Interpretación de resultados toxicológicos post-mórtem: criterios de garantía de calidad Postmortem toxicological results interpretation: Quality assurance criteria
Rosario García-Repetto a, a
Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses, Departamento de Sevilla, Sevilla, España
Palabras Clave Interpretación. Resultados post mórtem. Sangre. Garantía de calidad.
Keywords Interpretation. Postmortem results. Blood. Quality assurance.
Resumen La correcta interpretación de los resultados toxicológicos post mórtem debe ser capaz de ofrecer una explicación sobre el significado y la trascendencia de los resultados analíticos obtenidos en el caso forense estudiado. El ajuste de la interpretación de resultados a la realidad de los l os hechos acontecidos será función de la calidad cal idad de la muestra analizada y de los resultados analíticos a nalíticos y del conocimiento de la existencia diversos fenómenos post mórtem y de las circunstancias en la que ocurrió la muerte. Todo el proceso está dificultado por la inexistencia de recomendaciones o protocolos que guíen al toxicólogo en el proceso de la interpretación. Constituye, por tanto, la etapa más compleja de la investigación toxicológica. Con el objetivo de a yudar al toxicólogo forense en esta tarea, se presenta esta revisión bibliográfica sobre los conocimientos existentes.
Abstract The correct interpretation of postmortem toxicology results offers an explanation on the meaning and significance of the obtained analytical results . Interpretation agreement to reality will depend on the quality of the sample and anal ytical results. It will also depends on the knowledge of the existence of different postmortem phenomena and the circumstances in which the death occurred. The whole process is hampered by the lack of recommendations or protocols to guide the toxicologist in the process of interpretation. Therefore, it is the more complex stage of toxicological research. In order
to assist the forensic toxicologist in this task, this review of the ex isting knowledge on this matter is presented.
Artículo Introducción
El objetivo primordial de un informe químico-toxicológico post mórtem es establecer si la presencia de una sustancia tóxica en las muestras analizadas puede explicar la causa y/o la manera de la muerte de un individuo. Los resultados toxicológicos presentan, por tanto, numerosas implicaciones médicas, sociales y judiciales. Así, se considera indispensable no concluir el informe con la expresión de la concentraci ón del analito en la muestra analizada e incluir una interpretación que explique el significado y la trascendencia de los resultados obtenidos. La interpretación de los resultados resulta ser la etapa más compleja del análisis toxicológico-forense1. Es un hecho generalmente aceptado que la interpretación de los resultados se debe realizar teniendo en cuenta el historial médico, las circunstancias que rodearon la muerte y la manera en que se produjo, los efectos probables de la concentración de la sustancia presente, la consideración de factores farmacocinéticos, la presencia concomitante de otras sustancias y la exclusión de otras causas potenciales. Además, la interpretación apropiada de las concentraciones sa nguíneas debe tener en cuenta las limitaciones del método analítico empleado, la naturaleza de las muestras analizadas y el conocimiento de los cambios post mórtem 1, 2. Se presenta en este trabajo una revisión bibliográfica con el propósito de proporcionar al toxicólogo forense, en la medida de lo posible, criterios de garantía de calidad necesarios para facilitar la interpretación de los resultados toxicológicos post mórtem y asegurar la fiabilidad de la misma. Factores que influyen en la c oncentración sanguínea post mórtem
Un resultado analítico en toxicología post mórtem está influido 3 por una serie de condiciones preanalíticas (Tabla 1) relacionadas con las características de la muestra analizada, por factores relacionados con el método analítico, por factores relacionados con la sustancia presente (Tabla 2) y con la idiosincrasia del individuo (Tabla 3, Tabla 4). Tabla 1. Factores preanalíticos que influyen en la interpretación de resultados Relacionados con causa/manera muerte
Trauma, pérdida de sangre
Relacionados con tiempo transcurrido
Intervalo post mórtem Existencia de putrefacción
Relacionados con toma y conservación de la muestra
Sitio de muestreo Volumen de sangre y conservante añadido Calidad de la muestra de sangre: fluidez, coágulos, contenido en agua y lípidos
Otros
Disponibilidad de otras matrices Conocimiento estabilidad analitos tras la muerte
Tabla 2. Factores relacionados con las propiedades de los analitos que influyen en la interpretación de resultados Tipo de sustancia
Sustancia legal o ilegal
Tiempo de vida media Parámetros toxicocinéticos Volumen de distribución Existencia metabolitos activos Forma de consumo
Forma dosificación y receta valida Vía de administración Dosis y frecuencia de uso: ¿desarrollo tolerancia?
Interacciones
Consumo de otras sustancias activas SNC Consumo de sustancias que comparten vías metabólicas
Tabla 3. Utilidad de la genotipificación en la interpretación Información existente
Factores a determinar ¿Polimorfismo enzimático?
¿Interacción? ¿Genotipificación?
Cociente compuesto original/metabolito elevado: muerte accidental o suicidio
Sí – No
Sí No –
Considerar Sí No
Cociente compuesto original/metabolito elevado anormalmente alto o bajo
Sí – No
Sí No –
Considerar Considerar No
Reacciones adversas
Sí – No
Sí No –
Considerar Considerar No
Cociente compuesto original/metabolito elevado: ingesta acorde prescripción
Sí – No
Sí No –
Considerar Sí No
Tomado de Eicherlbaum et al.
34
.
Tabla 4. Ventajas y desventajas de las aplicaciones de la farmacogenómica a la toxicología forense Ventajas
Desventajas
Estabilidad ADN Información limitada en casos post mórtem Evaluación respuesta individualizada Evaluación cumplimiento terapéutico Interacciones debida a factores medioambientales, presencia de inhibidores o inductores enzimáticos Diferenciación toxicidad aguda/crónica Implicación múltiples sistemas enzimáticos Coste asumible por laboratorios forenses
No informa modificaciones postraslacionales Complejidad interpretación legal
Tiempo necesario análisis acorde con lo requerido en toxicología forense Tomado de Jornil y Linnet
36
.
Condiciones preanalíticas: características de la muestra analizada
La sangre post mórtem es la muestra con mayor interés interpretativo 4. Es un hecho demostrado que la concentración post mórtem de una sustancia no es neces ariamente la presente en el momento de la muerte, ya que tras la muerte del individuo, comienzan una serie de procesos bioquímicos que pueden alterar el valor de dicha concentración 2. Tras la muerte, se produce la sedimentación de los eritrocitos por acción de la gravedad y formación de coágulos desiguales, motivo por el que no se dispone de plasma y sí de sangre total. La muerte celular provoca una salida del contenido celular al líquido extracelular que se vuelve ácido debido al metabolismo anaerobio: ello provoca un cambio en la composición de los fluidos corporales 4, 5. No se dispone de marcadores bioquímicos adecuados que indiquen la magnitud de los cambios post mórtem producidos6. La descomposición del cadáver implica procesos de autólisis enzimática y de putrefacción bacteriana. La extensión de los procesos putrefactivos varía según la temperatura, las circunstancias que rodean la muerte y el vaso sanguíneo del que se obtenga la muestra de sangre 4. El embalsamamiento del cadáver afecta a la calidad de las muestras que se pueden obtener, ya que se obtiene una muestra de un fluido diluido en el que, en ocasiones, se observan coágulos, pudiendo los productos utilizados en el proceso enmascarar, alterar o destruir las sustancias químicas presentes7. Los cambios post mórtem se pueden minimizar manteniendo el cadáver refrigerado a 4 °C, realizando la toma de muestras lo antes posible mediante aspiración con aguja a partir de un vaso periférico, preferentemente la vena femoral8, ya que normalmente es un líquido fluido homogéneo libre de coágulo s9. Para evitar la alteración de las sustancias presentes en la sangre, se recomienda la adición de un conservante. Por lo general, se utiliza fl uoruro sódico en una concentración que varía entre el 1-5% p/v. El fluoruro sódico está especialmente indicado en los casos en los que se quiera determinar cocaína, alcohol etílico, monóxido de carbono y cianuro 4, 10, 11. Se desaconseja su utilización si se necesita determinar plaguicidas organofosforados12. Las normas de remisión de muestras para análisis del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses13 exigen que además del fluoruro sódico se añada oxalato cálcico como anticoagulante. Asimismo, no se recomienda la utilización de citrato como conservante debido a su capacidad tamponadora, a que favorece la cesión de plastificantes desde los contenedores de la muestra y a que contribuye a la formación in vitro de GHB 14. Es muy frecuente que los tubos y tapones de plástico cedan plastificantes a la muestra, especialmente ftalatos6. Por ejemplo, el cloruro de polivinilo puede ceder p,p-di-2etilhexilftalato a las muestras15.
La influencia de las condiciones preanalíticas sobre la incertidumbre de la medida de concentración puede ser importante e incluso mayor que la incertidumbre asociada al método analítico16. Por ejemplo, se ha demostrado que la incertidumbre asociada a la concentración de metadona en sangre femoral se incrementa 5 veces cuando se tienen en cuenta los factores preanalíticos17. Por ello, la interpretación de la concentración post mórtem no debe realizarse sin el conocimiento preciso de los procesos que afectan al valor de la concentración presente en la sangre 18. Lo expuesto con anterioridad muestra la gran influencia de las condiciones preanalíticas sobre el resultado y su interpretación. Por ello, y para facilitar y armonizar los procesos de toma de muestras, se han publicado varias recomendaciones, como las efectuadas por de Zeeuw et al. en 2001 19 y Flanagan et al. en 2005 20, la Sociedad de Toxicólogos Forenses estadounidense en 2006 21, la Sociedad de toxicólogos forenses alemana 22 o la Sociedad británica de toxicólogos forenses en 2010 23. Características del resultado analítico
Una de las razones que hace que el análisis toxicológico sea tan complicado es que frecuentemente se pretende la determinación de cualquier sustancia que pudiera tener interés toxicológico. Esta aproximación, aunque idealista, no es útil para un laboratorio que recibe miles de casos al año. Hay que tener presente que pueden existir s ustancias de difícil detección o que no están incluidas en los protocolos habituales y que solo serán determinadas si la información que concierne al caso así lo sugiere. En la práctica, resulta indispensable que el laboratorio reciba la información más completa posible, incluyendo detalles de las circunstancias en las que ocurrió la muerte y los hallazgos de la autopsia24. El toxicólogo forense debe conocer las limitaciones y la fiabil idad de los métodos analíticos utilizados debido a que la calidad de la interpretación dependerá de la calidad de los resultados obtenidos25. En este sentido, debe saber si el método analít ico empleado está correctamente validado y es lo suficientemente específico, si se utilizaron calibradores preparados en la matriz y si la calibración efectuada era válida en el intervalo de interés21, 22, 23. Por todo lo expuesto, resulta prácticamente imposible conocer la concentración «real» del analito en la muestra de sangre post mórtem. Sin embargo, la fiabilidad del resultado aumenta con la especificidad del análisis, con la replicación del mismo o mediante la aplicación de 2 técnicas analíticas basadas en principios físico-químicos diferentes. Tradicionalmente, se ha considerado la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas en modalidad de monitorización de iones (SIM) como la técnica instrumental que proporciona una mayor confianza en la exactitud y la precisión del resultado analítico2,26. Por último, la obtención de un resultado negativo no implica necesariamente la ausencia de intoxicación. Este hecho puede deberse bien a una mala aplica ción del método analítico o bien a la utilización de un método analítico inapropiado para la determinación solicitada27. Características de la sustancia presente
El comportamiento de las distintas sustancias tóxicas en el organismo está caracterizado por diversos parámetros toxicocinéticos:
– Volumen de distribución: es una medida de la extensión de la distribución de la sustancia en el organismo28, 29. Leikin y Watson2 establecieron que cuando la relación concentración en sangre central:concentración en sangre periférica es < 3, el volumen de distribución de la sustancia en cuestión es elevado. – Liposolubilidad: definida por el coeficiente de partición octanol-a gua. No se ha podido establecer una relación entre el cociente de concentraciones central y periférica y el coeficiente de partición octanol:agua30. – Grado de ionización de las sustancias: la disminución post mórtem del pH sanguíneo puede modificar el grado de ionización, alterando las propiedades físico-químicas y parámetros toxicocinéticos que condicionan la distri bución31. – Existencia de mecanismos de transporte activo – Grado de unión a proteínas plasmáticas. Las sustancias unidas a proteínas plasmáticas suponen un reservorio circulante de la misma30.
Idiosincrasia del individuo
Los distintos individuos suelen reaccionar de forma distinta a una dosis determinada de una sustancia concreta25. Son numerosos los factores que pueden influir en los efectos manifestados. Entre ellos, podemos citar:
– Factores individuales: sexo, edad, masa corporal, factores genéticos. – Interacción con otras sustancias consumidas simultáneamente: alcohol, otros medicamentos, drogas de abuso. – Influencia del estado fisiopatológico del paciente: embarazo, enfermedades anteriores, presencia de heridas, quemaduras, infecciones.
En general, se estima que los factores genéticos suponen entre el 15 y el 30% de las diferencias toxicocinéticas y toxicodinámicas inter individuales. En algunos casos, la influencia de los factores genéticos puede llegar a ser hasta del 95%32. La familia enzimática del citocromo P450 presenta un elevado polimorfismo en la población. Los individuos presentan una distinta actividad metabólica, lo que determina la concentración presente en sangre. Se puede clas ificar a los individuos en: metabolizadores ultrarrápidos, extensos, intermedios y pobres33. Se sabe también que la frecuencia de los distintos alelos varía con la raza, por lo que varía también la actividad enzimática. Por ejemplo, entre el 7 y el 8% de los caucásicos es deficiente en el CYPP450 IID6, motivo por el que dichas personas presentan una menor actividad oxidativa34. Algunos autores recomiendan la realización de la genotipificación para mejorar la interpretación de las concentraciones post mórtem2. En la actualidad, se dispone de un protocolo para determinar, en cada caso forense, la utilidad de realizar la genotipificación (Tabla 3)35. Dicho protocolo se basa en el cociente de concentraciones metabolito/compuesto original, el consumo concomitante de otras sustancias y la existencia de polimorfismo enzimático. Resulta indispensable, además, tener en cuenta la capacidad metabólica global del individuo y la ingesta concomitante de sustancias que pudieran interaccionar con las enzimas metabolizadoras36.
Wong et al.37 resumieron en su trabajo publicado en el año 2010 las ventajas y las desventajas de la aplicación de la farmacogenómica a la interpretación de resultados en toxicología forense (Tabla 4). Variación de las concentraciones post mórtem: fenómenos de redistribución post mórtem
Las concentraciones post mórtem de las sustancias tóxicas pueden variar debido a la existencia de fenómenos putrefactivos y de redistribución post mórtem. Los fenómenos putrefactivos pueden originar la degradación de algunos compuestos y la formación de otros, como son las aminas biógenas y el alcohol etíli co8. La existencia de los fenómenos de redistribución post mórtem es un hecho conocido desde hace varias décadas, siendo la digoxina la primera sustancia para la que se describieron38, 39, 40. Se definen como el movimiento que los fármacos tienen dentro del cuerpo una vez que se ha producido la muerte. Dicho proceso es responsable de la detección de concentraciones más altas que las presentes en el momento de la muerte. Comienza tan pronto como acaba la fase de agonía debido a la lisis celular que se produce al ir disminuyendo los procesos bioquímicos necesarios para el mantenimiento de la vida41. Por tanto, se trata de un fenómeno que complica enormemente la interpretación de las concentraciones post mórtem3. Tanto es así que ha llegado a ser considerado una «pesadilla toxicológica»28. La redistribución post mórtem 8 se puede producir mediante los siguientes mecanismos:
– Liberación tras la muerte de la sustancias desde los tejidos donde se ha depositado a los vasos pulmonares o cardíacos. – Difusión simple de la sustancia a favor de gradiente de concentración al cesar, tras la muerte, los mecanismos de transporte activo e incrementarse la permeabilidad de la membrana plasmática. Este fenómeno tiene mucha influencia en la distribución de moléculas pequeñas apolares5, como el etanol42. La difusión se puede producir a partir de la liberación traumática a partir del estómago, la aspiración agónica del contenido estomacal a los pulmones, la absorción a partir del esófago o la tráquea tras vómitos o reflujo y de la liberación continuada a partir de un sistema de li beración retardada43. Las sustancias pueden acumularse en la vejiga urinaria tras difundir desde la orina si el individuo permanece varias horas inconsciente antes de producirse la muerte44. – Distribución incompleta de la sustancia en el momento de la muerte. La muerte se produce, en esos casos, antes de que se alcance el estado estacionario de las concentraciones.
Las sustancias con volumen de distribución alto (> 3 l/kg) son más propensas a sufrir los fenómenos de redistribución28. En general, las sustancias alcalinas y liposolubles tienden a tener un volumen de distribución elevado, pudiendo acumularse en los pulmones45 y difundir, tras la muerte, al corazón. De esta manera, la concentración en sangre cardíaca aumenta artificialmente46. La mayoría de los metabolitos de las drogas de abuso sufren en menor grado los efectos de la redistribución post mórtem, ya que son más hidrosolubles que el compuesto original47.
La relación entre las concentraciones presentes en sangre cardíaca y sangre femoral se ha utilizado para predecir si una sustancia sufrirá redistribución post mórtem. Dicha relación dependerá del volumen de distribución de la sustancia, de su pKa, el grado de unión a proteínas plasmáticas, el rango de concentraciones y el intervalo transcurrido entre la muerte y la autopsia48, 49. Se ha establecido la relación existente para diversas sustancias. Así, por ejemplo, la carbamacepina no presenta redistribución, mientras que alprazolam, fenobarbital, venlafaxina y tramadol presentan una redistribución poco extensa. El delta-9 tetrahidrocannabinol y sus principales metabolitos presentan una redistribución moderada, siendo las sustancias con mayor tendencia a la redistribución amitripilina, fluoxetina, sertralina, trazodona, zolpidem, nordiazepam y propofol50, 51. Interpretación de la concentración sanguínea
La interpretación de los resultados post mórtem es muy complicada y debe hacerse con un conocimiento completo de la historia del caso 52. El mayor reto al que se enfrenta el toxicólogo forense es definir cuál es la concentración en sangre post mórtem que indica la presencia ante mórtem de una concentración letal. La concentración post mórtem suele aumentar de manera si gnificativa a medida que el intervalo entre el momento de la muerte y el momento de la toma de la muestra se incrementa. Este aumento de concentración puede llegar a ser mayor que la incertidumbre del método analítico empleado53. Relación entre las concentraciones obtenidas antes y después de la muerte
Los resultados obtenidos en el escaso número de estudios realizados en humanos en los que se relacionen las concentraciones ante mórtem y post mórtem están sujetos a una gran incertidumbre. Ello desaconseja la estimación de l as concentraciones ante mórtem a partir de los resultados post mórtem41. Algunos estudios peri mórtem demuestran que las concentraciones post mórtem obtenidas en vena femoral son similares a las concentraciones in vivo obtenidas justo antes de la muerte. Sin embargo, no se puede generalizar, ya que cuando se calcula la relación existente entre concentraciones en sangre femoral post mórtem y concentraciones ante mórtem se obtiene un factor de 3 para antidepresivos tricíclicos29 y de 4 para la clozapina 54. Existen numerosos estudios realizados con animales de experimentación en los que se han podido demostrar las diferencias existentes en la concentración post mórtem en virtud del sitio de muestreo para sustancias como citalopram, morfina, 3,4metilendioximetilanfet amina(MDMA), paracetamol o fluoxetina55, 56, 57, 58, 59. Los resultados de dichos estudios son difíciles de aplicar al trabajo forense diario debido a las diferencias existentes en fisiología y anatomía entre animales de experimentación y el ser humano. Para poder distinguir entre una intoxicación aguda, un tratamiento crónico y la existencia de redistribución post mórtem, se ha propuesto la utilización del cociente entre concentraciones de la sustancia y su metabolito principal. Como referencia, se
utilizan los cocientes calculados para un tratamiento crónico; así, si el cociente obtenido es alto, se puede suponer la existencia de una intoxicación aguda60. Realización de cálculos toxicocinéticos
La estimación de la dosis consumida por un individuo a partir de la concentración encontrada en sangre utilizando como parámetro el volumen de distribución es un cálculo común en farmacocinética clínica61que se ha utilizado, en ocasiones, en la interpretación de concentraciones post mórtem62. En la actualidad, dichos cálculos están desaconsejados, ya que se desconoce el valor del volumen de distribución de las sustancias en el organismo una vez que se ha producido la muerte 63. Se estima que la utilización de este tipo de cálculos puede llevar a la sobreestimación de la dosis por un factor de 10 o más7. Algunos autores han propuesto el análisis cuantitativo de varias muestr as de tejidos para poder estimar la carga corporal total o «la mínima dosis administrada»61 en un intento de evitar los errores inherentes al uso del volumen de distribución en el cálculo de la dosis. Relación concentración post mórtem y efectos
Uno de los dogmas centrales de la farmacología cl ínica es que la acción de un fármaco está determinada por su concentración en el sitio de acción. Los efectos fisiológicos de la mayoría de los fármacos y los tóxicos se correlacionan con sus concentraciones en sangre o fracciones sanguíneas como plasma o suero. De esta manera, se han establecido rangos terapéuticos para diversas sustancias64. Se asume, por tanto, que la concentración en el compartimento de muestreo es la presente en el sitio de acción y que, a su vez, se corresponde con la dosis administrada. Sin embargo, las relaciones entre dosis y concentración plasmática y entre la concentración y los efectos pueden variar enormemente entre l os diferentes individuos30. A pesar de que las relaciones dosis-respuesta ante mórtem son conocidas, la obtención de dicho tipo de relaciones post mórtem es complicada. Los datos farmacológicos tienen una aplicación limitada en la interpretación de concentraciones post mórtem, ya que se obtuvieron a partir de individuos vivos y no tienen en cuenta los cambios que se producen tras la muerte, como son la autólisis y la putrefacción. Además, muchos intervalos se basan en medidas efectuadas a un número relativamente pequeño de individuos. Ello conlleva una incertidumbre estadística considerable tanto para intervalos ante mórtem como post mórtem 65. Normalmente, los datos farmacológicos se obtienen a partir del análisis de muestras de suero o plasma, mientras que las concentraciones post mórtem se obtienen en sangre. Además, en casos de sobredosis, habría que tener en cuenta la posible saturación de los sistemas enzimáticos. Con frecuencia, los datos farmacológicos disponibles hacen referencia únicamente al compuesto original y no a sus metabolitos. En cualquier caso, los datos tienen aplicación en una población sana, por lo que no se recomienda la extrapolación a una población de adictos a drogas. Por tanto, no se puede establecer una
relación directa entre la concentración en sangre post mórtem y los efectos de una sustancia determinada. Tolerancia
La tolerancia disminuye los efectos que produce una dosis determinada de una droga, lo que implica que hace falta una dosis mayor para lograr los mismos efectos. Parece ser que la tolerancia es un fenómeno que depende del tiempo y que suele desaparecer una vez que el individuo se vuelve abstinente. El tiempo necesario para perder la tolerancia a una droga depende en parte de su vida media de elimi nación. Así, la tolerancia a la heroína se pierde tras 2 días de abstinencia66, la tolerancia a la cocaína aparece tras una semana de consumo y se pierde aproximadamente tras una semana de abstinencia67. Por otro lado, el cese del consumo de GHB puede precipitar los efectos adversos de manera inmediata68. Se ha demostrado una regulación a la baja de rece ptores en el caso del tratamiento crónico con opiáceos 69, 70 y con agonistas del GABA, como el alcohol etílico 31 y la clozapina71, de manera que se necesita una dosis mayor para obtener los mismos efectos. Un estudio72 realizado con 693 víctimas que murieron a causa de intoxicación letal por etanol demostró la influencia de los fenómenos de toler ancia en las concentraciones post mórtem de etanol, ya que la concentración letal p ara algunas víctimas era 3 veces más alta que para otras. Por tanto, la interpretación de los efectos farmacodinámicos a partir de concentraciones sanguíneas debe realizarse teniendo en cuenta el contexto de las posibles variaciones de la relación concentración-respuesta y la existencia de tolerancia72. Utilización de tablas de referencia
El toxicólogo forense dispone desde hace años en la bibliografía científic a de tablas de referencia que incluyen datos de concentraciones terapéuticas, tóxicas y letales de distintas sustancias. Las primeras compilaciones de datos post mórtem no especificaban el lugar de muestreo pero en 1997 se publicó la primera tabla de concentraciones en sangre femoral73. Posteriormente, se han publicado numerosas compilaciones de distinta extensión y utilidad62, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84. Como inconvenientes de estas tablas, hay que mencionar que están construidas a partir de datos clínicos, no teniendo en cuenta las circunstancias del uso de los distintos fármacos, los fenómenos de tolerancia, las circunstancias en las que ocurrió la muerte y la existencia de redistribución post mórtem. Los datos de las tablas deberían reflejar también los casos en los que la persona ha sobrevivido durante un periodo corto gracias a una intervención médica, muriendo finalmente con unas concentraciones sanguíneas menores a las iniciales. La aplicación inapropiada de las tablas puede, por tanto, resultar en infravaloración o en sobrevaloración de la toxicidad potencial de una sustancia. Para mejorar la calidad de la interpretación se ha propuesto la creación de tablas de referencia para sangre post mórtem en las que se establezcan categorías de acuerdo con la causa de la muerte30.
Reis et al.85 aplicaron esta propuesta al estudio de las muertes causadas por intoxicación con antidepresivos, distinguiendo entre los casos en los que se detectó una única sustancia, los casos en los que se detectó más de una sustancia y un tercer grupo en el que se incluyen los casos en los que la muerte no se produjo por intoxicación. Un estudio similar 86, en el que se relacionaban las concentraciones post mórtem con la causa de la muerte, se centró en las sustancias serotoninérgicas. Los autores de ambos trabajos afirman que con este tipo de tablas de referencia la interpretación de resultados post mórtem sería más acertada, a pesar de que es bastante probable que las concentraciones en los diversos grupos establecidos se superpongan debido a la variabilidad biológica interindividual, la variabilidad analítica y de muestreo. Linnet et al.27 desaconsejaron la utilización de compilaciones de datos obtenidos in vivo, como las listas TIAFT o los publicados por Baselt87 y Schulz y Schmoldt75. Opinan que sería más apropiada la utilización de los percentiles superiores obtenidos a partir de concentraciones post mórtem procedentes de casos donde no se produjo intoxicación. Una propuesta diferente es la realizada en 2009 por Jones y Homlgren88, que proponen el cálculo de los percentiles superiores 90, 95 y 97,5 de las concentraciones de 25 sustancias y la utilización de los mismos en la interpretación de concentraciones post mórtem. Los percentiles son útiles para realizar comparaciones con nuevos casos de autopsias. Así, una concentración mayor que el percentil 97,5% puede indicar una sobredosificación y que la muerte se pueda deber a una intoxicación. Existe también la posibilidad de utilizar, en lugar de las tablas de referencia, la relación de concentraciones entre metabolito y compuesto original en la interpret ación de concentraciones post mórtem. Así se ha propuesto en los casos de muertes relacionadas con el consumo de heroína, el cálculo de la relación entre las concentraciones de morfina y de codeína en sangre. Si el valor del co ciente es mayor de uno, podemos afirmar que el individuo consumió heroína, incluso si no se detecta la presencia de 6monoacetilmorfina. Sin embargo, un valor del cociente menor de uno puede indicar un consumo simultáneo de codeína y heroína89. Como consecuencia de lo expuesto, la mayoría de los toxicólogos con experiencia utilizan sus propios casos como referencia y utilizan monografías en las que las referencias estén disponibles, así como las circunstancias de cada caso para interpretar las concentraciones obtenidas63. Criterios de calidad en la interpretación toxicológica post mórtem
Como ya se ha mencionado, la correcta interpretación de los resultados toxicológicos post mórtem depende de la calidad de los datos analíticos y del conocimiento de los procesos post mórtem59. Las normas publicadas por las diferentes organizaciones profesionales internacionales recomiendan que los laboratorios de toxicología forense tengan instaurado un sistema de calidad que les permita garantizar que los resultados generados en el mismo son fiables19, 20, 21, 22, 23. Resulta indispensable que un laboratorio de toxicología forense tenga la capacidad de poder asegurar la fiabilidad de sus resultados, ya que van a ser utilizados por el sistema legal en toma de decisiones90.
Un sistema de calidad describe todos los procedimientos y los criterios adoptados por el laboratorio para asegurar la integridad de la muestra recibida, la continuidad de la cadena de custodia y la trazabilidad de los resultados analíticos91, 92. La evaluación de los mecanismos de control se realiza mediante la participación en pruebas de aptitud1, 93. En este sentido, un ejercicio de intercomparación realizado en el Reino Unido en el año 2001 demostró cómo, a pesar de que los laboratorios participantes obtuvieron unos resultados analíticos adecuados, la interpretación de los mismos varió notablemente entre unos laboratorios y otros. Los autores reconocen la necesidad de s eguir diseñando ejercicios similares en los que se evalúe la interpretación de resultados94. Una vez obtenido el resultado analítico, las normas internacionales19, 20, 21, 22, 23 recomiendan que, antes de realizar la interpretación, se revise todo el proceso seguido documentando la cadena de custodia, los controles realizados y la validez del resultado. Para ello, se dispone de criterios de calidad cualitativos y cuantitativos95, 96. Sin embargo, las normas no establecen criterios para la interpretación de los resultados post mórtem19, 20, 21, 22, 23. En el mismo sentido, la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 97 dispone que la interpretación de resultados quedará al criterio del facultativo responsable, que tendrá que haber demostrado su competencia técnica. Sin embargo, la interpr etación de resultados en sí misma no es acreditable. Por consiguiente, el cumplimiento de las directrices gubernamentales y las recomendaciones realizadas por asociaciones profesionales y la implantación de un sistema de calidad pueden asegurar que el proceso preanalítico y analítico se realice con total fiabilidad. Sin embargo, no aseguran que la interpretación de result ados sea correcta. Por ello, en los casos en los que se carece del fundamento científico necesario para realizar la interpretación, el toxicólogo forense no debe ceder a presiones externas encaminadas a que decida si una determinada concentración sanguínea es la responsable de la muerte de un individuo o no 98. Conclusiones
La interpretación de una determinada concentración en sangre requiere una revisión cuidadosa de cada caso concreto, ya que un valor aisl ado de concentración no determina por sí mismo la etiología de un suceso. Asimismo, ha quedado patente la necesidad de realizar estudios experimentales encaminados a un mejor conocimiento de los procesos post mórtem. La interpretación de los resultados analíticos en los que se detectan sustancias de reciente aparición en el mercado, también conocidas como sustancias emergentes, es aún más complicada debido a la escasez de conocimientos existentes sobre las propiedades toxicológicas de las mismas. El estudio de los factores que afectan a la interpretación de las concentraciones de dichas sustancias merece por sí mismo un artículo específico. Sería recomendable que se publicara por parte de las asociaciones profesionales internacionales algún protocolo que guiara al toxicólogo forense en la interpretación de los resultados post mórtem. Además, resulta de gran uti lidad la participación en
ejercicios de intercomparación en el que, además de demostrar la capacidad de producir resultados analíticos fiables, se pudiera demostrar la corrección de la interpretación de resultados y acreditar la capacitación profesional. Por último, y aunque su estudio no está incluido en los objetivos del presente trabajo, cabría resaltar la información complementaria que el análisis del humor vítreo podría aportar para facilitar la interpretación post mórtem de los resultados analíticos de determinados compuestos tóxicos, como por ejemplo el alcohol etílico. Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Recibido 31 Marzo 2014 Aceptado 4 Mayo 2014
Bibliografía 1.Hearn WL, Walls HC. Introduction to postmortem toxicology. En: Karch S.B., editors. Postmortem toxicology of abused drugs. Boca R aton: CRC Press; 2008. 1-11. 2.Leikin J, Watson W. Post-mortem toxicology: What the dead can and cannot tell us. J Toxicol Clin Toxicol. 2003; 41:47-56. 3.Nilsson GH, Kugelberg F, Ahlner J, Kronstrand R. Influence of pre-analytical conditions on the interpretation of zopiclone concentrations in whole blood. Forensic Sci Int. 2011; 207:35-9. 4.Skopp G. Preanalytical aspects in postmortem toxicology. Forensic Sci Int. 2004; 142:75-100. 5.Pélissier-Alicot AL, Gauller JM, Champsaur P, Marquet P. Mechanism underlying postmortem redistribution of drugs: A review. J Anal Toxicol. 2003; 27:533-44. 6.Langford AM, Pounder DJ. Possible markers for postmortem drug redistribution. J Forensic Sci. 1997; 42:88-92. 7.Gannet PM, Doft JR, James D, Rybeck B, Knopp JB, Tracy TS. In vitro reaction of barbiturates with formaldehyde. J Anal Toxicol. 2001; 25:443-9. 8.Flanagan RJ, Connally G. Interpretation of analytical toxicology results in life and post-mortem. Toxicol Rev. 2005; 24:51-62. 9.Pounder DJ. Postmortem drug sampling and redistribution. En: Payne-Jones J., editors. Encyclopedia of Forensic and Legal Medicine. Nueva York: Academic Press; 2005. 211-7. 10.Caplan YH. Blood, urine and other fluid and tissue specimens for alcohol analysis. En: Garriot J.C., editors. Medicolegal aspects of alcohol determination in biological samples. Boca Raton: Year Book Medical Publishers; 1988. 74-86. 11.Isenschmid DS, Levine BS, Caplan YH. A comprenhensive study of the stability of cocaine and its metabolites. J Anal Toxicol. 1989; 13:250-6. 12.Moriya F, Hashimoto Y, Kuo TL. Pitfalls when determining tissue distributions of organophosphorus chemicals: Sodium fluoride accelerates chemical degradation. J Anal Toxicol. 1999; 23:210-5.
13.Orden JUS/1291/2010 de 13 de mayo del 2010. Normas para la preparación y remisión de muestras objeto de análisis por el Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Boletín Oficial del Estado, 19 de ma yo del 2010. 14.Ferrara SD, Frison G, Tedeschi L, LeBeau M. Gammahydroxybutyrate (GHB) and related products. En: LeBeau M., Mozayani A., editors. Drug-facilitated sexual assault. A forensic handbook. San Diego: Academic Press; 2001. 107-26. 15.Dine T, Luyckx M, Cerin M. Rapid determination by high performance liquid chromatography of di-2-ethylhexylphtalate in plasma stored in plastic bags. Biomed Chromatog. 1991; 5:94-7. 16.Hargrove VM, McCutcheon JR. Comparison of drug concentration taken from clamped and unclamped femoral vessels. J Anal Toxicol. 2008; 32:621-5. 17.Linnet K, Johansen S, Buchard A, Munkholm J, Morling N. Dominance of preanalytical over analytical variation for measurement of methadone and its main metabolite in postmortem femoral blood. Forensic Sci Int. 2008; 179:78-82. 18.Skopp G, Potsch L, Klingmann A, Maltern R. Stability of morphine, morphine-3glucuronide and morphine-6-glucuronide in fresh blood and plasma and postmortem blood samples. J Anal Toxicol. 2001; 25:2-7. 19.De Zeeuw RA, Muller RK, Finke BS. Systematic toxicological analysis: Laboratory guidelines. Bulletin TIAFT. 2001; 31:23-6. 20.Flanagan RJ, Connally G, Evans MJ. Analytical toxicology: Guidelines for sample collection postmortem. Toxicol Rev. 2005; 24:63-71. 21.Society of Forensic Toxicologists/American Academy of Forensic Sciences (SOFT/AAS). Forensic laboratory guidelines [consultado 24 J un 2013]. Disponible en: www.soft-tox.org. 22.Society of Toxicological and Forensic Chemistry (GTFCH). Guidelines and recommendations [consultado 27 Jun 2013]. Disponible en: www.gtfch.org/cms/index.php/guidelines. 23.Cooper GAA, Paterson S, Osselton D. The United Kingdom and Ireland association of forensic toxicologists. Forensic toxicology laboratory guidelines (2010). Sci Jus. 2010; 50:166-76. 24.Levine B. Forensic Toxicology. Anal Chem. 1993; 65:272-6. 25.Baselt R, Carvey R. Disposition of drugs and toxic chemicals in man. 4. a ed. Foster City: Chemical Toxicological Institute; 1995. 26.Cody JT, Foltz RL. GC/MS analysis of body fluids for drugs of abuse. En: Yinon E.E., editors. Forensic applications of mass spectrometry. Boca Raton: CRC Press; 1995. 1-59. 27.Linnet K. Postmortem drug concentration intervals for the non-intoxicated state — a review. J Forensic Leg Med. 2012;19:245-9. 28.Pounder DJ, Jones GR. Post-mortem drug redistribution-a toxicological nightmare. Forensic Sci Int. 1990; 45:253-63. 29.Hilberg T, Rodge S, Morland J. Postmortem drug redistribution-human cases related to results in experimental animals. J Forensic Sci. 1999; 44:3-9. 30.Ferner RE. Post-mortem clinical pharmacology. Br J Clin Pharmacol. 2008; 66:43043.
31.Drummer OH, Gerostamoulos J. Postmortem drug analysis: Analytical and toxicological aspects. Ther Drug Monit. 2002; 24:199-209. 32.Hernandez AF, Pla A, Gil F, Gómez A, Lozano D, Alarcón R, et al. Importancia de la toxicogenómica en la interpretación de los resultados postmortem. Rev Toxicol. 2011; 28:16-7. 33.Musshoff F, Stemer UM, Madea B. Pharmacogenetics and forensic toxic ology. Forensic Sci Int. 2010; 203:53-62. 34.Eicherlbaum M, Ingelman-Sundberg M, Evasn WE. Pharmacogenomics and individualized drug therapy. Annu Rev Med. 2006; 57:119-37. 35.Holgren P, Ahlner J. Pharmacogenomics for forensic toxicology: Swedish experience. En: Wong S.H., Linder M., Valdes R., editors. Pharmacogenomics and proteomics. Washington DC: AACCPress; 2006. 295-9. 36.Jornil J, Linnet K. Roles of polymorphic enzymes CYP2D6 and CYP2C19 for in vitro metabolism of amitriptyline at therapeutic and toxic levels. Forensic Toxicol. 2009; 27:12-20. 37.Wong SHW, Happy C, Blinke G, Gock S, Jenten JM, Donald J, et al. From personalized medicine to personalized justice: The promises of translationale pharmacogenomics in the justice system. Pharmacogenomics. 2010; 11:731-7. 38.Holt DW, Benstead JG. Postmortem assay of digoxine by radioimmunoassay. J Clin Pathol. 1975; 28:483-6. 39.Rouzioux JM. Résultats des analyses toxicologiques lors des autopsies médicolégales: Intérêt-difficultés d’interpretation. Acta Med Leg Soc (Liege). 1980; 30:25-42. 40.Koren G, MacLeod SM. Postmortem redistribution of digoxine in rats. J Forensic Sci. 1985; 30:92-6. 41.Cook DS, Braithwaite RA, Hale KA. Estimating antemortem drug concentrations from postmortem blood samples: The influence of postmortem redistribution. J C lin Pathol. 2000; 53:282-5. 42.Pounder DJ, Fuke C, Cox DE, Smith D, Kuroda N. Postmortem diffusion of drug form gastric residue: An experimental study. Am J Forensic Med Pathol. 1996; 17:1-7. 43.Moriya F, Hashimoto Y. Postmortem diffusion of drugs from the bladder into femoral venous blood. Forensic Sci Int. 2001; 123:248-53. 44.Pounder DJ, Yonemitsu K. Postmortem absorption of drugs and etanol from aspirated vomitus-an experimental model. Forensic Sci Int. 1994; 51:185-95. 45.Yarema MC. Becker Ce Key concepts in post-mortem drug redistribution. Clin Toxicol (Phila). 2005; 43:235-41. 46.Schloegl H, Dresen S, Spazynski K, Stoertzel M, Wurst M, Weinmann W. Sta bility of ethyl glucuronide in urine, post-mortem tissue and blood samples. Int J Legal Med. 2006; 120:83-8. 47.Moriya F, Hashimoto Y. Criteria for judging whether postmortem blood concentrations can be used for toxicological evaluation. Legal Med. 2000; 2:143-51. 48.Dalpe-Scott M, Degouffe Garbutt D, Drost M. A comparison of drug concentrations in post-mortem cardiac and peripheral blood in 320 cases. Can Soc Forensic Sci Int. 1995; 28:1. 49.Hilberg T, Morland J, Bjorneboe A. Postmortem release of amitriptyline from the
lungs; a mechanism of postmortem drug redistribution. Forensic Sci Int. 1994; 64:4755. 50.Holland MG, Schwope DM, Stoppacher R, Gillen SB, Huestis MA. Postmortem redistribution of (9-tetrahydrocannabinol (THC), 11-hydroxy-THC (11-OH-THC) and 11-nor-9-carboxy-THC (THCCOOH). Forensic Sci Int. 2011; 212:247-51. 51.Han E, Kim E, Hond H, Jeong S, Kim J, In S, et al. Evaluation of postmortem redistribution phenomena for commonly encountered drugs. Forensic Sci Int. 2012; 219:265-71. 52.Patel G. Postmortem drug levels: Innocent bystander or guilty as charged. J Pharm Practice. 2012; 25:37-40. 53.Saar E, Beyer J, Gerostamoulos D, Drummer OH. The time-dependant post-mortem redistribution of antipsychotic drugs. Forensic Sci Int. 2012; 222:223-7. 54.Flanagan RJ, Spencer EP, Morgan PE, Barnes TRE, Dunk L. Suspected clozapine poisoning in UK/Eire 1992-2003. Forensic Sci Int. 2005; 155:91-9. 55.Kugelberg FC, Druid H, Carlsson BR, Ahlnor J, Bengtsson F. Postmortem redistribution of the enantiomers of citalopram and its metabolites: An experimental study in rats. J Anal Toxicol. 2004; 28:631-7. 56.Pohland RC, Berthard NR. Postmortem serum and tissue redistribution of fluoxetine and nor fluoxetine in dogs following oral administration of fluoxetine hydrochloride Prozac. J Forensic Sci. 1997; 42:812-6. 57.Crandall CS, Kerrigan S, Agnero B, LaValley J, Zumwait R, Mckinney PE. The influence fo site of collection on postmortem morphine concentration in heroin overdose victims. J Forensic Sci. 2006; 51:413-20. 58.DeLetter EA, Clauwaert KM, Belpaire FM, Lambert WE, van Bocxlaer JF, Plette MHA. Post-mortem redistribution of 3,4 methylenedioxymetanphetamine (MDMA, ecstasy) in the rabbit. Part I: Experimental approach after in vivo intravenous infusion. Int J Legal Med. 2002; 116:216-24. 59.DeLetter EA, Belpaire FM, Clauwaert KM, Lambert WE, van Bocxlaer JF, Plette MHA. Post-mortem redistribution of 3,4 methylenedioxymetanphetamine (MDMA, ecstasy) in the rabbit. Part II: Post-mortem infusion in trachea or stomach. Int J Legal Med. 2002; 116:225-32. 60.Couchman L, Morgan PE, Spencer EP, Flanagan RJ. Plasma clozapine, norclozapine and the clozapine: Norclozapine ration in relation to prescribed dose and other factors: Data from therapeutic drug monitoring service, 1993-2007. Ther Drug Monit. 2010; 32:438-47. 61.Moffat AC, Osselton MD, Widdop B. Clarke's analysis of drugs and poisons. London: Pharmaceutical Press; 2011. 62.Spiehler V, Levine B. Pharmacokinetics and pharmacodynamics. En: Levine B., editors. Principles of forensic toxicology. Washington DC: AACC Press; 2003. 47-66. 63.Jones GR. Interpretation of postmortem drug levels. En: Karch S.B., editors. Postmortem toxicology of abused drugs. Boca Raton: CRC Press; 2008. 113-31. 64.Brunton LL, Lazo JS, Parker KL. Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. 11th ed. New York: McGraw-Hill; 2006. 65.Linnet K. Nonparametric estimation of reference intervals by simple and bootstrap-
based procedures. Clin Chem. 2000; 46:867-9. 66.Aronson JK, Ferner FE. Joining the DoTS: New approach to classifying adverse drug reactions. BMJ. 2003; 327:1222-5. 67.Dum J, Mayer G, Holt V, Henz A. In vivo opiate binding in tolerante/dependent mice. Eur J Pharmacol. 1979; 58:453-60. 68.Hamner JERP, Egimez Y, Emmett-Ohlesby MW. Neural mechanisms of tolerance to the effects of cocaine. Brain Res. 1997; 84:225-39. 69.Dyer JE, Roth B, Hyma BA. Gamma-hydroxybutyrate withdrawal syndrome. Ann Emerg Med. 2001; 37:147-53. 70.Jung BF, Reidenberg MM. Interpretation of opioid levels: comparison of levels during chronic pain therapy to levels from forensic autopsies. Clin Pharmacol Ther. 2005; 77:324-34. 71.Stanworth D, Hunt NCA, Flanagan RJ. Clozapine — a dangerous drug in a clozapine-naive subject. Forensic Sci Int. 2012; 214:23-5. 72.Jones AW, Holmgren P. Comparison of blood-ethanol concentrations in deaths attributed to acute alcohol poisoning and chronic alcoholism. J Forensic Sci. 2003; 48:874-9. 73.Koski A, Ojampera I, Vuori E. Interaction of alcohol and drugs in fatal p oisonings. Hum Exp Toxicol. 2003; 22:281-7. 74.Druid H, Holmgren P. A compilation of fatal and control concentrations of drugs in postmortem femoral blood. J Forensic Sci. 1997; 42:79-87. 75.Schulz M, Schmoldt A. Therapeutic and toxic blood concentrations of more than 500 drugs. Pharmazie. 1997; 52:895-911. 76.Repetto MR, Repetto M. Habitual, toxic, and lethal concentrations of 103 drugs of abuse in humans. J Toxicol Clin Toxicol. 1997; 35:1-9. 77.Holmgren P, Druid H. Compilations of therapeutic, toxic and fatal concentrations of drugs. J Toxicol Clin Toxicol. 1998; 36:133-4. 78.Regenthal R, Krueger M, Koeppel C, Preiss R. Drug levels: Therapeutic and toxic serum/plasma concentrations of common drugs. J Clin Monit Comput. 1999; 15:52944. 79.Repetto MR, Repetto M. Tabla de valores de referencia en fluidos biológicos [consultado 21 Abr 2014]. Disponible en: http://www.aloj.us.es/toxicologia/doc. 80.Winek CL, Wahba WW, Winek CL, Balzer TW. Drug and chemical blood-level data 2001. Forensic Sci Int. 2001; 122:107-23. 81.Schulz M, Schmoldt A. Therapeutic and toxic blood concentrations of more than 800 drugs and other xenobiotics. Pharmazie. 2003; 58:447-74. 82.Musshoff F, Padosch S, Steinborn S, Madea B. Fatal blood and tissue concentrations of more than 200 drugs. Forensic Sci Int. 2004; 142:161-210. 83.Moffat AC, Osselton MD, Widopp B. Clarke's analysis of drugs and poisons. 3rd ed. Londres: Pharmaceutical Press; 2004. 84.Molina DK. Handbook of forensic toxicology for medical examiners. Boca Ratón: Taylor Francis; 2010. 85.Reis M, Aamo T, Ahlner J, Druid H. Reference concentrations of antidepressants. A compilation of postmortem and therapeutic levels. J Anal Toxicol. 2007; 3:255-64.
86.Pilgrim JL, Gerostamoulos D, Drummer OH. Death involving serotoninergic drugs. Forensic Sci Int. 2010; 198:110-7. 87.Baselt RC. Disposition of toxic drugs and chemicals in man. 8th ed. Foster City: Biomedical Publications; 2008. 88.Jones AW, Holmgren A. Concentration distributions of the drugs most frequently identified in post-mortem femoral blood representing all causes of death. Med Sci Law. 2009; 49:257-73. 89.Jones AW, Holmgen A. Concentration ratios of free-morphine to free codeine in femoral blood in heroin-related poisoning deaths. Legal Med. 2011; 13:171-3. 90.Merves ML, Goldberger BA. Forensic toxicology. En: Miller NS, Ed. Principles of addictions and the law – applications in forensic, mental health, and medical practice. New York:Elsevier; 2010. p. 193-201. 91.Merves ML, Goldberger BA: Quality assurance, quality control, and method validation in chromatographic applications. En: Bertholfd R Winecker R, Eds. Chromatographic methods in clinical chemistry and toxicology. Chichester:John Wiley & Sons, Ltd.; 2007. p. 1-14. 92.Soria Sánchez ML. Criterios de calidad en la interpretacióin toxicológica postmortem. Rev Toxicol. 2011; 28:17-8. 93.Compañó R, Ríos A. Garantía de la calidad en los laboratorios analít icos. Madrid: Editorial Síntesis; 2002. 94.Wilson J, Toseland PA, Capps NE, Sandle LN, Smith BL, Sweeney G, et al. External quality assessment of laboratory performance in analysis of toxicological cases. Forensic Sci Int. 2001; 121:27-32. 95.Martínez González MA. Criterios cualitativos y cuantitativos en toxicología forense. Rev Toxicol. 2011; 28:15-6. 96.Martínez González MA. Criterios cualitativos en toxicología forense. Rev Esp Med Legal. 2012; 38:68-75. 97.Norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005. Requisitos generales relativos a la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración. 98.Palmer RB. Fentanyl in postmortem toxicology. Clin Toxicol. 2010; 48:771-84.
