TUGAS TPPP-REAKSI HIDROLISIS&OKSIDASI HIDROLISIS&OKSIDASI LEMAK, UJI INDOL STELLA DARMADI F24060717
HIDROLISIS DAN OKSIDASI LEMAK Ketengika Ketengikan n disebabkan disebabkan oleh adanya perubahan perubahan yang terjadi terjadi dari reaksi Off flavou flavour r dengan dengan oksigen oksigen di udara-seh udara-sehingga ingga disebut disebut ketengika ketengikan n oksidatif. oksidatif. Off dihas dihasilk ilkan an oleh oleh reak reaksi si hidroli hidrolisis sis yang yang dikat dikatali alis s oleh oleh enzimenzim-seh sehing ingga ga disebu disebutt ketengikan hidrolisis. Reaksi hidrolisis dan efek absorpsi dapat dikurangi dengan penyimpan penyimpanan an dingin, dingin, transpor transportasi tasi yang baik, pengemasan pengemasan yang hati-hati hati-hati dan ster sterili ilisa sasi si seme sement ntar ara a kete keteng ngik ikan an oksi oksida dati tiff tida tidak k dapa dapatt diku dikura rang ngii deng dengan an merendahkan merendahkan temperatur ruang penyimpanan. Pada reaksi reaksi hidrolisis hidrolisis akan dihasilkan dihasilkan gliserida gliserida dan asam lemak lemak bebas bebas dengan rantai pendek (C4 - C12). Akibat yang ditimbulkan dari reaksi ini adalah terjadinya perubahan bau dan rasa dari minyak atau lemak, yaitu timbulnya rasa tengik tengik (D (Djat jatmik miko o dan Pandji Pandjiwid widjaj jaja, a, 1984). 1984). Keteng Ketengika ikan n oksida oksidasi si yang yang umum umum dijumpai yaitu reaksi oksidasi pada ikatan rangkap dari asam lemak tidak jenuh. Asam lemak tidak jenuh mempunyai ikatan rangkap yang mempengaruhi reaksi ini menyebabkan lemak menjadi keras dan kental. Peroksida merupakan hasil antara yang biasanya dipakai sebagai ukuran tingkat ketengikan (Kaced, et al., 1984). Ketengikan oksidatif merupakan reaksi autocatalytic dimana laju reaksi meni mening ngka katt seja sejala lan n deng dengan an meni mening ngka katn tnya ya wakt waktu u peny penyim impa pana nan. n. Hal Hal ini ini disebabkan karena adanya hasil oksidasi awal yang dapat mempercepat reaksi oksidasi oksidasi selanjutn selanjutnya, ya, dan reaksi reaksi ini dikenal dikenal sebagai sebagai reaksi reaksi berantai berantai (Schultz, et.al., 1962). Ketengikan hirdrolisis disebabkan oleh hidrolisis trigliserida, adanya uap air dan dan pembeb pembebas asan an asam asam lemak lemak bebas bebas.. Dalam Dalam reak reaksi si hidroli hidrolisis sis,, lemak lemak dan dan minya minyak k akan akan diubah diubah menja menjadi di asam asam-as -asam am lemak lemak bebas bebas dan gliser gliserol. ol. Reaksi Reaksi hidrol hidrolisi isis s menga mengakib kibat atka kan n kerusa kerusakan kan lemak lemak dan minya minyak. k. Ini terjad terjadii karen karena a terdapat terdapat sejumlah air dalam lemak dan minyak tersebut.
Kerusakan lemak yang utama adalah timbulnya bau dan rasa tengik yang disebut proses ketengikan. Hal ini disebabkan oleh proses otooksidasi radikal asam lem lemak tida tidak k jenu jenuh h dala dalam m miny inyak. Otoo Otooks ksid ida asi dim dimula ulai deng denga an pembentuk pembentukan an faktor-fa faktor-faktor ktor yang dapat dapat memperc mempercepat epat reaksi reaksi seperti seperti cahaya, cahaya, panas, panas, peroksida peroksida lemak atau atau hidropero hidroperoksida ksida,, logam-loga logam-logam m berat, berat, dan enzimenzimenzim lipoksidase. Oksidasi dapat berlangsung bila terjadi kontak antara sejumlah oksigen dengan lemak atau minyak . terjadinya reaksi oksidasi ini akan mengakibatkan bau tengik pada lemak atau minyak. Reaksi oksidasi lemak akan berlangsung dalam dalam tiga tahap. Pada tahap permulaan permulaan terjadi reaksi reaksi pembentuk pembentukan an radikal radikal lemak bebas dan pemisahan hidrogen dari lemak yang tidak jenuh. Tahap kedua
TUGAS TPPP-REAKSI HIDROLISIS&OKSIDASI LEMAK, UJI INDOL STELLA DARMADI F24060717 adalah tahap perkembangan, di mana berlangsung reaksi antara radikal bebas yang terbentuk pada langkah permulaan dengan oksigen dan senyawa organik. Tahap terakhir merupakan tahap penghentian, di mana terjadi pembentukan senyawa yang tidak lagi merupakan radikal bebas. Tahap permulaan : RH + O2 -+ R' + 'OOH Tahap perkembangan : R' + O2 + ROO' ROO' + RH +ROOH + R' Tahap penghentian : ROO' + ROO' -+ ROOR + O2 ROO' + R' +ROOR R'+R'RR Pada persamaan di atas RH dapat berupa senyawa organik, antara lain seperti asam lemak tidak jenuh. H bersifat labil karena terletak pada atom karbon yang berdekatan dengan ikatan rangkap. Hasil lain dari oksidasi lemak ini adalah pembentukan aldehid, keton, alkohol, dan ester yang akan memberikan rasa dan bau yang tidak enak atau tengik. Ketengikan dari lemak ini dapat menimbulkan masalah pada proses industri makanan, karena akan mengakibatkan berkurangnya nilai gizi dari makanan tersebut, misalnya akan merusak vitamin A yang terdapat dalam makanan sehingga berakibat negatif pada kesehatan, di samping rasa yang menjadi tidak enak. Untuk mencegah terjadinya ketengikan tersebut, ditambahkan antioksidan yang akan melindungi lemak dari oksidasi. Pada dasarnya antioksidan berfungsi sebagai pemangsa radikal atau yang bisa bereaksi dengan radikal, seperti senyawaan fenolik, BHA, dan BHT. Derivat fenolik sebagai antioksidan dapat memberikan satu atom hidrogen kepada radikal bebas lemak R' , RO' atau ROO' menjadi molekul yang lebih stabil RH, ROH, atau ROOH, sehingga dengan demikian penghentian reaksi rantai oksidasi lemak dapat terjadi. Pada tahun 1904, Franz Knoop menerangkan bahwa asam lemak itu dipecah melalui oksidasi pada karbon –β. Kemudian pada tahun 1949 Eugene Kennedy dan Lehninger menerangkan bahwa terjadinya oksidasi asam lemak di mitokondria, di mana asam lemak sebelum memasuki mitokondria mengalami aktivasi. adenosin trifosfat (ATP) memacu pembentukan ikatan tioester antara gugus karboksil asam lemak dengan gugus sulfhidril pada KoA. Reaksi pengaktifan ini berlangsung di luar mitokondria dan dikatalisis oleh enzim asil KoA sintetase tiokinase asam lemak). Paul Berg membuktikan bahwa aktivasi asam lemak terjadi dalam dua tahap. Pertama, asam lemak bereaksi dengan ATP membentuk asil adenilat. Dalam bentuk anhidra campuran ini, gugus karboksilat asam lemak diikatkan dengan gugus fosforil AMP. Dua gugus fosforil lainnya dari ATP dibebaskan sebagai pirofosfat. Gugus sulfhidril dari KoA kemudian bereaksi dengan asila adenilat yang berikatan kuat dengan enzim membentuk asil KoA dan AMP. R–C + ATP
TUGAS TPPP-REAKSI HIDROLISIS&OKSIDASI LEMAK, UJI INDOL STELLA DARMADI F24060717 R – C – AMP + PPi Asam lemak Asil adenilat R – C – AMP + H- S – KoA R – C – S – KoA + AMP Asil KoA Pengangkutan asam lemak rantai panjang ke dalam matriks mitokondria. Asam lemak diaktifkan di luar membran mitokondria, proses oksidasi terjadi di dalam matriks mitokondria. Molekul asil KoA rantai panjang tidak dapat melintasi membran mitokondria, sehingga diperlukan suatu mekanisme transport khusus. Asam lemak rantai panjang aktif melintasi membran dalam mitokondria dengan cara mengkonjugasinya dengan karnitin, suatu senyawa yang terbentuk dari lisin. Gugus asil dipindahkan dari atom sulfur pada KoA ke gugus hidroksil pada karnitin dan membentuk asil karnitin. Reaksi ini dikatalisis oleh karnitin transferase I, yang terikat pada membran di luar mitokondria. R – C – S – KoA + H3C – N – CH2 – C – CH2 – C HS – KoA + H3C – N – CH2 Asil KoA Karnitin Asil Karnitin –C – CH2 – C. Selanjutnya, asil karnitin melintasi membran dalam mitokondria oleh suatu translokase. Gugus asil dipindahkan lagi ke KoA pada sisi matriks dari membran yang dikatalisis oleh karnitin asil transferase II. Akhirnya karnitin dikembalikan ke sisi sitosol oleh translokase menggantikan masuknya asil karnitin yang masuk. Molekul asil KoA dari sedang dan rantai pendek dapat menembus mitokondria tanpa adanya karnitin. Kelainan pada transferase atau translokase atau defisiensi karnitin dapat menyebabkan gangguan oksidasi asam lemak rantai panjang, Kelainan tersebut diatas ditemukan pada kembar identik yang menderita kejang otot disertai rasa nyeri yang dialami sejak masa kanak-kanak.. Rasa nyeri diperberat oleh puasa, latihan fisik, atau diet tinggi lemak; oksidasi asam lemak adalah proses penghasil energi utama pada ketiga keadaan tersebut. Enzim glikolisis dan glikogenolisis dalam keadaan normal.
TUGAS TPPP-REAKSI HIDROLISIS&OKSIDASI LEMAK, UJI INDOL STELLA DARMADI F24060717
Asetil KoA, NADH dan FADH2 terbentuk pada setiap satu kali oksidasi Asil KoA jenuh dipecah melalui urutan empat reaksi yang berulang yaitu: oksidasi oleh flavin adenin dinukleotida ( FAD ), hidrasi oleh NAD dan tiolisis oleh KoA. Rantai asil diperpendek dengan dua atom karbon sebagai hasil dari keepat reaksi tadi dan terjadi pembentukan FADH2, NADH dan asetil KoA. Reaksi pertama pada tiap daur pemecahan adalah oksidasi asil KoA oleh asil KoA dehidrogenase yang menghasilkan satu enoil KoA denganikatan rangkap trans antara C – 2 dan C – 3. Asil KoA + E – FAD
→
trans - ∆² - Enoil KoA + E – FADH2
Langkah selanjutnya adalah hidrasi ikatan ganda antara C- 2 dan C – 3 oleh enoil KoA hidratase.
Trans ∆² - Enoil KoA + H2O L- 3 – hydroksiasil KoA. Hidrasi enoil KoA membuka jalan bagi reaksi oksidasi kedua, yang mengubah gugus hidroksil pada C – 3 menjadi gugus keto dan menghasilkan NADH. Oksidasi ini dikatalisis oleh L – 3 – hidroksiasil KoA dehidrogenase. L – 3 – hidroksiasil KoA + NAD 3 – ketoasil KoA + NADH + H+ ↔
↔
Langkah akhir adalah pemecahan 3 – ketoasil KoA oleh gugus tiol dari molrkul KoA lain, yang akan menghasilkan asetil KoA dan suatu asil KoA rantai karbonnya dua atom karbon lebih pendek. Reaksi ini dikatalisis oleh β – ketotiolase. 3- ketoasil KoA + HS – KoA (karbon- karbon n ) ( karbon- karbon n-2 ).
↔
asetil KoA + asil KoA.
Asil KoA yang memendek selanjutnya mengalami daur oksidasi berikutnya, yang diawali dengan reaksi yang dikatalisis oleh asil KoA dehidrogenase. Rantai asam lemak yang mengandung 12 sampai 18 karbon dioksidasi oleh asil KoA dehidrogenase rantai panjang. Asil KoA dehidrogenase untuk rantai sedang mengoksidasi ranta asam lemak yang memiliki 14 sampai 4 karbon, sedangkan asil KoA dehidrogenase untuk rantai pendek hanya bekerja pada rantai 4 dan 6 karbon. Sebaliknya, β – ketotiolase, hidroksiasil dehidrogenase, dan enoil KoA hidratase memiliki spesifitas yang luas berkenaan dengan panjangnya gugus
TUGAS TPPP-REAKSI HIDROLISIS&OKSIDASI LEMAK, UJI INDOL STELLA DARMADI F24060717 asil. Oksidasi sempurna asam palmitat Kita dapat menghitung energi yang dihasilkan dari oksidasi suatu asam lemak. Pada tiap daur reaksi, asil KoA diperpendek dua karbon dan satu FADH2, NADH dan asetil KoA terbentuk. Cn – asil KoA + FAD + NAD + H2O + KoA + asetil KoA + H
→
Cn-2 – asil KoA + FADH2 + NADH
Pemecahan palmitoil KoA ( C16 – asil KoA ) memerlukan tujuh daur reaksi. Pada daur ketujuh, C4 – ketoasil KoA mengalami tiolisis menjadi dua molekul asetil KoA. Dengan demikian stoikiometri oksidasi palmitoil KoA menjadi. Palmitoil KoA + 7 FAD + 7 NAD +7 KoA + & H2O NADH + 7 H
→
8 asetil KoA + 7 FADH2 + 7
Dua setengah ATP akan terbentuk per NADH yang dioksidasi pada rantai pernafasan, sedangkan 1,5 ATP akan terbentuk untuk tiap FADH2. Jika diingat bahwa oksidasi asetil KoA oleh daur asam sitrat menghasilkan 10 ATP, maka jumlah ATP yang terbentuk pad oksidasi palmitoil KoA adalah 10,5 dari 7 FADH2, 17,5 dari 7 NADH dan 80 dari 8 molekul asetil KoA, sehingga jumlah keseluruhannya adalah 108. Dua ikatan fosfat energi tinggi dipakai untuk mengaktifkan palmitat, saat ATP terpecah menjadi AMP dan 2 Pi. Jadi oksidasi sempurna satu molekul asam palmitat menghasilkan 106 ATP. Oksidasi asam lemak tak jenuh Oksidasi asam lemak tak jenuh reaksinya sama seperti reaksi oksidasi asam lemak jenuh. Hanya diperlukan tambahan dua enzim lagi yaitu isomerase dan reduktase untuk memecah asam-asam lemak tak jenuh. Oksidasi asam palmitoleat atau asam lemak C16 yang memiliki ikatan rangkap antara C- 9 dan C –10 ini diaktifkan dan diangkut melintasi membran dalam mitokondria dengan cara yang sama dengan asam lemak jenuh. Selanjutnya palmitoleil KoA mengalami tiga kali pemecahan dengan enzim-enzim yang sama seperti oksidasi asam lemak jenuh. Enoil KoA – sis - ∆³ yang terbentuk pada ketiga kali jalur oksidasi bukanlah substrat bagi asil KoA dehidrogenase. Adanya ikatan rangkap antara C-3 dan C-4 menghalangi pembentukan ikatan rangkap lainnya antar C – 2 dan C – 3. Kendala ini dapat diatasi oleh suatu reaksi yang mengubah posisi dan konfigurasi dari ikatan rangkap sis - ∆³. Suatu isomerase mengubah ikatan rangkap ini menjadi ikatan rangkap trans - ∆². Reaksi- reaksi berikutnya mengikuti reaksi oksidasi asam lemak jenuh saat enoil KoA – trans - ∆² merupakan substrat yang reguler.
TUGAS TPPP-REAKSI HIDROLISIS&OKSIDASI LEMAK, UJI INDOL STELLA DARMADI F24060717 Satu enzim tambahan lagi diperlukan untuk oksidasi asam lemak tak jenuh jamak .Misalnya asam lemak tak jenuh jamak C18 yaitu linoleat , dengan ikatan rangkap sis - ∆9 dan sis ∆12. Ikatan rangkap sis - ∆³ yang terbentuk setelah tiga daur oksidasi – β, diubah menjadi ikatan rangkap trans - ∆² oleh isomerase tersebut di atas, seperti pada oksidasi palmitoleat . Ikatan rangkap sis - ∆¹² linoleat menghadapi masalah baru. Asil KoA yang dihasilkan oleh empat daur oksidasi β mengandung ikatan rangkap rangkap sis - ∆4. dehidrogenase pada spesies ini oleh asil Koa dehidrogenase menghasilkan zat antara 2,4 – dienoil yang bukan substrat bagi enzim berikutnya pada jalur oksidasi β. Kendala ini dapat diatasi oleh 2,4 - dienoil – KoA reduktase, suatu enzim yang menggunakan NADH untuk mereduksi zat antara 2,4 – dienoil menjadi enoil KoA – sis - ∆³. Isomerase tersebut di atas kemudian mengubah enoil KoA – sis -∆³ menjadi bentuk trans, suatu zat antara yang lazim pada oksidasi – β.Jadi ikatan rangkap yang letaknya pada atom C nomer ganjil ditangani oleh isomerase dan ikatan rangkap yang terletak pada atom C nomor genap ditangani oleh reduktase dan isomerase. Oksidasi asam lemak dengan nomor atom karbon ganjil Asam lemak yang memiliki jumlah karbon ganjil merupakan spesies jarang. Asam lemak ini dioksidasi dengan cara yang samaseperti oksidasi asam lemak dengan jumlah atom karbon genap, kecuali pada daur akhir degradasi akan terbentuk propionil KoA dan asetil KoA, bukan dua molekul asetil KoA. Unit – tiga karbon aktif pada propionil KoA memasuki daur asam sitrat setelah diubah menjadi suksinil KoA.
UJI INDOL Tingkat kesegaran udang selain dengan uji organoleptik dapat dilengkapi dengan pengukuran kadar indol secara kimiawi. Kenaikan kadar indol pada penyimpanan dingin udang segar dapat disebabkan oleh aktivitas bakteri E. coli dan Proteus margoni, yaitu akibat proses dekarboksilasi asam amino triptofan oleh jasad renik. Penyimpanan udang dalam ruangan dingin (cool box) pada 4 oC selama 12 hari memberikan kadar indol mendekati 25µg/100g (ambang batas mutu udang kelas satu menurut US-FDA). Pada penyimpanan udang beku -20 oC tidak terjadi kenaikan kadar indol. Jenis mikroba lain yang dapat berkembang selama penyimpanan udang yaitu Salmonella, Vibrio, dan Listeria, yang merupakan parameter mutu udang yang sangat penting (Edy Primar dan Sunarya, 1989).
TUGAS TPPP-REAKSI HIDROLISIS&OKSIDASI LEMAK, UJI INDOL STELLA DARMADI F24060717 Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Bakteri menguraikan triptofan membentuk asam piruvat yang kemudian dapat digunakan sebagai sumber energinya. Bakteri tertentu seperti Escherichia coli mampu menggunakan triptofan sebagai sumber karbon. O CH2 CH C NH2
O
triptofanase
OH
+
H2O
N
N
H
H
H3C
C
NH3
O
amoniak
HO asam piruvat
indol
triptofan
+
C
H3C C N H indol
+
+
N(CH3)2
p-dimetil amino benzaldehida (reagen kovac)
N
N
H
H
H2O
N(CH3)2
rosindol (berwarna merah)
Gambar 9. Hidrolisis triptofan dan uji indol (Lay, 1994). Pembentukan indol dari triptofan oleh mikroorganisme dapat diketahui dengan menumbuhkannya dalam media biakan yang kaya dengan triptofan (Lay, 1994). Untuk uji ini biasanya dipakai kaldu tripton (1%) karena medium ini mengandung banyak triptofan. Triptofan biasanya diberikan dalam bentuk tripton yang merupakan suatu polipeptida yang kaya dengan residu triptofan (Lay,1992). Medium untuk uji pembentukan indol dapat digunakan medium tripton cair atau hidrolisat kasein. Penumpukan indol dalam media biakan dapat diketahui dengan penambahan berbagai reagen yaitu reagen Gnezda, reagen Kovacs, reagen Ehrlich, reagen Salkowski, dan reagen Coles dan Onslow. Masingmasing reagen menunjukan hasil yang berbeda jika terbentuk indol. Untuk media biakan semi padat, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada permukaan medium, sedangkan untuk medium tripton cair juga menghasilkan hasil uji positif terbentuknya indol yang berbeda-beda, yakni tergantung pada jenis reagen yang digunakan. Pada pengujian dengan reagen Gnezda, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya kristal asam oksalat yang berwarna merah
TUGAS TPPP-REAKSI HIDROLISIS&OKSIDASI LEMAK, UJI INDOL STELLA DARMADI F24060717 muda. Pada pengujian dengan reagen Kovacs, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna merah pada lapisan larutan reagen. Pada pengujian dengan reagen Erhlich, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna merah ungu dibawah lapisan eter. Pada pengujian dengan reagen Salkowski, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna merah pada media, sedangkan Pada pengujian dengan reagen Coles dan Onslow, terbentuknya indol ditandai dengan terbentuknya warna merah ungu pada kapas penutup tabung reaksi (Waluyo, 2008). Triptofan merupakan suatu asam amino dengan gugus indol. Bakteri tertentu mampu menghasilkan enzim triptofanase yang mengkatalisis penguraian gugus indol dari triptofan. Dalam media biakan, indol menumpuk sebagai bahan buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul triptofan seperti asam piruvat dapat digunakan sebagai sumber energi melalui siklus asam sitrat, sedangkan amonium (NH4+) dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme.
