el de a$arosa________________________________________________________________%3 #reparación de muesra_____________________________________________________________________%& #reparación de las muesras con el 'uffer._______________________________________________________%& isualización del $el_______________________________________________________________________%
DISCUSIÓN_____________________________________________________16 CONCLUSIONES________________________________________________16 BIBLIOGRAFÍA_________________________________________________1
IDENTIFICACIÓN & CARACTERIZACIÓN DE PROTEINAS RESUMEN En esa prácica se realizó la idenificación * caracerización de las proe+nas presenes en al$unas muesras, para ellos se dispuso de %2 u'os de ensa*o cada uno de ellos con una muesra disina, las cuales se someieron a las -cnicas de idenificación de proe+nas más comunes, as+ pues la caracer+sica principal de cada uno de los m-odos es la reacción ane la presencia de deerminados aminoácidos, dando coloraciones espec+ficas para cada uno de las procesos.
INTRODUCCIÓN as proe+nas son un $rupo de 'iomol-culas caracerizadas por su $ran /ariedad esrucural * enorme di/ersidad de funciones 'ioló$icas. as proe+nas de cada ser /i/o, son espec+ficas *a 0ue esán codificadas por sus $enes. 1in em'ar$o a pesar de 0ue al$unas desempean la misma función, las proe+nas presenan li$eras /ariaciones esrucurales en cada especie. #or su composición, 0u+micamene pueden diferenciarse en proe+nas simples consiuidas nicamene por aminoácidos * proe+nas comple4as 0ue conienen maerial adicional como car'ohidraos, l+pidos o ácidos nucleicos. as proe+nas pueden ser a$rupadas en clases funcionales numerosas * di/ersas5 proe+nas esrucurales, 0ue pro/een ri$idez esrucural a la c-lula6 proe+nas ransporadoras, 0ue conrolan el flu4o de maeriales a ra/-s de las mem'ranas celulares6 proe+nas re$uladoras, 0ue acan como sensores e inerrupores para conrolar la aci/idad de las proe+nas * la función de los $enes6
proe+nas sealizadoras, incluidas las receporas de la superficie celular * oras proe+nas 0ue ransmien seales exernas al inerior de la c-lula6 * las proe+nas mooras, 0ue producen el mo/imieno. 7na finalidad primordial de la 'io0u+mica es el deerminar cómo las secuencias de aminoácidos especifican la conformación *, por ano, la función de las proe+nas. 8ras meas son el sa'er cómo las proe+nas indi/iduales se unen a susraos espec+ficos * a oras mol-culas, cómo median en la caálisis * ransducen ener$+a e información. El primer paso en esos esudios es la idenificación de proe+nas en una muesra, proceso 0ue se realiza mediane di/ersas -cnicas de idenificación 0ue se deallaran más adelane.
OBJETIVOS
9denificar la presencia de proe+nas en una muesra, a parir de di/ersos m-odos, considerando las /ena4as * des/ena4as de cada una de las -cnicas. :omprender cuales son las propiedades 0ue permien la idenificación de cieras proe+nas en una muesra. 9nerprear los resulados o'enidos considerando la presencia de aminoácidos en cada muesra.
MATERIALES #ara la realización de la prácica ;idenificación * caracerización de proe+nas<, uilizamos al$unas muesras exra+das de disina procedencia, as+ como
reaci/os * especiales.
maeriales
de la'oraorio
MUESTRAS O REACTIVOS: • • • • • • • • • • • •
=elaina eche :aldo >l'mina #epona :ase+na >sparame ?irosina :ise+na >r$inina >lanina >$ua
1a'emos 0ue al ser posii/o el resulado es decir de ha'er presencia de ese ipo de aminoácidos en nuesra muesra esa se ornara de color ne$ro o $ris. Ese ipo de reacción se 'asa en la separación mediane un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al lle/ar aca'o la reacción con una solución de aceao de plomo, forma el sulfuro de plomo. El procedimieno para 'uscar lo aneriormene mencionado fue el si$uiene6 a cada una de nuesras muesras conenidas en un u'o de ensa*o se les a$re$o la canidad máxima de l+0uido conenida por el $oero
INSTRUMENTOS • • • • •
?u'os de ensa*o =radilla #ipeas asos de precipiado #lancha
PRUEBAS A REALIZAR: Reacción de plomo (aminoácidos azufrados). Reacción con ninhidrina. Reacción de millón. Reacción xanoproeica. Reacción de 'iure.
METODOLOGIA R'())*+, -' /00 (*,03)*-0 (78(-09 El o'4ei/o de esa prue'a es 'uscar la presencia de aminoácidos azufrados (cise+na * meionina) en nuesras diferenes muesras.
en dos ocasiones, poseriormene, la disolución se mezcló (dando pe0ueos $olpecios al u'o de ensa*o) * se calenó a 'ao mar+a para e/iar falsos posii/os.
R'())*+, )0, ,*,*-8*,( El o'4ei/o de esa prue'a es idenificar la presencia de proe+nas o aminoácidos li'res. a ninhidrina reacciona con los $rupos amino li'reando amonio, el cual poseriormene se condensa con la ninhidrina reducida * con ora mol-cula de ninhidrina formando un compueso coloreado 0ue /ar+a de azul a /iolea prpura, se$n la canidad de aminoácidos presenes.
> cada una de las muesras conenidas en los %2 u'os de ensa*o se les a$re$ó la canidad
máxima medida por el $oero en dos ocasiones, inmediaamene, la disolución se mezcló * calenó a 'ao mar+a para e/iar falsos posii/os.
R'())*+, -' *//+, >l i$ual 0ue las -cnicas aneriores, esa iene como o'4ei/o idenificar la presencia de proe+nas mediane el cam'io de color del precipiado al exponerlo al calor ('ao mar+a), eso será posi'le $racias a 0ue el anillo fenólico iene un comporamieno caracer+sico frene a las sales de mercurio a p@ ácido, me refiero a la formación de comple4os color ro4o con el anillo fenólico de la irosina * la fenilalanina * por lo ano con las proe+nas 0ue la conienen.
En 'usca del comple4o color ro4o6 > cada muesra conenida en un u'o de ensa*o se le a$re$ó la canidad máxima medida por el $oero (en esa ocasión solo una /ez), poseriormene, la disolución se mezcló dando pe0ueos $olpecios al u'o de ensa*o * despu-s se calenó a 'ao mar+a para o'ser/ar el cam'io hacia color ro4o si la muesra conen+a al$uno de los aminoácidos aneriormene mencionados.
R'())*+, ;(,<0=80<'*)( El o'4ei/o de esa prue'a es idenificar la presencia de proe+nas con a'undanes aminoácidos como irosina, fenilalanina * ripófano mediane un cam'io de onalidad a amarillo. Eso será posi'le, *a 0ue los anillos aromáicos presenes en al$unos aminoácidos reaccionan con ácido n+rico concenrado formando niro deri/ados de color amarillo, dicho lo anerior sa'emos 0ue esa reacción nos permiirá reconocer la presencia de irosina, fenilalanina * ripófano presenes en cada una de las muesras.
> cada una de las muesra conenidas en los u'os de ensa*o se le a$re$ó la canidad máxima de ácido n+rico medida por el $oero, despu-s, se aadió una 'ase, en esa ocasión hidróxido de amonio, poseriormene la disolución se mezcló * calenó a 'ao mar+a * se de4ó enfriar para o'ser/ar el cam'io hacia color amarillo en
caso de 0ue la muesra presenara proe+nas con aminoácidos ;aromáicos<.
R'())*+, -' B*8'< a mea de esa prue'a es idenificar la presencia de proe+nas mediane un reaci/o de co're (de all+ el nom're de esa -cnica) 0ue se a$re$a a los $rupos amino de dos o más enlaces pep+dicos, pro/ocando una coloración /iolea. El reaci/o de "iure esá formado por una solución de sulfao de co're en medio alcalino, ese idenifica el enlace pep+dico de odas las proe+nas mediane la formación de un comple4o de
coordinación enre los iones :u2A * los pares de elecrones no comparidos del niró$eno 0ue se encuenra en los enlaces pep+dicos. > cada una de las muesras presenes en un u'o de ensa*o se le aadió la canidad máxima medida por el $oero en dos ocasiones, en primer lu$ar el reaci/o de co're o 'iure, * despu-s hidróxido de sodio, por limo la disolución se mezcló * calenó a 'ao mar+a para e/iar falsos posii/os.
RESULTADOS a si$uiene a'la muesra los efecos ocasionados en cada una de las muesras al reaccionar con los diferenes reaci/os caracer+sicos de cada una de las -cnicas de idenificación descrios aneriormene.
T 6 > 0
M 6 ' 4 < 8 (
P / 0 1 0
N * , : * - 8 * , (
M * / / + ,
P ? 8 ( 0 < , ' * < 0 ) ( =
B * 6 8 ' <
1 2 $ 4 5 6 ! " 1# 11 12
=elaina eche :aldo >l'mina #epona :ase+na >sparame ?irosina :ise+na >r$inina >lanina >$ua
= A A A A = A = = = = =
= = = = = = = = = = A =
A = = = A = = A = = = =
= A = A A A = A = = = =
A A = A = = = = = = = =
DISCUSIÓN =racias a la prácica se lo$ró idenificar la presencia de proe+nas en al$unas de nuesras muesras mediane di/ersos m-odos uilizados para ello, esas -cnicas suelen ser espec+ficas para cada ipo de muesra, *a 0ue como se mencionó aneriormene cada una reacciona ane la presencia de deerminados ipos de aminoácidos, lo 0ue le confiere a cada una un alo poder de especificidad, pueso 0ue apro/echa las caracer+sicas disini/as de cada proe+na enre ellas su esrucura primaria. Mediane esas prue'as lo$ramos poner en prácica lo aprendido durane la exposición de idenificación * cuanificación de proe+nas pueso 0ue al$unos punos no 0uedaron mu* claros, sin em'ar$o al lle/ar dichos conocimienos a la prácica odas las dudas 0uedaron esclarecidas. 7n dao ineresane fue lo ocurrido con la muesra de caldo de pollo (o'enida indusrialmene), la cual a la hora de ser analizada mosró mu* poca canidad de proe+na, por lo ano se deduce 0ue muchas /eces la pu'licidad con la 0ue se anuncian * comercializan esos producos es en$aosa pueso 0ue su composición realmene comprende $rasas 0ue en su
ma*or+a producen efecos ne$ai/os al or$anismo.
lle/an a ca'o di/ersas funciones lo 0ue las hace fundamenales para muchos procesos /iales. as proe+nas de oros animales * de al$unas planas son un alimeno imporane, *a 0ue proporcionan los aminoácidos 0ue son esenciales para el cuerpo en la producción de las proe+nas necesarias.
EVIDENCIAS R'())*+, -' B*8'< R'())*+, -' ,*,*-8*,( R'())*+, ;(,<0=80<'*)(
CONCLUSIÓN. as proe+nas son pol+meros de aminoácidos * se producen en las c-lulas del cuerpo,
C0/0)(,-0 /( '<8( ( >(@0 (8( (8( '*<(8 7(/0 0*<*0. L((,-0 '/ <>0 -' ',(0 '<0 ' 0)88*+ , ())*-',<' '/ 0<'80 ' 8'',<+9 R'/<(-0 -' )(-( ,( -' /( <),*)(. BIBLIOGRAFÍA
Belson, C., ehnin$er, >., D :ox, M. (2F). Lehninger
principles
of
biochemistry (h ed., pp. G%%3).
BeH IorJ5 K.@. Lreeman.
IDENTIFICACIÓN & CARACTERIZACIÓN DE ENZIMAS RESUMEN En la prácica se realizó la idenificación de la formación de comple4os Enzima1usrao, uilizando para ello a la enzima ureasa * su susrao urea, a la par se uilizaron al$unos a$enes desnauralizanes * la mezcla de más de un susrao para conocer de 0u- manera esos facores afeca'an el poder caal+ico de la enzima . 1e lo$ró caracerizar mediane la formación de un compueso colorim-rico, a a0uellos comple4os en los 0ue la reacción enzimasusrao se produc+a de una forma ópima, apro/echando al máximo su poder caal+ico.
INTRODUCCION as enzimas son el $rupo más /ariado * especializado de las proe+nas 0ue caalizan odas las reacciones 'io0u+micas, permiiendo 0ue las reacciones 0ue ranscurren en los seres /i/os puedan desarrollarse a un rimo adecuado. >demás de su imporancia como caalizadores 'ioló$icos, ienen muchos usos m-dicos * comerciales. 7n caalizador es una susancia 0ue disminu*e la ener$+a de aci/ación de una reacción 0u+mica, al disminuir la ener$+a de aci/ación, se incremena la /elocidad de la reacción. a ma*or+a de las reacciones de los sisemas /i/os son re/ersi'les, es decir, 0ue en ellas se esa'lece el e0uili'rio 0u+mico. #or lo ano, las enzimas aceleran la formación de e0uili'rio 0u+mico, pero no afecan las concenraciones finales del e0uili'rio. a susancia so're la cual aca una enzima se llama susrao. os susraos son espec+ficos para cada enzima5 a urea es el susrao de la ureasa 0ue aca rompi-ndola en sus componenes. a capacidad caalizadora de una enzima depende de su conformación, la desnauralización causa la p-rdida de funcionamieno. =ran pare de sus propiedades caal+icas radican en el alo $rado de especialización 0ue presenan respeco a las susancias reaccionanes o susraos. >l i$ual 0ue las proe+nas, les ha* de mu* diferenes amaos * re0uerimienos6 al$unas necesian para desarrollar su aci/idad an sólo sus residuos de aminoácidos, mienras 0ue oras re0uieren la presencia de un cofacor, ese compueso puede ser, sencillamene un ion inor$ánico, Le2A, M$2A, Mn2A o n2A6 o una mol-cula or$ánica más o menos comple4a, 0ue si se encuenra unida co/alenemene se denomina $rupo pros-ico, * si esa'lece uniones de nauraleza d-'il * re/ersi'le se denomina coenzima. Muchas /iaminas, o deri/ados de las mismas, funcionan como coenzimas. a enzima complea 4uno a su cofacor se denomina holoenzima * su pare exclusi/amene proeica apoenzima.
OBJETIVOS :aracerizar e idenificar enzimas, as+ como reconocer los di/ersos facores6 desnauralización, especificidad, hidrolisis, ec, 0ue pueden inerferir en la formación del comple4o enzimasusrao durane la reacción enzimaica * de 0u- manera lo hacen.
9
MATERIAL
?u'os de ensa*o. =radillas =oeros. Mechero #inzas para u'o de ensa*o
REACTIVOS
7rea 7reasa 2N ?iurea 7reasa concenrada >ceona #eróxido Lenolfale+na
METODOLOGÍA %. a/ar odo el maerial con a$ua * deer$ene6 en4ua$ar con a$ua de la lla/e * finalmene con a$ua desilada. 2. ?omar nue/e u'os de ensa*o, enumerarlos * colocarlos en una $radilla. 3. >adir a cada uno de los u'os de ensa*o, los reaci/os indicados en la si$uiene a'la, si$uiendo el orden esa'lecido5 A')<0
T>0
C0,<80/ =9
% 2
H*-80/** 9
3
E,*( 8'((9 % m 1emilla Molida
E')*7*)*-(-
&
% m
C0'<*<*( I,*>*)*+, P08 <8(<0
% m
O
% m
G F
% m % m % m
D',(<8(/*()*+,
A',<' -',(<8(/*(,<'
S<8(<0 8'(9 % m % m % m
#or calor #eróxido 2 m >ceona 2 m
% m ?iurea % m 7rea * ?iurea % m PP7reaQQ % m % m % m
I,-*)(-08 2 $oas 2 $oas 2 $oas 2 $oas 2 $oas 2 $oas 2 $oas 2 $oas 2 $oas
&. 7na /ez aadidos los reaci/os en el u'o de ensa*o, mezclar dando unos li$eros $olpecios al u'o (ese paso de'erá realizarse en cada u'o una /ez a$re$ado el indicador). 10
. 8'ser/ar e inerprear el resulado o'enido. Nota: En el caso del u'o de ensa*o SG, al cual se le a$re$are calor, primeramene aadir en
-l u'o la ureasa, poseriormene calenar, hasa e'ullición inermiene, despu-s la/ar con a$ua a emperaura am'iene (cuidar 0ue no enre a$ua al u'o de ensa*o, pueso 0ue eso podr+a iner/enir en nuesros resulados), por ulimo aadir los oros reaci/os * o'ser/ar el resulado.
DISCUSIÓN a ureasa, cu*o nom're sisemáico es amidohidrolasa de urea, iene un peso molecular de &F3 Calon. a ureasa consa de O su'unidades esrucurales i$uales. Es una enzima mu* espec+fica, 0ue exise en /arios ipos de /e$eales, por e4emplo, en el fri4ol de so*a. a ureasa se uiliza mucho como a$ene caal+ico para la medición cuaniai/a de urea. El hidróxido de amonio 0ue se forma puede iularse * puede relacionarse, ese0uiom-ricamene, con la canidad de urea presene en una muesra. >un0ue la ureasa no es mu* comn en la nauraleza, esa enzima ha enido más imporancia en el desarrollo de la enzimolo$+a moderna 0ue nin$una ora. as in/esi$aciones so're la ureasa han permiido deducir el principio imporane en las reacciones enzimáicas5 la función de los $rupos 1@ (sulfh+drico) en la caálisis. a ureasa posee 3 o & $rupos aci/os, es una represenane de un $ran nmero de enzimas cu*a aci/idad depende de la exisencia de $rupos 1@ inacos, procedenes de cise+nas 0ue forman pare de la cadena poli pep+dica de la enzima. a ureasa aca en los compuesos a ni/el de los puenes :B excepo en a0uellos 0ue coniene puenes pep+dicos. El p@ ópimo para la aci/idad de la ureasa es de G.
RESULTADOS En la a'la % se muesran los resulados o'enidos en cada uno de los u'os, as+ como la explicación de dicho resulado.
CONCLUSIÓN as enzimas son caalizadores 'ioló$icos de nauraleza proeica (a excepción de un pe0ueo $rupo de mol-culas de RB> caal+ico) presenes en odos los procesos 'io0u+micos, caalizan reacciones $racias a las ineracciones co/alenes * no co/alenes 0ue forman con el susrao. os aminoácidos se unen al cenro aci/o para esa'lecer los enlaces d-'iles con el susrao por lo 0ue la especificidad de la enzima radica ah+, una enzima * un susrao no lle$an a adherirse si sus formas no enca4an con exaciud. Ese hecho ase$ura 0ue la enzima no paricipe en reacciones e0ui/ocadas. Cenro de los Lacores 0ue influ*en en las reacciones enzimáicas se encuenran5 cam'ios en el p@, cam'ios en la emperaura * las concenraciones del susrao * de los producos finales.
11
Es de suma imporancia conocer el p@ * la emperaura ópimos de una enzima, *a 0ue a esas condiciones alcanzara su ma*or poder caal+ico, a la par la concenración del susrao es mu* imporane *a 0ue a /alores ele/ados de esa am'i-n se incremena la /elocidad de una reacción caalizada por enzimas. as enzimas son encar$adas de disminuir la ener$+a de aci/ación (T=U) de una reacción, causando la aceleración de la asa de reacción. Bo ol/idar 0ue las enzimas no aleran el 'alance ener$-ico, ni modifican el e0uili'rio de la reacción solamene iner/ienen para 0ue una reacción 0u+mica se produzca con una ma*or rapidez.
EVIDENCIAS 1omeiendo la enzima ureasa a calor, para propiciar su desnauralización.
>adiendo los reaci/os (enzima, susrao e indicador) al u'o de ensa*o, poseriormene dar unos pe0ueos $olpecios al u'o de ensa*o para mezclar.
:oloración de los producos o'enidos a parir de las reacciones enzimáicas (u'os de ensa*o ordenados de iz0uierda a derecha comenzando por el nmero %.
12
BIBLIOGRAFÍA Belson, C., ehnin$er, >., D :ox, M. (2F). Lehninger principles of biochemistry (h ed., pp. %F322G). BeH IorJ5 K.@. Lreeman.
13
Tabla 1: Resultados
A')<0
T>0
C0,<80/ =9
%
E,*( 8'((9
A',<' -',(< 8(/*(,<'
S<8(<0 8'(9
I,-*)(-08
% m
2 $oas
R'/<(-0 0><',*-0 )0/08()*+,9 Bo hu'o nin$n ipo de coloración
2
% m
% m
2 $oas
:oloración rosa 'rillane
3
1emilla Molida
% m
2 $oas
:oloración rosa claro
&
% m
% m ?iurea
2 $oas
Bin$n ipo de coloración ( no hu'o reacción)
% m
% m 7rea * ?iurea
2 $oas
Rosa Lucsia
O
% m
% m PP7reaQQ
2 $oas
:oloración6 Rosa inenso
G
% m
% m
2 $oas
Bin$una
F
% m
% m
2 $oas
% m
% m
2 $oas
H*-80/** 9
E')*7*)*-(-
C0'<*<*( I,*>*)*+, P08 <8(<0
D',(<8(/*()*+ , #or calor
#eróxido 2 m >ceona 2 m
Bin$una
E;/*)()*+, -'/ 8'/<(-0 :omo se indica al principio, ese es el conrol ne$ai/o, la reacción no se lle/ó a ca'o pueso 0ue el u'o no conen+a enzima, solo susrao e indicador, por lo ano no se produce la formación del comple4o enzimáico. 1e produce la formación del comple4o enzimasusrao pueso 0ue am'os se encuenran presenes en nuesro u'o de ensa*o, as+ pues la coloración es fuere *a 0ue la reacción se lle/ó a ca'o por compleo de'ido a la presencia de enzima * susrao en canidades proporcionales. 1e produce la reacción * por lo ano la formación del comple4o enzimasusrao, sin em'ar$o la coloración es menor respeco al anerior *a 0ue la enzima no se encuenra purificada por compleo, sino en su forma de semilla (naural). 1in duda al$una una de las principales caracer+sica de cual0uier enzima es su ala especificidad, en ese caso deposiamos en nuesro u'o de ensa*o la enzima ureasa * el comple4o iurea, aun0ue esa lima es mu* parecida 0u+micamene a la urea, no es i$ual, * por lo ano el siio especifico de la ureasa no esá adapado para 0ue enre * se lle/e a ca'o la reacción enzimáica. a reacción no se produce compleamene *a 0ue la canidad de susrao es menor a la de enzima, el reso del susrao es iurea 0ue como se mencionó aneriormene no reacciona con la ureasa. a concenración es uno de los facores 0ue afecan la /elocidad de las reacciones enzimáicas, por lo ano en ese caso la formación del comple4o enzima susrao se produ4o de una forma más rápida. a aci/idad enzimáica aumena, hasa alcanzar la /elocidad máxima, puno donde la enzima se saura, de'ido a 0ue la enzima iene odos sus siios aci/os ocupados. Ce esa forma6 si se incremena la concenración de enzima, se forma ma*or canidad de producos por unidad de iempo. ?oda enzima iene una emperaura ópima, a la cual su /elocidad de reacción es máxima. > emperauras de'a4o de esa emperaura, la frecuencia de cho0ues enre la enzima * el susrao es 'a4a *, por ano, la /elocidad de reacción am'i-n lo es. :onforme se incremena la emperaura, aumena la frecuencia de cho0ues * se fa/orece la /elocidad de reacción (la formación del produco). #ero si la emperaura es mu* ele/ada, pueden romper la esrucura de ander Kaals * los puenes de hidro$eno 0ue esa'ilizan la esrucura erciaria * cuaernaria de las enzimas, como consecuencia, se produce su desnauralización * la perdida de la aci/idad enzimáica. ?al como en ese caso. a esrucura ridimensional de una enzima deermina su siio caal+ico *, por lo ano, su aci/idad. a ureasa aca en los compuesos a ni/el de los puenes :B excepo en a0uellos 0ue coniene puenes pep+dicos. El p@ ópimo para la aci/idad de la ureasa es de G. En esos casos se someió el u'o de ensa*o a un 14
O>'8()*0,'
:ada /ez 0ue se a$re$ue un reaci/o, mezclar, dando unos $olpecios li$eros al u'o
15
ELECTROFORESIS DE ADN EN GEL DE AGAROSA RESUMEN En la prácica se realizó elecroforesis con $el de a$arosa para deerminar la canidad * calidad de >CB presene en una muesra, por lo ano se e4ecuó el proocolo oporuno para la realización de ese, uilizando la exracción de >CB. #rimeramene se procedió a la preparación del $el a$arosa a un 2N en el cual poseriormene se correr+an las muesras de >CB exra+do con anerioridad para aclarar la presencia de >CB * su esado, consecui/amene se procede a la aplicación de nuesra muesra en la cámara elecrofor-ica (en esa ocasión ela'orada caseramene) para poder o'ser/ar la corrida del >CB en el $el a$arosa, * finalmene se hace o'ser/ación elecrofor-icamene de ese, donde es ransporado al cuaro oscuro para someerlo a la o'ser/ación en los ra*os 7 * as+ deerminar la calidad * canidad de >CB * por lo ano6 si el procedimieno fue hecho correcamene. 1e enconraron al$unas inconsisencias, las cuales pudieron ser ocasionadas por una mala preparación del $el a$arosa, mala uilización del ampón o incluso a una mala exracción del >CB realizado aneriormene.
INTRODUCCION a elecroforesis de los ácidos nucleicos es el m-odo más empleado para separar, idenificar * purificar mol-culas o fra$menos de >CB * >RB en función de su amao. #odemos además exraer del $el los fra$menos de >CB 0ue sean de iner-s, para poseriormene uilizarlos en diferenes aplicaciones. a elecroforesis de ácidos nucleicos por lo $eneral se lle/a a ca'o en $eles de a$arosa, ese m-odo es considerado sumamene sencillo * enormemene eficiene para separar fra$menos de >CB. 7na de las caracer+sicas más imporanes 0ue permie 0ue esa separación se lle/e a ca'o es el hecho de 0ue los ácidos nucleicos esán car$ados ne$ai/amene de'ido a los $rupos fosfaos. >s+ pues una /ez 0ue el >CB es expueso al campo el-crico * en
soluciones 'uffers, ese mi$rara hacia el ánodo (elecrodo posii/o) su /elocidad de mi$ración esará limiada por las fuerzas de fricción procedenes del sopore o $el. :ada mol-cula oor$a una car$a ne$ai/a * de'ido a la presencia de 1C1 se esa'lece una relación car$amasa similar en odas las mol-culas independienemene de su amao6 por lo ano la mi$ración o mo/ilidad del >CB en un $el /a depender del amao o conformación as+ como am'i-n del poro del $el. 7na /ez realizada la elecroforesis los fra$menos de >CB lo$ran o'ser/arse al uilizar compuesos fluorescenes6 el 'romuro de eidio es el colorane más empleado para la /isualización de >CB en los $eles, para ello se inercala en las 'ases de los ácidos nucleicos, emiiendo as+ una fluorescencia cuando es iluminado con los ra*os ulra/iolea los cuales hacen posi'le la 16
/isualización de canidades m+nimas de >CB, la uilización de ese compueso de'e ser mane4ada con mucho cuidado * con el cumplimieno ri$uroso de los proocolos de 'iose$uridad de los la'oraorios de 'ioecnolo$+a, pueso 0ue se considera un a$ene alamene cancer+$eno.
#unas para micropipea.
?u'os ipo eppendorf.
=uanes impermea'les para mane4o del 'romuro de eidio.
el
REACTIVOS >$arosa
OBJETIVOS #oner en prácica los principios ad0uiridos eóricamene acerca de la elecroforesis, as+ como comprender 0ue la separación de >CB es una de las -cnicas más imporanes acualmene, la cual nos permie idenificar pe0ueos fra$menos de ácido desoxirri'onucleico. :omprender cómo la conformación de la mol-cula de >CB deerminará su mo/ilidad a ra/-s de una mariz de $el. :omprende el mecanismo por el cual el 'romuro de eidio permie la /isualización de las 'andas de >CB.
Vcido ac-ico. EC?> eilendiaminoeraac-ico. Vcido 'órico. "romuro de eidio. >mori$uador de 'oraos.
METODOLOGÍA as eapas para lle/ar a ca'o una corrida elecrofor-ica se represenan en el si$uiene dia$rama5
E%UIPO :ámara horizonal de elecroforesis con los accesorios correspondienes (molde para hacer el $el, peine, ca'les para conecar a la fuene de alimenación). Luene de alimenación o de poder. ?ransiluminador ulra/iolea).
(fuene
de
luz
E0uipo foo$ráfico 0ue permia omar foos del $el. MATERIAL
Micropipeas.
17
P8'(8()*+, -'/ '/ -' ((80( 1e prepara el $el de a$arosa a un 2N. En ese se correrán las muesras de >CB exra+das con anerioridad.
P8'(8()*+, -' '<8( En ese caso la muesra *a se enconra'a preparada, la exracción de >CB perenece a ora prácica.
7na /ez colocada nuesra muesra en la
P8'(8()*+, -' /( '<8( )0, '/ >77'8. 7na /ez 0ue el $el ha solidificado reirar, el sellado de los 'ordes * colocar el molde con el $el en la cámara de elecroforesis.
cámara elecrofor-ica, procederemos a conecar los ca'les a la fuene de alimenación * aplicar un /ola4e de 2% (% Wcm de acuerdo a la disancia enre los elecrodos), los cuales serán los encar$ados de producir el campo el-crico, * por lo ano la separación de nuesras mol-culas.
>adir 'uffer de elecroforesis hasa 0ue cu'ra el $el unos 3 mm. Reirar cuidadosamene el peine para 0ue 0ueden li'res los pocillos para las muesras. Reire la apa. Cespacio * cuidadosamene. :ar$ar la muesra de >CB (s) en los pocillos del $el.
18
V*(/*()*+, -'/ '/ 7na /ez ranscurridos los 3 minuos (erminada la elecroforesis), apa$ue la fuene de alimenación * reire la apa de la ca4a de $el, en el si$uiene paso ese de'e eirse para lle/ar a ca'o la /isualización de los resulados. #ara ello se saca el $el de su molde * se sumer$e en una solución de "rE (. X$Wml) durane al menos % min.
Nota: Debe tenerse en cuenta que el ADN migra hacia el ánodo, por lo que debe disponerse correctamente la orientación del gel y de los cables.
:orrer el $el hasa 0ue el colorane azul de 'romo fenol es- a una disancia del 'orde de aproximadamene un 2N de la lon$iud oal del $el. En ese momeno de'e deenerse la elecroforesis. Eso se lo$rara en aproximadamene 3 minuos, a un /ola4e consane.
19
a/ar el $el con a$ua desilada para as+ reirar odas las fuerzas de inción no fi4adas en el $el. #ueso 0ue el la/ado con a$ua no elimina por compleo el color fi4ado en el inerior del $el, por esa razón es
:olocar el $el so're un ransiluminador * encender la lámpara de luz ulra/iolea (Y Z 3 nm), el >CB se /isualizará como 'andas de color anaran4ado.
necesario incu'ar el $el en una disolución decolarane. a cual se encar$ara de eliminar el colorane 0ue no se ha unido de forma espec+fica al >CB separado por la elecroforesis.
Loo$rafiar el $el con el sisema foo$ráfico disponi'le5 7na /ez 0ue se ha realizado esa acción puede lle/arse a ca'o el analisis de los resulados.
20
DISCUSIÓN a elecroforesis en $el de a$arosa es un m-odo normalizado 0ue se uiliza para separar, idenificar * purificar fra$menos de >CB. 1e raa de una -cnica sencilla * rápida 0ue permie diferenciar fra$menos de >CB 0ue no pueden separarse adecuadamene con oros procedimienos (M. 1omma). En nuesro caso se hizo para para idenificar la calidad * canidad de >CB presene en las muesras omadas. El desplazamieno de los ácidos nucleicos se de'e a la car$a el-crica omada por esos se$n el p@ presene en la solución del $el. os $eles (poliacrilamida o la a$arosa) se colocan en la cu'ea de elecroforesis, sumer$idos en un ampón de p@ alrededor de F. Ce esa forma, las mol-culas de >CB someidas a elecroforesis se desplazarán al polo posii/o *a 0ue a p@ superiores a poseen car$a ne$ai/a (:armen >licia #adilla #ea). a uilización de coloranes fluorescenes acan mediane inserción enre las pares de 'ases 0ue conforman el ácido nucle+co. El 'romuro de eidio es ampliamene uilizado para la /isualización de >CB * es ese un reaci/o alamene oxico, sin em'ra$o en la acualidad exisen coloranes fluorescenes alernai/os, como 1I"R 1afe, 1I"R =old, 1I"R =reen 9, isra =reen * 1*oO, desarrollados espec+ficamene para reducir los ries$os (Cu0ue, 2). a elecroforesis es uno de los m-odos de cuanificación más uilizados para la separación de mol-culas se$n la mo/ilidad de esas en un campo el-crico, exisen
diferenes ipos de elecroforesis en $el los cuales ienen una función de erminada. a elecroforesis en $el de muesras $randes de >CB * >RB se efeca en $eles de a$arosa, la elecroforesis de proe+nas se lle/a a ca'o en $eles de poliacrilamida1C1 (1C1 #>=E), isoelecroenfo0ue, $eles nai/os o elecroforesis 'idimensional, elecroforesis capilar, elecroforesis de >CB, zimo$raf+a o zimo$ramas. 7no de los m-odos más usados en los limos aos * de $ran imporancia en medicina6 es la elecroforesis capilar la cual presena la /ersailidad de poder separar aminoácidos, ácidos or$ánicos, iones inor$ánicos, car'ohidraos, eseroides, ioles, conaminanes alimenicios, maerial $en-ico * al$unos fármacos imporanes en el esudio de diferenes ramas en el área de la salud6 usualmene el análisis de los diferenes analios puede realizarse en unos minuos, se re0uiere de pe0ueas canidades de muesra (=>R:[>:>B>1 , 2G). En si la elecroforesis es una -cnica sensi'le * alamene /ersáil 0ue se encuenra in/olucrada en in/esi$ación $enómica * farmac-uica, pero 0ue además se expande consanemene en el dia$nósico molecular * cl+nico con resulados asom'rosos sin conar con las aplicaciones forenses 0ue de al$una forma la hicieron salar a la fama en sus inicios (\onahan \ Ma$aa%, 2F).
CONCLUSIONES a preparación inadecuada en el $el de a$arosa, puede ocasionar 0ue la resolución de las 'andas 0ue se forman ienda a ser difusas.
21
a composición * la fuerza el-crica del ampón pueden afecar la mo/ilidad de >CB, *a 0ue en ausencia de iones se desplaza lenamene o no se mue/e, * con demasiados iones se so'recaliena o se funde. as -cnicas de elecroforesis de >CB son ho* en d+a 'ásicas e insusiui'les para cual0uier ra'a4o en 'iolo$+a molecular con ácidos nucleicos, por lo 0ue se$uirán uilizándose pre/isi'lemene durane mucho iempo. > lo lar$o de los aos se han ido desarrollando a/ances en ese ipo de -cnicas, como la #L=E, as+ como aplicaciones nue/as, como el EM1>. El coninuo desarrollo de las -cnicas de 'iolo$+a molecular hace pre/er 0ue se enconrarán nue/as aplicaciones para los diferenes m-odos de elecroforesis de ácidos nucleicos en $el. a elecroforesis de >CB es il para comparar parones de 'andas de diferenes muesras 'ioló$icas, para la idenificación de ácidos nucleicos de a$enes infecciosos o para la o'ención de un fra$meno deerminado de >CB 0ue, una /ez localizado en el $el, puede ser exra+do para análisis poseriores. En los fra$menos de >CB do'les (con esrucura de do'le h-lice) la /elocidad de
mi$ración es in/ersamene proporcional a su amao. En fra$menos simples de >CB * >RB (una sola cadena), dichas mol-culas ienden a ple$arse de forma comple4a * a mi$rar de forma más complicada, se$n la esrucura erciaria formada ras el ple$amieno. 1in em'ar$o, compuesos 0ue puedan romper los enlaces de puene de hidró$eno, como el hidróxido de sodio o la formamida, son empleados para ]desple$ar] las mol-culas ple$adas * permiir 0ue la /elocidad de mi$ración dependa nicamene * exclusi/amene del amao * no de la esrucura formada ras el ple$amieno.
BIBLIOGRAFÍA
"andoH \ "aJer \C, "erh M, #ainer :, e al Improed image analysis !or"flo! for #$D gels enables large$scale #$D gel$based proteomics studies $ %&'D biomar"er discoery study
P9nformeQ. Ps.l.Q 5 #roeomics , 2F. "erh M Moser LM, ^ol'e M, e al. (he state of the art in the analysis of t!o$dimensional gel eletcrophoresis images. >ppl Micro'iol "ioechno
P9nformeQ. 2G. Cu0ue Cuina #osso 'rotocolos de laboratorio 7E= . 2.
22
23
