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QUIMICA
ENOLOGICA
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QUIMICA ENOLOGICA
Ediciones Mundi-Prensa Madrid · Barcelona · México -7-
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La edición original de esta obra ha sido publicada en italiano con el título CHIMICA ENOLOGICA por edizioni AEB, Brescia, Italia. © 1995, Edizioni AEB © 1995, Ediciones Mundi-Prensa Depósito Legal: M. 2.795-1998 ISBN: 84-7114-701-7
No se permite la reproducción total o parcial de este libro ni el almacenamiento en un sistema informático, ni la transmisión de cualquier forma o cualquier medio, electrónico, mecánico, fotocopia, registro u otros medios sin el permiso previo y por escrito de los titulares del Copyright. IMPRESO EN ESPAÑA - PRINTED IN SPAIN Imprime: Artes Gráficas Cuesta, S.A. Avda. Pedro Diez, 33. 28019 Madrid
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A Stefano y Marco
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Prólogo a la cuarta edición Se mantiene el esquema general del libro, así como la idea de hacerlo accesible completamente sin tener que recurrir a otras fuentes. Sin embargo, se ha procedido a una notable ampliación, profundizando en temas ya tratados y añadiendo capítulos nuevos, que son, en general, resultado de experiencias personales: la investigación no resulta vana, afortunadamente, con el tiempo y los resultados adquiridos más recientemente se han introducido en el libro. Se ha realizado un esfuerzo para no dejar ninguna duda, para evitar hipótesis fantasiosas y para atenerse rigurosamente a los resultados de la experiencia. El libro está orientado a un lector paciente y no presuroso: una lectura atenta permitirá obtener una respuesta clara a los problemas tratados. El autor.
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Indice Capítulo I.-Conceptos de química general …………………………………………………………… 19 Substancias y cuerpos simples ………………………………………………………………… 19 Peso molecular y atómico ……………………………………………………………………... 19 Propiedades químicas de los elementos ………………………………………………………. 20 Estructura del átomo …………………………………………………………………………... 20 Electrovalencia y covalencia …………………………………………………………………... 22 Fórmula de la estructura ............................................................................................................. 23. Número atómico e isótopos …………………………………………………………………… 23 Oxidos, anhídridos, bases y ácidos ……………………………………………………………. 23 Ley de acción de masas y producto iónico del agua ………………………………………….. 24 Valor pH ……………………………………………………………………………………….. 25 Acidos fuertes y débiles ………………………………………………………………………... 25 Efecto tampón ………………………………………………………………………………….. 27 Capítulo II.-Los ácidos de la uva ……………………………………………………………………… 29 Acido tartárico …………………………………………………………………………………. 29 Acido málico …………………………………………………………………………………… 29 Acido cítrico …………………………………………………………………………………… 30 Acidez titulable y alcalinidad de las cenizas ………………………………………………….. 30 Capítulo III.-Conceptos de química orgánica ………………………………………………………….. 33 Equivalencia de las valencias del carbono ……………………………………………………… 33 Hipótesis de LE BEL y VAN'T HOFF …………………………………………………………. 34 Luz polarizada ………………………………………………………………………………….. 35 Azúcares ………………………………………………………………………………………… 36 Configuraciones espaciales …………………………………………………………………….. 36 Tetrosas ………………………………………………………………………………………… 36 Pentosas ………………………………………………………………………………………… 37 Hexosas …………………………………………………………………………………………. 38 Poder rotatorio …………………………………………………………………………………. 39 Oxidaciones y reducciones …………………………………………………………………….. 40 Poder reductor de los azúcares …………………………………………………………………. 41 Producto de solubilidad ………………………………………………………………………… 42 Formación de complejos ……………………………………………………………………….. 43 Acción y constante de pantalla ………………………………………………………………… 43 Energía de formación ………………………………………………………………………….. 44 Adiciones al grupo carbonílico ………………………………………………………………… 45 Estructura ciclosemiacetálica …………………………………………………………………… 46 Disacáridos; polisacáridos ……………………………………………………………………… 47 Inversión ………………………………………………………………………………………. 47 Acidos urónicos ………………………………………………………………………………… 48 Anillo bencénico y carácter aromático ………………………………………………………… 48 Fenoles, polifenoles, quinonas …………………………………………………………………. 49 Sales de pirilo y de flavilo ……………………………………………………………………… 50 Capítulo IV.-La materia colorante roja de la uva ………………………………………………………. 53 Antocianinas y antocianidinas …………………………………………………………………. 53 Monoglucósidos y diglucósidos ………………………………………………………………… 53 Antocianinas aciladas …………………………………………………………………………… 54 Equilibrios de los antocianos en solución ………………………………………………………. 54
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Capítulo V-Los taninos ……………………………………………………………………………….. 57 Estructura y propiedades de los taninos ……………………………………………………….. 57 Flavonoles o catequinas ………………………………………………………………………. 57 La procianidina ……………………………………………………........................................... 57 Reacciones con la vainilina ……………………………………………………………………. 59 Flavones ……………………………………………………………………………………….. 60 Polifenoles totales …………………………………………………………………………….. 60 Capítulo VI-Conceptos de espectrometría …………………………………………………………… 61 Espectro electromagnético y longitud de onda ………………………………………………. 61 Ley de LAMBERT- BEER …………………………………………………………………… 61 Espectros de absorción ……………………………………………………………………….. 62 Capítulo VII-Composición comparativa de las diferentes partes del racimo …………………………. 63 Capítulo VIII.-Substancias nitrogenadas ……………………………………………………………… 65 Nitrógeno amoniacal y orgánico ………………………………………………………………. 65 Aminoácidos …………………………………………………………………………………… 65 Anfoiones ……………………………………………………………………………………… 67 pH isoeléctrico ………………………………………………………………………….………67 Enlace peptídico ……………………………………………………………………………….. 67 Nitrógeno total. ………………………………………………………………………………… 68 Composición nitrogenada de la baya …………………………………………………………… 68 Capítulo IX.-Substancias minerales ……………………………………………………………………. 71 Capítulo X.-Composición de las pepitas ……………………………………………………………….. 73 Constitucción de las grasas …………………………………………………………………...... 73 Capítulo XI -La pruína y las substancias olorosas………………………………………………………. 75 La pruina ………………………………………………………………………………………… 75 Las substancias olorosas ……………………………………………………………………….. 75 Alcoholes terpénicos y terpenoides de la uva y del vino ………………………………………. 75 Reacciones de los alcoholes terpénicos a pH = 3. ……………………………………………… 77 Reacciones de los terpenoides di y trihidroxilados a pH = 3 …………………………………… 77 Compuestos volátiles no terpénicos ……………………………………………………………. 79 Capítulo XII-Vitaminas y enzimas ……………………………………………………………………… 83 Vitaminas de la uva ……………………………………………………………………………….83 Enzimas …………………………….……………………………………………………………. 84 Especificidad de las enzimas ……………………………………………………………………. 84 Influencia de la temperatura y del pH …………………………………………………………… 85 Constitución de las enzimas ……………………………………………………………………… 85 Endoenzimas y exoenzimas …………………………………………………………………….. 85 Enzimas de la uva ……………………………………………………………………………….. 85 Reacciones monomoleculares ……………………………………………………………………. 87 Pectinmetilesterasas ……………………………………………………………………………… 87 Poligalacturonasas ………………………………………………………………………………. 89 Capítulo XIII.-Química de las fermentaciones …………………………………………………………. 93 Coenzimas ……………………………………………………………………………………… 93 La glicolisis ……………………………………………………………………………………... 95 Fermentación alcohólica ………………………………………………………………………… 97
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Acido láctico producido por las levaduras ……………………………………………………… 98 Fermentación gliceropirúvica …………………………………………………………………… 98 Productos secundarios formados a partir del ácido pivúrico ……………………………………. 99 Balance de productos secundarios de la fermentación gliceropirúvica ………………………… 101 Fermentación en presencia de ácido acético …………………………………………………… 102 Degradación del ácido málico ………………………………………………………………….. 103 Metabolismo de los constituyentes nitrogenados por obra de las levaduras …………………… 104 Formación de los alcoholes superiores…………………………………………………………. 106 Reducción de los sulfatos y síntesis de aminoácidos azufrados ………………………………. 108 Combinación del anhídrido sulfuroso con compuestos conteniendo grupos aldehidos o acetonas ……………………………………………………………. 110 Degradación de los azúcares por obra de las bacterias lácticas ……………………………….. 110 La vía de las pentosas …………………………………………………………………………. 111 Fermentación maloláctica ……………………………………………………………………… 114 Descomposición bacteriana del ácido cítrico ………………………………………………….. 115 Degradación bacteriana de la glicerina ……………………………………………………….. 116 Degradación bacteriana del ácido tartárico …………………………………………………… 117 Fermentación acética del alcohol ……………………………………………………………… 118 Oxidación de los azúcares por bacterias acéticas ……………………………………………… 119 Capítulo XIV-Comparación entre la composición del mosto y del vino ………………………………. 121 Glicerina y butanodiol ………………………………………………………………………… 121 Acido acético y acetato de etilo ……………………………………………………………….. 123 Evolución de las substancias nitgrogenadas …………………………………………………… 125 Los alcoholes superiores ………………………………………………………………………. 126 Variación del contenido coloidal ……………………………………………………………….. 127 Evolución de los aminoácidos y de los oligopéptidos del mosto al vino ………………………. 130 Vinificación en blanco …………………………………………………………………………. 130 Vinificación con maderación …………………………………………………………………… 135 Evolución de los aminoácidos y de los oligopéptidos en función de la multiplicación celular y de la mortalidad de las levaduras ………………………………… 138 Antes y después de la segunda fermentación (vinos espumosos)………………………………. 139 Antes y después de la fermentación maloláctica ………………………………………………. 140 La producción de substancias volátiles por las levaduras ……………………………………… 140 La variablidad dentro de una misma cepa ……………………………………………………… 141 Comparación organoléptica entre las muestras ………………………………………………… 147 Las levaduras de especie distinta ……………………………………………………………….. 148 Influencia de la temperatura ……………………………………………………………………. 151 Conclusiones ……………………………………………………………………………………. 157 Capítulo XV-Equilibrios de salificación de los vinos …………………………………………………. 159 Concentración y actividad de los iones ……………………………………………………….. 159 Constante de disociación mixta y termodinámica ……………………………………………… 160 Teoría de DEBYE e HÜCKEL ……………………………………………………………….. 160 Estado de combinación de los ácidos orgánicos ………………………………………………. 161 Soluciones equimoleculares de ácido tartárico, málico y láctico ……………………………… 166 Balance de salificación de un vino …………………………………………………………….. 166 pH y estado de combinación de un ácido ………………………………………………………. 169 Significado químico-físico y organoléptico de la fermentación maloláctica y de la fermentación maloalcohólica ……………………………………………………….. 169 Fermentación maloláctica ……………………………………………………………………..... 170 Fermentación maloalcohólica …………………………………………………………………... 173 Acidos diácidos representados como monoácidos ……………………………………………… 175 El poder tampón ante las bases ………………………………………………………………… 177
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El poder tampón ante los ácidos ………………………………………………………………… 179 Influencia del estado de combinación de los ácidos sobre el extracto densimétrico ……………. 179
Capítulo XVI.-Desacidificación y acidificación de los vinos …………………………………………… 181 Modificación del pH en los vinos………………………………………………………………… 181 Desacidificación de los vinos …………………………………………………………………… 182 Previsión de la cantidad de desacidificante necesaria para obtener un valor determinado del pH después de la estabilización ………………………………………………………….. 187 Acidificación de los vinos ………………………………………………………………………. 188 Significado e importancia de los parámetros relacionados con la acidez de los Vinos …………. 191 Utilización de resina catiónicas …………………………………………………………………. 192 La sensación ácida ……………………………………………………………………………….. 192 Capítulo XVII.-Precipitaciones de sales en los vinos ……………………………………………………. 193 Las precipitaciones tartáricas …………………………………………………………………….. 193 La difícil indivualización de las substancias que impiden la precipilación del cremor. …………. 197 Cálculo de la cantidad de bitartrato potásico con exceso en un vino a una temperatura determinada …………………………………………………………………………….. 198 Caracterización del estado de sobresaturación …………………………………………………… 199 Precipitaciones de tartrato de calcio ………………………………………………………………. 202 Precipitaciones de sal de calcio del ácido múcico ……………………………………………….. 205 Capítulo XVIII.-El estado coloidal ………………………………………………………………………. 207 Dimensiones y características dé las partículas coloidales ………………………………………. 207 Macromoléculas, coloide s liófilos y liófobos ……………………………………………………. 207 La.floculación ……………………………………………………………………………………. 208 Propiedad de las soluciones coloidales …………………………………………………………… 209 Fenómenos de absorción ………………………………………………………………………….. 211 Precipitaciones debidas a metales ………………………………………………………………… 212 Precipitaciones debidas al hierro…………………………………………………………………… 213 Comportamiento del hierro en vinos aireados ……………………………………………………... 214 Precipitaciones debidas al cobre …………………………………………………………………… 215 Enturbiamientos debidos a la presencia de proteínas ……………………………………………… 216 Precipitaciones de materia colorante en vinos tintos ………………………………………………. 217 Precipitaciones de naturaleza oxidásica ……………………………………………………………. 217 Capítulo XIX.-Los coloides del mosto y del vino: origen, estructura, dimensiones moleculares, asociaciones coloidales …………………………………………………………………………………………………. 219 Los coloide s de naturaleza glucídica del mosto ………………………………………………… 219 Estructura de las pectinas ……………………………………………………………………….. 219 Otros coloide s de naturaleza glucídica ………………………………………………………….. 221 Dimensiones moleculars de los coloides glucídicos ……………………………………………… 223 Coloide s producidos por las levaduras …………………………………………………………… 224 Coloides glucídicos del vino ……………………………………………………………………… 225 Coloide s de naturaleza proteica …………………………………………………………………… 226 Proteínas cedidas por las levaduras ………………………………………………………………… 228 Capítulo XX.-Los sistemas óxido-reductores………………………………………………………………. 231 El potencial de óxido-reducción ……………………………………………………………………231 Afinidad de una reacción ………………………………………………………………………….. 231 El electrodo de hidrógeno ………………………………………………………………………….. 232 El potencial normal ………………………………………………………………………………… 232 Valor rH …………………………………………………………………………………………… 233
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Clasificación de los sistemas de óxido-reducción …………………………………………………. 234 Los sistemas óxido-reductores de los vinos ………………………………………………………. 235 Disolución del oxígeno en el vino ………………………………………………………………… 236 Electrodo de CLARK ……………………………………………………………………………… 237 Evolución del oxígeno disuelto ……………………………………………………………………. 237 Papel del oxígeno en el vino …………………………………………………………………….. 239 Capítulo XXI.-EI anhídrido sulfuroso en enología …………………………………………………….. 241 Influencia de la fuerza iónica ………………………………………………………………….. 242 Influencia de la graduación alcohólica ………………………………………………………… 242 Influencia de la temperatura …………………………………………………………………… 243 Acciones del anhídrido sulfuroso ………………………………………………………………. 243 Formación de SO2 ………………………………………………………………………………. 244 Formación de los compuestos que combinan con el SO2 ……………………………………… 244 Reacciones de combinaciones del SO2 …………………………………………………………. 245 Comportamiento del SO2 en vinos tintos ……………………………………………………… 247 Acción antimicrobiana del SO2 ……………………………………………………………….. 247 Tratamiento de los mostos con SO2 …………………………………………………………… 248 Adición del SO2 en el momento de embotellado de los vinos blancos …………………………. 248 Efecto del SO2 sobre la calidad de los vinos blancos …………………………………………... 249 Efecto del SO2 sobre la calidad de los vinos tintos …………………………………………….. 249 Capítulo XXII.-Envejecimiento de los vinos …………………………………………………………… 251 Envejecimiento de tipo oxidante y de tipo reductor …………………………………………… 251 Reacciones de esterificación ……………………………………………………………………. 251 Fórmula de BERTHELOT ……………………………………………………………………… 252 Ley de acción de masa ………………………………………………………………………….. 253 Influencia de la edad sobre el contenido de ésteres del vino …………………………………… 254 Significado organoléptico del acetato de etilo ………………………………………………….. 255 Evolución de los polifenoles ……………………………………………………………………. 256 Influencia de las cesiones de la madera sobre la calidad y características del vino ……………. 258 Uno de los aspectos de la diversidad: las condiciones de envejecimiento de los vinos ……….. 260 El envejecimiento de los vinos tintos …………………………………………………………. 261 Influencia del modo de envejecimiento …………………………………………………….. 261 Evolución de la composición química de los vinos …………………………………………….. 262 Abril de 1980. Después de un año de envejecimiento ………………………………………….. 265 Abril de 1981. Después de dos años de envejecimiento ………………………………………… 265 Abril 1982 ……………………………………………………………………………………….. 266 Envejecimiento de los vinos blancos ……………………………………………………………. 267 Capítulo XXIII.-Métodos objetivos de valoración de los caracteres organolépticos ……………………. 269 Del umbral de percepción individual al concepto de «grupo» ……………………………….. 269 Las valoraciones sensoriales …………………………………………………………………… 270 Valoraciones sensoriales con fines tecnológicos ………………………………………………. 270 Duo-trío test. …………………………………………………………………………………… 270 Test triangular …………………………………………………………………………………... 271 Un ejemplo concreto ……………………………………………………………………………. 271 Valoraciones sensoriales con fines edonísticos …………………………………………………. 273 Las escalas estructuradas ............................................................................................................. 273 Las escalas no estructuradas……………………………………………………………………. 274 Un ejemplo concreto de aplicación de una escala no estructurada ……………………………... 275 Control del tipo de distribución de los valores obtenidos ………………………………………. 276 Aplicaciones del análisis de varianza ………………………………………………………….. 276 El empleo de procedimientos no paramétricos …………………………………………………. 278
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La reproducibilidad en el tiempo ………………………………………………………………. 280 Correlaciones entre composición química y caracteres organolépticos ………………………. 281 Conclusiones …………………………………………………………………………………… 281
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CAPITULO PRIMERO
Conceptos de química general Substancias y cuerpos simples Recordamos algunos breves conceptos de química general, ciertamente banales, pero necesarios para precisar el significado de otros conceptos de los que haremos uso enseguida. Denominamos «materia» al sus trato de los fenómenos observables. En la materia se pueden aislar cuerpos materiales que, fraccionados mecánicamente, resultan constituidos por partes que presentan idénticas propiedades físicas y que con medios físicos normales no son susceptibles de dar porciones materiales con distinta propiedad: dichos cuerpos son representativos de una «substancia» química. Podemos imaginar el subdividir una porción de substancia hasta el infinito: llegamos a alcanzar la más pequeña partícula que posea aún todas las características de la substancia: esta partícula es la «molécula». La molécula es, por tanto, un edificio complejo compuesto, a su vez, por un número definido de partículas, el cual todavía representa la más pequeña porción de materia que posee todas las propiedades de la substancia a que se refiere. Si las más pequeñas partículas que constituyen una molécula (átomos) son iguales entre ellas, estamos en presencia de un «cuerpo simple»; si son diferentes estamos en presencia de un «cuerpo compuesto» o de un «compuesto». Los átomos constituyentes de los cuerpos simples (elementos) llevan, combinándose entre ellos, a la formación de los infinitos compuestos que constituyen la «materia». Las moléculas representan completamente las substancias químicas a que corresponden y cuando pasamos a examinar los fenómenos que ocurren cuando ponemos en contacto cantidades ponderables de dos substancias diversas, esos no serán otros que múltiplos de aquellos relativos al contacto entre dos únicas moléculas, una para cada substancia. Peso molecular y atómico Hemos hablado de substancias, de compuestos, de cuerpos simples, de elementos y de moléculas; vamos a hablar ahora de peso atómico y peso molecular. Hemos dicho que las moléculas de los cuerpos simples están constituidas por partículas todas iguales, que representan los átomos de los elementos. El problema fundamental para los cuerpos simples es el conocer el número de átomos de que están constituidas sus moléculas. Suponemos resuelto este problema de la manera descrita por la química general y por la química física y conocer las moléculas de los cuerpos simples: por ejemplo, para el hidrógeno, el nitrógeno y el oxígeno sabemos que las moléculas son diatómicas y podemos pues expresadas como H2, N2, O2 ¿Cómo es posible encontrar un modo para hacer reaccionar átomos y moléculas entre ellos y poder estudiar las «reacciones químicas», no sólo cualitativa sino también cuantitativamente? A este interrogante responde la famosísima ley de AVOGADRO: «volúmenes iguales de gas en las mismas condiciones de temperatura y de presión contienen el mismo número de moléculas». Sería pues suficiente preparar volúmenes iguales de substancias diversas en estado gaseoso o de vapor para estar seguros de tener el mismo número de moléculas. Por esta vía sería posible comparar entre ellos los diferentes cuerpos simples e individualizar el más ligero (aquél que, a igualdad de volumen, pesa menos). El cuerpo simple más ligero es el hidrógeno cuya molécula sabemos que está constituida por dos átomos. El átomo de hidrógeno es pues, la partícula de referencia más ligera de toda la materia. Comparando ahora, entre ellos, los pesos de iguales volúmenes en las mismas condiciones de temperatura y de presión de hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, monóxido de carbono (CO), anhídrido carbónico (CO2), óxido de nitrógeno (NO), helio (He) y argón (Ar); observaremos que el volumen de nitrógeno pesa 13,895 veces que el del hidrógeno, el de oxígeno 15,87 veces, el de monóxido de carbono 13,892 veces, el de anhídrido carbónico 21,83 veces, el de óxido de nitrógeno 14,883, el de helio 1,9854 y el de argón 19,811 veces. Sabemos que volúmenes iguales contienen el mismo número de moléculas y sabemos también que la molécula de hidrógeno
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está compuesta por dos átomos. Si asignamos el valor 1 al peso del átomo de hidrógeno (es decir, tomamos el peso del átomo de hidrógeno como unidad de medida), el peso molecular del hidrógeno sería 2 y los pesos moleculares de todos los gases expuestos se obtendrían multiplicando por 2 los números que indican cuantas veces su volumen pesa más que el mismo volúmen de hidrógeno. Pero si buscamos en los manuales los pesos moleculares de los gases indicados encontraremos valores diferentes. El motivo de esas diferencias es de orden práctico y se relaciona con la determinación de los pesos atómicos. Se considera peso atómico de un elemento la más pequeña cantidad cotejada en el peso molecular de sus componentes. Pero mientras casi todos los elementos reaccionan con el oxígeno, son menos frecuentes las reacciones con el hidrógeno y, por eso, se elige como unidad de medida de los pesos atómicos la dieciseisava parte del peso atómico del oxígeno igualado a 16 y, en consecuencia, el peso atómico del hidrógeno se convierte en 1,008; si se multiplican por 2,016 los valores indicados anteriormente, que expresan la relación entre el peso de un cierto volumen de gas y el peso del mismo volumen de hidrógeno, se obtendrán directamente los pesos moleculares citados en la literatura. Los pesos atómicos y los pesos moleculares son, pues, «números» que indican cuantas veces los átomos y las moléculas pesan más que una dieciseisava parte del átomo de oxígeno. Atomo-gramo y molécula-gramo (o mol) son, respectivamente, el peso atómico y el peso molecular expresados en gramos. De cuanto se ha expuesto resulta evidente que un mol de cualquier substancia contiene el mismo número de moléculas (el número de Avogadro, NAv = 6,022 ·1023) Y que poniendo en contacto cantidades molares (o múltiplos y submúltiplos según el mismo número) de dos substancias diversas pondremos en contacto un número de moléculas de una especie con idéntico número de la otra. Definidos el peso atómico y molecular, las ecuaciones químicas adquieren, además del significado cualitativo, un preciso significado cuantitativo. Por ejemplo la ecuación: 2 H 2 + O2 → 2 H 2O significa que dos moléculas de hidrógeno reaccionan con una de oxígeno para dar dos moléculas de agua, pero, a la vez, significa que 2 x 2,016 = 4,032 gramos de hidrógeno reaccionan con 32 gramos de oxígeno para dar 2 x 18,016 = 36,032 gramos de agua. Propiedades químicas de los elementos Hacemos una breve referencia a la periodicidad de las propiedades químicas de los elementos en función del peso atómico para llegar a los conceptos de metal, metaloide, bases, ácidos, sales y al concepto de valencia. Se debe a Mendelejeff, la observación de que si se ordenan los elementos según el peso atómico creciente se observa una variación progresiva de las propiedades químicas hasta llegar a un gas, que muestra incapacidad completa de reacción en el sentido de que no forma compuestos con ningún elemento y por esto se define como gas noble. Continuando más allá del primer gas noble la capacidad de reacción evoluciona de la misma forma anterior hasta llegar al nuevo gas noble que muestra capacidad de reacción, otra vez, nula. Las características químicas de los elementos resultan, pues, función periódica de su peso atómico. La interpretación moderna y exacta de estas observaciones guarda relación con la estructura de los átomos y de ella haremos una representación esquemática muy útil para encuadrar el problema de las propiedades químicas de los elementos. Estructura del átomo Un átomo está constituido por un «núcleo» central cargado positivamente y que representa la casi totalidad de la masa, y por un número de «electrones» (unidad de carga negativa) que neutralizan exactamente la carga positiva y rotan, en torno al núcleo, sobre órbitas concretas. El núcleo del hidrógeno tiene masa 1 y carga 1 y se denomina protón. En el hidrógeno hay, por tanto, un solo electrón que neutraliza la carga del protón y que posee una masa mucho más pequeña, 1/1845 de la del protón. El átomo de hidrógeno posee un solo electrón periférico mientras que el del elemento con peso atómico inmediatamente superior, el helio, tiene dos electrones periférico s que neutralizan las dos cargas positivas del núcleo. El helio es un gas inerte o noble, es decir, un elemento sin capacidad de reacción: debemos, pues, concluir que dos electrones sobre una órbita representan una estructura de elevada estabilidad.
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Siguiendo a lo largo del sistema periódico encontraremos elementos con carga nuclear progresivamente creciente y, por tanto, con número creciente de electrones periféricos. Visto que la órbita con dos electrones del helio representa una estructura estable, introduciremos un nuevo electrón para ellitio en una órbita sucesiva obteniendo la serie de átomos representados en la figura l
Fig. 1
Después de una serie de 7 elementos volvemos a encontrar un gas noble, el neón, que posee una estructura estable en la órbita periférica. Continuando con el elemento siguiente introduciremos el nuevo electrón en una nueva órbita: después de otros siete elementos encontramos otro gas noble, el argón. Si comparamos entre sí la serie que va del litio al neón con la que va del sodio al argón observamos que, en ambas, las últimas órbitas contienen respectivamente 1, 2,...7, 8 electrones y que los elementos con el mismo número de electrones poseen propiedades químicas estrechamente análogas. Los electrones presentes en la órbita más externa son llamados electrones ópticos o de valencia porque son aquellos que se ven involucrados en fenómenos de emisión luminosa de baja energía (el litio puesto en contacto con una llama la colorea de rojo, el sodio de amarillo, etc.) y en las reacciones químicas Ahora podemos comprender por qué los elementos reaccionan entre ellos y cómo lo hacen. Tomemos el caso del litio: si cede su electrón externo, la parte restante presentará una carga positiva y la estructura del helio que, como sabemos, es muy estable. El electrón cedido por el litio podría ser asumido por un elemento que, insertándolo en su Órbita externa, adoptase una configuración estable: este elemento puede ser el flúor que posee 7 electrones en la órbita más externa y que, asumiendo uno, consigue la estructura estable del neón, gas noble que le sigue en el sistema periódico. El fenómeno se representa en la figura 2. Hemos obtenido el fluoruro de litio, LiF, en el cual, respecto a los elementos, los dos átomos han alcanzado una configuración más estable (respectivamente aquella del gas noble precedente y siguiente en el sistema periódico) y quedan unidos por atracción electrostática.
Fig. 2
Esta es la razón por la que los elementos reaccionan entre sí; para dar el compuesto que tiene una configuración más estable. Está claro que el litio, al tener un solo electrón que ceder, en las reacciones en que intervenga un solo átomo de litio deberá reaccionar con un elemento capaz de asumir un solo electrón para alcanzar los ocho en su órbita periférica; es el caso del flúor. Dos átomos de litio pueden, sin embargo, ceder su electrón periférico a un átomo
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que necesite dos electrones para completar los ocho. Como por ejemplo el azufre: tendremos entonces el sulfuro de litio, Li2S, cuya estructura se representa en la figura 2. Electrovalencia y covalencia En los casos descritos estamos en presencia de «electrovalencia»: electrovalencia «positiva» para los elementos que ceden electrones, cuya valencia, precisamente, viene representada por el número de electrones periféricos cedibles para alcanzar la estructura del gas noble precedente; electrovalencia «negativa» para los elementos que captan electrones y representada por el número de electrones que han de tomar para alcanzar la estructura del gas noble siguiente. En este momento las combinaciones entre elementos se hacen perfectamente comprensibles desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo. En el caso de la electrovalencia hemos hablado de partículas cargadas de signo opuesto que se atraen mutuamente con una fuerza de tipo electrostática. Existen pruebas experimentales de la presencia, como entidades separadas, de estas partículas cargadas de signo opuesto y denominadas iones (del griego: me muevo, voy) porque se mueven, a causa de su carga, bajo el efecto de un campo eléctrico. Por ejemplo, un compuesto como el cloruro sódico NaCl, perfectamente análogo como estructura al fluoruro de litio, se disuelve en agua y se disocia en dos iones, Na+ y Cl-. La fuerza que mantiene unidas a dos cargas eléctricas (el y e2) viene dada por la ecuación: e ⋅e F = 1 22 η ⋅r donde r es la distancia entre las cargas y 11 una constante que recibe el nombre de constante dieléctrica del medio. En el aire el valor de la constante di eléctrica es uno mientras que la constante di eléctrica del agua es de alrededor de 80. Así, cuando disolvemos un compuesto heteropolar en el agua, la fuerza que mantiene unidos a los iones se reduce ochenta veces y se verifica la disociación. En la serie de elementos que hemos ilustrado está claro que se pasa progresivamente, de una tendencia a ceder electrones de valencia, a captarlos: para el litio será mucho más fácil ceder un electrón alcanzando la configuración del helio que captar siete electrones para conseguir la configuración del neón. Al flúor le ocurre lo contrario. Cuando en un período (se denomina período a la serie de elementos que va desde un gas noble al gas noble sucesivo) llegamos a un elemento como el carbono que posee cuatro electrones en la órbita periférica estamos ante un elemento que tiene la misma tendencia a captar electrones que a cederlos o, dicho de otra forma, no tiene tendencia ni a captarlos ni a cederlos: precisamente de esta característica del átomo de carbono deriva la posibilidad de formación de una infinidad de compuestos que constituyen el vastísimo campo de la química orgánica. Un elemento un poco anómalo y que presenta, bajo este aspecto, características análogas al carbono es el hidrógeno. Así, perdiendo un electrón se convierte en un «protón», esto es, un núcleo cargado positivamente, un ion hidrógeno, estable, por ejemplo, en solución acuosa. Tomando un electrón el hidrógeno consigue la configuración estable del helio y se conocen los «hidruros» como elementos fuertemente electropositivos, por ejemplo: LiH, hidruro de litio. Los elementos que tienen tendencia a ceder electrones, constituyen los metales, aquellos con tendencia a captados, los metaloides. El grupo del carbono contiene los elementos que, en este sentido, tienen propiedades intermedias entre los unos y los otros. Tratando la electrovalencia hemos visto que es un medio por el que los átomos consiguen una configuración más estable; pero no es el único modo. Para conseguir una cierta configuración, en vez de ceder o captar, se pueden poner en común los electrones periféricos. Tomemos como ejemplo el hidrógeno, que indicaremos con su símbolo químico, poniendo en evidencia su electrón con un punto. Si dos átomos de hidrógeno ponen en común su electrón consiguen entre ambos la configuración estable del helio: H • + • H → H •• H . Así, dos átomos de oxígeno poniendo en común dos electrones consiguen la configuración estable del neón:
O O
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He aquí por qué el hidrógeno y el oxígeno tienen moléculas biatómicas: dos átomos de oxígeno iguales no pueden captar y ceder electrones, pero pueden ponerlos en común en un edificio más complejo, la molécula, donde se obtiene una configuración más estable para ambos átomos. Del mismo modo el átomo de carbono, que como sabemos tiene esa aptitud tanto para captar como para ceder electrones, puede poner en común sus cuatro electrones periféricos con otros tantos electrones de átomos de hidrógeno:
H H C H H El carbono ha alcanzado la configuración del neón, los cuatro átomos de hidrógeno la del helio y hemos obtenido el metano, el más simple de los compuestos orgánicos. Este tipo de valencia descrito es la «covalencia». Lo que importa, pues, es alcanzar ciertas configuraciones electrónicas y no tanto el modo en que se alcanzan. Fórmula de la estructura Escribiendo las fórmulas de los compuestos, los átomos se ligan entre ellos mediante trazos, cada uno de los cuales representa una pareja de electrones implicados en el enlace. Por ejemplo: representan respectivamente, las «fórmulas de estructura» del agua, del metano, del anhídrido carbónico y del ácido carbónico y todo trazo indica una pareja de electrones implicados en un enlace interatómico. La representación que hemos hecho del átomo y del enlace químico, aunque se trata de un esquema, respeta una realidad objetiva y suficiente para una clara interpretación de los fenómenos químicos. Un conocimiento más profundo del átomo y de .los enlaces químicos requeriría el estudio de los conceptos de número cuántico, orbital, spin, función de onda, etc., estudio que escapa de nuestros objetivos y que, especialmente para las moléculas más grandes, plantearía problemas muy complejos que no aportarían aclaraciones útiles. Número atómico e isótopos Hemos visto que las propiedades de un elemento dependen exclusivamente de la carga c.ie su núcleo y, como consecuencia, del número de electrones que la neutralizan, dispuestos en una serie de órbitas, sucesivas, la más externa de las cuales contiene los electrones ópticos o de valencia. Las propiedades de los elementos dependen, pues, del número de electrones del átomo, llamado «número atómico», y no de su peso. En el núcleo pueden encontrarse partículas de masa 1 como el protón, pero privadas de carga y se les llama «neutrones». La adición de un cierto número de neutrones al núcleo de un elemento modifica la masa sin cambiar la carga ni el número atómico y, por consiguiente, sin modificar las propiedades químicas: estamos en presencia de un «isótopo», esto es, una substancia que ocupa el mismo lugar en el sistema periódico de los elementos y presenta idénticas propiedades químicas. Por ejemplo, existe un isótopo del hidrógeno, el deuterio (D), con peso atómico 2, y cuyo producto de reacción con el oxígeno se llama agua pesada. De la mayor parte de los elementos se conocen isótopo s que pueden ser individualizados y separados con métodos especiales de forma que los elementos conocidos constituyen una mezcla en proporciones definidas de isótopo s con peso atómico ligeramente distinto. Oxidos, anhídridos, bases y ácidos Vamos a examinar brevemente los compuestos de los elementos con el oxígeno (óxidos y anhídridos) y los productos de reacción de estos con el agua. El agua es el óxido de hidrógeno: H2O. Un elemento fuertemente electropositivo como el Sodio reacciona con el oxígeno dando Na2O, óxido de sodio. El óxido de sodio reacciona con el agua de la siguiente forma: Na 2 O + H 2 O → 2 NaOH Se obtiene un hidróxido de sodio, esto es, un compuesto en el que además del sodio están presentes un átomo de hidrógeno y uno de oxígeno: tratemos de interpretar la estructura.
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El aporte al oxígeno del electrón del hidrógeno lleva a la formación de un grupo OH en el que el oxígeno posee 7 electrones en su órbita periférica y asume una configuración totalmente análoga a la del fluor y del cloro, es decir, una configuración que, mediante la captación de un nuevo electrón, alcanza la estructura estable de los ocho electrones periféricos. Es por tanto, previsible que el grupo constituido por un átomo de oxígeno y otro de hidrógeno y llevando una carga negativa sea un grupo estable, un ion con carga negativa como el ion flúoruro y el ion cloruro. En efecto, el hidróxido de sodio se disocia en agua en un ion sodio cargado positivamente y en un ion «hidroxilo» cargado negativamente. NaOH → Na + + OH Los hidróxidos de los metales son las «bases», es decir, compuestos que en solución acuosa se disocian en iones metálicos cargados positivamente y en hidróxilos. Tomemos ahora en consideración un óxido de un metaloide, por ejemplo, el azufre en su grado máximo de oxidación: el anhídrido sulfúrico SO3 Los enlaces entre azufre y oxígeno, ambos elementos electronegativos, son enlaces covalentes y la estructura del anhídrido sulfúrico puede representarse: O S
O
O
donde cada barra indica una pareja de electrones. También el «trióxido de azufre» da un hidróxido al reaccionar con una molécula de agua: SO3 + H 2 O → H 2SO 4 Veamos la estructura de este hidrógeno. Cada uno de los oxígenos del anhídrido sulfúrico está ligado al azufre con un doble enlace, es decir, pone en común dos electrones con el azufre. Se tiene, pues, la posibilidad con la intervención de otros átomos, de que el oxígeno ponga en común con el azufre un solo electrón, asociando el otro a un átomo distinto y el azufre asocie también el electrón que le ha quedado libre a otro grupo atómico. La estructura del producto de reacción entre el anhídrido sulfúrico y el agua, es así, la siguiente: OH
O S O
OH
En esta estructura el oxígeno está ligado al azufre con un enlace covalente mientras el hidrógeno puede alcanzan la configuración estable del protón cediendo al oxígeno su electrón y estableciendo un enlace de electrovalencia. Así, en solución acuosa el compuesto se escinde en un ion cargado negativamente y en dos iones hidrógeno o «hidrogeniones»: H 2SO 4 → SO 2-4 + 2 H + Los hidróxidos de los anhídridos son los ácidos, es decir, compuestos que en solución acuosa se disocian en hidrogeniones y aniones (iónes cargados negativa-' mente). En general se denominan «ácidos» los compuestos que, en solución acuosa se disocian liberando hidrogeniones y «bases» los compuestos que se disocian liberando hidroxilos. Ley de acción de masas y producto iónico del agua Entre las substancias di sociables en iones, tiene una particular importancia el agua que sufre la disociación siguiente: H 2 O → H + + OH El agua se disocia en una pequeñísima fracción y su disociación está gobernada por una ley que tiene una gran importancia en química, en todos los casos en que se alcanza un equilibrio final: la ley de acción de masas. Si escribimos una ecuación química que indica por una parte las substancias reaccionantes y por otra los productos de reacción y expresamos la concentración de toda substancia en concentración molar (en moléculas gramo por litro), el producto de las concentraciones de las substancias formadas cada una de ellas elevada a su coeficiente de reacción dividido por el producto de las concentraciones de las substancias reaccionantes, también elevada cada una al propio coeficiente de reacción, da un valor constante a temperatura constante. Es más fácil poner un ejemplo con símbolos. Sea la reacción: m A + n B o C + p D. Indicaremos la concentración molar mediante los símbolos: [A], [B], [C] Y [D] La ley de acción de masas dice:
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[ C] [ D] m n [ A ] [ B] o
p
= K = constante de equilibrio
Aplicamos la ley a la disociación del agua: H + OH - =K [ H 2O] Debido a que la cantidad de agua que se disocia es pequeñísima podemos considerar constante el valor del denominador y escribir: H + OH - = K H2O = 10-14 (a 20 ºC) El producto de la concentración molar de los hidrogeniones y de los hidroxilos es una constante que se denomina «producto iónico del agua» y que a 20 °C vale 10-14. En el agua purísima a 20 ºC se encuentran, pues, presentes 10-7 iones gramo de hidrogeniones y 10-7 iones gramo de hidroxilos. Así pues, son muy pequeñas las cantidades compatibles de los dos iones; si ponemos en contacto grandes cantidades de hidrogeniones y de hidroxilos se reúnen formando agua quedando solamente disociadas unas cantidades de iones cuyo producto no supera al producto iónico del agua. Se comprende por qué al poner en contacto una molécula de base monobásica (di sociable en un catión monovalente y en un hidróxilo) con una molécula de ácido mono ácido (di sociable en un hidrogenión y en un anión monovalente) se forma una molécula de sal y una de agua: hidrogeniones e hidroxilos se unen para formar agua; los ácidos y las bases se «neutralizan» entre ellos. El agua pura, que contiene el mismo número de hidrogeniones y de hidroxilos es «neutra». Si añadimos al agua un ácido aumentará el número de los hidrogeniones pero, debido a la constante del producto iónico del agua, disminuirá proporcionalmente el número de los hidroxilos. Análogamente en el caso de la adición de una base: aumentarán los hidroxilos y disminuirán proporcionalmente los hidrogemones. Siendo el producto iónico constante de 10-14, está claro que si la concentración inicial de hidrogeniones en el agua pasa de 10-7 a 10-5, 10-3, 10-1, la correspondiente concentración de hidroxilos pasa respectivamente a 10-9, 10-11, 10-13. En solución acuosa, cuando viene dada la concentración de los iones hidrógeno, conocemos paralelamente la de los iones hidroxilo.
Valor pH Los iones hidrógeno son los responsables de la sensación de acidez percibida por las papilas gustativas del borde de la lengua; por otro lado la concentración de hidrogeniones tiene una enorme importancia para el desarrollo de la actividad biológica ya que condiciona selectivamente las reacciones bioquímicas. Hemos visto que para la neutralidad se tiene una concentración de hidrogeniones de 10-7, esto es, de 0,0000001 iones gramo de hidrógeno por litro y al ser el peso atómico del hidrógeno 1 (1,008) la neutralidad corresponde a una concentración de una diezmilésima de mili gramo de ión hidrógeno por litro. Las concentraciones de hidrogeniones vienen representadas por números muy pequeños, y entonces, se ha pensado el expresarlos por medio de su logaritmo en base 10, cambiado de signo para no tener valores negativos; se introduce así la noción de pH definido como pH = -log [H+]. A la neutralidad, con concentración de hidrogeniones de 10-7, corresponderá el pH 7, mientras a una concentración de hidrogeniones de 10-3, es decir, de 1 mg/l de ion hidrógeno, corresponderá el pH 3. Cuando la concentración de hidrogeniones crece el pH disminuye y viceversa.
Acidos fuertes y débiles Hagamos un breve repaso al comportamiento en solución de los ácidos, definidos en sentido general como substancias que se disocian liberando hidrogeniones. Un ácido será monoácido si es susceptible de liberar un ion hidrógeno, diácido, triácido, si es susceptible de liberar dos o tres. El peso molecular de un ácido dividido por el número de hidrógenos ácidos se denomina «peso equivalente» o «equivalente»; su milésima parte «miliequivalente» y se indica meq. Los ácidos se distinguen cualitativamente en ácidos fuertes, que se disocian completamente en solución, y en ácidos débiles, que se disocian parcialmente según la ley de acción de masas: se tienen todos los grados
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posibles de disociación desde un ácido muy débil como el cianhídrico hasta uno fuerte como el ácido clorhídrico. Los ácidos que interesan en enología, y que estudiaremos particularmente después, son ácidos orgánicos (ácidos carboxílicos) que pertenecen a la categoría de los ácidos débiles. Tratemos de comprender el significado de la expresión «fuerza de un ácido» tomando un parámetro para evaluada con una indicación numérica. Indicamos con HA un ácido monoácido, poniendo en evidencia el hidrógeno disociable; en solución el ácido se disocia hasta alcanzar un equilibrio: (1) HA H + + A Aplicando la ley de acción de masas se obtiene: H + A - =K (2) [ HA ] En la expresión (2) los símbolos [ ] indican las concentraciones molares y la constante K se llama constante de disociación del ácido. El valor de la constante K es una medida de la fuerza del ácido, tanto más fuerte cuanto más elevada es su constante de disociación. Partiendo de la simple expresión de la constante de disociación de un ácido se pueden hacer una serie de observaciones importantes, reservando un estudio más amplio para cuando tratemos los equilibrios de salificación en los vinos. De la citada expresión (2) se obtiene: [ HA ] H + = K A - [ HA ] Log H + = Log K + Log A - A - + - Log H = - Log K + Log (3) [ HA ] A - pH = pK + Log [ HA ] Hemos indicado con pK el logaritmo con signo cambiado de la constante de disociación, expresión análoga al pH. En la ecuación (3) aparece la relación entre la concentración del anión y la del ácido no disociado y el valor de esta relación es el que determina el pH de la solución: el pH es función lineal del pK, que es una constante, y del logaritmo de la relación indicada. Cuando tenemos en solución un ácido débil en presencia de una sal propia, la sal se disocia completamente y su concentración representa a la del anión y el ácido libre representa la concentración del ácido no disociado: se habla, a propósito de la concentración del anión de ácido salificado y, a propósito de la concentración del ácido no disociado, de ácido libre. Retornamos la ecuación (3) que establece la relación que existe entre el pH de una solución de un ácido y la cantidad del mismo en forma disociada y no disociada y tratemos de neutralizar nuestro ácido con una base fuerte. Para las bases vale el mismo concepto de fuerza ilustrado para los ácidos. Suponemos que neutralizamos el 99 % de un ácido de modo que quede solo una molécula de ácido no disociado de cada 100 moléculas de ácido disociado: habremos alcanzado la siguiente situación: 100 pH = pK + Log = pH + 2 1 El pH final supera en 2 unidades el valor del pK del ácido. Si queremos neutralizar el ácido al 999 0 00 las condiciones finales serán: 1000 pH = pK + Log = pH + 3 1 El pH final deberá superar en 3 unidades el valor del pK del ácido. Cuando queramos determinar cuantitativamente un ácido por titulación con una solución alcalina debemos elegir un pH final que tenga en cuenta el pK del ácido. Por ejemplo para valorar al 99% el ácido acético que
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tiene pK = 4,76 se necesita llegar a pH = 6,76 mientras para el ácido láctico que tiene, pK = 3,81 basta llegar al pH 5,81. La expresión (3) permite aun otras consideraciones. A igualdad de ácido total, si la fracción salificada es más grande, el pH es más elevado y viceversa. Un ácido está mitad libre y mitad salificado cuando el pH de la solución es igual al pK del ácido: en estas condiciones la relación entre el ácido disociado y el no disociado es igual a 1 y el logaritmo de 1 es cero. Efecto tampón Una solución de un ácido débil en presencia de una sal propia constituye una solución tampón es decir, una solución que cambia poco el valor de su pH por adición de pequeñas cantidades de bases o ácidos fuertes. Tomemos el ácido láctico que tiene un pK = 3,81, un peso molecular de 90,08 o sea un miliequivalente pesa 0,09008 g, y es un ácido monoácido. Su sal potásica tiene un peso molecular de 128,18 y un miliequivalente pesa 0,12818 g. Preparamos una solución conteniendo 50 meq/L de ácido láctico (50 x 0,09008 = 4,504 g/L) y 50 meq/L de lactato potásico (50 x 0,12818 = 6,409 g/L). De la expresión (3) se obtiene: 50 pH = 3,81 + Log = 3,81 50 Añadiendo a la solución con pH 3,81 1 meq/L de HCl ácido fuerte, completamente disociado que formará cloruro potásico a expensas del lactato liberando una cantidad equivalente de ácido láctico; la situación se modifica de la manera siguiente: 49 pH = 3,81 + Log = 3,81 + 1,69020 - 1,70757 = 3,81 - 0,01737 =3,793 51 Hay una pequeña disminución del pH, inferior a dos unidades sobre la segunda cifra decimal. En el caso de la adición de 1 meq/L de hidróxido de potasio, base fuerte que salifica al ácido láctico libre transformándolo en lactato; la situación se modifica así: 51 pH = 3,81 + Log = 3,81 + 1,70757 - 1,6902 = 3,81 + 0,01737 =3,827 49 Hay un pequeño aumento de pH, inferior a dos unidades sobre la segunda cifra decimal. Preparemos ahora con un ácido fuerte, por ejemplo ácido clorhídrico, una solución de pH = 3,81. Habrá que disolver en agua 10-3,81 moléculas gramo por litro de ácido clorhídrico (0,005648g/L) que disociándose completamente dará 0,00015488 gramos/litro de ion hidrógeno; el logaritmo de este valor es 4,19 en la notación con mantisa positiva, esto es -3,81, y cambiando de signo se llega al valor de pH de 3,81. Añadiendo a esta solución 1 meq/L de ácido clorhídrico, la concentración de hidrogeniones será: 0,00015488 + 0,001 = 0,00115488; el logaritmo de este valor es 3,06253 = 2,93747 y el valor del pH será 2,94. La adición de un meq/l de ácido fuerte, que en el caso de la solución de ácido láctico y de lactato disminuiría el pH en menos de dos centésimas de unidad, en el caso de una solución de ácido fuerte hace pasar al pH del valor 3,81 a 2,94. Veamos el efecto de la adición de 1 meq/L de base fuerte. Tendremos 0,001 equivalentes gramo de hidróxilos que reaccionarán, para dar agua, con 0,00015488 equivalentes gramo de hidrogeniones; quedará un exceso de 0,001 - 0,00015488 = 0,00015488 ó 0,00084512 equivalentes gramo de hidróxilo que expresados en forma exponencial equivalen a 10-3,07308, que aproximamos a 10-3,073, Recordemos ahora que el producto iónico del agua vale 10-14 y que, por lo tanto, la concentración de hidrogeniones resulta 10-(14-3,073) = 10-10,927 y, como consecuencia, el pH de la solución asume el valor 10,927. Las soluciones de ácidos débiles en presencia de sus sales son, pues, «soluciones tampón», que se oponen a la modificación del pH del medio y ejercen una función de extraordinaria importancia en los líquidos biológicos, en los que las reacciones bioquímicas están estrechamente condicionadas por el pH. Una última observación aún, a propósito del efecto de la dilución. En el caso de una solución de ácido débil en presencia de una sal propia sabemos que d valor del pH viene dado por la relación: A- pH = pK + Log [ HA ] Si diluimos la solución, en los límites en que conserva su validez la ley de acción de masas, disminuirá la concentración del anión, pero disminuirá también, y en la misma proporción, la del ácido no disociado de modo que la relación entre ambos permanecerá invariable y, por lo tanto, no se alterará el pH: éste es el motivo de que
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un vino puede diluirse hasta 8 veces con agua sin que se pierda al gusto la sensación de acidez. Por el contrario, en el caso de una solución de un ácido fuerte la concentración de hidrogeniones disminuye proporcionalmente a la dilución 1 meq/L de HCl, es decir, 0,001 equivalentes suponen 10-3 iones gramo de hidrógeno y le corresponde un pH = 3, si hacemos 10 diluciones la concentración de hidrogeniones se hace de 0,0001, es decir, 10-4 y el pH = 4.
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CAPITULO SEGUNDO
Los ácidos de la uva El racimo de uva está constituido por el raspón o escobajo, el hollejo, las pepitas y la pulpa. Refiriéndonos a algunos componentes fundamentales, la composición de estas partes del racimo es muy distinta y ello supone, unido a la diferente estructura anatómica ya las técnicas de elaboración, un diverso «significado enológico». Comenzamos con el análisis de algunos constituyentes fundamentales para abordar, progresivamente, el cuadro completo. Los ácidos que se encuentran en la uva son el ácido tartárico, el ácido málico yel ácido cítrico. Acido tartárico El ácido tartárico de la uva es el L (+) tartárico, es decir, la forma ópticamente activa dextrógira del ácido tartárico con configuración levo. El significado preciso de esta definición será aclarado cuando, tratando los azúcares, describamos las fórmulas espaciales o fórmulas estéricas de los compuestos orgánicos e ilustremos los conceptos de actividad óptica y poder rotatorio. El ácido tartárico es un ácido biácido de fórmula: HOOC-CHOH-CHOH-COOH y P.M. = 150,09. Siendo un biácido tiene dos posibilidades de disociación. Si lo representamos con la notación simplificada H2 T, que pone en evidencia los hidrógenos ácidos, se tienen las disociaciones siguientes: +
H 2 T H + HT -
+
HT H + T
2-
-
H + HT - =K1 [ H 2T ] H + T 2- =K 2 HT -
En solución acuosa se tienen los valores siguientes: pK1 = 3,04 pK2 = 4,37. El ácido tartárico es el ácido más fuerte de la uva y es característico y típico de este fruto, no encontrándose naturalmente en otros frutos. Como se ve en la fórmula, además de ser biácido, el ácido tartárico posee dos grupos alcohólicos secundarios vecinos que le confieren las particularidades físico-químicas y químicas que posee, en primer lugar la fuerza ácida, después la solubilidad en el agua del ácido, de sus sales, etc. Entre las sales del ácido tartárico, dos revisten particular importancia enológica debido al hecho de que son poco solubles: el bitartrato potásico o «crémor» (HOOC-CHOH-CHOH-COOK) y el tartrato neutro de calcio tetrahidratado: O HO CH Ca 4 H2O HO
CH O
De las precipitaciones tartáricas en los vinos hablaremos ampliamente cuando examinemos los fenómenos de insolubilización. Con la excepción del ácido múcico, que se encuentra únicamente en casos particulares de uvas atacadas por hifomicetos (hongos) y que presenta una sal de calcio poco soluble, el ácido tartárico es el único ácido orgánico que plantea problemas de estabilidad en el vino a causa de sus sales poco solubles. Acido málico El ácido málico de la uva es el L (-) málico, HOOC-CH2-CHOH-COOH
P.M.:= 134,09.
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Es también un ácido biácido que en agua presenta dos constantes de disociación con los siguientes valores: pK1 = 3,46 pK2 = 5,13. Como se ve, la simple diferencia respecto al ácido tartárico de un oxidrilo en la molécula comporta una gran diferencia en la fuerza del ácido. Recordando las consideraciones hechas a propósito de las relaciones entre el pH y el valor del pK podemos decir que la primera función del ácido málico está casi tres veces menos disociada que la primera del ácido tartárico y que la segunda función del ácido málico está seis veces menos disociada que la segunda del ácido tartárico. Acido cítrico El ácido cítrico es un triácido: P.M. = 192,13
HO
COOH
CH2 C
COOH
CH2 COOH
Indicándolo simbólicamente H3C para poner en evidencia los tres hidrógenos ácidos se tienen las siguientes disociaciones: H + H 2 C- + H 3C H + H 2 C =K1 [ H 3C ] H + HC2- =K 2 H 2 C-
H 2 C- H + + HC2-
HC
2-
+
H +C
H + C3- =K 3 HC2-
3-
Las constantes de disociación en agua presentan los siguientes valores: pK1 = 3,15
pK2 = 4,71
pK3 = 6,41
El ácido posee pues, la primera función con una fuerza comparable a la de la primera función del ácido tartárico, la segunda función está dos veces menos disociada que la segunda función del ácido tartárico, pero tres veces más disociada que la segunda función del ácido málico. En cuanto a la tercera función, para los pH que interesan en enología (2,8-3,8), está completamente libre y, por tanto, el ácido cítrico se comporta como un ácido biácido de características intermedias entre el tartárico y el málico. Además de los ácidos que hemos descrito pueden encontrarse en la uva pequeñas cantidades de otros ácidos que alcanzan contenidos más relevantes sólo en el caso de ataques de hongos (especialmente podredumbre o Botrytis cinerea) o en uvas sometidas voluntariamente a un ataque de Botrytis cinerea en forma larvada denominado «podredumbre noble», «marciume nobile» de los italianos, «EdeWiule» de los alemanes o «porriture noble» de los franceses. Los ácidos de la uva están parcialmente salificados con los cationes potasio, magnesio, calcio y (en pequeña cantidad) sodio.
Acidez titulable y alcalinidad de las cenizas Con el fin de poder describir y comparar la composición en ácidos de las diferentes partes del racimo, es necesario comprender el significado de dos determinaciones analíticas que, normalmente se efectúan en los vinos: la acidez titulable y la alcalinidad de las cenizas.
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Si disolvemos en un litro de agua una molécula gramo de una base monobásica, como por ejemplo el hidróxido de sodio NaOH, habremos preparado una solución titulada «normal» de la base. Un litro de esta solución neutraliza exactamente una cantidad igual a una molécula gramo de un ácido monoácido, la mitad de moléculas gramo de un ácido biácido, un tercio de moléculas gramo de un ácido triácido, es decir, un equivalente de cualquier ácido. Un mililitro (una milésima de litro o cm3) de la solución normal de la base representa un meq de un ácido cualquiera. Supongamos haber consumido exactamente 10 mL de hidróxido de sodio normal para neutralizar un cierto volumen de líquido conteniendo ácido tartárico: ¿cuánto ácido tartárico había en aquel volúmen? 10 mL de sosa normal significa 10 meq. El ácido tartárico es un ácido biácido y, como consecuencia, su peso equivalente se obtiene dividiendo su peso molecular por 2: 150/2 = 75. El mili equivalente de ácido tartárico es la milésima parte del equivalente, es decir 0,075 g, 10 meq de sosa han neutralizado 0,75 g de ácido tartárico y por tanto, aquel volumen de solución acuosa contenía 0,75 g de ácido. La operación descrita es una titulación que permite conocer la cantidad de ácido a determinar a partir del volumen de «solución titulada» empleado. Además de las soluciones normales de una base (o de un ácido) se pueden preparar soluciones de normalidad múltiplo o submúltiplo: 2 normal (2N), 5 normal (5N), etc. o décimonormal (N/10), vigésimonormal (N/20), centésimonormal (N/100), etc. 1 mL de estas soluciones contendrá respectivamente: 2 meq, 5 meq, 0,1 meq, 0,05 meq, 0,01 meq. Supongamos ahora que tomamos con un instrumento tarado un volumen de 10 mL de una solución y lo neutralizamos hasta pH final 7, empleando una solución de sosa N/l0. Supongamos haber consumido 15 mL de solución de sosa. La solución de sosa es N/l0 y, por lo tanto, contiene 1 meq cada 10 mL; el volumen consumido corresponde a 1,5 meq. 1,5 meq de base han neutralizado 10 mI de solución ácida si queremos referirlo a 1 litro de solución ácida deberemos multiplicar por 100 y, así, nuestra solución contiene: 1,5 x 100 = 150 meq/L de acidez titulable. La experiencia descrita aclara completamente el concepto de acidez titulable que expresaremos en meq/L. Consideramos ahora los ácidos tartárico, málico y cítrico; todos están constituídos por carbono, hidrógeno y oxígeno. Imaginemos que tenemos un cierto volumen de una solución de una mezcla de estos tres ácidos en una cápsula de platino. Si hacemos evaporar el agua por calor encontraremos los ácidos en el fondo de la cápsula en forma cristalina. Incineramos ahora el contenido deja cápsula, es decir, pongamos la cápsula sobre una llama un tiempo suficientemente largo hasta que cese todo desprendimiento de humos o de vapor. Preguntémonos qué hemos hecho con esta operación: hemos hecho reaccionar con el oxígeno del aire los ácidos contenidos en la cápsula. En esta reacción ha habido un aporte del oxígeno del aire para transformar el hidrógeno de los compuestos en agua y su carbono en anhídrido carbónico desapareciendo ambos en forma gaseosa. Al final, en la cápsula no ha quedado nada y si después de enfriar añadimos agua pura ésta no tendrá nada que disolver y quedará neutra. Supongamos ahora que repetimos la experiencia precedente con una solución de bitartrato potásico:HOOCCHOH-CHOH-COOK. Durante la calcinación toda la parte orgánica, esto es, constituida por carbono e hidrógeno, viene destruida y alejada en forma de H2O y CO2 pero el potasio queda en la cápsula bajo forma de carbonato potásico K2CO3. Al añadir agua tendremos una solución de carbonato potásico. Un carbonato como el de potasio, de calcio, de magnesio y de sodio es una sal de una base fuerte con un ácido debilísimo como el ácido carbónico H2CO3 el cuál, además, se descompone en agua de la forma siguiente: CO3 H 2 CO 2 + H 2 O Se forma anhídrido carbónico que se desprende en forma gaseosa desplazando el equilibrio hacia la derecha. La primera y segunda constantes de disociación del ácido carbónico presentan los valores pK1 = 6,52 Y pK2 = 10,2. Añadiendo a la solución de carbonato potásico una solución titulada (N/10 por ejemplo) de un ácido fuerte como el ácido clorhídrico, el ácido carbónico es «desplazado» completamente y el carbonato se transforma totalmente en cloruro y neutraliza el ácido de la misma forma que si se tratase de hidróxido de potasio, el ácido carbónico que se libera se descompone en anhídrido carbónico y agua. Después de la calcinación del bitartrato potásico hemos obtenido, pues, una solución alcalina de la que podemos determinar la alcalinidad neutralizándola con una solución titulada de ácido. Si, por ejemplo, habíamos tomado 25 mL de solución y después, de la evaporación y calcinación hemos consumido 5 mL de ácido clorhídrico N/10, nuestra solución presenta una alcalinidad de 5 x 0,1 x 40 = 20 meq/L.
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Si ahora tomamos 25 mL de la misma solución y, en vez de incinerarlos, los neutralizamos directamente con NaOH N/10, consumiremos exactamente 5 mL de sosa. Si después de esta neutralización procedemos a la incineración, el residuo disuelto en agua requerirá para ser neutralizado 10 mL de cm N/10. Conviene aclarar muy bien el significado de los hechos descritos. El bitartrato potásico que, con notación simplificada indicaremos KHT, poniendo en evidencia el potasio y el hidrógeno salificable, es ácido tartárico neutralizado por mitad, susceptible de ser neutralizado completamente: KHT + NaOH KNaT + H2O Los miliequivalentes de alcalinidad que encontramos después de la calcinación corresponden a la mitad de los necesarios para neutralizar completamente el ácido y son iguales a los que se consumen de sosa en la titulación directa, también estos iguales a la mitad de los necesarios para la neutralización completa, ya que la otra mitad está ya neutralizada. La alcalinidad encontrada después de la neutralización y calcinación resulta el doble de los valores registrados en los dos tipos de determinación y expresa la cantidad de álcali necesaria para neutralizar todo el ácido tartárico presente. Si queremos expresar en mili equivalentes la cantidad total de ácido tartárico presente en la solución de bitartrato examinada deberemos hacer la suma de los miliequivalentes correspondientes a la acidez titulable y de los correspondientes a la alcalinidad de las cenizas: 20 + 20 = 40 meq/L. Del ejemplo expuesto resulta claramente que la alcalinidad de las cenizas expresa la fracción salificada (combinada) de un ácido orgánico, mientras la acidez titulable expresa la fracción salificable (libre) del mismo ácido: la suma de los dos valores nos da la cantidad total del ácido. Hemos dicho que la alcalinidad de las cenizas es una medida de las sales de los ácidos orgánicos presentes y sólo de los ácidos orgánicos que son los únicos que se destruyen por oxidación. En efecto, una sal como el sulfato potásico K2SO4 no sufre ninguna modificación durante la calcinación y no es fuente de ninguna alcalinidad. De cuanto ha sido expuesto aparece claro que en presencia de una mezcla de ácidos orgánicos parcialmente salificados, la acidez titulable expresará la acidez salificable y la alcalinidad de las cenizas la acidez salificada. La suma en meq de la acidez titulable y de la alcalinidad de las cenizas representará la cantidad total de ácidos orgánicos presentes. Determinemos sobre una mezcla de ácido tartárico, málico y cítrico, parcialmente salificados, la acidez titulable y la alcalinidad de las cenizas, expresadas ambas en meq, y hagamos después con métodos analíticos específicos, la determinación respectiva del ácido tartárico total, del ácido málico total y del ácido cítrico total, expresando los valores de estos ácidos en meq: en los límites de los errores experimentales, la suma de los meq de los ácidos individuales debe ser igual a la suma de la acidez titulable y de la alcalinidad de las cenizas. Supongamos que hemos determinado sobre un mosto límpido por centrifugación una acidez titulable de 150 meq/L y una alcalinidad de las cenizas de 40 meq/L: los datos son seguros porque resultan de una serie de determinaciones repetidas que han dado valores concordantes. La cantidad total de ácidos orgánicos es, por tanto, de 190 meq/L. Procediendo sobre el mismo mosto a la determinación específica del ácido tartárico hemos encontrado 120 meq/L; mientras la determinación específica del ácido málico ha dado el valor de 130 meq/L, superando ampliamente el valor de 190 meq/L obtenido sumando la acidez titulable y la alcalinidad de las cenizas y, por tanto, los resultados obtenidos para el ácido tartárico, para el ácido málico, o para ambos ácidos, deben considerarse erróneos.
pH-metro digital
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CAPITULO TERCERO
Conceptos de química orgánica Antes de estudiar los azúcares de la uva, substancias fundamentales a partir de las cuales (de aquellos fermentescibles) se origina el alcohol según la fermentación alcohólica recordaremos algunos conceptos de química orgánica indispensables para la comprensión de las propiedades físicas y químicas de estas substancias. Cuando hemos expuesto la posición del carbono en el sistema periódico de los elementos hemos subrayado la escasa tendencia a ceder electrones o a adquirirlos en el orbital más periférico y, por el contrario, la tendencia a poner en común electrones en enlaces de covalencia. Esta tendencia se manifiesta también en relación con otros átomos de carbono de manera que es posible la formación de cadenas de átomos de carbono dando origen a una infinidad de compuestos posibles que constituyen precisamente el vastísimo campo de la química orgánica y que forman las substancias fundamentales para la vida de todos los organismos. Otros elementos del grupo del carbono presentan, aunque en menor medida, la característica de formar cadenas de átomos, en particular el silicio: existe hoy una bien desarrollada «química orgánica» del silicio, que ha dado lugar a la síntesis de compuestos de gran importancia industrial y científica. . El átomo de carbono es tetravalente y puede formar cuatro enlaces de covalencia con átomos diversos. Equivalencia de las valencias del carbono Podemos preguntamos si las 4 valencias del carbono son equivalentes, es decir, si para igual estructura molecular es indiferente que un grupo atómico esté ligado a una u otra valencia del carbono Exponemos un ejemplo: 1 b CH2 a OH CH2 CH3
1 OH b CH2 a CH 2 CH2
1 a CH2 OH b CH2 CH2 CH3
I CH3 CH a 2 CH3 CH2 b CH2
a
CH3
CH2
CH2 b
CH2 OH CH2
Por las dos vías indicadas se obtiene un compuesto idéntico aunque en un caso y en otro el grupo metilo CH3 y el grupo etilo - CH2 - CH3 están ligados a valencias distintas, pero resultan perfectamente equivalentes. Con procedimientos análogos se ha demostrado la equivalencia de todas las valencias del carbono. La «fórmula bruta» de un compuesto, es decir, aquella que indica el tipo y el número de átomos que constituyen la molécula no es apta para individualizarlo químicamente. En efecto, existen compuestos muy distintos en cuanto a sus propiedades químicas con idéntica fórmula bruta por ejemplo, el ácido acético y el formiato de metilo tienen la misma fórmula C2H4O2 y son compuestos muy diferentes, son «isómeros». Para los compuestos orgánicos de forma especial hay que establecer las fórmulas de la estructura, es decir, aquellas que además del tipo y número de átomos indican como están ligados los átomos entre ellos y cuales son sus distancias recíprocas. En el caso del ácido acético y del formiato de metilo tenemos las siguientes fórmulas de estructura: O
H H H
C
H
C O
Ac. acético
H
H
O C H
C O
H H
Formiato de metilo
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Hipótesis de LE BEL Y VAN'T HOFF La experiencia sobre un elevadísimo número de compuestos orgánicos ha llevado a las siguientes conclusiones, jamás desmentidas por la misma experiencia: se conoce un solo isómero de los compuesto de tipo CA4,CA3B, CA2B2, CA2DB; se conocen dos isómeros de los compuestos de tipo CABDE. En este último caso los compuestos tienen idénticas propiedades químicas e idénticas propiedades físicas salvo la de determinar una rotación en sentido opuesto del plano de luz polarizada: por el contrario, resultan muy diferentes las propiedades bioquímicas de los dos «isómeros ópticos». Este conjunto de hechos experimentales se interpreta perfectamente si admitimos como VAN'T HOFF que los cuatro sustituyentes de un átomo de carbono no pueden situarse en el mismo plano. Al ser las 4 valencias de carbono equivalentes, en un compuesto del tipo CA4 (por ejemplo el metano, CH4) si se colocaran en un plano, el carbono debería encontrarse en el centro de un cuadrado del cual los sustituyentes ocuparían los vértices:
Fig. 3
Fig. 4
Esta estructura justifica la equivalencia de las valencias y la unicidad de los isómeros para los compuestos del tipo CA4 y CA3B, pero no justifica la unicidad de los isómeros para los compuestos de tipo CA2B2, CA2BD: en efecto, como se ve en la figura 3, los dos sustituyentes iguales podrían encontrarse sobre el mismo lado y sobre lados opuestos del cuadrado: las distancias interatómicas serían diferentes en los dos casos y, como consecuencia, diferentes las propiedades físicas y químicas. La única estructura que justifica a la vez la equivalencia de las valencias del carbono y la unicidad de los isómeros para los compuestos del tipo CA2Ba es la imaginada por LE BEL Y VAN'T HOFF con el carbono en el centro de un tetraedro regular con las valencias dirigidas hacia los vértices (fig. 5).
Fig. 5
Efectivamente, en este caso dos vértices cualesquiera son siempre equivalentes y se explica como del cloruro de metileno CH2Cl2 se conoce un solo isómero. Pero la feliz intuición de VAN'T HOFF ofrece también la llave para comprender la existencia de dos «isómeros ópticos» en el caso de los compuestos tetrasustituídos del tipo CABDE.. En efecto, si se disponen los cuatro sustituyentes distintos en los vértices de un tetraedro es fácil constatar que se obtienen dos estructuras idénticas en las cuales las distancias interatómicas son iguales y que, por tanto, deben poseer idénticas
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propiedades físicas y químicas, pero que, sin embargo, no son superponibles y, como las dos manos, son una imagen especular de la otra (fig. 5). La completa asimetría molecular es la causa de la propiedad de hacer rotar el plano de luz polarizada y de la existencia de dos «isómeros ópticos». La teoría de VAN'T HOFF de la estructura tetraédrica del átomo de carbono ha encontrado confirmación objetiva en las medidas de interferencia de rayos X hechas por DEBYE sobre tetracloruro de carbono CCl4 y sobre otros compuestos. Luz polarizada Una indicación sobre la luz polarizada. La luz es un fenómeno ondulatorio transversal, es decir, las vibraciones se producen en un plano perpendicular a la dirección de propagación. En el plano de vibración, las oscilaciones suceden en todas las direcciones. Existen láminas de cristales (por ejemplo, láminas de turmalina cortadas paralelamente al eje cristalográfico) que se comportan de modo particular respecto a un haz de luz con rayos paralelos. Tomamos dos de estas láminas iguales, las superponemos de forma que sus ejes sean paralelos y las ponemos en la trayectoria de un haz de rayos luminosos; la luz atravesará las dos láminas superpuestas. Por el contrario, si disponemos las láminas superpuestas de forma que sus ejes sean perpendiculares (fig. 6), la luz no será capaz de atravesar las láminas.
El fenómeno se produce porque una lámina de turmalina se deja atravesar sólo por los componentes de las vibraciones de la luz que tienen una orientación definida, por ejemplo paralela a su eje cristalográfico: la luz que emerge de una lámina de turmalina está, pues, «polarizada rectilíneamente» en una sola dirección y el plano perpendicular a esta dirección se denomina «plano de polarización» (fig. 6). Si sobre la dirección de los rayos que salen de la primera lámina ponemos una segunda, pero con el eje óptico en posición perpendicular al de la primera, la luz, polarizada en dirección perpendicular al eje óptico de la segunda lámina, no podrá atravesarla. La turmalina constituye, pues, un medio para obtener luz polarizada y para identificar la posición del plano de polarización de la luz. Si ponemos dos láminas de turmalina con los ejes ópticos perpendiculares la
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luz polarizada no atraviesa la segunda lámina. Si, ahora, entre las dos láminas interponemos, en un cierto espesor una substancia (sólida o en solución) capaz de rotar el plano de polarización de la luz, una fracción de luz atravesará la segunda lámina de turmalina, porque se tendrá una componente de vibración paralela al eje óptico. Rotando la lámina hasta hacer desaparecer nuevamente la luz transmitida, podremos medir el ángulo de rotación del plano de luz polarizada debido a la interposición de la substancia dotada de «poder rotatorio» .
Azúcares Los azúcares también se denominan hidrato s de carbono ya que presentan una fórmula bruta Cn(H2O)m, con la relación hidrógeno/oxígeno idéntica a la del agua. Los azúcares contienen un grupo aldehídico o cetónico en la extremidad de la molécula y un hidroxilo alcohólico unido a cada uno de los átomos de carbono: tenemos, por tanto, aldoazúcares y cetoazúcares. Podemos considerar las triosas como los azúcares más simples: H
CHO
CH2 OH
C
C
OH
O
CH2 OH
CH2 OH Aldehído glicérico
Dioxiacetona
Son estos algunos de los compuestos que encontraremos en el estudio del mecanismo de la fermentación alcohólica. Configuraciones espaciales Si observamos la fórmula del aldehído glicérico encontraremos una estructura molecular asimétrica, es decir, con un átomo de carbono unido a 4 sustituyentes distintos. Podemos pues, esperar la existencia de una actividad óptica y de dos isómeros antípodas ópticos, que rotan en sentido opuesto el plano de luz polarizada. La experiencia confirma la existencia de dos aldehídos glicéricos: CHO
CHO H
C
HO
OH
C
H
CH2 OH
CH2 OH
Aldehído l-glicérico
Aldehído d-glicérico
Además de las fórmulas de la estructura asumen, pues, significado las «fórmulas espaciales» las cuales se obtienen según la notación de Fischer, proyectando sobre un plano las fórmulas espaciales tridimensionales de forma que los átomos de carbono se alineen sobre una recta y los sustituyentes se dispongan a izquierda y derecha. Con la condición de no levantarlas sobre el plano del dibujo, sino sólo de rotarlas, estas fórmulas de proyección conservan la característica de especularidad de las antípodas y de no superponibilidad de los dos isómeros ópticos: si es posible trazar un plano de simetría, entonces la molécula no tendrá actividad óptica como, por ejemplo, en el caso del ácido metatártrico: COOH H
C
OH
H
C
OH
COOH
Tetrosas Partiendo del aldehído glicérico es posible, aumentando en 1 el número de átomos de carbono de la molécula, pasar a una tetrosa, es decir, a un azúcar con 4 átomos de carbono. Partiendo del aldehído d-glicérico y del aldehído l-glicérico se tienen las siguientes posibilidades:
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El aumento de un carbono en la cadena permite derivar de cada uno de los dos antípodas ópticos dos nuevos azúcares: dos de la serie dextro y dos de la serie levo. Todos los azúcares que derivan del aldehído d-glicérico son levoazúcares. La elección de una de las dos formas del aldehído glicérico como dextroforma ha sido arbitraria, sin embargo, posteriores consideraciones teóricas encaminadas a deducir la «configuración absoluta» de algunos compuestos, han conducido a las mismas configuraciones que habían sido elegidas arbitrariamente. La pertenencia a la serie dextro o levo de los compuestos ópticamente activos depende sólo del hecho de que su configuración espacial se pueda reconducir a una de las dos formas del aldehído glicérico, independientemente de la rotación a derecha o izquierda del plano de luz polarizada. En efecto, hemos hablado antes del ácido 1(+) tartárico que significa una configuración reconducible a la del aldehído l-glicérico y una actividad óptica dextrógira indicada por el (+). La fórmula estérica del ácido tartárico y la del ácido málico son ambas comparables a la del aldehído l-glicérico. CHO HO H CHO H
C
CHO
C H C
OH
H
C
OH
HO
C
H
CH2 OH
OH
CHO
CH2 OH HO
l-treósico
d-treósico
C
H
CH2 OH
CH2 OH CHO
CHO
Aldehído d-glicérico H
C
OH
HO
H
C
OH
HO
d-glicérico
C
H
Aldehído l-glicérico
l-glicérico COOH
COOH
CHO C
H
CH2 OH
CH2 OH
HO
C
H
CH2 OH
HO
C
H
H
C
OH
HO
C
CH2 COOH
COOH Aldehído l-glicérico
H
l (+)- tartárico
l (-)-málico
Pentosas Alargando la cadena de las cuatro tetrosas se obtienen ocho pentosas, cuatro con estructura dextro y cuatro con estructura levo; se trata de arabinosa, xilosa, ribosa y lixosa. De éstas se encuentran en los vinos las formas levo de la arabinosa y de la xilosa y la forma dextro de la ribosa. En pequeña cantidad está presente otro azúcar perteneciente a las pentosas, aunque tenga seis átomos de carbono, la 1l-ramnosa; se trata de una metilpentosa: CHO
CHO
CHO
CHO
HO
C
H
HO
C
H
H
H
C
OH
HO
C
H
H
HO
C
H
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
HO
C
HO
C
H
HO
C
HO
C
H
CH2 OH
CH2 OH
CH2 OH
CH3 L-Ramnosa
L-Arabinosa
L-Xilosa
L-Ribosa
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Hexoxas Alargando la cadena en un átomo de carbono, de las 8 pentosas se pasa a las hexosas obteniendo 16 azúcares, 8 con configuración dextro y 8 con configuración levo. Todos estos azúcares son conocidos, pero a nosotros nos interesan de. forma particular tres: d-glucosa, d-manosa y d-galactosa: CHO
CHO
CHO H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
HO
C
H
HO
C
H
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
CH2 OH
CH2 OH
CH2 OH D-Glucosa
D-Manosa
D-Galactosa
Los azúcares examinados hasta ahora son aldoazúcares. En efecto, poseen un grupo aldehído R-CHO en la extremidad de la cadena y un grupo alcohólico por cada átomo de carbono. El grupo alcohólico que se encuentra ligado al carbono de la e.xtremidad opuesta al grupo aldehido es un grupo alcohólico primario, oxidable a grupo ácido. Los otros grupos alcohólicos son secundarios, oxidables a grupos cetónicos. Además de los aldoazúcares existen los cetoazúcares o cetosas, que contienen en la molécula un grupo cetónico R1-CO-R2 donde R1 y R2 son dos radicales orgánicos.
Representaciones espaciales de la d-glucosa. (En gris los átomos de carbono, en rojo los de oxígeno y en blanco los átomos de hidrógeno. En la figura de la derecha se han omitido los átomos de hidrógeno). Entre las hexosas nos interesa una sola cetosa que es azúcar fundamental de la uva: la d-fructosa. CHO
CHO
CHO
C
O
H
C
OH
HO
C
H
HO
C
H
HO
C
H
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
CH2 OH D-Fructosa
CH2 OH D-Glucosa
CH2 OH D-Manosa
Si comparamos entre ellas la d-glucosa, la d-manosa y la d-fructosa observamos que la configuración espacial de las tres moléculas es idéntica, salvo para el átomo adyacente al grupo carbonílico. Azúcares como glucosa y manosa que se diferencian sólo por la posición espacial del hidrógeno y del hidroxilo sobre el carbono 2, se llaman «epímeros».
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Los compuestos orgánicos que tienen sobre dos carbonos vecinos respectivamente un grupo carbonílico y un grupo alcohólico están sujetos a un tipo de isomería intramolecular que se denomina «tautomería ceto-enólica»: un hidrógeno pasa del carbono al oxígeno del grupo carbonílico vecino y entre los carbonos se establece un doble enlace: R
C
CH2 OH
R
O
C
CH
OH OH
En general el equilibrio está casi completamente desplazado hacia la forma cetónica. El compuesto en el que un hidroxilo está ligado a un carbono que lleva un doble enlace se denomina «eno!» y de aquí el nombre de tautomería cetoenólica. Si consideramos ahora este tipo de tautomería aplicada a d-glucosa, d-fructosa y d-manosa, vemos que lleva a la formación de idéntica forma enólica: CHO C
O
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
D-Fructosa
CH2 OH
H HO H H
CHO
CH OH
C
C
OH
HO
C
H
OH
H
C
OH
OH
H
C
OH
C C C
OH H
CH2 OH D-Glucosa
CH2 OH
CHO HO
C
H
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
CH2 OH D-Manosa
Pues bien, glucosa, fructosa y manos a son los únicos azúcares fermentescibles, mientras la galactosa fermenta con dificultad bajo la acción exclusiva de algunas levaduras y sólo a condición de una previa habituación. Los tres azúcares tienen pues una configuración análoga que explica no sólo el comportamiento bioquímico, sino también el comportamiento químico: por ejemplo, de uno cualquiera de los tres azúcares se obtiene en solución alcalina un equilibrio con los tres azúcares presentes a la vez. La tautomería cetoenólica comentada explica perfectamente estos hechos experimentales. . En este punto, antes de examinar otras características químicas importantes de los azúcares, volvemos al poder rotatorio, característico de las substancias que como los azúcares poseen centros de asimetría en la molécula, es decir, carbonos ligados a 4 sustituyentes distintos. Poder rotatorio En el caso de los azúcares el poder rotatorio, esto es, la propiedad de rotar a izquierda o derecha el plano de luz polarizada, es una característica importante, utilizada para su determinación por medio de un instrumento, el polarímetro. Es oportuno, por tanto, dar para cada azúcar una definición cuantitativa de su aptitud para rotar el plano de luz polarizada. Si p gramos de azúcar se disuelven en 100 g de solución acuosa, esto es, 100-p gramos de agua y la solución tiene un peso específico respecto al agua a 4 °C indicado con d, recordando que tal peso específico es el peso de la unidad de volumen de la solución, el volumen total de ésta resulta ser 100/d. Indicamos con a el ángulo de
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rotación del plano de luz polarizada obtenido para un espesor 1 en decímetros de solución conteniendo el peso p de azúcar en 100 g de solución. 1 mL de solución contiene 100 p⋅d p: = gr de azucar d 100 p⋅d 100 Una solución que tuviera 1 g/mL de azúcar tendría una concentración 1 : = veces superior a la 100 p⋅d considerada y, así, a igualdad de espesor 1, provocaría una rotación otras tantas veces mayor, es decir, una 100 solución que contenga 1 g/mL de azúcar provoca un ángulo de rotación de α : con un espesor de 1 p⋅d decímetro. Si consideramos la rotación debida al espesor de un sólo decímetro deberemos dividir por 1 y obtendremos el α ⋅100 ángulo de rotación relativo a una solución de 1 g/mL de azúcar y para el espesor de 1 dm: Este ángulo de l⋅d ⋅p rotación se denomina «poder rotatorio específico» para el azúcar concreto: se refiere a una longitud de onda determinada del espectro visible (la línea D del sodio) y a una temperatura determinada; 20 °C. α ⋅100 20 (1) [α ]D = l⋅d⋅p p⋅d Hemos visto antes que 1 mL de solución contiene gramos de azúcar y, como consecuencia, 100 mL 100 contendrán la cantidad p·d = C donde C es la concentración expresada en gramos por 100 mL de solución. Si sustituimos p·d por el valor C en la fórmula (1) tendremos: α ⋅100 20 [α ]D = l⋅C de lo que se desprende α ⋅100 C= 20 l ⋅ [α ]D La concentración de un azúcar expresado en g por 100 mililitros de solución se puede obtener del ángulo de rotación del plano de luz polarizada, medido sobre un espesor conocido de la solución y del valor del poder rotatorio específico del azúcar en cuestión.
Oxidaciones y reducciones Hemos visto que los dos azúcares fundamentales que interesan a la enología, glucosa y fructosa, son susceptibles de transformarse uno en otro pasando a través de la misma forma intermedia con el mecanismo de tautomería cetoenólica, consecuencia de la presencia de un carbonilo y de un hidroxilo respectivamente sobre dos átomos de carbono vecinos. La presencia de un grupo carbonilo confiere a los azúcares otra propiedad, la de ser reductores. Es oportuno recordar el significado de los conceptos generales de oxidación y reducción. Oxidación significa asunción de cargas positivas, pérdida de cargas negativas, asunción de oxígeno o de un elemento electronegativo, pérdida de hidrógeno: reducción significa pérdida de cargas positivas, asunción de cargas negativas, asunción de hidrógeno, pérdida de oxígeno o de un elemento electronegativo. Cuando un compuesto se oxida, otro se reduce a la vez: se tienen siempre reacciones de óxido-reducción. Cuando el sodio reacciona con el cloro: 2 Na + Cl2 → 2 NaCl → 2 Na + + 2 Clel sodio ha asumido una carga positiva y se ha oxidado mientras que el cloro ha asumido una carga negativa y se ha reducido. Cuando el sodio reacciona con el agua: 2 Na + 2 H 2 O → 2 NaOH + H 2 → 2 Na + + 2 OH - + H 2 El sodio ha asumido una carga positiva y se ha oxidado, el agua se ha reducido, en parte, al asumir una carga negativa y, en parte, perdiendo oxígeno.
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Si consideramos los siguientes pasos: H
H H
C
H
H
C
O OH
H
H
H
O
O
C
H
C
OH
C
O
H
que llevan del metano al anhídrido carbónico a través del alcohol metílico, el aldehido fórmico y el ácido fórmico, tenemos una serie de oxidaciones que se manifiestan como una asunción de oxígeno o pérdida de hidrógeno; la serie inversa, que pasa del anhídrido carbónico al metano, es una serie de reducciones. El grupo aldehído puede ser oxidado a grupo ácido con la asunción de oxígeno: O
O R
+ 1/2 O2
C
R
C OH
H
En solución acuosa el fenómeno se interpreta como una deshidrogenación; en efecto, entra en juego otra propiedad del grupo aldehído, la de «adición», debida a la «insaturación» del doble enlace carbono-oxígeno: OH
O R
R
+ H OH
C
C
H
H
OH R
O
C H
OH
R
+ 1/2 O2
OH
H OH
+
C OH
Se forma como producto intermedio un hidrato del aldehido. Las capacidades aditivas del grupo carbonílico son muy importantes y veremos en seguida una consecuencia sobre la misma estructura de los azúcares. El tipo de oxidación que hemos efectuado con la intervención directa del oxígeno podemos obtenerla también por otra vía, empleando otro «oxidante», por ejemplo, el ion Cu2+: OH
O R
C
+
H2O
R
H
C H
OH R
C H
OH O
+ 2 Cu2+ + 2 OHOH
R
C
+ 2 Cu+ + 2 H2O OH
El adehído se ha oxidado a ácido y el ion cúprico se ha reducido a ion cuproso. Poder reductor de los azúcares En el caso de los azúcares esta reacción que se desarrolla en caliente y en solución fuertemente alcalina es fundamental porque en ella se basa precisamente el método de determinación de los azúcares denominados, por ello, reductores. Los azúcares que como glucosa y fructosa poseen el grupo carbonílico (aldehídico o cetónico) libre, es decir, no involucrado en otros enlaces, son «azúcares reductores», capaces de reducir el líquido de Fehling, que es una solución alcalina de cobre cúprico. Azúcares reductores son también la galactosa, la manosa y también las pentosas. El líquido de Fehling se prepara mezclando una solución de sulfato de cobre con una solución fuertemente alcalina, por adición de hidróxido de sodio, de tartrato sódico potásico o sal de Seignette. El cobre cúprico Cu2+ en solución alcalina lleva a la formación de hidróxido de cobre insoluble, el cual en caliente se transforma en óxido de cobre negro: Cu 2+ + 2 OH - → Cu(OH) 2 → CuO + H 2 O El cobre cúprico «precipita» en solución alcalina tanto en caliente como en frío. La adición de tartrato sódicopotásico impide la precipitación y la solución se colorea intensamente de azul. Los iones cobre reaccionan con el anión del ácido tartárico de forma particular, esto es, formando un «ion complejo» y precisamente un anión complejo cargado negativamente en el que además de los enlaces de valencia existen enlaces de
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«coordinación». Se dice que el cobre está «enmascarado» en un complejo y sin la posibilidad de llevar a cabo ciertas reacciones. Entre los iones cobre libres y «complejos» existe un equilibrio fuerte, aunque no totalmente, desplazado hacia los iones complejos: el complejo es «imperfecto» y el equilibrio está regulado por la ley de acción de masas.
Producto de solubilidad Hemos dicho que alcalinizando una solución de sulfato de cobre precipita hidróxido de cobre Cu(OH)2 Tratemos de comprender el fenómeno de la insolubilización del hidróxido de cobre. En solución se tiene la disolución siguiente: Cu(OH) 2 Cu 2+ + 2 OH Aplicamos la ley de acción de masas: 2
Cu 2+ OH - =K [Cu(OH)2 ] En la solución saturada, esto es, en presencia de hidróxido cúprico sólido, el número de las moléculas no disociadas que aparece en el denominador se hace constante ya que no es posible disociar más hidróxido cúprico y se puede escribir: 2
Cu 2+ OH - = L El valor L se denomina «producto de solubilidad» del hidróxido de cobre y es una constante a temperatura constante, lo que significa que, análogamente a lo que sucedía para el producto iónico del agua, en solución las cantidades respectivas de iones Cu2+ y OH- no pueden ser cualesquiera. Si se supera el producto de solubilidad definido, se produce «precipitación» del hidróxido cúprico hasta que queden en solución cantidades de ion cúprico y de ion hidróxido tales que el producto de solubilidad no sea superado. Pues bien, la adición de tartrato sódico-potásico a la solución de sulfato de cobre disminuye, con la formación del complejo cupritartárico, la concentración de los iones cobre hasta el punto que no se supera más el producto de solubilidad del hidróxido cúprico y, por tanto, el cobre puede quedar en solución incluso en presencia de una elevada concentración de iones hidroxilo. El complejo cupritartárico presenta la siguiente fórmula: H C
HO H
COOH O O O C Cu C O C H C O C COOH O HO H
COOH Cu2+
+
2
CH OH CH OH COOH
La concentración de los iones cúpricos en el líquido de Fehling está fuertemente disminuida, pero no anulada y pueden oxidar los azúcares por el mecanismo descrito antes. El líquido de Fehling es, pues, un artificio químico para poder mantener en solución iones cúpricos en medio fuertemente alcalino ya que el cobre cúprico se comporta como un oxidante de los azúcares reductores sólo en medio alcalino. Los iones cuprosos (monovalentes) Cu+, que se forman como producto de la reacción no forman complejos y su hidróxido CuOH es muy poco soluble y se transforma en caliente en óxido de color rojo vivo, óxido cuproso: 2 CuOH → Cu 2 O + H 2 O Trabajando en condiciones determinadas, esto es, con el empleo de soluciones azucaradas en concentración comprendida dentro de un cierto intervalo, con la cantidad prescrita de líquido de Fehling, con tiempos precisos de duración de la ebullición, etc., a cada cantidad de azúcar corresponde una precisa cantidad de óxido cuproso precipitado. Valorando directa o indirectamente el óxido cuproso precipitado se puede conocer el contenido en azúcares reductores de la solución azucarada.
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Formación de los complejos Hablando del líquido de Fehling hemos descrito un «ion complejo» formado entre el ion cúprico y el anión tartrato. Trataremos ahora brevemente la formación y las características de los iones cpmplejos, que en enología ejercen un papel determinante en relación con algunos enturbiamientos (especialmente la denominada «quiebra férrica») e intervienen modificando el equilibrio de óxido-reducción entre el hierro férrico y el hierro terroso. Un ion metálico en solución cargado positivamente crea en torno a él un campo eléctrico y tiende a rodearse de iones cargados con signo opuesto. Las fuerzas de tipo electrostático interactuantes entre los iones de signo opuesto son directamente proporcionales al producto de las cargas e inversamente proporcionales al cuadrado de la distancia y a la constante dieléctrica que vale 1 en el vacío. Si imaginamos por ejemplo un ion plata cargado positivamente y un ión iodo cargado negativamente, podremos representarlos como dos esferas en contacto con distancia entre las cargas igual a la distancia interatómica, indicada con R, mientras con e indicamos la carga unitaria del electrón. e2 La fuerza de atracción será 2 R
Fig. 7
Acción y constante de pantalla Podemos imaginar (como se ilustra en la fig. 7) otro ion iodo en contacto con el ion plata; en este caso existirá e2 una fuerza de atracción sobre cada uno de los iones iodo de 2 , pero también existirá una fuerza de repulsión R 2 2 e e entre los dos iones con la misma carga de = 0, 25 2 2 4R R
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Imaginaemos ahora tres iones iodo (fig. 7) que se situaran en los vértices de un triángulo equilátero. La fuerza de repulsión que se ejerce sobre cada ion iodo es la componente según la regla del paralelogramo de las fuerzas e2 de repulsión de dos cargas a distancia R 3 y, por tanto, con una fuerza La componente de las dos 3R 2 e2 e2 fuerzas vale evidentemente 2 2 cos 30º = 0,577 2 3R R Pasando de un solo ion coordinado, donde la fuerza de repulsión es nula, a 2 y respectivamente 3 iones e2 e2 coordinádos, se ejerce sobre cada ion una fuerza de repulsión respectivamente igual a 0, 25 2 y 0,577 2 R R Esta fuerza de repulsión se denomina «acción de pantalla» y los factores 0,25 y 0,577 «constantes de pantalla». Si al ion central positivo se unen más de tres iones negativos estos no pueden situarse sobre el mismo plano y se disponen simétricamente en el espacio. De forma análoga a lo indicado en los ejemplos precedentes, se podrán calcular las constantes de pantalla para las distintas disposiciones espaciales de los iones coordinados, obteniendo los datos presentados en la tabla l. TABLA 1 Número de iones coordinados 2 3 4 4 5 6 6 7 8 8
Disposición de los iones coordinados Lineal simétrica en los vértices del triángulo equilátero en los vértices del tetraedro en los vértices del cuadrado en los vértices del pentágono regular en los vértices del octaedro en los vértices del hexágono regular en los vértices del heptágono regular en los vértices del cubo en los vértices del octágono regular
S 0,25 0,58 0,92 0,96 1,38 1,66 1,83 2,30 2,47 2,80
Como se ve, las constantes de pantalla son menores para la disposiciones espaciales y estas serán, por tanto, las más probables. Si el ion central es n-valente en vez de monovalente como en el ejemplo de la plata y p son los iones e2 e2 coordinados, la fuerza de atracción sobre cada ion será n 2 mientras la acción de pantalla, permanece s 2 R R Por tanto, la fuerza con la que cada ion está coordinado al ion central resulta de la diferencia entre los dos valores indicados: e2 (n − s) 2 = K R Energía de formación El trabajo que se obtiene llevando un ion desde una distancia infinita hasta la distancia R, es decir, hasta e2 contactar su esfera con la del ion central, viene dado como dice la electrostática por (n − s ) 2 y es ésta la R energía que se libera para cada ion. Si los iones son p, la energía total de formación del complejo será: e2 U = p(n − s) 2 R Al ser la carga e constante, a igualdad de valor de la distancia R, la energía de formación del complejo es proporcional a m = p (n - s).
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La tabla 2 presenta los valores de m en función de la valencia del ion central y del número de coordinaciones: TABLA 2 m = p (n - s) n p=l =2 =3 =4 =5 =6 =7 =8 1 1,00 1,50 1,26x 0,32 x 2 3,50 4,26 4,24x 4,32 3,12 2,04 x x 3 7,26 8,32 8,12 8,04 4,90 4,24 x 4 12,32 13,12 14,04 11,90 12,24 5 18,12 20,4x 18,90x 20,24 6 26,04 25,90 28,24 . 7 32,90 36,24 8 44,24 De la tabla se desprende claramente que en la formación de iones complejos se obtiene más energía que en las sales simples, lo que explica y justifica precisamente su fórmación. También se ve cuales son los números de coordinación más probables para una carga dada del ion central: los números subrayados son los más probables, los señalados con una cruz presentan una cierta probabilidad. La experiencia confirma las resultadas previstas par la teoría de coordinación de Werner. A la acción de un campa eléctrica provocada par un ion cargada no están sujetas sólo los iones de carga opuesta, sino también moléculas neutras, pero polares, esta es, con una estructura asimétrica en la que los baricentros de las cargas positivas y negativas no coinciden. Este tipo de moléculas son orientadas por el ion y la pueden circundar ocupando las posiciones de coordinación. Moléculas polares son por ejemplo el agua, el amoníaco, las alcoholes y los ácidos, cuyas estructuras espaciales pueden esquematizarse así: H
H O
O
H
H
H
O
H R R
H O
H
Con el oxígeno del agua en el vértice de un triángulo y el nitrógeno del amoníaco en el vértice de una pirámide triangular, no se tiene coincidencia de los baricentros de las cargas de signo opuesto y la molécula resulta orientable en un campo eléctrico: lo mismo sucede para los alcoholes y los ácidos. En el caso del agua las moléculas orientadas rodean al ion que es «salvatado». El ion hidrógeno en particular lleva a la estructura H3O+ del ion hidronio. La que hemos expuesto explica por qué la función alcohólica del ácido tartárico ocupa una posición de coordinación del ion cúprico, formando el camplejo soluble fuertemente coloreado de azul del líquido de Fehling. Análogamente, si se añade amaníaco a una solución de sulfato de cobre, la solución se coloreará intensamente de azul por formación de ion complejo cupritetramino: H 3N
NH3
2+
Cu NH3
H3N
Para un ion bivalente camo el cobre el número de coordinación 4 es el más probable, como se exponía en la tabla correspondiente. Adiciones al grupo carbonílico Para comprender bien las propiedades de los azúcares hay que tener presente otra característica importante del grupo carbonílico C=O, y es su aptitud para reacciones de adición. Por ejemplo en solución acuosa el aldehído acético sufre una adición de una molécula de agua formando el hidrato del aldehído: H
H + H
CH3 C O
OH
CH3 C
OH
OH
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En solución alcohólica de elevada concentración el aldehído acético reacciona con dos moléculas de alcohol etílico para formar el acetal, compuesto presente en los destilados y que contribuye a sus características organolépticas: CH3 C
+ O
CH3
H
H HO
CH3 CH2
CH3 C
CH2 + HO
O
CH3
H CH3 CH2
CH3 C
OH
O
hemiacetal
acetal
O
CH2
CH3 CH2
Estructura ciclohemiacetálica Pues bien, un azúcar como la glucosa por ejemplo, puede sufrir una reacción de este tipo en el interior de la propia molécula. O
H
H
C H
C
OH
HO
C
H
H
C
H
C
OH C
H
C
OH
HO
C
H
OH
H
C
OH
OH
H
C
CH2 OH
O
CH2 OH
D-Glucosa
La molécula adquiere estructura cíclica que es la de un hemiacetal, un ciclohemiacetal; en efecto, al carbono adehídico queda unido un hidróxilo libre, análogamente al hemiacetal entre el aldehído acético y el alcohol etílico. La estructura cíclica introduce en la molécula un nueva átomo de carbono asimétrico, precisamente el carbono aldehídico que va a estar unido a 4 sustituyentes distintos. Pero la formación de un nueva centro de asimetría permite dos configuraciones distintas y, por lo tanto, dos tipos de azúcar: α y β - glucosa. Apenas 20 disuelto en agua la glucosa normal presenta un poder rotatorio específico [α ]D = + 109,6°: es el poder rotatorio de α - glucosa. Con el transcurrir del tiempo el poder rotatorio de la solución va disminuyendo hasta estabilizarse en el valor 20 constante [α ]D = + 52,3°. Cuando se disuelve en agua β - glucosa presenta un poder rotatorio específico [α ]D = + 20,5°. También en 20
este caso el poder rotatorio después de un tiempo asumirá el valor [α ]D = + 52,3°, que representa pues el poder 20
rotatorio de una mezcla en proporciones definidas y constantes de las dos formas α y β. Se dice que la glucosa está sujeta a «mutarrotación» y como la glucosa se comportan otros azúcares (manosa, galactosa). La estructura cíclica lleva en el caso de la glucosa a la formación de un anillo hexaatómico y en el de la fructosa a la de un anillo pentaatómico. Como el ciclo hexaatómico que contiene un oxígeno se llama pirano y el pentaatómico que contiene un oxígeno se llama furano, se habla también de glucopiranosa y fructofuranosa. O Pirano
O Furano
La representación de los azúcares se hace, pues, más correctamente por medio de fórmulas que ponen en evidencia el plano del ciclo hexaatómico con los otros grupos por encima o por debajo del plano:
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OH H
H OH H
OH
HO
OH H
OH
Disacáridos; polisacáridos El hidroxilo hemiacetálico es susceptible de eliminar agua con un hidroxilo de otra molécula de azúcar igualo distinta formando di, tri, polisacáridos. Si el agua se elimina entre los dos hidroxilos hemiacetálicos, los grupos carbonílicos estarán bloqueados y el disacárido carecería de poder reductor: la sacarosa es típica representante de este tipo de enlace. Si el enlace se establece entre el hidroxilo hemiacetálico de una molécula y un hidroxilo cualquiera de otra, el disacárido resultante contendrá aún un grupo carbonílico y tendrá poder reductor: un representante típico es la maltosa, que es un α -4- glucosido- glucosa. En los polisacáridos interviene siempre un hidroxilo hemiacetálico y el enlace puede ser de tipo α o β según que participen las formas α o β del azúcar. La importancia bioquímica del tipo de enlace (α o β) es muy grande porque existen enzimas específicos para la formación y para la excisión de un tipo u otro de los dos enlaces. Presentamos las fórmulas de la sacarosa y de la maltosa que son, respectivamente, α -glucopiranosa-β-fructofuranosa y α-4-glucósido-β-glucosa: CH2 OH OH H H OH H HO H OH O HO CH2 O H HO CH2 OH H OH H
CH2 OH OH H H OH H HO H OH
O
CH2 OH OH H H OH H OH H OH
α - glucopiranosa - β- glucopiranosa Maltosa
α - Glucopiranosa - β -fructofuranosa Sacarosa
En la uva en maduración tenemos cantidades de glucosa y fructosa casi equivalentes; la mitad de los azúcares reductores están constituidos por glucosa y la otra mitad por fructosa. Inversión En la uva y en el mosto están presentes pequeñas cantidades de sacarosa (hasta algunos gramos por litro), pero después del estrujado y por obra de las invertasas liberadas en el mosto, la sacarosa se «invierte», es decir, se excinde, con la intervención de una molécula de agua, en glucosa y fructosa en cantidades equimoleculares. Hemos usado el término «inversión» para indicar la excisión hidrolítica de la sacarosa en glucosa y fructosa. Este término es consecuencia de los datos polarimétricos que presentan los tres azúcares. La sacarosa tiene 20 20 [α ]D = + 66,5, mientras los poderes rotatorios de glucosa y fructosa son respectivamente [α ]D = + 52,3° y
[α ]D
20
= -93,0°. Como con la hidrólisis de una molécula de sacarosa se obtienen una de glucosa y otra de
fructosa y la mezcla equimolecular de estos dos azúcares presenta un poder rotatorio específico de [α ]D =93,0 20
+ 52,3 = -40,7°, mientras el poder rotatorio específico de la sacarosa antes de la hidrólisis era, como hemos dicho + 66,5°. Con la hidrólisis se produce, por tanto, una «inversión» del poder rotatorio que de positivo se hace negativo: de la medida polarimétrica del poder rotatorio antes y después de la inversión será posible llegar a la cantidad de sacarosa presente.
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Acidos urónicos Pasamos ahora al examen de dos compuestos que pueden considerarse, a la vez, ácidos y azúcares. Se trata del ácido glucónico y del ácido galacturónico, o mejor, del ácido d-glucónico y d-galacturónico: CHO
CHO H
C
OH
H
HO
C
H
C
OH
HO
C
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
HO
C
H H
COOH
COOH
Ac. D-Galacturónico
Ac. D-Glucónico
Los dos compuestos derivan de la oxidación a grupo ácido del grupo alcohólico primario respectivamente de la glucosa y de la galactosa. De los dos compuestos es el ácido galacturónico el que reviste particular interés enológico porque es la base de la constitución de las pectinas, coloides de naturaleza ácida presentes en la uva y que sufren una evolución en el curso de la vinificación. Anillo bencénico y carácter aromático Con el fin de poder comprender las propiedades de toda una serie de compuestos que revisten una gran importancia enológica es oportuno, entre las conceptos de química orgánica, incluir algunos relativos a la estructura del benceno y de particulares compuestos «aromáticos» que contienen en su molécula núcleos bencénicos y ciclos con características especiales. La química alifática estudia las moléculas orgánicas constituidas por cadenas abiertas de átomos de carbono. Cuando entre dos átomos de carbono existe un enlace que involucra la participación de dos pares de electrones decimos que estamos en presencia de un «doble enlace»; en el caso de un hidrocarburo, esto es, un compuesto sólo de carbono e hidrógeno, el más simple es el etileno CH2 = CH2. Se dice «in saturado» porque posee dos carbonos que pueden disponer de una valencia para ligarse a otros átomos o grupos de átomos. Por ejemplo, el doble enlace adiciona el bromo incluso en frio y así, el consumir bromo por parte de una substancia es en química orgánica índice de la presencia de un doble enlace. En el caso del etileno tenemos: H 2 C=CH 2 + Br2 → Br-CH 2 -CH 2 -Br y obtenemos el 1,2-dibromoetano. Dos átomos de carbono pueden estar unidos por un enlace que involucra a tres pares de electrones, es decir, por un «triple enlace» formando compuestos denominados de la serie acetilénica porque el compuesto más simple es precisamente el acetileno HC == CH. Los compuestos acetilénicos son todavía más insaturados que los etilénicos en el sentido de que cada carbono tiene dos valencias disponibles para dar-productos de adición. Del acetileno por adición de bromo se llega al tetrabromo derivado del etano: Br Br H
C
C
H
+ 2 Br2
H
C
C
H
Br Br
El benceno es un hidrocarburo en el que la relación entre carbono e hidrógeno es la misma del acetileno, pero que no presenta la cáracterísticas expuestas de la insaturación. Su fórmula bruta es C6H6 y los seis átomos de hidrógeno son sustituibles por otros elementos, por ejemplo el cloro, para obtener el hexaclorobenceno. Los 6 átomos de carbono presentan, pues, una estructura compacta y definida y están ligados entre ellos en un ciclo cerrado hexaatómico en el que, para respetar la fórmula bruta, cada carbono tiene una valencia ligada al hidrógeno, otras dos valencias coaligadas con otros dos átomos de carbono y la cuarta valencia no saturada. Los 6 electrones libres de la molécula asumen una configuración tal que justifica la relativa estabilidad de la molécula de benceno, que puede representarse con la fórmula:
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H H
H
H
H H
La molécula de benceno conserva todavía un carácter de in saturación y es susceptible de adicionar otro átomo para saturar los 6 enlaces disponibles; por adición de hidrógeno se llega por ejemplo al ciclohexano: + 3 H2
Con el objeto de poner en evidencia las propiedades aditivas y los enlaces insaturados existentes, el benceno se representa con la notación:
Esta notación pone en evidencia las valencias no saturadas y la posibilidad de movimiento de los enlaces. Independientemente de la representación formal, el químico ha adquirido consciencia del tipo de actividad del anillo bencénico, de su carácter «aromático», que permite más fácilmente las sustituciones en el carbono que las adiciones, con relativa pérdida del carácter aromático del ciclo. Fenoles, polifenoles, quinonas Sustituyendo en el benceno un hidrógeno por un hidroxilo se obtiene el fenol: OH
O + H+
A diferencia del hidroxilo alcohólico, el hidroxilo fenólico posee propiedades ácidas y en medio fuertemente alcalino cambia el hidrógeno con el metal dando un fenato. Doble enlace, triple enlace, grupo alcohólico primario, grupo alcohólico secundario, grupo aldehídico, grupo fenílico (fenilo se llama al radical obtenido del benceno eliminando un átomo de hidrógeno), hidroxilo fenólico, son todos «grupos funcionales», que conservan, incluso en las más diversas estructuras moleculares, características y reactividades propias. Es tarea del químico orgánico asumir plena consciencia de estas características: frente a un compuesto, el químico orgánico lo observa inmediatamente en términos de grupos funcionales. En el curso del estudio de las substancias presentes en la uva y en los vinos se encontrará toda una serie de grupos funcionales característicos. Se denominan «orto» las posiciones sobre dos átomos contiguos del anillo bencénico, «para» las posiciones sobre las diagonal es del hexágono, mientras las posiciones sobre dos átomos de carbono separados por un tercero son posiciones «meta». OH OH
OH OH
o-difenol
OH p-difenol
OH m-difenol
Entre los fenoles presentan interés particular los difenoles con los hidroxilos en posición orto y para. Estos son facilmente oxidables en las respectivas quinonas.
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OH
O OH
O
+ 1/2 O2
+ H2O o-quinona O
OH
+ H2O
+ 1/2 O2
OH
O p-quinona
Hemos dicho que el ciclo bencénico posee un carácter particular que hemos indicado con el término «aromático», que asume un significado técnico independientemente de su valor etimológico. El carácter «aromático» está ligado a la existencia de un ciclo hexaatómico con 6 electrones disponibles para realizar en la molécula una configuración estable. Que sea esta disposición electrónica la que confiere el carácter aromático, independientemente de los átomos que constituyen el ciclo, lo demuestra la existencia de otros tipos de ciclos aromáticos que contienen átomos distintos del carbono (heterociclos). Sales de pirilio y flavilio Consideramos la estructura del γ-pirano:
O γ-Pirano
Se trata de un heterociclo (hetero en griego significa otro), es decir, de un ciclo que contiene un átomo, el oxígeno, distinto del carbono. Compuestos de este tipo son oxidables en medio ácido para dar productos de tipo salino denominados sales de «pirilio». H + C + HCl + 1/2 O2 O
Cl-
H2O + +
O
O
Se ve que pasando el pirano al pirilio se establece una estructura hexaatómica que lleva una carga positiva en el oxígeno y que presenta una distribución electrónica similar a la del benceno y asume, por tanto, características aromáticas. Compuestos de este tipo son sales de «oxonio» o de «carbono» si se tiene en cuenta el posible paso a la estructura en que la carga positiva está localizada sobre el carbono. Las dos estructuras con la carga positiva respectivamente en el oxígeno y en el carbono se denominan formas «mesómeras» y «mesomería» el estado intermedio entre las dos. La mesomería es una isomería en la que se producen sólo cambios de electrones, a diferencia de la «tautomería» donde se tienen cambios de un átomo en la molécula. En la naturaleza no se conocen derivados del pirilio, sino derivados del fenilbenzopirilio o «flavilio»:
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+
O
Flavilio
Estos compuestos naturales son los «antocianos», los colorantes de las flores y de los frutos.
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CAPITULO CUARTO
Los pigmentos rojos de la uva Antocianinas y anticianidinas En la uva tinta se encuentran cinco tipos de antocianos los cuales son, a la vez, sales de flavilio y glucósidos porque están unidos por enlace glucosídico (es decir, enlace en el que interviene el hidroxilo hemiacetálico) a una molécula de azúcar. Los antocianos están localizados en el hollejo, mientras la pulpa es incolora de forma que se pueden obtener mediante suave presión, vinos blancos de uvas tintas. Sólo alguna escasa variedad de uva (tintoreras) presenta la pulpa coloreada. Los antocianos se llaman también antocianinas y sus derivados privados del azúcar se denominan antocianidinas. Vamos a exponer las cinco antocianidinas presentes en la uva para aclarar su estructura: se trata de derivados hidroxilados y metoxilados del flavilio. Las fórmulas siguientes ilustran la estructura de las antocianidinas de la uva: R R OH O
HO
+
R´
+
O
HO
OH OH OH OH 1R = R´= OH ; delfinidina 2R = OCH3; R´=OH; petunidina 3R = R´= OCH3; malvidina
4R = OH ; cianidina 5R = OCH3; peonidina
Monoglucósidos y diglucósidos Como hemos dicho, los antocianos son glucósidos de las antocianidinas. A este respecto conviene hacer una observación importante. La vid cuyo fruto interesa en enología corresponde a la especie Vitis vinifera, perteneciente al género Vitis, al que pertenecen también otras especies. Debido a que Vitis vinifera es sensible a una serie de plagas y enfermedades importadas de América, una de las cuales, de origen entomológico causada por Philloxera vastratix es la más importante, se recurrió al injerto sobre pie americano resistente al insecto para evitar la desaparición de la viticultura. De la misma forma, para luchar contra las enfermedades (mildiu, oidio) se hicieron hibridaciones entre Vitis vinifera y vides americanas (rupestris, riparia, berlandieri, etc.) con el objeto de obtener un híbrido resistente a las enfermedades y capaz de dar un fruto susceptible de ser vinificado con buenos resultados. Aunque el esfuerzo de los genetistas e hibridadores ha dado a veces resultados no despreciables, en general la calidad del fruto de los híbridos es mediocre y en todos los estados adheridos a la O.LV (Organización Internacional de la Viña y el Vino) la ley prohibe vinificar el producto obtenido de los híbrido s productores directos, producto que no es considerado vino. Pues bien, Vitis vinifera tiene tales características genéticas que sus antocianos son sólo monoglucósidos mientras los antocianos contenidos en frutos de otras especies de Vitis están, preferentemente, bajo forma de diglucósidos y bajo esta forma se encuentran mayoritariamente en los híbridos. Por cromatografía en papel o en capa fina es posible reconocer la presencia en un vino de los diglucósidos de las antocianinas y detectar una adición de hasta un 5 - 10% de un vino de híbridos. Estos resultados fueron obtenidos por PASCAL RIBEREAU-GAYON del Instituto de Enología de la Universidad de Burdeos. Posteriormente se ha planteado alguna duda sobre la absoluta ausencia de diglucósidos en Vitis vinifera pero, todavía hoy, su presencia es generalmente considerada como índice de adición de vino de híbridos: para los híbrido s que producen uva
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blanca no existe tal posibilidad objetiva de identificación. Las fórmulas siguientes representan el mono y diglucósido de la malvidina: OMe
OMe OH
O
HO
OH
+
OH
O OH
OMe
O HO
OH
OH
O
HO
OH
OH
+
O
HO
OMe
OH
O O
OH
OH
O OH
OH Malvidina-3-monoglucósido
Malvidina-3-5-diglucósido
Antocianinas aciladas Existen también, entre los antocianos de Vitis vinifera, formas aciladas, es decir, formas en las que una molécula de un ácido es esterificada a un hidróxilo del azúcar; se trata del ácido cinnámico y más generalmente de ácido paracumárico o paraoxicinnámico: O H OH H
HO
El ácido p-oxicinnámico contiene un doble enlace y es, a la vez, un ácido insaturado y un fenol. OMe OH O
HO
+
OMe OH
O OH
OH
OH
OH
O O
C O
Malvidin-3-(p-cumaril-4-glucosido)
La proporción relativa de los diversos antocianos en las distintas variedades de Vitis vinifera no es la misma y en base a la composición en antocianos es posible, si no distinguir una variedad de otra, sí al menos reagrupar las variedades en familias similares por composición antociánica. Esto puede ser de utilidad para tratar de distinguir objetivamente el origen de los vinos, aunque en los vinos, las posteriores modificaciones a que están sujetos los antocianos hacen más difícil la solución del problema. Equilibrios de los antocianos en solución Vamos a ver las propiedades de las antocianinas y para ilustrarlo usaremos las fórmulas de los derivados sin azúcares, es decir, de las antocianinas. Expongamos una serie de equilibrios y reacciones a los que se halla sometida la molécula del antociano en solución acuosa: las formulas se refieren a la malvidina.
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OMe
OMe OH
O
HO
OH
+
OH + OH-
OMe
O
HO
OMe
OH OH
OH OMe
OH
OMe
OH O
HO
OH
+
OMe
O
HO
+ SO3H-
OMe SO3H
OH
OH
OH
OMe
OMe
OH OH
OH
+
O
HO
OMe
O
HO
+ H2
OMe
OH
OH
OH
OH
OMe
OMe OH
OH
O
HO
+ H2O
OMe
OH
HO
OMe O
OH OH
OH OH
OMe
OMe
OH
O
OH O
HO
O
HO
pH
OMe
OMe
OH
OH
OH
OH OMe O
pH
O O
HO
OMe OH OH
Como se desprende de la primera de las reacciones indicadas arriba, en agua existe un equilibrio, funcion del pH, entre la forma oxonio coloreada y la “pseudo-base” incolora:
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A + + OH - AOH Al equilibrio es aplicable la ley de acción de masas: [ AOH ] =K´ pero OH - = 10-14 H+ A + OH - y, por tanto
[ AOH ] H + A +
=K
y pasando a logaritmos:
pH = pK + Log
[ AOH ] A +
Según algunos autores que han trabajado con el 3-monoglucósido de la pelargonidina y el 3-monoglucósido de la malvidina, el valor del pK está en torno a 3 por lo que, para el pH del vino, los antocianos estarán en un 50% en forma coloreada roja y en un 50% en forma incolora. La acidificacfón con un ácido mineral de una solución de antocianos o de un vino produce una gran intensificación del color y su intensidad disminuye, por el contrario, al aumentar el pH. Como también se desprende de las fórmulas expuestas, de forma análoga se comporta el anhídrido sulfuroso, es decir, el ion SO3H-. El anhídrido sulfuroso reacciona en agua para dar el ácido sulfuroso: SO 2 + H 2 O H 2SO3 H + + HSO3-
El ácido sulfuroso es un diácido con dos constantes de disociación, expresadas en agua por los siguientes valores logarítmicos: pK1 = 1,77 pK2 = 7,08. Es evidente que para los valores del pH de los mostos y de los vinos sólo la primera función está fuertemente disociada y así, el ácido sulfuroso está bajo forma de ion bisulfito. Como se desprende de la fórmula, el equilibrio con los antocianos es análogo al del hidroxilo y lleva también a la formación de un producto incoloro. Por este motivo la adición de anhídrido sulfuroso, de bisulfito o de metabisulfito al vino provoca decoloración: cuando desaparece el sulfuroso, por vía física o por oxidación, reaparece el color. Los antocianos son, aún, susceptibles de ser reducidos a derivados incoloros que pueden ser reoxidados (ver ecuaciones precedentes): a este mecanismo se puede atribuir una cierta disminución del color observable cuando, durante la fermentación, el medio se hace cada vez más reductor. Las fórmulas expuestas muestran, aún, otras posibilidades de evolución de la molécula antociánica, a través de una serie de equilibrios regulados por el pH, las cuales suponen, a veces, la apertura del heterociclo central. Las antocianinas con dos grupos hidroxi en orto en el anillo aromático lateral (petunidina, delfinidina, cianidina) pueden formar complejos de coordinación con metales pesados (hierro férrico, aluminio) dando estructuras complejas insolubles de color azul que son el origen de la llamada «quiebra azul» de los vinos. Se ha observado que el grupo metoxilo de los antoéianos y también, como veremos, de los taninos es muy estable y no representa una fuente de alcohol metílico. También el enlace glucosídico de los antocianos parece mostrarse muy estable, sin hidrólisis con el tiempo, al pH del vino.
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CAPITULO QUINTO
Los taninos Estructura y propiedades de los taninos Los taninos son particulares compuestos fenólicos caracterizados por su capacidad para combinarse con las proteínas y otros polímeros como los polisacáridos. Esta característica explica sus propiedades en el curtido de las pieles haciéndolas imputrescibles al reaccionar con el colágeno y explica también su astringencia causada por las precipitaciones de las proteínas y de las glucoproteínas de la saliva. Usados junto con proteínas añadidas se comportan como clarificantes formando con las proteínas asociaciones insolubles que, atravesando la masa, engloban a las partículas suspendidas y dejan el líquido límpido. Los taninos inhiben a las enzimas porque se combinan, desnaturalizándola, con la fracción proteica que constituye la apoenzima, es decir, aquella estructura molecular capaz de un cierto tipo de reacciones químicas: éste es el motivo por el que la actividad enzimática del mosto disminuye rápidante con el tiempo y la del vino resulta muy inferior. Para formar complejos estables con las proteínas las moléculas fenólicas deben tener dimensiones moleculares relativamente grandes para poder establecer un número suficiente de enlaces; si la molécula de tanino se hace demasiado grande resulta incapaz, por motivos estéricos, de ligarse con los centros activos de las proteínas y el enlace se hace menos sólido. Se puede decir que los enlaces más estables entre proteínas y taninos se obtienen para pesos moleculares de estos últimos comprendidos entre 500 y 3.000. Flavonoles o catequinas Los taninos presentes en la uva y en los vinos son polímeros condensados de los 3-flavonoles. La constitución de los 3-flavonoles se ilustra en la fórmula siguiente: R OH O 1
HO
3 5
4
R´
2
3-flavonoles (catequinas) OH
OH R=R´= H R=OH R´=H catequina R=R´=OH galocatequina
Por catequina se entiende el 5, 7, 3', 4' tetraoxiflavon-3-ol con fórmula bruta C15H14O6 . El compuesto presenta dos centros de asimetría y, por tanto, puede dar lugar a cuatro formas ópticamente activas y a dos formas racémicas: se tiene la serie de las catequinas y de las epicatequinas. Todas las formas previsibles aparecen. En los mostos y en los vinos, como generalmente en la naturaleza, están presentes sobre todo la ( + )-catequina y la (- )-epicatequina. Las procianidinas En los mostos y en los vinos se encuentran compuestos, dímeros y polímeros, denominados procianidinas porque calentados en presencia de ácidos minerales se transforman en cianidinas y catequinas o epicatequinas.
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La transformación en cianidinas permite una determinación colorimétrica de estos compuestos independientemente de su grado de polimerización. Las procianidinas naturales son de las deshidrocatequinas y su formación puede ser representada así: -2H -2H 2 C15 H14 O6 → C30 H 26 O12 → C30 H 24 O12
La deshidrogenación puede implicar a más de dos moléculas con formación de deshidrocatequinas torneras y oligomeras: es lo que ocurre en el curso del envejecimiento de los vinos tintos. En los mostos y en los vinos jóvenes los taninos presentan pesos moleculares medios en tomo a 500 - 700 (dímeros, trímeros), mientras en los vinos viejos se tienen condensaciones con pesos moleculares medios en tomo a 2.000-3.000 (diez moléculas condensadas). Como ya se ha indicado, existen dos tipos de procianidinas dímeras con fórmula bruta respectiva C30H26O12 y C30H24O12. Como resultado de los trabajos de WEINGES, la estructura de las procianidinas dímeras con fórmula bruta C30H26O12 es la representada en la fórmula siguiente: OH OH
H O
HO
H OH H
OH
O
HO
OH
H H
OH
OH OH
De la fórmula resulta que el dímero se constituye estableciendo un enlace entre el C4 de una molécula de catequina o epicatequina y el C8 o el C6 de la otra molécula, con eliminación de dos átomos de hidrógeno. La estructura presentada por el dímero muestra 5 centros de asimetría que pueden dar lugar teóricamente a 32 formas ópticamente activas: 4 de estas formas han sido aisladas por WEINGES y cols. Cuando intervienen más de dos moléculas, la condensación prosigue siempre formando un enlace entre el C4 de una catequina (o epicatequina) ya condensada y el C8 y C6 de una molécula de catequina (o epicatequina) monómera. La estructura de las procianidinas dímeras con fórmula bruta C30H24O12 no ha sido establecida aún con absoluta seguridad, aunque los trabajos de WEINGES han aportado válidos elementos químicos, físicoquímicos y espectrales para la siguiente fórmula propuesta por él: OH
HO
O 2
HO
H
HO HO
H H
4 O OH 8´´
HO OH
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OH H
O
En la fórmula propuesta se ve que de los dos hidrógenos desaparecidos, uno se ha eliminado del carbono C2 y el otro de un hidroxilo fenólico de la otra molécula de catequina condensada, con formación de un puente de oxígeno. Se observa que en lo que respecta a los mecanismos exactos de polimerización tanto de las catequinas como de las procianidinas, no se tienen todavía datos experimentales suficientemente seguros. Reacciones con la vainillina El fraccionamiento de los taninos según el grado de polimerización se presenta experimentalmente muy difícil a causa de su particular estructura química que lleva fácilmente a la formación de complejos estables con muchos materiales con los que se ponen en contacto. Así, el uso de la filtración sobre gel que en muchos casos ha permitido óptimos fraccionamientos en función del peso molecular (coloide s de naturaleza glucídica y proteica), en el caso de los taninos polimerizados no ha habido éxito. Se ha tratado de obtener información sobre el grado de polimerización a través de valoraciones químicas relacionadas, de algún modo, con las dimensiones moleculares de los taninos. Observamos que cuando hay polimerizaciones de más moléculas de flovonol o de procianidina, el número de posiciones libres en 6 y 8 disminuye con el aumento del número de moléculas polimerizadas. Pues bien, la vainillina, un aldehído aromático, es susceptible de reaccionar en un medio sulfúrico con las posiciones 6 y 8 para formar primeramente un compuesto de adición que después, por eliminación de agua, lleva a derivados coloreados: HO O CH3
vainillina
C
O
H R HO
HO
OH
O
O CH3
1
O
2
+
C
4
H
R´
3 OH
HO
HO
R HO HO
HO
C
8
O
2 4
5 HO
OH
O
6
H
H3C
1
7
3
R´
OH HO
La reacción de las procianidinas con la vainillina da, pues, coloraciones tanto menos intensas cuanto más elevado es el grado de polimerización, porque son menores los puntos de ataque libres. Por el contrario, la reacción que lleva a la formación de antocianidinas en medio clorhídrico no parece muy influida por el grado de polimerización, obteniéndose una fácil hidrólisis del polímero. Si se emplea, pues, la relación entre la intensidad colorante obtenida con la reacción de la vainillina y la obtenida con la determinación de las procianidinas (V/PC), se obtendrán valores decrecientes cuanto más elevado sea el grado de polimerización.
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Flavones En la uva existen también pigmentos amarillos de estructura parecida a la de los flavones, una estructura similar a la de los antocianos, flavonoles y prociamidinas, que posee un grupo cetónico en la molécula. El pigmento de este tipo, predominante en la uva tanto blanca como tinta, es la isoquercitrina, un glucósido en posición 3 de la quercetina, la cual, a su vez, es un derivado del flavón. Exponemos las estructuras del flavón, de la quercetina y de la isoquercitrina: OH OH O
HO
O
HO
OH
OH
OH
O
2-fenilbenceno-γ −pinone ó flavón
O
quercetina OH OH
O
HO
OH O OH
O
OH OH O
OH
isoquercitrina
Los flavones presentes en la uva no parece que puedan justificar el color de los vinos blancos, atribuido a ellos durante mucho tiempo; en efecto, su solubilidad y la cantidad en que se encuentran en los vinos blancos no explican la intensidad de color, que sería debida más bien a productos de una incipiente oxidación de los taninos. Los polifenoles totales Una valoración completa de los polifenoles totales se efectúa determinando el «índice permangánico», esto es, oxidándolos oportunamente con una solución titulada de permanganato o, más recientemente, por medio de reactivo de FOLIN-CIOCALTEU, constituido por una mezcla de ácido fosfotúngstico (H3PW12O40) y de ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40) que, oxidando los fenoles, se reduce dando una mezcla de óxidos de tungsteno (W8O23) y de molibdeno (Mo8O23) de color azul. El color desarrollado se evalúa midiendo la densidad óptica a la longitud de onda de 765 nanómetros después de haber operado en condiciones bien definidas. El valor obtenido, teniendo en cuenta las diluciones realizadas, da los g/L de polifenoles totales, expresados en ácido gálico. Las expresiones densidad óptica y longitud de onda encontrarán explicación en las exposiciones siguientes.
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CAPITULO SEXTO
Conceptos de espectrometría Hemos hablado de substancias colorantes rojas de la uva, de variaciones del color de los antocianos en solución en función del pH del medio, de decoloraciones por obra del anhídrido sulfuroso, de reacciones coloreadas con la vainillina o con el reactivo de FOLIN-CIOCALTEU. Vamos a precisar ahora cómo se puede evaluar una intensidad de color y expresarla con valores numéricos. Espectro electromagnético y longitud de onda Las radiaciones luminosas son vibraciones electromagnéticas transversales a la dirección de propagación, como ya hemos expuesto a propósito de la luz polarizada. Si indicamos con T el tiempo de una vibración completa (periodo) y con V la velocidad de propagación de la luz, tenemos la relación : λ = TV; o, indicando con ν el número de vibraciones por segundo (frecuencia), tenemos ν = 1/T y la “longitud de onda” puede ser expresada también como: V λ= υ La velocidad de propagación de la luz sabemos que es del orden de 300.000 Km/sg. A esa velocidad tenemos radiaciones de frecuencia muy diversa y, como consecuencia, de longitud de onda muy distinta: el conjunto de todas esas radiaciones constituye el espectro de las radiaciones electromagnéticas. De este espectro, a nosotros nos interesa en particular el campo visible y del ultravioleta. Este campo parte del extremo rojo y pasa a través del naranja, el amarillo, el verde, el violeta, hasta el citado ultravioleta, donde las radiaciones no son visibles para el ojo, pero apreciables y medibles con instrumentos oportunos. A nosotros nos interesa un campo del espectro que va, como decíamos, de la longitud de onda de 800 a 200 mµ. La milimicra es la milésima de micra, es decir, la milésima de la milésima de milímetro. La milimicra se indica también como nanómetro, el prefijo nano significa 10-9 ; en efecto, un nanómetro es igual a una millonésima de milímetro, es decir, a la milésima de micra o milimicra. Ley de Lambert-Beer Una solución de una sustancia que absorba las radiaciones luminosas en el ámbito del espectro visible y ultravioleta que hemos indicado, interfiere con la luz según la ley de Lambert-Beer. Si consideramos un espesor de solución iluminado por un haz de rayos paralelos e indicamos con I0 la intensidad luminosa incidente y con I la intensidad luminosa transmitida se cumple la relación siguiente: I = I0 e –Klcs donde e es la base de los logaritmos neperianos, K una constante, c la concentración de la solución y s el espesor atravesado por la luz. De la expresión anterior se obtiene: I Ln = − K ⋅ c ⋅ s I0 Para pasar de los logaritmos neperianos a los decimales se multiplica por una constante (2,3..) y la expresión procedente se transforma: I − Log = K ⋅ c ⋅ s I0 El logaritmo con signo cambiado de la fracción de luz transmitida para el espesor de 1 cm se llama “extinción” o “densidad óptica” y es directamente proporcional tanto a la concentración como al espesor. Manteniendo constante el espesor, la extinción es directamente proporcional a la concentración: a una concentración doble corresponderá un valor doble de la extinción y así sucesivamente de modo que de la medida de la extinción se podrá obtener el valor de la concentración. En la práctica se opera de la manera siguiente. Una cubeta de caras planas y paralelas, ópticamente trabajada, con espesor rigurosamente definido, se llena de disolvente puro (por ejemplo agua), se pone sobre la dirección del haz luminoso y se registra la luz transmitida, llevando la escala del instrumento de medida, conectado a una célula fotoeléctrica o a un fotomultiplicador, sobre el 100 % de luz transmitida. Se establece de este modo lo
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que en el lenguaje técnico se conoce como “blanco”. Después se pone en una cubeta idéntica la solución de la substancia coloreada en el mismo disolvente: se tendrá solo un cierto porcentaje de luz transmitida, el logaritmo con signo cambiado del cual será proporcional a la concentración de la substancia disuelta. Naturalmente, si se quiere conocer el valor numérico de la concentración se necesita trazar una “curva de referencia”, es decir, hacer previamente una serie de medidas con soluciones de concentración conocida. Llevando sobre un diagrama las concentraciones en función de la extinción medida se tendrá, en el ámbito de aplicación de la ley de LAMBERT-BEER una recta de referencia que permitirá obtener el valor de la concentración a partir del valor de la extinción. Además de dibujar un diagrama es posible, a partir de los datos experimentales, calcular la ecuación de la recta, con la posibilidad de valorar la precisión y la reproducibilidad de la determinación colorimétrica. Espectro de absorción Si respecto al blanco habitual medimos la extinción para una substancia en solución y para todas las longitudes de onda, por ejemplo, en el visible y ultravioleta, y llevamos sobre un diagrama cartesiano la extinción en función de la longitud de onda, obtendremos el “espectro de absorción” de esa substancia, espectro cuya forma es característica de la substancia misma y tiene, por lo tanto, un valor cualitativo. El espectro de absorción de un compuesto presenta, frecuentemente al menos, un máximo y se puede escoger aquella longitud de onda para la que se tiene mayor absorción y, como consecuencia, la máxima sensibilidad en la medida. Presentamos a modo de ejemplo los espectros relativos a vinos de diferente edad, determinados por P. SUDRAUD:
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CAPITULO SEPTIMO
Comparación entre la composición de las diferentes partes del racimo Ya hemos adquirido el conocimiento de los elementos necesarios para establecer e interpretar una comparación entre la composición de los raspones o escobajos, de lo hollejos y de la pulpa de la uva. Expondremos los datos obtenidos por RIBREAU-GAYON y PEYNAUD relativos a uvas bordelesas. Los datos corresponden al año 1951 y, aunque se pueden criticar, dan una representación significativa de las diferencias de composición entre las diferentes partes del racimo. Sería oportuno repetir este tipo de análisis para la determinación de substancias como el ácido málico y el cítrico
Sección de la baya de uva 1 = pulpa 2 = pepitas 3 = pedúnculo 4 = haz de tejidos vasculares (pincel)
Un examen atento de los datos de la tabla 3 pone en evidencia la notable diferencia de composición entre las diferentes partes del racimo, en particular los ácidos orgánicos están mucho más salificados en el raspón y en el hollejo que en la pulpa, aunque la cantidad global referida al mismo peso de substancia sea del mismo orden. TABLA 3
pH
Acidos libres
Acidos salificados
Suma de cationes
Acido tartárico
Acido málico
Acido cítrico
Suma de aniones
Polifenoles solubles(g)
Raspón Sauvignon Sémillon Cabernet-Sauv. Merlot Hollejo Sauvignon Sémillon Cabernet-Sauv. Merlor Pulpa Sauvignon Sémillon Cabernet-Sauv. Merlot
Proporción %
Composición química del racimo. Contenidos en meq por 1.000 g de raspón, por 1.000 g de hollejo y por 1.000 g de pulpa (RIBEREAU-GAYON y PEYNAUD, 1951)
6,8 5,9 8,1 5,3
4,08 4,30 4,52 4,45
88 58 67 73
102 104 138 110
190 162 205 183
94 86 62 29
80 80 98 150
6 5 10 4
180 171 170 183
5,4 6,8 12,0 15,2
14,0 21,0 19,6 16,2
4,15 4,30 4,05 3,79
94 67 80 55
148 116 90 65
242 183 170 120
99 64 79 80
132 110 75 40
9 3 4 3
240 177 158 123
2,6 3,4 6,8 6,4
82,3 76,0 74,6 79,0
3,30 3,38 3,20 3,22
123 109 107 98
43,8 49,3 43,6 58,6
167 158 151 157
90 69 54 57
79 84 91 72
2,5 2,3 2,9 1,8
171 156 148 131
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CAPITULO OCTAVO
Substancias nitrogenadas Las substancias nitrogenadas de la uva juegan un papel de primera importancia no sólo por su aporte directo en la nutrición, sino por el significado que tienen para el desarrollo y alimentación nitrogenada de las levaduras en la fermentación. Nitrógeno amoniacal y orgánico Hay que distinguir entre nitrógeno amoniacal y nitrógeno orgánico. El nitrógeno amoniacal es aquél en forma de sales amónicas y que se puede liberar como amoníaco por alcalinización. El amoníaco es recuperable por destilación bloqueándolo con una solución titulada de ácido fuerte (por ejemplo ácido clorhídrico) donde neutraliza al ácido formando cloruro amónico: titulando con álcali el exceso de ácido se obtiene, por diferencia, la cantidad de nitrógeno amoniacal.
NH +4 + OH - NH 4 OH NH 3 + H 2 O NH 3 + H 2 O → NH 4 OH NH 4 OH + HCl → NH 4 Cl + H 2 O Por ejemplo, de 100 mL de mosto diluido con agua y alcalinizado con hidróxido de magnesio recuperamos por destilación el amoníaco sobre 10 mL de H2SO4 N/10. Titulando con sosa décimonormal el exceso de ácido se tiene un consumo de 4 mi de sosa. 10 - 4 = 6 mi de ácido decimonormal habrán reaccionado con el amoníaco destilado. 6 mL de ácido N/10 neutralizados por el amoníaco existente en 100 mL de mosto, o sea, 6 mL de ácido normal serán neutralizados por el amoníaco presente en 1 litro de mosto. Pero 6 mI de ácido normal son 6 meq; el amoníaco se comporta como una base monobásica, es decir, 6 meq de amoníaco por litro. Cada molécula de amoníaco contiene 1 átomo de nitrógeno y, por tanto, en este caso, 1 miliequivalente de nitrógeno es la milésima parte del átomogramo, es decir, 14 mg ya que el peso atómico del nitrógeno es 14. 6 meq/L de nitrógeno representan, pues, 6 x 14 = 84 mg/l de nitrógeno amoniacal. El nitrógeno que no se encuentra en forma amoniacal se denomina nitrógeno orgánico y está representado esencialmente por los aminoácidos, polipéptidos y proteínas. Los aminoácidos Los aminoácidos son compuestos que contienen junto a un grupo ácido un nuevo grupo funcional, el grupo amino primario -NH2, ligado al carbono vecino del carboxilo. En la naturaleza se trata generalmente de los llamados α-aminoácidos, indicándose como a la posición próxima al carboxilo. Así la glicina es el ácido a-aminoacético H2N - CH2-COOH, la alanina es el ácido αaminopropiónico CH3-CH-COOH, la fenilalanina es el ácido α-amino-β-fenil-propiónico CH2 – CHNH2 COOH, la serina es el ácido α-amino-β-oxipropiónico C6H5- CH2 – CHNH2 - COOH La cisteína contiene en su molécula, además del grupo ácido y del grupo amino, un nuevo grupo funcional, el grupo tiol -SH, que es análogo azufrado del grupo alcohólico -OH: la cisteína es el ácido α-amino-βtiolpropiónico, HS - CH2- CHNH2 - COOH La cisteína se encuentra habitualmente como producto de oxidación dímero, la cistina: H2C
S
CH H2N
COOH
S
CH2 HC
NH2
COOH
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Estos aminoácidos azufrados entran en la constitución de las proteínas que son, como veremos, polímeros con enlace peptídico de los aminoácidos y constituyen las substancias más importantes de la célula y de los tejidos vivos. Entre los aminoácidos azufrado s el más importante es la metionina, que es el éster metílico del ácido αamino-β-tiol-butírico: H3C - S - CH2 - CH2 – CHNH2 - COOH Como veremos, la uva y el mosto no están' provistos de los aminoácidos azufrados necesarios para la producción de las proteínas constituyentes de las células de las levaduras, las cuales deberán sintetizarlas partiendo de los compuestos azufrados disponibles en el mosto, es decir, anhídrido sulfuroso y sulfatos. Citemos aún alguno de los aminoácidos más importantes. El ácido aspártico o aminosuccínico: HOOC - CH2 CHNH2 - COOH; se trata de un ácido diácido que posee realmente características ácidas como ilustraremos enseguida. Al contrario, la lisina o ácido α, ε-diaminocaprónico posee dos grupos amínicos en la molécula y tiene características básicas: H2N - CH2 - CH2 - CH2 - CH2 - CHNH2 - COOH Citaremos aún la prolina, un aminoácido cíclico muy abundante en la uva y en los vinos, normalmente un aminoácido entre los más representativos a nivel cuantitativo:
COOH
N H
Se trata de un aminoácido cíclico en el que está presente un grupo amino secundario. En efecto, análogamente a los alcoholes, las aminas pueden ser primarias, secundarias y terciarias según el número de radicales orgánicos a que están unidas: R R
CH2 OH
CH OH R1 R
R
NH2
R R2 C R3
OH
R NH
R1
N
R2
R1
Examinemos más detenidamente las características de un aminoácido que indicaremos genéricamente como R - CHNH2 - COOH. Tenemos contiguos un grupo ácido y un grupo básico; grupo ácido es aquél que, como el carboxilo, cede iones hidrógeno, grupo básico es aquél capaz de liberar iones hidroxilo o, lo que es lo mismo en solución acuosa, capaz de ligarse a iones hidrógeno y, como consecuencia, dejar libres los correspondientes iones hidroxilo del agua. Por ejemplo, el amoníaco se comporta como una base al ser capaz de tomar iones hidrógeno para formar el ion amonio: NH 3 + H-OH → NH 3 + H + + OH - → NH 4+ + OH El hidróxido de amonio es una base fuerte porque está completamente disociada, el amoníaco se comporta, sin embargo, como una base débil, a consecuencia del equilibrio: NH 4 OH NH 3 + H 2 O Este equilibrio está notablemente desplazado a la derecha y consiente, pues, la presencia de pocas moléculas de hidróxido amónico en solución y, como consecuencia, de pocos hidroxilos. He aquí por qué una solución de amoníaco se comporta como una base débil aunque el hidroxilo amónico esté completamente disociado. Características análogas al amoníaco poseen las aminas: R-NH 2 + H 2 O → RNH 3+ + OH -
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Los anfoiones El grupo amino acepta iones hidrógeno, el grupo carboxílico los cede y, en solución acuosa, todo esto sucede según equilibrios en función de la concentración de hidrogeniones. Escribamos, para facilitar la comprensión, los dos equilibrios separadamente:
R-NH 2 + H + → RNH 3+ R-COOH R-COO- + H + Es evidente que un aumento en la concentración de hidrogeniones hará aumentar el número de moléculas con una carga positiva en el nitrógeno y disminuir el número de moléculas con carga negativa en el carboxilo. En el caso de los aminoácidos los dos fenómenos suceden en la misma molécula: O R
CH COOH
H2N +
NH2
R
CH COOH
CH
C
NH2
R1
H N
CH COOH
+
O
H 2O
R1
Se tiene, por tanto, la posibilidad de formación de un «anfoión», es decir, un ion que puede llevar una carga positiva y una carga negativa sobre la misma molécula. pH isoeléctrico El grupo carboxílico es un grupo ácido débil, con una constante de disociación pequeña, esto es, con un valor del pK relativamente elevado: en solución muy ácida estará poco o nada disociado, mientras su disociación aumentará progresivamente con el aumento del pH. Para el grupo amino ocurrirá exactamente lo contrario. Habrá pues, un determinado pH para el cual las moléculas tendrán el mismo número de cargas posiitivas y negativas, este valor del pH se llama «pH isoeléctrico» . A pH isoeléctrico la moléculas, sometidas a la acción de un campo eléctrico, no se mueven y se comportan como si fueran eléctricamente neutras ya que poseen el mismo número de c gas positivas y negativas. Enlace peptídico Los aminoácidos pueden enlazarse entre ellos de la forma siguiente: O R
CH COOH NH2
H2N +
CH COOH R1
R
CH NH2
C
H N
CH COOH
O
+
H 2O
R1
Se forma entre el carboxilo y el grupo amino un «enlace peptídico» y al quedar libres todavía un grupo carboxílico y un grupo amino se tiene la posibilidad de continuar la concatenación con participación de otros aminoácidos obteniendo una serie de «polipéptidos» y proteínas: se alcanzan de esta manera valores de los pesos moleculares de varios millares. Si tenemos en cuenta el gran número de aminoácidos existentes en la naturaleza (en el mosto se han identificado 24), las distintas posibilidades de enlace y concatenación resultantes dejan fácilmente prever una enorme variedad de estructuras proteicas, que son aquéllas que caracterizan los diversos tejidos animales y vegetales y la gran variedad de enzimas o catalizadores biológicos que, como veremos enseguida, están todos constituidos por una proteína (apoenzima) asociada a un grupo activo o coenzima: es la particular estructura de las proteínas la que determina la especificidad de acción en relación a un determinado substrato. Damos ahora las fórmulas y los valores medios encontrados en los mostos para algunos aminoácidos, determinados por vía microbiológica por LAFON-LA FOURCADE y PEYNAUD, advirtiendo que las determinaciones microbiológicas no coinciden siempre con las químicas.
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O
NH
OH
H2N
O
O HO
OH
N H
OH
NH OH Arginina 327 mg/L
O
O
NH2
Prolina 266 mg/L
NH2
Treonina 258 mg/L
O
O
Ac. glutámico 173 mg/L
O H2N
OH
HO
OH
NH2
NH2
Serina 69 mg/L
Glicina 22 mg/L
O
OH
NH2
NH2
Leucina 20 mg/L
Lisina 16 mg/L
Histidina 11 mg/L
O
O O
OH
Isoleucina 7 mg/L
O
OH
O
NH2
OH
NH2
OH NH2 Valina 6 mg/L
OH
OH NH2 Fenilalanina 5 mg/L
NH2
NH2
Ac. aspártico 2 mg/L
Metionina 1 mg/L
Hemos visto que las substancias nitrogenadas pueden dividirse en nitrógeno amoniacal y nitrógeno orgánico, este último constituido esencialmente por aminoácidos y sus productos de polimerización. Nitrógeno total Existe un método famoso debido a KIELDAHL, que permite, en un producto cualquiera, llegar a la determinación de la cantidad de nitrógeno contenido bajo cualquier forma. Es el método de determinación del denominado «nitrógeno total». Atacando en caliente con ácido sulfúrico concentrado, en presencia de un catalizador, cualquier tipo de substancia orgánica, el carbono y el hidrógeno se transforman respectivamente, en CO2 y H2O y el nitrógeno, bajo cualquier forma, en amoníaco, es decir, en sulfato amónico. El ácido sulfúrico en caliente se comporta también como oxidante, reduciéndose a ácido sulfuroso. Si después de la destrucción de la substancia orgánica se alcaliniza el medio, se puede recoger por destilación el amoníaco que se desarrolla sobre ácido titulado y titular por retorno con sosa, análogamente al caso del nitrógeno amoniacal. Composición nitrogenada de la baya Tenemos, pues, la posibilidad de determinar el nitrógeno total sobre cualquier parte de la baya. Ade / s, existen métodos para determinar el denominado nitrógeno amínico, esto es, el correspondiente a los aminoácidos libres, el nitrógeno proteico, esto es, el correspondiente a las proteinas (se hace una precipitacion preventiva seguida de la determinación del nitrógeno total sobre el precipitado) y se determina el nitrógeno polipeptídico, es decir, el relativo a los polímeros de los aminoácidos con bajo peso molecular. La tabla 4, debida a RIBEREAU-GAYON y PEYNAUD, expresa la composición nitrogenada, referida a 1.000 bayas, de las mismas variedades de uva de las que, anteriormente, hemos expuesto la composición en
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ácidos y polifenoles. Conviene señalar que los valores relativos al nitrógeno polipeptídico han sido obtenidos con métodos convencionales, que respetan sólo aproximadamente, el contenido real de los mostos. Las proteínas resultan de la polimerización con enlace peptídico de los aminoácidos. Pero, como hemos observado anteriormente, existen aminoácidos como la lisina que contienen otro grupo amino además de aquél en posición a, que podemos considerar «neutralizado» por el carboxilo contiguo y que, por tanto, tendrán características básicas: otros aminoácidos que tienen un segundo carboxilo en su molécula presentarán, al contrario, características ácidas. En la molécula proteica existe, pues, un cierto número de grupos amínicos y carboxilos no implicados en el enlace peptídico y que podrán llevar o no una carga positiva o negativa según la acidez del medio: también en este caso existe un pH isoeléctrico para el que la proteína se comportará como eléctricamente neutra. A los pH de los mostos y de los vinos las proteínas se presentan cargadas positivamente. TABLA 4 Substancias nitrogenadas en la baya madura – mg por 1000 bayas (RIBEREAU-GAYON y PEYNAUD)
N total
Pepitas
Hollejos
N parte líquida
NH4
N orgánico
NH2
N proteico
N polipeptídico
Composición nitrogenada de la parte líquida
Peso de 1000 bayas (g) Sauvignon Sémillon Cabernet-Sauv. Merlot
N parte sólida
1600 1830 1320 1620
1930 1590 1270 1510
465 386 523 630
990 865 530 525
480 636 214 355
83 98 50 154
397 265 164 201
204 139 65 84
45 55 25 47
148 71 74 70
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CAPITULO NOVENO
Substancias minerales Las substancias minerales presentes en la uva son las que se encuentran representadas en las cenizas. Como ya hemos dicho, los cationes ligados a los ácidos orgánicos están en las cenizas bajo forma de carbonatos y, una pequeña parte, en forma de óxidos, especialmente el magnesia cuyo carbonato puede descomponerse, en pequeña medida, a 550°C, temperatura a la que se produce la incineración: CO3Mg
MgO + CO2
El elemento más representativo es el potasio seguido del calcio que en la uva es más abundante que el magnesia, mientras en el vino, a causa de la precipitación de tartrato de calcio, puede ocurrir al contrario. El sodio es generalmente menos abundante, salvo en el caso particular de uvas provenientes de viñedos cultivados al borde del mar. La tabla 5 presenta datos obtenidos de la literatura que ilustran la composición en cationes de las cenizas de varias partes del racimo: los valores están referidos a 1 gramo de cenizas. Como orden de magnitud, se puede decir que la pulpa da 4-5 g/kg de cenizas. Junto a los cationes tenemos presencia de aniones minerales, representados esencialmente por fosfatos, sulfatos y cloruros. Para los fosfatos se puede dar un valor del orden de 500 mg/kg de pulpa expresados como PO4, es decir, unos 5 milimoles, y 190 mg en la cantidad de hollejo correspondiente a 1 kg de pulpa, esto es, 2 milimoles. Se tienen, pues, unos 7 milimoles de fosfatos por kg de bayas. La presencia de los fosfatos es determinante para el desarrollo de la fermentación alcohólica, en particular para la fase denominada glicolisis en la que entran en juego, como veremos, una serie de reacciones de fosforilación. TABLA 5 Composición de substancias minerales (mg por gramo de cenizas).
K Ca Mg Na Fe
Raspón 362 97 41 16 6
Hollejo 360 150 30 14 6
Pepitas 230 228 51 10 3
Pulpa 480 52 34 24 2
Los sulfatos no superan, en general, los 0,6-0,7 g/kg en la baya, expresados como sulfato potásico, es decir, 7 miliequivalentes y normalmente aparecen en cantidades inferiores. Conviene tener presente que la ley permite el enyesado, esto es, la adición de sulfato de calcio. El enyesado produce un aumento de la acidez real del mosto: se produce una precipitación de tartrato neutro de calcio a expensas del bitartrato, con liberación de ácido tartárico: 2KHT + CaSO Ca T + K2SO4 +
H2T
El enyesado equivale pues a una sustitución del crémor por una cantidad equivalente de ácido tartárico. En presencia del crémor como cuerpo de fondo, se puede disolver otro en sustitución del precipitado como tartrato de calcio y se puede obtener un aumento de la acidez total. Esta práctica no está muy difundida en Italia pero persiste en algunas regiones extranjeras como en la zona de Jerez, productora del famoso vino homónimo. La ley establece el límite, en los vinos, de 1 gil de sulfatos expresados en sulfato potásico, es decir, 11,5 meq/L de sulfatos. Los cloruros representan en la baya entre 20 y 200 mg/kg expresados como NaCl, esto es, de 0,3 a 3 meq/kg.
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Se observa una cierta correspondencia entre los contenidos en cloruros y los contenidos en sodio, como si la vid asimilase los dos elementos en forma de cloruro sódico. Sólo en raros casos, sobre uva de viñedos cultivados a orillas del mar, se han encontrado cantidades de cloruros de hasta 1 g/kg expresados en cloruro sódico.
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CAPITULO DECIMO
Composición de las pepitas En la exposición que hemos hecho hasta ahora sobre la composición de la uva no hemos abordado la de las pepitas. Hemos esperado a la descripción de las substancias nitrogenadas en sus diversas formas antes de precisar la composición de las pepitas en las cuales las substancias nitrogenadas están ampliamente representadas junto a contenidos notables de substancias grasas. De las pepitas se extrae un aceite, aceite de pepita, que tiene usos alimentarios e industriales. Constitución de las grasas No nos ocuparemos a fondo del aceite de las pepitas porque saldríamos del camino de la enología para adentrarnos en el de la industria de los aceites vegetales. Sólo haremos una pequeña introducción a la constitución de las grasas que son ésteres de un polialcohol que es el principal entre los productos secundarios de la fermentación, la glicerina y los ácido grasos, esto es, compuestos constituidos por una larga cadena de hidrocarburos y terminando con un grupo carboxílico. La glicerina tiene la siguiente fórmula: CH2 HO
CH2 OH CH OH
Entre los ácidos grasos indicamos uno saturado, el palmítico, C15H31 - COOH ó CH3 - (CH2)14 - COOH, y uno insaturado, el ácido oleico, C17H33 - COOH ó CH3 -(CH2)7 -CH = CH -(CH2)7 - COOH. Las grasas son ésteres (es decir, productos derivados de la eliminación de agua entre el hidroxilo de un grupo ácido y el de un grupo alcohólico) entre la glicerina y los ácidos grasos: O CH2 O CH2 CH O R3
O
R1 R2
O O
Cuando en las grasas predominan los ácidos grasos insaturados como el oleico tenemos los aceites, mientras que si predominan los ácidos grasos saturados como el palmítico tenemos las grasas sólidas. Ahora podemos presentar la composición de las pepitas, que constituyen del 3 al 6% del peso de la uva; la composición expuesta en la tabla 6 se refiere a 100 g de pepitas. TABLA 6 Composición de las pepitas (3-6% de la uva). Valores referidos a 100 gramos.
Agua Sustancias glucídicas Aceite Polifenoles Sustancias nitrogenadas Sustancias minerales Acidos grasos
25 – 45 34 – 36 13 – 20 4–6 4 – 6,5 2–4 1
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Las substancias glucídicas están constituidas esencialmente por almidón que se acumula en la semilla como substancia de reserva, también substancias de reserva son las nitrogenadas constituidas fundamentalmente por proteínas y substancias de reserva son, en fin, las grasas acumuladas también en la semilla. Una última observación para completar el conocimiento sobre la composición del racimo: la cantidad de azúcares contenida en los raspones o escobajos no supera los 10 g por kg de raspones: la cantidad de azúcares encontrada en los hollejos obtenidos de 1.000 bayas oscila entre 0,7 y 3 gramos. Estos datos explican por qué en la descripción de la composición de las diversas partes de racimo no se han expresado los contenidos en azúcares: los azúcares reductores son patrimonio, esencialmente, de la pulpa de la baya.
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CAPITULO UNDECIMO
La pruina y las substancias aromáticas La pruina El hollejo de la baya está recubierto por un estrato de substancia cerosa que le confiere un aspecto aterciopelado, influyendo sobre el color del racimo: la pruina. Al microscopio electrónico la pruina se presenta como una serie de escamas imbricadas unas sobre otras. . Según los trabajos de RADLER está constituida por dos tercios de ácido oleanólico, una substancia de estructura compleja, que recuerda la de los esteroles y que actúa, análogamente a los esteroles y a algunas grasas de cadena larga, como un activador de la fermentación. El otro tercio de la pruina está constituido por un centenar de compuestos: alcoholes, ésteres, ácidos grasos y aldehídos, todas de cadena larga. He aquí la estructura del ácido oleanólico, el .constituyente principal de la pruina: H3C
CH3
CH3
CH3
COOH
CH3 HO H3C
CH3 ácido oleánico
Las substancias aromáticas Las substancias aromáticas se pueden dividir en tres grupos: el primero comprende substancias presentes en la uva con aromas característicos, como el de Moscatel, que pasan como tales al vino confiriéndole el típico perfume; el segundo grupo comprende un gran número de compuestos que derivan del metabolismo de las levaduras y que son esencialmente responsables del carácter «vinoso» del vino: por fin, se tiene un tercer grupo de substancias sin olor particular, provenientes en parte de la uva y en parte originadas en el curso de la fermentación, las cuales se transforman muy lentamente dando origen durante el envejecimiento a otras substancias responsables del «bouquet», el perfume característico de los grandes vinos. Los alcoholes terpénicos y los terpenoides de la uva y del vino La gran diferencia entre las uvas aromáticas y las de sabor simple es debida a la presencia, en las primeras, de sensibles contenidos en compuestos terpénicos mientras que sólo aparecen en pequeña cantidad o trazas en las segundas. Gracias a esta diferencia es posible actualmente distinguir objetivamente, por medio del análisis cualitativo y cuantitativo de dichos compuestos, las dos clases de uvas y los vinos que derivan de ellas. La presencia de los compuestos terpénicos en uvas aromáticas representa una ventaja relevante para la valoración objetiva de la calidad del producto ya que son estas substancias las que determinan la intensidad del aroma y permiten seguir la entidad de las transformaciones químicas que han tenido lugar en el medio. Por el contrario, en las uvas de sabor simple es difícil correlacionar su composición química con la calidad de los vinos obtenidos de ellas. En efecto, los compuestos volátiles presentes en los mostos de uvas con sabor simple están casi totalmente representados por aldehídos y alcoholes de seis átomos de carbono, de ácido
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caprónico, de alcohol bencflico, de a-butirolactona, junto a otras numerosas substancias presentes en cantidades infinitesimales, inferiores a 1 µg/L. Ninguno de los compuestos indicados es característico de una variedad particular y, por tanto, las diferencias organolépticas entre los distintos vinos hay que buscadas en la composición del medio que, de alguna forma, determina la formación de compuestos volátiles o durante la fermentación o por sucesivos y lentos fenómenos de transformación química: no teniendo elementos suficientes para correlacionar la calidad del vino con la composición de la uva no parece útil, en el momento actual, efectuar estudios para establecer objetivamente el momento óptimo de vendimia y vinificación de las uvas con sabor simple, sean blancas o tintas, salvo la determinación de los macroparámetros que indican una maduración adecuada. Las uvas aromáticas, al contrario, se prestan muy bien a ser estudiadas para evaluar su calidad, ya que la calidad de los vinos que producen está íntimamente ligada a su cuadro aromático y éste a la naturaleza y cantidad de los terpenos que lo determinan. Los compuestos terpénicos presentes en las uvas aromáticas son los siguientes: a) Alcoholes monohidroxilados: linalol, a-terpineol, nerol, geraniol, citro nelol, hotrienol Entre estos, el compuesto más activo organolépticamente es ellinalol, que presenta en el mosto un umbral de percepción en torno a los 50 µg/L: ellinalol es también el alcohol terpénico más representado cuantitativamente. El umbral de percepción para los otros alcoholes terpénicos es mucho más ele vado que el dellinalol. b) Oxidos: linalolóxido A furánico, linalolóxido B furánico linalolóxido C piránico, linalolóxido D piránico, nerolóxido, óxido de rosas Gis, óxido de rosas trans. El poder aromático de estos compuestos es modesto y cuando se forman a partir del linalol y del nerol provocan una disminución del aroma. c) Alcoholes di y trihidroxilados: 3,7 - dimetil - 1,5 octadieno - 3,7 - diol (diendiol 1); 3,7 dimetil- 1,7 octadieno - 3,6 - diol (diendioI2); 3,7 - dimetil- 1 octen - 3,7 - diol (endiol); 3,7 - dimetil- 1 - octen - 3,6,7 triol (triol). Estos compuestos presentan cierta importancia porque de ellos se originan otras substancias organolépticas activas. d) Glucósidos terpénicos: como se desprende de los trabajos de DI STEFANO, existen en los mostos de uvas aromáticas cantidades substanciales de linalol en forma combinada, es decir, no extraíble con disolventes y sin actividad organoléptica: DI STEFANO ha demostrado que existe una estructura muy probablemente de linalilarilanóxido en la moscatel blanco del Piemonte. Estos terpenos combinados, aunque no ejercen una influencia organoléptica directa, constituyen una importante reserva de aroma liberando lentamente con el tiempo el alcohol terpénico que desaparece progresivamente en el vino transformándose en compuestos con poder aromático bajo o nulo. Desde el punto de vista cuantitativo se puede señalar que, en los mostos recién obtenidos, se encuentran algunos centenares de µg/L de linalollibre; algunos µg/L de diendiol 1; contenidos superiores a 100 µg/L de linalolóxido C; en torno a 50 µg/L de óxido D, de diendiol 2 y de geraniol; alrededor de 10-20 µg/L de linaloló xido A y B, de a-terpineol, herol y cifronelol; algunos µg/L de nerolóxido y trazas de óxidos de rosas. De estos datos resulta evidente la influencia preponderante dellinalol sobre el aroma, también debido a su particularmente bajo umbral de percepción. Los compuestos de naturaleza glucosídica están ampliamente representados: .para el linalol se encuentran contenidos superiores a los de la forma libre. Los contenidos en nerol y geraniol son notablemente más elevados en el hollejo que en la pulpa, pero no son extraíbles del hollejo sin enriquecer excesivamente el mosto en taninos. Conviene señalar que no es segura la presencia del a-terpineol y del hotrienol en la uva ya que las pequeñas cantidades podrían derivar también, en el curso de la extracción, de la transformación dellinalol y del diendol 1, respectivamente, o de la hidrólisis de los glucósidos. Los compuestos terpénicos libres se extraen fácilmente con pentano: cloruro de metileno (60:40 V/V). Si aún se somete el residuo de extracción a destilación en corriente de vapor se encuentran notables cantidades de alcoholes terpénicos en el destilado: por obra del calor se produce la liberación de los alcoholes terpénicos libres de sus productos de combinación.
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Las reacciones de los alcoholes terpénicos a pH = 3 Como han demostrado USSEGLIO-TOMASSET y DI STEFANO, al pH del mosto y con calor, partiendo de soluciones de linalol, nerol y geraniol se llega a obtener presencia contemporánea de linalol, nerol, geraniol y a-terpineol. Sucede que cada uno de los tres alcoholes terpénicos no solo se convierte parcialmente en los otros dos, sino que da cantidades muy relevantes de a-terpineol, el cuál parece ser el compuesto al que tienden a transformarse los otros dos alcoholes terpénicos. Las reacciones de los terpenoides di- y trihidroxilados a pH = 3 En medio ácido y bajo influencia del calor los terpenoides sufren, según WILLIAMS, profundas transformaciones. 1) Diendiol 1
t hotrienol + nerolóxido. H+
2) Diendiol 2
t trans a cis anhidrofuranlinalolóxidos. H+
3) Triol
t H+
4) Endiol
t H+
trans y cis furanlinalolóxidos
2,6,6-trimetil-2-.vinil-tetrahidropirano + H 2,2-dimetil-5-(l-metilpropenil) tetrahidrofurano+ linalol + mircenol + ocimenoll + ocimenol 2 + α-terpineol.
Las reacciones arriba indicadas se desarrollan lentamente incluso a la temperatura ambiente de la bodega y es por esto que durante la conservación se produce una disminución y una desaparición del aroma característico de los vinos aromáticos, con una tendencia a la acumulación de α-terpineol el cual desaparece a su vez por envejecimiento aún más prolongado: para conservar a lo largo del tiempo las características organolépticas de los vinos aromáticos es necesario mantenerlos a temperaturas inferiores a 10 ºC. Presentamos ahora las fórmulas de los principales compuestos presentes en las uvas y en los vinos aromáticos: junto a los números correspondientes a las fórmulas se da el nombre de los respectivos compuestos: OH
OH
1 = diendiol 1
O
5 = 2,6,6-tri,etil-2 -vinil-tetrahidropirano
OH
OH
OH
OH OH
OH
2 = diendiol 2
O
6 = transanhidridofuranlinaloloxido
3 = triol
O
7 = 2,2-dimetil-5(1-etilpropenil)tetradrofurano
HO 4 - endiol
O
8 = cis-anhídrofuranlinaloloxido
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OH HO
HO O
9 = trans-furanlinaloloxido
OH
O
O
10 = cis-furanlilanololoxido
12 = linalol
11 = noreloxido
OH
OH
HO
OH 13 = hotrienol
14 = mircenol
15 = cis-ocimenol
16 = trans-ocimenol
OH
17 = α-terpineol
Del mosto de uvas aromáticas se extraen los compuestos responsables del cuadro aromático con disolventes orgánicos y después de la concentración del extracto en un pequeño volumen, se procede al análisis por cromatografía de gases, preferiblemente con columnas capilares y en presencia de un estándar interno, lo que permite una precisa valoración cuantitativa incluso de pequeñísimas cantidades. El método mejor consiste en someter la muestra a dos extracciones sucesivas, una con pentano y la otra con mezcla azeotrópica pentano: cloruro de metileno (60:40 V/V). El residuo de la doble extracción se somete a destilación en corriente de vapor, recogiendo un volumen igual de destilado que se extrae con disolvente. Las figuras 9, 10 Y 11 representan los cromatogramas obtenidos de un mosto de Moscatel blanco del Piemonte fermentado hasta el desarrollo de 6,50 de alcohol: la figura 9 representa el cromatograma obtenido después de la extracción con pentano; la figura 10 el de después de la extracción con pentano: cloruro de metileno y la figura 11 representa el cromatrograma obtenido después de destilación con corriente de vapor del residuo de extracción. La tabla 7 indica la serie de compuestos encontrados, cada uno de los cuales aparece en los cromatogramas con el número correspondiente. Compuestos volátiles no terpénicos Al tratarse de un fermentado de vino aromático, junto a los compuestos de naturaleza terpénica se evidencia, en los cromatogramas citados, toda una serie de componentes volátiles que son producto del metabolismo de las levaduras y que, por tanto, se encuentran en todos los vinos en los que contribuyen, como por ejemplo los ésteres no etílicos, evolucionan con el tiempo hacia una disminución ya que son producidos por las levaduras en mayores cantidades que los compatibles con el equilibrio de esterificación. Otros compuestos como el lactato, succinato, malato de etilo y, en general, los ésteres de los ácidos fijos, aumentan con el tiempo como consecuencia del avance de un proceso de esterificación.
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En la tabla 8 se exponen los contenidos más representativos de los componentes volátiles no terpénicos presentes en las muestras de las que se han obtenido los cromatogramas comentados. En cuanto a los constituyentes del «bouquet» que se desarrolla lentamente en botella, en ambiente reductor, en el curso del envejecimiento, no se tiene actualmente conocimiento ni siquiera aproximado; con excepción de algún compuesto organolépticamente activo en vinos particulares (pirazina), no se tiene ningún conocimiento preciso de las substancias que, a lo largo del tiempo, confieren las características organolépticas típicas de un gran vino: precisamente por ser típicas de un vino específico es razonable pensar que se trata de compuestos derivados de determinados precursores específicos de la variedad que ha dado lugar al vino. TABLA 7 1) etilbutlrato 40) acetato de lanoloilo 2) 2-CH3 propanol-l 41) no identificado 3) 2,6,6 trimetll-2-viniltetrahidropirano 42) 2,3-butanodiol 4) isoamilacetato 43) no identificado 5) l-butanol 44) γ -butiro lactona 6) limoneno 45) Ho-trienol 7) isoamil alcohol 46) mircenol 8) trans anhidrofuranilnalol oxido 47) acido butirico 9) 2,2-dlmetil-5-(1-metil-propenil)48) etil capriato tetrahidrofurano 49) ocimenol-1 10) etil capronato 50) acido isovalerianico 11) cis anhidrofuranilnalol oxido 51) 12) etilpiruvato 52) ocimenol-2 13) hexilacetato 53) α-terplnol 14) acetoino 54) etil 9 decan enoato 15) cis 3 hexenil acetato 55) 3-metil tiopropanol-1 16) no identificado 56) no identificado 17) etil-lactato 57) no identificado 18) hexanol 58) trans-piran linaloloxido 19) trans-3-hexanol 59) 1,1,6-trimetil dlhidro naftaleno (simpson 20) 3-etoxi-propanol-1 1978 chemistiry and industry) 21) cis-3-hexanol 69) cis-plran llnalol oxido 22) no identificado 61) citronelol 23) trans furan linaloloxido 62) nerol 24) no identificado 63) 2-fenil etllacetato 25) etil caprilato 64) 4-OH-butirato deetllo 26) acido acetico 65) damascenona 27) furfurol 66) acido capronico 28) nerol oxido 67) geraniol 29) cis-furano llnaloloxido 68) alcohol benzilico 30) n-oitilacetato 69) n-( 3-metil butil) acetamida 31) no identificado 70) no identificado 32) benzaldehido 71) 2-feniletanol 33) 3-hidroxi butirato de etilo 72) dien diol-1 34) vitis pirano (simpson y col. 1977 chemistry 73) endiolacido 2 furancarboxillco and industry) 74) dietilmalato 35) vitis pirano isomero 75) acido caprico 36) no identificado 76) dien diol 2 37) 2,3-butanodiol 77) acido caprico 38) linalol 78) no identificado 39) 1-octanol 79) no identificado
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TABLA 8 Butirato de etilo Acetato de isoamilo Capronato de etilo Acetato de hexilo Caprilato de etilo Capriato de etilo Decan-9-enoato de etilo Acetato de 2-fenil etilo Piruvato de etilo Acetoino Lactato de etilo 4-hidrovi butirato de etilo Succinato de etilo Malato de etilo Hexanol Trans-3-hexenol Cia-2-hexanol 2-fenil etanol y-butiro lactona Acido butírico Acido isovalerianico Acido caprónico Acido caprílico Acido cáprico
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136 631 917 147 203 267 8 200 149 1707 3257 677 35 742 14 69 5963 1936 491 574 1415 1877 5004
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CAPITULO DUODECIMO
Vitaminas y enzimas Las vitaminas de la uva Las vitaminas son substancias indispensables para la vida de los organismos y no sólo para los organismos superiores, sino también para levaduras y bacterias y actúan como catalizadores .exógenos, es de ir, provienen de fuera, de los procesos metabólicos. Ejercen, pues, una acción análoga a las hormonas con la diferencia de que estas últimas son producidas por el organismo mismo mientras que las vitaminas deben ser tomadas del exterior. La uva contiene una cierta cantidad de vitamina e o ácido ascórbico, no muy elevada, con valores máximos en torno a 90 mg/kg. También están presentes las 10 vitaminas que se adscriben al grupo B y que no tienen tanta importancia como posible aporte vitamínico en la dieta una vez que pasan al vino, sino como factores muy útiles para el desarrollo de la fermentación alcohólica en relación con la actividad de las levaduras. En el paso de mosto a vino, y especialmente después de los procesos de estabilización, el contenido vitamínico original, que es muy modesto, decrece notablemente: entre los muchos valores del vino no se puede, honestamente, incluir el de ser una bebida vitamínica, salvo por el aporte de mesoinosita y por la acción vitamínica PP de los polifenoles. En la tabla 9 presentamos el orden de magnitud de los contenidos en vitaminas de la uva madura según los análisis efectuados con métodos microbiológicos por PEYNAUD y LAFOURCADE, observando que la naturaleza de los métodos utilizados permite una precisión bastante inferior a la indicada por las cifras significativas de los valores presentados: TABLA 9 Vitaminas B en uva madura. Valores medidos para 1000 bayas Tiamina 253 µg Riboflabina 3,6 µg Ac. pantotéico 660 µg Nicotinamida 700 µg Piridoxina 260 µg Biotina 2,2 µg Mesoinositol 297 mg Ac. aminobenzoico 14 µg Ac. fólico 1,3 µg Colina 24 mg OH OH OH OH
HO
N O
OH
OH O
N
N
OH
N
O OH
Ac. ascórbico Vitamina C
Cl
NH N Riboflavina Vitamina B2
O
S
N
Tiamina Vitamina B1
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O
OH HOOC
CH2
H N CH2
CH3
CH C
C
O
CH3
CH2
OH
N
Ac. pantoténico OH HO
OH
NH2
OH
N OH COOH
HO
OH
HO
OH
OH N Piridoxina Vitamina B6
OH Mesoinositol
NH2 Ac. amino-benzoico
En la uva y, como consecuencia, en el mosto existen enzimas que juegan un papel importante en la transformación de algunos constituyentes. Además, todos los fenómenos fermentativos que implican la actividad de levaduras y de bacterias son el resultado de una serie de actividades enzimáticas que se desarrollan de forma coordinada en el complicadísimo y eficientísimo laboratorio que es la célula viva. . Los enzimas La levadura es una fuente tan abundante de enzimas que estas substancias han. tomado su propio nombre de levadura; en efecto, enzima deriva del griego “EVSVUN”, en la levadura. Los enzimas pueden definirse como catalizadores biológicos. Catalizadores son substancias que aceleran reacciones químicas posibles sin cambiar el estado de equilibrio y sin participar en la reacción, en el sentido de que aparecen otra vez inalteradas en el medio. Está claro que los enzimas participan activamente en las reacciones y que sin su intervención no se desarrollarían de forma sensible, pero su participación se manifiesta a nivel de asociaciones intermedias lábiles con los productos que deben reaccionar, de manera que, al final de la reacción, el catalizador se encuentra libre de nuevo. Este comportamiento de los enzimas es la causa por la que actúan en pequeña cantidad; son suficientes pequeñas cantidades de enzima para catalizar la transformación de grandes cantidades de substrato. Especificidad de los enzimas Existen notables diferencias entre los enzimas y los catalizadores inorgánicos. Los enzimas son mucho más sensibles a las variaciones de temperatura y de reacción del medio y sufren una disminución de actividad con el tiempo, es decir, son bastante frágiles. Además los enzimas presentan una elevada especificidad; cada enzima cataliza una reacción concreta y expresa su acción sobre un determinado grupo de compuestos que presentan una estrecha analogía de estructura molecular. Pero la especificidad de un enzima llega más lejos. Por ejemplo, en la destrucción hidrolítica del almidón actúa la amilasa que escinde la cadena de glucosa unida por enlace glucosídico, pero detiene su acción al nivel del disacárido maltosa. Entonces interviene, para la posterior destrucción a glucosa, otro enzima: la maltasa. La especificidad enzimática es tan elevada que exige una relación estereoquímica entre enzima y substrato. Así, por ejemplo, la maltasa actúa sólo sobre a-glucósidos como la maltosa, es decir, aquellos glucósidos donde el hidroxilo ciclohemiacetálico tiene la configuración a, y no sobre β-glucósidos; la lactosa, sin embargo, actúa sobre β-galactósidos como la lactosa y no sobre α-galactósidos. La especificidad enzimática está en la base de la taxonomía de las levaduras; en efecto, su clasificación está fundada sobre una serie de ensayos fisiológicos diseñados para evidenciar la presencia o ausencia de determinados enzimas. Por ejemplo, la especie Kloeckera apiculata no fermenta la sacarosa porque no tiene invertasas. La estereoespecificidad de acción (especificidad debida a la configuración espacial) de los enzimas en relación con el substrato es parangonable, según FISCHER. con la de una llave en relación con la cerradura.
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Influencia de la temperatura y del pH Dos factores fundamentales son tenidos en consideración en las reacciones enzimáticas.: la temperatura y el pH del medio. Con el aumento de la temperatura aumenta la velocidad de las reacciones enzimáticas hasta que se alcanza una temperatura óptima por encima de la cual la velocidad de la reacción disminuye hasta anularse: se tiene entonces la inactividad del enzima. La temperatura óptima está comprendida generalmente entre 35 y 50° C, no siendo un valor rigurosamente constante para cada enzima ya que interviene la influencia de otros factores, especialmente del pH del medio. Se define «temperatura crítica de inactivación» de un enzima aquella que determina en una hora la inactivación del 50%. Con el calentamiento a 100° C los enzimas, si están en solución, se destruyen en pocos minutos; muchos son inactivados a temperaturas comprendidas entre 60° y 70° C, es decir, a las temperaturas de pasteurización. En estado seco los enzimas presentan una mayor resistencia a la temperatura elevada. Como Rara la temperatura, también para la acidez existe un pH óptimo, alejándose del cual la actividad enzimática disminuye hasta anularse. Tampoco el pH óptimo es un valor rigurosamente fijo, sino que está influido por la temperatura y por la naturaleza del substrato. Constitución de los enzimas Según WILLSTÁTTER los enzimas constituyen un complejo enzimático formado por un soporte coloidal de naturaleza proteica, termolábil y no dializable llamado apoenzima y de un componente activo o grupo prostético, termoestable y ultrafiltrable denominado coenzima. La unión de los dos constituyentes forma el holoenlima, al cuál se debe la actividad enzimática: holoenzima apoenzima + coenzima Entre apoenzima y coenzima se establece un equilibrio regido por la ley de acción de masas: [apoenzima ][coenzima ] = K [ holoenzima ] Normalmente el valor de K es muy pequeño, es decir, el enzima está poco disociado. El apoenzima determina la especificidad del substrato sobre el que va a actuar el enzima, mientras que el coenzima establece la especificidad de acción. La actividad enzimática se debe a una combinación entre el enzima y el substrato que activa al substrato exaltando la reactividad. Mientras se desarrolla la reacción específica se va liberando el enzima, que se fija nuevamente sobre otra alicuota del substrato. Endoenzimas y exoenzimas Los enzimas presentes en la célula viva se encuentran difundidos en el citoplasma y según la posibilidad de atravesar o no la membrana celular se distinguen entre endoenzimas y exoenzimas. Los primeros operan en el interior de la célula mientras los segundos pasan al substrato y actúan sobre las substancias que no son capaces de atravesar la membrana celular.
Los enzimas de la uva Son varios los enzimas encontrados en la uva; indicaremos los más importantes en relación con las consecuencias prácticas de su actividad en las transformaciones que preceden a la fermentación. La invertasa escinde la sacarosa en glucosa y fructosa. Está presente ya en la uva inmadura como han constatado CASALE e GARINO-CANINA que en 15 horas han obtenido la inversión completa de 10 gramos de sacarosa por 100 mI de mosto. La invertasa invierte rápidamente la pequeña cantidad de sacarosa (2-3 g/L) presente en la uva. Las oxidorreductasas presentes en la uva pertenecen a los oxígeno-transferasas que catalizan la fijación del oxígeno sobre el substrato y se distinguen una tirosinasa, propia de la uva misma, y una la casa producida principalmente por Botrylis cinerea o podredumbre que puede atacar más o menos intensamente a los racimos.
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Lasoxidasas ejercen su acción sobre muchas substancias oxidables y, en particular, sobre los polifenoles y sobre la materia colorante. Los enzimas pectolíticos comprenden una pectinmetilesterasa que libera alcohol metílico de los grupos carboxílicos metilados de la cadena poligalacturónica y una poligalacturonasa que escinde la cadena galacturónica liberando ácido galacturónico monómero. Antes de abordar las transformaciones de la vendimia que preceden a la fermentación y que son debidas principalmente a los enzimas de la uva antes citados, conviene destacar que el mosto y el vino no son substratos muy favorables para la permanencia en el tiempo de la actividad enzimática ya que son bastante ricos en polifenoles susceptibles de reaccionar con las proteínas desnaturalizándolas. Como hemos dicho anteriormente, la apoenzima es una proteína y su desnaturalización conduce al cese de la actividad enzimática. Al pasar del mosto al vino se observará, pues, una caída notable de la actividad enzimática, como hemos demostrado en colaboración con TARANTOLA en lo que respecta, por ejemplo, a la pectinmetilesterasa. Oxidación de polifenoles. Los polifenoles del mosto están sujetos a la oxidación por la intervención de dos enzimas que, como hemos expuesto antes, son la tirosinasa, contenida naturalmente en la uva, y la lacasa, más peligrosa, cedida por Brotrytis cinerea. Si en un cilindro se vierte mosto recién extraído, se observará con el tiempo un oscurecimiento de la capa superior en contacto con el aire, oscurecimiento que se extenderá progresivamente hacia la base del cilindro: el fenómeno es consecuencia de la acción de la tirosinasa. La tirosinasa está, en parte, solubilizada en el mosto y, en parte, ligada a las partículas en suspensión y cataliza dos tipos de reacciones: 1.- La oxidación de los ortodifenoles a quinonas: OH
O OH
O
2
+
+
2
O2
H2O
2.- La oxidación de los monofenoles a ortodifenoles, contemporanea a la oxidación de otro compuesto oxidable, por ejemplo un ortodifenol: OH
OH OH + O2
+
+
2H
H2O
Si recordamos que la tirosina es la p-oxi-β-fenilalanina se comprende el nombre de tirosinasa dado al enzima. H 2N OH HOOC Tirosina
El ortodifenol viene después oxidado según el esquema 1). En numerosas especies vegetales y también en la uva la tirosinasa está ligada a los cloroplastos. La lacasa es producida por Botrytis cinerea y se caracteriza por su acción sobre p-difenoles. Por ejemplo sobre la hidroquinona: OH
O
+
OH
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1/2 O2
+
O
H2O
La lacasa se diferencia de la tirosinasa por la ausencia de acción sobre la tirosina; sin embargo, presenta como la tirosinasa una acción marcada sobre ortodifenoles y sobre monofenoles distintos a la tirosina. La especificidad de la lacasa es muy baja, en el sentido de que oxida un gran número de compuestos fenólicos, lo que la hace mucho más peligrosa que la tirosinasa. La lacasa producida por Botrytis cinerea que se desarrolla sobre un medio de cultivo (por ejemplo, mosto esterilizado) es soluble en el substrato. Así, el enzima en la uva atacada por podredumbre se solubiliza y difunde en el mosto. Esta es otra característica muy peligrosa de la lacasa que la diferencia de la tirosinasa, la cuál tiende en su mayor parte a quedar unida a las partículas sólidas y, como consecuencia, a actuar sólo en la superficie de contacto sólido-líquido por lo que una rápida separación del mosto (caso de los vinos blancos) puede disminuir fuertemente la carga oxidásica. La lacasa, además oxida enérgicamente los compuestos fenólicos del vino, antocianos y taninos, los cuales no son prácticamente atacados a fondo por la tirosinasa. La oxidación enzimática directa de los antocianos por acción de la lacasa es la causa principal de la «quiebra oxidásica» de los vinos tintos, que lleva rápidamente a la destrucción de la materia colorante. Veamos ahora las características de las dos oxidas as obtenidas de los trabajos de DUBERNET y RIBEREAU -GAYON. La tirosinasa presenta un pH óptimo en torno a 4,75 y en el ámbito del pH de mostos y vinos (2,8 - 3,8) su actividad es del orden del 80% de la máxima. En cuanto a la conservación de la actividad enzimática en el tiempo, es óptima a pH 7, mientras que a los pH de mostos y vinos no existe una buena estabilidad del enzima cuya presencia no va a durar mucho tiempo. La lacasa presenta un pH óptimo en relación con los antocianos en torno a 4,0 y con los pH de mostos y vinos sufre una disminución de actividad hacia los pH bajos y más sensible que la sufrida por la tirosinasa. En compensación, el óptimo de estabilidad en el tiempo se tiene a pH 3,4, es decir, en torno al pH de mostos y vinos: la lacasa queda estable hasta pH 2,5 de un lado y hasta pH 7,0 del otro. En cuanto a la influencia de la temperatura se observa para la tirosinasa al pH óptimo de 4,75 un máximo de actividad a 30° C y la inactivación instantánea a 75-80° C; mientras que son suficientes 30 minutos de calentamiento a 55° C a pH 3,4 para destruir totalmente la actividad enzimática. La lacasa presenta en relación a la temperatura un comportamiento notablemente distinto con un máximo de actividad, en lo que respecta a los antocianos, en torno a 50° C, pero con una temperatura de inactivación a pH 3,4 muy próxima a la óptima y para tiempos relativamente breves: a 45° C la lacasa es destruida en menos de 10 minutos. El calentamiento se presenta, pues, muy eficaz contra la lacasa, pero es necesario llegar rápidamente a la temperatura más elevada para no aumentar excesivamente la actividad del enzima que presenta temperatura óptima y temperatura de inactivación muy próximas. En cuanto a la acción del SO2 la tirosinasa se muestra muy sensible, hasta el punto de registrar una disminución del 90% de actividad después de 30 minutos para una adición de 50 mg/l al mosto. Diferente es el comportamiento de la lacasa cuando se añade sal a la vendimia, como se desprende de la experiencia de DUBERNET sobre uva atacada de podredumbre: dosis variables entre 20 y 150 mg/l de SO2 no producen una sensible disminución en la actividad oxidásica de los vinos obtenidos en relación con el testigo no sulfitado. Por el contrario, cuando el SO2 se aplica después de la fermentación, dosis de 100 mg/l hacen desaparecer la actividad enzimática, al cabo de una semana, en el vino conservado al abrigo del aire, mientras toda la actividad enzimática se mantiene en el testigo no sulfitado. Transformación de las pectinas. La presencia en la uva de una pectinmetilesterasa, PME, libera rápidamente alcohol metílico por hidrólisis de los grupos carboxílicos metilados de las cadenas poligalacturónicas. Estudios realizados por nosotros determinando el alcohol metílico liberado en el mosto a lo largo del tiempo, han demostrado que la hidrólisis enzimática del alcohol metílico sigue el camino de una reacción de primer orden o monomolecular. Reacciones monomoleculares Las reacciones enzimáticas son monomoleculares cuando es lenta la velocidad de la combinación del enzima con el substrato y muy rápida la descomposición que resulta. Si indicamos con V, Cs y Ce respectivamente la velocidad de reacción, la concentración del substrato y la concentración del enzima, el postulado general
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de la cinética química (es decir, del estudio de la velocidad de desarrollo de las reacciones) establece la siguiente relación: V = K1 Cs Ce La velocidad de una reacción es proporcional al producto de las concentraciones de las substancias reaccionantes. Ahora bien, en el caso en que la descomposición del complejo enzima-substrato es instantáneo, la concentración Ce del enzima en el medio permanece constante y, por lo tanto, K1Ce = K. Se tiene, pues, que la velocidad de reacción es proporcional a la concentración del substrato V = K Cs Por velocidad de reacción se entiende la cantidad de substancia transformada por unidad de tiempo, es decir, la derivada de la concentración respecto al tiempo. Se puede establecer, entonces, la siguiente relación: dC = K ⋅C dt Se trata de una ecuación diferencial con variables separadas de primer orden. dC dC = K ⋅ dt = ∫ K ⋅ dt + m ∫ C C Ln C = K ⋅ t + m La constante. de integración m sirve para definir las condiciones iniciales. Si al tiempo cero se tiene la concentración Co, m = lnCo. Se tiene pues: 1 C K = Ln Ln C = K ⋅ t + LnC0 t C0 2,3026 C K= Log t C0 Muchas actividades enzimáticas se desarrollan siguiendo reacciones del primer orden. La pectinmetilesterasa Conociendo la concentración inicial del substrato (en el caso de las pectinas la cantidad total de alcohol metílico hidrolizable) y la cantidad presente a un tiempo t, es decir, el alcohol metílico liberado en el tiempo t, es posible calcular el valor de la constante K. Teniendo en cuenta que el valor de la constante K es proporcional a la concentración del enzima, se tiene, de esta forma, un medio para valorar la concentración de pectinmetilesterasa en mostos diversos, en las diferentes partes de la baya y en los vinos en relación con los mostos de que proceden. Para este fin se procede a la saponificación en frío con sosa durante 24 horas para liberar todo el alcohol metílico hidrolizable, que se determina después de la destilación. Se determina además el alcohol metílico liberado después de un tiempo establecido eor acción del enzima y así se puede calcular el valor de K. Las determinaciones efectuadas sobre un mosto de Barbera a pH 3,15 han demostrado la liberación en 48 horas de más del 80% del alcohol metílico presente. Un aumento de 10 °C de temperatura acelera 1,84 veces la velocidad de hidrólisis. Operando sobre un tampón a pH 6,5, que puede considerarse el pH óptimo para la PME, hemos calculado la actividad del enzima en las diferentes partes de la baya: pulpa, hollejo y pepitas. En el hollejo la carga enzimática es al menos el doble de la de la pulpa correspondiente, es decir, una cantidad de bayas que de 100 g de pulpa posee en sus hollejos al menos el doble del enzima presente en los 100 g de pulpa, mientras en la parte correspondiente de pepitas la carga enzimática es 5-6 veces inferior. Al pH natural los mostos presentan una actividad mucho más pequeña que la correspondiente al pH óptimo (6,5), de 300 a 500 veces menor, pero todavía suficiente para liberar, como hemos dicho antes, más del 80% del alcohol metílico en 48 horas. El tratamiento con estrujadora-despalilladora enriquece notablemente el mosto en PME debido a la rotura de los hollejos que son mucho más ricos en el enzima. En el mismo año, la carga enzimática resulta muy diversa según la variedad, incluso para vides cultivadas en el mismo viñedo: por ejemplo la Barbera ha presentado valores dobles que Dolcetto y que Cortese, tanto en lo que respecta a la pulpa como al hollejo y a las pepitas. A pesar del aporte enzimático de las partes sólidas, especialmente del hollejo, la carga pectinmetilesterásica de los vinos, después de la vinificación en presencia del hollejo, se reduce de 1/12 a 1/30 respecto a la de la pulpa de la uva de la que derivan: se observa, pues, un importante decaimiento de la actividad enzimática.
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La poligalacturonasa USSEGLIO-TOMASSET Y col. han realizado un trabajo particular sobre la degradación de las pectinas por obra de una poligalacturonasa, PG, de la uva. Para este fin los autores han puesto a punto los métodos de determinación del ácido galacturónico coloidal, presente en las pectinas, y del ácido galacturónico libre bajo forma de monómero. Los datos de la tabla 10 se refieren a mostos de la vendimia 1973.
Mostos de la vendimia 1973 expresados en ácido galacturónico Moscato Cortese Riesling Pinot Dolcetto
TABLA 10 Mostos de la Acidos urónicos vendimia 193 libres mg/L expresados en ácido galacturónico 45,4 47,4 183,8 110,7 33,4
Acidos urónicos libres mg/L
Merlot Freisa Barbera Gignolino Nebbiolo
139,9 88,7 205,0 388,4 73,6
El ácido galacturónico coloidal se determina sobre coloide s separados por precipitación con alcohol mientras que el monómero se determina sobre la solución desalcoholizada, fijándolo primeramente sobre resina aniónica en forma de acetato y recuperándolo de la resina por elución con ácido acético. En los mostos se tienen generalmente pequeñas cantidades de ácido galacturónico en forma monómera. Se ha seguido la evolución de las pectinas en el tiempo a través de la doble valoración de los ácidos urónicos coloidal es y libres, sobre una serie de mostos de 1974. Dos, Riesling y Cortese, se han vinificado en blanco, mientras el Barbera y el Nebbiolo han sido vinificados en presencia de las partes sólidas excluidos los raspones. Presentamos en la tabla 11 datos obtenidos en el caso Riesling. TABLA 11 Evolución de los ácidos urónicos coloidales y libres del mosto al vino (RIESLING, 1974) Tiempo desde el Acidos urónicos Acidos urónicos estrujado en horas coloidales mg/L libres mg/L 0 300,0 37,8 2 317,2 38,6 4 331,6 40,0 6 346,6 41,4 8 373,9 42,8 10 373,9 48,8 12 373,9 51,2 22 385,7 52,4 24 364,8 53,2 26 373,9 53,6 28 373,9 52,2 30 373,9 61,7 32 358,9 62,7 47 336,5 67,7 a 20 dias (vino) 42,3 469,9 Como se observa en los datos expuestos, la degradación de las peptinas es mucho más lenta que la hidrólisis con liberación del alcohol metílico por obra de la PME. Sin embargo, cuando la fermentación ha finalizado las
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pectinas han desaparecido casi totalmente mientras se encuentra una cantidad proporcional de ácido galacturónico libre: este hecho experimental prueba la intervención de una poligalucturonasa. El mismo comportamiento se ha observado (tabla 12) en la vinificación en blanco de un Cortese y en las vinificaciones en tinto de un Barbera y de un Nebbiolo:
Evolución de los ácidos urónicos Riesling (mosto) Riesling (mosto) Riesling (vino) Cortese (mosto) Cortese (mosto) Cortese (vino) Barbera (mosto) Barbera (mosto) Barbera (vino) Nebbiolo (mosto) Nebbiolo (mosto) Nebbiolo (vino)
TABLA 12 Tiempo desde el Acidos urónicos estrujado coloidades mg/L 0 300,0 47 horas 336,5 20 dias 42,3 0 153,5 47 horas 171,2 20 dias 41,5 0 264,8 47 horas 336,5 20 dias 186,9 0 109,1 47 horas 173,8 20 dias 103,8
Acidos urónicos libres mg/L 37,8 67,7 469,2 35,8 38,6 374 37,2 98,3 1762 37,4 66,1 561
En el caso de la vinificación en tinto aparece un contenido en ácido galacturónico libre mucho más elevado como consecuencia del paso a la solución de las pectinas del hollejo que son después hidrolizadas. Los llamados enzimas pectolíticos comerciales, como por ejemplo Ultrazym 100 están, en realidad, constituidos por una mezcla de enzimas, extraídos del cultivo de aspergilus, que representan un espectro bastante amplio de actividad enzimática, alguna de las cuales son desfavorables. En particular presentan una acciónsolubilizante de las pectinas sobre las partes sólidas, acción que se traduce después, en un aumento considerable del ácido galacturónico libre en vino. Pues bien, como ha demostrado CASTINO, existe una correlación entre el oscurecimiento de los vinos blancos y su contenido en ácido galacturónico y, como consecuencia, su aumento tiene una influencia desfavorable. La acción solubilizante sobre las pectinas debida a Ultrazym 100 se aprecia en los resultados de la tabla 13 que comparan una vinificación en blanco, con estrujado e inmediata separación del mosto por prensado, y una vinificación con el empleo de 2 g/q de preparado enzimático seguido de maderación de cuatro horas antes de la separación del mosto.
Ac. urónicos coloidales Ac. urónicos libres
Ac. urónicos coloidales Ac. urónicos libres
TABLA 3 Vinificación Pinot MOSTO Sin Con enzima enzima 240 mg/I 463 mg/I 63 mg/I 85 mg/l VINO Sin Con enzima enzima 25 mg/I 27 mg/I 337 mg/I 623 mg/l
Vinificación Riesling MOSTO Sin Con enzima enzima 282 mg/I 352 mg/l 126 mg/I 160 mg/I VINO Sin Con enzima enzima 21 mg/l 21 mg/I 385 mg/I 519 mg/l
Se observa un notable incremento de las pectinas que han pasado al mosto las cuales, después de la degradación hidrolítica, van a aumentar el contenido en ácidos urónicos del vino.
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La conservación de los mostos 9btenidos centrifugados y con la adición de cloroformo para impedir la fermentación ha dado los siguientes resultados (tabla 14) que demuestran la degradación de las pectinas por la acción de una poligalacturonasa de la uva en ausencia de fermentación: Además, después de la conservación durante 20 días deAlIOstos estériles por filtración sobre millipore, los análisis han dado los resultados siguientes (tabla 15), que demuestran la existencia de degradación de las pectinas por vía enzimática: TABLA 14 BARRERA Centrifugado y no fermentado Vinificación en tinto Tiempo Ac. Días Ac. galacturóuico Ac. galacturónico Ac. galacturónico galacturónico libre mg/L coloidal mg/L libre mg/L coloidal mg/L 0 341 30 341 30 2 219 37 425 34 4 181 38 399 66 6 160 65 245 104 8 134 66 218 248 10 92 102 181 336 13 82 119 107 465 15 64 130 88 639 FREISA Tiempo Días Centrifugado y no fermentado Vinificación en tinto 0 3 5 7 10 12 14
373 152 123 74 45 37 32
58 146 168 218 224 237
373 76 99 121 127 135 119
58 290 534 939 994 1.042 1.125
NEBBIOLO Tiempo Días Centrifugado y no fermentado Vinificación en tinto 0 2 3 6 8 10 13
Barbera Nebbiolo Cortese Moscato
226 83 38 32 31 30 29
34 49 53 57 81 84 98 Tabla 15 Ac. galacturónico coloidal mgll 28 31 19 30
226 163 119 76 83 83 84
34 105 134 297 418 507 558
Ac. galacturónico libre mgll 244 298 210 416
Queda por precisar la eventual influencia de las levaduras sobre la degradación de las pectinas. Con este objetivo se han añadido a un medio sintético 250 mg/L de coloides aislados del mosto y conteniendo el 37% de
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ácido galacturónico. El medio se ha sembrado con una serie de cepas de levaduras de diferentes especies y se ha conservado a 20° C durante 30 días. En cada uno de los ensayos se ha procedido a la determinación de los ácidos urónicos libres obteniendo los resultados que aparecen en la tabla 16. TABLA 16 Alcohol % Ac. galacturónico en volumen libre mg/L Sacch. cerevisiae T 1 Sacch. cerevisiae 13 Sacch. cerevisiae B 17 Sacch. cerevisiae D \O Sacch. chevalieri Malan B 1 11 Sacch. chevalieri Malan G 13 Sacch. bayanus Castelli 838 Sacch. bayanus Castelli S 41/2 Sacch. baili C 14 Sacch. baili PC 8/3 Sacch. baili L 14/2 Sacch. italicus N 10 Sacch. rosei Castelli 63 Sacch. uvarum D 11 Sacch. uvarum G 25 Kloeckera apiculata B 2 Kloeckera apiculata G 5 Kloeckera magna Castelli 103 Saccharomycodes ludwigii F 1 Saccharomycodes ludwigii Castelli 678 Schizosaccharomyces pombe Castelli 1551 Schizosaccharomyces pombe v. liquefaciens
10,61 10,78 11,23 10,57 10,39 10,80 10,57 11,03 8,67 3,71 3,57 3,61 6,87 4,7 3,8 3,0 2,53 5,94 9,4 8,2 4,39 8,02
Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente 26 Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
Sólo una cepa de Saccharomyces uvarum ha liberado una cierta cantidad (el 28%) de ácido galacturónico de las pectinas mientras que ninguna otra cepa se ha mostrado capaz de su degradación hidrolítica. Se debe concluir que las levaduras no ejercen ninguna acción poligalacturonásica sobre las pectinas. La determinación de los ácidos urónicos coloidal es y libres sobre los vinos obtenidos en 12 años sucesivos de uva procedente de las mismas vides cultivadas en el mismo viñedo, ha demostrado no sólo que el ácido galacturónico se encuentra casi completamente en forma libre, sino que el contenido en pectinas es una característica varietal, aunque influida fuertemente por el año de producción: por ejemplo, el Nebbiolo y el Grignolino presentan un contenido en pectinas significativamente menor que Freisa, Dolcetto y Barbera.
Representación esquemática de una de las primeras reacciones de la glucólisis
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CAPITULO DECIMOTERCERO
Química de las fermentaciones Los coenzimas Antes de entrar en la bioquímica de la fermentación alcohólica y de otras fermentaciones vamos a estudiar cuatro coenzimas que ejercen un papel fundamental en los mecanismos de las fermentaciones. Comenzamos con el NAD+ o nicotinaminadenindinucleótido, indicado durante mucho tiempo también con DPN con el nombre de difosfopiridinnucleótido. El NAD+ constituye el coenzima de diversas deshidrogenasas y puede fijar reversiblemente dos átomos de hidrógeno según la siguiente ecuación: NAD+ + 2H NADH + H+ El NAD+ pertenece pues a las hidrogenotransferasas a diferencia de la tirosinasa y de la lacasa que son oxigenotransferasas; tiene la siguiente constitución: H2N
NH2
O N
nicotamida O +
N
CH2 O
O
P O
HO
O
P O
O
HO
N
O
CH2
OH
ribosa
N
O
ribosa
N adenina
OH
Nicotinaminadenindinucleótido
+ +
H2
+
N
H+
N
Mecanismo Redox del NAD+
El coenzima resulta de la unión, a través de un enlace difosfato, del nucleótido formado por ribosa y adenina con el nucleótido formado por ribosa y nicotinamida. El mecanismo de óxido-reducción es el esquematizado y ocurre al nivel del núcleo piridílico que puede asumir una forma oxidada con una carga positiva en el nitrógeno y una forma reducida con el nitrógeno sin carga y la introducción de un hidrógeno en el mismo núcleo piridílico. Una reacción de óxido-reducción en la que una substancia se oxida y otra se reduce puede representarse según el esquema siguiente: deshidrogenasa 1 A
AH2
NAD+
BH2
NADH + H+
deshidrogenasa 2
B
Oxido-reducción catalizada por NAD
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Otro importante coenzima es la tiaminapirofosfato (TPP), coenzima de las descarboxilasas, las cuales descarboxilan los ácidos cetónicos a aldehidos con un átomo de carbono menos según el esquema: TPP R-CO-COOH → R-CHO + CO 2 descarboxilasas
La tiamina pirofosfato, como su nombre indica, es el éster pirofosfórico de la tiamina o vitamina B 1: necesita para desarrollar su acción la presencia del ion magnesio en el substrato. La estructura del coenzima se expresa en la fórmula siguiente: O
NH2 Me
O
O O
P
+
N
Me N
O
O
S
O
P
Tiaminapirofosfato ó TPP
Hablamos ahora de dos coenzimas que controlan el transporte del ion fosfato en las reacciones bioquímicas (son cofosforilasas) y juegan un papel fundamental en la transferencia de energía. Se trata del adenosintrifosfato o ATP y el adenosindifosfato o ADP. Presentamos la estructura del adenosintrifosfato; la del adenosindifosfato es idéntica pero con una molécula de ácido fosfórico menos: NH2 Adenosintrifosfato o ATP
O
O O
O
P
P O
O
N
adenina
N
O O
P
N N
O O
ribosa
O
OH
HO
adenosinmonofosfato
adenosindifosfato o ADP
adenosintrifosfato o ATP energía
ADP + fosfato
ATP + H2O
energía Intervención del ATP en los cambios energéticos
La tercera molécula terminal de fosfato está ligada a través de un enlace denominado «rico en energía»: la rotura de este enlace con formación de ADP y ácido fosfórico es acompañada de liberación de energía y, viceversa, hay que aportar energía para la formación del tercer enlace entre el ADP y una molécula de fosfato mineral. De modo esquemático puede decirse que las reacciones químicas exoenergéticas, es decir, capaces de liberar energía, permiten la formación, a partir del adenosindifosfato Y del fosfato mineral, de una molécula de ATP, la cual representa una forma de almacenamiento de energía. Las moléculas de ATP serán después utilizadas para aportar la energía necesaria para el desarrollo de reacciones endoenergéticas, que requieren
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energía, y que son indispensables para asegurar las funciones vitales de las células y en particular su multiplicación. El coenzima A se expresa de forma abreviada CoA-SH para poner en evidencia la presencia del grupo tiol que constituye la base de su comportamiento. El coenzima A reacciona con los ácidos dando un tioéster muy reactivo que permite fijar sobre otra molécula el radical acilo R-CO-: CoA-SH + HOOC-R R-CO-S-CoA + H2O Por ejemplo, con el ácido acético se tiene el acetilcoenzima A CH3 - CO - S - CoA o acetato activo. El coenzima A posee la siguiente fórmula, donde encontramos estructuras moleculares ya conocidas en otros coenzimas y entre las vitaminas del grupo B: NH2 N
acido pantoténico
N
N
N O
CH2
O
O
OH
P
P
OH
O
CH3 OH O
CH2 C CH
O
CH3
H N
C
CH2
C
CH2
CH2
SH
O
O
OH
HO
H N
CH2
ac. pantoico
β - alanina
tioetilamina
Coenzima A
La glucólisis La glucólisis o vía de EMBDEN-MEYERHOF comprende el conjunto de reacciones que permiten a las células vivas transformar los azúcares C6 (glucosa y fructosa) en ácido pirúvico. Estas reacciones se producen tanto en anaerobiosis (fermentación alcohólica y láctica) como en aerobiosis (respiración) y constituyen la premisa del metabolismo de los azúcares para diferentes rutas bioquímicas. El primer paso de la glucólisis es un proceso de fosforilación que con la intervención de dos moléculas de ATP lleva a la formación de fructosa 1,6 - bifosfato o éster de HARDEN y YOUNG. O OH HO
OH
O H HO H
H
H OH H
OH
HO H OH Sacarosa
OH
O -
H
H OH H
OH O
HO
OH H
-
P
O
ADP
OH
HO O
OH H H
H OH H
ATP
H
OH
OH
OH glucosa-6-fosfato (ester de Robinson)
α-D-glucopiranosa HO
O H HO
O
OH -
O
OH
H
ATP
ADP
OH
O H HO
-
O
OH H α-D-fructopiranosa
O
P
H
OH OH H fructosa-6-fosfato ATP (ester de Neuberg) ADP
O
O -
O
O
P
O H HO
-
O
H
O
-
P
O -
OH
O
OH H fructosa-1,6-bisfosfato (ester de Harden y Young)
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En esta fase se produce el consumo de la energía relativa al paso de dos ATP a dos ADP. La molécula de fructosa, 1,6-bifosfato se divide en dos moléculas de triosa en equilibrio entre ellas: la dihidroxiacetona fosfato y el gliceradehído 3-fosfato. O
O CH2
C O O
P O
O CH2
O
CH2
O
OH
O P O
OH HO
O dihidroxiacetona fosfato (96,5 %)
CH2
O
O P
O
O
OH
gliceraldehido 3-fosfato (3,5 %)
OH C
O
CH
H
CH2 O
O P O
Rotura de la fructosa-1,6-bisfosfato en dos moléculas de triosas fosfato
El equilibrio está desplazado hacia la dihidroxiacetona fosfato que representa el 96,5% mientras el gliceraldehido, 3 fosfato representa sólo el 3,5%. Sin embargo, es este último el que reacciona sucesivamente con la intervención del NAD sobre la forma hidratada y se transforma en ácido 3-fosfoglicérico, mientras la energía de la oxidación permite la formación de una molécula de ATP a partir de una de ADP y de fosfato mineral. El ácido 3- fosfoglicérico pasa a 2- fosfoglicérico y este último, por eliminación de agua, pasa a ácido fosfoenolpirúvico. El enlace de fósforo es un enlace rico en energía y permite, por reacción con una molécula de ADP la formación de una molécula de ATP, mientras se libera la forma enólica del ácido pirúvico, en equilibrio con la cetónica. OH
O
H2O
C
NAD
CH OH
H CH OH
NADH2
CH OH CH2 O
CH2 O P
O C OH CH OH
P ADP
ATP
CH2 O
O
HO P
C
O
P
CH CH2
OH ac. 2-fosfo-glicérico
ac. 3-fosfo-glicérico gliceraldehido-3-fosfato
O
HO
C
ceto-eno
HO
C O
HO CH3
O C
ATP
C CH2
ac. pirúvico
ADP
HO P
O
O C C
ac. fosfoenolpirúvico
CH2
La evolución de una molécula de gliceraldehido, 3-fosfato a ácido pirúvico lleva a la formación de dos moléculas de ATP y, por lo tanto, en la degradación a ácido pirúvico de una molécula de hexosa se forman 4 moléculas de ATP. Dos moléculas de ATP habían sido consumidas en las reacciones de fosforilación y, por lo tanto, la glucólisis supone un rendimiento de 2 ATP por cada molécula de azúcar metabolizada. La glucólisis lleva a la producción de ácido pirúvico. En la respiración aeróbica el ácido pirúvico puede ser oxidado, a través de las reacciones del ciclo de KREBS, hasta agua y anhídrido carbónico: CH 3 -CO-COOH + 5
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2
O 2 → 3 CO 2 + 2 H 2 O
En anaerobiosis el ácido pirúvico no puede ser oxidado por falta de oxígeno y entonces puede servir como aceptar del hidrógeno que aparece en la glucólisis bajo forma de NADH2: en este caso se reduce directamente a ácido láctico (fermentación homoláctica). Si la reducción es precedida de la descarboxilación a acetaldehído, se tiene la formación de alcohol (fermentación alcohólica). Sin embargo, si los dos átomos de hidrógeno de la glucólisis se utilizan de otro modo, el ácido pirúvico no puede ser reducido y entonces puede dar origen, en anaerobiosis, a un gran número de productos secundarios
La fermentación alcohólica La fermentación alcohólica se expresa, en rigor, por la ecuación de GAY-LUSSAC: C6 H12 O6 → 2 CH 3 -CH 2 OH + 2 CO 2 En el caso de una fermentación vínica, sin embargo, no se tiene una fermentación alcohólica pura en el sentido de que no todas las moléculas de azúcar siguen la ecuación de GAY-LUSSAC sino que una ciertaproporción es degradada por fermentación gliceropirúvica según la ecuación de NEUBERG: C6 H12 O6 → CH 3 -CO-COOH + CH 2 OH-CHOH-CH 2 OH Junto a la glicerina aparece el ácido pirúvico, eventualmente descarboxilado a acetaldehído, pero no reducido a alcohol: éste es el origen de diferentes productos secundarios que se forman en anaerobiosis. En la fermentación alcohólica, el ácido pirúvico de la glucólisis es descarboxilado y el acetaldehído es reducido a alcohol por la acción de NADH2 que se había formado en el curso de la oxidación del gliceraldehído, 3-fosfato. Las dos reacciones están acopladas y constituyen un mecanismo de óxidorreducción: si el NADH2 no fuera reoxidado, la glucólisis se detendría al reducirse todo el NAD. O C6H12O6
glucólisis
C
H CH OH
H2O
C
O OH
glucólisis
CH OH
CH2 O P
CH2 O
gliceraldehido-3-fosfato
P
ac. 3-fosfo-glicérico NAD
NADH2 O
HO
C
O CH3
OH CH2
alcoholdeshidrogenasa
CH3
etanol
C
C H
descarboxilasa
O
CH3 ac. pirúvico
Esquema de la fermentación alcohólica
Ya hemos expuesto el balance energético de la glucólisis que es idéntico al de la fermentación alcohólica con formación de 2 ATP. El balance químico completo de la fermentación por acción de las levaduras puede expresarse del siguiente modo: C6 H12 O6 + 2 ADP + 2 H 3 PO 4 → 2 CH 3 -CH 2 OH + 2 CO 2 + 2 ATP + 2 H 2 O Desde el punto de vista energético la variación de energía libre en la transformación de una molécula de hexosa en alcohol y anhídrido carbónico supone la cesión de 40 Kcal. Este valor se desprende fácilmente de la diferencia entre las calorías producidas por la combustión de una molécula de azúcar y de dos moléculas de alcohol etílico.
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La formación de un enlace de ATP supone la fijación de 7,3 Kcal, es decir, dos enlaces de ATP, 14,6 Kcal, se ponen a disposición de las levaduras para asegurar su actividad vital, en particular la multiplicación: en efecto, las levaduras toman la energía que necesitan exclusivamente del ATP. Quedan por tanto, 40 - 14,6 = 25,6 Kcal que se liberan en forma de calor que calienta la masa en fermentación: un mosto que contenga el 18% de azúcares es decir una molécula-gramo por litro (las hexosas tienen un peso molecular del orden de 180), al realizar su fermentación alcohólica sufriría un aumento de temperatura de 25,6° C si 'nada del calor desarrollado se dispensara hacia el exterior. En el caso de la degradación biológica de las hexosas en aerobiosis (C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O), la reoxidación del NADH2 por el oxígeno del aire, de un lado, y la oxidación del ácido pirúvico a través del ciclo de KREBS, de otro, permiten una recuperación de energía mucho mayor por cada molécula de hexosa, unos 38 ATP. Esta energía es tomada de la liberada en la combustión de una molécula de azúcar que supone 686 Kcal. De éstas, 38 x 7,3 = 277,4 Kcal están disponibles para la actividad vital. Se comprende, pues, por qué se dice que la fermentación es «una mala utilización de la energía del substrato glucídico» y por qué pocas levaduras degradan mucho azúcar. En la fermentación alcohólica, de las 686 Kcal que se obtienen por la combustión de una molécula de hexosa, se liberan sólo 40, es decir, el 5,8% de las cuales sólo 14,6 Kcal, el 2,16% del total, son almacenadas en forma de ATP y, por lo tanto, puestas a disposición de las levaduras; en aerobiosis, como hemos dicho, se almacenan como ATP 277,4 Kcal, es decir, el 40,4% de la energía total que produce la oxidación completa de una molécula de hexosa se pone a disposición de la actividad celular. Acido láctico producido por las levaduras Durante la fermentación de los azúcares, las levaduras producen siempre una pequeña cantidad de ácido láctico, cerca de 400 .mg/l, alrededor del 0,05% de las moléculas de azúcar presentes. Una pequeña cantidad de ácido pirúvico escapa a la acción de la descarboxilasa y se reduce directamente a ácido láctico por la acción de una lacticodeshidrogenasa. Pero se manifiesta aquí la especificidad de los enzimas ya comentada, existen dos lacticodeshidrogenasas: la d (-) lacticodeshidrogenasa, que produce ácido d( - )láctico y la 1(+) lacticodeshidrogenasa, que produce ácido 1(+) láctico. Las levaduras forman casi exclusivamente ácido d (-) láctico, es decir, están provistas esencialmente de la lacticodeshidrogenasa correspondiente; es una excepción Saccharomyces veronae que produce, a veces exclusivamente, ácido 1 (+) láctico. La fermentación gliceropirúvica Exponiendo la bioquímica de la fermentación alcohólica habíamos subrayado cómo el NADH2 era reoxidable a expensas del acetaldehido y que las reacciones de oxidación del aldehido, 3 fosfoglicérico al ácido correspondiente y la de reducción del acetaldehido a alcohol estaban perfectamente acopladas. Pero al inicio de la glucólisis no existe acetaldehído presente en el medio y el NADH2 formado en la oxidación del gliceraldehído, 3-fosfato no puede descargar su hidrógeno sobre el acetaldehído y, si la glucólisis debe proseguir, necesita reoxidarse de otro modo. La reoxidación sucede a expensas de dioxiacetonafosfato, que se reduce a glicerofosfato y después es hidrolizado a glicerina. Existe, por tanto, un período de inducción durante el que se produce una fermentación glicero pirúvica. Al reoxidarse el NADH2 con formación de glicerina, la glucólisis puede proseguir, pero el ácido pirúvico formado o el acetaldehído proveniente de su des carboxilación no pueden ser reducidos a ácido láctico y alcohol y se acumulan en el medio: el acetaldehído formado permite que ocurra la fermentación alcohólica. Existe competencia entre los dos aceptores de hidrógeno acetaldehído y dioxiacetona. El primero es reducido más fácilmente y, por ello, prevalece la formación de alcohol, pero una cierta competencia del segundo aceptar subsiste también después del período de inducción. Si se considera una cantidad de glicerina en el vino en torno a 8 g/l corresponde a 0,087 moles provenientes de 0,087 moles de azúcar. Esta cantidad de glicerina se corresponde con 100 g de alcohol (= 120); es decir 2,2 moles que proceden de 1,1 moles de azúcar; tenemos pues la formación de 8,7 moles de glicerina cada 110 moles de azúcar, es decir, cerca del 8% de las moléculas de azúcar siguen la fermentación gliceropirúvica y sólo el 92% la fermentación alcohólica propiamente dicha.
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El ácido pirúvico es el origen de toda una serie de productos secundarios. O C H CH OH CH2 O P gliceraldehido-3-fosfato + OH CH2 C O CH2 O P dioxiacetona fosfato
O H2O
C
O
HO
OH
C
glicólisis
CH OH CH2 O
C O
P
ac. pirúvico
ac. 3-fosfo-glicérico NAD
NADH2
NADH2
NAD
OH CH2 C
CH3
H2O
H3PO4
OH CH2
O
CH OH
CH2 O P Glicerofosfato
CH2 OH Glicerina
Esquema de la fermentación gliceropirúvica
Productos secundarios formados a partir del ácido pirúvico El ácido pirúvico como tal está poco representado en los productos fermentados; en el vino se encuentran, por término medio, 80 mg/L. Pero, como hemos dicho, constituye el punto de partida para la formación de muchos productos secundarios. El ácido pirúvico puede dar lugar a la formación de acetilcoenzima A CH3 - CO - S - CoA la cual, por hidrólisis, da ácido acético: CH3 - CO - S - CoA + H2O CH3COOH + HS - CoA Son dos las vías por las que se puede llegar a la formación de acetilcoenzima A, una oxidativa con la intervención de NAD y producción de CO2 y la otra con formación de ácido fórmico HCOOH: la más importante es la primera vía ya que junto a la cantidad de ácido acético que se encuentra en los vinos, en torno a 4 - 5 meq/L (a veces hasta 10 meq/L), se encuentran sólo algunos miligramos de ácido fórmico. La condensación de dos moléculas de ácido pirúvico acompañada de descarboxilaciones (en la práctica la condensación de dos moléculas de acetaldehido) lleva la formación de acetilmetilcarbinol. El acetilmetilcarbinol puede transformase por oxidación en diacetilo o por reducción en 2,3 - butanodiol o butilenglicol: todos estos compuestos se encuentran en el vino, en particular el 2,3 - butanodiol puede alcanzar hasta 1 g/L. El ácido pirúvico puede, también, ser carboxilado con formación de ácido oxalacético, el cual, como ha demostrado CHARLES, puede ser transformado por las levaduras en ácido málico; en el vino, sin embargo, esta transformación queda enmascarada por la composición natural del mosto en ácido málico. , El ácido málico puede dar origen a ácido succínico pasando por ácido fumarico como producto intermedio y el ácido succínico puede ser descarboxilado a ácido propiónico, también presente, en trazas, en el vino. Al ácido succínico se puede llegar también por condensación oxidativa de dos moléculas. de acetilcoenzima A. Es difícil decir cuál de los dos mecanismos predomina: probablemente se desarrollan los dos en las levaduras. El ácido succínico es uno de los productos secundarios más representativos en el vino, donde pueden encontrarse contenidos cercanos a 1,5 g/L. Todas las reacciones descritas, que a partir del ácido pirúvico llevan a la formación de los diversos productos secundarios existentes en el vino, se indican en el esquema siguiente:
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CH3
CH3 CH2
OH CH2
etanol
CH3 COOH
CH2 COOH
ac. acético
ac. butírico
NAD NADH2
2 NAD
HS-CoA
H 2O CH3 CHO CO2 H 2O
HS-CoA
2 NADH2
NADH2 NAD
NADH2
COOH
NAD
HO O
C
CH OH
O
CH3
H 2O
1 2
S
CoA
x2
CH3
CH2 COOH
CH3
CH3
ac. láctico
O C
C
C
HS-CoA
O
ac. acetilacético
Acetilcoenzima A
ac. pirúvico
HCOOH
HS-CoA
x2
CO2 CO2 O
CH3
C
reacción Thunberg
reacción Wood-Werkman
CH3
diacetilo
C
C
CH3
O
2 HS-CoA CH2
NADH2 O NAD O C
2 CO2
COOH
COOH
ac. oxalacético NADH2
2 H 2O
NADH2
CH CH 3 HO acetonio
NAD
NAD
C
CH3
NADH2
O
CH3
NAD CH2 COOH CH COOH HO ac. málico H 2O
HO CH
CH3 COOH
CH HO
CH3
2,3-butanodiol
NADH2
CO2
NAD COOH
CH
CH2
CH
CH2
HOOC ac. fumárico
HOOC
CH3
CH2 COOH
ac. propiónico
ac. succinico
Aún a partir del ácido pirúvico se produce la fonnación de ácido citramálico o metilmálico cuya presencia había sido atribuida por CHARLES a una fermentación bacteriana del ácido cítrico, pero que KOURAKOU ha demostrado que se forma sólo en el transcurso de la fermentación alcohólica, mientras que la degradación bacteriana del ácido cítrico durante la fermentación maloláctica no produce ácido citramálico. En los vegetales superiores el ácido citramálico se forma por condensación entre el ácido acético, bajo forma de acetilcoenzima A, y el ácido pirúvico y el mismo mecanismo se puede afirmar que actúa en las levaduras.
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CH2 COOH HO
C
ac. cítrico
COOH
CH2 COOH
ac. acético
CO2
CH3 COOH CH2 COOH O
HO
ac. pirúvico
C
COOH
C
COOH
ac. citramálico
CH3
CH3
Junto al ácido citramálico, que puede encontrarse en los vinos en contenidos variables de 0 a 300 mg/L, se ha encontrado en cantidades entre 0 y 600 mg/L el acido dimetilglicérico y en cantidades hasta 150 mg/L del ácido 2,3 dihidroxiísovaleriánico encontrado por primera vez en el vino por CASTINO: CH3
OH
OH CH
CH3
CH3
C
CH3
C
OH
CH
C O
Ac. 2,3-dihidroxi-2 metilbutírico ó dimetilglicérico
CH3
HO
OH C O
Ac. 2,3-dihidroxi-3 metilbutírico ó dihidroxiisovaleriánico
Balance de los productos secundarios de la fermentación gliceropirúvica Puesto que cada vez que se forma una molécula de glicerina otra molécula de ácido pirúvico no puede ser reducida y se dirige hacia la formación de productos secundarios, está claro que debe existir una correlación entre la glicerina y los productos secundarios derivados del ácido pirúvico y que se puede pensar en establecer un balance. En efecto, independientemente de los mecanismos intermedios, se pueden escribir las ecuaciones siguientes que tienen en cuenta el que a cada oxidación corresponde una reducción y viceversa, es decir, que el nivel de óxido-reducción no .debe ser modificado: 2 CH 3 -CHO + H 2 O → CH 3COOH + CH 3 -CH 2 OH 5 CH 3 -CHO + 2 H 2 O → HOOC-CH 2 -CH 2 -COOH + 3 CH 3 -CH 2 OH 2 CH3-CHO → CH 3 -CHOH-CO-CH 3 CH 3 -CHO + CH 3 -CH 2 OH → CH 3 -CHOH-CHOH-CH 3 Indicamos con: a s m b h
los moles de ácido acético; los moles de ácido succínico; los moles de acetilmetilcarbinol; los moles de 2,3-butanodiol; los moles de acetaldehído que quedan libres al final de la fermentación.
Puesto que cada vez que una molécula de aldehído acético escapa a la reducción a alcohol se forma una molécula de glicerina por reducción de la dioxiacetona, se podrá establecer la siguiente equivalencia, donde g es el número de moles de glicerina:
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g = 2a + 5s + 2m + b + h Si indicamos con Σ la suma de los términos de la derecha podemos expresar el balance de los productos secundarios con la notación Σ /g = 1. Este tipo de balance propuesto por GÉNÉVOIS, se basa en consideraciones técnicas correctas y es aplicable a fermentaciones muy puras desarrolladas en anaerobiosis estricta. En el caso del vino aparecen muchas dificultades por las cuales una buena aproximación al balance pudiera ser la consecuencia de una compensación de errores. En efecto, en primer lugar se puede encontrar una cierta presencia de glicerina en el mosto causada por el metabolismo de hifomicetos (hongos) con la consiguiente alteración del balance. Además, un aspecto delicado es el del ácido succínico, que puede formarse a partir del pirúvico a través del oxalacético, el málico y el fumárico, sin la contemporanea formación prevista de glicerina y, la parte eventualmente prevista por esta via, no debería intervenir en el balance. El ácido succínico puede formarse tambien a partir del ácido glutámico por un mecanismo que veremos y aún puede originarse del málico presente en el mosto. Además también los ácidos citramálico, dimetilglicérico y dihidroxiisovaleriánico deberían entrar en el balance. Sin embargo el concepto de una correlación entre la glicerina y los productos secundarios derivados del ácido pirúvico permanece válido y queda claramente ilustrado en la serie de datos (tabla 17) obtenidos de la fermentación de un mosto a diferentes pH, datos tomados del Tratado de Enología de RIBEREAu-GAYON y cols. TABLA 17
1,0 0,8 0,7 0,5 0,5
7,2 7,2 6,3 4,8 4,1
1,0 1,1 1,3 1,0 1,0
M/g
16,6 6,3 16,4 6,3 31,9 5,6 53,1 9,3 80,5 10,1
M
84 80 112 169 209
2,3Butanodiol (b) Ald. acético (m)
Acetoíno (m)
3,0 5,0 5,8 7,0 8,0
Ac. Acético (a) Ac. Succínico (s)
pH Mosto de uva
Glicerina (g)
Formación de productos de la fermentación gliceropirúvica en función del pH. Valores expresados en milimoles.
75 74 101 159 216
0,90 0,93 0,86 0,94 1,03
A pesar de la gran variabilidad en la formación de productos secundarios la relación Σ/g se mantiene próxima a la unidad. Fermentación en presencia de ácido acético Cuando se sigue la producción de ácido acético a lo largo de la fermentación del mosto en función de la cantidad de azúcares fermentados, se observa que la formación del ácido sucede preferentemente al inicio, después se ralentiza hasta sufrir una neta disminución en muchos casos: el comportamiento depende de la cepa de levadura empleada. Parece que la utilización del ácido acético por las levaduras requiere primero una reducción a aldehído acético, favoreciendo la fermentación alcohólica en menoscabo de la gliceropirúvica, con una disminución de la glicerina, pero con un aumento de los productos secundarios que pueden derivar del acetaldehído: se tendría pues, un mecanismo que perturba el balance de los productos secundarios. La capacidad que presentan las levaduras de metabolizar el ácido acético preexistente en el substrato hace posible rebajar por refermentación la acidez volatil de un vino. En efecto, un vino picado, añadido a un mosto o a la vendimia estrujada en proporción de un tercio a la mitad de forma que se obtenga una acidez volátil en torno a 0,7 g/L puede dar después de la fermentación un producto con acidez volátil generalmente no superior a la de una fermentación normal. También el acetato de etilo, responsable del carácter organoléptico picado es contemporáneamente rebajado.
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Los fenómenos descritos se ponen en evidencia en los siguientes diagramas, debidos a PEYNAUD:
Fig. 12
Degradación del ácido málico El ácido málico del mosto disminuye durante la fermentación alcohólica y según la especie de levadura puede observarse una pérdida de 10 al 25% de la cantidad inicial. Recientes estudios realizados en la Sección de Microbiología Enológica del Instituto Experimental de Asti han observado para algunas cepas de Sacch. cerevisiae una degradación de más del 40 % del ácido málico inicial. Esta degradación del ácido málico ocurre en mayor medida a pH bajos y se anula a pH 5. Sin embargo, la cantidad de ácido málico de un vino conservado en presencia de levaduras no cambia y, por tanto, ,la disminución se verifica exclusivamente durante el período fermentativo. Levaduras particulares del género Schizosaccharomyces pueden degradar cantidades importantes de ácido málido, hasta el 90 % del contenido inicial (Schizosacch. pombe); estas levaduras tienen, sin embargo, un desarrollo lento por lo que difícilmente predominan y, además, confieren a menudo caracteres organolépticos desfavorables. Es necesario señalar a propósito de las Schizosaccharomyces que se está desarrollando un trabajo microbiológico cuyo objetivo es aislar cepas con buenas características enológicas que pueden ser eficazmente utilizadas en el caso de mostos demasiado ricos en ácido málico. La degradación del ácido málico corresponde a una verdadera fermentación con la intervención del enzima málico que transforma el ácido málico en ácido pirúvico el cual sigue después la fermentación alcohólica. La actividad del enzima málico se desarrolla en presencia de iones manganeso según el siguiente mecanismo: COOH CH OH
CO2 EM +
Mn2+
COOH C
CH2
O
CH3
COOH NAD
NADH2 CO2
OH CH3 CH2
CH3
CHO
Fermentación maloláctica
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Observamos que si 5,36 g/L de ácido málico, unos 40 milimoles, sufrieran completamente la fermentación malo alcohólica se registraría un aumento de 0,23 en la graduación alcohólica del vino obtenido. Metabolismo de las substancias nitrogenadas por las levaduras Las substancias nitrogenadas están constituídas por el nitrógeno amoniacal, los aminoácidos, los polipéptidos y las proteínas. Las levaduras son capaces de sintetizar todos los compuestos nitrogenados que necesitan a partir del nitrógeno amoniacal que representa la forma nitrogenada más fácilmente asimilable. Sin embargo, la presencia de determinados aminoácidos en el substrato facilita la fermentación ya que las levaduras pueden seguir tres vías de asimilación de nitrógeno. 1) La primera consiste en la asimilación directa de los aminoácidos del substrato: según THORNE la mayor proporción de los aminoácidos se toman directamente, y la desaminación de los aminoácidos la efectúan las levaduras sólo cuando su mezcla no está en proporciones adecuadas para la nutrición nitrogenada de las levaduras. 2) La segunda vía es la de STICKLAND que lleva a la liberación de amoníaco a través de un mecanismo de óxido-reducción: existen aminoácidos que se comportan como donadores de hidrógeno y otros como aceptores y esto explica por qué una mezcla de aminoácidos es más eficaz como medio de alimentación nitrogenada que uno cualquiera de sus componentes. Se producen reacciones del siguiente tipo: R´-CHNH 2 -COOH + 2 H 2 O → R´-COOH + NH 3 + CO 2 + 4H R´´-CHNH 2 -COOH + 2H → R´´-CH 2 -COOH + NH 3 Es decir, acoplando los dos mecanismos: R´-CHNH 2 -COOH + 2R´´-CHNH 2 -COOH + 2 H 2 O → R´-COOH + 2 R´´-CH 2 -COOH + CO 2 + 3 NH 3 Como consecuencia de estas reacciones los aminoácidos son fuente de nitrógeno por el amoníaco que liberan y se comprende, pues, la facilidad de asimilación del nitrógeno amoniacal. En la primera de las reacciones indicadas se observa que quedan disponibles 4 H de un aminoácido, hidrógenos que pueden fijarse sobre moléculas de NAD. Se puede considerar una primera oxidación que transforma el aminoácido en iminoácido: R
R
CH COOH
COOH
C
+2H
NH
NH2
Ahora se produce la hidrólisis del iminoácido a cetoácido con liberación de amoníaco: R
C NH
O
COOH + H2O
R
C
COOH + NH3
Se produce una descarboxilación con formación de un ácido con un átomo de carbono menos, liberación de CO2 y disponibilidad de otros dos átomos de hidrógeno: R-CO-COOH + H 2 O → R-COOH + CO 2 +2H 3) La tercera vía de asimilación de nitrógeno es la de EHRLICH, por desaminación y descarboxilación, con formación de alcoholes superiores: COOH
COOH
CH NH2
C
R
R
COOH OH C OH R
COOH C R
NH
COOH + 2H
C
COOR OH + NH3 C OH R
NH + 2 H2O
R
O
CO2 R
CHO
R CH2 OH NADH2
NAD
Al cetoácido, que será después descarboxilado y reducido, se llega a través de reacciones de transaminación que implican a otro cetoácido sobre el que se transfiere el grupo amino: el ácido típico que participa en estas reacciones es el α-cetoglutámico.
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Presentamos un ejemplo para la fenilalanina, que conduce a la formación de alcohol feniletílico, presente en los vinos: COOH
COOH
COOH
COOH
CH NH2
C
C
CH NH2
CH2
O
CH2
CH2
+
O
CH2
+
CH2
CH2
COOH
COOH Ac. glutámico
β-Fenilalanina
Ac. α-cetoglutárico CO2 HO
Alc. β-feniletílico
COOH
CH2 CH2
NAD
NADH2
C CH2 O Ald. β-feniletílico
Con análogo mecanismo de la valina se obtiene el 2-metil-l-propanol (alcohol isobutílico); de la leucina se forma el 3-metil-l-butanol (alcohol isoamílico inactivo) y de la isoleucina se obtiene el 2-metil-l-butanol (alcohol isoamílico activo): CH3
O CH2
CH C OH CH3 CH
CH CH3
NH2
CH3 2-Metil-1-propanol (Alc. isobutílico)
Valina O CH3
OH
CH2
CH2 C CH CH OH
OH
CH2 CH
CH3
NH2
CH3 CH3 3-Metil-1-butanol (Alc. isoamílico inactivo)
Leucina
CH3
CH3
O
CH
C
CH2
CH NH2
Isoleucina
OH
CH2 OH CH CH2 CH3 CH3 2-Metil-1-butanol (Alc. isoamílico activo)
estos son los principales alcoholes superiores encontrados en los fermentados. A ellos debe sumarse el 1propanol, para el que no se encuentra en los mostos el precursor directo, el ácido α-aminobutírico. Los alcoholes superiores pueden, entonces, derivar de los cetoácidos que se obtienen por desaminación de los aminoácidos correspondientes; sin embargo, a estos mismos cetoácidos se puede llegar por otro camino a partir de los azúcares y precisamente del ácido pirúvico que se forma en la glucólisis. Este es el motivo de que no exista una exacta correspondencia entre el contenido en aminoácidos del mosto y los alcoholes superiores que
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se encuentran en los vinos: estos se forman indudablemente siguiendo ambas vías. Volveremos más tarde sobre este argumento. Veamos ahora el mecanismo de síntesis de los aminoácidos por parte de las levaduras. La utilización del nitrógeno amoniacal se hace a partir del ácido α-cetoglutárico con formación de ácido glutámico: COOH C
NH3
O
COOH
COOH
H 2O
C
NAD
NADH2
NH
CH NH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
COOH
COOH
COOH
Ac. α-cetoglutámico
Ac. glutámico
Ac. iminoglutámico
El resto de aminoácidos se forman o por modificación del esqueleto del ácido glutámico o por transaminación con los cetoácidos correspondientes: O HO
C
O O CH2
CH2
CH
O
C OH
C OH
NH2
O
OH
N H
NH Prolina
Ac. glutámico
COOH
COOH C
O
COOH COOH
CH NH2 +
CH2
CH2 CH2
COOH
COOH Ac. oxalacético
C CH NH2
Ac. glutámico
transaminación
+
CH2
CH2
CH2
COOH Ac. Aspártico
COOH Ac. α-cetoglutárico
COOH COOH C
O
CH3
CH NH2 +
CH2 CH2
COOH O CH3 C CH OH NH2
COOH Ac. pirúvico
Ac. glutámico
O
Alanina
C +
O
CH2 CH2 COOH Ac. α-cetoglutárico
Formación de los alcoholes superiores Volviendo a los alcoholes superiores hay que hacer dos observaciones. La primera es que las levaduras son capaces de sintetizar todos sus aminoácidos a partir del nitrógeno amoniacal; la segunda que cuando tienen a disposición nitrógeno amoniacal como única fuente de alimentación nitrogenada producen bajísimas cantidades de alcoholes superiores, del orden de 60 mg/L, como hemos comprobado sobre medio sintético. Cuando por el contrario, se ofrece a las levaduras, como única fuente de nitrógeno, un aminoácido y, por consiguiente, es necesaria una desaminación, se tiene una notable producción
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de alcoholes superiores, más de 600 mg/l y hasta más de 1 g/L. Los datos de la tabla 18 ilustran los resultados obtenidos sobre medio sintético: TABLA 18 Substrato sintético sembrado con Sacch. cerevisiae var: ellipsoideus TI. Los resultados se expresan en mg/L: los valores entre paréntesis indican los milimoles/L.
Fuente de Alcohol 2-metil-l3-metil-lalimentación % en l-propanol propanol butanol nitrogenada volumen Nitrógeno amoniacal 10,50 21,3(0,35) 7,0(0,09) 21,2(0,24) 400 mg/L Lisina 0,66 10 milimoles/L Cistina 3,46 trazas 45,6(0,62) 11,7(0,13) (sol. saturada) Histidina 27,1(0,37) 76,1(0,86) 6,74 38,4(0,64) 10 milimoles/L Arginina 8,57 20,7/0,34) 10,0(0,14 36,1(0,41) 10 milimoles/L Glutamina 9,3(0,13) 24,9(0,28) 10,57 25,1(0,42) 10 milimoles/L Treonina 8,95 27,7(0,46) 23,9(0,32) 69,2(0,78) 10 milimoles/L Tirosina 49,3(0,67) 117,8(1,34) 10,11 24,4(0,41) (sol. saturada) Ac. a-aminobutir 9,84 190,6 (3,17) 33,5(0,45) 43,6(0,49) 10 milimoles/L Glicina 571,9(6,49) 10,42 25,3(0,42) 174,8(2,36) 10 milimoles/L Valina 10,40 37,7(0,63) 496,8(6,70) 66,4(0,75) 10 milimoles/L Leucina 30,5(0,41) 446,2(5,06) 10,25 24,5(0,41) 10 milimoles/L Isoleucina 10 milimoles/L
10,40
21,4(0,36)
81,9(1,10)
143,9(1,63)
2-metil-l. butanol
Alcoholes superiores totales
8,9(0,10)
58,4(0,78)
-
-
2,6(0,03)
59,9(0,77)
47,5(0,54)
189,1(2,41)
13,7(0,16)
80,5(1,05)
10,0(0,11)
69,3(0,94)
324,8(3,68)
445,6(5,24)
77,3(0,88)
268,8(3,30)
549,3(6,23)
817,0(10,34)
63,4(0,72)
835,4(9,99)
45,3(0,51)
646,2(8,59)
206,2(2,34)
707,4(8,22)
813,2(9,22)
1060,4(12,3)
Los principales alcoholes superiores producidos son el l-propanol (de 20 a 40 mg/L), que se produce en el mismo orden de magnitud en presencia o ausencia de nitrógeno amoniacal; el 2-metil-l- propanol o alcohol isobutílico (una media de 80 mg/L), cuyo contenido aumenta en presencia de valina; el 3-metil-l-butanol o alcohol isoamílico inactivo (una media de 175 mg/L) cuyo contenido aumenta en presencia de leucina y el 2metil-l-butanol o alcohol isoamílico activo (una media de 100 mg/L) cuyo contenido aumenta en presencia de isoleucina. Los alcoholes superiores fundamentales son siempre los que hemos relacionado; incluso cuando, por ejemplo, la única fuente de nitrógeno es la glicina se forman los cuatro alcoholes citados y sólo ellos. Se debe, por tanto, concluir que las levaduras sintetizan los cuatro cetoácidos precursores correspondientes αcetobutírico, α-cetoisovaleriánico, α-cetoisocapriónico y α-ceto-β-metilvaleriánico: COOH
COOH
C
C
O
O
CH2
CH CH3
CH3
CH3
Ac. α-cetobutírico
Ac. α-cetoisovaleriano
COOH
COOH
C
C
O
O
CH2
CH CH3
CH CH3
CH2
CH3
CH3
Ac. α-cetoiso-capriónico
Ac. α-ceto-βmetilvalerianico
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De estos cetoácidos por descarboxilación y reducción se forman los cuatro alcoholes superiores con un carbono menos: los cetoácidos se originan según el mecanismo de EHRLICH de los aminoácidos correspondientes. Los alcoholes superiores pueden proceder, pues, de los azúcares a partir del ácido pirúvico; presentamos, por ejemplo, el mecanismo de formación de l-propanol: CH3 COOH
CH2
Ac. acético +
CH OH
HO
COOH
CH COOH
CH3
O C CH3
COOH
COOH
COOH
CH3
Ac. citramálico
NAD
Ac. pirúvico CO2
OH CH2
NAD
O
NADH2
C
CH2 CH3 L-propanol
COOH
CO2
H
NADH2
C
O
CH2
CH2
CH3
CH3
Ald. propiónico
También se ha observado que aumentando considerablemente el contenido en nitrógeno amoniacal o ureico disminuye la producción de alcoholes superiores como queda reflejado en los resultados de la tabla 19. TABLA 19 Mosto Cortese 1969 sembrado con Sacch. cerevisiae varo ellipsoideus TI. Los resultados se expresan en mg/L.
Muestra analizada Mosto testigo Mosto + 400 mg/L N ammo Mosto + 400 mg/L N ureico Mosto + 800 mg/L N ureico
Alcohol % en volumen 12,02 11,92 11,92 12,12
l-Propanol
2-metil-lpropanol
3-metil-lbutanol
14,4 46,0 62,3 76,4
38,4 49,2 74,4 66,8
122,6 49,5 64,2 51,1
2-metil-lbutanol 76,6 23,1 29,0 24,4
Alcoholes superiores totales 252,0 167,8 229,9 218,7
Mosto Pinot 1970: fermentación espontánea en cubas de 1 hL. Los resultados se expresan en mg/L. Mosto testigo 10,23 Mosto + 400 mg/L N 10,87 Mosto + 400 mg/L N ureico 10,83
5,0 23,0 49,4
89,5 54,1 61,6
258,4 144,0 77,4
149,5 105,1 41,0
502,4 326,2 229,4
Reducción de los sulfatos y síntesis de los aminoácidos azufrados Las levaduras son capaces de formar sulfhídrico por reducción de los sulfatos y, en condiciones particulares, de formar iones sulfito SO32-, que en el vino se encuentran en forma de iones bisulfito HSO3-. Refiriéndonos a los datos de ESCHENBRUCH, según el tipo de levadura, se produce la formación de anhídrido sulfuroso en contenidos comprendidos entre 10 y 80 mg/L, pero la mayor parte de las levaduras no producen más de 10-20 mg/L de SO2 Sólo cepas particulares de levaduras que, precisamente por ello, se denominan «levaduras productoras de SO2» pueden superar ampliamente las cifras indicadas con formación de más de 200 mg/L y más aún de SO2: estas cepas de levaduras, aisladas en Alemania, no son frecuentes en las regiones italianas. Según ESCHENBRUCH la composición del substrato no tendría una influencia preponderante sobre la producción de SO2 pero tomando algunas experiencias recientes, se manifiesta una influencia bastante sensible
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del substrato en el sentido de que, sobre determinados substratos, las mismas cepas producen más SO2 que sobre otros sin que la causa del fenómeno haya sido individualizada. Se puede decir, además que la especie Saccharomyces bayanus presenta una cierta tendencia a la producción de S02' aunque sea en proporciones modestas. Es interesante destacar que, comparando una cepa de Sacch. bayanus (entonces, denominada oviformis) y una cepa de Sacch. cerevisiae, WEEKS ha observado como la cepa de bayanus producía cantidades mucho más elevadas de ácido α-cetoglutárico, ácido pirúvico y acetaldehído, compuestos todos ellos aptos para combinarse de forma estable con el SO2 Se puede pues pensar (RIBEREAU-GAYON es de la misma opinión) que, por la exigencia de sintetizar los aminoácidos necesarios, la levadura reduzca los sulfatos a sulfhídrico con paso intermedio a través del anhídrido sulfuroso el cual está combinado con substancias aldehídicas o cetónicaso Veamos la formación de los dos principales aminoácidos azufrados a partir de sus precursores y del sulfhídrico proveniente de la reducción de los sulfatos: O HO HO
C
H2N
CH2
CH2 CH C
H2N
O
CH C
O
OH OH homoserina
Ac. aspártico
CH3 S
HS CH2 CH
H2N
C
-CH3 O
CH H2N
OH SO42-
SO32-
H2S
O C OH
homocisteina
Metionina
HS
HSO3-
CH2 HO CH2
H2SO3
CH2 CH2
H2N
CH C
O
H2N
CH C
O
HO Cisteina
HO Serina Biosíntesis de los aminoácidos azufrados
Conviene recordar que las levaduras, que son grandes productoras de anhídrido sulfuroso, no producen sulfuro de hidrógeno y viceversa. Según ESCHENBRUCH la cantidad de sulfuro de hidrógeno producido varía entre 10 y 100 mg/L. La producción de sulfuro de hidrógeno durante la fermentación no debe confundirse con su formación, y la de mercaptanos, en los vinos dejados mucho tiempo sobre las heces después de la fermentación. Se tiene en este caso la producción de algunos miligramos por litro de compuestos azufrados, que en el caso de los mercaptanos son difícilmente eliminables y confieren al vino un olor desagradable. El fenómeno está ligado a la reducción de ion bisulfito y también a la descomposición de aminoácidos azufrados: se trata de una reducción realizada por las levaduras vivas pero que no desarrollan más actividad fermentativa. El sulfuro de hidrógeno producido durante la fermentación es arrastrado fuera del vino por el CO2.
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Combinación del anhídrido sulfuroso con compuestos que contienen grupos aldehídicos o cetónicos En su momento hemos visto la combinación del anhídrido sulfuroso con los antocianos y la consiguiente decoloración. El anhídrido sulfuroso se adiciona también sobre el grupo carbonílico para dar como derivado un ácido oxisulfónico: se alcanza un equilibrio y el producto de adición es más o menos estable según la substancia sobre la que sucede la adición y en función del pH y de la temperatura del medio. Los compuestos que adicionan el anhídrido sulfuroso son principalmente el acetaldehído, el ácido pirúvico y el ácido α-cetoglutárico, compuestos que ya conocemos, el ácido α-cetoglutárico interviene de modo esencial en la síntesis de los aminoácidos. En el caso, por ejemplo, del acetaldehido la adición del SO2 sucede del siguiente modo: H
O
OH
H
C
+
CH3
O
Acetaldehído
H
S O
Ac. Sulfuroso
OH C SO3H CH3
Ac. oxialdehidosulfuroso
A la reacción se aplica la ley de acción de masas: [ R-CHO][ H 2SO3 ] = K [ R-CHOH-SO3H ] El valor K para la combinación con el acetaldehído es 2,5 x 10-6 a 25° C y es 5 veces mayor a 37,5°C. [ R-CHO][ H 2SO3 ] = 2,5x10-6 [ R-CHOH-SO3H ]
[CH3 -CHO]
2
= 2,5x10-4
[CH3 -CHO] =
2,5x10-4 = 0,016
Podemos calcular cuántas moléculas disociadas están en equilibrio con 100 moleculas de aldehidobisulfito: Se tiene, pues, una pequeñísima disociación del aldehidobisulfito y esto justifica su uso como método de determinación del acetaldehído. Se hace combinar a pH adecuado el acetaldehído con bisulfito en exceso, se elimina con iodo el exceso de bisulfito, se libera por alcalinización blanda el acetaldehido combinado y se titula con iodo el SO2 correspondiente. Para el compuesto de adición con la glucosa la literatura da una constante de disociación de 2,2 x 10-1 y, como consecuencia, están en equilibrio 4,69 moléculas disociadas con 100 moléculas no disociadas.
Degradación de los azúcares por las bacterias lácticas Las bacterias lácticas, denominadas así porque son capaces de transformar los azúcares en ácido láctico, se dividen en dos grandes grupos: homo y heterofermentativas. Las bacterias homofermentativas se caracterizan por la capacidad de transformar la glucosa y, en la mayor parte de los casos, también la fructosa integralmente en ácido láctico con producción nula o mínima de otros productos secundarios. Se puede escribir la transformación producida por las bacterias homolácticas del modo siguiente: C6 H12 O6 → 2 CH 3 -CHOH-COOH Muy diferente es el resultado de la fermentación de los azúcares por las bacterias heterolácticas que no sólo metabolizan los azúcares de forma más compleja, sino que metabolizan de modo notablemente distinto la glucosa y la fructosa. Los datos (tabla 20) ilustran claramente la diferente actividad de los dos tipos de bacteria:
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TABLA 20 Productos de la fermentación de 200 milimoles de glucosa y de fructosa por bacterias homolácticas y heterolácticas.
Bacterias homolácticas Glucosa o fructosa 360 0 0
Ac. láctico CO2 Alcohol etílico Ac. acético Ac. succínico Manita 2,3-butanadial Glicerina
0 0 0,3 10
Baterias heterolácticas Glucosa 60 100 100 120 10 0 10 80
Fructosa 40 50 0 100 10 50 10 40
Por lo que respecta a la fermentación de los azúcares por las bacterias homolácticas, el mecanismo es el de las glucólisis seguida por la intervención sobre el ácido pirúvico de la lacticodeshidrogenasa que cierra el ciclo oxidorreductor iniciado durante la glucólisis con la oxidación del gliceraldehído-3-fosfoglicérico: Como hemos indicado antes existen dos lacticodeshidrogenasas que llevan a la formación de dos isómeros ópticos d( -) y 1(+) láctico. Como ha demostrado PEYNADO las bacterias lácticas forman generalmente ambos isómeros en proporciones diferentes. Sin embargo, algún bacilo homoláctico forma exclusivamente ácido l( +) láctico. O C6H12O6
H2O
C
glucólisis
H CH OH
C
O OH
CH2 O P
CH2 O
gliceraldehido-3-fosfato NADH2
O
HO C
P
ac. 3-fosfo-glicérico NAD
O
glucólisis
CH OH
C
OH
C CH OH
lacticodeshidrogenasa
CH3 Ac. láctico
O
CH3
ac. pirúvico
Esquema de la fermentación homoláctico
El balance energético de la fermentación homoláctica es idéntico al de la fermentación alcohólica ya que corresponde al balance de la glucólisis, es decir, formación de dos moléculas de ATP por cada molécula de azúcar metabolizada. La vía de las pentosas Mucho más compleja es la degradación de las hexosas por parte de las bacterias heterolácticas, responsables del denominado picado láctico, es decir, aquella alteración debida a la formación, junto al ácido láctico, de ácido acético y de manitol. Este tipo de alteración ocurre cuando, por una excesiva elevación de la temperatura, se produce una detención de la fermentación alcohólica y se instala una fermentación heterolactica. Los mecanismos en juego difieren de los de la fermentación homolactica porque en vez de seguir la vía de la glucólisis siguen en las primeras fases las reacciones características de la vía de las pentosas. . Las reacciones del ciclo de las pentosas constItuyen otro modo clásico de degradación de los glúcidos. Presentamos el esquema de la evolución de las hexosas según la vía de las pentosas:
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HO H
NAD
NADH2
O OH H HO
OH
OH
CH2 CH CH CH CH2 CH
HO
OH
OH H Fructosa
OH
OH ATP
OH
Manitol
ADP O
O
P
O OH H HO H OH H
H
H OH H
ATP
H
H OH H
OH
HO
OH H
Fructosa-6-fosfato
ADP
OH
HO
OH
OH
P
OH H
OH
Glucosa-6-fosfato
OH
Glucosa
Vía de las pentosa fosforilación COOH O H
H OH H
P
NADH2
OH
HO
H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
NAD
OH H
OH
Glucosa-6-fosfato
CH2 O
CH2 OH
CH2 OH NAD
NADH2
CO2
O
C
H
C
H
C
O
C
OH
HO
C
H
OH
H
C
OH
CH2 O
P
CH2 O
P
xilosa-5-fosfato
Ribulosa-5-fosfato
Ac. 6-fosfoglucónico
P
H3PO4 H 2O COOH
NAH2 NAD
O
HO
2 ATP NAH2 NAD
C
CH OH
H
2 ADP
C
CH3
O
H glucólisis
CH3
O C C
OH
CH2 O
CH3 P
C
Ac. pirúvico
Ac. láctico
O
P
O Gliceraldehido -3-fosfato
Acetilfosfato ADP
NAH2 ATP NAD CH2 OH CH OH CH2 OH Glicerina
H3PO4
H 2O
CH2 OH H
C
OH
CH2 O
2 NADH2
CH3
H3PO4
COOH
2 NAD P
Glicerofosfato
CH3 CH2 OH
Vía de las pentosas
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Etanol
Ac. acético
El punto de partida lo constituye la glucosa-6-fosfato o ester de ROBINSON, que hemos visto ya como etapa preliminar de la glucólisis. Entonces se tenía una isomerización en fructosa-6-fosfato o éster de NEUBURG seguida de una posterior fosforilación que llevaba a la fructosa-l,6-difosfato o éster de HARDEN y YOUNG. Ahora es la fructosa-6-fosfato formada por la fosforilación de la fructosa la que se isomeriza a glucosa-6fosfato, la cual constituye el punto de partida de la evolución sucesiva para los azúcares. La glucosa-6-fosfato se oxida a ácido-6-fosfoglucónico que sufre una posterior descarboxilación oxidativa transformándose en una pentosa, la ribulosa-5-fosfato. Se produce una isomerización de ribulosa-5-fosfato a xilosa-5-fosfato a partir de la cual se produce la rotura de la molécula con formación de un compuesto C2, el acetilfosfato, y de un C3, el gliceraldehído-3-fosfato, que ya conocemos como producto de la glucólisis. En este punto tenemos un mecanismo principal en el cual el gliceraldehído-3 fosfato retoma la vía de la glucólisis y llega al ácido pirúvico y, por reducción, al ácido láctico. Tenemos también un mecanismo secundario que permite la reducción a glicerina del aldehído 3fosfoglicérico por obra de NADH2 procedente de la glucólisis, con la consiguiente imposibilidad de posterior reducción del ácido pirúvico a láctico y, como consecuencia, con la evolución del ácido pirúvico hacia todos los productos secundarios que, como dijimos, pueden formarse. La posibilidad de reducción a glicerina del aldehído fosfoglicérico determina, pues, una verdadera fermentación gliceropirúvica. El acetilfosfato, el otro elemento originado en la rotura de la molécula de las pentosas, se reduce a alcohol etílico para asegurar la reoxidación de dos moléculas de NADH2. En efecto, si no se tiene en cuenta el mecanismo secundario de formación de la glicerina, en el curso de la degradación de una molécula de hexosa se produce la formación de 3 NADH2: 1 por la oxidación de la glucosa a ácido glucónico, 1 por la oxidación con descarboxilación del ácido glucónico a ribulosa y 1 por la oxidación del aldehído 3-fosfoglicérico a ácido 3-fosfoglicérico. De estas 3 moléculas de NADH2 una se reoxida reduciendo el pirúvico a láctico y las otras dos reduciendo precisamente el acetofosfato a alcohol etílico. La fermentación heteroláctica (descuidando la fermentación gliceropirúvica que puede manifestarse contemporáneamente) puede expresarse por la ecuación siguiente: C6H12O6 CH3 - CHOH - COOH + CH3 - CH2OH + CO2 Sin embargo, la célula bacteriana para reoxidar el NADH2 puede disponer de un aceptor de hidrógeno exógeno, es decir, presente en el substrato y capaz de penetrar en la célula y propiciar la oxidación de las dos moléculas de NADH . En este caso, el acetofosfato puede ser hidrolizada ácido acético con la recuperación de una molécula de ATP y, como consecuencia, de energla suplementaria disponible por la célula. . La formación de ácido acético en cantidad relevante demuestra una utilización preferencial del aceptor de hidrógeno exógeno, entonces, indicando con A este aceptor, el balance de la fermentación heterolactica se transforma: C6H12O6 + 2A + H2O CH3 - CHOH - COOH + CH3 - COOH + CO2 + 2 AH2 En una fermentación natural los dos tipos de evolución de los azúcares y la fermentación gliceropirúvica se producen simultáneamente con la formación de todos los perivados. La intervención del aceptor exógeno lleva a la formación de poli alcoholes de 5 átomos de carbono como el arabitol, derivado de la reducción de una pentosa que ejerce las funciones de aceptor de hidrógeno. En el caso de la fermentación de la fructosa es este azúcar precisamente el que funciona como aceptor del hidrógeno exógeno, reduciéndose a manitol: en la fermentación heteroláctica de la fructosa se producen, en efecto, notables cantidades de manitol y no de alcohol etílico ya que el acetofosfato no puede ser reducido porque el NADH2 se ha reoxidado a expensas de la fructosa con formación de manitol. Desde el punto de vista de la energía disponible por la célula, la fermentación heteroláctica pura, la que lleva a ácido láctico y alcohol etílico, permite la recuperación de un solo ATP; en efecto, 2 ATP se han formado por el gliceraldehído-3-fosfato que sigue la vía de la glucólisis y uno se ha consumido en la fosforilación de la glucosa y de la fructosa. Por el contrario, en el mecanismo que lleva a la formación de ácido acético se tiene una recuperación de 2 ATP, uno más, procedente de la excisión del acetofosfato. Tanto la fermentación heteroláctica como la homoláctica o la alcohólica representan mecanismos poco eficientes de utilización de energía por parte de la célula. En los vinos existen pequeñas cantidades de pentosas: arabinosa (l00 mg/L), xilosa (20 mg/L) y ribosa (40 mg/L). La ribosa procede del metabolismo de las levaduras mientras que la arabinosa y xilosa preexisten en el
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mosto. Algunas bacterias pueden atacar a la arabinosa y a la xilosa según el mecanismo de la vía de las pentosas, pasando a través de la xilosa-5-fosfato, según el esquema descrito para la fermentación heteroláctica de las hexosas. Fermentación maloláctica La transformación del ácido málico en ácido láctico se produce a través de unos mecanismos intermedios no aclarados aún. El fenómeno puede ser descrito globalmente así: HOOC-CH 2 -COHOH-COOH → CO 2 + CH 3 -CHOH-COOH ac. málico ac. láctico Se conocen diversos enzimas capaces de transformar el ácido málico con posible evolución final hacia el ácido láctico y en particular la malicodeshidrogenasa y el enzima málico. La intervención de la malicodeshidrogenasa, que lleva a la formación intermedia de ácido oxalacético y, después de la descarboxilación, a la de ácido pirúvico, no se ha considerado nunca en la fermentación maloláctica; sin embargo, se ha tenido, durante mucho tiempo, como responsable de la transformación al enzima málico, que también lleva a la formación de ácido pirúvico. Si se llega al ácido pirúvico, es necesaria la intervención de una lacticodeshidrogenasa para pasar a ácido láctico: en efecto, el enzima málico transforma exclusivamente el málico en pirúvico. PEYNAUD y LAFON-LAFOURCADE han observado que las bacterias lácticas del vino poseen las dos lacticodeshidrogenasas, la dextro( -) y la levo( +) y, así, en la fermentación de los azúcares son capaces de reducir el ácido pirúvico, a la vez, a d( -) láctico y 1(+) láctico. Pero en la fermentación maloláctica, es decir, en la transformación bacteriana del ácido málico en láctico, se produce la formación exclusiva de ácido 1(+) láctico: este hecho experimental demuestra que o no se produce el paso a través del ácido pirúvico o que, al menos, las lacticodeshidrogenosas no están involucradas en la fermentación maloláctica. Como confirmación de lo expuesto, RADLER ha aislado, a partir de bacterias lácticas, una preparación enzimática de la que ha eliminado la lacticodeshidrogenasa obteniendo un residuo enzimático capaz aún de transformar el ácido málico en ácido láctico. Según lo referido por LONDON a RIBEREAU-GAYON existen dos tipos de enzima (además de la malicodeshidrogenasa) que atacan al ácido málico. Uno con pH óptimo a 8,5, es el verdadero enzima málico, que transforma el ácido málico en pirúvico y la formación de ácido láctico depende de la presencia de lacticodeshidrogenasa, los isómeros ópticos producidos guardan relación con la naturaleza de los lacticodeshidrogenasas presentes. Este enzima no es sintetizado por las células bacterianas cultivadas sobre substratos ricos en glucosa. El otro enzima málico existente transforma directamente el ácido málico en ácido 1(+) láctico, tiene un óptimo de actividad en medio ácido y su producción por parte de las células bacterianas no es inhibida por grandes cantidades de glucosa en el substrato. Los mecanismos intermedios de la transformación no son conocidos aún, pudiéndose suponer una descarboxilación directa del ácido málico (aunque este mecanismo no es frecuente) o que el ácido pirúvico formado quede ligado al enzima y constituya una configuración estérica que lleve solamente a la formación del ácido l(+) láctico. Desde el punto de vista energético la fermentación maloláctica no libera energía ya que se produce el desprendimiento, bajo forma de CO2, de un átomo de carbono ya en su grado máximo de oxidación. La transformación es endoenergética, no pone ninguna energía a disposición de la célula, sin_ que ésta debe procurarse la energía necesaria de los glúcidos presentes en el medio no se trata pues de una verdadera fermentación. En necesario, sin embargo, tener presente que son suficientes 10 mg de bacterias (expresado en peso de sustancia seca) para transformar 1 gramo de ácido málico y que tal cantidad de bacterias requiere para su desarrollo 100 mg de azúcares. SI estos azucares fueran fermentados con fermentación heterolactica producirían sólo 50 mg de ácido láctico, 26 mg de alcoba y 22 mg de anhídrido carbónico. La fermentación maloláctica es, por tanto, un fenómeno de una cierta relevancia que viene acompañado por un desarrollo mínimo de bacterias y que no tiene justificación energética: la desacidificación puede crear, en el aumento de pH que se consigue, mejores condiciones en el medio para el desarrollo de las bacterias mismas. Al fenómeno de la fermentación maloláctica pueden ser útiles pequeñas cantidades de substancias nitrogenadas y también, en particular, la mesoinosita que puede encontrarse en cantidades de 0,5 g/L y parece disminuir
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fuertemente después de la fermentación maloláctica: la degradación de la mesoinosita se produce sin formación de ácidos volátiles. En la práctica, el principal factor condicionante del desarrollo de las bacterias responsables de la degradación del ácido málico es el pH: por debajo del pH 3,2 la fermentación maloláctica se hace difícil. El SO2 es un factor de inhibición, pero menos importante. Presentamos los diferentes esquemas que hemos descrito referidos a las transformaciones enzimáticas del ácido málico en ácido láctico: I. Malicodeshidrogenasa COOH
NAD
COOH
NADH2
CH2
C descarboxilasa
CH2
MDI
COOH
COOH
O
C
HO CH
CO2
NADH2
O
CH3
D (-) LDI L (+) LDI
ac. pirúvico
ac. oxalacético
COOH C
COOH
ac. málico
NAD
O
CH3 D (-) láctico L (+) láctico
II. Enzima málico COOH
NAD
CH2
COOH
NADH2
C
HO CH COOH ac. málico
ac. pirúvico
EM + Mn2+
NAD
O
CH3
CO2
NADH2
COOH C
D (-) LDI
O
CH3
L (+) LDI
D (-) láctico
III. Enzima maloláctica COOH COOH
CH2 HO CH
¿? EML
C
O
EML
COOH ac. málico
+
CO2
CH3 L (+) láctico
Descomposición bacteriana del ácido cítrico Durante la fermentación maloláctica puede, a veces, ocurrir el ataque del ácido cítrico con formación de ácido acético, responsables del aumento de la acidez volátil que se observa a lo largo de la degradación del ácido málico. Estudiando el balance de la descomposición bacteriana del ácido cítrico, CHARPENTIÉ ha demostrado que una molécula de ácido cítrico da entre 1,2 Y 1,5 moléculas de ácido acético, una cantidad muy pequeña de ácido láctico y entre 0,2 y 0,3 moléculas de 2,3-butanodiol y acetoíno. El mecanismo propuesto es el de la descomposición del ácido cítrico en dos moléculas, una de ácido acético y otra de ácido oxalacético. Este último pasa a ácido pirúvico con la posibilidad de formación de 2,3-butanodiol, acetoíno y ácido láctico. El ácido pirúvico, además, pasando a través del aceti1coenzima A como compuesto intermedio, puede dar ácido acético con producción de CO2 y eventualmente de ácido fórmico. Este mecanismo que prevé un doble origen del ácido acético rinde cuenta del hecho de que se forma más de una molécula por cada molécula de ácido cítrico:
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CH2 COOH HO
COOH Ac. cítrico
C
CH2 COOH
CH2 COOH
CH3 COOH Ac. acético
C O
COOH
Ac. oxalacético
CO2 Ac. láctico CO2
HS-CoA
CH2 COOH C
Acetilcoenzima A
O
CH3
2,3-butanodiol y acetoíno
Ac. pirúvico Degradación bacteriana del ácido cítrico
Degradación bacteriana de la glicerina El ataque de la glicerina por parte de las bacterias. es poco frecuente y corresponde a una alteración según la cual los vinos adquieren un amargor que sería debido a la formación de compuestos particulares, pr?ductos de reacción entre los polifenoles y la acroleína, un aldehído insaturado derivado de la glicerina. CH2 OH
reacción inversa
C
CH OH de la fermentación gliceropirúvica
CH2 OH Glicerina
O
COOH
C
O
CH2
H
O
CH2 OH
Glicólisis
C
CH OH P
CH2 O
Dioxiacetonafosfato
O
CH3
P
Ac. pirúvico
Glicero aldehído-3-fosfato
H2O Ac. láctico H2O
O
H
O
H
C
C
CH2
CH
CH2 OH Ald. β-oxipropiónico
CH2 acroleína
NADH2 NAD CH2 OH CH2 CH2 OH 1,3-Propanodiol
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Degradación bacteriana de la glicerina
Ac. acético Ac. fórmico Ac. succínico 2,3-butanodiol acetoíno
En el caso de esta alteración no se conoce, como ocurre para el ácido cítrico un balance de la transformación y se ha propuesto solamente Un esquema que tiene en cuenta los conocimientos generales que se tienen sobre la degradación de la g1icerina por los microorganismos. En la fermentación de la glicerina se forma también el 1,3-propanodiol, cuya presencia no ha sido demostrada en vinos alterados. El esquema propuesto lleva por un lado el ácido pirúvico, del cual deriva toda la serie de productos secundarios que ya conocemos; por otro lado preve la deshidratación de la glicerina a acroleína y la formación del l,3-propanodiol. Degradación bacteriana del ácido tartárico Esta degradación se produce en el curso de la alteración llamada «vuelta», alteración muy grave y bastante frecuente en otros tiempos que afecta a vinos con valores elevados de pH y, a menudo, a los vinos de calidad. Hoy, por la mejora de las técnicas de conservación, la alteración tiende a desaparecer. RADLER y YANISSIS han estudiado a fondo este tipo de alteración debido a un número limitado de especies bacterianas y que, según la especie, sigue dos mecanismos distintos, que llevan el primero a la transformación del ácido tartárico en ácido láctico y en ácido acético; el segundo a la producción de ácido acético y ácido succínico. El primer mecanismo es utilizado por Lactobacillus plantarum; el segundo por Lactobacillus brevis. Presentamos los esquemas de los dos mecanismos citados como han sido propuestos por RADLER y YANISSIS: Descomposición bacteriana del ácido tartárico (Lactobacillus plantarum) COOH
Mecanismo I:
NAD
COOH CH OH
COOH
H2O
C
O
CH2
COOH
COOH
Ac. láctico
O
H2O
CH3
Ac. oxalacético x2
CH3
COOH C
CH OH
Ac. tartárico x2
CO2 x 2
CH OH
NADH2
NAD
Ac. pirúvico x2
COOH
NADH2
+
CO2
CH3 Ac. acético
Descomposición bacteriana del ácido tartárico (Lactobacillus brevis) Mecanismo II: COOH CH OH
COOH
H2O
C
NADH2 NAD
O
COOH
H2O
COOH
NADH2
NAD
COOH
CH OH
CH
CH2
CH OH
CH2
CH2
CH
CH2
COOH
COOH
COOH
COOH
COOH
Ac. tartárico x2
Ac. málico
Ac. oxalacético x3
Ac. fumárico
Ac. succínico
CO2 x2 COOH C
NAD
NADH2
O
COOH
CH3 Ac. pirúvico x 2
CH3 H2O
CO2 x2
Ac. acético x2
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En los dos mecanismos expuestos se mantiene el equilibrio de óxido-reducción en el sentido de que a un número de moléculas de NADH2 le corresponde igual número de moléculas de NAD. Fermentación acética del alcohol El ataque del alcohol por parte de las bacterias tiene lugar en presencia de oxigeno, es decir en aerobiosis. La transformación global puede indicarse: CH 3 -CH 2 OH + O 2 → CH 3 -COOH + H 2 O Se tienen pasos intermedios a través del acetaldehído con la intervención de dos deshidrogenasas, una alcoholdeshidrogenasa y una aldehidodeshidrogenasa, todas ellas relacionadas con el NAD. La reoxidación de NADH2 se produce a expensas el oxígeno del aire a través de una cadena respiratoria que incluye una serie de transportadores de hidrógeno y es acompañada por almacenamiento de energia bajo forma de ATP. Existen dos complejos enzimáticos que funcionan según el mismo mecanismo pero, de los cuales, uno es soluble y se encuentra en la parte acuosa después de la disgregación de las células bacterianas, mientras que el otro queda fijado a la membrana citoplásmica de la célula. La existencia de estos dos complejos enzimáticos explica la diferente velocidad con la que las bacterias pueden oxidar el alcohol en medio ácido y neutro. La oxidación bacteriana del alcohol puede ser representada del modo siguiente: OH CH3 CH
CH3
CH2
OH
etanol
OH
2 NAD
2 H2O
transportador de electrones
aldehidodeshidrogenasa
2 NADH2
O2
CH3 COOH ácido acético H2O CH3 CHO acetaldehido
Algunas bacterias acéticas tienen la posibílidad de realizar una posterior oxidación del ácido acético a agua y anhidrido carbónico: CH 3 -COOH + 2 O 2 → 2 CO 2 + 2 H 2 O La ecuación global de la fermentación acética es entonces: CH 3 -CH 2 OH + 3 O 2 → 2 CO 2 + 3 H 2 O Se llega en este caso a la completa mineralización de los azúcares, a través de las fermentaciones alcohólicas y acética y la oxidación final del ácido acético. Las especies de bacterias acéticas que oxidan el ácido acético no son numerosas; esta posibilidad de oxidación se utiliza como un criterio de clasificación. Está claro que la evolución espontánea del mosto no lleva naturalmente al vino, sino al vinagre y el vino debe, por tanto, considerarse como una fase intermedia de la degradación de los azúcares del mosto. Las bacterias acéticas además de la oxidación del alcohol provocan en las primeras fases de la fermentación acética la esterificación del ácido acético y del alcohol con formación de acetato de etilo:
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CH 3 -CH 2 OH + CH 3 -COOH → CH 3 -CO-O-CH 2 -CH 3 + H 2 O El acetato de etilo es el principal responsable del carácter organoléptico picado acético, carácter que se hace evidente cuando supera el contenido de 200 mg/L. Oxidación de los azúcares por las bacterias acéticas Las bacterias acéticas tienen la capacidad de oxidar los azúcares con formación de grupos cetónicos. Estos derivados cetónicos están presentes en todos los vinos, pero resultan más abundantes en los que provienen de vendimias afectadas de podredumbre, donde se ha producido rotura de las bayas con la consiguiente posibilidad de desarrollo notable de bacterias acéticas. Estos derivados cetónicos contribuyen a la combinación del anhídrido sulfuroso. Presentamos la derivación de algunos compuestos de los azúcares correspondientes, independientemente de los mecanismos concretos de formación: CH2 OH
CH2 OH
C
O
C
O
HO
C
H
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
C
O
CH2 OH D-fructosa
CHO
CHO
H
C
OH
C
OH
HO
C
H
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
CH2 OH
CH2 OH
CH2 OH
Xilosona
Xilosa
5-ceto-fructosa
O
OH C
O
H
O C
OH
HO
C
H
OH
H
C
OH
OH
H
C
OH
OH
HO
C
H
H
C
H
C
CH2 OH D-glucosa
HO
C
H
H
C
OH
H
C
OH
OH
H
C
O
OH C
Ac. 2-cetoglucónico
C
O
HO
C
H
H
C
OH
C
O
O
H C
CH2 OH Ac. D-glucónico
O
CH2 OH
C
C H
C
CH2 OH
H
C
OH
HO
C
H
H
C
OH
C
O
Ac. 2,5-dicetoglucónico
CH2 OH Ac. 5-cetoglucónico
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CAPITULO DECIMOCUARTO
Comparación entre la composición del mosto y del vino Habiendo examinado las principales transformaciones sufridas por el mosto como consecuencia de la actividad de los enzimas, las levaduras y las bacterias de la fermentación maloláctica, podemos hacer una comparación entre la composición del mosto y la del vino. En la hipótesis de que los fenómenos de la fermentación y de la degradación del ácido málico se sucedan separadamente podremos establecer una primera comparación después de la fermentación alcohólica y otra después de la degradación del ácido málico. Si nos referimos al mosto recién prensado y límpido por centrifugación o filtración, está esencialmente caracterizado por su contenido en azúcar, lo que permite una buena aproximación al grado alcohólico después de la fermentación, contenido en ácidos orgánicos tartárico, málico, cítrico y pequeñas cantidades de ácido galacturónico. En el mosto límpido recién prensado están poco representados los polifenoles y faltan las substancias colorantes, que serán cedidas en el curso de la maceración en el caso de la vinificación en tinto y, por lo tanto, un examen del mosto a este respecto no es representativo de la situación que se encontrará en el vino y que vendrá determinada por el tipo de vinificación, con maceración más o menos prolongada, por termovinificación, etc. El análisis del mosto destinado a vinificación en blanco, especialmente si se efectúa después de la clarificación, puede dar resultados equivalentes en lo que respecta al contenido en polifenoles del vino futuro. En el curso de la fermentación los azúcares se transforman en alcohol etílico y en los distintos productos secundarios que, según hemos visto, pueden derivarse tanto de los azúcares como del metabolismo de los aminoácidos. En relación con el mosto se tiene la formación de toda una serie de nuevos compuestos, la mayor parte de ellos consecuencia de fenómenos fermentativos pero también derivados de la actividad enzimática preexistente en el mosto.
Glicerina y butanodiol Entre los compuestos originados con la fermentación tenemos la glicerina. Ya hemos indicado que el 8% de las moléculas de azúcar siguen la fermentación gliceropirúvica. La glicerina puede incluso estar presente en el mosto procedente de uvas con podredumbre, especialmente después de ataques de Botrytis cinerea y, en particular, en los mostos de uvas sometidas a «podredumbre noble» para la producción de vinos licorosos obtenidos de uvas pasificadas con la intervención del hongo, sobre la vid o sobre esteras. Es interesante presentar algunos datos obtenidos en colaboración con CASTINO sobre mostos procedentes de uva del año 1968 en el que la uva de la zona se presentaba en maduración, más o menos dañada por ataques de podredumbre. Se tomó una muestra de mosto procedente de la cosecha completa de cada variedad y, a la vez, se eligieron algunos racimos totalmente sanos Y de éstos se eligieron bayas una a una para obtener un mosto procedente de uva íntegra. Los resultados aparecen en la tabla 21.
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TABLA 21 Mosto de racimos íntegros Mosto de la masa estrujada Alcohol Alcohol 2,3 2,3 Variedad Extracto Extracto Glicerma Glicerina % en % en butanodiol butanodiol g/L g/L g/L g/L mg/L volumen mg/L volumen Erbaluce 218,9 0,00 0,000 76 Pinot blanco 235,7 0,00 0,327 34 Dolcetto 216,3 0,03 0,687 113 198,7 0,03 1,192 114 Riesling 209,4 0,00 1,020 45 235,7 0,11 5,180 72 Nebbiolo 239,9 0,00 0,063 80 237,3 0,09 2,100 125 Freisa 189,2 0,00 0,399 65 219,2 0,09 3,640 72 Como se ve, se pueden encontrar antes del inicio de la fermentación cantidades notables de glicerina (cuya presencia ha sido confirmada por cromatografía sobre papel) en mostos que han dado después vinos normales en cuanto a caracteres organolépticos y acidez volátil. Algunas uvas íntegras no contienen glicerina, sin embargo, se encuentran pequeñas cantidades en uvas de aspecto perfectamente sano. Por otra parte no siempre las uvas pasificadas dan mostos ricos en glicerina como consecuencia del metabolismo de Botrytis cinerea; en efecto, las mismas uvas de Erbaluce perfectamente sanas de la vendimia 1968 han sido muestreadas después de la pasificación (tabla 22). TABLA 22 Densidad Extracto 20º/20º g/L Mosto de Erbauce fresca 1,0840 219 Mosto de Erbauce pasificada 1,1204 315
Glicerina g/L 0,00 0,104
Butanodiol mg/L 76 174
También los mostos concentrados contienen cantidades muy variables de glicerina (tabla 23).
Mostos concentrados 1 2 3 4 5
TABLA 23 Densidad Glicerina 20º/ 20º g/L 1,3829 1,3749 1,3427 1,3535 1,3429
2,280 0,817 5,240 1,910 6,910
Butanodiol mg/L 364 262 328 408 694
Conviene señalar que pequeñas cantidades de glicerina en los mostos concentrados pueden proceder de la actividad de levaduras osmófilas, a las cuales se atribuyen las trazas de alcohol que normalmente se encuentran en estos productos. No debe extrañamos, entonces, que la cantidad de glicerina contenida en los vinos varíe entre 5 y 20 g/L con valores medios en torno a 8 - 10 g/L. Se supone, o mejor suponen los franceses, que la relación entre glicerina en g/L y alcohol en g/L para vinos normales varía entre 6/100 y 8/100. Relaciones más elevadas serían índice de adición de glicerina, pero de cuanto se ha dicho hasta ahora se desprende que hay que ser prudentes antes de llegar a conclusiones similares. Otro poli alcohol formado en el curso de la fermentación es el 2,3-butanodiol que se encuentra en los vinos en contenidos que van de 0,4 a 1,3 g/L. Junto al butilenglicol se encuentra el acetilmetilcarbinol pero en pequeñas cantidades comprendidas entre 2 y 20 mg/L con valores medios en tomo a 6-8 mg/L. La formación de glicerina y del 2,3-butanodiol tiene lugar preferentemente al inicio de la fermentación; el fenómeno es, sin embargo, más acentuado (tabla 24) en el caso de la glicerina que en el del butilenglicol.
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TABLA 24 Vinificación en tinto en garrafas de 10 Litros en termostato a 27 ºC
114 125 153 444 583 673
0,09 0,24 0,54 1,69 6,03 8,92 10,70 11,91
2,100 2,610 2,750 4,050 8,610 9,790 10,610 11,260
125 136 162 241 534 660 700 757
Butanodiol mg/L
1,192 2,081 3,620 7,770 10,050 10,220
Glicerina g/L
0,03 0,22 0,88 4,59 7,86 9,92
Alcohol en % vol.
Butanodiol mg/L
105 105 138 398 380 400
Butanodiol mg/L
Glicerina g/L
0,832 0,976 3,060 6,120 6,240 6,600
Glicerina g/L
Alcohol en % vol.
0,10 0,16 2,41 8,48 9,54 11,21
Freisa 1968
Alcohol en % vol.
Butanodiol mg/L
Nebbiolo 1968
Glicerina g/L
Dolcetto 1968
Alcohol en % vol.
Vinificación en blanco en cubas de 1 hL a 18 – 20 ºC Pinot 1968
0,09 0,22 0,97 6,04 7,97 9,33 10,31
3,640 3,830 3,590 8,880 9,380 9,860 10,050
72 107 160 504 556 607 640
Fig. 13
Acido acético y acetato de etilo En los vinos también tenemos la formación de ácido acético y acetato de etilo que no están presentes en los mostos de uvas sanas. Sin embargo, el desarrollo de bacterias acéticas sobre uvas dañadas comporta una cierta acidez volátil en los mostos procedentes de uvas con podredumbre, pero, como hemos visto, la acidez volátil preexistente disminuye en el curso de la fermentación alcohólica a un ritmo que es función lineal de aumento de grado alcohólico, como lo demuestra el diagrama siguiente obtenido del análisis a lo largo de la fermentación de un mosto de uva Barbera 1969 pasteurizado a 70 ºC durante 30' y sembrado con una cepa de Saccharomyces cerevisiae:
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Fig. 14
El acetato de etilo es producido después por las bacterias acéticas en las fases iniciales de la acetificación y es completamente metabolizado al progresar y ultimarse la fermentación acética: en un vinagre producido por nosotros partiendo de un vino Barbera de 8° de alcohol y con una acidez después de la fermentación acética del 7,08 % no ha sido encontrada la presencia de acetato de etilo. La determinación mediante cromatografía de gases del acetato de etilo en 172 vinos de todas las regiones de Italia ha dado contenidos que varían entre 30 mg/L y valores superiores a 200 mg/L, sólo en tres casos se han encontrado valores superiores a 200 mg/L y siempre en presencia de una elevada acidez volátil. Sin embargo, son numerosas las muestras con valores comprendidos entre 90 y 140 mg/L y con valores inferiores a 90 mg/L. Como el ácido acético y el acetato de etilo proceden del metabolismo de las levaduras y de las bacterias acéticas es interesante examinar las relaciones que existen entre el contenido en acetato de etilo y el valor de la acidez volátil de los vinos. Las 172 muestras de vino analizadas se han dividido en dos grupos: con acidez volátil inferior o igual a 0,60 g/L y con acidez superior a 0,60 g/L. Hasta 0,60 g/L se puede suponer convencionalmente que la acidez volátil es fruto del metabolismo de las levaduras preferentemente. Los valores de acetato de etilo encontrados en las muestras analizadas en correspondencia a los dos niveles de acidez volátil se presentan en la tabla 25. TABLA 25 nº de muestras Ac. volátil ≤ 0.60 g/L
78
Ac. volátil> 0,60 g/L
94
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Acetato de etilo mg/L 0-40
40-80
80-120
35 (44,9%) 36 (46,1%) 7(9,0%) 2(2,1%)
> 120 -
43 (45,7%) 33 (35,1%) 16 (17,0%)
Si para estos. dos grupos de vino analizados se calcula el coeficiente de correlación lineal entre acidez volátil y acetato de etilo se encuentra en ambos casos una correlación significativa como era de esperar ya que la formación de los dos componentes sucede a la vez, sea durante la fermentación alcohólica o en el proceso de avinagramiento. Sin embargo, en el caso de los vinos con acidez volátil superior a 0,60 g/L la correlación resulta mucho más estrecha y con un nivel de significación más elevado: si se tiene en cuenta que en la fermentación alcohólica el ácido acético, como dijimos, se forma preferentemente en las primeras fases mientras que el acetato de etilo es producido proporcionalmente al alcohol, se comprende la correlación lineal menos estrecha para el grupo de vinos en los que los dos productos derivan del metabolismo de las levaduras respecto al grupo en los que la producción se debe preferentemente al metabolismo de las bacterias acéticas. El ácido succínico no existe en el mosto mientras en el vino se puede encontrar en contenidos que van de 0,5 a 1,0 g/L. Se trata de un ácido diácido HOOC - CH2 -CH2 - COOH, privado de hidroxilos en la molécula y, como consecuencia, más débil que el ácido málico y que el ácido tartárico. Presentamos para que sirvan de comparación las fórmulas y los valores logarítmicos con signo cambiado (pK) de la primera y de la segunda constante de disociación, determinadas por nosotros por vía potenciométrica. Los valores corresponden a una solución acuosa: más tarde indicaremos los relativos a diferentes graduaciones alcóhólicas. pK1 pK2 ácido tartárico HOOC - CHOH - CHOH – COOH 3,04 4,38 3,48 5,11 ácido málico HOOC - CH2 - CHOH – COOH ácido succínico HOOC - CH2 - CH2 – COOH 4,21 5,63 La formación del alcohol en cantidades que superan el 10% en volumen tiene consecuencias físico-químicas: de acuosa la solución se hace hidroalcohólica. Una primera consecuencia de la alcoholización es la disminución de la solubilidad de las sales poco solubles, bitartrato de potasio y tartrato neutro de calcio, con la consiguiente precipitación. Respecto al mosto se tiene por tanto un empobrecimiento en ácido tartárico, en potasio y en calcio. El calcio que en el mosto es más abundante que el magnesio como vimos antes, en el vino se encuentra en menor cantidad: todas las sales de magnesio de los ácidos orgánicos son solubles y la disminución respecto al mosto es sólo la que corresponde a la asimilación por parte de las levaduras. En lo que respecta al bitartrato potásico y al tartrato de calcio el vino, a pesar de las precipitaciones, mantiene una sobresaturación de estas dos sales, es decir, mantiene en solución cantidades muy superiores a la solubilidad de las sales mismas: volveremos sobre este problema examinándolo de forma particular. En cuanto al ácido málico, hemos visto que, como consecuencia de la fermentación malo alcohólica puede disminuir un 10-25%; sus sales son solubles y puede ser extraído por maceración de las partes sólidas. La fermentación supone la formación de pequeñas cantidades de ácido láctico, en general D ( -) láctico, a partir de los azúcares por obra de las levaduras: se forman contenidos generalmente inferiores a 0,5 g/L. Sulfatos y fosfatos disminuyen en el paso de mosto a vino por asimilación por parte de las levaduras; los sulfatos se reducen, en parte, hasta sulfuro de hidrógeno por la necesidad de la síntesis de los aminoácidos azufrados, metionina y cisteína, por las levaduras. En este proceso de reducción de los sulfatos se produce, como hemos visto, anhídrido sulfuroso, generalmente en cantidades muy modestas, salvo en el caso de algunas cepas particulares de levaduras extremadamente raras, especialmente en las regiones italianas. En la vinificación en tinto se produce el paso a la solución de los antocianos y de los polifenoles, flavonoles y flavonodioles los cuales, como vimos, son susceptibles de evolucionar en el tiempo por polimerización: volveremos sobre este aspecto al estudiar los fenómenos correspondientes al envejecimiento. De origen no fermentativo, sino derivado de una hidrólisis enzimática se encuentra en el vino el ácido galacturónico en tomo a valores de 0,5 g/L para vinos blancos y de 1 a 2 g/L para vinos tintos en los que, como consecuencia de la maceración, las pectinas pasan a la solución en mayor cantidad con el correspondiente aumento del ácido galacturónico por hidrólisis enzimática a cargo de una poligalacturonasa del mosto. De origen enzimático, y procedente de la pectina, por intervención de la pectimetilesterasa, se encuentra en el vino el alcohol mefítico que, por ley, debe ser inferior a 0,2 mL % del alcohol anhidro en los vinos blancos y a 0,3 mL % de alcohol anhidro en los tintos. Evolución de las substancias nitrogenadas En cuanto a las substancias nitrogenadas tenemos en el vino la desaparición casi total del nitrógeno amoniacal asimilado por las levaduras que asimilan igualmente los aminoácidos para la síntesis de sus proteínas.
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El cuadro de los aminoácidos del mosto es modificado notablemente por la fermentación a causa de un fenómeno de excreción por parte de las levaduras: entre los aminoácidos excretados en mayor cantidad está el ácido glutámico que, como hemos visto, representa el punto de partida para la asimilación del nitrógeno amo niacal y el elemento fundamental para la síntesis de todos los otros aminoácidos. El aminoácido más abundante en el mosto, la prolina, sigue siéndolo también en el vino de manera que se ha afirmado que la prolina no es asimilada por las levaduras en anaerobiosis sino que éstas ceden prolina al substrato fermentativo. Recientes experiencias han demostrado que estas afirmaciones no tienen un valor absoluto. La prolina es asimilada por las levaduras también en anaerobiosis aunque en menor medida que otros aminoácidos. La asimilación de la prolina está relacionada con el contenido nitrogenado del mosto: en mostos muy pobres en nitrógeno la prolina puede ser metabolizada por las levaduras hasta desaparecer en el vino, al contrario, cuando el contenido en nitrógeno del mosto es elevado se pueden registrar cesiones de prolina como consecuencia del proceso de reelaboración de compuestos nitrogenados por las levaduras. Como ocurre con el nitrógeno total, también el contenido en prolina es una característica ligada a la variedad, aunque fuertemente influida por el año. La convicción, en otro tiempo muy difundida, de que el contenido en prolina pudiera considerarse un índice seguro de genuinidad al no ser asimilada por las levaduras y que todos los vinos poseían al menos 200 mg/l de prolina se ha demostrado que no es válida en investigaciones más cuidadosas. La mayoría de los vinos posee cantidades de prolina superiores al límite indicado, pero también puede resultar ausente o en contenidos mínimos en vinos absolutamente genuinos: esto sucede, generalmente, en vinos obtenidos de mostos con bajo contenido en nitrógeno total. La prolina como factor discriminante de genuinidad puede conservar su validez en relación con un vino de origen determinado. Los alcoholes superiores Otras substancias presentes en el vino y que, como hemos visto, proceden en parte del metabolismo de los glúcidos y en parte del de los aminoácidos, son los alcoholes superiores. Veamos los resultados obtenidos en un análisis por cromatografía de gases de 172 vinos de todas las regiones italianas. En los vinos se encuentra, a veces en cantidades apenas determinables, la presencia de l-butanol (CH3 - CH2 CH2 - CHOH) y de 2-butanol (CH3 - CHOH -CH2 - CH3). El 1-butanol se ha encontrado sólo en el 7,5% de las muestras examinadas en cantidades comprendidas entre 1 y 5 mg % de alcohol anhidro, es decir, por litro de un vino de 10°. El 2-butanol está presente en el 28% de las muestras analizadas y el contenido máximo encontrado ha sido de 3, l mg % de alcohol anhidro. Así, el 2-butanol no se encuentra jamás presente en el vino por encima de 5 mg % de alcohol anhidro y, por tanto, los destilados de vino no deben contener mayor cantidad. El 2-butanol se forma, por el contrario, en cantidades más importantes, a causa de la actividad bacteriana, en los orujos ensilados en espera de destilación para la producción de la «grappa»; este alcohol puede servir como elemento seguro de distinción entre los destilados de orujo (grappa) y los de vino; en estos últimos no debe superar el valor de 5 mg % de alcohol anhidro. Los otros cuatro principales alcoholes superiores presentes en los vinos son, como sabemos, el 1-propanol, el 2-metil-1-propanol (isobutílico), el 3-metil-l-butanol (isoamílico inactivo) y el 2-metil-1-butanol (isoamílico activo): de ellos hemos visto la doble posibilidad de formación a partir de los azúcares y a partir de los aminoácidos. Si sumamos los valores de estos cuatro alcoholes y comparamos el contenido total para los vinos italianos agrupados por regiones, el tratamiento estadístico de los datos lleva, no sólo a destacar la existencia de una diferencia altamente significativa, sino que permite distinguir significativamente los vinos piamonteses, que poseen el contenido más elevado de los vinos sardos, que muestran los contenidos menores. También los vinos sicilianos se muestran pobres en alcoholes superiores y se prestan, junto con los sardos, para la obtención de destilados con bajo contenido de alcoholes superiores. Los alcoholes superiores totales (refiriéndonos a los cuatro principales indicados) expresándolos en mg % de alcohol anhidro, varían desde un mínimo de 131 mg hasta un máximo de 526 mg; la media de los 172 vinos ha resultado de 303 mg y no han aparecido diferencias entre los vinos blancos y tintos. Un análisis de varianza sobre los datos obtenidos de vinos procedentes de uva de la misma variedad cultivada en el mismo viñedo durante ocho años consecutivos ha demostrado que el contenido en alcoholes superiores totales está muy influido por el cultivar y sólo modestamente por el año de producción.
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Examinamos ahora cada uno de los alcoholes superiores. El l-propanol está presente en los vinos en contenidos que van de un mínimo de 4 mg % de alcohol anhidro a un máximo de 33 mg; el valor medio es de 15 mg y representa sólo el 5% de los alcoholes superiores totales de los vinos. El contenido en l-propanol (tabla 26) resulta fuertemente influido tanto por la variedad como por el año de producción. E1 2-metil-1-propanol (alcohol isobutílico) se encuentra en contenidos que van de 14 mg % de alcohol anhidro a 152 mg, con un valor medio de 66 mg equivalente al 21,4% de los alcoholes superiores totales. Su contenido es influido fuertemente por la variedad y menos por el año de producción. El 3-metil-l-butanol (alcohol isoamílico inactivo) se encuentra en los vinos desde un mínimo de 57 mg % de alcohol anhidro a un máximo de 280 mg, con un valor medio de 144 mg equivalente al 47% de los alcoholes superiores totales. También la cantidad de alcohol isoamílico inactivo está influida por la variedad y por el año de producción, pero en menor medida que los otros dos alcoholes examinados. Por fin, el 2-metil-I-butanol (alcohol isoamílico activo) está presente en los vinos desde un mínimo de 30 mg % a un máximo de 162 mg con un valor medio de 82 mg, en torno al 26,6% de los alcoholes superiores totales. También la presencia de este alcohol viene influida por la variedad y el año de manera parecida al isoamílico inactivo. TABLA 26 Valores expresados en mg % de alcohol anhidro Máximo
Media
% alcoholes totales
4
33
15
5
14
152
66
21,4
57
280
144
47
30
162
82
26,6
Mínimo CH3 CH2 CH2 OH
1-propanol CH3 CH3 CH CH2 OH
2-meti1-1-propanol (Alc. isobutílico) CH3 CH3 CH CH2 CH2 CH2 OH
3-metil-1-butanol (isoamílico inactivo) CH3 CH2 CH CH2 OH CH3
2-meti1-1-butano1 (isoamílico activo)
La formación de los alcoholes superiores en el curso de la fermentación alcohólica sucede linealmente con la producción de alcohol etílico para todos los alcoholes excepto para el l-propanol que se forma fundamentalmente en las primeras fases de la fermentación. La evolución se representa en el diagrama de la página siguiente. Hay que señalar la presencia en el vino del ácido glucónico, producto de oxidación de la glucosa y primer término de la degradación de las hexosas por la vía de las pentosas. En los vinos procedentes de vendimias fuertemente atacadas por polilla, este ácido ha sido encontrado por VENTRE en contenidos excepcionalmente elevados de hasta 7-10 gramos por litro. También el ácido glucurónico, que generalmente representa sólo el 5% del ácido galacturónico, puede encontrarse en cantidades mayores en vinos procedentes de uvas atacadas por polilla o con abundante podredumbre, Variación en el contenido coloidal En el paso del mosto al vino se produce, en el caso de la vinificación en blanco, un marcado empobrecimiento en substancias coloidales,
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Se produce la insolubilización de la mayor parte de las proteínas que forman complejos de elevadas dimensiones moleculares con los leucoantocianos, los coloides de naturaleza glucídica y las pectinas. En el caso de la vinificación en blanco, la menor cantidad de polifenoles presentes respecto a una vinificación con maceración, puede permitir la permanencia en solución en el vino de complejos coloidales con las proteínas, que son después susceptibles de precipitación dando origen a la denominada «quiebra proteica». En la vinificación en blanco se produce además la desaparición de la casi totalidad de las pectinas presentes de manera que se registra una neta caída en el contenido en coloides totales, a pesar de la cesión de mananas y proteínas por parte de las levaduras. Los fenómenos de formación de complejos coloidales con las consiguientes precipitaciones, los de degradación de las pectinas y los de cesión por parte de las levaduras suceden también en el caso de la vinificadón en tinto, pero en este caso existen algunas diferencias. Debido a la gran cantidad de polifenoles presentes, las proteínas sufren una más marcada insolubilización y en los vinos tintos se encuentran cantidades de substancias proteicas del orden de 30 mg/L. Cerca de una tercera parte de éstas presentan pesos moleculares superiores a 200.000 y están probablemente involucradas en la formación de complejos macromoleculares con coloides de naturaleza glucídica. En la vinificación en tinto se tiene además una marcada cesión de coloide s de las partes sólidas de modo que el vino resulta bastante más rico en ellos que el mosto límpido de partida. Los hechos expuestos se ilustran claramente en los datos presentados en la tabla 27. TABLA 27
Mosto Moscato 1972 Vino Moscato 1972 Mosto Nebbiolo 1973 Vino Nebbiolo 1973 en el desvinado Mosto Barbera 1972 Vino Barbera 1972 en el desvinado Vino Barbera 1972 después de 2 años y 5 meses
Coloides totales desecados bajo vacío mg/L 525 282 280 498 625 1.150 712
Fig. 15
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Fig. 16 – Representación esquemática de los tipos de micelas coloidales en solución acuosa: en a) micela esférica b) micela cilíndrica c) micela laminar
TABLA 28 Composición de los coloides totales: porcentaje de los monómeros. Galactosa
Manosa
Arabinosa
Rarnnosa
Ac. urónicos
Mosto Nebbiolo 1973
37,68
3,82
15,68
3,87
38,95
Mosto Nebbiolo 1973 después de la eliminación de las pectinas
51,34
9,36
25,38
2,73
11,13
Vino Nebbiolo 1973 en el desvinado
38,42
25,50
17,04
5,28
13,76
Mosto Moscato 1972 después de la eliminación de las pectinas
51,30
10,10
18,00
4,33
16,17
Vino Moscato 1972 completamente fermentado
45,00
34,40
11,79
2,05
6,76
Mosto Barbera 1972 después de la eliminación de las pectinas
45,68
7,30
21,99
6,24
18,79
Vino Barbera 1972 en el desvinado
34,92
18,30
20,20
8,96
7,62
Vino Barbera 1972 conservado durante 2 años y 5 meses
31,64
39,85
12,30
5,39
10,82
Además, la composición de los coloides del vino es diferente de la de los coloides del mosto como consecuencia de la degradación de las pectinas y de la cesión de polímeros de manosa por parte de las levaduras. La diversidad en la composición coloidal entre el mosto y el vino se aprecia claramente en el análisis, referido a distintos monómeros constituyentes de los mismos coloides, expresados porcenfualmente en la tabla 28. En los datos expuestos se observa la mayor proporción de manosa en el vino respecto al mosto y el menor porcentaje de ácido galacturónico. Después de la fermentación maloláctica se observan las modificaciones que se derivan de la transformación cuantitativa del ácido málico en ácido L (+) láctico. También está involucrado el ácido cítrico que, como hemos visto, se transforma fundamentalmente en ácido acético con aumento de la acidez volátil. La fermentación maloláctica tiene una influencia físico-química que se manifiesta por un aumento del pH, ya que el ácido láctico es más débil que el málico y puede determinar como consecuencia también, una precipitación de bitartrato
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potásico. Con el aumento de pH aumenta la cantidad de tartárico semisalificado y se puede provocar una insolubilización del crémor. El efecto sobre el pH de la transformación del ácido málico en láctico lo examinaremos al estudiar los equilibrios de salificación en el vino. Evolución de los aminoácidos y de los oligopéptidos del mosto al vino La influencia ejercida por las levaduras en el curso de la fermentación sobre las substancias nitrogenadas no ha sido evaluada de forma detallada hasta que no se ha dispuesto de analizadores automáticos de aminoácidos. Nosotros hemos seguido la evolución de los aminoácidos y de los oligopéptidos del mosto al vino en los casos de vinificación en blanco y vinificación en tinto, determinando 20 aminoácidos, determinando 20 aminoácidos, que han sido fijados junto a los oligopéptidos sobre resina catiónica fuerte. Después de la elución y concentración, el residuo ha sido disuelto en un cierto volumen; una alicuota ha sido sometida a análisis y otra a hidrólisis en ampolla cerrada en solución clorhídrica 6 M a 100 °C durante 48 horas, para liberar los aminoácidos ligados en los polipéptidos Vinificación en blanco Se ha analizado un mosto de Riesling itálico de 1984. Los resultados aparecen en la tabla 29. TABLA 29 Riesling 1984 d = 1,0802. Azúcares = 187,5 g/L. Acidez total = 108 mq/L. pH = 3,04 Arninoácidos (rng/L) Fosfoserina Ac. aspártico Treonina Serina Ac. glutámico Prolina Citrulina Glicina Alanina ValiDa Metionina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilalanina Omitina Ac. γ-aminobutírico Lisina Histidina Arginina INaminado
0
5,83
ALCOHOL(%) 6,74
Libres Péptidos Libres Péptidos Libres Péptidos 10,22 5,12 Trazas Trazas 15,82 1,71 20,08 Trazas Trazas 27,56 50,88 Trazas 168,60 16,43 156,24 1,08 135,68 0,76 0,66 Trazas 7,04 0,75 10,88 0,73 17,70 1,58 28,42 1,68 Trazas 1,24 15,12 1,73 45,87 10,92 1,30 2,01 2,49 0,71 1,19 3,44 2,32 2,75 9,21 2,14 Trazas 47,31 1,44 53,94 8.63 64,31 12,10 36,44 1,17 21,02 -
8,66
9,73
Libres Péptidos Libres Péptido 1,16 1,16 2,77 2,50 0,50 7,02 Trazas 2,03 1,30 0,97 Trazas 2,26 0,60 5,06 2,33 2,76 14,20 85,32 22,60 116,16 43,17 2,39 1,60 7,64 1,52 4,79 8,41 1,03 2,58 1,73 0,61 2,07 1,46 0,51 1,53 0,70 0,47 8,97 10,38 4,77 10,08 11,72
El nitrógeno de los oligopéptidos representa el 18% y proviene esencialmente de la contribución de ácido aspártico, del ácido glutámico y de la prolina, que por sí solos representan el 15,9%. La prolina representa el 48,7% del nitrógeno polipeptídico. El mosto ha sido inoculado con una cepa de Saccharomyces cerevisiae. Al cuarto día de fermentación, en presencia de 5,83° de alcohol, se observa una asimilación completa, por parte de las levaduras, de todos los aminoácidos ácidos y neutros y de todos los polipéptidos, con excepción de la prolina que es asimilada en un 14%. Al 8° día, en correspondencia con 6,74° de alcohol, la asimilación de los aminoácidos y polipéptidos ácidos y neutros se mantiene completa y la prolina ha sido asimilada en un 26,7%. Al 11 ° día, con 8,66° de alcohol, la prolina está asimilada en un 53,9%.
- 130 -
En este momento, sin embargo, se comienza a notar una pequeña cesión de polipéptidos que contienen también aminoácidos no presentes en el mosto como la alanina y la fosfoserina.
Fig. 17
Fig. 18 Ligada a los polipéptidos, también la prolina comienza a ser cedida en la medida del 12,2% de la que estaba presente en el mosto original y del 20,9% de la presente en el vino. Al 19° día, con 9,73° de alcohol, se observa una cesión más importante de péptidos, que representan el 42% del nitrógeno de los aminoácidos ácidos y neutros. Al final de la fermentación se encuentra el 60,15% de los aminoácidos ácidos y neutros contenidos inicialmente en el mosto; sin embargo, en el mosto estos aminoácidos estaban bajo forma de péptidos sólo en un 18%. Con excepción de la prolina que se encuentra como péptido en un 27%, el resto de los aminoácidos están ligados a los péptidos en la medida del 40-90%: la fermentación supone pues un cambio profundo en la estructura de los oligopéptidos. Al final de la fermentación la prolina se encuentra en una cantidad correspondiente al 86,1% de la inicial en el mosto; esta cantidad inicial disminuye durante la fermentación hasta el 53,8% para aumentar después nuevamente. El comportamiento descrito es característico de los mostos blancos pobres en nitrógeno. La evolución de la prolina se ilustra en las figuras 19-a y 19-b. Todo lo que hemos expuesto hasta ahora concierne a los aminoácidos ácidos y neutros presentes en el mosto para un contenido total de 46,16 mg/l de nitrógeno.
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Fig. 19a.-Riesling.
Fig. 19b.-Riesling. El mosto contiene, sin embargo, 30,25 mg/l de nitrógeno debido a los aminoácidos básicos; el nitrógeno de los oligopéptidos representa el 12,43% del nitrógeno básico total. A 5,83° de alcohol se observa una intensa asimilación de todos los aminoácidos básicos, salvo la arginina, que parece jugar un papel similar al de la prolina. Sin embargo, a 6,74° de alcohol, más del 82% de la arginina está asimilada y la asimilación es completa a 8,66° de alcohol. A 9,73° de alcohol se observan trazas de ácido y-aminobutírico y una cantidad de arginina del 18,4% de la inicial en el mosto, Al final de la fermentación el nitrógeno de los aminoácidos y péptidos ácidos, neutros y básicos representa el 40,3% del presente inicialmente en el mosto, Mientras en el mosto original el 15,8% del nitrógeno formaba parte de enlaces peptídicos, después de la fermentación queda involucrado en enlaces peptídicos el 38% del nitrógeno presente, Los datos expuestos ilustran, al mismo tiempo, la intensa disminución de los aminoácidos y el cambio de los compuestos nitrogenados como consecuencia del fenómeno fermentativo. Los cromatogramas de las figuras 20-a a 25 muestran de manera evidente los fenómenos descritos.
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Fig. 20-a
Fig. 20-b
Fig. 21
- 133 -
Fig.22
Fig. 23
Fig. 24
Fig. 25
- 134 -
Vinificación con maceración Los fenómenos se han estudiado sobre un mosto Nebbiolo 1984 y los resultados se exponen en la tabla 30. TABLA 30 Nebbiolo 1984 d = 1,0822. Azúcares = 185,4 g/L. Acidez total = 165,4 mq/L. pH = 2,97
327,0 209,0 200,8 156,8 173,3 28,9 -
Péptidos
Nitrógeno total Nitrógeno amoniacal
1,62 2,25 1,72 2,24 0,73 1,86 0,66 3,20 0,49 0,83 3,46 0,41 1,53 2,58 3,94 6,04 269,84 7,32 294,22 12,79 1,88 2,61 0,37 2,83 1,12 0,87 1,05 1,66 0,80 1,93 0,44 0,70 0,60 1,01 0,54 0,90 0,90 1,53 1,42 1,50 1,12 0,47 1,54 0,97 1,07 0,36 3,48 21,27 6,19 6,58 3,46 36,23 8,62 38,60 3,79
Libres
269,84 1,66 0,94 0,54 0,71 1,07 41,30 0,94 27,08 50,90
9,73 Péptidos
1,38 6,87 59,89 13,99 0,55 7,65 6,83 3,90 4,69 1,93 1,43 5,77 7,52 1,17 .4,06 1,79 15,60
8,66 Libres
Libres
4,40 16,53 37,10 44,74 55,17 239,85 1,97 66,34 26,85 8,55 25,76 32,79 8,75 30,64 51,80 1,69 3,25 9,55 54,15 102,09
Péptidos
Péptidos
Fosfoserina Ac.aspártico Treonina Serina Ac. glutámico Pro1ina Citrulina G1icina A1anina Valina Metionina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilalanina Omitina Ac. γ-aminobutírico. Lisina Histidina Arginina LN aminado
Libres
Libres
5,83
Péptidos
0 Aminoácidos (rng/L)
ALCOHOL (%) 6,74
1,72 2,25 0,80 6,52 2,26 0,24 0,38 3,82 - 10,25 291,02 0,55 0,27 4,58 0,70 3,23 0,82 1,49 0,18 0,50 2,22 0,90 2,27 1,58 1,18 0,97 0,97 0,72 2,50 37,35 4,00
Es evidente que en el caso de la vinificación en tinto ocurre una cesión de substancias nitrogenadas de las partes sólidas al mosto durante la fermentación. El mosto contiene 83,87 mg/L de nitrógeno debido a los aminoácidos y polipéptidos ácidos y neutros. El nitrógeno de los oligopéptidos representa el 16,1 % y es debido, esencialmente, al ácido aspártico, el ácido glutámico y a la prolina, que por sí solos representan el 10,8 %. La prolina representa el 36,8 % del nitrógeno de los aminoácidos y péptidos ácidos y neutros. Al 4° día de fermentación, en correspondencia con 4,95 de alcohol, se encuentra la prolina completamente en forma libre y en una cantidad superior a la total del mosto (106,3 %): se produce, pues, una cesión de nitrógeno en forma de prolina. Aunque se debe admitir la posibilidad de cesiones de las partes sólidas durante la maceración, resulta, sin embargo, claro que la prolina no es metabolizada por las levaduras en presencia de cantidades suficientes de otras substancias nitrogenadas. Al contrario, los otros aminoácidos son absorbidos casi completamente por las levaduras: con excepción de la prolina inicialmente presente, el 92,8 % del nitrógeno de los aminoácidos y polipéptidos ácidos y neutros desaparece del medio. Al 7° día de fermentación, para 8,10 de alcohol, no hay presencia de aminoácidos libres mientras la prolina permanece constante; se observa una muy débil cesión de oligopéptidos. La prolina del vino es ligeramente más alta y no parece, pues, que sea metabolizada por las levaduras.
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Con excepción de la prolina, el cuadro de los aminoácidos del mosto aparece totalmente modificado por la fermentación y el nitrógeno de los aminoácidos ácidos y neutros del vino representa sólo prolina excluída, el 10,7 % del que había en el mosto. El mosto contiene además, 33,57 mg/L de nitrógeno debido a los aminoácidos y péptidos básicos: el nitrógeno de los oligopéptidos representa sólo el 7,8 %; la arginina está completamente libre y representa el 51,1 % del nitrógeno de los aminoácidos y oligopéptidos básicos. El 4° día de fermentación, con 4,95° de alcohol, ha sido absorbido por las levaduras el 27,8 % de la omitina el 28 % del ácido γ-aminobutírico, el 78,9 % de la lisina, el 90,6 % de la histidina y el 42,7% de la arginina: en su conjunto el nitrógeno de los aminoácidos básicos ha disminuído en el 11,4 %. Al 7° día de la fermentación, para 8,10 de alcohol, se observa una absorción casi completa de todos los aminoácidos básicos con excepción de la arginina, la cual ha sido asimilada en un 48,6 % y está ligada en los oligopéptidos en un 22,5 %. Las levaduras utilizan, pues, los aminoácidos básicos de la misma forma que los ácidos neutros; la menos asimilada es la arginina que participa, sin embargo, en la formación de los polímeros. Para 9,2° de alcohol la asimilación es total, salvo pequeñas cantidades de arginina (asimilada en más del 90 %).La situación no cambia para 10,20 de alcohol: al final de la fermentación el nitrógeno relativo a los aminoácidos básicos libres y combinados ha disminuido hasta el 6,28 % del inicialmente presente en el mosto y esto a pesar de la cesión de substancias nitrogenadas de las partes sólidas. Los resultados obtenidos confirman completamente la hipótesis de Thorne de una asimilación directa de los aminoácidos por las levaduras, que recurren a vías metabólicas diferentes sólo cuando no encuentran en el medio los aminoácidos necesarios en las proporciones adecuadas, incluso siendo capaces de sintetizarlos todos a partir del nitrógeno amoniacal. Cuando el mosto tiene suficiente nitrógeno, no sólo no es metabolizada la prolina, sino que representa un producto de excreción del catabolismo de las levaduras. Los cromatogramas de las figuras 26 a 31 muestran de manera evidente estos fenómenos descritos.
Fig. 26
Fig. 27
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Fig. 28
Fig. 29
Fig. 30
Fig. 31
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Evolución de los aminoácidos y de los oligopéptidos en función de la multiplicación celular y de la mortalidad de las levaduras Las pruebas se han realizado sobre un mosto blanco obtenido de una mezcla de Cortese y Riesling 1985. Los resultados se presentan en tabla 31 y se expresan gráficamente en la figura 32. TABLA 31 Fermentación en blanco del mosto Riesling + Cortese d = 1,0848. pH = 3,14. T = 20° C Inoculación 1 millón de células/mL de Saccharomyces cerevisiae S47C Aminoácidos y oligopéplidos (mg/L) Fosfoserina Ac. aspártico Treonina Serina Ac. glutámico Prolina Citrulin Glicina Alanina Valina Metionina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilalanina Omitina Ac. γ-aminobutírico Lisina Histidina Arginina Σ N aminado
Tiempo: 2 TIempo: 5 Tiempo: 9 Tiempo: 16 Tiempo: 19 Tiempo: 24 Tiempo: 0 Alcohol: Alcohol: Alcohol: Alcohol: Alcohol: Alcohol: Alcohol: 0 2,03º 5,60º 10,56º 12,60º 12,60º 12,60º Células: Células: Células: Células: Células: Células: Células: 1x10/mL 58 x 10 /mL 90 x 10 /mL 99xl0 /mL 100x 10 /mL 10 x 10 /mL 100x10 /mL Mort.%:0 Mort.%:0 Mort%:0 Mort. %:0 Mort.%:6 Mort. %: 38 Mort. %: 84 7,40 5,86 3,86 9,65 1,89 4,19 7,15 1,58 2,38 4,88 1,19 1,17 18,92 2,10 4,07 1,01 1,62 22,93 14,51 17,39 2,14 33,18 22,27 2,64 15,26 120,14 24,15 200,23 193,97 3,87 2,16 2,33 1,13 1,25 4,07 3,00 10,79 7,62 1,50 1,12 34,38 1,83 6,39 4,41 l,0l 1,83 2,19 5,04 0,96 2,72 3,14 1,62 2,10 5,60 10,66 6,16 1,34 40,18 2,12 2,92 2,00 0,11 1,19 2,05 0,62 1,57 6,35 0,62 14,52 53,51 13,67 7,56 2,55 3,17 14,31 30,08 68,63
Fig. 32.-Evolución del nitrógeno de los aminoácidos y péptidos durante la multiplicación de las células de levaduras.
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El mosto líquido ha sido inoculado con 1 millón de células por mL de S. cerevisiae 547 C y se ha procedido a una serie de muestreos escalonados en el tiempo para la determinación de los aminoácidos libres y combinados, la cuantificación de las células de levadura y la valoración del porcentaje de células muertas. Se ha observado una multiplicación de 1 a 100 millones de células por mL, con una disminución de los aminoácidos libres y combinados hasta un mínimo y un aumento posterior más lento y de menor entidad. Como se observa en los datos de la tabla 31 y, aún mejor, en el diagrama de la figura 32, la rápida disminución del nitrógeno sigue casi simétricamente la rápida multiplicación celular, alcanzando el mínimo en correspondencia con el máximo desarrollo celular de las levaduras. La cesión de nitrógeno amínico comienza sólo con el inicio de la mortalidad celular y aumenta con ella, pero con una velocidad netamente diferente. De los datos presentados resulta evidente que la levadura viva y activa asimila y no cede aminoácidos y oligopéptidos: la cesión concierne sólo a las células muertas. Antes y después de la segunda fermentación (vinos espumosos) Los datos obtenidos se exponen en la tabla 32 y se refieren a un vino base obtenido de Pinot Noir. Los datos confirman que la segunda fermentación supone un modesto fenómeno microbiológico con una variación muy pequeña del nitrógeno, de los aminoácidos y de los polipéptidos. En efecto, entre los aminoácidos sólo la metionina es sensiblemente asimilada. TABLA 32 Aminoácidos y oligopéptidos (mg/L) Fosfoserina Ac. aspártico Treonina Serina Ac. glutámico Prolina .Citrulina Glicina Alamina Valina Metionina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilalanina Omitina Ac. aminobutírico Lisina Histidina Arginina Σ N aminado
Antes de la 2ª fermeutación 35,4 40,1 41,5 103,0 176,3 24,5 99,3 20,7 6,1 20,0 27,5 18,1 19,7 79,2 13,6 18,7 10,6 191,6 162,3
Después de la 2ª fermentación 12,30 34,7 36,5 35,4 103,7 165,5 26,0 111,4 24,0 1,6 16,7 22,0 18,1 16,7 89,7 12,1 20,9 11,9 256,9 185,2
El análisis detallado de las substancias nitrogenadas demuestra, pues, que en la segunda fermentación los cambios de nitrógeno entre el medio y la modesta cantidad de levaduras que se forman son de pequeña entidad y no justifican el prejuicio de que el contacto de las levaduras con el vino pueda modificar sus características. Hay que destacar que antes de la segunda fermentación el vino base recibe siempre una adición de nitrógeno amoniacal por lo que las levaduras disponen de cantidades de nitrógeno abundantes. En efecto, en la tabla 32 se ve que después de la segunda fermentación se produce una cierta cesión de nitrógeno, en particular de aminoácidos, como por ejemplo la arginina, que representan en cierta medida productos de catabolismo de las levaduras.
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Antes y después de la fermentación maloláctica Se ha comparado la composición en aminoácidos y oligopéptidos de dos vinos de la vendimia 1987 y de un vino de la vendimia 1988 antes y después de la fermentación maloláctica. Los resultados se presentan en la tabla 33. Se trata de vinos muy pobres en nitrógeno; en efecto, el Barbera presentaba en el desvinado (11,1º de alcohol y más de 1,50 aún por desarrollar) sólo 17,76 mg/L de nitrógeno amínico y el Dolcetto tenía después de finalizar la fermentación maloláctica 12,50 mg/L de nitrógeno amínico y 44,8 mg/L de nitrógeno total, mientras el Cabemet-Sauvignon tenía 123 mg/l de nitrógeno total. Esto demuestra que para el desarrollo de la fermentación maloláctica no existen problemas de substancias nitrogenadas, al menos desde el punto de vista cuantitativo. En efecto, en lo que respecta al desarrollo bacteriano, la fermentación maloláctica es un fenómeno modesto que supone un metabolismo glucídico limitado y un metabolismo nitrogenado aún más limitado. De todas formas, en presencia de cantidades de nitrógeno tan débiles (excepcionales para los vinos tintos) es muy difícil recoger las eventuales transformaciones. Es suficiente una ojeada a la tabla 33 para observar que la entidad de los cambios es muy pequeña: se nota, sin embargo, un pequeño aumento después de la fermentación maloláctica, debido probablemente a cesiones procedentes de las levaduras. El caso del Carbemet-Sauvignon muestra la desaparición de la omitina, pero las cantidades son demasiado pequeñas para extraer conclusiones seguras. TABLA 33 Antes y después de la fermentación maloláctica Antes y después de la segunda fermentación. Vino base Pinar Noir 1984 guardado en acero inoxidable bajo nitrógeno hasta 1987.Segunda fermentación el 25 de abril de 1987 Aminoácidos y oligopéptidos Fosfoserina Ac. aspártico Treonina Serina Ac. glutámico Prolina Citrulina Glicina Alanina Valina Metionina Isoleucina Leucina Tirosina Fenilalanina Omitina Ac. γ-aminobutírico Lisina Histidina Arginina
Barbera 1987 Antes 7,46 1,60 1,49 1,44 2,73 121,43 2,95 0,98 1,12 0,67 0,86 0,60 0,52 1,22 1,23 17,76
Despnés 4,94 2,89 5,47 3,03 81,85 3,92 4,18 2,89 0,73 2,38 3,86 2,34 2,82 0,30 2,38 0,81 5,23 16,88
Dolcetto 1987 Antes 5,60 1,20 1,30 1,90 3,10 2,30 2,30 1,40 1,70 1,00 0,65 1,08 0,81 3,92 5,44
Despnés 4,92 2,52 2,88 3,10 71,43 5,22 2,93 1,70 1,08 0,50 0,91 1,12 1,05 12,50
Cabernet-Sanvignon 1988 Antes Después 4,70 4,00 7,61 8,63 4,58 2,93 4,85 4,69 401,30 383,09 4,88 4,44 5,48 2,30 2,50 2,39 2,21 2,92 3,30 0,70 0,98 3,33 1,26 1,12 3,95 56,02 51,30
La producción de substancias volátiles por las levaduras Desde que el cromatógrafo de gases se ha extendido no sólo en los laboratorios de investigación, sino también en los de análisis y de control se han hecho accesibles al análisis cualitativo y cuantitativo una gran cantidad de compuestos volátiles, incluso estando presentes en contenidos inferiores a la parte por millón.
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En realidad muchas de las individualizaciones de substancias basadas exclusivamente en el valor del tiempo de retención y en la hipótesis de una separación perfecta de los componentes hay que tomadas con prudencia y sólo el acoplamiento, cada vez más difundido, de la cromatografía de gases con la espectrometría de masas, permite llegar a identificaciones seguras. Los productos secundarios de la fermentación alcohólica (alcoholes, ésteres, ácidos, aldehídos, etc.) se prestan muy bien al análisis por cromatografía de gases y han levantado especial interés por la influencia que pueden tener, en cuanto componentes volátiles, sobre las características organolépticas de los vinos. En particular se ha planteado desde hace tiempo la cuestión de la influencia sobre los caracteres organolépticos de las cepas de levadura principalmente responsables de la fermentación alcohólica, con el fin de evaluar no sólo su influencia negativa (hasta ahora la única seguramente verificada), sino también las eventuales contribuciones positivas y características. Aunque hay que reconocer que los vinos se diferencian por las uvas de que proceden (es por esto que desde siempre se distingue entre variedades de calidad y variedades comunes), las características de los vinos jóvenes y de los blancos en particular pueden depender notablemente de la cepa de levadura que los ha fermentado, aunque no se pueda atribuir la paternidad de la fermentación a la levadura seleccionada añadida en la vinificación. Sin embargo, el fácil hábito de comparar cromatogramas, definidos frecuentemente de manera sugestiva como «aromogramas», sin tener en general ningún elemento objetivo sobre la incidencia organoléptica real de los diferentes compuestos presentes, impone una verificación de la variabilidad con que determinados constituyentes volátiles pueden ser producidos por la misma cepa de levadura y en las mismas condiciones de substrato y temperatura. Sin el conocimiento de esta variabilidad, se corre el riesgo de atribuir a determinadas intervenciones físicas, físico-químicas, microbiológicas o tecnológicas, diferencias que, por el contrario, no tienen nada que ver con tales intervenciones y que corresponden simplemente a la variabilidad normal a nivel del micro-metabolismo de las levaduras. La variabilidad dentro de una misma cepa Es evidente que para evaluar la influencia de una cepa sobre las características organolépticas de un vino en función de los compuestos volátiles producidos, hay que conocer previamente la variabilidad intrínseca de la cepa en relación con este tipo de compuestos: la microbiología no posee la reproducibilidad de la química y la misma célula, incluso en las mismas condiciones, muestra una cierta variabilidad, especialmente para las substancias producidas en pequeña cantidad y que no forman parte de los metabolismos principales. La experiencia siguiente demuestra bien el modo de comportarse de la levadura. Una cantidad homogeneizada de mosto de uvas Pinot Blanc de la vendimia 1980 ha sido adicionada con 100 mg/l de SO2, sometida a centrifugación y después a filtración esterilizante a través de un filtro millipore con 0,45 U de diámetro de los poros. El mosto se ha introducido en 10 botellones estériles de 2 litros en la cantidad de 1.500 mi cada uno. Cada botellón ha sido inoculado con un cultivo en el mismo mosto de S. cerevisiae 13: buena cepa fermentadora de la colección del Instituto, en forma de obtener una carga microbiana de 1 millón de células por mililitro de mosto. Los botellones, cerrados con una válvula de Pasteur, se han guardado en termostato, 5 a la temperatura de 25 ºC y 5 a la temperatura de 15 ºC, controlando mediante pesadas sucesivas el desarrollo de la fermentación hasta la estabilización del peso. La conservación en termostato se ha mantenido durante 30 días a 25 ºC y durante 60 días a -15 ºC. La tabla 34 presenta los valores de las graduaciones alcohólicas. Si se observan los datos de la tabla 34 se ve que ni siquiera para el principal producto de la fermentación se obtiene una reproducibilidad, incluso en condiciones rigurosamente idénticas en substrato fermentativo, temperatura, cepa de levadura y número de levaduras: de los datos presentados resulta evidente la mejor concordancia de los valores obtenidos a temperatura de fermentación más baja. Cada muestra de vino se ha sometido, en la medida de 500 mL a dos extracciones sucesivas en extractor continuo y de 10 horas de duración cada una: la primera con pentano y la segunda con cloruro de metileno/pentano (40/60 V/V).
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Al vino se le han añadido, antes de la extracción con pentano, 272 µg/L de n-heptanol disuelto en alcohol absoluto y empleado como estándar interno. Antes de la segunda extracción se han añadido, como estándar interno, 484 µg/L de 1-pentanol disuelto en cloruro de metileno. Los extractos se han concentrado a pequeños volúmenes (1-2 mL), eliminando el solvente con deflegmación sobre baño de agua 50 ºC. TABLA 34 Alcohol % Muestras Temperatura ºC en volumen 1 25 11,07 2 25 11,30 3 25 12,00 4 25 11,53 5 25 11,30 6 15 11,88 7 15 11,83 8 15 11,96 9 15 11,94 10 15 11,57 Para la determinación del acetato de etilo y de los alcoholes superiores hasta los isoamilícos se ha seguido una determinación aparte, sometiendo a destilación 100 mL de vino, previamente adicionado con 2-pentanol como estándar interno, y recogiendo 25 mL del destilado. . Con el pentano se extraen los ésteres de los ácidos grasos, los acetatos, los ácidos graso s con 8 y 10 átomos de carbono, una parte de los alcoholes, una parte importante del ácido caprónico y una pequeña parte de los ésteres hidroxilados. Con el pentano/cloruro de metileno (60/40 V/V) son extraídos los ésteres hidroxilados, los alcoholes y los ácidos graso s de 4 átomos de carbono en adelante. Para cada muestra se han obtenido 3 cromatogramas, cada uno de ellos con la posibilidad de referencia cuantitativa ante un contenido conocido del estándar interno. Solamente el acetato de etilo, el piruvato de etilo, el 4-oxibutirato de etilo y el dietilmalato se han determinado considerando igual a 1 el factor de respuesta del revelador respecto al 1-heptanol; en todos los casos se han determinado los valores de los factores de respuesta. En los cromatogramas obtenidos extrayendo con solvente, los dos compuestos más volátiles tomados en consideración son el acetato de isobutilo (PE = 117,3 °C) y el butirato de etilo (PE = 121,3 °C). Estos dos ésteres han sido identificados sólo a través del tiempo de retención ya que su proximidad al pico del solvente no ha hecho posible la determinación del espectro de masas: el resto de los componentes considerados han sido identificados también por espectrometría de masas, previa separación sobre columna capilar de síiice fundida de 50 metros de longitud en fase estacionaria Carbowax 20 M. No viene al caso precisar aquí las condiciones de la cromatografía en fase gaseosa. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 35, mientras las figuras 33, 34 y 35 muestran, respectivamente, los cromatogramas del extracto pentánico, del extracto con pentano y cloruro de metileno y el cromatograma relativo al acetato de etilo y a los alcoholes superiores. Para los compuestos que no han sido extraídos completamente con el pentano, los valores presentados en la tabla 35 son la suma de los valores obtenidos en la primera y segunda extracciones. Sobre los cromatogramas de las figuras 33 y 34 se indica para cada pico el número que corresponde al componente presentado en la tabla 35 y entre paréntesis el valor de atenuación empleado; donde no se indica nada, el valor de atenuación ha sido 4. El cromatograma de la figura 34 se ha obtenido con una atenuación de 16. Los datos de la tabla 35 merecen un atento examen Y se prestan a una serie de consideraciones. Con la posible excepción del dietilmalato, todos los compuestos presentados en la tabla son productos secundarios del metabolismo fermentativo de las levaduras y se encuentran en cualquier fermentado de un substrato a pH similar al del mosto.
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Representan, ciertamente, unos constituyentes del vino, pero de cualquier vino, y no parece, por tanto, muy significativo el indicarlos como representativos de vinos particulares (Capella y cols., 1980; Slinsby y cols., 1980; Brander y cols.,1980). TABLA 35 Núm. del pico 1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Componente volátil Acetato de isobutilo µg/L Butirato de etilo µg/L Acetato de isoarni10 µg/L Capronato de elijo µg/L Acetato de hexilo + piruvato de etilo µg/L Acetilrnetilcarbinol µg/L Lactato de elijo µg/L Caprilato de etilo µg/L Caprato de etilo µg/L γ-Butirolactana µg/L Acido isovaleriánico µg/L Dietilsuccinato µg/L 4-oxibutirato de etilo µg/L Acetato de 2-feniletilo µg/L Acido caprónico µg/L 2-feniletanol µg/L Dietilrnalato µg/L Acido caprnico µg/L Acido cáprico µg/L 1-Propanol mg/L Acetato de etilo mg/L 2-Metil-propanol-1 mg/L 2-Metil-butanol-1 rng/L 3-Metil-butanol-1 mg/L
Fermentación a 25 °C
Fermentación a 15 °C
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
57 160 750 626
30 105 511 529
62 193 713 662
50 137 570 520
55 157 685 641
25 255 862 850
28 303 1.138 892
18 197 751 616
20 203 714 773
25 277 972 853
89 46 2.249 990 430 2.103 175 204 1.470 89 5.765 7.722 260 6.594 2.692 10,0 28,8 12,0 9,6 49,2
104 59 3.271 1.158 304 3.058 224 166 2.067 80 5.763 8.863 275 4.731 1.441 11,0 39,4 12,5 9,9 51,9
77 55 2.459 985 407 2.586 172 230 1.628 107 5.997 8.014 241 9.092 4.106 11,0 21,6 12,5 10,2 56,2
85 81 2.501 1.109 490 3.229 179 196 2.403 85 5.751 8.064 282 4.843 2.333 9,8 18,9 10,2 10,8 47,9
95 59 2.726 1.191 488 2.968 160 186 1.786 82 4.995 7.364 214 4.518 1.293 11,9 31,6 12,9 7,6 55,6
189 188 250 249 8.289 7.184 702 664 280 307 5.299 4.115 337 336 715 719 2.086 1.362 157 165 4.199 4.150 14.970 14.420 505 591 6.937 5.819 3.271 3.045 11,6 14,8 68,1 48,5 41,8 38,6 15,7 13,0 77,5 71,8
176 338 8.018 988 435 5.588 317 543 2.028 166 4.658 14.080 598 8.036 4.546 15,5 57,9 40,7 13,4 69,9
171 166 88 309 6.582 7.279 836 730 379 488 3.088 3.513 332 268 627 623 1.070 1.632 134 173 4.405 4.141 15.580 14.020 589 741 5.852 7.526 3.000 3.953 13,5 14,5 46,2 52,1 38,9 36,2 12,5 13,7 71,0 70,0
* Determinados considerando igual a 1 el factor de respuesta respecto al estándar interno (1-heptanol).
Fig.33
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Fig. 34
Fig. 35
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Con excepción de los alcoholes superiores y del feniletanol, cada constituyente aparece o en cantidades inferiores a la parte por millón o en contenidos de pocas partes por millón. Incluso teniendo en cuenta el umbral de percepción organoléptica de muchas de estas substancias, parece razonable pensar que contribuyen en su conjunto a establecer el carácter «vinoso» del vino, sin determinar, sin embargo, la típica calidad de un vino de origen definido. Una simple observación panorámica de los datos analíticos demuestra tanto una notable variabilidad en el ámbito de los fermentados a la misma temperatura (en particular para algunos constituyentes), como una pronunciada influencia de la temperatura de fermentación sobre la producción, por parte de las mismas cepas de levadura y en el mismo substrato, de los componentes volátiles examinados. Cinco repeticiones, aunque no constituyen una serie muy numerosa, permiten valorar con métodos estadísticos la variabilidad de cada componente para dos distintas temperaturas de fermentación y profundizar sobre los efectos de la temperatura. Para cada componente hemos calculado el valor asumido por el máximo resultado, hecho igual a 100 el valor del mínimo (desviación máxima %). Además, se ha calculado para cada componente la variabilidad respecto a la media de las dos temperaturas de fermentación para el 95% de probabilidad. La variabilidad viene expresada por el producto del valor t de Student (para 4 grados de libertad) por la desviación típica S, es decir, la raíz cuadrada de la suma, dividida por 4, de los cuadrados de las desviaciones de la media. Para poder comparar entre los distintos componentes, hemos expresado la variabilidad como coeficiente de variación porcentual de la media m: C.V. % =
t ⋅s ⋅ 100 m
Por último se ha hecho un análisis de varianza entre las muestras fermentadas a 25 °C y a 15 °C para establecer la existencia de una diferencia significativa a través del cálculo del valor de F. En la tabla 36 se presentan los valores obtenidos. Se ve que en el ámbito de cada grupo, es decir, para condiciones completamente iguales, la variabilidad es notable con posibilidad de diferencias de 1 a 2 para los valores mínimos y máximos. También las oscilaciones en tomo a la media con consistentes: a 25 °C 8 compuestos de 24 tienen una variacion próxima o inferior al 25%, 8 una variación próxima o inferior al 50% y 8 una variación superior al 50%. A 15 °C sólo 6 compuestos presentan un coeficiente de variación netamente superior al 50%, pero también sólo 6 presentan valores por debajo del 25%. La influencia de la temperatura es clarísima. Sólo para 4 compuestos la producción no es influida por una variación de l0 °C en la temperatura de fermentación y son el caprato de etilo, el 4-oxibutirato de etilo, el ácido caprílico y el ácido cáprico. Para 3 compuestos (acetato de isoamilo, capronato de etilo y y-butirolactona) se obtiene una diferencia significativa mientras para el resto de componentes la diferencia es altamente significativa. Con la disminución de la temperatura de fermentación se tiene una neta disminución de los alcoholes superiores, mientras en lo que respecta a los ácidos disminuye el isovaleriánico, aumenta el caprónico y no varían significativamente el caprílico y el cáprico. Con la disminución de la temperatura algunos ésteres, como y-butirolactona, disminuyen netamente mientras que aumentan fuertemente el butirato de etilo, el acetato de isoamilo, el capronato de etilo y el caprilato de etilo: el caprato de etilo no presenta variación significativa. Es de destacar la ausencia de ácido valeriánico normal (Usseglio-Tomasset, 1967) lo que hace muy dudosa la individualización de sus ésteres en los vinos, como indica la literatura. Una vez demostrada la notable variabilidad, en idénticas condiciones, en lo que concierne a la producción de constituyentes volátiles por parte de las levaduras y la, aún más importante, influencia de una variación de temperatura, hay que tener mucha prudencia a la hora de atribuir a la variedad de origen o a la intervención de una levadura particular las eventuales diferencias encontradas en los cromatogramas de componentes volátiles. También es oportuno preguntarse por el significado real de la presencia de pocos microgramos por litro de substancias, productos secundarios del metabolismo de las levaduras.
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TABLA 36
Nº com. puesto 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Componente volálil Acetato de isobutilo Butirato de etilo Acetato de isoarnilo Capronato de etilo Acetato de hexilo + piruvato de etilo Acetilrnetilcarcinol Lactato de etilo Caprilato de etilo Caprato de etilo γ-Butirolactona Acido isovaleriánico Dietilsuccinato 4-oxibutirato de etilo Acetato de 2-feniletilo Acido caprónico 2-feniletanol Dietilrnalato Acido capnlico Acido cáprico 1-Propanol Acetato de etilo 2-Metil-propanol-1 2-Metil-butano1-1 3-Metil-butanol-l
Fermentación a 20 ºC Media Desviación mmáxima % 50,8 µg/L 206,6 150,4 µg/L 183,8 645,8 µg/L 131,6 595,6 µg/L 127,3 178,0 µg/L 246,8 µg/L 7.470,4 µg/L 784,0 µg/L 377,8 µg/L 4.320,6 µg/L .318,0 µg/L 645,4µg /L 1.635,6 µg/L 159,0 µg/L 4.310,5 µg/L 14.614 µg/L 604,8 µg/L 6.834,0 µg/L 3.563,0µg /L 13,98 rng/L 54,56 rng/L 39,24 rng/L 13,66rng/L 72,04 rng/L
113,9 384,1 125,9 148,8 174,3 181,0 125,7 132,4 195,0 129,1 112,5 11,1 146,7 138,1 151,5 133,6 147,4 115,5 125,6 110,9
Fermentación a 15 ºC
C.V. % P=0,95 67,8 59,8 43,5 30,9 16,0 108,9 25,5 46,4 63,7 70,3 25,4 31,6 73,7 26,4 14,3 12,5 39,1 40,3 52,2 30,1 44,6 15,2 24,9 12,2
Media m23,2 µg/L 247,0 µg/L 887,4 µg/L 796,8 µg/L 90,0 µg/L 60,0 µg/L 2.641,2 µg/L 1.086,6 µg/L 423,8 µg/L 2.788,8 µg/L 182,0 µg/L 196,4 µg/L 1.870,8 µg/L 88,6 µg/L 5.654,2 µg/L 8.005,4 µg/L 254,4 µg/L 5.995,6 µg/L 2.373,0 µg/L 10,73 mg/L 28,06 mg/L 12,02 mg/L 9,62 mg/L 52,16 mg/L
Confron. 25 y 15 ºC Desviación C.V. % F máxima % P=0,95 155,6 153,8 159,4 144,8
49,0 52,0 54,1 38,3
22,35 * 14,66 * 7,29 * 12,29*
l35,1 176,1 145,4 120,9 161,2 153,5 140,0 138,6 163,5 133,7 120,1 120,4 131,8 201,2 317,6 121,4 208,5 126,5 142,1 114,2
31,5 59,7 41,1 24,3 49,9 44,9 37,5 33,3 55,0 34,0 18,8 19,3 30,1 90,5 132,8 22,1 81,0 24,7 35,1 19,8
185,71 * 18,32* 187,44* 17,52 * 0,79 8,40* 63,91 ** 169,37** 0,85 71,87 ** 46,16** 294,47 ** 76,68 ** 0,81 4,09 17,41 ** 24,45 ** 644,29 ** 27,43 ** 83,36 **
t 0,95 = 2,78 F0,95 = 6,39 F0,99 = 15,98
Si se reflexiona, por ejemplo, en que de los 20 aminoácidos presentes en un substrato fermentativo, si se exceptúan la glicina, la prolina, la oxiprolina y algún otro, la mayor parte puede dar, según el mecanismo de Ehrlich, el alcohol con un átomo de carbono menos, podremos prever no sólo la presencia de todos estos alcoholes, sino también la de los correspondientes ésteres con todos los ácidos presentes y con los producidos en el curso de la fermentación: parece deseable dirigirlos esfuerzos y el uso de las sofisticadas técnicas hoy disponibles hacia la individualización y valoración de aquellos compuestos que tienen una real incidencia organoléptica sobre las características típicas de los distintos vinos. En lo que respecta a la influencia organoléptica hay que tener presente el umbral de sensibilidad olfativa. Como punto de referencia utilizaremos los valores indicados por Meilgaard para la cerveza, que representa, sin embargo, un producto mucho más homogéneo que el vino, el cual ofrece una infinita variedad de tipos. Presentamos para una serie de componentes el umbral olfativo indicado en partes por millón y el valor máximo encontrado en los mostos fermentados.
Acetato de isobutilo Butirato de etilo Acetato de isoamilo Capronato de etilo Acetato de etilo Lactato de etilo Caprilato de etilo Caprato de etilo Acetatode2-feniletilo 2-feniletanol. Acido isovaleriánico Acido caprónico Acido caprílico Acido cáprico
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Umbral olfativo p.p.m. 1,6 0,4 1,6 0,23 3,5 250 0,9 I,S 3,8 125 1,5 8,0 13,0 10,0
Cantidad máxima mg/L 0,06 0,3 1,1 0,89 0,19 8,3 1,19 0,49 0,17 15,6 0,34 6,0 9,1 4,5
De estos datos resulta que sólo el capronato y el caprilato de etilo superan el umbral de sensibilidad mientras se aproximan a él el butirato de etilo, el acetato de isoamilo, el ácido caprónico y el ácido caprílico. A pesar de que la mayoría de los componentes no alcanza el umbral de sensibilidad olfativa parece razonable pensar que el complejo de todos estos compuestos volátiles sea organolépticamente significativo, aunque con un resultado sobre el olor netamente distinto al atribuible a los componentes simples. La fisiología del olor es, no sólo extremadamente compleja, sino también poco clara por lo que resulta más que difícil, imposible, prever el efecto acumulativo de varias substancias organolépticamente activas cada una de las cuales esté por debajo del umbral de sensibilidad. De forma puramente hipotética y simple con el fin de establecer comparaciones admitiremos que cada componente da una contribución organoléptica porcentualmente proporcional a su umbral olfativo hecho igual a 100; el efecto conjunto se obtendrá de la suma de todos los valores porcentuales. Por ejemplo, como el umbral olfativo para el butirato de etilo es de 0,4 ppm, 0,3 mg/L de butirato de etilo darán una contribución de 75; para el umbral olfativo del lactato de etilo de 250 ppm corresponde un valor de 3,3 cuando está presente en una cantidad de 8,3 mg/L. Adoptando este tipo de valoración hemos obtenido los datos expuestos en la tabla 37 de la que resultan diferencias de cierta relevancia. La fisiología del olor es, no solo extremadamente compleja, sino también poco clara por lo que resulta más que dificil, imposible, prever el efecto acumulativo de varias sustancias organolépticas activas cada una de las cuales esté por debajo del umbral de sensibilidad. De forma puramente hipotética y simple con el fin de establecer comparaciones admitiremos que cada componente da una contribución organoléptica porcentualmente proporcional a su umbral olfativo hecho igual a 100; el efecto conjunto se obtendrá de la suma de todos los valores porcentuales. Por ejemplo, como el umbral olfativo para el butirato de etilo es de 0,4 ppm, 0,3 mg/L de butiato de etilo darán una contribución de 75; para el umbral olfativo del lactato de etilo de 250 ppm corresponde un valor de 3,3 cuando está presente en una cantidad de 8,3 mg/L. Adoptando este tipo de valoración hemos obtenido los datos expuestos en la tabla 37 de la que resultan diferencias de cierta relevancia. TABLA 37 Contribución porcentual a los caracteres olfativos en función del umbral de sensibilidad de cada componente Fermentación a 25 ºC Fermentación a 15 ºC Acetato de isobutilo Butirato de etilo Acetato de isoamilo Caproato de etilo Acetato de hexilo Lactato de etilo Caprilato de etilo Acetato de 2-feniletilo 2-feniletanol Ac. isovalerianico Ac. caprónico Ac. caprílico Ac. cáprico Total
1 3,6 40,04 46,9 272,2 5,4 3,3 78,0 4,1 12,0 22,5 52,5 53,4 32,7 626,6
2 1,9 26,2 31,9 230,0 5,4 2,9 73,8 4,3 11,5 22,4 51,9 44,8 30,4 537,4
3 3,9 48,2 44,6 287,8 5,0 3,2 109,8 4,4 11,3 21,1 58,2 61,8 45,5 704,8
4 3,1 34,2 35,6 226,1 4,9 2,6 92,9 3,5 12,5 17,9 55,1 45,0 30,0 567,6
5 3,4 39,2 42,8 270,7 4,7 2,9 81,1 4,6 11,2 11,7 51,8 57,9 39,5 635,7
1 1,6 63,7 53,9 369,6 2,5 0,9 110,0 2,3 6,2 14,9 72,1 50,7 26,9 772,1
2 1,7 75,7 70,7 387,8 3,0 1,3 128,7 2,1 7,1 11,5 72,0 36,4 14,4 815,8
3 1,1 49,2 46,9 267,8 2,2 1,0 109,4 2,8 6,4 11,9 75,0 69,9 41,1 684,3
4 1,2 50,7 44,6 336,1 2,4 1,0 123,2 2,2 6,5 10,7 71,9 37,3 23,3 712,3
5 1,6 69,2 60,7 370,9 2,7 1,1 132,3 2,2 5,9 62,4 34,8 12,9 767,4
Comparación organoléptica entre las muestras Para hacer una comparación organoléptica hemos adoptado el duo-trio test.Hemos hecho las comparaciones siguientes: 1. Muestra 3 y muestra 5, ambas fermentadas a 25 ºC. Se trata de dos muestras, que difieren en 0,7º de alcohol y presentan, como se ve en la tabla 37, una pequeña diferencia en los constituyentes con acción organoléptica más pronunciada: no existe ninguna diferencia significativa entre las dos muestras (22 respuestas, 13 correctas).
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2. Muestra 2 y muestra 3 fermentadas a 15 ºC. Se trata de dos muestras con pequeña diferencia en la graduación alcohólica y notable diferencia, como se ve en la tabla 37, en el contenido en componentes volátiles con acción organoléptica pronunciada: no existe ninguna diferencia significativa (20 respuestas, 10 correctas). 3. Muestra 1 fermentada a 25 ºC y muestra 2 fermentada a 15 ºC. Se trata de dos muestras que, como se ve en la tabla 37, difieren notablemente por el contenido en compuestos organolépticos activos, los cuales son más abundantes en la muestra fermentada a 15 ºC: aparece una diferencia altamente significativa (20 respuestas, 17 correctas). 4. Muestra 3 fermentada a 25 ºC y muestra 3 fermentada a 15 ºC. Se trata de dos muestras que no difieren sensiblemente en el contenido de compuestos organolépticamente activos, pero se observa un mayor contenido en la muestra fermentada a 25 ºC, contrariamente al caso anterior: aparece una diferencia altamente significativa (20 respuestas, 19 correctas). Las comparaciones 3 y 4 en un test de preferencia han mostrado una preferencia altamente significativa por los vinos fermentados a temperatura más baja. Los resultados de los ensayos organolépticos descritos merecen algunas reflexiones y comentarios. Resulta evidente que las muestras fermentadas a la misma temperatura no sondistinguibles entre ellas independientemente de las diferencias, incluso relevantes, en la composición de los constituyentes volátiles. Por el contrario, las diferencias son muy evidentes entre las muestras fermentadas a distinta temperatura, tanto si los componentes volátiles son más abundantes en las muestras fermentadas a temperatura más elevada como si lo son en los fermentados a temperatura más baja, siendo estas últimas muestras las preferidas por el consumidor: los constituyentes volátiles que hemos determinado no son, pues, responsables de las diferencias cualitativas entre los vinos. Los datos expuestos indican, por un lado, que no tiene sentido atribuir como características de un vino típico los productos volátiles del metabolismo de las levaduras y, por otro, que hay que ser muy prudentes a la hora de correlacionar las diferencias organolépticas encontradas entre dos vinos con las diferencias que aparecen sobre los cromatogramas de sus substancias volátiles. Para conocer la impresión organoléptica real que, operando sobre el mismo substrato, pueden dejar distintas cepas de la misma especie o especies distintas de levadura hay que aplicar con rigor comparaciones organolépticas objetivas, sin olvidar los resultados de la cromatografía de gases, pero utilizándolos con mucha prudencia. Cuanto hemos expuesto nos confirma la opinión de que los productos volátiles derivados de la fermentación contituyen, por así decir, “el ruido de fondo” común a todos los fermentados, mientras que las diferencias típicas que caracterizan a los distintos vinos son atribuibles a la variedad. Para reconocer los constituyentes responsables de los caracteres típicos de un vino es necesario orientar los esfuerzos a la investigación de lo que emerge o se esconde entre el común “ruido de fondo”. Las levaduras de especie distinta Una vez establecido el significado real de la producción de los componentes volátiles por parte de una cepa de levadura, podemos preguntamos si existe una diferencia de comportamiento entre levaduras pertenecientes a especies distintas. En cuanto al concepto de especie para las levaduras nos referimos al concepto clásico, antes de que se decidiera reunir a todas las levaduras bajo una sola especie.Para aclarar este problema han trabajado DI STÉFANO, CIOLFI y DELFINI (1981) Y llegaron a la conclusión de que existe diferencia, tanto sobre medio sintético como sobre el mosto. Los métodos de investigación empleados son los de cromatografía de gases y los de espectrometría de masas. Los resultados obtenidos sobre mosto se exponen en la tabla 38, en la que para los compuestos señalados con asterisco se ha considerado la respuesta del reveladoridéntica a la dada por el estándar interno. Las indicaciones c, i, b, u, r, corresponden, respectivamente, a cerevisiae, italicus, bayanus, uvarum, rosei. Se han obtenido los resultados siguientes: Saccharomyces cerevisiase es una buena productora de ésteres y de ácidos grasoso Saccharomyces italicus se comporta de forma muy similar a S. cerevisiae. Saccharomyces bayanus produce elevadas cantidades de acetato de etilo y de acetato en general y cantidades modestas de ésteres y de ácidos grasoso Saccharomyces uvarum produce cantidades elevadas de 2 feniletanol y de ácido isovaleriánico y buenas cantidades de ésteres. Saccharomyces rosei da la típica producción de 3-etoxipropanol-l y produce las cantidades más elevadas de ácido cáprico respecto a los ácidos caprónico y caprílico.
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Schizosaccharomyces presenta la producción típica de acetilmetilcarbinol. Parece pues, posible obtener a partir de los productos volátiles informaciones sobre la especie a que pertenecen las levaduras que los han producido, teniendo, sin embargo, presente la variabilidad antes citada. Un medio sintético bien definido aumenta la reproducibilidad de los resultados y permite obtener conclusiones más seguras. Otra acción específica de las levaduras durante la fermentación es la de transformar los aldehídos y los alcoholes en C6 (Di Stéfano y Ciolfi, 1982). En efecto, las levaduras son capaces de reducir a hexanol el hexanal y el trans2-hexenol, mientras que el cis y el trans-3-hexenol no son reducidos; las transformaciones no son cuantitativas. Un compuesto de particular interés por su influencia organoléptica y su reactividad es el acetaldehído. DI STÉFANO y ClOLFI (1982) han evaluado su producción por parte de 9 cepas distintas de levadura pertenecientes a las especies S. cerevisiae, S. bayanus y S. uvarum. Los resultados se exponen en la tabla 39 y parece evidente que S. uvarum se diferencia de las otras dos levaduras. Dada la importancia de la producción de aldehído acético, en particular por su capacidad de combinarse con el anhídrido sulfuroso, CROLFI y DI STÉFANO (1983) han seguido su evolución durante la fermentación, comparando el comportamiento de S. uvarum con S. cerevisiae. TABLA 39 Acetaldehído producido por levaduras de distintas especies Cepa
Acetaldehído mg/L
Alcohol % vol.
S1u S3u S5u S6u S8u Sl0u Sl1u S40u S44u
232 144 221 350 220 110 219 195 224
8,10 8,34 6,37 8,37 8,73 6,89 9,06 8,62 9,21
Cepa S1c S2c S48c S53c S59c S70c S132c S178c S180c
Acetaldehído mg/L
Alcohol % vol.
30 17 27 43 50 38 49 46 23
10;51 12,12 10,38 11,55 11,44 11,02 10,83 9,70 12,18
Cepa S1b S2b S4b S5b S15b S26b S30b S31b S32b
Acetaldehído mg/L
Alcohol % vol.
35 34 16 28 25 59 27 72 20
11,90 12,72 11,75 11,95 12,67 12,84 12,88 12,64 12,16
S. uvarum es una criolevadura que prevalece en las vinificaciones que hacen amplio uso del frío, como la producción del Asti Spumante a partir del mosto de Moscatel Blanco, conservado en depósitos refrigerados en torno a 0 ºC.
Fig. 36.-Producción de acetaldehído durante la fermentación de un mosto de Moscatel, sin
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adición de SO2 por parte de S. cerevisiase (S1c, S47c) y S. uvarum (S48u).
La figura 36 muestra los resultados obtenidos en la fermentación de un mosto de Moscatel por obra de una cepa de S. uvarum y de dos cepas de S. cerevisiae. Se ve que al inicio de la fermentación S. uvarum produce grandes cantidades de aldehído acético, que alcanza un máximo hacia la mitad de la transformación de los azúcares y que sólo es metabolizado en la segunda parte de la fermentación. Este comportamiento presenta grandes problemas para los vinos dulces naturales, como el Asti Spumante, si la fermentación es producida por levaduras de esta especie. Por esta razón se ha tratado de realizar inmediatamente la fermentación del mosto hasta 6º de alcohol y conservar después el semifermentado a - 3 ºC, condiciones éstas que impiden el desarrollo de S. uvarum. Podemos preguntamos ahora si algunas levaduras particulares producen compuestos volátiles cuya presencia puede demostrar su contribución en la fermentación. DI STÉFANO y CIOLFI (1985) han demostrado que Torulopsis stellata, junto a toda una serie de compuestos comunes a otras levaduras y presentados en, la tabla 40, produce, tanto sobre medio sintético como sobre mostos, ácido 2-etiloctanoico, metilcetonas superiores y compuestos no identificados para los que se da la lista de los principales iones encontrados en el espectro de masas. Estos productos no están presentes en los fermentados de S. cerevisiae y pueden servir para poner en evidencia la intervención de Torulopsis stellata. DI STEFANO y DELFINI (1984) han señalado la formación de cantidades relevantes de l-octanol (1015 µg/l) y de su acetato (340 µg/l) por Schizosaccharomyces: la presencia de estos compuestos, asociada a la desaparición de otras substancias como el ácido málico, pueden probar el desarrollo en el mosto de levaduras de esta especie, levaduras que en determinadas regiones y en particulares condiciones ambientales constituyen un verdadero peligro para la vinificación. Influencia de la temperatura Falta tomar en consideración la influencia de la temperatura en función de las diferentes cepas y de las diferentes especies. El problema ha sido estudiado por CIOLFI, CASTINO y DI STÉFANO (1985) en una experiencia con bloques al azar en la que se examina el comportamiento de 5 cepas de S. cerevisiae, 5 de S. uvarum y 5 de S. bayanus a las temperaturas de l0 ºC, 20 ºC y 30 ºC. También se han hecho observaciones sobre el metabolismo de los productos volátiles relativos a las especies Schizosaccharomyces pombe, Torulopsis stellata y Kloeckera apiculata. Los resultados se presentan en las tablas 41, 42 y 43 Y merecen algún comenta no. De la tabla 41 resulta que las tres especies S. cerevisiae, S. uvarum, y 5.. bayanus se diferencian por el 2 feniletanol, el ácido caprónico, eI3-etoxipropanol-l, el ácido isovaleriánico, los ésteres etílicos de los ácidos en C6 + C8 + C10 el ácido caprílico, el ácido cáprico, el ácido butírico y el 1,2-propanodiolmonoacetato. S. uvarum muestra las concentraciones más elevadas de los compuestos mientras S. bayanus se presenta como la más baja productora de ésteres y de ácidos grasas. El test de TUKEY evidencia para el 2-feniletanol una diferencia significativa sólo entre S. uvarum por un lado y S. cerevisiae y S. bayanus por otro, mientras no existe diferencia entre estas últimas especies. S. uvarum se distingue por la elevadísima producción de feniletanol: 156 mg/L contra 29 mg/L de S. cerevisiae y 25 mg/L de S. Qayanus. Para el ácido caprónico no existen diferencias entre S. uvarum y S. bayanus, pero sí entre éstas y S. cerevisiae, que produce los contenidos más elevados. Para el 3-etoxipropanol-1 S. uvarum y S. cerevisiae no se diferencian significa tivamente, pero se distinguen de S. bayanus, que produce las cantidades más ele vadas. Para el ácido isovaleriánico el test de TUKEY distingue S. cerevisiae y S. bayanus por un lado y S. uvarum por otro: este último produce las mayores cantidades. Para los ésteres de los ácidos C6 + C8 + C10 S. bayanus, que produce la cantidad más baja, se distingue significativamente de S. cerevisiae y S. uvarum.
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TABLA 40 Compuestos volátiles identificados en el medio sintético y en el mosto fermentados por Turulopsis stellata 1) 2-metil-propanol-1 2) Isoamil acetato 3) 1-butanolo 4) 2-heptanona 5) Isoamil alcol 6) Etil capronato 7) 1-pentanol 8) Etil piruvato 9) Etil acetato** 10) Acetoino 11) 2-heptanol* 12) Etillactato 13) Hexanol** 14) Trans-3-hexanol** 15) m/e(%): 45(100) 29(66) 57(49) 43(32) 32(24)* 16) 3-etossi-propanolo-1 17) Cis 3-hexenol* 18) 2-nonanone 19) Trans-2-hexanol* 20) Acido acético 21) Etil caprilato 22) m/e(%):45(100) 57(100) 43(76) 85(73) 41(49) 29(36)** 23) 1-heptanol** 24) Cis-5-ossi-2-metil-l,3 diossolano 25) Benzaldeide
26) Etil-2-oxi-2-metil51) m/e(%): 57(100) 43(90) 71(61) pentanoato** 85(59) 41(56) 45(56) 3(44) 27) Acido isobutirrico 83(44) 55(19) 97(17) 28) Cis-4-oximetil-2-metil 112(17) 140(16) 171(5) 1,3-diossolano 52) Dietil malato** 53) Acido caprílico 29) γ-butirro lactona 54) m/e(%): 30(199)113(93)55(80) 30) Etil caprato 56(63)85(51) 41(41) 42(39) 31) Acido isovaleriánico 84(39) 43( 18) 67 (12) 32) Trans-4-ossimetil-2 68( 10) metil-1,3-diossolano* 55) m/e(%): 43(100) 29(10) 33) Dietil succinato** 100(9) 57(6) 84(6)** 34) m/e(%): 85(100) 29(49) 56) m/e(%): 43(100) 117(76) 121(10) 136(11)** 57(27) 29(17) 61(10) 35) 3-metil-tiopropanol-1 ** 31(10)** 36) Metil-bencil cetona** 57) Un succinato** 37) Acido valeriánico** 58) Dietil-2-ossi-glutarato 38) 1,3-proparodiol monoacetato 59) Monoetil-2-ossi-glutarato-γ39) m/e(%): 45(100) 57(73) 29(49) 41(41) 31(27) 75(24) 87(17) Lactona 100(12) 86(12) 101(7) 60) Acido-2-etil octanoico* 40) Etil-4-oxi-butirato 61) γ-decalattona 41) 2-fenil etil acetato 62) Acido cáprico 42) Metil bercilcarbinol** 63) Etil-3-fenil-2-oxi43) Acido capronico proprionato** 44) Etillaurato 64) Ftalide** 45) Alcohol bencílico 65) Acido benzoico 46) 2-fenil etanolo 66) m/e(%): 45(100) 57(83) 43(83) 47) Acido-2-etil hexanoico 71(48) 41(46) 77(45) 85(45) 48) Acido-2-furan carboxilico** 107(21) 138( 17) 29(34) 49) Fenolo 67) Acido láurico 50) γ-nonalattone Los compuestos señalados con (*) han sido encontrados sobre el medio sintético, los (**) sólo sobre el mosto.
TABLA 41 Fuentes de vanación Entre especies * Metabolitos F0,05 = 3,34; F0,01 =5,45 2-fenil etanolo Acido caprónico 3-etoxi propanolo-I Acido isovalerianico Etile C6+C8+C;o Acido caprílico Acido cáprico Acido butírrico 1,2-propandiolo monoacetato 4-OH-butirrato etil Acetoino Dietil-2-0H-glutarato Isoamil acetato Piruvato etile Dietil malato 3-CH3-tio-propanolo-1 Monoetil-2=Hglutarato Dietil succinato γ-butirrolattone Acido isobutirrico Esanolo Moetil succinato Lactato etile
20,38 ++ 11,15 ++ 9,21 ++ 5,96 ++ 5,65 ++ 5,47 ++ 4,68 + 3,82 + 3,42+ 1,93 1,37 1,36 1,34 1,22 1,19 0,86 0,68 0,59 0,50 0,41 0,21 0,11 0,009
Fuentes de variación Metabolitos 3-etoxi-propanolo-1 4-OH-butirato etilo Acido caprónico 1,2-propandiolo monoacetato Isoamil acetato Monoetil-2-0H-glutarato Etile C6+C8+C10 Dietil 2-0H-glutarato γ-butirrolattone Acido capn1ico Dietil succinato Dietil malato 3-CH3-tio propanolo-I Acetoino Piruvato etile Acido isobutírrico Monoetil succinato Esanolo Acido isovaleriánico Lactato etile Acido butírrico Acido caprico 2-fenil etanol
Entre especies * F0,05 = 2,12; F0,01 = 2,90 5,47 ++ 3,04 ++ 2,80+ 2,62+ 2,38 + 1,95 1,88 1,62 1,57 1,12 1,05 1,04 0,95 0,90 0,88 0,74 0,70 0,65 0,53 0,47 0,35 0,28 0,17
Fuentes de variación Entre especies * Metabolitos F0,05 = 3,34; F0,01 =5,45 Acido caprónico Isoamil acetato Etil C6+C8+C10 Acido cáprico Piruvato etile Acido butírrico Dietil-0H-glutarato Acido caprílico 4-0H-butirato etile Monoetil 2-0H-glutarato 2-fenil etanolo 3-CH3-tio propanolo-1 γ-butirrolactone Acetoino Lactato etile Acido isovaleriánico Esanol Dietil succinato 1 ,2-propandiolo monoacetato Acido isobutírrico Dietil malato 3-etossi propanolo-1 Monoetil succinato
10,03 ++ 9,43 ++ 7,63 ++ 4,83 + 4,23 + 3,82 + 2,87 2,85 2,58 2,06 2,80 1,79 1,74 1,14 1,14 0,83 0,94 0,81 0,68 0,67 0,53 0,26 0,19
(*) Para valores de F inferiores al límite de probabilidad P = 0,05 la diferencia no es estadísticamente significativa; es significativa (+) si el valor F supera el 5 %, pero no el l %; si F es superior al nivel de probabilidad del l % la diferencia es altamente significativa (++).
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Para los ácidos caprílico y cáprico, S. uvarum es el más alto productor, diferenciándose de S. cerevisiae y S. bayanus. En lo que respecta a las diferencias entre cepas dentro de una especie, resulta de la tabla 41 que son debidas al 3-etoxipropanol-l, al 4-oxibutirato de etilo, al ácido caprónico, all,2-propanodiólmonoacetato, al acetato de isoamilo. El test de TURKEY, presentado en la tabla 41, permite establecer que las diferencias no conciernen a las cepas de las tres especies: en todo caso las diferencias entre cepas son mucho menos evidentes que las encontradas entre las especies o entre las temperaturas. Veamos ahora las diferencias entre las temperaturas de 10°, 20° y 30° C. De la tabla 41 resulta que esas diferencias son significativas para el ácido caprónico, el acetado de isoamilo, los ésteres de los ácidos C6 + C8 + C10 el ácido cáprico, el piruvato de etilo, el ácido butírico. Para el resto de los compuestos no aparecen diferencias y la influencia de la temperatura se confunde con la variabilidad propia de cada compuesto en el ámbito de la especie. Mientras el feniletanol y el 3-etoxipropanol-l son caracteres ligados esencialmente a la especie, los ácidos grasas y los relativos ésteres además de por la especie vienen influidos por la temperatura de fermentación. Los resultados obtenidos muestran que el ácido caprónico, el acetato de isoamilo y los ésteres de los ácidos C6 + C8 + C10 se encuentran en la concentración más elevada a 20 °C y en la más baja a 30 °C: no está claro por qué a 10 °C se registra una concentración más baja que a 20 °C. El ácido butírico se encuentra en mayor concentración a la temperatura de 10 °C y con los valores más bajos a 30 °C. Para el ácido cáprico y el piruvato de etilo la concentración máxima corresponde a 30 °C y la mínima a 10 °C. El primero es, en efecto, el menos volátil entre los ácidos grasas y el segundo deriva de una mayor acumulación de ácido pirúvico a 30 °C. En la tabla 44 se exponen los resultados relativos al análisis de los fermentos de una cepa de Kloeckera apiculata (Klla), de una de Torulopsis stellata (T 1 s) y una de Schizosaccharomyces ponbe (Schiz. 4). Mientras Kloeckera apiculata ha producido de 2,5 a 3% de alcohol, Torulopsis stellata ha producido en torno al 6 %. Aunque sea en presencia de graduaciones bajas se puede señalar que estas últimas especies se distinguen por la escasísima producción de compuestos volátiles mientras que son buenas productoras de acetoíno y 2feniletanol. T. stellata, además, muestra una producción abundante de I-propanol y cantidades de 2-metilpropanol-l incluso superiores a las producidas por levaduras del género Saccharomyces. Tanto T. stellata como K. apiculata dan contenidos elevados en acidez volátil y en ácido pirúvico. K. apiculata se diferencia, además, de T. stellata neta_ente por el alto valor de acetato de etilo, mientras T. stellata produce elevadas cantIdades de acetaldehldo y de anhídrido sulfuroso. Schizosaccharomyces pombe ha producido una graduación alcohólica comparable a la de las especies S. cerevisiae y S. bayanus, pero la cantidad de productos volátiles es muy baja y algunos de ellos ni siquiera son determinables. Se tiene una producción discreta de monoetilsuccinato. En lo que respecta al efecto de la temperatura, también en este caso los mejores resultados se tienen a 20 ac. Una última observación en lo que concierne a los olores anómalos producidos por las levaduras. Ya hemos señalado que ésta es una característica negativa de Schizosaccharomyces, aunque no se hayan individualizado las substancias responsables. Recientemente BLAISE (1986) ha señalado la presencia de un gusto a almendra amarga en vinos que habían sido conservados en depósitos recubiertos con resina epoxídica. La causa ha sido descubierta en el benzaldehído originado por la oxidación enzimática del alcohol bencílico empleado como plastificante. DELFINI (1987) ha encontrado el mismo fenómeno en vinos italianos que no habían estado en contacto con resinas epoxídicas (que en Italia, además, no contienen alcohol bencílico). También para DELFINI se produce la formación de benzaldehído que proviene del alcohol bencílico; el origen de este último no está claro, parece que la causa es el empleo de gelatina en hojas tratadas con alcohol bencílico para evitar la adhesión entre ellas.
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Conclusiones De todo lo dicho se puede concluir que las levaduras producen numerosos compuestos volátiles, los cuales tienen ciertamente un significado organoléptico. Para alguno de estos compuestos la producción depende de la especie, sobre todo desde el punto de vista cuantitativo, tanto que de la cantidad de algún compuesto se puede deducir la intervención de una especie de levadura particular. Para la mayor parte de los compuestos volátiles, sin embargo, se observa, no sólo una gran variabilidad cuantitativa en el ámbito de la especie, sino también una notable variabilidad en el ámbito de la cepa misma, en el sentido de que a igualdad de substrato y en las mismas condiciones, la misma cepa da resultados distintos en una serie de repeticiones. La temperatura tiene una importancia notable sobre la producción de substancias volátiles por obra de las levaduras, pero no sólo eso, la temperatura parece ser la causa de diferencias organolépticas a favor de los vinos obtenidos a temperatura más baja, que no dependen, sin embargo, de las diferencias en el contenido de los cerca de 40 compuestos volátiles que han sido determinados. Parece que el gran número de compuestos volátiles producidos por las levaduras son la base del general y genérico carácter «vinoso», pero que no son los responsables de la calidad típica y específica de cada vino.
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CAPITULO DECIMOQUINTO
Equilibrios de salificación en los vinos Concentración y actividad de los iones Los ácidos orgánicos que se encuentran en el vino están en parte libres y en parte salificados a los pH normales para los vinos, que podemos considerar comprendidos entre 2,8 y 3,8 aunque ciertos vinos alemanes presentan valores inferiores y ciertos vinos de otros países (por ejemplo vinos australianos) tienen valores superiores a pH 4,0. El estado de disociación de un ácido débil depende de su constante de disociación K y del pH del medio. En el caso de ácidos diácidos se tienen dos constantes de disociación K, y K2 relativas a la primera y segunda disociación del ácido con formación, respectivamente, de un anión monovalente y bivalente. Como expusimos en su momento, las constantes de disociación miden la fuerza de un ácido y son la expresión de la aplicación de la ley de acción de masas a los equilibrios de disociación. En el caso de un ácido monoácido, que indicamos como HA, se tiene el siguiente equilibrio: (1) HA H + + A y aplicando la ley de acción de masas, e indicando entre corchetes las concentraciones molares, se obtiene la siguiente expresión: H + A - = Kc (2) [ HA ] Kc es la constante de las concentraciones. La rigurosa validez de la ley de acción de masas se verifica cuando en vez de las concentraciones se consideran las «actividades» de los iones, definiendo como actividades, precisamente, aquellos valores en los que se cumple rigurosamente la ley de acción de masas, dando un valor de la constante Kt que depende exclusivamente de la temperatura y del tipo de disolvente, pero no de la concentración de los iones presentes: este valor de la constante Kt se denomina «constante termodinámica». Cuando las substancias en equilibrio están cargadas, se crean campos electrostáticos que están influidos por todos los iones presentes y que implican la fuerza iónica de la solución. Las actividades se indican con los símbolos de la substancia entre paréntesis y se relacionan con las concentraciones a través del «coeficiente de actividad», esto es, el coeficiente por el que hay que multiplicar la concentración para obtener la actividad: a A− = A− ⋅ f A− Se tiene entonces:
aH+ ⋅ aA-
= Kt (3) aHA El hecho de que no se cumpla rigurosamente la ley de acción de masas en función de la concentración de los iones presentes depende de la recíproca influencia de las cargas eléctricas de los iones, mientras que las moléculas no disociadas presentan un coeficiente de actividad sensiblemente igual a l. La concentración hidrogeniónica se valora normalmente a través de la medida del pH que se hace por vía potenciométrica y que representa una verdadera medida de actividad hidrogeniónica y no de concentración, aunque los dos valores están en este caso muy próximos al tratarse de concentraciones muy bajas. En rigor, sin embargo, la expresión exacta del pH es la siguiente: pH = - Log aH + es decir, el pH es el logaritmo con signo cambiado de la actividad hidrogeniónica. Así, cuando conocemos el pH de una solución conocemos la actividad hidrogeniónica y, en el caso de un ácido monoácido, deberemos escribir: aH+ A - = Km (4) [ HA ]
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Obtenemos una constante de disociación que se define «constante mixta» (Km) precisamente porque resulta de la contribución de actividades y concentraciones. Constante de disociación mixta y termodinámica Veamos la relación que existe entre la constante mixta Km y la termodinámica Kt y, como consecuencia, entre los valores de los pK, es decir, de los logaritmos con signo cambiado de las constantes mismas. De (3) se obtiene: [ HA ] f HA a pKt = pH + Log HA = pH + Log a A− A - f A− [ HA ] + Log f HA pKt = pH + Log f A− A - y por lo tanto: f pKt = pKm + Log HA (5) f A− Esta última ecuación relaciona el valor de la constante mixta con el de la constante termodinámica en función del logaritmo de los coeficientes de actividad de la forma disociada y de la no disociada. De forma general, suponiendo la disociación ácida de una molécula que posea ya una carga y que libere un ion hidrógeno podemos escribir: A ZA B Z B + H + (6) donde ZA es la carga de la molécula no disociada y ZB la carga después de la disociación. Existe evidentemente la relación: ZA = ZB – 1 (7) En este caso la ecuación (5) se hace: f pKt = pKm + Log A (8) fB Teoría de DEBYE y HÜCKEL DEBYE Y HÜCKEL considerando las interacciones electrostáticas de los iones en solución han llegado a calcular el valor del coeficiente de actividad de un ion en función de la temperatura, de la constante dieléctrica del medio y de la fuerza iónica. La fuerza iónica I viene definida por la expresión siguiente: 1 I = ∑ ci ⋅ zi2 (9) 2 donde c¡ es la concentración del ión y zi su carga. Por ejemplo, una solución 0,1 M de KCL, que se disocia en iones K+ y Cl-, tiene la fuerza iónica: 1 (0,1 ⋅12 + 0,1 ⋅12 ) = 0,1 2 La fuerza iónica de una solución 0,1 M de K2SO4 es: 1 (2 ⋅ 0,1 ⋅12 + 0,1 ⋅ 22 ) = 0,3 2 La influencia de la carga sobre la fuerza iónica es muy relevante. La fuerza iónica coincide con la concentración molar sólo para las sales monovalentes. A una temperatura determinada, por ejemplo 20° C, la expresión de DEBYE y HÜCKEL para el coeficiente de actividad de un ion es la siguiente: z2 A I Log f = − (10) 1+ B I En esta expresión z es la carga del ion, I la fuerza iónica de la solución, A y B dos constantes que dependen de la temperatura y de la constante dieléctrica del medio.
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Si volvemos al caso de la expresión (8), podremos escribir las siguientes relaciones: z 2A I z 2A I Log f A = − A Log f B = − B 1+ B I 1+ B I fA z A2 A I Log = Log f A − Log f B = − fB 1+ B I
(11)
zB 2 A I A I = ( zB 2 − z A2 ) 1+ B I 1+ B I 2 2 2 2 Recordando la (7): Z B − Z A = Z A − 2 Z A + 1 − Z A = 1 − 2 Z A y entonces: fA A I = ( 2 Z A − 1) (12) fB 1+ B I La expresión (5), que da el valor de la constante mixta en función de la constante termodinámica, se hace ahora: A I pKm = pKt + ( 2 Z A − 1) (13) 1+ B I Podemos poner 2ZA - 1 = n y la expresión precedente queda: n⋅ A I pKm = pKt + (14) 1+ B I n asume distintos valores según la carga de la molécula que se disocia, es decir, de la naturaleza del ácido: Log
ZA = 0 ZA = - 1 ZA = - 2
Ejemplo. CH3COOH Ejemplo HTEjemplo HPO42-
n = -1 n=-3 n = -5
La expresión (14) permite, pues, obtener el valor de la constante mixta conociendo la constante termodinámica o viceversa, una vez conocida la fuerza iónica del medio y los valores de las constantes A y B. Aclarado el concepto de constante de disociación y refiriéndonos a los valores de las constantes mixtas, que somos capaces de conocer en función de la fuerza iónica del medio, vamos a abordar las relaciones que existen entre pH, pK y canttidad de ácido no disociado (libre) y disociado (salificado).
Estado de combinación de los ácidos orgánicos Caso de un ácido monoácido Indicamos el ácido monoácido con HA; en el caso del vino tenemos los ácidos acético, láctico, galacturónico, glucurónico y glucónico. Mediante la medida del pH se conoce la actividad del ion hidrógeno, siendo por definición el pH el logaritmo con signo cambiado de esta actividad. De la disociación de un ácido mono ácido se pueden deducir las relaciones siguientes: aH+ A - + =K HA H + A [ HA ]
aH + = K
[ HA ]
Log aH+ = Log K + Log
A - - Log aH+
[ HA ] A -
A - = - Log K + Log [ HA ]
A - pH = pK + Log [ HA ] 10
A - pH - pK = Log [ HA ] ( pH - pK )
A - = [ HA ]
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Hacemos 10(pH-pK) = a y llamando C a la concentración molar del ácido tendremos: C = [HA] + [A-] Se podrá escribir: [A - ] =a [HA] C = [HA] + [A - ] Tenemos un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas fácil de resolver: [A-] =a [HA] y sustituyendo en la otra ecuación: [HA] + a [A - ] = C [HA] ⋅ (1 + a ) = C 1 a [HA] = C [A - ] = C 1+a 1+a En función del pH y del valor del pK de un ácido monoácido es, entonces, posible calcular la cantidad del ácido no disociado (libre) y la del ácido disociado (salificado ). Consideramos como ejemplo el ácido acético y el ácido láctico y tomamos como valores del pH 3,0 y 3,5 asumiendo para el ácido acético el pK de 4,76 y para el ácido láctico el pK de 3,86. Acido acético a pH 3,0 a = 10(3,0− 4,76) = 0, 017378 [HA] =
1 1 C= C = 0,9825 C 1+a 1,017378
[A - ] = 0,0175 C Sobre 100 moléculas de ácido acético 98,25 están no disociadas y 1,75 salificadas.
Acido acético a pH 3,5 a = 10(3,5− 4,76) = 0, 054953 [HA] =
1 1 C= C = 0,9479 C 1+a 1,054953
[A - ] = 0,0521 C Sobre 100 moléculas 94,79 están no disociadas y 5,21 sólo salificadas.
Acido láctico a pH 3,0 a = 10(3,0−3,86) = 0,13803 1 1 [HL] = C= C = 0,8787 C 1+a 1,13803 [L- ] = 0,1213 C Sobre 100 moléculas de ácido láctico 87,87 están libres y 12,13 salificadas.
Acido láctico a pH 3,5 a = 10(3,5−3,86) = 0, 43652 [HL] =
1 1 C= C = 0,6961 C 1+a 1,43652 [L- ] = 0,0175 C
Sobre 100 moléculas de ácido láctico 69,61 están libres y 30,39 salificadas.
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Caso de un ácido diácido Indicamos con H2A el ácido diácido
H 2 A HA - + H + aH + HA -
[H2A]
aH + = K1
= K1
HA - A 2- + H +
aH + A 2- HA
[H2A] HA -
-
= K2
- Log aH +
[ H 2 A ] + HA - + A 2- = C
HA - = pK1 + Log [H2A]
HA - pH = pK1 + Log [H2A] análogamente A 2- pH = pK 2 + Log HA - ( pH − pK1 ) HA - HA - 10 = =a [H2A] = a [H2A] 2 ( pH − pK 2 ) A 2= =b 10 A = b HA HA 2[ H 2 A ] + HA + A = C HA - + HA - + b HA - = C a 1 + a + ab HA = C a
1 + 1 + b HA = C a a HA - = C 1 + a + ab
En función del pH y de los valores de pK1 y pK2 es, pues, posible de un ácido diácido calcular la cantidad de ácido no disociado (libre), semidisociado (semicombinado) y disociado completamente (combinado completamente). Consideramos como ejemplos algunos diácidos a pH 3,0 y a pH 3,5.
Acido tartárico a pH 3,0 ( pK1 = 3,04
pK 2 = 4,37 )
a = 10(3-3,04) = 0,912 b = 10(3-4,37) = 0,04266 1 1 C= C = 0,5126 C [ H 2T ] = 1 + a + a ⋅b 1 + 0,912 + (0,912 ⋅ 0,04266) a 0,912 HT - = C= C = 0, 4675 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,912 + (0,912 ⋅ 0,04266) a ⋅b 0,912 ⋅ 0,04266 T 2- = C= C = 0, 0199 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,912 + (0,912 ⋅ 0,04266)
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Sobre 100 moléculas de ácido tartárico 51,26 están libres, 46,75 semicombinadas y 1,99 combinadas completamente Acido tartárico a pH 3,5 a = 10(3,5-3,04) = 2,884 b = 10(3,5-4,37) = 0,1349 1 1 C= C = 0, 234 C 1 + a + a ⋅b 1 + 2,884 + (2,884 ⋅ 0,1349) a 2,884 HT - = C= C = 0, 6749 C 1 + a + a ⋅b 1 + 2,884 + (2,884 ⋅ 0,1349) a ⋅b 2,884 ⋅ 0,1349 T 2- = C= C = 0, 091 C 1 + a + a ⋅b 1 + 2,884 + (2,884 ⋅ 0,1349) Sobre 100 moléculas de ácido tartárico 23,4 están libres, 67,49 semicombinadas y 9,1 combinadas completamente.
[ H 2T ] =
Acido málico a pH 3,0 ( pK1 = 3,46
pK 2 = 5,13 )
a = 10(3-3,46) = 0,3467 b = 10(3-5,13) = 0,007413 1 1 C= C = 0, 7411 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,3467 + (0,3467 ⋅ 0,007413) a 0,3467 HM - = C = 0, 2570 C C= 1 + a + a ⋅b 1 + 0,3467 + (0,3467 ⋅ 0,007413) a ⋅b 0,3467 ⋅ 0,04266 M 2- = C= C = 0, 0019 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,3467 + (0,3467 ⋅ 0,007413) Sobre 100 moléculas de ácido málico 74,11 están libres, 25,7 semicombinadas y 0,19 combinadas completamente.
[H2M] =
Acido málico a pH 3,5 a = 10(3,5-3,46) = 1,0965 b = 10(3,5-5,13) = 0,02344 1 1 C= C = 0, 4712 C [H2M] = 1 + a + a ⋅b 1 + 1,0965 + (1,0965 ⋅ 0,02344) a 1,0965 HM - = C= C = 0,5167 C 1 + a + a ⋅b 1 + 1,0965 + (1,0965 ⋅ 0,02344) a ⋅b 0,912 ⋅ 0,02344 M 2- = C= C = 0, 0121 C 1 + a + a ⋅b 1 + 1,0965 + (1,0965 ⋅ 0,02344) Sobre 100 moléculas de ácido málico 47,12 están libres, 51,67 semicombinadas y 1,21 combinadas completamente. Se puede decir que a los pH normales del vino el ácido málico se comporta como un monoácido. Acido cítrico a pH 3,0 ( pK1 = 3,46 pK 2 = 5,13 pK 3 = 6,41 ) A la tercera constante de disociación le corresponde un pK tan elevado que no presenta interés para los pH característicos de los vinos y el ácido cítrico se comporta como un ácido diácido.
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a = 10(3-3,14) = 0,72443 b = 10(3-4,77) = 0,016982 1 1 C= C = 0,5758 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,72443 + (0,72443 ⋅ 0,016982) 0,72443 a H 2 Ct - = C= C = 0, 4171 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,72443 + (0,72443 ⋅ 0,016982) 0,72443 ⋅ 0,016982 a ⋅b HCt 2- = C= C = 0, 00708 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,72443 + (0,72443 ⋅ 0,016982) Sobre 100 moléculas de ácido cítrico 57,58 están libres, 41,71 están monosalificadas y 0,708 están disalificadas.
[ H3Ct ] =
Acido cítrico a pH 3,5 a = 10(3,5-3,14) = 2,22908 b = 10(3,5-4,77) = 0,053703 1 1 C= C = 0, 2929 C 1 + a + a ⋅b 1 + 2,22908 + (2,22908 ⋅ 0,053703) 2,22908 a H 2 Ct - = C= C = 0, 67105 C 1 + a + a ⋅b 1 + 2,22908 + (2,22908 ⋅ 0,053703) a ⋅b 2,22908 ⋅ 0,053703 HCt 2- = C= C = 0, 03604 C 1 + a + a ⋅b 1 + 2,22908 + (2,22908 ⋅ 0,053703) Sobre 100 moléculas de ácido cítrico 29,29 están libres, 67,1 monosalificadas y 3,6 bisalificadas. Tampoco en el caso del ácido cítrico son muchas las moléculas bisalificadas a los pH normales de los vinos.
[ H3Ct ] =
Acido succínico a pH 3,0 ( pK1 = 4,22
pK 2 = 5,64 )
a = 10(3-3,46) = 0,060255 b = 10(3-5,13) = 0,0022908 1 1 C= C = 0,943 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,060255 + (0,060255 ⋅ 0,0022908) a 0,060255 HSuc- = C= C = 0, 0568 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,060255 + (0,060255 ⋅ 0,0022908) a ⋅b 0,060255 ⋅ 0,0022908 2Suc = 1 + a + a ⋅ b C = 1 + 0,060255 + (0,060255 ⋅ 0,0022908) C = 0, 00013 C Sobre 100 moléculas de ácido succínico 94,3 están libres, 5,68 semicombinadas y 0,013 completamente combinadas.
[ H 2Suc] =
Acido succínico a pH 3,5 a = 10(3,5-3,46) = 0,19054 b = 10(3,5-5,13) = 0,0071443 1 1 C= C = 0,839 C [ H 2Suc] = 1 + a + a ⋅b 1 + 0,19054 + (0,19054 ⋅ 0,0071443) a 0,19054 HSuc- = C= C = 0,15986 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,19054 + (0,19054 ⋅ 0,0071443) a ⋅b 0,19054 ⋅ 0,0071443 Suc 2- = C= C = 0, 001158 C 1 + a + a ⋅b 1 + 0,19054 + (0,19054 ⋅ 0,0071443) Sobre 100 moléculas 83,9 están libres, 15,99 semicombinadas y 0,116 completamente combinadas. A los pH normales del vino el ácido succínico puede considerarse un ácido monoácido.
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Soluciones equimoleculares de ácido tartárico, málico y láctico Vamos a hacer ahora algunas comparaciones entre soluciones de la misma concentración molar de distintos ácidos refiriéndonos en particular al ácido tartárico, al málico y al láctico. Consideramos la solución acuosa de 40 milimoles/L de los ácidos indicados, es decir, 6,0 g/L de ácido tartárico, 5,36 g/L de ácido málico y 3,60 de ácido láctico. Si tenemos en cuenta que a pH 3,0 incluso el más fuerte de los ácidos, el tartárico, tiene sólo dos moléculas de cada 100 combinadas completamente, para las soluciones de ácidos puros a pH bastante inferior podremos despreciar la segunda disociación y considerar monoácidos también a los ácidos tartárico y málico. En este caso podremos, con suficiente aproximación, obtener el valor del pH en función de la primera constante de disociación de los ácidos y de la concentración total C expresada en moles por litro. En efecto, en la expresión: aH+ A - = K1 (1) [ HA ] Se puede sustituir [A] por (H+) con una óptima aproximación ya que se origina un anión monovalente por cada hidrogenión presente; además [HA] se puede sustituir por C-(H+) ya que la concentración del ácido no disociado se obtiene restando de la concentración total la del anión que es igual a la del hidrogenión. La expresión (1) se hace entonces: aH+ 2 = K1 (2) C - aH+ De la ecuación (2) se obtiene mediante sucesivos pasos: aH+ 2 = K1C - K1aH+ aH+ 2 + K1aH+ - K1C = 0 Se tiene una ecuación de 2° grado en la que la incógnita es la concentración hidrogeniónica y que tiene por solución:
- K1 + K12 + 4 ⋅ K1 ⋅ C aH+ = (3) 2 Recordando que K1 = l0-pK, la expresión (3) se convierte en
aH+ =
- l0-pK + l0-2pK + 4 ⋅ l0-pK ⋅ C 2
y entonces
- l0-pK + l0-2pK + 4 ⋅ l0-pK ⋅ C (4) 2 Sustituimos en (4) C por 0,04 y pK, por el valor 3,04 para el ácido tartárico: pH = - Log
- l0-3,04 + l0-6,08 + 4 ⋅ l0-3,04 ⋅ 0, 04 2 - 0,000912 + 0,00014675 = - Log 2 - 0,000912 + 0, 012114 = - Log = 1,95 2 La solución acuosa de 40 mmoles/L (6 g/L) de ácido tartárico tiene un pH 1,95. Aplicando la fórmula (4) para la misma concentración molar de ácido málico y ácido láctico se obtienen los valores siguientes: pH = - Log
Acido málico 40 mmoles/L (5,36 g/L) : pH = 2,45 Acido láctico 40 mmoles/L (3,60 g/L) : pH = 2,64
Balance de salificación de un vino Para obtener el valor de una constante mixta o lo que es lo mismo, del pK, hay que conocer la fuerza iónica de la solución y los valores de las dos constantes A y B que aparecen en la expresión de los coeficientes de
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actividad según DEBYE y HÜCKEL. Mediante la oportuna elaboración matemática de los valores que aparecen en la literatura para las constantes dieléctricas de las soluciones hidroalcohólicas hemos llegado al cálculo de los valores de A y B en el ámbito de las graduaciones alcohólicas de interés enológico; también hemos determinado el valor de las constantes de los ácidos orgánicos a las distintas graduaciones alcohólicas. Las constantes de disociación que hay que utilizar en el caso de los vinos deben ser las correspondientes a su graduación alcohólica. La única incógnita que queda es la fuerza iónica del vino cuyo conocimiento requiere el análisis completo de los cationes y de los aniones. Tomamos, como ejemplo, el análisis de un vino Barbera de 1967: Alcohol = 12,98° pH = 3,23 = 0,000589 eq/L. Acidez Total = 100,9 meq/L = 7,57 g/L. Acidez Volátil = 13 meq/L = 0,78 g/L. Alcalinidad de las cenizas 23,2 meq/L. Acido tartárico = 19,67 mmoles/l = 2,95 g/L. Acido málico = trazas. Acido láctico = 26,1 mmoles = 2,35 g/L. Nitrógeno amoniacal = 0,43 meq/L = 6 mg/L. Potasio = 19,05 meq/L = 745 mg/L. Sodio = 0,87 meq/L = 20 mg/L. Calcio = 2,35 miliátomos/L = 4,7 meq/L = 94 mg/L. Magnesio = 4,60 miliátomos = 9,21 meq/L = 112 mg/L. Sulfatos = 3,87 mmoles/L = 7,75 meq/L = 675 mg/L como K2SO4 . Cloruros = 1,61 meq/L = 94 mg/L como NaCl. Fosfatos = 3,02 meq/L como ión H2PO4 = 278 mg/L como PO4 Los aniones orgánicos están representados por la alcalinidad de las cenizas y se pueden considerar monovalentes con la excepción de una pequeña cantidad de ion tartrato neutro y otra, todavía más pequeña, del ion malato neutro en el caso de que el málico esté presente: no será pues de los aniones orgánicos de donde se derive un error apreciable en la valoración de la fuerza iónica de un vino si los consideramos todos monovalentes. La fuerza iónica del Barbera en examen se obtiene dividiendo por dos la suma de las concentraciones en ionesgramo/L de todos los cationes y aniones, cada una de ellas multiplicada por el cuadrado de la carga del ión: 1 I = ( 0, 000589 + 0, 00043 + 0, 01905 + 0, 00087 + 0, 00235 ⋅ 4 + 0, 0046 ⋅ 4 + 2 0, 0232 + 0, 00387 ⋅ 4 + 0, 00161 + 0, 00302 ) = 0, 046 Si hacemos la suma de los cationes y de los aniones en meq/L obtenemos los siguientes resultados: cationes = 34,85 meq/L aniones = 35,67 meq/L Se tiene una buena concordancia de valores lo que demuestra que los análisis se efectuaron correctamente. Si consideramos a todos los aniones y cationes monovalentes obtendremos una fuerza iónica aproximada de 0,035 en vez de 0,046. La nueva fuerza iónica aproximada puede determinarse fácilmente a través de la valoración de la acidez cambiable, obtenida por medio de una resina catiónica libre. En efecto, la diferencia de acidez titulable antes y después del cambio, expresada en meq/L representa la suma de todos los cationes presentes y, dividida por 1.000, da directamente la fuerza iónica aproximada del vino. Veamos ahora la influencia que ejerce el valor aproximado de la fuerza iónica sobre las constantes de disociación relativas al ácido tartárico y al ácido láctico del Barbera considerado. A la graduación alcohólica de 13° las constantes termodinámicas del ácido tartárico adoptan los siguientes valores: pK2t = 4,57, mientras la del ácido láctico es pKt = 4,08. pK1t = 3,18 Para 13° de alcohol se tienen además: A = 0,5678 B = 1,704, Recordando las relaciones existentes entre constante termodinámica y constante mixta se tendrá: n ⋅ 0,5678 I pKm = pKt + 1 + 1, 704 I
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En el caso de la primera constante del ácido tartárico n = - 1 (ver pág. 204). 0,5678 0, 046 = 3,18 − 0, 0892 = 3, 091 1 + 1, 704 0, 046 pK1m = 3,18 0,5678 0, 046 = 3,18 − 0, 0805 = 3, 099 1 + 1, 704 0, 046 En el caso de la segunda constante del ácido tartárico n = - 3. 3 ⋅ 0,5678 0, 046 = 4,57 − 3 ⋅ 0, 0892 = 4,302 1 + 1, 704 0, 046 pK1m = 4,57 3 ⋅ 0,5678 0, 035 = 4,57 − 3 ⋅ 0, 0805 = 4,328 1 + 1, 704 0, 035 En el caso del ácido láctico n = - l. 0,5678 0, 046 = 4, 08 − 0, 0892 = 3,991 1 + 1, 704 0, 046 pK1m = 4,08 0,5678 0, 035 = 4, 08 − 0, 0805 = 3,999 1 + 1, 704 0, 035 Como se ve en la comparación de los resultados la valoración de la fuerza iónica en base a la acidez cambiable supone un error muy pequeño del pK mixto, que es del orden de dos unidades sobre la segunda cifra decimal en el caso del pK2 de un diácido, donde la corrección es mayor, mientras no supera una unidad sobre la segunda cifra decimal del pK1. La acidez cambiable sobre una resina catiónica libre es, por tanto, idónea para valorar con suficiente aproximación la fuerza iónica de un vino. Calculamos ahora el estado de combinación para el ácido tartárico y para el ácido láctico en el vino Barbera de composición antes indicada: Acido tartárico 2,95 g/L equivalente a 19,67 mmoles/L pH = 3,23 a = 10(3,23-3,09) = 1,3804 b = 10(3,23-4,30) = 0,08511 1 1 ⋅19,67 = ⋅19,67 = 7,87 mmol / L 1 + a + a ⋅b 1 + 1,3804 + (1,3804 ⋅ 0,08511) a 1,3804 HT - = ⋅ 7,87 = ⋅ 7,87 = 10,87 mmol / L 1 + a + a ⋅b 1 + 1,3804 + (1,3804 ⋅ 0,08511) a ⋅b 1,3804 ⋅ 0,08511 T 2- = ⋅10,87 = ⋅10,87 = 0,925mmol / L 1 + a + a ⋅b 1 + 1,3804 + (1,3804 ⋅ 0,08511) Acido láctico 2,35 g/L equivalente a 26,1 mmol/L
[ H 2T ] =
a = 10(3,23-3,99) = 0,17378 1 1 ⋅ 26,1 = ⋅ 26,1 = 22, 24mmol / L 1 + a 1 + 0,17378 a 0,17378 L- = ⋅ 22, 24 = ⋅ 22, 24 = 3,86mmol / L 1 + a 1 + 0,17378 La suma en meq/L de la parte salificada relativa a los ácidos tartárico y láctico viene dada por:
[ HL] =
10,87 + 0,925 x 2 + 3,86 = 16,58 meq/L La suma de la acidez total y de la alcalinidad de las cenizas lleva a 100,9 + 23,2 = 124,1 meq/L. Restando de este valor la acidez volátil (13 meq/L) y la suma de los miliequivalentes relativos al ácido tartárico y al ácido láctico (39,34 + 26,1 = 65,44), se llega al valor 45,66 meq/L de ácidos distintos al tartárico, láctico y acético. De estos 45,66 meq 23,2 - 16,58 = 6,62 meq están salificados.
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6, 6 ⋅100 = 14,5 % y se trata entonces de ácidos débiles como 45, 66 el succínico, el galacturónico, el glucónico acompañados de pequeñas cantidades de ácido cítrico, el cual. por el contrario, está salificado sobre el 50% de su primera función, es decir, sobre 1/6 sólo de la cantidad total presente. Se tiene pues, una salificación equivalente al
pH y estado de combinación de un ácido Vamos a hacer aún algunas consideraciones sobre los equilibrios de salificación de los ácidos orgánicos del vino por la influencia que ejercen sobre el valor del pH, valor que asume una importancia determinante sobre la característica organoléptica de la acidez, uno de los factores decisivos en la calidad de los vinos. Consideramos de nuevo el caso de una solución de 5,36 g/L, esto es, 40 mmoles/L, de ácido málico a pH 3,0 Y calculamos las fracciones libres y salificadas adoptando para las constantes de disociación los valores pK1 = 3,46 y pK2 = 5,13. El cálculo ha sido expuesto antes y ha dado los siguientes resultados: [HM-] = 0,257 C = 0,257 x 40 = 10,28 mmoles/L [M2-] = 0,0019 C = 0,0019 x 40 = 0,076mmoles/L = 0,152 meq/L Suponemos ahora que nuestra solución de ácido málico se transforma íntegramente en láctico, tendremos 40 mmoles/L de ácido láctico, de los que 10,28 + 0,152 = 10,432 mmoles estarán salificados y 40 - 10,432 = 29,568 mmoles estarán libres. ¿Qué valor tendrá el pH de la solución? El pK del ácido láctico es 3,86 y entonces: 10, 432 pH = 3,86 + Log = 3,86 − 0, 452 = 3, 408 29,568 Significado físico-químico y organoléptico de la fermentación maloláctica y de la fermentación maloalcohólica Sin entrar en la bioquímica de los dos fenómenos se puede afirmar con suficiente aproximación que la fermentación maloláctica consiste en la transformación del ácido málico presente en el vino en la cantidad equimolecular de ácido láctico, mientras la fermentación maloalcohólica determina la desaparición del ácido málico del vino. Para darse cuenta de la substancial diferencia entre los dos fenómenos es oportuno hacer algunas consideraciones sobre las consecuencias que estos dos diferentes modos de transformación del ácido málico tienen en relación con los equilibrios de salificación del vino. Prescindiendo de una pequeña cantidad de ácido cítrico, los ácidos fundamentales del mosto son el tartárico y el málico. Después de la fermentación alcohólica tenemos además, en el vino modestas cantidades de ácido láctico procedente de los azúcares, ácido acético, ácido succínico y ácido galacturónico, derivado este último de la hidrólisis de las pectinas. Los últimos tres ácidos citados son ácidos débiles que juegan un papel modesto sobre los equilibrios de salificación. Examinamos, por tanto, a título de ejemplo una solución constituída por ácido tartárico y málico conteniendo precisamente 40 mmoles/L (6,0 g/L) de ácido tartárico y 40 mmoles/L (5,36 g/L) de ácido málico y con un pH de 3,0. El conocimiento del pH y de la cantidad total de ácido permite calcular las concentraciones de las diferentes formas en que se encuentra el ácido en solución (su estado de combinación) en función de los valores de la constante o de las constantes mixtas de disociación del ácido mismo. Adoptamos para el ácido tartárico y para el ácido málico los siguientes valores de las constantes de disociación: pK2 pK1 Acido tartárico 3,04 4,37 Acido málico 3,46 5,13 Acido láctico 3,86 Ahora podemos analizar el estado de combinación de la solución anteriormente indicada y que contenía 40 mmoles/L de ácido tartárico y 40 mmoles/L de ácido málico con un pH de 3,0.
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Acido tartárico a = 10(3,0-3,04) = 0,912 b = 10(3,0-4,37) = 0,04266 1 1 C= C= [ H 2T ] = 1 + a + ab 1 + 0,912 + 0,912 · 0,04266 = 0,5126 C = 20,504 mmol/L a 0,912 HT - = C= C= 1 + a + ab 1 + 0,912 + 0,912 · 0,04266 = 0,4675 C = 18,7 mmol/L ab 0,912· 0,04266 T 2- = C= C= 1 + a + ab 1 + 0,912 + 0,912 · 0,04266 = 0,0199 C = 0,796 mmol/L
Acido málico a = 10(3,0-3,46) = 0,3467 Y entonces :
b = 10(3,0-5,13) = 0,007413
[ H 2 M ] = 0,7411 C = 29,644 mmol/L HM - = 0,257 C = 10,28 mmol/L M 2- = 0,0019 C = 0,076 mmol/L
Fermentación maloláctica Suponemos ahora que el ácido málico presente en la solución se transforma íntegramente en ácido láctico y nos preguntamos cuál será el nuevo valor del pH y cuál el nuevo estado de combinación de la solución. De los 40 mmoles de ácido málico se originan 40 mmoles de ácido láctico. Si no estuviera presente el ácido tartárico, el ácido láctico originado vendría salificado en correspondencia con la cantidad exacta en que se encontraba salificado el ácido málico, es decir, refiriéndonos a los valores calculados anteriormente, 10,28 + 2 x 0,076 = 10,432 mmoles/L. De la simple ley de acción de masas se obtiene: [ H 2T ] aH + = K IT para el ácido tartárico (1) HT - [ HL] aH + = K L para el ácido láctico (2) L- Antes de la transformación del ácido málico en láctico a pH 3,0, la relación entre la cantidad de ácido tartárico libre y semicombinado, expresada en mmoles/L era: [ H 2T ] = 20,504 18, 7 HT - Para el ácido láctico procedente de la transformación del málico, la relación entre libre y combinado es, como hemos visto: [ HL] = 20,568 L- 10, 432 Pero al estar el ácido tartárico y el málico presentes a la vez, las condiciones de salificación del ácido láctico serán modificadas por obra del ácido tartárico no disociado, el cual, al ser más fuerte, liberará un poco de ácido láctico del lactato, salificándose de forma correspondiente: en una primera aproximación podemos suponer que el fenómeno sucede a expensas de la primera función del ácido tartárico. Al final se alcanzará un nuevo equilibrio con un valor preciso de la concentración hidrogeniónica.
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Indicamos con x la cantidad de ácido que pasa del estado combinado al libre y teniendo presentes las relaciones (1) y (2) antes expuestas, podremos escribir la igualdad siguiente: 20,504 - x 29,568 + x aH + = K IT = KL (3) 18,7 + x 10,432 - x La igualdad (3) se puede desarrollar y lleva, a través de una serie de pasos que indicamos, a una ecuación de 2° grado que permite conocer el valor de x: (20,504 - x)(10,432 - x)K IT = (29,568 + x)(18,7 + x)K L 2
(x - 30,936 x + 20,504·10,432)K IT = (x 2 + 48,268 x + 29,568·18,7)K L K IT x 2 - 30,936 K IT x + 20,504·10,432 K IT = = K L x 2 + 48,268 K L x + 29,568·18,7 K L
(K IT - K L )x 2 - (30,936 K IT + 48,268 K L ) x + + 20,504·10,432 K IT - 29,568·18,7 K L = 0 K IT - K L = 10-3,04 - 10-3,86 = 0,00077397 30,936 K IT + 48,268 K L = 30,936·0,000912 + + 48,268·0,00013803 = 0,034876 20,504·10,432 K IT - 29,568·18,7 K L = 0,118753 Se tiene entonces: 0,00077397 x 2 - 0,034876 x + 0,118753 = 0 0,034876 ± (0,034876) 2 - 4 ⋅ 0,00077397 ⋅ 0,118753 x= = 2 ⋅ 0,00077397 41,35 0, 034876 ± 0, 029226 = 3, 71 0,00154794 La relación entre la forma libre y la semidisociada del ácido tartárico se hace entonces: [ H 2T ] = 20,504 − 3, 71 = 16, 79 18, 7 + 3, 71 22, 41 HT - =
Pero sabemos que el pH está en relación con la proporción entre la forma libre y semidisociada, a través del valor de pKIT 22,41 pH = 3,04 + Log = 3,04 - 0,125 = 3,165 16,79 La relación entre la forma libre y disociada del ácido láctico se hace: [ HL] = 20,568 + 3, 71 = 33, 278 L- 10, 432 − 3, 71 6, 722 y se puede obtener el pH: 6,722 = 3,86 - 0,695 = 3,165 33,278 Naturalmente, con las dos fórmulas distintas se llega al mismo valor del pH. El valor del pH después de la transformación del ácido málico en láctico ha sido, pues, calculado en una primera aproximación de la forma indicada. Tratemos de llegar a una aproximación mayor. Es evidente que la alcalinidad de las cenizas de la solución antes y después de la transformación del ácido málico en láctico permanece constante. pH = 3,86 + Log
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Antes de la transformación la alcalinidad de las cenizas expresadas en meq/L viene dada por la suma de los milimoles de ácidos semicombinados aumentada en el doble de la suma de los mili moles de los ácidos combinados completamente: Alcalinidad cenizas = HT - + HM - + 2 T 2- + 2 M 2- = 18,7 + 10,28 + 2 · 0,796 + 2 · 0,076 = 30,724 meq/L Después de la transformación del ácido málico, la alcalinidad de las cenizas viene dada por la suma de los milimoles de ácido tartárico semicombinado y de ácido láctico combinado más el doble de los milimoles de ácido tartárico combinado completamente: Alcalinidad cenizas = HT - + L- + 2 T 2- A pH 3,165 el cálculo de las concentraciones indicadas da el siguiente resultado: Alcalinidad cenizas = 22,08 + 6,722 + 2 · 1,377 = 31,56 meq/L En correspondencia con el pH indicado se obtiene, pues, una alcalinidad de las cenizas ligeramente superior a la calculada antes de la transformación y esto significa que el pH indicado es un poco elevado. En correspondencia con el pH 3,15 el cálculo de la alcalinidad de las cenizas de la mezcla de ácido tartárico y láctico da el siguiente resultado: 21,78 + 6,527 + 2 x 1,312 = 30,93 meq/L Se tiene en este caso una práctica coincidencia con el valor 30,724meq/L anterior y, por tanto, el pH después de la transformación del ácido málico en láctico ha pasado del valor 3,0 a 3,15: el valor exacto es suficientemente aproximado al calculado por el método anteriormente descrito. Hemos visto lo que sucede con el pH como consecuencia de la fermentación maloláctica; veamos ahora cuales son las consecuencias sobre el poder tampón. El poder tampón de la solución de ácido tartárico y málico, indicando con T la acidez titulable y con A la alcalinidad de las cenizas, viene dado por la expresión siguiente:
π =
dB T·A = 2,303 d pH T+A
La alcalinidad de las cenizas es, como hemos visto, de 30,734 meq/L y la acidez titulable, expresada también en meq/L, se obtiene restando la alcalinidad de las cenizas de la concentración total de los ácidos expresada en meq/L: 80 + 80 - 30,724 = 129,276 meq/L Antes de la transformación del málico el poder tampón es: 129, 276 ⋅ 30, 724 π = 2,303 = 57,17 meq/L 160 Después de la transformación del málico la alcalinidad de las cenizas queda la misma, pero la concentración total del ácido láctico es la mitad de la del málico y, por tanto, la concentración total de los ácidos es 80 + 40 = 120 meq/L y la acidez titulable:
120 - 30,724 = 89,276 meq/L El poder tampón después de la transformación del má1ico en láctico asume el valor siguiente: 89, 276 ⋅ 30, 724 π = 2,303 = 52,64 meq/L 120 Se observa, pues, una disminución del poder tampón del medio, disminución que se mantiene dentro de ciertos límites bastante modestos inferiores, en el ejemplo citado, a 5 meq/L.
172
Fermentación maloalcohólica La fermentación maloalcohólica consiste en la transformación del ácido málico en alcohol con la desaparición casi sin contrapartida del ácido málico presente. . Veamos las consecuencias de tal evolución del ácido málico. También después de la desaparición del ácido málico la alcalinidad de las cenizas permanece invariable y es entonces debida sólo a las formas semicombinadas y combinadas del ácido tartárico, así como exclusivamente al ácido tartárico se refiere la acidez titulable. Indicando con T la acidez total y con A la alcalinidad de las cenizas se tendrán las siguientes relaciones: 2 [ H 2 T ] + HT - = T HT - + 2 T 2- = A K1
[ H 2T ]
HT - = K 2 HT - T 2-
Sustituyendo en la última expresión los valores de [H2T] y [T2-], sacados de las dos igualdades precedentes, se obtiene: T - HT - 2 HT - K1 = K2 y desarrollando: 2 HT - A - HT -
K1 (T - HT - ) (A - HT - ) = 4 K 2 HT -
2
2
(K1 - 4 K 2 ) HT - - K1 ( T + A ) HT - + K1TA = 0 Esta última es una ecuación de 2° grado en la incógnita [HT -] que tiene como solución:
HT - =
K1 ( T - A ) ±
K12 ( T + A ) 2 - 4 ( K 1 - 4 K 2 ) K1 TA 2 ( K1 - 4K 2 )
No queda ahora más que sustituidos valores de la acidez total, de la a1calinidad de las cenizas y de las constantes de disociación del ácido tartárico para obtener la concentración del ácido tartárico semicombinado. A = 30,724
T = 49,276
K1 ( T - A ) = 80K1 = 80·10-3,04 = 0,072961 K12 ( T + A ) 2 = 0,005323 4 ( K1 - 4K 2 ) K1 TA = 4 · 0,0007414 · 0,000912 · 30,724 · 49,276 = 0,004095 Se tiene entonces: 0,072961 ± 0,005323 - 0,004095 = HT = 0,001483 =
72,83 0,072961 ± 0,035043 = 25,57 mmol/L 0,001483
30,724 - 25,57 = 2,577 mmol/L 2 49,276 - 25,57 = 11,853 mmol/L [ H 2T ] = 2
T 2- =
El conocimiento de la concentración de las formas libres y combinadas permite llegar al valor del pH:
173
HT - 25,57 pH = pK1 + Log = 3,04 + Log = 3,374 11,853 [ H 2T ] T 2- 2,577 pH = pK 2 + Log = 4,37 + Log = 3,373 25,57 HT Después, de la fermentación malo alcohólica el pH pasa del valor original de 3,0 al de 3,37 con una elevación muy superior a la que se verifica con la fermentación maloláctica: es oportuno recordar que los valores del pH son logaritmos y que pequeñas variaciones corresponden a variaciones considerables de la concentración hidrogeniónica. Consideramos ahora la variación sufrida por el poder tampón que presenta el siguiente valor:
π = 2,303
49, 276 ⋅ 30, 724 = 43,58 meq/L 80
Se produce una disminución del poder tampón de 13,59 meq/L equivalente al triple de la disminución que se verifica con la fermentación maloláctica. Los ejemplos ilustrados tienen contenidos en ácido tartárico notablemente elevados. En el caso más frecuente de valores en torno a 3 g/L (20 mmoles/L) y permaneciendo constante la cantidad de ácido málico indicada antes de 40 mmoles/L, a pH 3,0 la solución de los dos ácidos presenta las siguientes características: pH = 3,0
[ H 2T ] = 10,252 [ H 2 M ] = 29,644
HT - = 9,35
T 2- = 0,398
HM - = 10,28 M 2- = 0,076 T = 99,422 A = 20,578 99, 422 ⋅ 20,578 π = 2,303 = 39,26 meq/L 120 Repitiendo el camino seguido anteriormente se obtienen los resultados siguientes:
a) Después de la fermentación maloláctica El pH pasa del valor 3,0 al valor 3,22; en efecto, a este pH se obtiene el siguiente estado de combinación: [HT-] = 11,5 [T2-] = 0,82 [L-] = 7,46 Entonces se deduce el valor de la alcalinidad de las cenizas: A = 11,55 + 0,82·2 + 7,46 = 20,65 meq/L valor sensiblemente coincidente con el inicial de 20,578 meq/L. El poder tampón es:
π = 2,303
59, 422 ⋅ 20,578 = 35,20 meq/L 80
b) Después de la fermentación maloalcohólica Se tienen los siguientes valores: T = 19,422 meq/L A = 20,578 meq/L HT - = 13,94 mmol/L 19,422 - 13,94 = 2,74 mmol/L [ H 2T ] = 2 20,578 - 13,94 T 2- = = 3,319 mmol/L 2 Se deduce, por tanto, el siguiente valor del pH:
174
13,94 = 3,75 2,74 3,319 pH = 4,37 + Log = 3,75 13,94 pH = 3,04 + Log
El pH pasa, pues, del valor 3,0 al valor 3,75 con una repercusión desastrosa sobre el carácter organoléptico de la acidez. El poder tampón del medio, además, se convierte en:
π = 2,302
19,4222 ⋅ 0,578 = 23,0 meq/L 40
Respecto a la solución original se produce una caída del poder tampón de 16,26 meq/L equivalente al cuádruple de la disminución que se verifica después de la fermentación maloláctica: el medio resulta profundamente alterado. De cuanto hemos expuesto resulta evidente la profunda diferencia entre las fermentaciones maloláctica y maloalcohólica: esta última supone un verdadero atentado contra la estructura ácida del vino, con un profundo desequilibrio que repercute sobre el estado de combinación de los ácidos, sobre el valor del pH y, como consecuencia, sobre las características organolépticas del producto. Es curioso observar que mientras los enólogos se sublevarían ante la propuesta de eliminar el ácido tartárico del vino, la perspectiva de una eliminación completa del ácido málico sea acogida sin objeciones. Este hecho deriva de dos principales motivos: el insuficiente conocimiento del significado químico-físico de la presencia de un ácido, de su transformación y de su desaparición; el prejuicio difundido de que una intervención microbiológica (en este caso de una Schizosaccharomyces), por su característica de «fenómeno natural» no comporta consecuencias negativas. Es cierto que en enología no conviene recurrir a tratamientos químicos demasiado numerosos aunque estén muy bien definidos por su acción y consecuencias, pero también es cierto que una intervención microbiológica es, en rigor, un tratamiento químico, pero de acción mucho menos definida y de consecuencias mucho menos previsibles, especialmente en lo que respecta a los caracteres organolépticos de los productos secundarios del metabolismo de los microorganismos, no todos conocidos y a veces con influencias negativas incluso existiendo sólo trazas. En el caso específico de la fermentación maloalcohólica la intervención microbiológica lleva a la destrucción del ácido málico sin ninguna contrapartida y ello comporta las consecuencias negativas que hemos ilustrado ampliamente.
Acidos diácidos representados como monoácidos Hagamos ahora algunas consideraciones sobre los ácidos diácidos que servirán para precisar de forma más rigurosa el concepto de poder tampón del vino. Tomamos en consideración los ácidos tartárico, málico y succínico en solución alcohólica a 10° y adoptamos para sus constantes de disociación termodinámicas los valores siguientes: pK1 pK2 Acido tartárico 3,20 4,46 Acido málico 3,61 5,27 Acido succínico 4,35 5,80 Por medio de estos valores y del valor del pH podemos calcular, como hemos visto anteriormente, el estado de disociación para cada uno de los ácidos indicados. Proponemos ahora el sustituir un ácido diácido H2A por un ácido monoácido HB tal que al mismo pH los miliequivalentes del ácido libre HB sean iguales a la suma de los mili equivalentes del ácido libre H2A más la mitad del ácido semicombinado HA-; y los mili equivalentes del ácido combinado B- sean iguales a los mili equivalentes del ácido combinado A- más la mitad del ácido semicombinado HA-. El ácido HB debe, por tanto, ser tal que se den las siguientes relaciones:
175
[ HB]
= 2 [ H 2 A ] + HA -
B- = 2 A 2- + HA - HA - pH - pK1 = Log [H2A] A 2- pH - pK 2 = Log HA -
(2) (3)
(4)
B- 2 A 2- + HA - pH - pK = Log = Log 2 [ H 2 A ] + HA - [ HB] pK = pH + Log
(1)
2 [ H 2 A ] + HA - 2 A 2- + HA -
(5)
(6)
La expresión (6) permite calcular la constante de disociación del hipotético ácido monoácido que presenta para cada pH la misma acidez titulable y la misma alcalinidad de las cenizas que el ácido diácido correspondiente. Naturalmente la reducción de un diácido a un monoácido es una simplificación aproximada: se trata, sin embargo, de ver si el grado de aproximación obtenido por esta vía es suficiente para permitir encuadrar los fenómenos físico-químicos sin errores sensibles. En base a los valores indicados de las constantes de disociación para la graduación alcohólica de 10° se calcula para el ácido tartárico el estado de combinación siguiente, referido a 100 moléculas: pH 2,50 2,70 2,90 3,10 3,30 3,50 3,70 3,90
H2 T 83,21 75,66 66,01 54,67 42,64 31,11 21,22 13,53
HT16,60 23,93 33,08 43,43 53,65 62,08 67,11 67,80
T20,18 0,41 0,91 1,90 3,71 6,80 11,66 18,67
Calculando con estos datos mediante la fórmula (6) el pK del hipotético monoácido equivalente al tartárico, se obtienen los valores siguientes: pH 2,50 2,70 2,90 3,10
pK 3,53 3,55 3,57 3,61
pH 3,30 3,50 3,70 3,90
pK 3,66 3,71 3,78 3,86
Se observa que cuando no se tienen variaciones del pH superiores a 0,2 la simplificación es perfectamente legítima y podremos considerar al ácido tartárico, además de diácido, monoácido con los valores del pK presentados. Análogamente se obtiene para el ácido málico el estado de combinación siguiente, referido a 100 moléculas:
176
pH H2 M HMM22,50 92,79 7,20 0,01 2,70 89,02 10,95 0,03 2,90 83,62 16,31 0,07 3,10 76,27 23,57 0,16 3,30 66,89 32,76 0,35 3,50 55,88 43,38 0,74 3,70 44,18 54,36 1,46 3,90 32,97 64,29 2,74 Calculando con estos datos y la fórmula (6) el valor del pK del hipotético monoácido equivalente al málico se tienen los siguientes datos: pH pK pH pK 2,50 3,93 3,30 4,00 2,70 3,93 3,50 4,04 2,90 3,95 3,70 4,10 3,10 3,97 3,90 4,17 Se ve que las variaciones del pK al variar el pH son, aún, inferiores al caso del ácido tartárico. Examinamos por fin el ácido succínico que presenta el siguiente estado de combinación, referido a 100 moléculas: pH 2,50 2,70 2,90 3,10 3,30 3,50 3,70 3,90
H2Suc 98,61 97,81 96,57 94,67 91,79 87,57 81,59 73,57
HSuc1,39 2,19 3,43 5,32 8,18 12,37 18,27 26,10
Suc20,0007 0,002 0,004 0,011 0,026 0,062 0,145 0,33
Calculando mediante la fórmula (6) los valores del pK del hipotético monoácido equivalente al succínico se tiene: pH pK pH pK 2,50 4,65 3,30 4,67 2,70 4,65 3,50 4,68 2,90 4,66 3,70 4,69 3,10 4,66 3,90 4,71 En todo el campo de pH representativo de los valores posibles para los vinos se puede considerar con perfecta aproximación al ácido succínico como monoácido además de diácido. De cuanto se ha expuesto se concluye que es posible, para pequeñas variaciones de pH, considerar los ácidos diácidos como monoácidos, libres para la fracción correspondiente a la acidez titulab1e y combinados para la fracción correspondiente a la alcalinidad de las cenizas. El poder tampón en relación con las bases Tratemos ahora de aclarar el concepto de poder tampón de una solución de un ácido orgánico parcialmente salificado ante la adición de una base fuerte. Examinamos un ácido monoácido HA, partiendo de la relación deducible de la ley de acción de masas: A - pH = pK + Log [ HA ] Escribimos la expresión de forma ligeramente distinta:
177
pH = pK + Log A - - Log [ HA ] Expresamos ahora los logaritmos decimales como logaritmos naturales, recordando que: Ln x Log x = 2,3026 1 1 pH = pK + Ln A - Ln [ HA ] 2,3026 2,3026 Diferenciamos los dos miembros de la igualdad recordando que el diferencial de una función es igual al 1 producto de su derivada por el diferencial de la variable y que la derivada de Ln x = x 1 1 1 1 d pH = d A - d [ HA ] (1) 2,3026 A 2,3026 [ HA ]
Supongamos que añadimos a la solución del ácido una cantidad de base fuerte dB, esta adición tenderá a aumentar en la misma cantidad el ácido salificado y hará disminuir, también en la misma cantidad el ácido libre, es decir, será: d B = d A - = - d [ HA ] Si en la expresión (1) sustituimos d[A -] y d[HA] por el correspondiente valor de dB obtenemos: dB 1 1 d pH = + - = (2) 2,3026 [ HA ] A d B [ HA ] + A = 2,3026 [ HA ] A -
De esta última expresión se obtiene:
[ HA ] ⋅ A - dB = 2,3026 d pH [ HA ] + A -
(3)
Hemos obtenido la expresión de ANDERSON-HASSELBACH del poder tampón de una solución de un ácido definido precisamente como la cantidad de base fuerte necesaria para una variación de una unidad del pH, calculada en correspondencia con variaciones infinitesimales de pH. Para una mezcla de ácidos la cantidad de base fuerte dB necesaria para la variación unitaria del pH, resultará del sumatorio de la cantidad de base relativa a cada ácido simple y estará en relación con el sumatorio de todos los ácidos libres y con el sumatorio de todos los ácidos combinados. Pero el sumatorio de todos los ácidos libres representa la acidez total, mientras el sumatorio de todos los ácidos combinados representa la alcalinidad de las cenizas. El razonamiento hecho se refiere a ácidos monoácidos, pero ya sabemos que los ácidos diácidos pueden considerarse mono ácidos con la misma acidez titulable y alcalinidad de las cenizas si las variaciones de pH no son demasiado amplias; en el caso de variaciones de pH infinitesimales la asimilación de los diácidos a monoácidos es rigurosa. Así pues, en el caso del vino se podrá expresar rigurosamente el poder tampón por medio de la fórmula (3) sustituyendo el ácido libre por la acidez titulable y el ácido combinado por la alcalinidad de las cenizas. Si indicamos la acidez titulable con T y la a1calinidad de las cenizas con C, la fórmula (3) se hace: dB T⋅C (4) = 2,3026 d pH T+C Consideramos por ejemplo el valor del poder tampón del vino Barbera 1967 del que ya hemos expuesto los análisis y el cálculo del estado de combinación de los ácidos. El vino tiene una acidez total de 100,9 meq/L y una alcalinidad de las cenizas de 23,2 meq/L y su poder tampón será: dB 100,9 ⋅ 23,2 = 2,3026 = 43,43 meq/L d pH 100,9+23,2 Una adición de 43,4 meq/L de base fuerte como el hidróxido potásico o el carbonato cálcico o el bicarbonato potásico (que se comportan exactamente como bases fuertes) hace variar el pH del vino de 3,23 a 4,23. Para
178
aumentar el pH en 0,1 será suficiente la adición de 4,34 meq/L del desacidificante y la acidez total disminuirá, como consecuencia, de 100,9 meq/L a 100,9 - 4,34 = 96,56 meq/L, pasando de 7,57 g/L a 7,24 g/L. El poder tampón en relación con los ácidos El poder tampón que hemos ilustrado es el relativo a la adición de una base fuerte, es decir, en relación con una desacidificación. Con un razonamiento análogo se llega a la definición del poder tampón en relación a la adición de un ácido fuerte como por ejemplo el ácido sulfúrico. Tomamos la expresión ya utilizada: 1 1 1 d pH = d A - − d [ HA ] 2,3026 2,3026 [ HA ] Indicando con dAc la adición de una ácido mineral se tiene: dAc = d[HA] = - d[A], en efecto, ante la adición se obtiene un aumento equivalente del ácido libre y una equivalente disminución del ácido salificado. Se llega por esto a la expresión: d Ac 1 1 d pH = + - 2,3026 [ HA ] A y entonces:
[ HA ] ⋅ A - d Ac = 2,3026 d pH [ HA ] + A - y refiriéndonos a un vino con acidez total T en meq/L y alcalinidad de las cenizas C en meq/L, la expresión se hace: d Ac T⋅C = 2,3026 d pH T+C La expresión es idéntica a la de la adición de base fuerte, salvo la presencia del signo - que indica una disminución del pH con la adición del ácido.
Influencia del estado de combinación de los ácidos sobre el extracto densimétrico Además de las consecuencias sobre el pH, sobre el poder tampón, sobre los problemas de la desacidificación y de la acidificación, el estado de combinación de los ácidos orgánicos de los vinos tiene influencia sobre el parámetro físico de la densidad y, como consecuencia, sobre el valor del extracto que se determina normalmente por vía densimétrica. Si se procede a la determinación del extracto seco de un mosto por vía densimétrica y lo comparamos con el extracto obtenido por vía gravimétrica (trabajando a 70° C para evitar la caramelización de los azúcares después de haber hecho absorber el mosto sobre una amplia superficie de papel para facilitar la evaporación) observaremos que el extracto den simétrico resulta más elevado, incluso en varios gramos, que el gravimétrico. Si, por el contrario, hacemos la misma comparación para los vinos, los valores de los dos extractos resultarán prácticamente coincidentes. Para explicar estos hechos experimentales es necesario recordar que el extracto densimétrico expresa los gramos de sacarosa por litro que dan la misma densidad que las substancias, distintas de glucosa y fructosa, contenidas en un litro de mosto o de vino desalcoholizado y llevado al volumen original. El valor del extracto será pues la consecuencia de la influencia sobre la densidad de la unidad de peso de cada una de las substancias no azucaradas disueltas; por ejemplo 1 g de K2SO4 actúa sobre la densidad como 2,2 g de sacarosa y, por vía densimétrica, será valorado como 2,2 g de extracto. En la tabla siguiente se presentan los gramos por litro en base a la densidad 200/200 para cada gramo realmente disuelto de una serie de substancias presentes en los vinos:
179
Substancia Acido tartárico Bitartrato potásico Tartrato neutro potásico Acido málico Bimalato potásico Malato neutro potásico Acido láctico Lactato potásico Acido succínico Fosfato monopotásico Sulfato potásico Acido glutámico Arginina Prolina Glicerina
Gramos por litro en base a la densidad 20/20 para cada gramo realmente disuelto 1,190 1,533 1,762 1,030 1,412 1,671 0,639 1,370 0,775 1,837 2,200 1,050 0,900 0,650 0,603
Se observa que los ácidos orgánicos influyen sobre el extracto de manera distinta según su estado de combinación. Conociendo la composición de una solución y calculando el estado de combinación de los ácidos orgánicos se puede llegar con buena aproximación al extracto densimétrico. En el caso de los mostos prevalecen las substancias que elevan el valor del extracto den simétrico, el cual resulta más elevado que el gravimétrico; en el caso de los vinos la presencia de glicerina en cantidad relevante compensa la elevación del extracto producida por las sales y se obtiene un buena correspondencia entre los extractos densimétrico y gravimétrico.
180
CAPITULO DECIMOSEXTO
La desacidificación y la acidificación de los vinos Para valorar con rigor los efectos de los desacidificantes químicos permitidos (bicarbonato potásico, carbonato de calcio) y del ácido tartárico, única substancia acidificante admitida por la ley, hay que trabajar sobre el vino, medio homogéneo, con estructura ácida definida y determinable analíticamente: las desacidificaciones y acidificaciones efectuadas sobre mostos turbios o peor sobre la masa estrujada, a menudo en presencia de bitartrato potásico cristalino en suspensión, no permiten seguir la evolución de los fenómenos. Una desacidificación o una acidificación ejercen sobre el vino una influencia compleja que implica a todos los equilibrios de salificación de los ácidos orgánicos; la adición de bicarbonado potásico, carbonato de calcio o ácido tartárico no determina sólo fenómenos de neutralización recíproca entre ácidos y bases, sino que supone automáticamente la precipitación de sales poco solubles. Estas precipitaciones, con independencia de los problemas de estabilización físico-química, influyen profundamente sobre el resultado final de la desacidificación o acidificación y son determinantes para el resultado mismo. Desde el punto de vista organoléptico, que debe representar el objetivo substancial de una intervención, una des acidificación o una acidificación debe tratar de modificar el valor del pH del vino: es la concentración hidrogeniónica la que determina la sensación gustativa de la acidez. Es necesario, pues, razonar en términos de pH y no de acidez total; esta verdad evidente tiende a abrirse paso en la enología, pero es fácil y habitual la determinación de la acidez total y la estimación de su variación aunque no esté ligada proporcionalmente a la variación de la concentración hidrogeniónica que es la significativa desde el punto de vista organoléptico. Hoy se tienen aparatos accesibles para la medida del pH que dan resultados precisos si las medidas se hacen con el cuidado y diligencia necesarios; existe, sin embargo, una cierta dificultad psicológica para asumir el conocimiento de la importancia de las variaciones de pH y se debe a que las variaciones se expresan mediante números pequeños y se olvida que se trata de valores exponenciales para los cuales una variación de 0,3 en el pH supone una variación de 1 a 2 en la concentración hidrogeniónica. La modificación del pH de los vinos Los vinos son soluciones «tampón» porque contienen ácidos débiles en presencia de sus propias sales y manifiestan una cierta resistencia a la variación del pH por adición de ácidos o de bases. Esta resistencia, como ya se ha ilustrado antes, viene expresada por el poder tampón, definido como la relación entre la cantidad de base o ácido fuerte y la variación del pH relativa, para variaciones infinitesimales del pH. dL π = d pH donde dL representa una adición infinitesimal de base o de ácido fuerte. En otras palabras, el poder tampón expresa la cantidad de base o de ácido fuerte necesaria para hacer variar el pH en una unidad (por ejemplo de 3,00 a 4,00), determinada tomando en consideración variaciones pequeñísimas del pH. Hemos visto que mediante consideraciones teóricas podemos expresar el poder tampón π de una solución de un ácido orgánico en presencia de sus sales en función de la concentración (expresada en meq/L) del ácido libre y de la del ácido salificado y que estas consideraciones son perfectamente aplicables a los vinos, considerando los ácidos libres expresados por la acidez titulable y los salificados expresados por la alcalinidad de las cenizas. Indicando con T y S respectivamente la acidez total y la alcalinidad de las cenizas, ambas expresadas en meq/L, se llega a la expresión del poder tampón según HENDERSON-HASSELBACH:
π =
dL T ⋅S = 2,303 d pH T+S
(1)
El coeficiente 2,303 corresponde a la transformación de los logaritmos neperianos en logaritmos decimales.
181
Desacidificación de los vinos Nos proponemos efectuar en una serie de vinos distintos una desacidificación para obtener un aumento del pH del orden de 0,3. Una precipitación de bitartrato significa una disminución del numerador de la fracción en el segundo miembro de la ecuación (2): disminuye el valor de la relación del pH, que se obtiene sumando allogaritmo una constante. Con un pHmetro de precisión, y trabajando sobre 100 mL de vino, medimos la cantidad de NaOH N/10 necesaria para un aumento del pH de 0,3 , para conocer los meq/L de base fuerte necesarios para alcanzar ese objetivo. A 100 mL de vino añadimos ahora respectivamente la cantidad exactamente pesada de KHCO3 y de CaCO3, correspondiente a los meq/L de NaOH empleados y efectuamos la medida del valor del pH. Observamos que en el caso del empleo de KHCO3 se obtiene exactamente el mismo valor que en el caso de la sosa, mientras con el CaCO3 registraremos un valor del pH más bajo. Para evaluar la divergencia de comportamiento entre el bicarbonato potásico y el carbonato de calcio, al vino desacidificado con carbonato potásico se añade ácido clorhídrico N/l0 hasta igualar exactamente el pH obtenido con la desacidificación por medio del carbonato de calcio: los meq/l de ácido clorhídrico empleados dan una medida de la divergencia de comportamiento entre los dos desacidificantes. Tal diferencia de comportamiento demuestra que el calcio se combina parcialmente con liberación de iones hidrógeno. Para comprender la evolución de los fenómenos que se verifican en la desacidificación hay que proceder a la determinación del alcohol, del pH, de la acidez total, de la alcalinidad de las cenizas, del calcio y del potasio. Como el resultado que interesa es el que se alcanza después de la estabilización físico-química, los vinos desacidificados con KHCO3 se someten a refrigeración a – 4 °C o – 5 °C durante 6 - 7 días, mientras que los desacidificados con CaCO3 se conservan durante 10 días a temperatura ambiente. Después de la estabilización, sobre los vinos separados de los precipitados se procede a la determinación del pH y, respectivamente, del potasio y del calcio. Como resultará de los datos experimentales, que serán expuestos más adelante, la variación del pH causada por la precipitación de las sales es distinta según el pH alcanzado por el vino después de la desacidificación: para valores de pH próximos a 3,60 las modificaciones son pequeñas, mientras que para valores inferiores éstas se manifiestan en el sentido de una disminución sensible del pH. Este comportamiento es perfectamente explicable si se tiene presente que las precipitaciones se producen a causa del ácido tartárico, que a pH 3,60 se encuentra casi completamente bajo forma de ion bitartrato HT-, mientras a pH inferiores se encuentra bajo forma de ácido libre H2T y de ión bitartrato HT-. Del equilibrio de la primera disociación del ácido tartárico se obtiene la expresión: HT - pH = pK1 + Log [ H 2T ]
(2)
Una precipitación de bitartrato significa una disminución del numerador de la fracción en el segundo miembro de la ecuación (2): disminuye el valor de la relación del pH, que se obtiene sumando al logaritmo una constante. Cuando importantes cantidades de tartárico desaparecen como tartrato de calcio se produce una desviación de los equilibrios de salificación con disminución final de la concentración de ion bitartrato y la consecuente disminución del pH. Así pues, la precipitación de las sales después de la desacidificación actúa en sentido opuesto a la desacidificación misma, es decir, disminuye el valor del pH que había aumentado como consecuencia de la neutralización. Conviene subrayar la profunda diferencia de comportamiento entre el bicarbonato de potasio y el carbonato de calcio. Aparte de su menor poder neutralizante que será puesto en evidencia con los datos experimentales, el carbonato de calcio comporta, en fase estabilizada, una precipitación de tartrato neutro con una consiguiente disminución de la alcalinidad de las cenizas correspondiente a los miliequivalentes del catión precipitado, mientras en esta fase la acidez total no sufre ninguna disminución posterior.
182
Por el contrario, el empleo del bicarbonato potásico provoca en fase de estabilización la precipitación de bitartrato potásico con una disminución de la alcalinidad de las cenizas correspondiente a los miliequivalentes de catión precipitado, pero con una contemporánea disminución de la acidez total del mismo valor: para los mismos miliequivalentes del catión precipitado, el potasio elimina del vino una cantidad doble de ácido tartárico que el calcio con el consiguiente efecto de un resultado final que se expresa en una mayor desacidificación con un valor del pH más elevado respecto al CaCO3. Exponemos los resultados de las experiencias de des acidificación antes descritas sobre 18 vinos de variedades y años distintos: naturalmente no todos los vinos requerían una des acidificación, pero se ha querido estudiar el fenómeno incluso sobre vinos envejecidos y con valores de pH más elevados. Los resultados obtenidos se presentan en las tablas 45, 46, 47 y 48. Antes de pasar a analizar y comentar los resultados y para una mejor comprensión de los datos expuestos en las tablas vamos a explicar el procedimiento adoptado para el Barbera 1980: para el resto de los vinos, los valores de las tablas se han obtenido de la misma forma. Refiriéndonos a la tabla 45 se presentan para el Barbera los valores de alcohol, pH, acidez total y alcalinidad de las cenizas. Dividiendo los meq/L de sosa añadida para la relativa variación del pH, se obtiene el poder tampón determinado: 16,55/0,33 = 50,15 meq/L. El poder tampón determinado representa un valor medio para una variación del pH en tomo a 0,3 y no coincide, por tanto, con el poder tampón calculado que se refiere a una variación infinitesimal del pH, aunque los dos valores no son muy diferentes. El poder tampón en juego en los fenómenos de des acidificación es el experimental; además permite calcular en función de la acidez total el valor de la acidez salificada, evitando la determinación indudablemente laboriosa y fastidiosa de la alcalinidad de las cenizas. TABLA 45 Vinos 1980. Desacidificación con KHCO3 y sucesiva estabilización con conservación a -4°, -5° C durante 6-7 días Barbera Freisa Alcohol % en volumen pH Acidez total meq/L Alcalinidad cenizas meq/L π calculado meq/L Kmeq/L Ca meq/L
Dolcetto Nebbiolo
Grignolin Merlot o
Cortese
Pinot bianco
Riesling
9,60 2,96 118,5 22,0 42,73 15,244 2,398
11,30 3,11 136,1 27,0 52,00 26,345 2,545
10,80 3,14 94,5 20,5 39,80 18,621 2,245
10,60 3,19 93,5 21,5 40,20 18,544 2,794
10,10 3,05 113,9 22,0 42,46 20,104 4,990
11,20 3,27 87,5 22,0 40,49 23,123 2,415
10,32 2,81 113,2 19,5 38,31 19,183 1,796
11,40 3,26 80,9 20,0 36,93 19,056 3,044
10,75 2,88 87,8 15,0 29,51 17 ,265 4,192
16,55 3,29 0,33 50,15 26,68 3,61
16,60 3,42 0,31 53,50 28,01 3,80
12,75 3,44 0,30 42,50 22,93 3,76
13,80 3,49 0,30 46,00 25,40 3,76
15,30 3,37 0,32 47,81 25,39 3,70
14,00 3,60 0,33 42,42 23,33 3,84
13,30 3,14 0,33 40,30 20,70 3,55
11,85 3,58 0,32 37,03 20,07 3,87
10,25 3,19 0,31 33,06 17,16 3,59
Desacidificación K añadido meq/L Acidez total meq/L Acidez salificada meq/L pH determinado pH calculado
16,681 101,82 43,36 3,30 3,24
16,711 119,39 44,72 3,43 3,37
12,885 13,884 81,61 79,62 35,81 39,28 3,44 3,50 3,40 3,45
15,382 98,52 40,77 3,38 3,45
14,084 73,42 37,41 3,62 3,32
13,315 99,88 34,01 3,14 3,55
12,166 67,83 32,24 3,61 3,08
10,278 77,57 27 ,44 3,20 3,14
Estabilización K precipitado meq/L Acidez total meq/L Acidez salificada meq/L pH determinado pH calculado π calculado meq/L
14,506 87,31 28,85 3,18 3,13 49,94
10,060 109,33 34,66 3,38 3,30 60,61
6,286 75,33 29,52 3,42 3,35 48,84
15,408 83,11 25,36 3,28 3,18 44,75
12,011 61,40 25,40 3,56 3,46 41,38
18,355 81,53 15,65 2,98 2,83 30,24
8,584 60,15 23,66 3,60 3,46 39,11
12,886 64,49 14,55 3,03 2,94 27,34
Desacidificación NaOH añadido meq/L pH ∆pH π determinado meq/L Acidez salificada meq/L
6,697 72,92 32,58 3,48 3,41 51,86
183
TABLA 46 Vinos 1980. Desacidificación con CaCO3 y sucesiva estabilización con conservación durante 10 días a temperatura ambiente Pinot Barbera Freisa DoIcetto Nebbiolo Grignolino Merlot Cortese Riesling blanco Desacidificación Ca añadido meq/L 16,625 16,765 12,983 14,107 15,366 14,227 13,368 12,169 10,351 pH determinado 3,23 3,37 3,39 3,44 3,31 3,55 3,08 3,53 3,14 Desacidificación con KHCO) + acidificación con HCI K añadido meq/L pH determinado HCl añadido meq/L pH determinado
16,681 3,30 2,06 3,23
16,711 3,43 2,48 3,37
12,885 3,44 1,64 3,39
13,884 3,50 2,16 3,44
15,382 3,38 3,36 3,31
14,084 3,62 2,56 3,55
13,315 3,14 2,40 3,08
12,166 3,61 2,80 3,53
10,278 3,20 1,87 3,14
K añad . − HClañad ⋅100 Caañad .
87,95
84,89
86,61
83,11
78,24
81,00
81,65
76,97
81,23
Acidez total meq/L Acidez salificada meq/L pH calculado
103,88 41,30 3,21
121,87 42,24 3,34
83,26 34,17 3,37
81,78 37,12 3,42
101,88 37,41 3,26
75,98 34,85 3,50
102,28 71,53 31,61 29,44 3,04 3,48
79,44 25,27 3,10
Estabilización Ca precipitado meq/L Acidez total meq/L Acidez salificada meq/L pH determinado pH calculado π calculado meq/L
15,979 103,88 25,32 3,02 3,00 46,88
14,520 121,87 27,72 3,21 3,16 52,01
11,886 83,26 22,28 3,25 3,19 40,48
13,621 81,78 23,50 3,28 3,22 42,04
17,759 101,88 19,65 3,17 2,99 37,94
13,448 75,98 21,40 3,38 3,29 38,45
12,770 12,320 11,447 102,28 71,53 79,44 18,84 17,12 13,82 2,97 3,40 3,03 2,82 3,25 2,83 36,64 31,81 27,11
TABLA 47 Vinos 1971-72. Desacidificación con KHCO3 y sucesiva estabilización con conservación a – 4 °, - 5 ° C durante 7 días Pinot Barbera Freisa Dolcetto Nebbiolo Grignolino Merlot Cortese bianco 1971 1971 1971 1971 1971 1972 1971 1971 Alcohol % en volumen 13,10 13,95 13,90 13,81 12,99 9,03 13,43 14,39 pH 3,41 3,54 3,50 3,49 3,43 3,63 3,45 3,58 Acidez total meq/L 100,4 89,5 71,1 78,0 93,3 84,0 70,4' 61,9 Alcalinidad cenizas meq/L 20,5 23,3 21,2 20,49 19,0 26,5 16,2 18,0 39,21 42,58 37,61 37,37 36,35 46,39 30,33 32,11 π calculado meq/L Kmeq/L 20,335 23,864 24,427 24,504 20,002 26,601 18,851 19,311 Ca meq/L 1,647 2,345 2,595 2,545 1,747 2,495 1,996 1,198 Desacidificación NaOH añadido meq/L 14,75 12,28 11,50 13,20 13,30 15,50 8,10 9,40 pH 3,71 3,84 3,82 3,79 3,75 3,96 3,74 3,89 0,30 0,30 0,32 0,30 0,32 0,33 0,29 0,31 ∆ pH 1t determinado meq/L 49,17 20,93 35,94 44,00 41,56 46,97 27,93 30,32 Acidez salificada meq/L 27,12 22,18 19,99 25,30 22,37 26,93 14,65 16,72 pK 3,98 4,15 4,05 3,98 4,05 4,12 4,13 4,15 Desacidificación K añadido meq/L 14,883 12,316 11,886 13,305 13,505 16,222 8,191 9,619 Acidez total meq/L 85,52 77,18 59,21 64,69 79,79 67,78 62,21 52,28 Acidez salificada meq/L 42,00 34,50 31,88 38,61 35,87 43,15 22,84 26,34 pH determinado 3,73 3,84 3,85 3,81 3,78 3,99 3,74 3,91 pH calculado 3,67 3,80 3,78 3,76 3,70 3,92 3,69 3,85 Estabilización K precipitado meq/L 5,240 6,254 1,138 6,603 1,407 4,968 3,894 3,097 Acidez total meq/L 80,28 70,93 58,08 58,09 78,38 62,81 58,32 49,18 Acidez salificada meq/L 36,76 28,25 30,74 32,01 34,46 38,18 18,95 23,24 pH determinado 3,67 3,81 3,85 3,78 3,74 3,97 3,63 3,86 pH calculado 3,64 3,75 3,77 3,72 3,69 3,90 3,64 3,82 58,07 46,53 46,29 47,53 55,13 54,59 32,94 36,35 π calculado meq/L
184
Riesling 1972 12,10 3,19 72,0 14,2 27,32 12,407 4,291 9,70 3,49 0,30 32,3 17 ,44 3,81 9,789 62,21 27,23 3,49 3,45 2,704 59,51 24,53 3,45 3,43 40,00
TABLA 48 Vinos 1971-72. Desacidiflcación con CaCO3 y sucesiva estabilización con conservación durante 10 días a temperatura ambiente Pinot Barbera Freisa Dolcetto Nebbiolo Grignolino Merlot Cortese Riesling bianco 1971 1971 1971 1971 1971 1972 1971 1972 1971 Desacidificación Ca añadido meq/L 14,787 12,309 11,929 13,288 13,788 15,986 8,392 9,452 9,791 pH determinado 3,68 3,80 3,83 3,76 3,74 3,93 3,72 3,86 3,44 Desacidificación con KHCO3 + acidificación con HCl K áñadido meq/L pH determinado CHI añadido meq/L pH determinado
14,883 3,73 2,28 3,68
12,316 3,84 1,80 3,80
11,886 3,85 0,82 3,82
13,305 3,81 2,58 3,75
13,505 3,78 2,14 3,74
16,222 3,99 2,40 3,93
8,191 3,74 0,64 3,72
9,619 3,91 1,70 3,86
9,789 3,49 2,18 3,43
K añad . − HClañad ⋅100 Caañad .
85,23
85,43
92,76
80,71
82,43
86,46
89,98
83,78
77,71
Acidez total meq/L Acidez salificada meq/L pH calculado
87,80 39,72 3,64
78,98 32,70 3,77
60,03 31,06 3,76
67,27 36,03 3,71
81,93 33,73 3,66
70,18 40,75 3,88
62,85 22,20 3,68
53,98 24,64 3,81
64,39 25,05 3,40
Estabilización Ca precipitado meq/L Acidez total meq/L Acidez salificada meq/L pH determinado pH calculado π calculado meq/L
12,340 87,80 27,38 3,51 3,47 48,07
10,263 78,98 22,44 3,70 3,60 40,24
4,344 60,03 26,72 3,78 3,70 42,58
12,440 67,27 23,59 3,63 3,52 40,22
11,393 81,93 22,34 3,57 3,49 40,43
9,000 70,18 31,75 3,93 3,78 50,34
6,646 62,85 15,55 3,55 3,52 28,71
8,054 53,98 16,59 3,70 3,64 29,22
2,905 64,39 22,14 3,33 3,35 37,94
En efecto, de la fórmula (1) se puede obtener la relación siguiente, donde S indica la acidez salificada: π⋅T (3) S= 2,303 ⋅ T - π Empleando la fórmula (3) se obtiene precisamente el valor de la acidez salificada presentado en la tabla 29: 50,15 ⋅118,5 = 26,68 meq/L 2,303 ⋅118,5 - 50,15 Además con el empleo de los valores de la acidez salificada, de la acidez total y del pH se calcula el valor del pK del monoácido que tiene una acidez libre y salificada iguales, respectivamente, a la acidez titulable y a la acidez salificada del vino, empleando la fórmula siguiente: T pK = pH + Log (4) S En el caso del Barbera se obtiene: 118,5 pK = 3,61 + Log = 3, 61 26,68 En la desacidificación con KHCO3 a 100 mL de vino se han añadido 165 mg de bicarbonato potásico equivalentes a 16,681 meq/L de potasio con una correspondiente disminución de la acidez total (118,5 - 16,681 = 101,8 meq/L) y un correspondiente aumento de la acidez salificada (26,68 + 16,681 = 43,36 meq/L). Junto al valor determinado del pH después de la des acidificación se indica también el valor del pH que se obtiene por cálculo con la fórmula (2) en función de la acidez titulable, de la acidez salificada y del pK: 43,36 pH = 3,61 + Log = 3, 24 101,82 Después de la refrigeración durante 6 días a -40 C, el vino desacidificado contiene una cantidad de potasio de 681 meq/L, lo que equivale a 17,419 meq/L. El contenido de potasio del vino antes de la estabilización se obtiene sumando al valor original del vino el potasio añadido como KHCO3: 15,244 + 16,681 = 31,925 meq/L; si se resta de este valor el potasio encontrado después de la estabilización se obtiene el potasio precipitado: 31,9125 - 17,419 = 14,506 meq/L.
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La disminución del potasio con la estabilización supone una disminución correspondiente tanto de la acidez total (101,82 - 14,506 = 87,31 meq/L) como de la acidez salificada (43,36 - 14,506 = 28,85 meq/L). Con el empleo de las fórmulas (4) y (1) respectivamente se obtienen los valores 3,13 para el pH calculado y 49,94 meq/L para el poder tampón calculado. Del mismo modo se han obtenido todos los datos expuestos en las tablas 45 y 47. Las tablas 46 y 48 se refieren a los resultados obtenidos desacidificando con la CaCO3. Para el Barbera, a 100 mL de vino se han añadido 83,2 mg de CaCO3 lo que supone 16,625 meq/L de calcio, obteniendo un pH de 3,23. 100 mL de vino, previamente desacidificado con KHCO3, han sido llevados con HCL N/l0 a pH 3,23 empleando 2,06 meq/L de ácido clorhídrico; esto significa que los 16,625 meq/L de carbonato de calcio han manifestado la misma acción desacidificante que 16,681 - 2,06 = 14,621 meq/L de KHCO3 y que, por tanto, el carbonato de calcio presenta en comparación con el bicarbonato de potasio un poder desacidificante de sólo el (14,621/16,625) x 100 = 87,95%. Después de la des acidificación la acidez total ha disminuido en 14,621 meq/L (118,5 - 14,621 = 103,88 meq/L) y otro tanto ha aumentado la acidez salificada (26,68 + 14,621 = 41,30 meq/L). Después de la estabilización durante 10 días a temperatura ambiente se ha encontrado para el calcio un valor de 61 mg/L, unos 3,044 meq/L. El contenido en calcio antes de la estabilización se obtiene sumando al valor original del vino el calcio añadido como CaCO3: 2,398 + 16,625 = 19,023 meq/L; si se resta de este valor el calcio encontrado después de la estabilización se obtiene el calcio precipitado: 19,023 - 3,044 = 15,979 meq/L. La disminución del calcio con la estabilización supone sólo una disminución correspondiente de la acidez salificada (41,30 - 15,979 = 25,32 meq/L). Con el ejemplo de las fórmulas (4) y (1) se obtienen respectivamente los valores 3,00 para el pH calculado y 46,88 meq/L para el poder tampón calculado. De la misma forma se han obtenido todos los datos de las tablas 46 y 48. Estos datos necesitan un atento examen y algunos comentarios. l. En fase de neutralización el bicarbonato potásico lleva siempre al mismo resultado que la cantidad equivalente de sosa. 2. Independientemente de la estabilización posterior, el poder neutralizante del carbonato de calcio resulta en el vino inferior al del bicarbonato potásico. Esto sucede porque después de la neutralización una parte del calcio reacciona con algunos componentes del vino liberando hidrogeniones. Haciendo la media de los valores presentados en las tablas 46 y 48, el poder neutralizante del CaCO3 resulta del 83,7% respecto al del bicarbonato potásico o al de la sosa: se puede, razonablemente, equipararlo al 85%. 3. La desacidificación, efectuada tanto con el bicarbonato potásico como con el carbonato de calcio, debe ser seguida por una estabilización. A este respecto se observa que mientras para el potasio es indispensable el recurrir a la refrigeración, esto no es necesario en el caso del calcio. Además, si se comparan las tablas 45, y 47 con las tablas 46 y 48, aparece de forma evidente que para los mismos meq/L añadidos en la desacidificación, se observa, después de la estabilización, una precipitación mucho más completa del calcio que del potasio. . De la tabla 46 se deduce que en los vinos con pH más bajo, precisamente aquellos en los que tiene interés la desacidificación, se observa una precipitación casi completa del calcio añadido, mientras en el caso del potasio la precipitación es notablemente inferior. 4. Como ya se dijo antes, la fase de estabilización supone, por razones físicoquímicas: una desviación del pH en sentido inverso al determinado durante la desacidificación. Bajo este aspecto potasio y calcio difieren substancialmente, no tanto por el menor poder desacidificante del carbonato de calcio como por el hecho de que la precipitación del calcio supone sólo una disminución de la alcalini dad de las cenizas (acidez salificada), mientras que la precipitación del potasio provoca en la misma medida, además de la disminución de la acidez salificada, una disminución de la acidez titulable. En términos de pH la desacidificación con CaCO3 resulta pues menos eficaz y para la obtención de un pH determinado se requieren mayores cantidades de desacidificante. 5. Si se considera la acidez del vino derivada de un monoácido cuya acidez libre viene expresada por la acidez titulable de las tablas resulta que sobre la base del valor determinado del poder tampón y del pH, es
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posible calcular según la fórmula de HENDERON-HASSELBLACH el valor del pH antes y después de la estabilización, obteniendo resultados muy concordantes con los datos experimentales. 6. Por último, hay que destacar que en el caso de la des acidificación con KHCO3 de los vinos viejos, resulta muy difícil la posterior estabilización, con una precipitación de bitartrato potásico netamente inferior respecto a los vinos jóvenes. Parece que con el envejecimiento aumenta el poder inhibidor del vino en relación con la precipitación del «crémor» confirmando los resultados obtenidos en el estudio sobre su estado de saturación en los vinos (U SSEGLIO- TOMASSET y BOSIA,1982). También para los vinos jóvenes la estabilización del potasio se revela más difícil en cualquier caso mientras la estabilización del calcio se presenta satisfactoria, con alguna excepción sólo en el caso de los vinos viejos. Previsión de la cantidad de desacidificante necesaria para obtener un valor determinado del pH después de la estabilización Con los elementos en nuestro poder es posible proceder al cálculo de la cantidad de desacidificante necesaria para obtener un pH previamente elegido después de la estabilización. Será suficiente admitir la hipótesis de una precipitación del potasio y del calcio añadidos en fase de neutralización y asumir para el carbonato de calcio un poder neutralizan te equivalente al 85% del teórico. Se debe distinguir, naturalmente, entre la desacidificación con KHCO3 y con CaCO3 Caso del empleo del bicarbonato potásico. Haremos el cálculo tomando como ejemplo el caso del Barbera 1980 y proponiéndonos obtener un pH final después de la estabilización de 3,30. Si x son los meq/L de K a añadir en la hipótesis de que el mismo potasio añadido precipite en fase de estabilización, la acidez total variará de T a T - 2 x : en efecto, se tendrá una disminución de x meq/L en fase de neutralización y otra disminución de x meq/L por la precipitación de otros tantos milimoles de crémor. La acidez salificada, por el contrario, no variará: en efecto, aumentará en x meq/L en fase de neutralización, pero disminuirá en x meq/L en fase de estabilización. Si se tiene presente la relación que existe entre pH, pK, acidez total y acidez salificada, indicando esta última con S, se podrá escribir: S pH = pK1 + Log (5) T - 2x De la que se obtiene mediante sencillos pasos: T - 2x 10 (pK - pH) = S (pK - pH) T - 2x = S ⋅10 T S x= - ⋅10 (pK - pH) (6) 2 2 Sustituyendo los valores de la tabla 45 en la fórmula (6) se obtiene: 118,5 26,68 x= ⋅10 (3,61 - 3,30) = 32,01 meq/L 2 2 Se deberán añadir 32 meq/L de potasio en forma de bicarbonato, con una con sistente disminución de la acidez total. Para la previsión de la cantidad de bicarbonato necesaria hay que conocer los siguientes parámetros del vino a desacidificar: pH y acidez total. Además, empleando 100 mL de vino se tomará nota de los mI de NaOH N/10 necesarios para una variación del pH exactamente determinada y del orden de 0,3. La relación entre la sosa empleada y la variación del pH correspondiente nos da el poder tampón determinado π del vino. Utilizando la fórmula (3), el valor de 1t y el de la acidez total se conoce el valor de la acidez salificada S. Con el empleo de los valores de acidez total y acidez salificada y a través de la fórmula (4) se obtiene el valor del pK. Con el uso de la fórmula (6) se puede calcular en meq/l de potasio la cantidad de bicarbonato a emplear para obtener después, de la estabilización un valor elegido del pH.
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El uso del bicarbonato potásico provoca una notable disminución de la acidez total por lo que puede ser utilizado cuando el vino presenta no sólo un bajo valor del pH, sino también una acidez total muy elevada y susceptible de ser reducida considerablemente. En el ejemplo presentado para el Barbera una precipitación de 32 meq/L de potasio supone una eliminación de 4,8 g/L de ácido tartárico, cantidad excesiva que puede incluso no estar presente en el vino. Es evidente que el límite de una desacidificación real viene impuesto por la cantidad máxima de ácido tartárico eliminable y que, como consecuencia, en el caso del Barbera 1980 no será posible alcanzar la desacidificación hasta obtener después de la estabilización un pH de 3,30, sino que habrá que contentarse con un pH final más bajo. Por ejemplo un pH de 3,20 requiere sólo 25 meq/L de potasio añadido, con eliminación de 3,74 g/L de ácido tartárico: en el caso concreto expuesto en la tabla 45, a causa de la precipitación ligeramente inferior de bitartrato, con el empleo de sólo 16,681 meq/L de potasio y una eliminación de 2,18 g/L de ácido tartárico se ha llegado al pH final de 3,18. En el caso de un vino tinto la desacidificación puede efectuarse antes de la fermentación maloláctica con el objetivo de favorecerla y, como consecuencia, antes de la estabilización. En este caso se empleará el bicarbonato potásico necesario para llevar en fase de neutralización el pH a un valor próximo a 3,2, teniendo presente que como consecuencia de la transformación del ácido málico el pH sufrirá un posterior aumento comprendido entre 0,1 y 0,2. Naturalmente, si el potasio añadido no precipita completamente en la fase de estabilización, el pH final del vino resultará más elevado, como demuestran los datos de las tablas 45 y 47, los cuales ponen en evidencia como los valores calculados del pH resultan en general un poco más bajos que los experimentales. Caso del empleo del carbonato de calcio. Como hemos destacado antes, el carbonato de calcio no sólo se diferencia del bicarbonato potásico por el menor poder neutralizante (cerca del 85%), sino que supone, en la fase de estabilización, la eliminación de una cantidad de ácido tartárico de alrededor de la mitad que la eliminada como bitartrato potásico: por esto existe la posibilidad de emplear una cantidad en meq/L de calcio dos veces mayor que la utilizable de potasio, en relación con la cantidad máxima de ácido tartárico eliminable. Además, de los datos experimentales expuestos se desprende que la estabilización es más completa con el empleo del carbonato de calcio. Teniendo en cuenta el menor poder desacidificante, para una adición de x meq/L de calcio la acidez total variará de T a T - 0,85 x : en efecto, ésta será la disminución en la fase de neutralización mientras en la fase de estabilización la acidez total permanecerá invariable. En la hipótesis de una precipitación del calcio añadido no se producirá ninguna variación de la acidez salificada. La fórmula que relaciona el pH después de la estabilización con la acidez total y la acidez salificada es, pues, la siguiente: S pH = pK + Log (7) T - 0,85x Relación de la que se obtiene mediante sencillos pasos: x = T - S ⋅10 (pK - pH) (8) De la fórmula (8) se desprende que por adición de 50 meq/L de calcio como CaCO3 se obtiene un pH de 3,16, un poco inferior al de 3,20 obtenido añadiendo 25 meq/L de potasio. Como en ninguno de los dos casos hay variación de la acidez salificada durante la estabilización, el aumento de pH viene determinado sólo por la disminución de la acidez total, disminución que como ya hemos repetido requiere, para el mismo resultado, el doble de meq/L de calcio respecto al potasio: no debe sorprender, por tanto, que en los dos casos se alcance el mismo resultado final con un pH un poco más bajo en el caso del carbonato de calcio debido a su menor poder desacidificante. Conviene indicar que si se quiere incrementar el pH de un vino tinto antes de la fermentación maloláctica, es decir, antes de la estabilización, no es oportuno el empleo de CaCO3 ya que la insolubilización del calcio es más fácil que la del potasio; la insolubilización del calcio desvía el pH hacia valores más bajos, anulando prácticamente el efecto de la neutralización. Acidificación de los vinos La acidificación de los vinos sólo puede ser efectuada con el empleo de ácido tartárico.
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También en este caso el objetivo final es el de obtener un valor determinado del pH del vino con el fin de conseguir un particular resultado organoléptico. Aunque el ácido tartárico es el más fuerte de los ácidos orgánicos del vino sigue siendo un. ácido débil y, como consecuencia, su efecto acidificante será debido no tanto a un aumento de la acidez total como a una disminución de la alcalinidad de las cenizas (de la acidez salificada) que se obtiene en la fase de estabilización por precipitación del bitartrato potásico. La estabilización es, por tanto, indispensable no sólo para conseguir la estabilidad físico-química necesaria del vino sino precisamente para alcanzar en la acidificación el resultado deseado. A diferencia de la des acidificación, pero por los mismos motivos físico-químicos, como la acidificación actúa a través del ácido tartárico se produce la precipitación de bitartrato potásico que acentúa la disminución del pH. En efecto, si el ácido tartárico añadido precipita completamente como bitartrato potásico, el efecto final es idéntico al que se obtiene añadiendo al vino los meq/L de un ácido fuerte, como por ejemplo, el clorhídrico, iguales a los meq/L de potasio precipitado: se observa en definitiva una disminución de la alcalinidad de las cenizas (acidez salificada) igual a los milimoles de ácido tartárico añadido. Presentamos el ejemplo de pruebas de acidificación efectuadas sobre 9 vinos de Puglia con elevado valor del pH: Se ha procedido de forma análoga al caso de la desacidificación, añadiendo ácido clorhídrico N/10 a 100 mL de vino hasta obtener una disminución del pH comprendida entre 0,25 y 0,50, según el valor inicial del pH. Después se ha añadido ácido tartárico al vino empleando un número de milimoles por litro igual a los meq/l de HCl usado y se ha efectuado después la estabilización por conservación a – 5 ºC durante 7 días. La diferencia entre los contenidos en potasio antes y después de la estabilización ha permitido valorar el ácido tartárico precipitado como bitartrato potásico. Como en el caso de la des acidificación se ha empleado el valor del poder tampón determinado en relación con los ácidos con el fin de calcular la acidez salificada, sin recurrir al análisis de la alcalinidad de las cenizas. También en este caso se ha calculado el valor del pK que ha permitido determinar el del pH en función de la acidez total y de la acidez salificada. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 49 y necesitan algunas observaciones y comentarios. 1. Los vinos meridionales, caracterizados por elevados valores de pH, presentan baja acidez total y valores generalmente elevados de la alcalinidad de las cenizas. El pH no está condicionado por la acidez total, sino por la relación entre la acidez total y la alcalinidad de las cenizas; la posibilidad de disminución del pH no depende de un aumento de la acidez total, sino de una disminución de la alcalinidad de las cenizas que sólo se obtiene en la fase de estabilidad con la precipitación de bitartrato. 2. El cambio favorable de un valor del pH demasiado elevado en los vinos se consigue sólo con una variación modesta de la acidez total y una consistente variación de la alcalinidad de las cenizas. Por tanto, después de la acidificación con ácido tartárico, seguida de una indispensable refrigeración, los vinos presentan una acidez titulable ligeramente aumentada, pero una alcalinidad de las cenizas fuertemente disminuida. Es imposible la mejora organoléptica de los vinos poco ácidos sin una relevante disminución de la alcalinidad de las cenizas: para estos vinos oportunamente corregidos la relación entre los valores de la alcalinidad y el peso de lascenizas resulta más baja que para otros tipos de vino. 3. Como consecuencia de la inevitable disminución de la alcalinidad de las cenizas, los vinos presentan después de la estabilización una notable disminución del poder tampón. 4. Como resulta evidente de los datos de'la tabla 48, se puede afirmar que un número de milimoles por litro de ácido tartárico causan, después de la estabilización, una disminución del pH igual a los mismos meq/L de ácido clorhídrico: en general la precipitación de bitartrato es igual a los milimoles de ácido tartárico añadidos y causa, por tanto, la misma disminución del pH que el mismo número de mili equivalentes del ácido fuerte. 5. En el caso de la acidificación con ácido tartárico la previsión de los resultados se simplifica: se obtendrá después de la estabilización el valor del pH previsto, si se añadieran tantos milimoles por litro de ácido tartárico como los meq/L de HCl necesarios para obtener tal pH.
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6. La estabilización con frío aparece en este caso, no sólo como una necesidad para evitar enturbiamientos de «crémor», sino como el medio indispensable para realizar, a través de la precipitación de bitartrato potásico, aquella disminución de la alcalinidad de las cenizas que permiten rebajar el pH hasta el valor deseado. . TABLA 49 Vinos 1981. Acidificación con ácido tartárico y posterior estabilización mediante conservación a -5° e durante 7 días Blanco S. Severo Alcohol % en volumen pH Acidez total meq/L Alcalinidad cenizas meq/L π calculado meq/L K meq/L Ca meq/L Acidificación HCI añadido meq/L pH ∆pH π determinado meq/L Acidez salificada meq/L pK Acidificación H,T añadido mmoles/L Acidez total meq/L Acidez salificada meq/L pH determinado pH calculado Estabilización K precipitado meq/L Acidez total meq/L Acidez salificada meq/L pH determinado pH calculado π calculado meq/L
Blanco Andria
Blanco Pnglia
Rosado Pnglia
Tinto Puglia
Blanco Trebbiano/ Trebbiano/ Trebbiano/ Puglia Bombino b. Bombino b. Lambrusco
10.38 3,50 61,10 22,0 37,25 22,253 2,794
12,48 3,92 54,00 42,0 54,41 40,413 3,194
11,80 3,63 60,45 27,0 42,98 31 ,461 3,992
13,50 3,68 57,40 27,0 42,29 26,090 2,794
12,84 3,56 66,50 29,0 46,51 29,671 3,992
11,87 3,73 50,90 28,00 41,60 29,057 3,792
10,89 3,60 52,80 26,6 40,74 26,345 4,391
10,56 3,64 59,35 31,5 47,39 29,415 4,990
13,10 3,80 64,85 35,0 52,35 38,879 3,293
10,80 3,20 0,30 36,00 21,01 3,96
22,20 3,43 0,49 45,31 30,95 4,16
11,70 3,28 0,35 33,43 19,10 4,13
10,70 3,35 0,33 32,42 18,65 4,17
11,10 3,30 0,26 42,69 25,70 3,97
11,30 3,37 0,36 31,39 18,61 4,17
12,30 3,23 0,37 33,24 19,86 4,02
12,90 3,30 0,34 37,94 22,80 4,06
18,80 3,37 0,43 43,72 26,84 4,18
11,147 83,39 21,01 3,31 3,36
22,207 98,41 30,95 3,52 3,66
11,753 83,96 19,10 3,39 3,49
10,687 78,77 18,65 3,44 3,54
11,193 11 ,280 88,89 73,46 25,70 18,61 3,35 3,45 3,43 3,57
12,213 77,23 19,86 3,31 3,43
13,086 85,52 22,80 3,36 3,49
19,112 103,07 26,84 3,44 3,60
10,589 72,80 10,42 3,15 3,12 20,99
23,071 75,34 7,88 3,33 3,18 16,43
11,843 72,12 7,26 3,25 3,13 15,19
10,232 68,54 8,42 3,32 3,26 17,27
7,162 81,73 18,54 3,28 3,33 34,80
8,338 68,89 11,52 3,24 3,24 22,73
9,720 75,80 13,08 3,26 3,30 25,69
17,266 85,80 9,57 3,29 3,23 19,83
9,495 63,96 9,11 3,34 3,32 18,36
Cristales de bitartrato de potasio aislados de un vino. Microscopio electrónico (375 X). (Universidad Católica del Sacro Cuore de Piacenza).
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Significado e importancia de los parámetros relacionados con la acidez de los vinos El vino es una bebida ácida, caracterizada en el aspecto sensorial por una cierta acidez. La sensación ácida depende de dos factores: la concentración del ión hidrógeno y el poder tampón. La concentración del ión hidrógeno se expresa normalmente por el valor del pH y representa la «nota» ácida, mientras que el poder tampón regula la permanencia de la sensación, la resistencia a la neutralización. El poder tampón depende de la relación entre los ácidos orgánicos libres y los ácidos orgánicos salificados y su valor en meq/L viene dado por la fórmula: dB L ⋅S = p = 2,303 ⋅ d pH L+S donde 2,303 es el coeficiente de transformación de los logaritmos neperiamos en decimales, L los ácidos libres (la acidez tiulable) y S los ácidos salificados (la alcalinidad de las cenizas). El poder tampón expresa cuantos miliequivalentes de la base fuerte son necesarios para aumentar en una unidad el valor del pH, para variaciones infinitesimales del pH. Para conocer la estructura ácida de un vino es necesario determinar la acidez titulable (ácidos orgánicos libres), la alcalinidad de las cenizas y los ácidos minerales. La acidez titulable es una determinación simple y fácil. Por el contrario, la determinación de la alcalinidad de las cenizas es costosa y difícil, en particular en presencia de azúcares. Sin embargo, es posible obtener el valor de la alcalinidd sin necesidad de determinar las cenizas. Para hacer esto hay que proceder del siguiente modo: A 100 mL de vino, si su pH ≤ 3,30, se añaden 10 mL de NaOH N/10 y se mide nuevamente el valor del pH. Se obtiene: S pH1 = pK + Log L S + 10 pH 2 = pK + Log (1) L - 10 10 ⋅ L S= (L - 10) ⋅10∆pH - L El valor de la alcalinidad de las cenizas S viene dado por la fórmula [1] en función de la acidez titulable y de la diferencia entre los valores del pH. Si el valor del pH del vino supera 3,30 se añaden 10 mL de cm N/l0 y se usan las fórmulas siguientes: S pH1 = pK + Log L S - 10 (2) pH 2 = pK + Log L + 10 10(1+∆pH) ⋅ L S= (L - 10) ⋅10∆pH - L El valor de la alcalinidad de las cenizas viene dado por la fórmula [2]. Hemos determinado la a1calinidad de las cenizas por el método tradicional de 50 vinos con pH < 3,30 y 50 vinos con pH > 3,30: las dos poblaciones de datos obtenidas no han mostrado diferencias significativas. Poseemos pues un método fácil para la determinación de la alcalinidad de las cenizas. En lo que respecta a la valoración de los ácidos minerales, es suficiente con determinar la acidez cambiable sobre resina catiónica en forma libre; se resta el valor de la acidez titulable, se obtiene la suma en meq/L de la alcalinidad de las cenizas y de los ácidos minerales, Y restando la alcalinidad de las cenizas, se obtiene el valor correspondiente a los ácidos minerales. Se puede, pues, con simples titulaciones establecer un cuadro completo de la estructura ácida de un vino. ¿Cómo se puede controlar la acidez de un vino? La base está constituida por el pH, que está estrechamente ligado a la sensación ácida,. Consiste en variar el valor del pH del vino acidificando o desacidificándolo para obtener el pH elegido después de la estabilización físico-química.
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Para la acidificación el problema es muy simple; basta con medir los mI de ácido clorhídrico N/10 añadidos al vino necesarios para modificar el pH hasta el valor elegido. Se añaden después al vino los mismos milimoles de ácido tartárico que insolubilizarán los mismos meq/L de potasio, resultando lo mismo que una acidificación con un ácido mineral: la diferencia es debida únicamente al hecho de que se elimina por precipitación el potasio que el ácido fuerte neutraliza. El caso de la des acidificación es un poco más complicado porque se pueden emplear dos substancias (el bicarbonato potásico y el carbonato cálcico) que actúan de modo distinto. El bicarbonato después de la estabilización precipita como bitartrato potásico y se obtiene un efecto que depende no sólo de la neutralización sino también de la disminución de la acidez titulable, mientras que el empleo del carbonato de calcio provoca una disminución de la alcalinidad de las cenizas. La precipitación de las sales provoca una disminución del pH y el valor del pH después de la estabilización se puede calcular a partir de las fórmulas: S pH = pK + Log (3) L L ⋅S H = 2,303 (4) L +S donde S y L son, respectivamente, la acidez titulable y la alcalinidad de las cenizas del vino estabilizado. Se añade la sosa N/10, a 100 mL de vino, necesaria para la variación prevista del pH y, después, se añaden los mismos meq/L de KHCO3 o CaCO3. Utilización de resinas catiónicas Para acidificar un vino se puede, también, recurrir al empleo de resinas catiónicas en forma libre. En efecto, con este tratamiento no se añade nada y sólo se eliminan cationes. El modo más racional de proceder es el siguiente. Se propone, por ejemplo, modificar el pH del vino de 3,50 a 3,30. Para ello hay que conocer los cationes totales restando la acidez titulable de la acidez cambiable sobre resina catiónica libre: supongamos 35 meq/L. Se añaden 100 mL de vino, ácido clorhídrico N/l0 hasta que el pH pase de 3,50 a 3,30: supongamos 10 meq/L. Deberemos, pues, cambiar 10 meq/L de cationes, es decir, 10/35 x 100 = 28,6 % del vino y, a continuación, se añadirá el 71,4 % del vino tal cual. De este modo, se obtendrá el pH deseado y se realizará una estabilización eliminando el 28,6 % de los cationes, con la consiguiente disminución del 28,6 % de la alcalinidad de las cenizas.
La sensación ácida La sensación ácida de un vino viene condicionada por dos factores: el pH y el poder tampón. El pH da la intensidad ácida mientras que el poder tampón influye sobre la duración de la sensación. Hemos realizado una experiencia con una serie de soluciones hidroalcohólicas a 10° de los ácidos puros del vino, soluciones con el mismo pH y el mismo poder tampón. Hemos sometido las soluciones a un análisis sensorial empleando el duo-trio test: todas las soluciones eran comparadas con la de ácido tartárico. Las soluciones empleadas eran: ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido glucorónico, ácido glucónico y ácido láctico. En ningún caso han aparecido diferencias significativas salvo en el caso del ácido láctico. El ácido láctico es el único que demuestra tener un gusto propio que se diferencia del resto de los ácidos (en el duo-trío test 18 degustadores de 20 han reconocido la muestra de ácido láctico). En los vinos, los ácidos orgánicos contribuyen a la sensación ácida proporcionalmente a su fuerza ácida y a su concentración, salvo el ácido láctico que aporta una contribución específica.
192
CAPITULO DECIMOSEPTIMO
Las precipitaciones de sales en los vinos Las precipitaciones tartáricas Examinados los equilibrios de salificación de los ácidos orgánicos del vino vamos a analizar ahora el problema de las precipitaciones tartáricas, que están en particular relación con los equilibrios de salificación del ácido tartárico. Con la excepción de casos particulares en los que, como consecuencia de la intervención de Botrytis cinerea sobre la uva, se encuentra en el vino la presencia de ácido múcico, el ácido tartárico es el único ácido orgánico que puede dar origen a precipitaciones de cristales de sales poco solubles: el bitartrato potásico y el tartrato neutro tetrahidratado de calcio. El ácido tartárico es constituyente típico y fundamental de la uva y del vino como componente típico y fundamental es el potasio. También el calcio es un constituyente del vino aunque no tan típico como el potasio: el vino es una bebida potásica y esto asume un significado particular por su valor biológico y alimentario. Para impedir las precipitaciones de las sales poco solubles del ácido tartárico no se puede, pues, pensar en eliminar el ácido tartárico mismo del vino y tampoco el potasio. En cuanto al calcio, una eliminación aunque no sea completa podría considerarse más aceptable, valorando sin embargo con mucha cautela las consecuencias sobre el vino de los medios empleados para realizarla. . Al estar presente y no ser eliminables los elementos que son el origen de las precipitaciones hay que examinar muy de cerca cuáles son sus relaciones recíprocas a fin de comprender y valorar la situación real del vino. Precipitaciones de bitartrato potásico Antes hemos llegado a calcular la cantidad de ácido tartárico que en un vino se encuentra bajo forma de ion bitartrato. Para ello es necesario conocer la concentración total en ácido tartárico, el pH y los valores de la primera y segunda constantes mixtas del ácido tartárico a la graduación alcohólica del vino y a su fuerza iónica. Hemos visto cómo esto se obtiene fácilmente utilizando los datos de las constantes termodinámicas a las distintas graduaciones alcohólicas y valorando la fuerza iónica a través de la determinación de la acidez cambiable sobre resina catiónica libre. En relación con la precipitación de bitartrato potásico son dos los factores determinantes que condicionan la solubilidad: la concentración del ion bitartrato y la concentración del ion potasio, esta última sensiblemente igual al potasio total, determinable analíticamente. Conocidas estas dos concentraciones, la temperatura y la graduación alcohólica «deberíamos» ser capaces de encuadrar rigurosamente el problema de la solubilidad del bitartrato potásico en el vino. Hemos utilizado a propósito el término «deberíamos» ya que, como veremos pronto, las condiciones indicadas antes son idóneas para establecer y prever la solubilidad del crémor en una solución hidroalcohólica sintética, pero no en el vino. Sin embargo, para hacemos idea de lo que ocurre en el vino debemos servimos de las soluciones hidroalcohólicas como referencia para establecer cuáles son las solubilidades del bitartrato a diferentes graduaciones alcohólicas, en el ámbito de los pH enológicos y a una temperatura suficientemente baja para garantizar los posibles golpes de frío que, eventualmente, puede sufrir el vino. Indicamos el bitartrato potásico con la notación KHT. En solución se tiene la disociación: KHT K + + HT Admitimos que una cierta cantidad de moléculas no disociadas están en equilibrio con los iones según la ley de acción de masas: K + HT - =L [ KHT ] L es una constante para cada temperatura y para cada tipo de disolvente, en nuestro caso para cada graduación alcohólica. En la solución saturada, donde no es posible disolver más sal, el denominador de la fracción se hace constante y, como consecuencia, también se hace constante el producto de las concentraciones de los dos iones: K + HT - = Ps
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La constante, que como hemos dicho asume un valor determinado para cada tipo de disolvente (para cada graduación alcohólica) y para cada temperatura, se llama producto de solubilidad de la sal. Cuando el producto de las concentraciones molares de los iones potasio y de los iones bitartrato supera el valor del producto de solubilidad, se tiene una precipitación de sales hasta igualar el valor prescrito, es decir, quedando en solución estable sólo cantidades de iones bitartrato y de iones potasio tales que el producto de sus concentraciones molares no supere el valor del producto de solubilidad. Hay que determinar, pues, el producto de solubilidad del bitartrato potásico a las graduaciones alcohólicas de los vinos y a temperaturas muy inferiores a las de bodega y a las habituales en las fases de comercialización; conocido el producto de solubilidad se podrá, con la determinación del ácido tartárico, del pH Y del potasio de un vino, tener todos los elementos para calcular si este valor es superado y si el vino es estable a determinada temperatura. Expresado en estos términos el problema de la estabilización en relación con las precipitaciones de bitartrato potásico parece de fácil solución, disponiéndose de un método racional de control de las condiciones de estabilidad a través del cálculo del producto de las concentraciones del ion potasio y del ion bitartrato, valor que, comparado con el del producto de solubilidad del bitartrato potásico a la misma temperatura y graduación alcohólica, nos da directamente una medida de la estabilidad. Pero, como veremos, la situación en los vinos es mucho más compleja encontrándose siempre en condiciones de fuerte sobresaturación, es decir, manteniendo en solución cantidades de potasio y de ácido tartárico incompatibles con el producto de solubilidad; el estudio de la solubilidad del bitartrato en mezclas hidroalcohólicas da resultados distintos y ha demostrado el comportamiento anómalo de los vinos. Operando con mezclas hidroalcohólicas hemos determinado el valor del producto de solubilidad a – 4 °C para las graduaciones alcohólicas entre 6 y 18° y hemos calculado las tablas que dan la cantidad de potasio que queda en solución para cada concentración de ácido tartárico, para cualquier graduación comprendida entre 6 y 18 Y para cualquier valor del pH comprendido entre 2,8 y 3,8. La temperatura de – 4 °C ha sido elegida porque es suficientemente distante de la temperatura alcanzable durante la conservación y la comercialización y también porque es muy utilizada como test de estabilización por frío, consiste precisamente en conservar el vino a – 4 °C durante dos días. BERG y KEEFER en los Estados Unidos, han determinado los valores del producto de solubilidad del bitartrato a diferentes temperaturas obteniendo resultados coincidentes con los nuestros, como demuestra la comparación que han hecho DIEMAIR y MAIER entre los valores obtenidos por KOCH y GEISS, BERG Y KEEFER Y los resultados obtenidos por nosotros. En efecto, en el diagrama siguiente, donde se presentan los valores del potasio en función de la concentración en ácido tartárico para 10° de alcohol, a pH = 3,10 y a – 4 °C, la curva a trazos representa los datos de KOCH y GEIS y la línea continua tanto los datos de BERG y KEEFER como los nuestros que son completamente coincidentes. De cuanto hemos expuesto hasta ahora resulta evidente que somos hoy capaces de establecer cuánto ácido tartártico y cuánto potasio «deberían» quedar en un vino a una determinada temperatura; se trata ahora de ver cuánto queda efectivamente, es decir, de comparar el modo condicional con el modo indicativo. Multiplicando la concentración del ion bitartrato presente en un vino por la concentración de potasio obtenemos un valor que denominaremos producto de concentración Pc; este valor debería ser igual al producto de solubilidad del bitartrato a la misma temperatura y graduación alcohólica, si el vino no se encuentra en estado de sobresaturación.
Fig. 37 - a
194
Una primera respuesta de cuál es la situación real en los vinos se encuentra en los datos, debidos a BERG y KEEFER, presentados en la tabla 50: TABLA 50 Vinos conservados a - 4 °C durante 2 años Vino Semillon Semillon Riesling Pinot Vino Semillon
Alcohol pH %
H2 T K total mg/L g/L
12,9 12,7 11,9 12,0 11,9. 12,9
1,80 1,95 1,50 1,80 2,10 2,25
3,70 3,66 3,75 3,59 3,35 3,50
899 743 938 821 743 665
HTM/L
K M/L
Pcx 10
0,00783 0,00889 0,00662 0,00781 0,00879 0,01018
0,023 0,019 0,024 0,021 0,019 0,017
1,80 1,69 1,59 1,64 1,67 1,73
4
Psx 104 a – 4 ºC 0,183 0,187 0,205 0,203 0,205 0,183
KHT en exceso M/L 0,00671 0,00729 0,00551 0,00642 0,00707 0,00812
KHT en exceso g/L 1,26 1,37 1,04 1,21 1,33 1,53
En las dos últimas columnas se indica la cantidad de bitartrato potásico en exceso, oportunamente calculada. Los vinos de la tabla presentan valores del pH generalmente elevados, pero tomaremos en consideración también el comportamiento de los vinos a pH bajo. . Como se ve en la tabla después de la permanencia durante dos días a baja temperatura quedan en los vinos cantidades de potasio y de ácido tartárico muy superiores a las que debieran estar presentes. A pesar del enfriamiento sufrido los vinos presentan condiciones de solubilidad que son compatibles con una temperatura de +20° C y no de -4° C. Puesto que al pasar de – 4 °C a + 20 °C el producto de solubilidad del bitartrato aumenta cerca de 5 veces, se podrán multiplicar por 5 los valores presentados en la tabla que hemos elaborado en correspondencia con las distintas graduaciones alcohólicas, con distintos contenidos de ácido tartárico y con distintos pH: se obtendrán de este modo las cantidades respectivas de ácido tartárico y potasio que quedan en solución en el vino a baja temperatura. De cuanto hemos expuesto hay que concluir que en los vinos existen factores que impiden la precipitación del bitartrato potásico con el tratamiento por frío. Muchos autores han estudiado el comportamiento de los vinos ante la refrigeración con el doble objetivo de conocer la entidad de esta resistencia en los distintos vinos a la estabilización y de individualizar los factores que son responsables. DIEMAIR y MAIER han iniciado su investigación conservando en frigorífico a -4° C y en reposo durante períodos prolongados pequeñas cantidades de vino susceptibles de ser enfriados rápidamente y contenidos en matraces de 50 mL. En un vino con contenido inicial en potasio de 800 mg/L. Los autores han encontrado 790 mg/L después de 10 días de refrigeración y 513 mg/L después de 47 días. Es clara la dificultad de precipitación del bitartrato y la permanencia de un estado de sobresatoración que evoluciona sólo con gran lentitud. Otra serie de experimentos de estos autores alemanes se ilustra en el siguiente diagrama que muestra la influencia del frotamiento de las paredes, de la adición del polvo de cuarzo en distintas dosis (0,5 y 0,1 gramos cada 50 mL) con agitación 5 veces al día, de la adición de pequeñas cantidades de bitartrato potásico (10 mg cada 50 mL) con agitación 5 veces al día. Se observa que la precipitación del bitartrato potásico en las muestras a que se refiere el diagrama es continua en el tiempo y el contenido en potasio se reduce de media a 270 mg/l después de 44 días de conservación a – 4 °C. Una vez verificada la marcada tendencia a la sobresaturación de bitartrato potásico de los vinos, se han tratado de individualizar los factores responsables de este comportamiento. DIEMAIR y MAIER han preparado una serie de soluciones hidroalcohólicas saturadas de bitartrato potásicoy conteniendo los diferentes constituyentes de los vinos, les han añadido 0,1 gramos de polvo de cuarzo a cada 50 mL y les han sometido a refrigeración prolongada a – 4 °C, agitándoles diariamente. Han procedido después a la determinación del potasio, considerando estables la soluciones cuando no hay ninguna variación en tres determinaciones sucesivas a 5 días de distancia entre una y otra. Las conclusiones han sido que en solución sintética se tiene una precipitación del bitartrato mucho más rápida que en los vinos y se alcanzan valores del producto de concentración Pc en buena correspondencia con el producto de solubilidad. .
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Los ácidos orgánicos del vino, los ácidos minerales, los cationes distintos del potasio, no parecen ejercer una influencia sensible sobre la precipitación del bitartrato. Un efecto relevante sobre la ralentización de la precipitación, con un contenido final más elevado, ha sido demostrado solamente por las proteínas y, en particular, por la albúmina de huevo.
Fig. 37-b
Así pues, trabajando sobre medio sintético, sólo se ha demostrado la influencia de las proteínas. En este momento se ha pasado a examinar una serie de vinos privados de proteínas, pobres en proteínas (hasta 30 mg/L) y ricos en proteínas (hasta 485 mg/L), sometiéndolos a la habitual refrigeración a – 4 °C con agitación diaria en presencia de polvo de cuarzo. También en este caso se ha considerado ultimada la precipitación cuando en tres análisis sucesivos, distanciados 5 días, no se han observado variaciones de potasio. Las conclusiones de la experiencia han sido las siguientes: l. En los vinos privados o pobres en proteínas la precipitación del bitartrato se inicia generalmente después de 1-4 días y termina después de 25-30 días. 2. En los vinos ricos en proteínas la precipitación se inicia después de 13 días y dura más tiempo. . 3. En algunos vinos se ha observado una contemporánea precipitación de proteínas. 4. Después de 30-50 días los vinos sin proteínas han mostrado valores del producto de concentración Pc hasta 2,14 veces más elevados que el correspondiente valor Ps del producto de solubilidad. 5. Los vinos que contienen proteínas, han mostrado un producto de concentración Pe aún más elevado. 6. El mismo vino sometido a dos tratamientos refrigerantes idénticos puede mostrar notables diferencias de comportamiento: existe una escasa reproducibilidad, típica de los sistemas metaestables. 7. Vinos distintos, con la misma graduación alcohólica, muestran productos de concentración netamente distintos aún cuando no contienen proteínas. Hay que señalar que con la excepción de pocos casos con pH superiores a 3,5, los vinos examinados por DIEMAIR y MAIER presentan valores del pH generalmente inferiores a 3,0, con un mínimo de 2,57. Este hecho es consecuencia de la gran precipitación de bitartrato debido al intenso tratamiento refrigerante: en efecto, en los vinos con pH inferior a 3,5 la precipitación de bitartrato causa un descenso del pH, el cual, al contrario, aumenta con la precipitación en los vinos con pH superior a 3,5. Si se recuerdan los datos comentados de BERG y KEEFER que hacían referencia a vinos con pH elevado se puede concluir que todos los vinos, tanto con pH bajo como con pH alto, quedan fuertemente sobresaturados de cremor cuando se someten a refrigeración. Se puede afirmar que el que no se alcance la estabilización teórica es un hecho providencial para muchos vinos, los cuales, a causa de la disminución del pH producida por la gran precipitación de bitartrato, se harían imbebibles por excesiva acidez real. A este propósito indicaremos los datos obtenidos por nosotros refrigerando a -2° e tres soluciones sintéticas con graduación alcohólica de 10° , 14° y
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18° y presentando antes de la refrigeración respectivamente los pH de 3,10, 3,08 y 3,15: después de la refrigeración los valores del pH se han convertido en 2,71, 2,68 Y 2,63. Hasta este momento hemos aumentado nuestra comprensión del problema de la estabilización en relación con el bitartrato potásico, pero no parece, sin embargo, que hayamos adquirido mucho conocimiento para clarificar y explicar el comportamiento de los vinos. Otras tentativas de contribuir a una explicación del fenómeno no han tenido mucho éxito y no parecen convincentes. Así, PEYNAUD y cols. buscando correlaciones estadísticamente significativas entre el contenido en potasio y otros constituyentes llegan a la conclusión de una influencia solubilizante del ión sulfato. Esta conclusión es muy dudosa incluso sobre los datos presentados que tienen una gran variabilidad. Además la existencia de una correlación no significa una relación causa efecto y, en este caso concreto, a una mayor cantidad de aniones minerales corresponde probablemente una mayor cantidad de cenizas y, por lo tanto, una mayor cantidad inicial de potasio y de calcio, que se encuentran después más abundantes en el vino. PILONE y BERG han atribuido a los antocianos una acción acomplejante sobre el anión bitartrato, que sería sustraído en parte a la precipitación; sin embargo, los datos aportados por ellos son contradictorios y, como consecuencia, esta explicación no parece aceptable.Especial interés presentan las investigaciones de HAUSHOFER y SZEMELlKER sobre el efecto de los ultrasonidos sobre la precipitación del bitartrato potásico. La acción de los ultrasonidos aplicados a un vino mantenido a 0 °C, con una intensidad de 66 Watt/cm2 y para una duración óptima de 10 minutos ha tenido una influencia muy relevante. Las muestras sometidas al tratamiento con ultrasonidos y conservadas a temperaturas comprendidas entre - 4,5 ° y - 50 ºC, han presentado después de 2 ó 3 días una precipitación de bitartrato superior a la ocurrida en las muestras no tratadas después de 28 días. Lo mismo ha ocurrido para soluciones con proteínas, que han alcanzado en 3 días las condiciones que sin tratamiento con ultrasonido s han requerido 21 días.Hay que destacar que los cristales de bitartrato que se obtienen por precipitaciones del vino con la simple refrigeración tienen unas dimensiones medias de 60 x 30 µ, mientras los precipitados de los vinos tratados con ultrasonidos presentan dimensiones de alrededor de 1µ. La importancia de las experiencias citadas no consiste tanto en la posibilidad práctica de una estabilización de los vinos con ultrasonido s (que a decir de los autores encontraría en un futuro inmediato obstáculos económicos insalvables), como en la demostración de la presencia en el vino de un estado físico-químico, cuya estabilización es acelerada por una íntima e intensa agitación interna, causada precisamente por la acción de los ultrasonidos. Un tratamiento físico que no modifica la naturaleza ni el número de moléculas presentes en solución, pero que facilita el encuentro de los dos iones que deben combinarse, lleva rápidamente a la rotura del equilibrio de sobresaturación. La grandísima diferencia en las dimensiones de los cristales de los vinos tratados y no tratados da una idea del enorme aumento del número de «gérmenes» cristalinos provocado por el tratamiento y convalida la hipótesis de que la resistencia de los vinos a la precipitación por frío es consecuencia de la dificultad de formación de los «gérmenes» cristalinos en el seno de la masa. Recientemente MÜLLER-SPAETH ha obtenido una rápida estabilización del bitartrato por medio de la adición al vino de cantidades masivas de cremor (más de 4 g/L) que es continuamente recuperado. En toda la exposición precedente se echa en falta la indicación de las causas precisas que determinan la resistencia de los vinos a la precipitación del bitartrato. A nuestro juicio estas causas están aún por aclarar. Si se reflexiona en que la adición de unas pocas centenas de rniligramos por litro de ácido metatartárico (un polímero obtenido del ácido tartárico por deshidratación a temperatura elevada) o de polifosfato son suficientes para ejercer una fuerte inhibición sobre las precipitaciones tartáricas, no parece absurda ni improbable la hipótesis de la existencia en el vino de substancias naturales de estructura y comportamiento análogos, aún por identificar.
La difícil individualización de las substancias que impiden la precipitación del cremor El vino es una solución fuertemente sobre saturada de bitartrato potásico y ello asegura a la bebida un pH aceptable después de la refrigeración. En efecto, si se alcanzaran las condiciones de saturación físico-química, el pH del vino descendería a valores excesivamente bajos.
197
Cálculo de la cantidad de bitartrato potásico en exceso en un vino a una temperatura determinada En el pasado habíamos sugerido explicar la fórmula: HT - - x ⋅ K + - x =L M
(
)
Donde los símbolos entre corchetes indican las concentraciones en mmoles/L de la especie considerada y LM es el producto de solubilidad del bitartrato a una determinada temperatura y fuerza iónica. La fórmula no tiene en cuenta el desplazamiento del equilibrio como consecuencia de la precipitación y ha sido justamente criticada, sin que se haya presentado solución al problema. Recurrimos a publicaciones precedentes para el cálculo del pK1 y pK2 del ácido tartártico y del producto de solubilidad LM a - 4 °C, con fuerza iónica 0,046 y con 10° de alcohol. Los parámetros a emplear son: C = Acido tartárico total mmoles/L K+ = meq/L pH Acidez total = 100 meq/L Alc. cenizas = 25 meq/L 100 ⋅ 25 H = 2,303 ⋅ = 46,06 meq/L 125 x = KHT en exceso LM = producto de solubilidad a - 4 °C = 46,5756 1.ª aproximación Se supone que el pH del mismo no varía. HT - pH = pK1 + Log [ H 2T ] + HT - + T 2- = C - x H T [ ] 2
T 2- pH = pK 2 + Log - HT 10
(pH - pK1 )
10
(pH - pK 2 )
HT - = [ H 2T ] T 2- = HT -
(
)
HT - K + - x = L M HT - [ H 2T ] = 10 ⋅ (pH - pK1 ) (pH - pK 2 ) 2⋅ HT - T = 10
HT - + HT - + 10(pH - pK 2 ) ⋅ HT - = C - x (pH - pK1 ) 10 LM HT - = K + - x 1 (pH - pK 2 ) (pH - pK1 ) + 1 + 10 HT = C - x 10 C-x HT = 1 + 1 + 10(pH - pK 2 ) (pH - pK1 ) 10 LM HT = + K - x LM = K + - x
C-x 1 10
(pH - pK1 )
+ 1 + 10(pH - pK 2 )
(
)
1 L M (pH - pK1 ) + 1 + 10(pH - pK 2 ) = ( C - x ) K + - x 10 1 x 2 - C + K + x + C K + - L M (pH - pK1 ) + 1 + 10(pH - pK 2 ) = 0 10
(
198
)
Si se aplica la fórmula con los datos indicados al principio se obtiene x = 10,61 2.ª a aproximación Una precipitación de 10,61 meq/L equivale a una acidificación con un ácido mineral. Si se tiene presente el poder tampón de 46,06 meqll, se podrá prever una disminución del pH de 0,23 y, por tanto, un pH de 2,97. Si se aplica la fórmula con el nuevo valor del pH se obtiene: x = 9,36 La variación no es muy importante. Caracterización del estado de sobresaturación Para caracterizar el estado de sobresaturación en cremar se puede recurrir a la «temperatura de saturación» de un vino, la cual se calcula a partir de una serie de parámetros. La graduación alcohólica permite el cálculo de las constantes de disociación mixtas de ácido tartárico; la fuerza iónica aproximada (obtenida por la diferencia en meq/L entre la acidez cambiable y sobre resina catiónica en forma libre y la acidez titulable) permite pasar a valores termodinámicos; finalmente, es posible el cálculo de la cantidad de ión bitartrato que, multiplicada por la cantidad de potasio, da el producto de solubilidad, al que corresponde de manera biunívoca una temperatura de saturación determinada: se ha puesto a punto un programa que, a partir de los valores del alcohol, del pH, de la acidez cambiable, de la acidez total, del ácido tartárico y del potasio, da inmediatamente la temperatura de saturación del vino. Un vino conservado a 20 ºC puede presentar una temperatura de saturación de 25 ºC y estar sobresaturado incluso a temperatura ambiente. Para comprobar la resistencia a la precipitación del cremor se le añaden al vino 4 g/L de bitartrato potásico micronizado y se somete a refrigeración a - 2 ºC durante 10 días. Es evidente que cuanto mayor sea la resistencia a la precipitación del cremar más alta será la temperatura de saturación después de la refrigeración. Interviniendo con tratamientos sobre el vino y determinando la temperatura de saturación después de la refrigeración se podrá verificar si los tratamientos han influido o no sobre las substancias que obstaculizan la precipitación del crémor. En un trabajo anterior (1992) habíamos verificado que: a) Todos los vinos están sobresaturados en crémor. b) El envejecimiento no influye sobre el estado de sobresaturación. c) Generalmente, los vinos tintos están más sobresaturados que los vinos blancos. d) Los polifenoles, sin embargo, no tienen ninguna influencia sobre el estado de sobresaturación del crémor. Estas conclusiones están justificadas en las siguientes tablas (Tab. 51-55). En efecto, sometiendo los vinos blancos y tintos al test H resulta una diferencia altamente significativa (H = 157,54). Además, aplicando el test de Kendall a la búsqueda de una correlación entre la temperatura de saturación después de la refrigeración y los polifenoles totales, la correlación resulta significativa para una probabilidad comprendida entre el 90 y el 95%. Si los vinos tintos se distribuyen en tres grupos (de 1 a 5 años; de 6 a 25 años; de 26 a 51 años) y se procede al test H, no aparece ninguna diferencia significativa (H = 2,3991). La afirmación de que los polifenoles no tienen influencia deriva de la comparación entre una serie de vinos tintos con los mismos vinos tratados con 10 g/L de carbón decolorante, que ha eliminado del 62% al 87% de los polifenoles totales. Los datos se recogen en la tabla 53 donde parece evidente la falta de influencia de los polifenoles. En el intento de individualizar las substancias que obstaculizan la precipitación del crémor en los vinos, hemos preparado otras dos pruebas. A 100 mL de vino se han añadido 5 volúmenes de alcohol de 95° para precipitar los coloides: El líquido privado de coloides ha sido des alcoholizado bajo vacío, se le ha añadido el alcohol inicialmente presente y llevado al volumen de 100 mL. Los coloides separados de cada vino se han añadido a 100 mI del mismo vino. Previa adición de 4 g/L de bitartrato potásico micronizado se han sometido a refrigeración a -2 ° C durante 10 días el vino tal cual, el vino al que se le han añadido coloides y el vino privado de coloides.
199
Los resultados aparecen en la tabla 54. En dicha tabla, es evidente que los coloide s precipitables con alcohol no ejercen una influencia sensible: ni su adición al vino aumenta la resistenCia a la precipitación ni su eliminación cambia sustancialmente el estado de sobresaturación del crémor. Sólo en dos casos (Chardonay 87 y Barolo 87) se observa una cierta influencia, más importante para el Barolo, en el sentido de que la adición de coloide s aumenta la temperatura de saturación y su eliminación la baja, sin embargo, no se han individualizado las sustancias responsables. Se ha preparado una segunda prueba para comprobar si las sustancias inhibidoras son de naturaleza ácida. El vino se ha pasado por una resina aniónica Ambelite IRA 400, vuelto a llenar con ácido tartárico al pH inicial y sometido a refrigeración a - 2 °C durante 10 días previa adición de 4 g/L de bitartrato micronizado. Los resultados se presentan en la tabla 55. Los datos de dicha tabla demuestran que las diferencias entre las temperaturas de saturación después de la refrigeración no permiten concluir que sean substancias de naturaleza ácida las inhibidoras de la precipitación del crémor.
TABLA 51
200
80 72,9 96 82 66 116 114 104 78,9 102 85,8 86,8 106,8 79,8 96 142,6 90 102,8 90 100,9 90 74 92 80,9 80,9 118,9 90 90 90,9 98,9 84 78 82,9 62 66 80
3,43 3,25 3,49 3,22 2,28 1,82 3,46 1,87 2,63 2,70 2,44 2,85 3,33 3,55 2,16 2,11 2,88 3,03 2,52 2,85 1,85 1,53 1,32 2,47 1,87 1,91 2,22 2,43 2,19 2,78 2,04 2,14 1,86 1,22 1,82 1 61
325 466 445 638 418 542 415 612 490 592 735 673 448 686 680 674 571 556 758 820 717 385 490 754 517 575 649 375 733 644 458 450 643 1.254 356 356
13,56 21,63 18,64 25,19 14,57 10,25 12,36 14,94 12,01 13,93 22,27 23,69 15,79 29,50 16,07 15,68 17,41 16,75 15,06 18,78 10,41 6,08 7,02 16,87 9,89 13,04 17,34 6,88 20,44 19,16 12,98 12,93 13,70 21,35 7,62 866
78,9 68,4 91,8 78,3 63,5 113,2 110,1 97,2 74,1 95,5 79,4 82,1 101,6 71,7 87,6 135,4 83,1 96,4 82,2 91,7 83,2 71,1 87,9 68;1 74,8 113,5 83,2 87,6 71,9 90,7 78 73,8 77,3 58,8 63 753
99,1 81,4 107,6 98,5 87,4 144,5 122,5 100,4 80,9 115,8 93,7 97,2 112,6 87,6 99,9 140,0 103,9 106,7 105,4 119,6 119,3 82,8 106,4 98 90,3 130,8 124,4 120,5 60,4 107,7 93,1 96 125,6 101,3 82,8 853
2,95 3,18 3,00 3,23 3,07 3,02 2,85 3,03 2,90 2,99 3,39 3,30 2,94 3,18 3,09 3,01 3,04 3,07 3,03 3,05 3,22 2,97 3,03 2,98 2,86 3,03 3,22 2,87 3,16 3,03 3,07 3,05 3,24 3,71 3,04 312
3,27 2,57 2,86 2,67 1,91 1,40 2,88 0,85 2,90 1,72 1,47 2,15 2,55 2,34 0,89 1,03 1,85 2,07 1,35 1,46 0,82 1,10 0,71 0,55 0,96 1,11 1,21 2,06 0,83 1,54 1,13 1,52 1,02 0,73 1,36 092
284 290 280 495 321 434 264 346 301 338 483 490 244 370 350 393 303 307 454 460 450 271 330 254 278 365 384 280 381 322 222 287 424 1.128 238 174
8,01 10,02 7,80 16,31 6,18 4,20 3,79 -2,39 2,33 1,31 9,39 13,74 4,57 12,88 -1,23 0,78 4,08 7,09 -0,01 1,61 -2,03 -2,50 -0,77 2,31 0,29 1,03 3,80 1,46 1,40 3,20 -2,08 2,73 2,86 13,37 -1,32 025
KHT en exceso mg/L
Ts ºC
Potasio mg/L
Ac. tart. g/L
pH
Ac. camb. meq/L
Ac. tot. meq/L
Ts ºC
3,23 3,48 3,25 3,48 3,47 3,12 2,98 3,26 3,00 3,12 3,67 3,53 3,08 3,34 3,15 3,15 3,17 3,21 3,21 3,29 3,24 3,11 3,14 3,03 3,06 3,18 3,36 2,93 3,30 3,18 3,26 3,25 3,27 3,78 3,19 331
A – 2 ºC durante 10 días + 4 g/L KHT micronizado
Potasio mg/L
101,2 90,4 116 105,8 92,4 150 130,2 114 90,6 128,8 106,6 106,6 123,0 103,8 116,8 154,4 117,6 119,4 121 138 133 88,6 114,6 123,6 102,5 141,5 137,9 125,4 107,4 124,2 105,2 104,3 136,8 107,8 88,8 946
Ac. tart. g/L
pH
11,23 12,25 11,66 11,74 12,21 11,15 10,14 11,11 10,45 9,04 10,40 10,99 11,49 13,72 11,27 10,73 11,23 9,37 7,22 7,51 7,30 11,57 11,66 11,66 11,23 11,49 11,61 11,11 12,08 11,49 12,33 12,29 11,41 12,60 11,74 1242
Ac. camb. meq/L
Riesling-1 Chardonnay-1 Riesling-2 Chardonnay-2 Cortese-2 Riesling-3 Riesling-3 Cortese-3 Cortese-4 Cortese-4 Chardonnay-4 Chardonnay-4 Chardonnay-4 Chardonnay-4 Riesling-5 Riesling-5 Chardonnay-5 Cortese-5 Asti Spumante-17 Asti Spumante-18 Asti Spumante-21 Mousseux-21 Mousseux-21 Riesling-22 Riesling-22 Riesling-23 Cortese-23 Riesling-25 Cortese-25 Cortese-26 Mousseux-27 Mousseux-27 Riesling-27 Muscat-27 Mousseux-31 Mousseux-44
Ac. tot. meq/L
Vino-Edad
Alcohol % vol.
A temperatura ambiente
284 632 499 1.108 383 245 260 162 130 572 904 288 791 14 74 265 484 71 148 90 235 130 91 202 179 179 450 14 -
TABLA 52
pH
Ac. tart. g/L
Potasio mg/L
Ts ºC
Ac. tot. meq/L
Ac. camb. meq/L
pH
Ac. tart. g/L
Potasio mg/L
Ts ºC
141,8 121,6 128,2 133,6 114,4 117 133,6 158 126 136 128 121 107,6 145,2 107,4 119,6 112 119,6 115,2 106,4 145,4 153,8 114 108,8 129,4 112 114,2 132,9 122,2 160 125,5 165,6 137,5 108,8 109 111,2 115 114 133 110,6 124,2 115 104
3,40 3,68 3,28 3,39 3,74 3,54 3,56 3,13 3,58 3,26 3,38 3,30 3,75 3,42 3,69 3,44 3,73 3,26 3,24 3,49 3,13 3,06 3,32 3,51 3,44 3,36 3,32 3,39 3,43 3,06 3,30 3,25 3,41 3,50 3,36 3,51 3,49 3,44 3,28 3,62 3,55 3,45 3,41
3,67 4,05 3,19 2,28 3,90 2,29 4,27 1,96 1,38 1,94 1,36 2,06 3,97 3,44 3,41 2,89 1,95 2,11 3,15 2,40 3,49 2,81 2,62 1,59 1,42 1,50 1,30 2,62 1,32 3,56 1,51 1,56 1,31 3,75 1,44 1,45 1,24 1,87 1,69 1,22 1,41 1,87 1,97
978 973 673 827 1.040 843 840 742 1.086 855 936 770 996 634 775 768 879 813 833 882 764 880 761 780 812 755 802 1.046 978 807 942 940 770 672 722 675 754 788 786 798 820 794 668
33,4 39,5 23,6 22,6 40,1 25,1 36,8 16,7 21,0 19,4 16,2 18,9 43,4 26,6 30,6 24,9 24,1 19,8 25,8 26,6 24,4 20,5 23,1 19,7 17,0 17,6 13,0 30,0 18,3 25,5 17,8 16,4 12,1 30,3 15,3 14,7 15,3 19,6 17,7 17,2 18,0 21,7 19,6
74 82,9 90 75,4 88,3 78,5 78,5 126,2 80,5 98,1 81,2 96 64,4 106,2 71,1 83 77,4 75,4 76,6 74,6 96,9 105,9 69,6 68,4 75,1 75,8 76,5 85 81,2 118,4 72,8 108,3 89,5 82,8 73 68,8 75,2 72,1 79,2 65,4 78,9 80,3 70,4
117,9 111,4 116,3 116,9 102,9 103,4 122,6 146,4 115 124,2 114,3 107,1 96,3 131,1 93,7 97,3 102,8 98,5 96,3 99,6 127,2 137,4 101,2 97,6 119,1 101,8 99,2 119,2 108,6 148,9 107,2 146,3 132,6 96,6 97,2 108,8 101,5 100,2 115,4 99,6 120,3 107,6 102,8
3,21 3,40 2,99 3,16 3,51 3,26 3,42 3,03 3,45 3,15 3,20 3,11 3,53 2,90 3,26 2,92 3,32 3,05 3,14 3,46 3,04 2,95 3,16 3,46 3,42 3,28 3,23 3,25 3,36 2,98 3,10 3,12 3,35 3,37 3,35 3,52 3,38 3,25 3,21 3,60 3,49 3,43 3,42
1,88 3,29 2,29 1,03 3,04 1,27 3,44 1,09 0,55 1,05 0,33 1,58 3,13 2,38 2,38 1,25 1,26 0,52 1,73 1,89 2,12 1,58 1,66 0,76 0,64 0,73 0,17 1,60 0,30 2,73 0,14 0,11 0,943 2,84 0,56 1,27 0,23 0,834 0,37 0,40 1,11 1,32 1,88
511 774 440 501 816 578 625 515 870 624 669 498 776 359 487 341 699 400 464 749 408 560 511 562 556 556 509 778 712 590 585 562 674 434 492 629 490 518 442 584 743 650 644
11,7 28,7 10,0 5,28 29,3 10,3 26,0 5,21 7,06 7,44 -1,76 8,66 31,87 7,74 15,30 -0,58 12,89 -0,25 9,24 20,21 8,91 6,73 10,43 7,23 4,48 5,90 2,93 16,36 -1,93 15,82 2,92 3,68 6,73 18,1 1,56 12,43 0,86 4,40 -0,53 2,30 13,58 14,45 18,55
Polifenoles mg/L
Ac. camb. meq/L
86 88 96 83,7 94 85,3 84 132 86 104 88 103 70 113,2 78 93,9 82 86 86 78 106 114,1 76 74 80,3 80,9 84 91,9 88 124 81,9 117,9 91,9 88,9 78,9 70 82 79 88 70,9 80,9 84 71
KHT en exceso mg/L
Ac. tot. meq/L
12,25 12,37 12,08 12,60 11,45 12,51 13,07 12,42 12,60 12,00 11,66 11,03 14,26 12,82 12,15 11,03 12,55 12,00 11,53 12,51 12,08 10,86 12,42 13,77 13,37 14,00 11,07 12,95 12,65 11,61 12,51 11,61 10,51 12,33 12,82 12,51 13,29 12,17 13,45 14,22 13,41 13,54 13,59
Vino.Edad
Barbera-1 Freisa-1 Grignolino-I Barbera-2 Freisa-2 Grignolino-2 Nebbio10-2 Barbera-3 Freisa-3 Grignolino-3 Doleetto-3 GrignolinoA BaroloA Barbera-4 Nebbiolo-4 Doleetto-4 Preisa-4 GrignolinoA Nebbiolo-5 Merlot-5 Barbera-5 Grignolino-5 Dolcetto-5 Barbaresei-l1 Barbareseo-11 Barbareseo-l1 Nebbiolo-13 Nebbiolo-13 Nebbiolo-13 Barbera-13 Gattinara-17 Barbera-22 Nebbiolo-24 Barolo-25 Montep.-31 Chianti-34 Barolo-34 Gattinara-36 Baro10-44 Baro10-46 Barolo-46 Baro10A8 Chianti-51
A – 2 °C durante 10 días + 4 g/L KHT micronizado
Alcohol % vol.
A temperatura ambiente
732 2.000 612 263 1.996 519 1.907 237 230 332 473 2.093 463 1.010 35 613 544 1.151 555 359 593 307 193 235 805 942 334 1.227 85 670 208 94 624 717 1.073
1.335 1.734 921 1.455 1.764 1.171 1.570 1.380 2.330 1.410 1.700 1.610 2.112 1.265 1.873 1.902 2.995 1.701 2.100 1.611 1.063 1.884 1.854 569 571 600 880 1.324 1.285 848 938 798 1.988 630 558 964 526 517 317 162 695 257 309
TABLA 53 Refrigeración a -20 ºC durante 10 días + 4 g/L de bitartrato potásico micronizado
Barajo 4 Freisa 2 Freisa 1 Merlo! 5 Barbera 1 Do1cetto 5 Grignolino 1
14,26 11,45 12,37 12,51 12,25 12,42 12,08
64,4 88,3 82,9 74,6 74,0 69,6 90,0
96,3 102,9 111,4 99,6 117,9 101,2 116,3
3,53 3,51 3,40 3,46 3,21 3,16 2,99
3,13 3,04 3,29 1,89 1,88 1,66 2,29
776 816 774 749 511 511 440
2.112 1.764 1.734 1.611 1.335 1.854 921
31,9 29,3 28,7 20,2 11,7 10,4 10,0
62,6 87,9 80,7 74,6 71,8 69,1 90,2
92,7 102,1 107,1 99,6 114,4 100,1 116,7
3,62 3,58 3,50 3,46 3,24 3,26 3,11
2,86 2,98 2,97 1,89 1,55 1,58 2,32
705 801 690 749 426 490 448
715 666 637 398 369 575 122
Ts ºC
Polifenoles mg/L
Potasio mg/L
Ac. tart. g/L
pH
Ac. camb. meq/L
Ac. tot. meq/L
Polifenoles mg/L
Ts ºC
Potasio mg/L
Ac. tart. g/L
Tratados con carbón decolorante 10 g/L
pH
Ac. camb. meq/L
Ac. tot. meq/L
Vino-edad
Alcohol % vol.
Testigos
29,1 29,2 26,0 20,2 8,1 10,5 11,9
201
TABLA 54 Vino-edad Barolo Riesling 89 Riesling 88 Chardonnay 87 Chardonnay 86 Dü1cetto 91 Barbera Grignolino 88 Barol0 87
Vino Cortese 91 Chardonnay 92 Riesling 92 Barbera 92 Grignolino 92 Do1cetto 92 Nebbiolo 92 Merlot 92
Vino tal cual TS 7,80 19,84 7,29 11,07 8,86 14,39 12,57 12,44 14,26
Vino + coloide Ts 6,21 21,37 680 12,57 9,37 14,60 14,21 6,68 21,08
TABLA 55 Testimonio Ts °C a - 2° 7,80 8,77 9,00 4,87 6,61 5,05 9,37 15,55
Vino sin coloide Ts 8,82 18,00 9,63 8,89 7,37 13,68 10,97 2,10 10,47
Tartrato Ts ºC a - 2° 6,57 9,24 6,81 6,08 10,12 13,20 3,16 10,61
Precipitaciones de tartrato de calcio El tartrato neutro de calcio o, mejor, el tartrato neutro de calcio con 4 moléculas de agua de cristalización. O HO
C C
H
Ca
C
HO H
O
C
O
: 4 H2O
O
es una de las sales menos solubles del ácido tartárico por lo que es previsible su precipitación en los vinos. También en este caso, para hacernos idea de la situación, podemos referirnos al producto de solubilidad en soluciones hidroalcohólicas, que viene representado por el producto de la concentración molar de los iones tartrato por la de los iones calcio: T 2- Ca 2+ = Ps Sabemos calcular la concentración del ión tartrato luego, conocida la concentración del calcio en la solución saturada, es fácil obtener el valor del producto de solubilidad. BERG y KEEFER han determinado el producto de solubilidad del tartrato de calcio para graduaciones alcohólicas y temperaturas distintas. Se tienen, pues, los elementos para afrontar el problema de las precipitaciones de tartrato de calcio en los mismos términos que las del bitartrato potásico. Hay que destacar que las concentraciones del ión tartrato a los pH del vino son más pequeñas que las del ión bitartrato (cerca de 14 veces a pH 3,0 y cerca de 5 veces a pH 3,5 con un contenido de alcohol del 10%) y las concentraciones naturales del calcio mucho más pequeñas que las del potasio (cerca de 10 veces inferiores), sin embargo, el producto de solubilidad del tartrato de calcio es, para las distintas temperaturas, cerca de 100 veces menor que el del bitartrato potásico. Existen, pues, en los vinos las condiciones físico-químicas objetivas para
202
una precipitación del tartrato de calcio. Sin embargo, también en este caso, como en el del bitartrato potásico, los datos analíticos de los vinos demuestran que la cantidad de calcio presente en solución es muy superior a la permitida por el producto de solubilidad: la sobresaturación es aún más acentuada que para el bitartrato potásico. Un ejemplo concreto se muestra en los valores de la tabla 56 con los datos de BERG y KEEFER: TABLA 56 Vinos conservados a - 4 °C durante 2 días Vino Sauteme Chianti tinto Sherry Cream sherry Porto bianco Moscatello Porto
Alcohol H2 T total Ca pH % g/L mg/L 11,8 12,0 19,7 19,6 19,5 19,5 19,6
3,45 3,75 3,45 3,50 3,65 3,80 3,85
1,52 1,47 1,13 1,21 1,34 1,38 1,10
76 92 84 68 56 60 76
T2M/L 0,00105 0,00209 0,00054 0,00068 0,00109 0,00161 0,00142
Psx l08 Psx l08 a 20° C a - 4ºC 107,0 14,0 35,6 36,1 36,6 36,6 36,1
24,7 24,0 7,4 7,6 7,7 7,7 7,6
Ca previsto a 20 ºC mg/L 41 20 26 21 13 9 10
Ca previsto 3 – 4 °C mg/L 9,4 4,6 5,5 4,5 2,8 1,9 2,1
A 20° C se encuentran cantidades de calcio de 2 a 7 veces superiores a las compatibles con la solubilidad del tartrato en estas condiciones; las cantidades se hacen de 9 a 33 veces mayores si se refieren a los compatibles con la solubilidad a – 4 °C, temperatura a la que han sido conservados los vinos durante 2 días. El problema de la estabilización para el tartrato de calcio se complica por la extrema lentitud con que se manifiestan las precipitaciones en los vinos y por la menor influencia de la temperatura sobre la solubilidad. DE SOTO Y cols. han observado que una permanencia de 90 días ha sido necesaria para que, a una temperatura definida, se alcanzase un equilibrio aparente, a pesar de la adición de «gérmenes» cristalinos para facilitar la precipitación. Se debe concluir, pues, que los vinos están siempre fuertemente sobresaturados de tartrato de calcio a cualquier temperatura y que la refrigeración es escasamente eficaz en cuanto a una estabilización. Si los vinos están fuertemente sobre saturados, el calcio, afortunadamente, precipita con notable dificultad, al menos mientras su contenido no alcanza límites excesivos. Es oportuno examinar los valores que se encuentran normalmente en vinos estables, aunque sabemos que superan con mucho aquellos permitidos por las condiciones físico-químicas. Un interés particular presenta el conocimiento de la cantidad de calcio que puede provenir del mosto y de los materiales empleados en el curso de la producción de los vinos. Según KLENK y MAURER los mostos contienen naturalmente de 70 a 140 mg/L de calcio; en general se encuentran valores inferiores a 100 mg/L y normalmente comprendidos entre 70 y 90 mg/L. Una cierta cantidad de calcio pueder ser añadida al vino como consecuencia de algún tratamiento y operaciones de bodega, 100 g/hL de bentonita pueden ceder de 3 a 20 mg/L de calcio según el tipo y las prefiltraciones con harina fósil, las filtraciones clarificantes y las esterilizantes pueden dar cada una un aporte de calcio de 2 a 4 mg/L. Despreciando la cantidad de calcio que puede ser cedida por los depósitos de cemento es necesario recordar que el carbonato de calcio se usa frecuentemente como desacidificante. En la desacidificación con CaCO3 la cantidad de calcio que queda en el vino se estabiliza en una decena de días en torno a 250 mg/L si quedan aún 0,2 - 0,5 g/L tartárico en el vino; en torno a 200 mg/L si queda aún 1,0 g/L de ácido tartárico; en torno a 150 mg/L si queda aún 1,5 - 2,0 g/L de ácido tartárico. Si se quiere que en el vino quede al menos 1,0 g/L de ácido tartárico hay que tener presente que una cantidad de 120-150 mg/L de calcio después del tratamiento disminuirá hasta 80 mg/L y esto supondrá una posterior disminución de 0,15 - 0,30 g/L de ácido tartárico: hay que añadir, pues, carbonato de calcio de manera que quede, después de la adición, al menos 1,5 g/L de ácido tartárico en el vino. KLENK y MAURER han ilustrado la influencia del pH y de la refrigeración sobre la precipitación del calcio con los diagramas siguientes:
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Cristales de cremor tártaro
Fig. 38 En el primer diagrama las cruces indican los vinos que contienen cristales de tartrato de calcio y parece evidente que las precipitaciones son menos frecuentes por debajo del pH 3,5. Del otro diagrama resulta claramente el escaso efecto de la refrigeración que en 20 días a la temperatura de 30 e ha provocado la precipitación de sólo 20 mg/L de calcio. Por el contrario, la adición de tartrato de calcio finamente pulverizado al vino sometido a refrigeración ejerce una influencia importante: se produce una neta aceleración de las precipitaciones y en pocos días se alcanzan contenidos en calcio tales que justifican la utilidad de una refrigeración en estas condiciones. El efecto estabilizante es ya neto con la adición de 100 mg/L de tartrato de calcio y mucho más evidente con la adición de 500 mg/L. Naturalmente, de la forma indicada se obtiene .una estabilización real, pero que dista mucho de las condiciones del verdadero equilibrio físico-químico.
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Según MAIXNER el problema de las precipitaciones de tartrato podría resolverse añadiendo al vino un exceso de D( -) tartrato de calcio tetrahidratado, el cual combinándose molécula a molécula con el L( +) tartrato de calcio natural en sobresaturación, determina la precipitación del calcio del vino bajo forma de racemato, mucho más insoluble aún que la forma dextro y levo. El autor afirma que la precipitación sucede como consecuencia de la adición de un producto insoluble y, así, el vino no se satura de racemato.
Fig.39
A nosotros nos parece que no se puede olvidar la antigua enseñanza «corpora non reagentur nisi soluta» y que, por tanto, parece improbable que el vino no se sature de racemato. Como con este tratamiento es posible eliminar sólo una parte del calcio, el vino quedará aún sobresaturado de tartrato de calcio y saturado (o quiza incluso sobresaturado) de racemato de calcio, el cual podría precipitar al cambiar las condiciones del medio: más que resolver el problema de la solubilidad del tartrato lo que hacemos es desviarlo hacia el de la solubilidad del racemato y hay que ser muy prudentes antes de adoptar una solución así. Las tentativas para explicar la permanencia en los vinos de cantidades de calcio incompatibles con sus condiciones físico-químicas no han tenido más éxito que las relativas al bitartrato potásico. También en este caso hay que atribuir la falta de consecución del equilibrio a la acción de substancias no identificadas que obstaculizan probablemente la formación de los «gérmenes» cristalinos. El empleo de resinas catiónicas permite una estabilización en relación al calcio incluso con cambios de modesta entidad. El calcio es el primero de los cationes del vino en ser cambiado, seguido del magnesio y por último del potasio. Para los vinos que requieren una acidificación un cambio oportuno con resina catiónica libre podría resolver el problema, estabilizando el vino en lo que respecta al calcio. Precipitaciones de sal de calcio del ácido múcico En relación con las precipitaciones del calcio, KIELHOFERY WÜRDING han demostrado que no todas las precipitaciones cristalinas de calcio consisten en tartrato, sino que se encuentra en algún caso, especialmente en vinos viejos, la presencia de sal de calcio del ácido múcico, hasta entonces no encontrado en el vino. La sal tiene la fórmula C6H8O8Ca. 4H2O. El ácido múcico es un ácido diácido con 6 átomos de carbono que se forma ya en la uva por oxidación enzimática del ácido galacturónico proveniente de la pectina, presumiblemente bajo la acción de Botrytis cinerea. KIELHOFER y WÜRDING han encontrado en el precipitado de un vino 242 mg/L de ácido múcico y otros 245 mg/L en solución, es decir, un contenido total en ácido múcico de cerca de 0,5 g/L. Es probable, entonces, que estén sujetos a precipitaciones de sal de calcio del ácido múcico los vinos procedentes de uvas que han sufrido la «podredumbre noble» o «Edelfaule».
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CAPITULO DECIMOOCTAVO
El estado coloidal Dimensiones y características de las partículas coloidales Cuando se habla de soluciones hacemos referencia a un solvente líquido y a un soluto que puede ser sólido, líquido o gaseoso como el ácido tartárico, la glicerina o el oxígeno. En el caso de los vinos estamos habituados a considerar solvente la mezcla hidroalcohólica que los constituye y solutos las otras substancias, precisamente «disueltas» en la mezcla hidroalcohólica con esa determinada graduación. La mezcla hidroalcohólica es, ella misma, una verdadera solución de alcohol en agua, considerado en este caso como solvente la substancia presente en mayor cantidad, aunque el alcohol y el agua son miscibles en todas las proporciones. En cuanto a las substancias disueltas, en el caso del vino, se encuentran en su inmensa mayoría, tanto en número como en cantidad, en solución verdadera, entendiendo por solución verdadera aquella en la que una substancia se dispersa en el solvente hasta alcanzar sus dimensiones moleculares: se tienen moléculas de substancia disuelta que se mueven en el seno de las moléculas del solvente. Una solución verdadera es, pues, un medio homogéneo en el que muchos constituyentes forman una única fase y donde no es posible distinguir entre las partes sin descender a las dimensiones moleculares. Sin embargo, se pueden dispersar en un líquido substancias sólidas finamente subdivididas con dimensiones enormemente más elevadas que las moleculares; obtendremos una suspensión turbia, de la que se separan depositándose en el fondo las partículas en suspensión, tanto menos rápidamente cuanto menores son las dimensiones de las partículas. Disminuimos ahora las dimensiones de las partículas por debajo de las observables al microscopio, es decir, por debajo de 100 nanómetros, teniendo el prefijo nano el significado de 10-9 (1 nanómetro = 10-9 metros = 10-6 milímetros). Con particulas tan pequeñas, no observables al microscopio y cuyas dimensiones se miden con la misma unidad de medida empleada para la longitud de onda de la luz, podremos observar dispersiones que se presentan límpidas, sólo con una ligera opalescencia si se ilumina con luz transversal, y que quedan así durante mucho tiempo sin formar depósitos o precipitados. Estas dispersiones tienen el aspecto exterior de las soluciones verdaderas, pero con una profunda diferencia en las dimensiones de las partículas en suspensión que tienen dimensiones comprendidas entre 2 y 100 nm, y consisten en aglomerados de átomos en número variable entre 103 y 109, mientras en las soluciones verdaderas las dimensiones de las partículas son inferiores a 2 nm con un número de átomos inferior al millar. La estabilidad de una suspensión depende innegablemente de las dimensiones de las partículas suspendidas, aunque no exclusivamente: una dispersión estable con partículas de tamaño comprendido entre los límites expuestos constituye una solución coloidal. Definidas las relaciones entre solvente y soluto en función de las dimensiones de las partículas dispersas, parece evidente que más que de substancias coloidales o coloides se debe hablar de «estado coloidal» de la materia. En efecto, culquier substancia es susceptible de ser dispersada coloidalmente, si con medios oportunos se puede subdividir en partículas suficientemente pequeñas. En líneas generales las relaciones posibles entre un solvente y un soluto pasan desde una solución verdadera hasta una suspensión grosera, a través de todos los estados intermedios y sin solución de continuidad. Macromoléculas, coloides liófilos y liófobos Siendo posible obtener una solución coloidal con cualquier substancia insoluble en un determinado solvente, existen substancias para las que no es posible otra forma de solución distinta a la coloidal porque sus dimensiones moleculares son tales que entran en el ámbito de las partículas coloidalmente dispersas: se trata de substancias constituidas por «macromoléculas» a las que les corresponde el nombre de coloides, ya que su comportamiento depende de su naturaleza. Para este último tipo de coloides no es la naturaleza química sino las dimensiones moleculares las que constituyen un obstáculo para la solubilidad; se trata generalmente de polímeros de moléculas polares como, por ejemplo, los polisacáridos, polímeros de azúcares muy solubles en el estado monómero.
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Estos coloides, a diferencia de las «dispersiones microcristalinas» para las que no hay ninguna afinidad entre el solvente y las partículas dispersas, son coloides «liófilos», presentan una marcada afinidad con el solvente en el que las partículas se «solvatan», es decir, se rodean de moléculas de solvente estableciéndose atracciones de tipo electrostático, especialmente en un solvente polar como el agua. Los coloides liófilos puestos en contacto con el solvente, a diferencia de lo que ocurre con los «liófobos», lo absorben hinchándose y pueden dar lugar a un/estado denominado «gel» en el cual el líquido aparece completamente absorbido, dando origen a un producto de aspecto sólido, elástico y gelatinoso, bien representado precisamente por la gelatina, obtenida añadiendo la homónima substancia obtenida del colágeno de los huesos a una solución acuosa, o de substratos sólidos agarizados o de la gelatina de la fruta obtenida por medio de la adición de pectinas. Con una posterior cantidad de solvente se pasa del estado de «gel» al estado de «sol», es decir, a una solución coloidal. Con la eliminación del solvente se puede obtener el proceso inverso con pasos intermedios a través del estado de gel. El gel no es un estado perfectamente definido y puede, por ejemplo, ser destruido por una intervención mecánica: no existe una verdadera solución de continuidad entre el inicio del hinchamiento y el paso a una solución coloidal. La floculación La insolubilidad de los coloides sucede generalmente por «floculación», es decir, las partículas dispersas se reúnen en agregados cada vez mayores que asumen dimensiones visibles y precipitan en forma de copos. Este fenómeno se produce por la intervención de algunos mecanismos que pueden diferir según se trate de coloides liófobos o liófilos. Examinamos, en primer lugar, el caso de los coloides liófobos. Las partículas dispersas, aunque no sean todas de las mismas dimensiones, presentan la misma naturaleza y, en particular, llevan todas una carga eléctrica del mismo signo. Esta carga eléctrica es la consecuencia de la ionización de los grupos disociables o de la adsorción de iones de la solución y constituye un elemento fundamental de estabilidad para la solución misma; en efecto, partículas de igual carga se repelen cuando se acercan debido a los movimientos brownianos. La pequeñez de las partículas y la gran superficie de contacto con el líquido en relación a su peso determina una resistencia del medio muy elevada con una consecuente lentísima velocidad de caída, aunque su peso específico sea mayor que el del solvente: bastan los simples movimientos de convección, debidos a pequeñas diferencias de temperatura en el seno del líquido, para mantener homogéneamente dispersa la substancia en solución. El fenómeno de la floculación viene precedido por la neutralización de las cargas de las partículas, las cuales no se repelen cuando se acercan por movimientos brownianos, se unen en agregados cada vez mayores, con mayor velocidad de sedimentación, hasta separarse visiblemente y reunirse sobre el fondo. En el fenómeno de la floculación se tiene tendencia a la separación completa del coloide disperso, no se llega a algo análogo a una solución saturada, sino que el coloide abandona completamente el estado de «sol». Se comprende, pues, el efecto floculante debido a la presencia o adición de iones con carga opuesta a la de las partículas en suspensión y cómo este efecto es más marcado cuanto más elevada es la carga de los iones. Por ejemplo, en el caso del fosfato férrico, coloide negativo responsable de la quiebra férrica, el calcio es 100 veces más eficaz que el potasio y el aluminio 1.000 veces más. La existencia de una carga eléctrica asociada a las partículas dispersas coloidalmente se demuestra experimentalmente mediante el fenómeno de electroforesis: un campo eléctrico establecido entre dos electrodos inmersos en la solución coloidal provoca el desplazamiento de todas las partículas hacia el electrodo con carga opuesta. Además de otros iones cargados de signo opuesto también pueden ejercer acción floculante coloide s cargados de signo opuesto: en este caso se puede producir una floculación recíproca entre coloides. Debemos considerar, pues, una partícula de un coloide liófobo (hidrófobo si nos referimos al caso de soluciones acuosas) circundada por un doble estrato eléctrico que le protege de la agregación con otras partículas similares. En el caso de coloides hidrófilos la situación es un poco más compleja y más favorable para la permanencia del coloide en solución. En efecto, la partícula coloidal, además de llevar una carga, puede estar rodeada por una capa de moléculas de agua retenidas por afinidad polar en torno a la misma partícula y que contituyen una protección complementaria contra la floculación. Incluso con la desaparición de la carga eléctrica, la afinidad con el agua, una verdadera «solubilidad» química del coloide, permite a las partículas el permanecer en solución. Los arabanos y galactanos (coloide s escasamente provistos de carga eléctrica como lo demuestra su comportamiento frente a la electroforesis) quedan estables en solución y sólo se obtiene su floculación
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mediante el empleo de un agente deshidratante, como, por ejemplo, el alcohol: por este motivo se separan comúnmente los coloide s del vino por alcoholización hasta 80° o precipitan las proteínas de sus soluciones por saturación con sales, las cuales, solvatándose, sustraen agua de las moléculas proteicas privándoles de la capa protectora del solvente. Además de la desaparición de la capa protectora del solvente puede producirse la pérdida de la carga eléctrica y se produce la floculación rápidamente. El esquema siguiente ilustra los mecanismos de floculación en el caso de coloides liófilos y liófobos.
Fig. 40
Algunos coloides como las pectinas y las proteínas son portadores de cargas al poseer grupos disociables como el grupo carboxílico o fijadores de protones como el grupo amino. En estos casos la carga de las partículas está fuertemente condicionada por el pH del medio; la disociación del carboxilo disminuye con la disminución del pH, mientras, al contrario, aumentará la carga positiva del nitrógeno amínico. Para coloide s como las proteínas existirá, por tanto, un pH isoeléctrico según el cual las moléculas coloidales estarán privadas de carga, ya que llevarán el mismo número de cargas positivas y negativas y se encontrarán, pues, en las condiciones más favorables para una floculación. Propiedades de las soluciones coloidales Las características de una solución coloidal no dependen exclusivamente de las dimensiones que las partículas dispersas, sino también, en cierta medida, de su forma. En efecto, las soluciones que contienen partículas resultantes de polímeros formando cadenas monodimensionales, alargadas, presentan normalmente una viscosidad mucho más elevada que las soluciones de coloides globulares, es decir, conteniendo partículas de forma esférica. Algunas características distinguen a las soluciones coloidales de las soluciones verdaderas. Las soluciones coloidales atraviesan el papel de filtro como las soluciones verdaderas, pero no los ultrafiltros tipo membrana o Una película de ferrocianuro cúprico. Por tanto, las soluciones coloidales no son dializables y pordiálisis se puede obtener la separación de los «coloides» de los «cristaloides». Cuando una solución acuosa que contenga a la vez substancias en solución verdadera y en solución coloidal (como, por ejemplo, una mezcla de azúcares y de pectinas), se pone en un recipiente con una pared constituida por una membrana ultrafiltrante y el recipiente se introduce, a su vez, en otro que contenga agua pura, sólo las moléculas de azúcar pueden atravesar la membrana y difundirse en el solvente puro: si se renueva el solvente continuamente será posible la eliminación completa de los azúcares de la solución de pectinas. Las soluciones moleculares ordinarias son sistemas homogéneos que no difraccionan la luz, ya que las moléculas son mucho más pequeñas que la longitud de onda de la luz visible. Por el contrario, las soluciones coloidales ejercen una acción de difracción sobre la luz que se difunde por las partículas en sus pensión; una observación hecha al microscopio en dirección ortogonal a la de la iluminación, y contra un fondo negro, permite ver las partículas suspendidas que aparecen como puntos luminosos de difracción mucho más grandes que las partículas mismas. Este dispositivo, llamado ultramicroscopio, permite constatar la realidad de las
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partículas coloidales, contadas y observar que la intensidad de los movimientos brownianos es inversamente proporcional a las dimensiones. Cuando en una solución coloidal se reúnen las partículas aumentando sus dimensiones, lo que ocurre en el inicio del proceso de floculación, aumenta la cantidad de luz difusa. En efecto, la luz difusa es proporcional al número n de partículas y al cuadrado de su volumen: D = K1 ⋅ n ⋅ V 2 = K 2 ⋅ V Durante la floculación el producto n y permanece constante, ya que representa el volumen total de coloide disuelto y, entonces, la luz difusa es proporcional al volumen y de las partículas. Con el aumento de tamaño de las partículas, la solución coloidal, que inicialmente aparecía límpida, se enturbia en el sentido corriente del término y, cuando las partículas alcanzan dimensiones de 100 nm, se llega a una verdadera suspensión. Todavía aumenta el enturbiamiento hasta alcanzar un máximo en correspondencia con las dimensiones de las partículas aun más grandes; después, se hace sentir el efecto de la sedimentación y el líquido se clarifica. Hemos recordado antes que las soluciones coloidales presentan el fenómeno de la electroforesis, es decir, que las partículas cargadas del mismo signo se dirigen hacia el electrodo con carga del signo opuesto. Las soluciones verdaderas no presentan ese fenómeno si se trata de substancias privadas de carga o presentan el fenómeno de la electrolisis en el caso de soluciones de ácidos, bases o sales. En este caso se tienen partículas cargadas de signo opuesto que se mueven hacia uno u otro de los electrodos según la carga que llevan. Exponemos a continuación las características comparadas de las soluciones verdaderas, soluciones coloidales y dispersiones groseras: Sistemas dispersos Dimensiones de Número de átomos en las partículas en Propiedades de las partículas una partícula nanómetros Atraviesan los filtros y los ultrafiltros; Dispersiones no son visibles al microscopio y moleculares (soluciones Inferiores a 2 Inferior a un millar ultramicroscopio; dializan y no verdaderas) sedimentan Soluciones coloidales. Las partículas pueden ser: microcristales macromoléculas
Dispersiones groseras (suspensiones)
Comprendidas entre 2 y 100
Superiores a 100
Comprendido entre un millar y mil millones
Atraviesan los filtros, pero no los ultrafiltros; no son visibles al microscopio; no dializan y sedimentan muy lentamente.
No atraviesan los filtros; son visibles Superior a mil millones al microscopio; no dializan; sedimentan rápidamente.
A diferencia de los «cristaloides» en los que se habla de peso molecular en un sentido bien preciso (el peso molecular expresa la relación entre el peso de las moléculas y el del átomo de oxígeno hecho igual a 16 ), en el caso de los coloides se habla más bien de dimensiones moleculares. Cuando se trata de polímeros constituidos por la reunión de un cierto número de moléculas de monómeros (como por ejemplo en el caso de las arabanas, galactanas, mananas y pectinas) existe la posibilidad de tener un índice de polimerización comprendido entre un valor mínimo y un valor máximo. Existe toda una serie de productos con moléculas progresivamente más grandes por el aumento gradual del número de moléculas del monómero del que están formadas: es evidente que, en este caso, el concepto de peso molecular pierde significado y se puede hablar sólo de peso molecular medio y de pesos moleculares comprendidos entre un mínimo y un máximo. En otros casos, como por ejemplo, para algunas proteínas, la estructura proteica está bien definida por un número determinado de distintos aminoácidos y, aún tratándose de macromoléculas, el peso molecular conserva un significado preciso. Conviene señalar que algunos coloides, en particular los coloides hidrófilos, pueden comportarse como «coloides protectores» en relación con otros coloides hidrófobos o menos hidrófilos del mismo signo, oponiéndose a su
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floculación. Se puede pensar que el efecto de protección se ejerce englobando de algún modo a las partículas protegidas. Por ejemplo, si a una solución que contenga 0,5 g/L de ácido fosfórico, los ácidos orgánicos del vino y un pH de 3,0 le añadimos, con agitación, 25 mg/L de hierro férrico en forma de cloruro no se produce ningún enturbiamiento incluso habiéndose formado fosfato férrico como lo demuestra la posibilidad de separado por ultrafiltración. Si ahora se añaden 200 mg/L de calcio o 1 g/L de potasio en forma de cloruro aparece un enturbiamiento con la precipitación de la misma cantidad de hierro. Las floculaciones coloidales tienen tendencia a producirse de manera completa y no existe el equivalente a la solución saturada para las soluciones verdaderas: cuando el soluto abandona el estado de «sol» tiende a flocular completamente. Contrariamente a la adición de calcio y potasio que determinan la precipitación del fosfato férrico, la adición de goma arábiga estabiliza la solución porque actúa como coloide protector. Acción similar a la goma arábiga ejercen los coloides de naturaleza glucídica que existen de forma natural en el vino. Son fenómenos coloidales no sólo las clarificaciones (tanino y gelatina, cola de pescado, etc ) y los tratamientos clarificantes y desproteinizantes (bentonita, gel de sílice) sino, en general, todas las precipitaciones que suceden en los vinos, con menos incidencia sólo para las precipitaciones cristalinas del cremor y tartrato de calcio. En efecto, toda precipitación consiste en una primera fase de naturaleza química, que lleva a la formación de un producto insoluble cuando se supera el producto de solubilidad relativo; sigue después una segunda fase de naturaleza coloidal en la que aumentan de tamaño las partículas microcristalinas progresivamente y que está sujeta a los fenómenos de floculación o estabilización típicos de las soluciones coloidales. Fenómenos de adsorción Nos vamos a referir ahora a un tipo de fenómenos que suceden en la superficie de contacto entre una fase sólida y una líquida. 'Se trata de los fenómenos de adsorción: el prefijo ad indica precisamente un efecto de superficie. Con oportunos materiales sólidos que presentan una particular estructura superficial, puede ocurrir que, en el contacto con una solución diluida de una determinada substancia, se observe un aumento de concentración de la fase sólida al absorber la substancia del líquido, reteniéndola en su superficie y permitiendo, a veces, extraerla completamente de la fase líquida. Por ejemplo, con el carbón decolorante, de origen vegetal y preparado en forma de obtener una gran porosidad y, por lo tanto, una enorme superficie de contacto, es posible decolorar completamente un vino tinto o, con dosis muy modestas de carbón, un vino blanco que contenga trazas de antocianos absorbidos accidentalmente. La concentración en la superficie sólida se produce cuando existe una cierta afinidad entre algunos sitios o centros activos de la superficie misma y la naturaleza de la substancia en solución. Entre el adsorbente y la substancia adsorbida se establecen enlaces de distinta naturaleza que pueden implicar fenómenos de capilaridad y de afinidad en la configuración espacial, la intervención de los denominados puentes de hidrógeno entre átomos de oxígeno estableciendo «valencias secundarias» y enlaces de atracción electrostática entre grupos con cargas opuestas. La característica de los fenómenos de adsorción es la existencia de una proporcionalidad entre la concentración de la substancia adsorbida en la fase sólida y la concentración en la solución de la que ha sido tomada. Llamando Cs y Cl respectivamente a las concentraciones en el equilibrio en las fases sólida y líquida, a una temperatura determinada y para una determinada cantidad de fase sólida en contacto con la fase líquida, la evolución de la concentración en el adsorbente en función de la concentración en el líquido es del tipo de la representada en el diagrama siguiente:
Fig. 41 Adsorción. Concentración en el adsorbente (Cs) en función de la concentración en el líquido (Cl)
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Como se ve en el diagrama, no existe una concentración definida en la fase sólida, sino que varía en función de la concentración en la solución. La adsorción es mucho más eficaz a bajas concentraciones y su entidad decrece proporcionalmente con el aumento de la concentración en la solución. Los fenómenos de adsorción, que determinan aumentos considerables de la concentración en la superficie de separación sólido-líquido, son a menudo la causa de la actividad catalítica que ejercen algunos cuerpos sólidos, haciendo posibles reacciones que, en su ausencia, serían muy lentas. Las dispersiones coloidales establecen una enorme superficie de contacto sólido-líquido. Si se piensa que cien mil millones de células de levadura con dimensiones medias de 5 x 10 µ representan, consideradas esféricas 5 + 10 2 con diámetro = 7,5 µ , una superficie de contacto de cerca de 18 m por litro, se puede hacer una idea de 2 la superficie de contacto desarrollada cuando las dimensiones de las partículas descienden por debajo de 100 mµ. Los fenómenos de adsorción suceden, pues, también a nivel coloidal, como por ejemplo por obra de la gelatina que se liga con cantidades variables de tanino, y aumentan con el aumento de la concentración del vino en tanino, siguiendo precisamente el mecanismo de la adsorción. Los fenómenos de adsorción confieren una cierta variabilidad a la composición de los coloide s que se obtienen por floculación, los cuales pueden adsorber en distinta cantidad iones y otros coloide s según la composición de la solución de la que han sido floculados: un precipitado coloidal representa en cierto modo su origen y su historia precedente. Recordemos que en los vinos, con la excepción de las proteínas originales del mosto que están cargadas positivamente, todos los demás coloide s o están privados de carga o están cargados negativamente. Entre los materiales empleados en enología y que ejercen acción adsorbente, sólo la celulosa está cargada positivamente y puede ejercer una acción electrostática sobre los enturbiamientos portadores de cargas negativas. Las arcillas, la bentonita, las harinas fósiles y el amianto están cargados negativamente y adsorben cationes del medio, contrariamente a la celulosa. Conviene indicar que el complejo resultante de la asociación entre taninos y proteínas asume las características de un coloide con carga negativa. Precipitaciones debidas a los metales En los vinos se pueden tener dos tipos principales de precipitaciones metálicas, uno causado por la presencia de hierro (quiebra férrica) y el otro causado por la presencia del cobre (quiebra cúprica). Las condiciones para las dos precipitaciones son en cierto modo opuestas ya que el hierro provoca enturbiamientos en el estado de ión férrico trivalente y, por lo tanto, en ambiente oxidante (después de una aireación) mientras que el cobre provoca precipitaciones en ambiente reductor. Los enturbiamientos debidos al hierro consisten esencialmente en fosfato férrico en los vinos blancos (quiebra blanca); en los vinos tintos además de las precipitaciones de fosfato férrico se puede producir la precipitación de complejos insolubles de hierro con los polifenoles y los antocianos y el fenómeno se indica como «quiebra azul» o «quiebra negra». Los enturbiamientos férricos se verifican en presencia de al menos 1525 mg/L de hierro total (a veces incluso menos), mientras un enturbiamiento de cobre requiere la presencia de 0,5 mg/L del metal. Debido a que las sales de hierro son solubles, los precipitados de «quiebra férrica» se redisuelven en ambiente reductor, es decir, manteniendo el vino fuera del contacto con el aire o exponiéndolo a la luz, la cual ejerce una acción reductora. Por el contrario, las precipitaciones debidas al cobre se redisuelven en ambiente oxidante, es decir, después de una aireación. Las condiciones de óxido-reducción que tienen lugar durante la conservación del vino en barricas de madera son tales que aseguran una estabilidad tanto en relación con el hierro como con el cobre. En efecto, la penetración de oxígeno es suficientemente modesta para evitar la oxidación del hierro, que queda preferentemente en estado terroso mientras que el ambiente es suficientemente oxidante para que el cobre permanezca en estado cúprico: en presencia de cantidades importantes de ambos metales pueden manifestarse precipitaciones relativas después, a causa de una aireación durante el trasiego o en el ambiente reductor que se determina después del embotellado.
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Precipitaciones debidas al hierro Las precipitaciones debidas a la presencia de hierro se deben a la formación de dos tipos de productos insolubles: el fosfato férrico coloidal y complejos insolubles de hierro férrico con polifenoles y antocianos. En todos los casos está implicado el hierro trivalente o férrico mientras el hierro bivalente (ferroso) no conduce a la formación de productos insolubles en el vino. En el caso de la «quiebra fosfatoférrica» por ejemplo, el producto insoluble que se forma es un fosfato férrico de composición no conocida exactamente pero que está constituido por iones férricos y iones fosfato trivalentes. El proceso de insolubilización necesita, pues, la presencia de iones Fe3+ y PO43 - en cantidad tal que sea superado el producto de solubilidad del fosfato férrico, extremadamente poco soluble: Fe3+ PO3-4 = Ps Para alcanzar las condiciones antes indicadas no es sólo necesaria la presencia de hierro en forma oxidada, sino que se requiere la presencia en solución de iones férricos Fe3+ libres en tal cantidad que se supere el producto de solubilidad de la sal que precipita. En el vino, el hierro férrico forma parte, en notable medida, de iones complejos solubles con los ácidos orgánicos de precipitación de las sales poco solubles como el fosfato férrico. La formación de complejos de hierro férrico en el vino y su significado en relación con la «quiebra férrica» han sido estudiados por J. RIBEREAU-GAYON Y PEYNAUD, los cuales han llegado a dar una explicación racional y coherente de los fenómenos observados. Los autores franceses han demostrado que el hierro férrico en el vino está en gran parte sustraido de algunas reacciones típicas como la del ferrocianuro que lleva a la formación de ferrocianuro férrico azul o la del sulfocianuro que produce una coloración roja de sulfocianato férrico. En un vino aireado sólo una pequeñísima parte del hierro se colorea con sulfocianato mientras que es suficiente acidificar fuertemente con ácido clorhídrico para que se manifieste una coloración mucho más intensa. Sin embargo, la falta de reacción al pH del vino no depende del valor demasiado elevado del pH mismo ya que una solución de cloruro férrico llevada al mismo pH del vino se colorea intensamente con sulfocianato que, a ese pH, reacciona completamente con el hierro férrico presente. El aumento de coloración que se verifica en el vino acidificado es debido al aumento de la concentración de los iones Fe liberados de los complejos con ácidos orgánicos, complejos que no son estables a pH bajo. En efecto, una solución de 10 mg/L de hierro férrico en ácido acético N/10 a pH 2,7 reacciona completamente con el sulfocianato y no se obtiene incremento del color por acidificación con ácidos minerales, mientras que 10 mg/L de hierro férrico en solución N/10 de ácido tartárico, incluso con pH más bajo de 2,1 reaccionan con el sulfocianato como si fueran sólo 3 mg/L: el 70% del hierro estaba acomplejado y, por lo tanto, sustraído de sus reacciones típicas. El ácido acético no ejerce acción acomplejante mientras la ejercen el tartárico, en mayor medida el cítrico y en menor medida los ácidos málico y láctico. La reacción con sulfocianato se presta bien para indicar el estado en el que el hierro se encuentra en el vino. En efecto, realizado después de la adición de agua oxigenada (que oxida todo el hierro presente a hierro trivalente) y acidificación con ácido mineral, permite la valoración del hierro total; con la sola acidificación permite la valoración del hierro férrico y, por diferencia con el total, también la del hierro terroso; sin adición de agua oxigenada y sin acidificación pone en evidencia el hierro férrico no acomplejado en forma de iones Fe3+. Otra demostración, aunque sea indirecta, de la presencia de complejos de hierro en el vino (como por ejemplo el ferritartrato de potasio: K[Fe(C4O6H2)2] ) viene dada por la cantidad demasiado elevada de hierro férrico que se encuentra en los vinos aireados respecto a la que debiera estar presente en base al potencial Redox del vino. Volveremos de forma particular sobre este problema cuando tratemos precisamente el potencial de óxidoreducción; por ahora basta decir que cuando se sumerge en un medio líquido una lámina de platino ésta asume un potencial bien determinado, que es también medible sumergiendo un electrodo de referencia. Cuando en una solución está presente un sistema óxido reductor, como por ejemplo Fe3+ / Fe2+, la relación entre las cantidades en forma oxidada y reducida [Fe3+] / [Fe2+] queda bien definida en función del potencial Redox de la solución misma. Pues bien, en los vinos mantenidos durante largo tiempo al abrigo del aire el potencial Redox asume valores de 0,10 - 0,15 V y en los aireados el potencial alcanza raramente los 0,50 V En una solución que contenga iones terrosos y férricos se necesita que el potencial alcance 0,75 V para que la relación entre las dos especies de iones sea igual a 1,es decir, 0,75 es lo que se denomina potencial Redox normal. A un potencial de 0,50 V la relación [Fe3+] / [Fe2+] es mucho más pequeña que la relación entre las concentraciones de hierro férrico y terroso encontradas en un vino aireado y que indicaremos [FeIII] y [FeII] respectivamente: esta relación
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en los vinos es frecuentemente de alrededor de 1 y varía en general entre 0,2 y 5. En base al valor del potencial de un vino aireado se deduce, en relación con el potencial normal del sistema Fe2+ Fe3+, que la relación [Fe3+] / [Fe2+] es entre 1.000 y 10.000 veces más pequeña que la relación [FeIII] / [FeII]. La mayor parte del hierro férrico se encuentra, pues, en el estado del complejo y sólo una pequeñísima parte, compatible con el potencial Redox, se encuentra en estado libre: es esta mínima fracción la que entra en juego inmediatamente en los fenómenos de insolubilización del hierro, naturales o provocados (tratamiento con ferrocianuro). A medida que el hierro libre desaparece por precipitación, se libera más de los complejos hasta que se alcanza un equilibrio final en el que no se supera el producto de solubilidad del compuesto que precipita. Indicando con C una substancia acomplejante para el hierro férrico se tiene el siguiente equilibrio: Fe3+ + C CFe3+
Fe3+ [ C] =K CFe3+ Cuanto más elevado es el valor de la constante K, más «imperfecto» es el complejo; un complejo perfecto tiene, por el contrario, K = 0. El ión ferrocianuro [Fe (CN)6]4- constituye, por ejemplo, un complejo perfecto del que no se obtienen trazas de iones Fe2+ en solución: es un complejo del hierro bivalente. Los complejos del hierro férrico aumentan su estabilidad con el aumento del pH y viceversa. También el hierro ferroso forma probablemente complejos el vino, pero mucho menos estables que los del hierro férrico. Las reacciones del hierro en el vino siguen una serie de mecanismos químicos,¡ físico-químicos y coloidales resumidos en el esquema siguiente: Compuestos solubles de FeII
Iones Fe2+ O2 +H Complejos solubles de FeIII
Iones Fe3+ Hidrólisis
Incoloros (Ac. orgánicos)
Vino límpido
Coloreados (Polifenoles)
"Quiebra negra"
iones fosfóricos
Fosfato férrico coloidal (vino límpido) + Ca2+ + K+
+ Proteinas
Fosfato férrico floculado "Quiebra blanca"
H2O
1/ H2 Fe (OH)3 (trazas)
iones ferricianuro
Ferrocianuro férrico coloidal + Ca2+ + K+
+ Proteinas
Fosfato férrico floculado
Comportamiento del hierro en los vinos aireados
Comportamiento del hierro en los vinos aireados Lo que hemos ilustrado sobre el comportamiento del hierro permite una comprensión clara y coherente de la experiencia llevada a cabo sobre un vino blanco. y descrita por RIBEREAU-GAYON y cols. La experiencia tenía por objetivo el estudio de la influencia del pH sobre la «quiebra fosfatoférrica» y emplearon un vino blanco con pH 3,1 Y conteniendo 34 mg/L de hierro. El vino había sido privado inicialmente de oxígeno y
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hierro férrico por conservación prolongada al abrigo del aire, después, fue distribuido en una serie de recipientes y llevado a pH comprendidos entre 2,5 y 4,2 mediante la oportuna adición de ácido sulfúrico y de hidróxido de potasio. Los recipientes fueron agitados con aireación durante un minuto para saturar el vino en oxígeno y fueron conservados abiertos a la temperatura de 12° C durante ocho días. Transcurrido ese período se observó un enturbiamiento en una serie de muestras. Sobre todas las muestras se determinó el hierro férrico total FeIII y, después de una clarificación de los vinos turbios con gelatina, se efectuó la determinación del FeIII bloqueado con los complejos: la diferencia dio la cantidad de hierro férrico precipitado como coloide fosfatoférrico. Los autores expresaron los resultados obtenidos en el siguiente diagrama:
Fig. 42 Precipitación del hierro y formación de complejos en un vino aireado en función del pH.
En el diagrama se observa cómo el hierro férrico total y el hierro férrico acomplejado aumentan con el aumento del pH, pero a partir de un determinado valor del pH (3,3) el hierro férrico acomplejado aumenta más rápidamente hasta llegar a representar la totalidad del hierro férrico presente. Es comprensible, por tanto, que se produzca un aumento de la «turbidez» que pasa por un máximo y después disminuye cuando la acción acomplejante hace disminuir la concentración del hierro férrico libre para combinarse con los fosfatos. El tratamiento con ferrocianuro, efectuado racionalmente, elimina el peligro de enturbiamientos férricos. Precipitaciones debidas al cobre Para que se verifique la «quiebra cúprica» se requieren, generalmente, al menos 0,5 mg/L de cobre. El enturbiamiento sucede en ausencia de oxígeno y es favorecido por los agentes reductores como, por ejemplo, la luz solar. Sin embargo, parece que las precipitaciones a la luz y en oscuridad comportan mecanismos distintos. El precipitado rojizo oscuro que se deposita es rico en cobre, libera sulfuro de hidrógeno por calentamiento con ácido clorhídrico diluído y es rico en nitrógeno proteico. La precipitación del cobre sucede generalmente en vinos blancos sulfitados conteniendo SO2 libre. Teniendo presentes todos estos elementos J. RIBEREAU-GAYON ha propuesto un mecanismo para la «quiebra cúprica» que conduce a la precipitación de sulfuro de cobre o de cobre metálico. En el mecanismo intervienen compuestos reductores del vino, el anhídrido sulfuroso es reducido hasta sulfuro de hidrógeno y las proteínas que ejercen sólo una acción floculante sobre el coloide metálico cargado negativamente. Indicando con RH una substancia reductora del vino se tienen las fases siguientes: Cu 2+ + RH → Cu + + R + H + 6 Cu + + 6 H + + SO 2 → 6 Cu 2+ + H 2S + 2 H 2 O Cu 2+ + H 2S → CuS + 2H +
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El cobre cúprico es reducido a cuproso y este último se reoxida a cúprico reduciendo al anhídrido sulfuroso a sulfuro de hidrógeno. Se forma una solución coloidal de sulfuro cúprico que es floculada con la intervención de cationes y de proteínas presentes. La reducción del cobre puede continuar hasta cobre metálico coloidal que se reoxida en parte reduciendo al sulfuroso y, en parte, puede ser floculado como tal. También en el caso de la «quiebra cúprica» la última fase del enturbiamiento es de tipo coloidal y puede ser impedida, conservando la limpidez, por la presencia de coloide s protectores naturales o añadidos (goma arábiga). JOSLYN y cols. han observado, sin embargo, que la intervención de las proteínas no se limita a una acción floculante, sino que comporta una participación directa en el mecanismo de insolubilización. La intervención reductora del anhídrido sulfuroso sucede al nivel del grupo ditiol de la cistina con formación de grupos sulfidrilos, mientras el ión sulfito se oxida a sulfato: R 1 -CHNH 2 -S-S-CHNH 2 -R 2 + SO32- + H 2 O → R1 -CHNH 2 -SH + HS-CHNH 2 -R 2 + SO 42El cobre cúprico y cuproso puede ligarse al grupo sulfidrilo de la proteína desnaturalizada. Con el empleo del bisulfito conteniendo el isótopo radiactivo 35S los autores americanos han establecido que la radiactividad específica del depósito obtenido, en condiciones de luz, es la misma que la del bisulfito y que, por lo tanto, la proteína no interviene en el mecanismo de reducción. Al contrario, cuando la quiebra se manifiesta en condiciones de oscuridad una parte del azufre proviene de la proteína desnaturalizada y el cobre resulta firmemente ligado a la proteína misma, de la que no es separable por electroforesis. Los dos tipos de mecanismos descritos pueden coexistir y superponerse. El tratamiento con ferrocianuro resuelve, a la vez, el problema de la «quiebra férrica» y el de la «quiebra cúprica». Enturbiamientos debidos a la presencia de proteínas Y llegamos a la «quiebra proteica», un enturbiamiento que es consecuencia de la presencia en los vinos de proteínas en cantidades elevadas. El fenómeno afecta esencialmente a los vinos blancos pobres en polifenoles y se verifica de forma particular para los vinos de determinadas regiones, como por ejemplo, los vinos alemanes, y en años particulares: en Alemania, los años 1947, 1953 Y 1959 dieron vinos blancos especialmente afectados por la «quiebra proteica». Las proteínas de los vinos son sensibles tanto al calor como al frío. Se puede obtener una coagulación por una larga permanencia a 30 °C, mientras que temperaturas en torno a 70 °C durante 20 minutos pueden hacer coagular las proteínas irreversiblemente y, por lo tanto, separarlas del vino. Con un enfriamiento en torno a 0° e se pueden observar enturbiamientos que desaparecen al volver a una temperatura normal: el comportamiento ante el frío es reversible. Según KOCH y BRETTHAUER, un calentamiento rápido a 75 °C durante dos minutos, seguido de un inmediato enfriamiento y conservación durante 5-7 días a baja temperatura, estabiliza completamente el vino, mejor que un tratamiento con bentonita, aunque éste provoca una mayor disminución de las substancias nitrogenadas precipitables con alcohol: el tratamiento con bentonita tiene, sin embargo, la ventaja de no someter el vino a calentamiento. Los autores aislaron de 200 botellas 40 mg de precipitado constituído sólo por el 40-50% de proteínas. Según KOCH y BREITHAUER los vinos procedentes de vinificación en tinto no contienen proteínas solubles. Incluso los vinos blancos, cuando son vinificados en presencia de las partes sólidas, resultan privados de proteínas y no son susceptibles de «quiebra proteica». Hay que destácar que precisamente la ausencia o, mejor, la pequeña cantidad de proteínas en los vinos tintos y en los blancos vinificados con maceración, demuestran la muy probable participación de los polifenoles en la insolubilización de las proteínas. Según nuestras recientes investigaciones, los vinos vinificados en tinto no están privados de proteínas, sino que presentan un contenido en substancias proteicas de 20-40 mg/L, un tercio de las cuales tienen peso molecular superior a 200.000. Hemos demostrado, tanto en mostos como en vinos, la formación de complejos de elevado peso molecular con la participación de proteínas, coloide s de naturaleza glucídica y leucoantocianos. El mecanismo de insolubilización de las proteínas en el vino aparece, pues, distinto del de desnaturalización por el calor de las proteínas puras precipitadas del mosto y el distinto comportamiento ante el calentamiento de
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las fracciones de proteínas puras aisladas de la uva con técnicas particulares, no permite hacer previsiones sobre su precipitabilidad por obra de los taninos y de coloides de otra naturaleza. Se han realizado muchos trabajos sobre la separación y fraccionamiento de las proteínas aislables de la uva mediante técnicas refinadas, como la focalización isoeléctrica sobre capa fina, llegando a la conclusión de que el cuadro proteico es una característica de la variedad. Sin embargo, una cosa son las proteínas aisladas de la uva mediante técnicas particulares y otra cosa son las proteínas que se encuentran en los vinos en presencia de todas las substancias cedidas al mosto durante la vinificación. ) Hay que recordar que las levaduras ceden, durante la viníficación, además de coloides de naturaleza glucídica, una cierta cantidad de substancias proteicas, más o menos ligadas a otros coloides, de las que no se conoce con exactitud la evolución en el vino. Contra la «quiebra proteica» resulta eficaz el tratamiento con bentonita, que provoca la floculación de los coloides que contienen estructuras proteicas. Recientemente se ha propuesto un clarificante a base de gel de sílice que debería ser eficaz también contra la «quiebra proteica»; la experimentación no es aun suficiente como para dar una respuesta documentada. Precipitaciones de materia colorante en los vinos tintos Se debe a RIBEREAU-GAYON y PEYNAUD la observación de que los vinos tintos, que no han sido clarificados recientemente, se enturbian generalmente por un enfriamiento suficientemente prolongado en torno a 0 °C, volviéndose límpidos por calentamiento. Después de un largo enfriamiento se puede formar un depósito, separable por centrifugación, que, visto al microscopio, presenta gránulos esféricos y que está privado tanto de hierro como de calcio. Este depósito se redisuelve en agua caliente o en alcohol con intensa coloración roja. Si en un recipiente que contenga vino introducimos una bolsa de celofán con agua destilada en cantidad inferior al 10 % del volumen del vino y cerramos herméticamente el recipiente, después de un tiempo suficientemente largo, todas las substancias no coloidales se habrán difundido a través de la membrana dializante y la composición se habrá hecho idéntica en el interior que en el exterior de la bolsa con la excepción de los coloides. El vino contenido en la bolsa de celofán será de color más claro y, sometido a refrigeración, no estará sujeto a enturbiamiento ni al depósito de materia colorante. Sin embargo, el vino dializado vuelve a enturbiarse por enfriamiento después del transcurso de un tiempo suficientemente largo desde el momento de la diálisis. Estas experiencias descritas de RIBEREAU-GAYON y PEYNAUD demuestran el paso con el tiempo de una fracción de la materia colorante bajo forma de coloide, con la consiguiente precipitación sucesiva: sería a través de este mecanismo por el que el vino se «despoja» con el tiempo. La materia colorante que precipita está constituida, probablemente, por un complejo coloidal que merecería una investigación más profunda. Precipitaciones de naturaleza oxidásica La precipitación, analizada antes, de materia colorante en estado coloidal ocurre por un proceso de condensación y formación de micelas, sin intervención del oxígeno. Distinto es el caso de las precipitaciones oxidásicas debidas a la acción de un enzima oxidante, particularmente la lacasa secretada por Botrytis cinerea, que conduce a la oxidación de la materia colorante y de los taninos y a la precipitación de los productos de condensación de las quinonas, derivadas de la oxidación de los ortodifenoles. Contra la «quiebra oxidásica» se puede actuar destruyendo el enzima mediante pasteurización o con el empleo del anhídrido sulfuroso y evitando el contacto del vino con el aire.
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CAPITULO DECIMONOVENO
Los coloides del mosto y del vino: origen, estructura, dimensiones moleculares, asociaciones coloidales Los coloides de naturaleza glucídica del mosto De los mostos recién prensados es posible precipitar los coloides por adición de 5 volúmenes de alcohol de 95°, previa acidificación con el 5 % de HCl 1:1 para evitar la precipitación de sales de los ácidos orgánicos. El precipitado, lavado con alcohol de 80°; puede ser purificado disolviéndolo en agua y reprecipitándolo con alcohol y el material así obtenido queda disponible para sucesivos estudios. Mediante el procedimiento descrito se han aislado los coloide s de tres mostos (Moscato 1982, Barbera 1972, Nebbiolo 1973) y de los vinos correspondientes después de una fermentación espontánea. El mosto de Moscato ha fermentado en blanco a baja temperatura (6 - 7 °C) hasta el agotamiento de los azúcares con el fin de estudiar la evolución de los coloides; normalmente en este tipo de vino la fermentación se detiene cuando quedan sin descomponer poco menos de la mitad de los azúcares iniciales. Los vinos Barbera y Nebbiolo se han obtenido por fermentación en tinto con despalillado previo: los coloides han sido precipitados del vino, una vez límpido por centrifugación, 11 días después del estrujado. Para Barbera se ha repetido la precipitación a los 2 años y 5 meses. La tabla 57 presenta los resultados relativos a la cantidad de coloides totales obtenidos por precipitación con alcohol. Los datos de la tabla 57 ponen en evidencia la disminución clara de los coloides totales después de la fermentación en blanco y el aumento después de la fermentación con maceración. El primer fenómeno depende de la pronunciada demolición de las pectinas por obra de la poligalacturonasa del mosto mientras que el segundo es consecuencia de la cesión de coloide s de las partes sólidas de las bayas. TABLA 57 Coloides totales desecados bajo vacío mg/L Mosto Moscato 1972 525 Vino Moscato 1972 282 Mosto Nebbiol0 1973 280 Vino Nebbiolo 1973 recién fermentado 498 Mosto Barbera 1972 625 Vino Barbera 1972 recién fermentado 1.150 Vino Barbera 1972 después de 2 años y 5 meses 712 De los coloides obtenidos por precipitación con alcohol es posible proceder a la eliminación de las pectinas. Para tal fin se toma una solución acuosa de los coloides al 2,5% y se lleva a pH 9,5 con NaOH; después de 6 horas se acidifica con ácido acético hasta pH 6,5 y se añade el 5% en volumen de una solución de cloruro de calcio 2 N. Después de 8 horas se separa por centrifugación el precipitado gelatinoso de pectato de calcio y del líquido límpido se precipitan los otros coloide s con alcohol. El pectato es lavado y desecado al vacío. La estructura de las pectinas Vamos a precisar la estructura de las pectinas. Se trata de polímeros del ácido d-galacturónico y consisten en una cadena de unidades de forma piránica ligados en posición (1 → 4) con enlace α-glucosídico y con los grupos carboxílicos esterificados en gran parte con alcohol metílico. Las pectinas constituyen, por tanto, la fuente del alcohol metílico del vino, de los fermentados de frutas y de sus destilados. Entre las frutas que constituyen la materia prima para la producción de bebidas fermentadas, la uva es quizás la más pobre en pectinas y esto explica el modesto contenido en alcohol metílico del vino y de sus destilados.
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El ácido galacturónico puede considerarse un ácido-azúcar; en efecto, tiene la configuración idéntica a la galactosa con un grupo carboxílico en el puesto del grupo alcohólico primario en la extremidad de la cadena. La producción del ácido galacturónico en los vegetales parte de la glucosa, en forma de glucosauridindifosfato, a través de la formación del ácido uridindifosfoglucurónico como consecuencia de la intervención del nicotinamidadenindinucleótido en forma oxidada (NAD+); a continuación la epimerasa transforma el ácido uridindifosfoglucurónico en ácido uridindifosfogalacturónico y se producen los procesos de polimerización con enlace glucosídico en 1 → 4 entre las moléculas y la separación del uridindifosfato. A continuación se ilustra el esquema de formación y la estructura de las pectinas. CH2OH 2 NAD+ OH H H OH H O HO UDP H OH
2 NADH
Glucosa-uridindifosfato
H
H
OH
HO
OH C
C O O
H O
H
O
OH
H
O
H OH H
H H
COOH OH H OH H O H UDP H OH
HO
Ac. uridindifosfogalacturónico
Ac. uridindifosfatoglucorónico
CH2OH OH H OH H
O
COOH Epimerasa OH H H OH H O HO UDP H OH
OH
H H
O
OH
Ahora se comprende el mecanismo de separación de las pectinas de las otras substancias coloidales que hemos descrito antes. A pH 9,5 se produce la saponificación de los grupos carboxílicos, que están metilados en un 50 – 80 %, obteniéndose el denominado ácido péctico que conserva su estructura polimerizada y que da sales de calcio insolubles. Sin embargo, el precipitado de pectato separado de los coloides del mosto, purificado por reprecipitación y desecado bajo vacío, ha presentado un contenido en ácido galacturónico del 63,9 % sólo y, sometido a hidrólisis ácida, ha mostrado la presencia de arabinosa, galactosa y ramnosa. Se podría, por tanto, pensar que estos azúcares participan, en cierta medida, en la constitución de la estructura de las pectinas, pero no está claro si las galactanas, arabanas y los polímeros de la ramnosa que se encuentran junto a las cadenas poligalacturónicas representan complejos ligados con enlaces de esterificación entre algunos carboxilos del ácido galacturónico y los hidroxilos de los azúcares o si están ligados con enlaces glucosídicos: una estructura en este sentido es la propuesta en la figura 43.
Fig. 43
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Sin embargo, en lo que respecta a las pectinas del mosto, se ha observado que el pectato de calcio precipitado, transformado en pectato sódico por agitación con una resina catiónica en forma sódica y sometido a electroforesis sobre fibra de vidrio, ha dado un componente móbil constituído prácticamente sólo por ácido galacturónico. Se puede concluir que si bien las pectinas tienen una notable tendencia a asociarse con otros coloides, como lo demuestran los fenómenos de coprecipitación, .no parecen incluir en su estructura molecular cantidades relevantes de monómeros distintos del ácido galacturónico. Las pectinas representan del 40 al 50 % de los coloides del mosto recién prensado, pero en el mosto están sometidas a la acción de dos enzimas procedentes de la uva, la pectinmetilesterasa y la poligalacturonasa. La pectimetilesterasa saponifica rápidamente los grupos esterificados liberando en 48 horas más del 80 % del alcohol metílico: éste es el origen del alcohol metílico en los vinos. La poligalacturonasa rompe la cadena poligalacturónica liberando ácido galacturónico monómero; actúa más lentamente que la pectimetilesterasa, pero en el curso de 10-15 días la demolición de las pectinas es, generalmente, completa con liberación de la cantidad correspondiente de ácido galacturónico. En el caso de la vinificación en tinto los hollejos ceden una notable cantidad de pectinas, las cuales son demolidas por la galacturonasa con el consiguiente aumento en el vino del ácido galacturónico libre que supera frecuentemente 1 g/L, alcanzando a veces 2 g/L. En la vinificación en blanco se originan, generalmente, cantidades de ácido galacturónico en torno a 0,5 g/L. Otros coloides de naturaleza glucídica Para conocer su composición, los coloide s precipitados del mosto se han hidrolizado a 100° C durante 4 horas en ampolla cerrada y en solución normal de H2SO4 . Con una serie de técnicas de aislamiento y de purificación se ha llegado al examen de los productos de la hidrólisis de cromatografía sobre papel, sobre capa fina de celulosa, sobre capa fina de gel de sílice, por electroforesis sobre papel, por espectrofotometría en el visible y en el ultravioleta. Las figuras 44, 45, 46 Y 47 ilustran los resultados obtenidos de los que se deduce que los monómeros presentes en los coloides glucídicos precipitables del mosto de uva sana son: galactosa, manosa, arabinosa, ramnosa, ácidos galacturónico y ácido glucurónico. Junto al ácido galacturónico existen, en efecto, pequeñas cantidades de ácido glucurónico
Fig. 44
Fig. 45
221
Fig. 46
Fig. 47
(6%), como aparece claramente en el espectro den simétrico de la figura 46, obtenido después de cromatografía sobre capa fina de gel de sílice de los ácidos, anteriormente separados sobre resina aniónica en forma acetada. La presencia de los monómeros indicados está rigurosamente confirmada incluso para los que, como la ramnosa, se encuentran en pequeños porcentajes. Es interesante destacar que este análisis exhaustivo no ha permitido identificar a la glucosa entre los monómeros. A pesar de la enorme cantidad de glucosa sintetizada por la vid, la estructura de las unidades de base de los coloide s de naturaleza glucídica se edifica sobre la de la galactosa: incluso la larabinosa, que constituye la unidad de base de las arabanas, es la que deriva del ácido d-galacturónico por descarboxilación. En los vinos se encuentran pequeñas cantidades de polímeros de la glucosa, pero son consecuencia del metabolismo de las levaduras. También Botrytis cinerea, que se desarrolla en forma larvada sobre las uvas de las que se obtienen los vinos de Rhin y de Sauternes, produce coloides (glucanas) que son polímeros de la glucosa. La valoración cuantitatíva de los monómeros lleva a la composición porcentual indicada en la tabla 58. TABLA 58 Composición de los coloides totales: porcentaje de los monómeros (anhídridos)
Mosto Nebbiolo 1973 Mosto Nebbiolo 1973 después de la eliminación de las pectinas Vino Nebbiolo 1973 en el desvinado Mosto Moscato 1972 después de la eliminación de las pectinas Vino Moscato 1972 completamente fermentado Mosto Barbera 1972 después de la eliminación de las pectinas Vino Barbera 1972 en el desvinado Vino Barbera 1972 conservado durante 2 años y 5 meses
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Acidos urónicos
Galactosa
Manosa
Arabinosa
Ramnosa
37,68
3,82
15,68
3,87
38,95
51,34
9,36
25,38
2,73
11,13
38,42
25,50
17,04
5,28
13,76
51,30
10,10
18,00
4,33
16,27
45,00
34,40
11,79
2,05
6,76
45,68
7,30
21,99
6,24
18,79
34,92
18,30
20,20
8,96
17,62
31,64
39,85
12,30
5,39
10,82
Como se ve en la tabla, la manosa y la ramnosaestán poco representadas en los coloides del mosto; en el paso del mosto a vino se observa un notable incremento de manosa, más relevante en el caso de la fermentación en blanco: este incremento es debido esencialmente a la cesión .de mananas procedentes del metabolismo de las levaduras, como ilustraremos más adelante. Las dimensiones moleculares de los coloides glucídicos Para la determinación de los pesos moleculares se ha recurrido a la filtración sobre gel, empleando «Sepharose 6B». La «Sepharose» se prepara a partir del ágar, un polisacárido de la glucosa con elevado peso molecular, y se obtiene un producto insoluble con un retículo tridimensional con mallas de determinadas dimensiones. Con técnicas particulares se producen gránulos esféricos, que en el caso de la «Sepharose 6B» presentan dimensiones de 40-210 µ. Con este material de aspecto gelatinoso, suspendido en agua, se prepara una columna en cuya sumidad se coloca un volumen de la solución coloidal no superior al 1 % del volumen del lecho filtrante. Alimentando con un oportuno tampón, por medio de una bomba peristáltica de bajo caudal (10-12 mL/hora), las partículas coloidales se filtran a través de la columna, en la que son ralentizadas de forma selectiva según sus dimensiones moleculares. Las partículas con dimensiones moleculares más grandes que las mallas que constituyen la estructura de los gránulos esféricos, no pueden penetrar en los mismos gránulos y, pasando entre gránulo y gránulo, descienden las primeras por la columna. Al disminuir las dimensiones moleculares, las partículas penetran más fácilmente en los gránulos alargando su recorrido y descienden más tarde por la columna. Con un recogedor automático se recoge una serie de fracciones de volumen exactamente conocido, en cada una de las cuales se determinan los coloides presentes. Existe una correlación lineal entre el volumen de elución y el logaritmo del peso molecular de la substancia eluída y es posible, por tanto, conocer el peso molecular de las partículas una vez «tarada» la columna, es decir, después, de haber establecido los volúmenes de elución correspondientes a partículas coloidales de peso molecular conocido. La figura 48 ilustra de forma esquemática pero clara, el mecanismo de separación por gelfiltración de dos especies con dimensiones moleculares distintas. El tarar la columna de gel requiere un procedimiento un poco laborioso ya que no existen en el comercio coloides de naturaleza glucídica con peso molecular definido para emplearse como substancias testigo, sino sólo mezclas de polímeros de glucosa de las que se conoce la distribución de los pesos moleculares: la individualización de la correspondencia biunívoca entre un peso molecular definido y el relativo volumen de elución se obtiene a través de una serie de determinaciones con un método, que para conocerlo en detalle hay que ver el trabajo original de USSEGLIO-TOMASSET y CASTINO.
Fig. 48
Por medio de la gelfiltración se ha establecido que los pesos moleculares del 60- 70 % de los coloide s del mosto están comprendidos entre 20.000 y 200.000; del 10 al 15 % tienen un peso molecular superior a 200.000, mientras cerca del 5% presenta un peso molecular inferior a 10.000.
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La comparación de los espectros densimétricos (figs. 49 y 50) muestra que la composición coloidal varía considerablemente según los distintos pesos moleculares: estos espectros se refieren a la composición de los coloide s del mosto de Moscato 1972 en correspondencia con los pesos moleculares de 125.000 y 50.300 respectivamente.
Fig. 49
Fig. 50
La diferencia de composición de los coloide s de los mostos (obtenidos después de la eliminación de las pectinas) en función de los distintos pesos moleculares, sugiere la existencia no de un único coloide de estructura compleja (en este caso se tendría una composición constante independientemente del peso molecular), sino de una mezcla de coloide s de composición diferente. Los coloides producidos por las levaduras Con el fin de caracterizar los coloide s cedidos por las levaduras se ha preparado un substrato sintético sembrado con una cepa de Saccharomyces cerevisiae. Después de la conservación durante 20 días en termostato a 20° C se han precipitado los coloide s con alcohol. El análisis de los azúcares después de la hidrólisis ha puesto en evidencia la sola presencia de manos a y en menor cantidad (cerca del 28%) de glucosa: la figura 51. muestra las proporciones de los dos azúcares, mientras la figura 52 expone el diagrama de elución del que se deduce que los coloide s cedidos por las levaduras tienen pesos moleculares superiores a los del mosto; 24% tienen peso superior a 500.000, 74% superan 50.000.
Fig. 51.-Coloides producidos por S. cerevisiae varo ellipsoideus cepa 15 sobre medio sintético. Fig. 52.-Coloides producidos por S. cerevisiae varo ellipsoideus cepa 15 sobre medio sintético. Concentraciones expresadas en Manosa. Columna «Sepharose 6B».
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Los coloides glucídicos de los vinos Cuando se pasa del mosto al vino hay dos fenómenos que modifican la composición coloidal de los dos medios: por un lado en el vino, como consecuencia de la acción de la poligalacturonasa del mosto, casi todas las pectinas han desaparecido por hidrólisis en ácido galacturónico; por otra parte se observa la desaparición de los polímeros de la manosa (también en menor cantidad de polímeros de la glucosa) procedentes de la actividad de las levaduras en el curso de la fermentación alcohólica. En el caso de los coloides del vino Barbera ha sido posible, además, individualizar la presencia de estructuras coloidales particulares. Si se examina el diagrama de elución de la figura 53 en el que se presenta la evolución de las concentraciones de los monómeros simples en función de los volúmenes de elución, se observa, además del aumento, respecto al mosto, de la concentración de manosa hacia los pesos moleculares más elevados (fig. 54), un aumento neto también de los contenidos en ácido galacturónico, ramnosa y arabinasa, con máximos coincidentes en correspondencia con el mismo volumen de elución de 355 mI, es decir, con un peso molecular de 12.5000 La presencia de un máximo de concentración, correspondiente a un peso molecular determinado, simultáneamente para estos tres monómeros y para ellos sólo, prueba la existencia en el vino de una estructura coloidal de peso molecular de 12.500, constituída en proporciones bien definidas de ácido galacturónico, ramnasa y arabinosa (fig. 55).
Fig. 53 – Coloides vino Barbera 1972 recien desvinado. 100 mg en 2 mL de NaSO 0,05 M. Columna Sepharose &B.
Fig. 54 – Coloides mosto Barbera 1972 después de la eliminación de las pectinas 100 mg en 2 mL de NaSO 0,05 M. Columna Sepharose 6B.
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Si se calculan las concentraciones de los tres monómeros entre los volúmenes de elución 330 y 380 (es decir, en la zona de los tres picos superpuestos, simétricos respecto al volumen de elución 335) y se expresan los resultados en micromoles (millonésimas de mol), se obtienen los valores siguientes:
Fig. 55 – Coloides del vino Barbera 1972. Columna Sepharose 6B.
En la estructura coloidal del peso molecular definido los tres monómeros están presentes en la proporción de 5 moléculas de ácido galacturónico (sustituido en un 6-7% por ácido glucurónico), 4 moléculas de ramnosa y 2 moléculas de arabinosa. Esta estructura, que muestra una relación sensiblemente equimolecular entre ácido galacturónico y ramnosa, confirma los resultados de Büchi y Deuel, los cuales habían aislado por hidrólisis parcial un ácido aldobiónico, constituído por ram. nosa y ácido galacturónico; sin embargo, en la estructura del polímero participa también la arabinosa, mientras galactosa y manos a están ausentes.
Coloides de naturaleza proteica Sobre el mismo material obtenido por precipitación con alcohol se ha ampliado el estudio a las substancias nitrogenadas, es decir, a los coloides de naturaleza proteica. Estos coloide s también han sido examinados bajo el doble aspecto de las dimensiones moleculares y de la composición química. Para el estudio del primer aspecto se ha empleado nuevamente la gelfiltración, mientras para la determinación de las proteínas presentes en cada fracción separada del gel, se ha recurrido a la determinación de los aminoácidos después de hidrólisis con una técnica de elevada sensibilidad y reproducibilidad. Los geles utilizados han sido Sepharose 6B (tarando la columna con proteínas de peso molecular muy elevado (de 800.000 a 50.000.000). Naturalmente este último gel no ha sido utilizado con el fin de determinar el valor exacto del peso molecular de partículas de dimensiones tan elevadas (cosa imposible por la falta de moléculas testigo), sino para poner en evidencia la eventual presencia de complejos con partículas coloidales de dimensiones moleculares mucho más grandes que las identificadas hasta ahora. La tabla 59 presenta los porcentajes de proteínas (N x 6,25) determinadas en los coloide s examinados: los valores en los vinos resultan siempre inferiores a los de los mostos, pero hay que tener presente que en el caso de vinificaciones con maceración se produce un aumento notable de los coloide s totales cedidos por el hollejo. Se registran valores porcentuales variables entre el 4 y el 16%.
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TABLA 59 Contenidos en proteínas de los motos y vinos correspondientes
Proteínas % de los coloides totales Moscato 1972 Barbera 1972 Nebbiolo 1973 Pinot blanco
Mosto Vino Mosto Vino Mosto Vino Mosto
15,9 11,3 6,8 3,5 7,1 4,6 4,4
El diagrama de elución sobre «Sepharose 6B» de las proteínas presentes en los coloide s del mosto Moscato 1972 muestra la existencia de un pico al volumen de exclusión Vo (volumen de elución de moléculas tan grandes que no pueden penetrar mínimamente en los gránulos y son eluidas inmediatamente), es decir, con un peso molecular superior al millón. Este pico representa el 51 % de las proteínas totales; las otras proteínas se distribuyen uniformemente en pequeñas cantidades desde pesos moleculares superiores a 300.000 hasta valores inferiores a 10.000. La presencia sorprendente en los coloide s de los mostos de complejos proteicos de dimensiones moleculares tan grandes nos ha inducido a hacer un análisis más detallado del complejo que sobre «Sepharose 6B» se presenta bajo la forma de un pico simétrico en correspondencia con el volumen de exclusión. Para tal fin se ha hecho un fraccionamiento sobre «Biogel A 50M», determinando en cada fracción, además de las proteínas, también los glúcidos totales, las procianidinas (leucoantocianos) y los ácidos urónicos. Los resultados se representan en el diagrama de elución de la figura 56, el cual demuestra la existencia de un complejo de peso molecular muy elevado que implica la presencia de estructuras proteicas, de taninos, de pectinas y de coloides de naturaleza glucídica. La parte glucídica, examinada después de la hidrólisis, aparece compuesta esencialmente por galactosa y arabinosa, con menores cantidades de manosa y ramnosa.
Fig. 56.-Filtración f;obre columna de «Biogel A 50 M». Coloides precipitados con alcohol de un mosto de Moscato 1972 recién prensado.
En el mosto de uva fresca las proteínas, los leucoantocianos y los coloide s glucídicos interaccionan entre ellos, llevando a la formación de complejos coloidales todavía solubles, pero de elevadísimo peso molecular. Con el paso del tiempo se asiste al aumento progresivo del peso molecular de estos complejos; en efecto,
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después de dos días, en mostos obtenidos perfectamente límpidos por centrifugación en los que se ha inhibido la fermentación por adición de cloroformo, se observa la formación de un precipitado insoluble, de composición similar a la del complejo aislado sobre Biogel aunque más rico en taninos:por medio de la precipitación inmediata de los coloides con alcohol se ha individualizado la fase inicial del proceso, que llevará a continuación a la insolubilización de las proteínas. En lo que respecta al vino del Moscato correspondiente, se observa una disminución considerable del pico proteico relativo al complejo de peso molecular elevado. Sin embargo más de la mitad de las pequeñas cantidades de proteínas precipitables con alcohol (unos30 mg/L) tienen pesos moleculares superiores a 200.000, mientras para la parte restante la distribución de los pesos moleculares varía de 200.000 a cerca de 15.000. Los resultados obtenidos por medio de la filtración sobre gel indican, pues, la presencia de pequeñas cantidades de proteínas que desarrollan un papel importante en la formación de complejos coloidales de peso molecular mucho más elevado del comúnmente atribuído a las proteínas de los vinos. Se han obtenido resultados similares analizando los coloide s de un vino Barbera 1972, precipitado después, de más de dos años de conservación. Se destaca que quedan en el vino pequeñas cantidades de coloides proteicos de los que más del 30% poseen peso molecular superior a 200.000, Las proteínas de los coloides obtenidos a partir de otros mostos y de otros vinos presentan características totalmente análogas. Las proteínas cedidas por las levaduras En lo que respecta a las proteínas cedidas por las levaduras, representan cerca del 30% de los coloide s totales y sus características se ilustran en los diagramas de elución de las figuras 57 y 58. Del diagrama de elución de la figura 57 se deduce que más del 40% de las proteínas cedidas por las levaduras tienen pesos moleculares superiores a 300.000, mientras el diagrama de la figura 58 demuestra la existencia de un complejo de peso molecular muy elevado, constituido en un 47% de proteínas y en un 53% de coloides glucídicos. Todos los resultados que hemos expuesto han sido obtenidos de los coloides de los mostos y de los vinos precipitados con alcohol. También se ha confirmado la formación de complejos macromoleculares en el mosto recién prensado, analizándolo por gelfiltración, sin someterlo a ningún tratamiento y manteniéndolo límpido por centrifugación a 10.000 r.p.m. durante 15'. La operación ha sido posible debido a la elevada sensibilidad de los métodos analíticos empleados, en particular el adoptado para las proteínas, basado en la valoración colorimétrica con «nihidrina» de los aminoácidos obtenidos después de una hidrólisis.
Fig. 57 – Filtración sobre columna de Sepharose 6B de los coloides cedidos a un medio sintético por las levaduras
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Fig. 58 – Filtración sobre columna de Biogel A 50 M de los coloides cedidos a un medio sintético por las levaduras
Después de la centrifugación se han sometido a filtración 4 mL de mosto sobre «Biogel A 50M», recogiendo una serie de fracciones sobre las que se han determinado los glúcidos totales, las proteínas, los leucoantocianos y los ácidos urónicos: se han utilizado mostos de Pinot blanco y de Riesling itálico, ambos de la vendimia 1976. También en estos mostos se ha demostrado la presencia de un complejo de elevadísimo peso molecular constituido por coloide s glucídicos, proteínas, leucoantocianos y pectinas. Tales complejos se forman en el momento de la rotura de las bayas y son análogos a los encontrados en los coloides de los mostos obtenidos por precipitación con alcohol. Estos resultados demuestran que las denominadas «proteínas» de los vinos son algo muy diferente de las aislables con técnicas particulares a partir de la uva. Incluso los mecanismos de la «quiebra proteica» deben ser interpretados como fenómenos que ponen en juego la participación de otros coloides y no es posible asimilados a una simple coagulación de proteínas. Por lo demás, KOCH y BRETTHAUER han encontrado sobre 40 mg de precipitado coloidal aislado de 200 botellas de vino blanco, contenidos en proteínas del orden del 40-50 % de los coloides precipitados.
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CAPITULO VIGESIMO
Los sistemas óxido- reductores El potencial Redox Ya hemos dicho que por oxidación de una substancia se debe entender no sólo la ganancia de oxígeno o la deshidrogenación, sino también la pérdida de cargas negativas (electrones), mientras por reducción se entienden los fenómenos contrarios, en particular la ganancia de cargas negativas. La presencia contemporánea de la forma oxidada y de la reducida constituyen un sistema Redox. Por ejemplo, una mezcla de cloruro ferroso y de cloruro férrico, constituye un sistema Redox, susceptible de evolucionar en un sentido o en otro: Fe2+ Fe3+ + eEl símbolo e representa un electrón. Si en la solución de FeCl2 y FeCl3 se introduce un electrodo indiferente (una lámina de platino o de oro) éste asumirá un determinado potencial que dependerá de la relación entre las concentraciones de iones ferrosos y férricos. La carga asumida por el electrodo será positiva si el sistema tiene tendencia a fijar electrones, es decir, si es oxidante (Fe3+ + e- → Fe2+); la carga del electrodo será negativa si el sistema es reductor, es decir, con tendencia a ceder electrones (Fe2+ → Fe3+ + e-). Un sistema óxido-reductor con un electrodo inmerso constituye un semielemento de una pila. Está claro, en efecto, que si por ejemplo, al electrodo cargado positivamente se le hacen llegar a través de un conductor electrones, estos serán absorbidos por los iones férricos que se reducirán a ferrosos y la transformación continuará hasta que la relación entre las concentraciones de los iones hayan anulado el potencial del electrodo. La afinidad de una reacción Existe la posibilidad de establecer una relación entre el potencial asumido por el electrodo y las concentraciones molares de la forma reducida y de la forma oxidada. Esta relación se establece teniendo presente lo que es el máximo trabajo obtenible en una reacción. Este máximo trabajo, A, se define en termodinámica como «afinidad» de la reacción y se obtiene cuando la reacción se desarrolla de forma isoterma y reversible. La afinidad es la medida de la aptitud de una reacción para desarrollarse. Las reacciones que se producen en soluciones diluidas son análogas a las que se producen entre los gases ideales, para los que se cumple la relación PV = RT, donde P y V son respectivamente presión y volumen, R es la constante característica de los gases ideales y T la temperatura absoluta. En el caso de las soluciones P será la presión osmótica y V el volumen ocupado por una gramomolécula, representado por un valor que es el inverso de la concentración expresada en moles por litro. VAN'T HOFF ha imaginado una reacción desarrollada isotérmicamente entre gases ideales (y análogamente en soluciones ideales) en la que se llega a calcular el máximo trabajo alcanzable por la transformación de un cierto número de moléculas de una especie en otro número de moléculas de otra distinta. Sea la reacción: qA + rB sC +tD La experiencia de VAN'T HOFF da el siguiente valor de la afinidad A: q r A ] [ B] [ A = R ⋅ T ⋅ Ln Kc - R ⋅ T ⋅ Ln s t [ C] [ D] Donde R es la constante característica de los gases ideales, T la temperatura absoluta y Kc la constante de equilibrio de la reacción. Si nos referimos a la reacción: Fe2+ Fe3+ + e- la expresión anterior se hace: Fe 2+ A = R ⋅ T ⋅ Ln Kc - R ⋅ T ⋅ Ln Fe3+
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La relación (1) expresa el máximo trabajo alcanzable de forma reversible, transformando un gramo-ión de hierro ferroso en hierro férrico. Ahora tenemos la posibilidad de expresar el mismo trabajo en términos eléctricos; en efecto, el paso del hierro ferroso a hierro férrico significa el transporte de la carga de un gramo equivalente-ión (carga que se define como un Faraday y que vale F = 96494 culombios) al potencial asumido por el electrodo. El trabajo eléctrico viene dado por el producto del potencial E por la carga F; podremos, pues, escribir: Fe 2+ EF = R ⋅ T ⋅ Ln Kc - R ⋅ T ⋅ Ln Fe3+ En el caso más general de un equilibrio entre substancias en estado reducido [Red.] y substancias en estado oxidado [Ox) en el que se tenga, en vez del cambio de una carga, el cambio de n cargas, la reacción precedente se hace: [ Red ] EnF = R ⋅ T ⋅ Ln K - R ⋅ T ⋅ Ln [Ox ] y entonces [ Red ] R ⋅T R ⋅T E= Ln K Ln n⋅F n⋅F [Ox ] R ⋅T In K es una n⋅F constante característica del sistema óxido-reductor considerado, constante que indicaremos como El La expresión (3) se hace entonces: [ Red ] R ⋅T E = El Ln n⋅F [Ox ]
Fijada la temperatura y el número n de electrones cambiados en el proceso el valor
El electrodo de hidrógeno Como no se tiene la posibilidad de medir más que diferencias de potencial, el valor E se expresa en función de la diferencia de potencial medida en relación con un electrodo de referencia, al que se le asigna el valor cero de potencial. El electrodo de referencia es el electrodo de hidrógeno construido sumergiendo una lámina de platino platinado en una solución conteniendo iones hidrógeno en la que borbotea hidrógeno molecular. Cuando la presión del hidrógeno sobre el electrodo es de una atmósfera y la actividad de los iones hidrógeno es de 1 gramo equivalente por litro, es decir a pH = 0, se tiene el electrodo normal de hidrógeno, al que se le atribuye el potencial cero. La expresión (4) establece pues una relación entre las concentraciones respectivas de la forma reducida y oxidada de un sistema óxido-reductor y el potencial asumido es el potencial Redox de la solución. Aunque los equilibrios Redox son complejos y derivan de la contribución de distintas parejas Redox, el potencial asume un valor bien determinado y también asumen un valor definido las relaciones entre las formas oxidada y reducida.
Potencial normal Cuando la concentración de la forma reducida y la de la oxidada son iguales, el segundo sumando de la expresión (4) se anula y resulta E = El' La constante El representa entonces el valor asumido por el potencial de un electrodo indiferente cuando está inmerso en una solución en la que la forma oxidada y reducida se encuentran en cantidades equimoleculares. El valor El se define como el potencial normal del sistema óxidoreductor considerado. Cuanto más elevado es el valor del potencial Redox de una solución más se encuentra en estado oxidado y tiene tendencia a reducirse. Poniendo en contacto dos soluciones con distinto potencial Redox, aquella con potencial más elevado actúa como oxidante en relación con la de potencial más bajo. Como ya hemos dicho hablando de la «quiebra férrica», el potencial Redox de los vinos varía entre un mínimo de 0,10 - 0,15 V. y un máximo de 0,45 - 0,50 V El potencial normal del sistema Redox hierro-férrico, hierro-ferroso es de 0,75 V, es decir, sólo para valores mucho más elevados de los registrables en los vinos se
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produce una relación equimolecular entre hierro ferroso y hierro férrico, mientras que incluso para el máximo potencial de los vinos, la cantidad de hierro férrico debiera resultar mínima: los contenidos elevados de hierro férrico, que se encuentran analíticamente en los vinos aireados, están justificados por el hecho de que la mayor parte del hierro férrico está substraído al equilibrio de óxidorreducción porque participa en la formación de complejos. El valor rH Precisado el concepto de potencial Redox y su significado vamos a definir ahora el rH, utilizado también para expresar el estado Redox de una solución. En solución acuosa estamos en presencia de iones hidrógeno, es decir, de la forma oxidada del hidrógeno, siendo la forma reducida el hidrógeno molecular. El electrodo de referencia, al que se atribuye el potencial cero, ofrece precisamente el equilibrio entre el hidrógeno molecular, que impregna el platino y satura la solución, y los iones hidrógeno. En solución acuosa, por tanto, podremos considerar cualquier fenómeno Redox como consecuencia de la participación en las reacciones de iones hidrógeno e hidrógeno molecular. Por ejemplo, la oxidación del hierro ferroso a hierro férrico se podrá indicar con la siguiente reacción: Fe 2+ + H + Fe3+ + 1 H 2 2 y en general: Red. + H + Ox. + 1 H 2 2 El equilibrio de la reacción está sujeto a la ley de acción de masas:
[Ox.][ H 2 ] 2 [ Red.] ( H + ) 1
=K
Pero la concentración del hidrógeno molecular es proporcional a la presión P a la que se encuentra y entonces [H2] = aP, donde a es un factor de proporcionalidad. Tendremos pues:
[Ox.][a ⋅ P ] 2 [ Red.] ( H + )
[ Red.] [Ox.]
1
=K
[a ⋅ P] 2 1
=
K ( H+ )
La relación entre la forma reducida y la oxidada de un sistema óxido-reductor se puede expresar en función de la actividad de los protones y de la presión del hidrógeno molecular existente en la solución. Si en la fórmula que da el valor del potencial Redox sustituimos la relación [Red]/[Ox] por su valor en función del equilibrio Redox del hidrógeno y tenemos presente que en el sistema 1 H 2 H + + e- se produce el 2 cambio de un solo electrón y, por lo tanto, n = 1, se llegará a la siguiente expresión:
[a ⋅ P] 2 R ⋅T E = El Ln n⋅F K ⋅ ( H+ ) 1
y entonces a] 2 R ⋅ T P] 2 [ [ R ⋅T E = El Ln − Ln F K F ( H+ ) 1
1
[a ] 2 es, a temperatura e 1m a, una constante que puede ser incluida en la constante E R ⋅T La expresión Ln l F K la cual asumirá el valor E2 . La expresión precedente se hace ahora: 1
[P] 2 R ⋅T E = E2 − Ln F ( H+ ) 1
Hemos expresado el potencial Redox de un sistema cualquiera en función de la actividad de los hidrogeniones en la solución y de la presión molecular del hidrógeno en equilibrio. Cuando P = 1 y (H+) = 1 el logaritmo del segundo miembro se anula y se obtiene E = E2.
233
Pero un electrodo que tenga una actividad de hidrógeno de un gramo-ión por litro y una presión del hidrógeno molecular de una atmósfera es, por definición un electrodo normal de hidrógeno, cuyo potencial, por convención, es igual a cero y entonces E2 = 0. Llegamos así a la expresión definitiva del potencial Redox:
[P] 2 R ⋅T E= − Ln F ( H+ ) 1
Recordando que Ln x = 2,3026 Log x; R = 8,309 VC; F = 96494 C, se obtiene: P] 2 [ 8,309 ⋅ 2,3026 ⋅ T E= − Log 96494 ( H+ ) 1
1 E = − 0,0002 ⋅ T Log [ P ] 2 − Log ( H + ) Si lo referimos a la temperatura de 20 °C, T = 293 K, se tiene: 1 E = − 0,0002 ⋅ 293 Log [ P ] 2 + pH 1 1 pero Log [ P ] 2 = Log P y entonces: 2 1 1 E = − 0,0002 ⋅ 293 ⋅ Log [ P ] 2 − 0,0002 ⋅ 293 ⋅ pH 2
E = − 0,0293 Log [ P ] 2 − 0,0586 ⋅ pH 1
De esta última relación se obtiene: E + 0,0586 ⋅ pH - Log P = 0,0293 Podemos, por simplificar, aproximar los valores numéricos a la segunda cifra decimal y escribir: E + 0,06 ⋅ pH - Log P = = rH 0,03 El logaritmo con signo cambiado de la presión real o ficticia del hidrógeno en una solución acuosa se indica como rH, con notación análoga a la del pH y pK. El rH ofrece, por tanto, una medida del estado Redox de un sistema como sucede con el potencial Redox. Sin embargo, en el caso del rH viene precisado el valor del pH de la solución, si no, la expresión queda privada de significado: según el pH, los mismos valores del rH corresponden a potenciales muy distintos. De la fórmula presentada se obtiene, por ejemplo, el valor del rH para un vino de pH = 3,5 Y que tenga un potencial Redox de 0,240 V: 0,240 + 0,06 ⋅ 3,5 rH = = 15 0,03 En este vino la presión del hidrógeno en equilibrio en el sistema es de 10 - 15 atmósferas: es evidente que presiones de este orden tan pequeño no tienen un significado físico real, sin embargo, el rH es una notación útil con la que representar el estado Redox de una solución.
Clasificación de los sistemas Redox Según WURMSER los sistemas Redox pueden distinguirse en tres tipos: 1) Substancias que directamente pueden cambiar electrones con un electrodo indiferente, el cual asume un potencial bien determinado: estas substancias constituyen, por sí solas, un sistema Redox. Pertenecen a este grupo los iones de metales pesados como el cobre y el hierro que dan los sistemas óxidoreductores Cu2+/Cu+ y Fe2+/Fe3+. De este tipo son una serie de colorantes llamados Redox como el azul de bromofenol y el azul de metileno los cuales poseen un color distinto en forma oxidada y en forma reducida y son utilizados para la determinación colorimétrica del potencial de óxidorreducción: existe una zona de
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«virage» apotencial determinado, análogamente a lo que sucede para el pH en el caso de los indicadores ácidobase. A este mismo grupo pertenecen la riboflavina y las deshidrogenasas que la contienen y que intervienen en la respiración celular. Todos estos sistemas son autooxidables, en el sentido de que su oxidación por obra del oxígeno no requiere catalizadores. 2) Substancias que, por sí solas, son débilmente electroactivas y para las que no se observa un potencial determinado sobre un electrodo indiferente. Sin embargo, en presencia de substancias del grupo precedente, que actúan como catalizadores incluso para contenidos muy bajos, las substancias de este segundo tipo alcanzan su equilibrio de oxidación y dan también un potencial determinado. Pertenecen a esta categoría la vitamina C, las reductonas, el ácido dihidroximaleico, es decir, substancias que contienen un grupo dienólico en equilibrio con un grupo dicetónico: HO
HO
O
O
HO
O
O
HO HO
+ 2 H+
OH
O
O
Vitamina C O H
O OH
H
H
OH
Reductona
O H
+ 2 H+
O
También los citocromos, importantes para la respiración celular, necesitan la presencia de catalizadores para explicar su electroactividad. COOH
COOH
O
C
OH
C
O
OH
C
OH
C
O
COOH
COOH
H
C
OH
C
H
C
OH
C
COOH
H
COOH
Ac. tartárico
COOH Ac. dihidroximaleico
COOH Ac. dioxitartárico
3) Existe un tercer grupo de substancias electroactivas que se comportan como tales sólo en presencia de enzimas, esto es, de deshidrogenasas que aseguran el transporte del hidrógeno de la molécula en forma reducida a la de forma oxidada, explicando una electroactividad potencial y alcanzando un equilibrio en éorrespondencia del cual se registra un determinado potencial. Es éste el caso del sistema ácido láctico"ácido pirúvico en presencia de un autolisado de bacterias lácticas (es decir, en presencia de lacticodeshidrogenasas) o de los sistemas acetaldehído-alcohol y acetoíno-butanodiol, en presencia de las deshidrogenasas relativas. Los sistemas óxido-reductores de los vinos No se éonocen todavía cuales son los sistemas óxido-reductores en los vinos (aparte de los relativos a los metales hierro ferro so-hierro férrico y cobre cúpricocobre cuproso), sin embargo, los estudios de titulación potenciométrica realizados por varios autores con soluciones oxidantes y reductoras han dado algunas indicaciones. Utilizando un método de determinación del oxígeno con hidrosulfito sódico (o ditionito sódico NaO2SSO2Na) J. RIBEREAU-GAYON ha estudiado tanto la disolución del oxígeno en el vino como la evolución en el tiempo del oxígeno disuelto.
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Disolución del oxígeno en el vino Presentamos, en primer lugar, las conclusiones establecidas por el autor en lo que respecta a la disolución del oxígeno en el vino. 1. Trasvasando un vino mediante sifón sin agitación y manteniendo el orificio del tubo inmerso en el líquido trasvasado, el vino no sufre un enriquecimiento sensible en oxígeno disuelto. 2. El vino agitado fuertemente en un volumen igual de aire se satura de oxígeno en menos de medio minuto, más rápidamente que el agua, porque el alcohol presente forma con el aire una emulsión persistente. La solubilidad del oxígeno varía poco de un vino a otro y disminuye con el aumento de la temperatura según la misma ley de la solubilidad en agua. Se puede decir que la solubilidad del oxígeno en el vino varía de 5,6 a 6,0 mL/L a 20° e y de 6,3 a 6,7 mL/L a 12° C. Las solubilidades más bajas se observan en los vinos más ricos en extracto. 3. Cuando un vino privado de oxígeno es expuesto al aire a través de una superficie de contacto, la cantidad de oxígeno que penetra en la masa es de algunos mL/L en 15 minutos cada 100 cm2 de superficie expuesta: la cantidad aumenta si la superficie no está quieta. 4. Los vinos contienen siempre en solución un poco de anhídrido carbónico, algunas decenas de mg/L y estas dosis normales son insuficientes para oponerse a la solubilización del oxígeno. Sin embargo, cuando la cantidad de CO2 es más elevada y supera, por ejemplo, los 100 mg/L, la penetración del oxígeno se ralentiza sensiblemente. 5. En un trasvase, cuando la apertura de la llegada del vino se encuentra en el fondo del recipiente que lo recibe, el enriquecimiento en oxígeno no supera 0,1- 0,2 mL/L. Por el contrario, cuando se hace llegar el vino a la parte superior del recipiente y, más aún, cuando se distribuye formando una fina lámina sobre las paredes de un gran embudo, se produce un enriquecimiento en oxígeno de varios mL/L; el enriquecimiento es tanto más grande cuanto más elevada es la presión del líquido y cuanto más fina y persistente es la emulsión con el aire. Cuando se quema azufre, por ejemplo en una barrica que debe recibir vino, el oxígeno consumido en la combustión alcanza como máximo el 5-10 % del oxígeno total de la barrica y, por consiguiente, la combustión del azufre no disminuye sensiblemente el oxígeno introducido en el vino después de un trasiego; el papel protector de la operación en relación con el oxígeno no se ejerce a través de su disminución en la disolución, sino de la acción del SO2, que protege de la oxidación a los constituyentes más fácilmente oxidables. 6. En el curso del embotellado la cantidad de oxígeno que se disuelve varía de 0,2 a 1,5 mL/L, según la presión del líquido al nivel de la botella. La cantidad disuelta resulta del mismo orden cuando el vino cae por las paredes (aumenta la superficie de contacto, pero disminuye la emulsión) que cuando se introduce bajo forma de un gran chorro con menor superficie expuesta, pero mayor facilidad de emulsión. La introducción de aire en el momento del embotellado, aunque sea en pequeñísima cantidad, provoca la denominada «enfermedad de la botella». 7. Los vinos pueden sufrir distintas manipulaciones como trasiego s por gravedad o con la ayuda de una bomba. Es difícil establecer la entidad de la disolución del oxígeno en estos casos sin una medición directa. A través de las superficies que suben o descienden se introducen normalmente cantidades de oxígeno despreciables, pero las bolsas de aire en la maquinaria o en las canalizaciones pueden ser unas fuentes de oxigenación insospechadas. 8. Una causa intensa de aireación puede ser el trasiego por medio de una bomba, sobre todo cuando el nivel del líquido aspirado se encuentra por debajo del de la bomba. En este caso, la más pequeña pérdida en la bomba o en un empalme de la tubería de aspiración puede hacer penetrar burbujas de aire finas y persistentes, que pueden saturar en oxígeno al vino (6-7 mL/L). 9. Es importante tener presente las posibilidades indicadas de introducción de oxígeno en el vino, porque normalmente son suficientes algunas décimas de mililitro de oxígeno por litro para transmitir al vino un carácter oxidado o para provocar una «quiebra férrica». Frecuentemente, en la convicción de haber operado completamente al abrigo del aire, se atribuyen estos fenómenos a otras causas. Sin el análisis no es posible afirmar que un vino está privado de oxígeno, a menos que haya sido conservado durante varias semanas en ambiente hermético.
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El electrodo de CLARK Hoy, la medida del oxígeno se hace de forma óptima con un método polarográfico que utiliza el electrodo de CLARK, esto es, un electrodo polarizado, portador de una carga negativa.
Fig.59 Electrodo de CLARK para la determinación del oxígeno En el cátodo de oro (aplicados 850 mV): O 2 + 2 H 2 O + 4 e- 4 OH En el ánodo de plata: 4 Ag + 4 Cl- 4 AgCl + 4 eEl electrodo de CLARK está constituido por un cátodo de oro y por un ánodo de plata inmersos en un gel de KCL que asegura su unión. El electrodo está aislado mecánicamente del líquido sometido a medida por medio de una membrana de teflón permeable al oxígeno. Se aplica al cátodo una tensión de 850 m V que polariza el electrodo. El oxígeno, que atraviesa libremente la membrana de teflón, es reducido en el cátodo según el siguiente mecanismo: O 2 + 2 H 2 O + 4 e- 4 OH Se tiene un consumo de electrones que es compensado por una liberación de electrones en el ánodo: O 2 + 2 H 2 O + 4 e- 4 OH En el electrodo se produce, por tanto, una corriente que es directamente proporcional a la presión parcial de oxígeno en el medio y que, oportunamente amplificada, se mide en un galvanómetro, directamente graduado en mg de oxígeno por litro. Evolución del oxígeno disuelto Después de haber precisado la entidad de la disolución del oxígeno en el vino en distintas condiciones, RIBEREAU-GAYON ha estudiado la evolución en el tiempo. Un vino saturado de oxígeno (6 mg/L) consume a 15 °C la mitad del oxígeno disuelto en 4 días si se trata de un vino tinto; lo mismo sucede para un vino blanco que contiene una decena de mg/L del SO2 libre. La velocidad del consumo del oxígeno es muy variable con la temperatura, tanto que un vino puede conservado durante meses o sólo durante algunos minutos, a 70 °C, por ejemplo. Sobre la velocidad del consumo del oxígeno ejercen notable influencia catalítica el hierro y el cobre como demuestran (tabla 60) los siguientes datos, debidos a RIBEREAU-GAYON. TABLA 60 Influencia del hierro y del cobre sobre la combinación del oxígeno en el vino O2 (mL/L) combinado en 7 días Vino testigo (24 mg/L Fe + 1,4 mg/L Cu) Vino tratado (sin Fe y Cu) Vino tratado + 24 mg/L Fe... Vino tratado + 1,4 mg/L Cu Vino tratado + 24 mg/L Fe + 1,4 mg/L Cu
5,5 O 1,9 2,3 5,1
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Restituyendo los contenidos originales en hierro y en cobre se restituye la velocidad de consumo del oxígeno por el vino: se destaca la influencia determinante de la presencia del cobre. Las experiencias de RIBEREAU-GAYON sobre la evolución del oxígeno en los vinos son muy interesantes. El autor ha efectuado la determinación del oxígeno por medio de una solución titulable de hidrosulfito en presencia de carmín de índigo como indicador Redox. El hidrosulfito sódico o ditionito sódico es la sal de sodio del ácido hidrosulfuroso que tiene la siguiente estructura: ONa
O S O
S ONa
El azufre es tetravalente y el compuesto se oxida fácilmente a sulfito. Na 2S2 O 4 + H 2 O + 1 O 2 2 NaHSO3 2 La solución del indicador es decolorada por la adición de una cantidad justa, pero suficiente de hidrosulfito y, después, se colorea nuevamente como consecuencia de la adición de una cierta cantidad de vino que contenga oxígeno: de la cantidad de hidrosulfito necesaria para decolorar nuevamente el indicador se obtiene el contenido en oxígeno del vino. El oxígeno se puede determinar también después de la separación por extracción de los gases disueltos en el vino. Los dos métodos dan resultados comparables cuando se aplican sobre un vino saturado de oxígeno, justo después de la saturación determinando, por ejemplo, la presencia de 6 mL/L de oxígeno disuelto. Sin embargo, si la valoración se efectúa después de algunas horas de reposo, el método por extracción de los gases da sólo 4 mL/L, mientras el método seguido directamente sobre el vino con hidrosulfito continúa dando el valor de 6 mL/L. Sometiendo otra vez el vino a saturación por agitación con igual volumen de aire, el método por extracción de gases dará el valor de 6 mL/L (el correspondiente al vino saturado), pero el método del hidrosulfito da un valor superior al de saturación, 8 mL/L. La diferencia de 2 mL/L encontrada entre los dos métodos se mantiene aún inmediatamente después de una nueva saturación. Estos son datos experimentales que hay que interpretar. Es evidente que la determinación hecha sobre los gases extraídos valora el oxígeno gaseoso y que éste no puede encontrarse en cantidades superiores a las de saturación y, en efecto, se encuentra siempre en la cantidad de 6 mL/L. La determinación con hidrosulfito demuestra que parte del oxígeno absorbido por el vino ha sido fijado en forma de compuestos oxidantes capaces de reoxidar el carmín de índigo decolorado por el hidrosulfito. En otras palabras un vino conservado durante un tiempo al abrigo del aire contiene substancias R capaces de fijar el oxígeno disuelto con formación de una substancia que indicaremos RO2 sin presumir nada sobre su naturaleza, la oxidación puede consistir tanto en una pérdida de hidrógeno y de electrones como en una fijación de oxígeno. Una substancia de este tipo es representada por los iones ferrosos que pasan al estado férrico después de aireación y vuelven a reducirse después, si el vino es conservado fuera del contacto con el aire. Sin embargo, la evolución del oxígeno en los vinos no puede explicarse sólo en términos de cambio de valencia de los iones metálicos. Existen pues substancias que dan productos de oxidación intermedios, que se comportan como oxidantes más enérgicos que el oxígeno molecular, que es un oxidante débil, y entre la forma oxidada y reducida se establece un equilibrio: R + O 2 RO 2 Hemos subrayado que los oxidantes intermedios son más enérgicos que el oxígeno, coloreando mucho más rápidamente el carmín de índigo. Todavía resulta más evidente empleando el azul de metileno que es menos oxidable que el carmín de índigo porque tiene un potencial normal a pH 7 de 0,0 1 V contra -0,12 V del carmín de índigo. Un vino blanco en estado reducido y saturado recientemente con oxígeno no colorea o colorea sólo parcialmente el azul de metileno que, por el contrario, es coloreado instantáneamente después de que, transcurrido un cierto tiempo, se han formado los productos de oxidación intermedios RO2. Las substancias indicadas con R son, pues, substancias autooxidables, en el sentido de que reaccionan directamente con el oxígeno para dar productos de oxidación intermedia, capaces a su vez de oxidar a otras substancias que no serían oxidadas directamente por el oxígeno disuelto. Indicando con A una de estas subs-
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tancias oxidables (por ejemplo, SO2 o un compuesto fenólico), el mecanismo de oxidación puede ser representado de la manera siguiente: RO 2 + A AO 2 + R Son reacciones de este tipo las que causan las modificaciones definitivas en los vinos y la velocidad de fijación del oxígeno viene regulada por su velocidad, mientras la oxidación intermedia de los compuestos autooxidables es rápida. En cuanto a la naturaleza de las substancias RO2 es cierto que a ellas pertenecen los iones de metales pesados hierro y cobre, pero no sólo ellos. En efecto, la titulación con hidrosulfito da a menudo resultados superiores a la cantidad de hierro trivalente total, mientras el cobre no interviene más que de forma despreciable. Una experiencia aclaratoria es la de un vino blanco privado de oxígeno por reposo largo en ausencia de aire, el cual reduce más o menos rápidamente el azul de metileno y los colorantes con potenciales normales Redox del mismo orden, añadidos en pequeñas proporciones. Pues bien, saturado de oxígeno, este vino justo después de la saturación, continúa reduciendo los colorantes añadidos, esto es, el oxígeno disuelto es un oxidante demasiado lento para contrarrestar la acción más enérgica de las substancias reductoras del vino. Si se espera un poco de tiempo (algunas horas) después de la saturación con aire, el vino no reduce más el azul de metileno. En vez de usar indicadores Redox se puede usar como reactivo el hierro férrico, que puede ser valorado con la reacción del sulfocianato. Se observa entonces un comportamiento idéntico; el hierro férrico es reducido a ferroso incluso inmediatamente después de la saturación con aire. Son, por tanto, substancias autooxidables distintas de los iones ferrosos las que se comportan como oxidantes intermedios más veloces que el oxígeno molecular. Estos son los hechos experimentales observados y las deducciones hechas por RIBEREAU-GAYON; la naturaleza de las substancias en cuestión no ha sido aclarada aunque autores rusos han atribuido el papel fundamental de oxidantes intermedios a las agliconas de los antocianos y a los taninos, sin ofrecer todavía pruebas experimentales seguras. Es un hecho que en los vinos existe una decena de mgll de substancias, expresadas como ácido ascórbico, denominadas reductonas y que pueden tener naturaleza alifática o aromática. Estas substancias oxidables por el iodo en las mismas condiciones que la determinación del SOl libre, tienen según PAUL una estructura dienólica, como la que hemos indicado antes para el ácido ascórbico, la reductona y el ácido dihidroximaleico. Papel del oxígeno en el vino El papel del oxígeno, o mejor, de las condiciones Redox de un vino, en relación con sus caracteres organolépticos no se ha aclarado del todo. Se ha hablado siempre de la permanencia en barricas de madera durante un período suficiente como una condición necesaria para la adquisición de las características de los grandes vinos tintos e incluso de los blancos, aunque para estos últimos quizás con menor convicción. La lenta y moderada penetración de oxígeno a través de la madera parece ser un factor indispensable para la maduración del vino y no sólo como estabilización. Ahora bien, la barrica de madera se ha heredado de los tiempos en los que no era posible contener y conservar cantidades importantes de vino en otros recipientes. Ello hace que las características de los vinos de calidad, que sirven de paradigma para enjuiciar el valor, no son sólo las adquiridas del mosto de uva con la maceración y la fermentación, sino que hay que añadir las derivadas de la extracción en ambiente no hermético de la madera de roble o de castaño, especies éstas que no tienen mucho que ver con el género Vitis. Es necesario reconocer que la enología no tiene una clara consciencia, en particular en lo que respecta a los grandes vinos tintos, de lo que serían las características adquiridas por un producto derivado exclusivamente de la uva, sin la contribución de cesiones que pueden incidir notablemente sobre el resultado organoléptico, bien directamente, o a través de sus productos de oxidación, reducción, esterificación, polimerización, condensación, etc. El papel del oxígeno sobre la calidad de los vinos no está comprobado de forma clara más que por sus efectos negativos. En efecto, es suficiente la ligera oxidación que se produce en el embotellado para provocar la denominada «enfermedad de la botella», con modificación y desaparición de los aromas y aparición de un cierto amargor, ligado a la presencia de acetaldehido libre, que puede originarse por disociación a partir de la oxidación del anhídrido sulfuroso. Después de un período de varios meses de conservación en botella el carácter «oxidado» desaparece y se recuperan las características olorosas típicas del vino. Para acortar el desarrollo de la «enfermedad de la botella» en el caso de vinos destinados a un consumo más rápido, es oportuna la adición antes del embotellado de 20-30 mg/L de SO2
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Si se considera dudosa la acción benéfica del oxígeno, es, por el contrario, muy cierta su acción perjudicial tanto en relación con el gusto como con el color, especialmente en los vinos blancos. Los vinos sometidos a un prolongado contacto con el aire asumen características de vinos oxidados, «maderizados», perdiendo rápidamente sus propiedades organolépticas normales. Se puede decir que en general, con la excepción de algunos vinos especiales en los que se busca el carácter oxidado, la preocupación constante del técnico es la de mantener el vino fuera del contacto con el aire. Las características organolépticas típicas de un vino procedente de una variedad determinada y que se recogen bajo la intraducible denominación del «bouquet» , son la consecuencia de una conservación suficientemente prolongada fuera del contacto con el aire y en ambiente reductor con un rH bajo. La intensidad del «bouquet» aparece ligada al potencial límite alcanzado, potencial límite que depende de la naturaleza del vino y de la eficacia del dispositivo de cierre de la botella. También tienen influencia las condiciones de temperatura y la eventual exposición a la luz. Con la elevación de la temperatura el potencial de óxidorreducción disminuye y, por ejemplo, un vino blanco al que se le añade índigo-tetrasulfonato de potasio (colorante Redox) se decolora más rápidamente. El vino decolorado, llevado a temperatura más baja, se colorea de nuevo, para decolorarse otra vez al subir la temperatura: la posición misma del equilibrio depende pues de la temperatura de conservación y las medidas directas del potencial confirman la existencia de oscilaciones en el nivel Redox en función de la temperatura. El «bouquet» se desarrolla más rápidamente con el aumento de la temperatura hasta el límite de 25 °C, por encima del cual el vino asume un sabor «cocido», especialmente si el pH es bajo y el anhídrido sulfuroso elevado. Es durante el verano y en años sucesivos cuando se produce el aumento más sensible del «bouquet», aumento que puede ser acelerado, entre ciertos límites, jugando con la temperatura de los locales. Una reducción demasiado intensa y demasiado rápida como la que se produce bajo la influencia de la luz solar, provoca, sin embargo, la aparición de aromas que, aunque pueden recordar el «bouquet» del vino, resultan desagradables y alterados. Los hechos descritos explican la dificultad y, en general el escaso éxito de las tentativas de envejecimiento acelerado de los vinos con intervenciones más o menos violentas tanto de oxidación como de reducción: no es fácil conseguir rápidamente condiciones que requieren una evolución sin variaciones bruscas del potencial Redox. El nivel límite del potencial Redox, a igualdad de condiciones del cierre de las botellas y tanto para vinos blancos como para tintos, depende de la cantidad de anhidrido sulfuroso, el cual acelera notablemente la velocidad de reducción y de formación del «bouquet»; en particular, el desarrollo del «bouquet» para determinados grandes vinos blancos exige la presencia de 50-60 mg/L de anhídrido sulfuroso libre. El «bouquet» es fuertemente atenuado o incluso destruido por la penetración de oxígeno incluso en pequeña cantidad y se necesita un prolongado período de conservación al abrigo del aire para que los caracteres organolépticos del «bouquet» vuelvan a emerger: se tiene una verdadera alternancia de los caracteres organolépticos, hasta cierto punto reversible, en función del estado reducido y oxidado del vino.
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CAPITULO VIGESIMO PRIMERO
El anhídrido sulfuroso en enología El anhídrido sulfuroso presenta en solución acuosa el siguiente equilibrio: H 2 O + SO 2 → H + + HSO3Aplicando la ley de acción de masas se tiene: [ H+] HSO3- = K´ [ H 2O][SO2 ] En solución acuosa la concentración del agua puede considerarse constante y se tendrá: [ H+] HSO3- = K´ [SO2 ] Junto al ión bisulfito HS03- está presente en solución el «sulfuroso molecular» en proporciones que dependen de la concentración hidrogeniónica, es decir, del pH de la solución. En función de la constante K o de su logaritmo con signo cambiado (pK) es posible calcular el porcentaje de SO2 molecular presente para un pH cualquiera. En efecto, denominando L a la cantidad de sulfuroso libre determinable analíticamente se pueden escribir las dos relaciones: HSO3- pH = pK + Log [SO2 ] HSO3- + [SO 2 ] = L Las dos expresiones constituyen un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas que permite calcular el valor del anhídrido sulfuroso en forma de ión bisulfito y en forma de anhídrido sulfuroso «molecular». Se puede asumir para el pK el valor de 1,81 y teniendo presente que a los pH del vino no se produce la disociación de la segunda función del ácido sulfuroso (pK2 = 6,91), es posible obtener el porcentaje de «sulfuroso molecular» para cada valor del pH, haciendo igual a 100 la cantidad de sulfuroso libre. Los valores porcentuales del SO2 molecular para los distintos pH se presentan en la tabla 61. SO2 molecular por 100 partes de sulfuroso libre pH SO2 molecular 3,0 6,06 3,2 3,91 3,4 2,51 3,6 1,60 3,8 1,01 4,0 0,64 4,2 0,41 4,4 0,26 El valor de la constante K de la expresión (2) disminuye con el aumento de la temperatura y significa un aumento del sulfuroso molecular. Pero el aumento de la temperatura no aumenta sólo el porcentaje de sulfuroso molecular; también produce un aumento consistente de la disociación del sulfuroso combinado y, como consecuencia, un aumento del sulfuro libre. SUDRAUD señala que un vino con 64 mg/L de SO2 libre a 16° C, presenta 120 mg/L a 48° C y 200 mg/L a 80° C. También el aumento de la graduación alcohólica hace disminuir el valor de la constante de disociación del ácido sulfuroso. Recientemente USSEGLIO-TOMASSET y BOSIA han determinado el valor de la constante de
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disociación en función de la graduación alcohólica y de la temperatura. Los valores obtenidos se presentan en forma de pK en la tabla 62. TABLA 62 Valores en función de la graduación y de la temperatura Temperatura ºC Alcohol % en volumen 19 22 25 28 31 34 37 0 1,78 1,85 2,00 2,14 2,25 2,31 2,37 5 1,88 1,96 2,11 2,24 2,34 2,40 2,47 10 1,98 2,06 2,21 2,34 2,44 2,50 2,57 15 2,08 2,16 2,31 2,45 2,54 2,61 2,67 20 2,18 2,26 2,41 2,55 2,64 2,72 2,78
40 2,48 2,56 2,66 2,76 2,86
Los valores de la tabla permiten valorar la influencia de los factores que actúan sobre el equilibrio de disociación del ácido sulfuroso y, por lo tanto, sobre su poder antiséptico, que está representado esencialmente por el anhídrido sulfuroso molecular. Influencia de la fuerza iónica Para regular los equilibrios en los vinos no son las constantes termodinámicas, sino las constantes mixtas las que se pueden calcular en función de la fuerza iónica del medio. Para cada vino es fácil determinar una fuerza iónica aproximada, restando la acidez total de la acidez cambiable sobre una resina catiónica libre; de este modo se obtienen valores de fuerza iónica suficientes para un cálculo correcto de la constante mixta. Se puede considerar que la fuerza iónica de los vinos varía entre los valores extremos de 0,016 a 0,056. Veamos cuanto varía la constante en función de la fuerza iónica utilizando los datos de la tabla y recordando la relación existente entre constante mixta y termodinámica: A I pK M = pK T 1+B I A 10° C de alcohol y 19° C A = 0,5510 y B = 1,6871 Con la fuerza iónica 0,056 se tiene: 0,5510 0,016 = 1,92 pK M = 1,98 1 + 1,6871 0,016 Con la fuerza iónica 0,056 se tiene: 0,5510 0,056 pK M = 1,98 = 1,87 1 + 1,6871 0,056 Si se hacen los oportunos cálculos se ve que a pH 3,0 Y con fuerza iónica 0,016 se tiene el 7,68% de anhídrido sulfuroso molecular, mientras al mismo pH y graduación alcohólica, pero con fuerza iónica 0,056, el anhídrido sulfuroso molecular es sólo el 6,90%. La fuerza iónica, es decir, la concentración salina, influye en el sentido de disminuir la concentración del anhídrido sulfuroso molecular, pero su influencia no es muy relevante. Influencia de la graduación alcohólica Consideramos una fuerza iónica media de 0,038 y veamos en base a los datos de la tabla la influencia de la graduación alcohólica a la temperatura de 19° C. En agua se tiene para la constante mixta: 0,5041 0,038 pK M = 1,78 = 1, 71 1 + 1,6378 0,038 A 10º de alcohol se tiene:
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0,5510 0,038 = 1,90 1 + 1,6378 0,038
pK M = 1,98 A 20º de alcohol se tiene:
0, 6080 0,038 = 2, 09 1 + 1,7433 0,038 A pH 3,0 los distintos valores de las constantes en función del contenido en alcohol superan respectivamente los siguientes valores de anhídrido sulfuroso molecular: 4,88%; 7,36%; 10,95%. El alcohol presenta, pues, una influencia importantísima sobre el poder antiséptico del anhídrido sulfuroso porque aumenta notablemente la fracción molecular a causa de la disminución de la constante de disociación: la acción antiséptica del anhídrido sulfuroso debe ser reconsiderada a la luz de estos resultados. pK M = 2,18 -
Influencia de la temperatura Calculamos los valores de las constantes mixtas a la fuerza iónica 0,038 y a 10° de alcohol, respectivamente para las temperaturas 19° C, 28° C y 40° C. A 19 ºC:
pK M = 1,98 -
0,5510 0,038 = 1,90 1 + 1,6378 0,038
pK M = 2,34 -
0,5612 0,038 = 2, 26 1 + 1,6974 0,038
pK M = 2,66 -
0,5763 0,038 = 2,58 1 + 1,7125 0,038
A 28 ºC:
A 40 ºC:
A pH 3,0 estos valores suponen los siguientes contenidos en anhídrido sulfuroso molecular: 7,36%; 15,40%; 27,55%. Pasando de 20° C a 40° C la cantidad de SO2 molecular se hace casi cuatro veces mayor y esto explica la estabilidad biológica que alcanzan los vinos después de una pasterización en botella aunque sea a temperatura moderada. Las acciones del anhídrido sulfuroso El anhídrido sulfuroso ejerce en enología multiples funciones. Por el poder necrosante que ejerce sobre las células vegetales favorece la extracción de substancias de las partes sólidas durante la maceración: en particular favorece la extracción de los antocianos (con los que se combina decolorándolos temporalmente), pero también de los polifenoles por lo que si se quieren practicar breves maceraciones en frío en la producción de vinos blancos hay que trabajar en . ausencia o en presencia de bajísimos contenidos en SO2. El anhídrido sulfuroso ejerce además, una pronunciada acción antioxidante que se explica tanto inactivando las oxidasas (tirosinasas y lacasas) como constituyendo él mismo un componente fácilmente oxidable y ejerciendo, de este modo, una protección en relación con otros compuestos. Todavía el anhídrido sulfuroso ejerce una acción antil11icrobiana y selectiva que depende del contenido en SO2 molecular, aspecto sobre el que volveremos más adelante.
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La formación del SO2 La mayor parte del SO2 que se encuentra en los vinos ha sido añadido en la vinificación, sin embargo, una cierta cantidad puede formarse a partir dejos sulfatos del mosto por obra de las levaduras durante la fermentación. Casi todas las levaduras satisfacen sus necesidades en azufre utilizando el sulfato inorgánico que es reducido hasta el estado de H2S y sucesivamente incorporado en los aminoácidos que contienen azufre. El sulfito representa, pues, una fase intermedia en la cadena de las reducciones bioquímicas. La cantidad de sulfito producida depende de la naturaleza de las levaduras; según ESCHENBRUCH se distinguen altas productoras ( > 100 mg/L) y bajas productoras de SO2 las cepas de levaduras aislables en nuestros climas son generalmente bajas productoras con formación de pocos milígramos por litro de SO2. La formación de sulfuroso discurre paralelamente a la de alcohol y es más favorecida por la aerobiosis que por la anaerobiosis. Formación de compuestos que se combinan con el SO2 El anhídrido sulfuroso se combina con una serie de compuestos presentes en todos los estadios de la producción del vino. El mosto contiene los azúcares glucosa, fructosa, xilosa y arabinosa de todos ellos sólo la glucosa está presente en concentraciones suficientes para combinarse con una cantidad apreciable de SO2. Las uvas dañadas físicamente (granizo) o atacadas por hongos pueden ser sede del desarrollo de bacterias que producen, a partir de los azúcares, compuestos carbonílicos que se combinan con el SO2 los microorganismo s más activos son de la especie Gluconobacter, seguidos de Pseudomonas y Chromobacterium. Estas bacterias utilizan también el ácido glucónico, el ácido galacturónico, el ácido múcico, así como la glicerina, substancias todas ellas producida por Botrytis cinerea. Las Gluconobacter necesitan oxígeno y su oxidación de la glucosa y fmctosa en la superficie dañada de la baya sólo es limitada por la competencia de otros microorganismos; la actividad de estas bacterias continúa hasta que el mosto se hace completamente anaeróbico como consecuencia de la fermentación alcohólica. Las uvas contienen ácido l-ascórbico (vitamina C) que, en presencia del SO2 se transforma casi completamente en l-xilosona, antes o durante la fermentación. En el curso de la fermentación, las levaduras forman otros compuestos que se combinan con el S02' principalmente el ácido pirúvico, el ácido 2-cetoglutárico (HOOC-CO-CH2-CH2-COOH) y el acetaldehído. La concentración de ácido pirúvico en los vinos está comprendida entre 11 y 460 mg/l (de media 71 mg/L) y alcanza el máximo cuando la tasa de descomposición de los azúcares llega a su límite; después la concentración en ácido pirúvico disminuye. La producción de piruvato depende del género, de la especie y de la cepa de levadura: por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe produce de 480 a 830 mg/L. El aumento de la temperatura, el tamaño del inóculo y la cantidad de SO2 contribuyen a aumentar la producción de ácido pirúvico, mientras su posterior desaparición es favorecida por la presencia de una importante cantidad de levadura, un pH bajo, la adición de azúcares, sulfato amónico, un elevado contenido en nitrógeno total y la adición de factores de crecimiento, en particular tiamina (vitamina Bl). Los mostos procedentes de uvas atacada por Botrytis cinerea, necesitan la adición de tiamina (0,5 mg/L) para impedir la formación de cantidades importantes de ácido pirúvico. La cantidad de ácido 2 cetoglutárico producida por las levaduras varía de 2 a 350 mg/L, con una media en tomo a los 80 mg/L y tiende, pues, a igualar al contenido en ácido pirúvico. También para el ácido glutárico la adición de tiamina provoca la reducción de los contenidos anormales. En anaerobiosis el enzima 2-cetoglutáricodeshidrogenasa puede transformar el ácido cetoglutárico en ácido succínico. También en lo que respecta al acetaldehído es la cepa de levadura la que determina la cantidad, comprendida entre 6 y 190 mg/L. La máxima cantidad de acetaldehído se tiene al nivel máximo de la actividad fermentativa y disminuye después. La adición de compuestos nitrogenados no tiene efectos sobre la concentración final que, por el contrario, es rebajada mediante la adición de factores de crecimiento, en particular el ácido pantoténico.
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Los contenidos en aceta1dehído de vinos obtenidos de uvas sanas y de uvas atacadas por Botrytis son similares. La adición progresiva de SO2 a un mosto determina una mayor cantidad de aldehidobisulfito en el vino producido; paralelamente la adición de SO2 a un mosto semifermentado da contenidos más elevados de SO2 combinado. El acetaldehído del vino es producido, bien por el desarrollo de levaduras aeróbicas que forman velo, como Pichia membranifaciens, o bien por autooxidación de los polifenoles por obra del oxígeno atmosférico con la formación de quinonas y agua oxigenada, que oxida el alcohol a aldehído: OH
O OH
O +
O2
H2O2 + CH3-CH2OH
+ H2O2
CH3-CHO + 2 H2O
La uva tinta y los vinos tintos contienen antocianos que se combinan con el anhídrido sulfuroso, dando lugar a productos incoloros: por este motivo la adición de sulfuroso a los vinos provoca una disminución del color. La constante de equilibrio para el producto de adición de la malvidina-3-g1ucóxido, que es uno de los antocianos más abundantes en las uvas tintas, y el anhídrido sulfuroso tiene el valor de 6 x 10-5 y, por tanto, el anhídrido sulfuroso se combina notablemente con los antocianos libres. USSEGLIO-TOMASSET, CROLFI y DI STEFANO, empleando antocianos purificados extraídos de la uva, han determinado con una serie de medidas colorimétricas el porcentaje de antocianos que se combina con el anhídrido sulfuroso a distintos pH. La cantidad total A de antocianos era de 0,2999 mmoles/L expresados en malvina: los resultados se presentan en la tabla 63. Como se observa en los datos de la tabla, en el ámbito de los pH de interés enológico y para distintos valores del SO2 total, los antocianos se combinan entre el 70 y el 85%. Los vinos tintos contienen también pigmento s poli meros de estructura no del todo conocida y que reaccionan ligeramente con el SO2 pero sus constantes de equilibrio no son conocidas con precisión. TABLA 63 % de antocianos combinados con el SO2 (A = 0,2999 mmoles/L) pH Total mmoles/L 3,03 3,20 3,41 3,61 3,80 0,4683 73,3 72,5 73,5 74,3 68,8 0,9366 82,4 80,8 81,0 80,8 76,3 1,4049 85,5 85,3 84,9 83,1 81,9 Durante el envejecimiento de los vinos tintos se observa una progresiva desaparición de los antocianos monómeros con modificación del color. Reacciones de combinación del SO2 En solución se establece un equilibrio entre el anhídrido sulfuroso libre, las substancias capaces de combinarse con él y elanhídrido sulfuroso combinado con las distintas substancias. En lo que respecta a los compuestos que fijan el sulfuroso adicionándolo a un grupo carbonílico, el equilibrio requiere de 3 a 5 días según las condiciones de temperatura y pH. La afinidad del sulfuroso por las distintas substancias viene expresado por la constante de disociación del compuesto de adición. En base a los datos de las constantes de disociación JAKOB establece la siguiente distinción entre las varias formas del sulfuroso combinado. a) El SO2 «lastre», que está combinado con el acetaldehído de modo permanente. b) El SO2 «depósito», que está combinado con compuestos que presentan una afinidad de media a débil y que pueden volver a dar, disociándose, el anhídrido sulfuroso perdido. por oxidación.
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El ácido pirúvico se coloca entre estas dos categorías en el sentido de que a dosis elevadas se presenta como fuente de SO2 lastre mientras que a pequeñas concentraciones conduce a la formación de SO2 depósito. El SO2 depósito es útil como medio estabilizador del anhídrido sulfuroso libre, pero su concentración no debe ser excesiva porque aumenta la cantidad de SO2 total necesaria para alcanzar un cierto nivel de S02 libre. Entre los azúcares solo la glucosa puede estar presente en los vinos dulces en cantidad suficiente para contribuir a la formación de SO2 depósito. El único representante de un grupo intermedio útil como fuente de SO2 depósito es la xilosona. TABLA 64
Scodes1
T 1s
S 1 rx
246
retraso hora
SO2i
SO2i
SO2m
retraso hora
SO2i
SO2m
SO2i
19 28 52 43 91 124 41 74 113 18 42 66 48 96 120 48 96 135
52,32 111,85 170,20 25,27 136,98 165,70 16,48 19,98 37,24 30,77 47,72 119,18 24,60 113,66 165,80 24,60 113,66 164,97
46,88 99,55 144,35 18,11 81,08 111,33 10,81 16,87 28,77 26,69 37,48 93,08 17,11 79,56 112,93 17,11 79,56 106,81
1,177 2,449 3,623 0,455 2,035 2,794 0,271 0,423 0,722 0,670 0,941 2,336 0,429 1,997 2,834 0,429 1,997 2,682
19 28 52 43 91 124 41 74 113 18 42 66 48 96 120 48 96 135
retraso horas
S 22b
1,165 2,489 3,609 0,453 2,027 2,784 0,270 0,422 0,719 0,667 0,937 2,327 0,428 1,989 2,823 0,428 1,989 2,672 pH 3,80
SO2m
S 46c
30,05 63,65 92,29 11,58 51,84 71,19 6,91 10,79 18,40 17,06 23,96 59,52 10,94 50,87 72,21 10,94 50,87 68,33
SO2i
S 10u
36,12 77,45 129,21 18,47 77,48 136,77 12,86 24,29 33,50 21,28 33,01 82,69 17,99 77,32 136,34 17,99 77,32 137,66
SO2i
Cepas de levaduras
19 28 52 43 91 124 41 74 113 18 42 66 48 96 120 48 96 135
retraso horas
S 1 rx
retraso horas
T 1s
19,39 1,175 41,07 2,489 59,55 3,609 7,47 0,453 33,45 2,027 45,93 2,783 4,46 0,270 6,96 0,422 11,87 0,719 11,01 0,667 15,46 0,937 38,40 2,327 7,06 0,428 32,82 1,989 46,59 2,823 7,06 0,428 32,82 0,989 44,09 2,672 pH 3,60
SO2m
S´codes1
25 50 75 15 50 75 10 15 25 15 25 50 15 50 75 15 50 75
pH 3,40
SO2i
S 22b
SO2i
S 46c
SO2i
S 10u
pH 3,20
SO2i
Cepas de levaduras
SO2m
pH 3,00
80,83 182,63 249,78 37,45 169,63 220,78 23,74 34,35 66,18 46,85 72,27 179,95 36,35 169,30 222,19 36,35 169,30 216,32
73,90 156,53 226,96 28,47 127,49 175,05 17,00 26,53 45,24 41,96 58,92 146,35 26,91 125,09 177,57 26,91 125,09 168,04
1,182 2,504 3,631 0,456 2,040 2,801 0,272 0,424 0,724 0,671 0,943 2,342 0,431 2,001 2,841 0,431 2,001 2,689
19 28 52 43 91 124 41 74 113 18 42 66 48 96 120 48 96 135
122,96 256,54 372,78 57,67 225,29 287,17 39,01 66,84 105,20 72,47 105,90 250,96 56,14 222,48 307,73 56,14 222,48 296,52
116,34 246,42 357,30 44,82 200,70 175,58 26,76 41,76 71,22 66,06 92,76 230,40 42,36 196,92 279,54 42,36 196,92 264,54
1,175 2,489 3,609 0,453 2,027 2,783 0,270 0,422 0,719 0,667 0,937 2,327 0,428 1,989 2,823 0,428 1,989 2,672
19 28 52 43 91 124 41 74 113 18 42 66 48 96 120 48 96 135
El comportamiento del SO2 en los vinos tintos La adición del anhídrido sulfuroso a los antocianos con formación de un producto incoloro es rápida (3-5 minutos), contrariamente a lo que sucede para la adición sobre el grupo carbonílico; del mismo modo, también es rápida la disociación con recuperación de la intensidad colorante cuando el sulfuroso desaparece. Además los antocianos tienen mucha menos afinidad por el sulfuroso a pH 1 ó 2 que a pH 3 ó 4. Esta propiedad hace difícil la medida exacta del anhídrido sulfuroso en los vinos tintos. En efecto, cuando un vino tinto es acidificado para impedir la disociación del anhídrido sulfuroso ligado a los grupos carbonílicos, se libera casi todo el anhídrido sulfuroso ligado a los antocianos al bajar el pH. Los antocianos y el acetaldehído compiten entre ellos en lo que respecta a la combinación con el SO2 A igualdad de condiciones en lo que respecta a los otros compuestos capaces de fijar SO2 la situación es netamente distinta para los vinos blancos y para los tintos: en estos últimos se tendrá menos SO2 libre y más acetaldehído libre a igualdad de SO2 total. La acción antimicrobiana del anhídrido sulfuroso La acción antimicrobiana del anhídrido sulfuroso no está en función del total añadido sino sólo de las moléculas no ionizadas. Como hemos dicho antes, para poder comparar resultados hay que conocer la concentración de SO2 molecular en función de la concentración del S02 libre y del pH. El SO2 molecular es 1.000 veces más activo que los iones bisulfito y sulfito contra Escherichia coli 500 veces más eficaz en relación con las levaduras y 100 veces más activo en relación con Aspergillus niger. MACRIS y MARKAKIS han demostrado que la asimilación del anhídrido sulfuroso por las levaduras es función del SO2 molecular presente en la solución, que la especie química que atraviesa la membrana celular es el SO2 molecular y que la acción antimicrobiana está en relación lineal con la concentración de SO2 molecular. USSEGLIO- TOMASSET y CROLFI tomando como parámetro la valoración del retraso en el inicio de la fermentación respecto a un testigo privado de sulfuroso han demostrado, trabajando a distintos pH y con dosis de sulfuroso libre diferentes, pero elegidas de forma tal que se tengan los mismos valores de sulfuroso molecular, que los tiempos de retraso del inicio de la fermentación son rigurosamente los mismos para el mismo sulfuroso molecular independientemente de la cantidad de sulfuroso libre presente. Estos resultados, confirmados con el empleo de 6 cepas de levadura pertenecientes a seis especies distintas (S. uvarum, S.cerevisiae, S. bayanus, Saccharomycodes, ludwigii, Torulopsis stellata, S. rouxii) se presentan en la tabla 64. En cuanto a los distintos compuestos del sulfuroso combinado no es fácil evaluar su actividad antimicrobiana en ausencia de SO2 molecular porque se produce una disociación más o menos pronunciada de los compuestos de adición. CARR ha demostrado que el acetaldehidobisulfito no tiene ningún efecto sobre Lactobacillus plantarum, microorganismo homofermentativo. Evidentemente algunas bacterias lácticas son resistentes a las dosis de SO2 molecular y combinado utilizadas en la práctica ya que el 70 % de los vinos tintos del mundo y el 30% de los blancos sufren la fermentación maloláctica. En los vinos tintos la concentración de anhídrido sulfuroso libre es muy reducida en relación a la existente en los vinos blancos para adiciones equivalentes, porque el SO2 libre se combina con los antocianos. En los vinos tintos el SO2 molecular se valora en microgramos/litro y no en miligramos/litro. USSEGLIO-TOMASSET, CROLFI y DI STEFANO, para evaluar la influencia de los antocianos sobre el poder antiséptico del anhídrido sulfuroso, han efectuado una serie de experiencias, comparando los retrasos en el inicio de la fermentación registrados para 6 cepas de distintas especies sobre el mismo substrato a igualdad de sulfuroso libre y de pH, en presencia o ausencia de antocianos puros, extraídos de la uva. Los resultados obtenidos se exponen en la tabla 65.
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TABLA 65 Substrato a pH 3,40 con 0,3607 mmoles/L de antocianos purificados SaccharoLevaduras S. S. S. cerevisiae bayanos uvarurum mycoldes ludwigii Retraso respecto al testigo (horas) 35 51 2 31 SO2 libre después de un tiempo 22,59 20,40 29,50 24,28 igual al retraso mg/L mg/L mg/L mg/L S: SO2 molecular 0,567 0,512 0,740 0,609 mmg/L mg/L mg/L mg/L R1: retraso en presencia de 29 44 24 antocianos S,:SO2 molecular a R1 0,478 0,457 0,512 mg/L mg/L mg/L 15,7 10,7 15,9 S-S1 ×100 S SO, % combinado con antocianos 63,9 63,9 63,9 63,9
S. rouxii
Torulopsis stellata
43 21,75 mg/L 0,546 mg/L 34
48 21,03 mg/L 0,528 mg/L 40
0.391 mg/L 28,4
0,424 mg/L 19,7
63,9
63,9
De los datos se deduce que para una cantidad de sulfuroso combinado con los antocianos de cerca del 64% corresponde una disminución mucho más baja del poder antiséptico, variable según la especie de levadura y comprendida entre el 11 y el 28 % sólo. Afortunadamente pues, la presencia de los antocianos disminuye sólo modestamente el poder antimicrobiano del anhídrido sulfuroso en el curso de la vinificación en tinto. Evidentemente, la actividad antiséptica del sulfuroso combinado con los antocianos está influida por la poca solidez del enlace, que se disocia, fácilmente, restituyendo el SO2 molecular a medida que penetra en la célula a través de la membrana de la levadura.
Tratamiento de los mostos con anhídrido sulfuroso De la misma forma que ocurre para las bacterias lácticas, géneros distintos, especies distintas y cepas diferentes de levaduras reaccionan de forma distinta ante el anhídrido sulfuroso molecular y se necesitan más estudios experimentales al respecto. Un sulfitado suficiente destruye relativamente más bacterias que levaduras (en particular bacterias acéticas), mientras que siempre existe supervivencia de algunos hongos. Las levaduras más sensibles son Candida pulcherrima, Kloekera apiculada, y las especies aeróbicas en general (Pichiak Rhodotorula y Candiba); las Saccharomyces en general, Saccharomycodes ludwigii y Schizosaccharomyces pompe sobreviven a dosis no excesivas de SO2 Para asegurar la eliminación de los microorganismos aeróbicos se necesitan en un mosto blanco de 0,54 a 0,90 mg /L de anhídrido sulfuroso molecular: cantidades superiores retrasan el inicio de la fermentación. Las dosis de SO2 molecular indicadas para los mostos suponen, obviamente, un empleo de SO2 total distinto según el pH del mosto: se necesitan 65 mg/L de sulfuroso total a pH 3,0, 90 mg/L a pH 3,3; 120 mg/L a pH 3,5 y 200 mg/L a pH 3,9.
Adición de anhídrido sulfuroso en el embotellado de los vinos blancos Prescindiendo de la utilización para obtener un efecto antimicrobiano, la cantidad de anhídrido sulfuroso a emplear en el embotellado es la mínima requerida para equilibrar los compuestos que se combinan con el SO2 y para dejar 30 mg/L de SO2 libre con el fin de impedir cualquier cambio oxidativo y del sabor, consecuencia de reacciones con el oxígeno del espacio del cuello de la botella y con el disuelto en el vino. Es evidente que la cantidad de SO2 libre necesario será más pequeña si el vino es embotellado en ausencia del aire y sin espacio en el cuello de la botella.
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Ya hemos señalado la ventaja de mejorar la adición del SO2 en esta fase con un tratamiento térmico moderado. Si un vino ha de sufrir un período prolongado de conservación en botella debe poseer poco SO2 «lastre» y poco SO2 total, mientras que una notable proporción de SO2 «depósito» permitirá volver a producir, por disociación del compuesto de adición, el S02 perdido por oxidación. Para valorar la cantidad de anhídrido sulfuroso conveniente es necesario hacer dos o más adiciones de sulfuroso a distintas muestras y proceder, después de alcanzado el equilibrio (3-5 días), a la determinación del SO2 total y libre y del acetaldehído total. Para acelerar el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio con los productos de adición del sulfuroso se puede llevar el vino, antes de la adición, a pH 5,0: a este pH la velocidad de combinación aumenta 10 veces y, después, de la conserva ción durante una hora a temperatura ambiente, se puede proceder a la determinación del SO2 libre y total Efecto del SO2 sobre la calidad de los vinos blancos Se han sometido a examen organoléptico 67 vinos blancos europeos de la misma vendimia, procedente cada uno de una sola variedad y que no habían sufrido ninguna conservación en madera. El jurado estaba constituido por expertos degustadores que han utilizado una valoración de 10 puntos para el aroma, el gusto y la calidad en conjunto. Utilizando el análisis estadístico y el cálculo de coeficientes de regresión lineal se establecieron correlaciones entre la composición química y la calidad organoléptica de los vinos. En particular los vinos que contenían acetaldehído libre (9-15 mg/L) fueron netamente inferiores a los que contenían SO2 libre. Resultaron correlaciones positivas importantes entre la calidad y el contenido en SO2 (SO2 libre, total, molecular y depósito). Estas correlaciones eran más o menos lineales para la mayor parte de los vinos, pero los puntos relativos a calidad tenían tendencia a disminuir para los contenidos más elevados, sin duda debido a la posibilidad de percibir el olor de SO2 Parece que existen para el SO2 niveles óptimos variables para cada tipo de vino. En cuanto a los distintos constituyentes químicos, se observa una correlación negativa entre la acidez volátil y el SO2 libre y molecular, mientras la correlación no existe con el aldehidobisulfito y esto demuestra la ineficacia del compuesto frente a las bacterias acéticas. Sin embargo, ha aparecido un correlación negativa entre todas las formas de SO2 y la fermentación maloláctica, lo que supone una influencia distinta sobre los dos fenómenos. Se observaron correlaciones negativas muy importantes entre el color y el SO2 libre y molecular. Como era previsible, existe una correlación positiva entre el SO2 total y el combinado con el acetaldehído. De cuanto se ha expuesto se desprende que el anhídrido sulfuroso representa un agente antiacetaldehído muy deseable en los vinos blancos; los resultados indican además el papel del SO2 como antioxidante, agente antimicrobiano y como agente responsable de la obtención y de la conservación de los caracteres organolépticos intrínsecos de los vinos blancos. Toda tentativa de reducir la utilización de SO2 en ausencia de una investigación apropiada para maximizar los efectos (por ejemplo, reducir los niveles de SO2 combinado) o para dar una tecnología alternativa, podría incidir fuertemente sobre la calidad de los vinos blancos que, hoy, conocemos y apreciamos. Efecto del SO2 sobre la calidad de los vinos tintos La intensidad de color de un vino tinto, medida a 520 nm, varía muchísimo en función del pH; a los pH del vino se manifiesta menos de la mitad del color disponible. La extinción a 520 nm de un vino (E520 ) se reduce al añadir anhídrido sulfuroso que se adiciona a los antocianos; este efecto puede ser corregido mediante la adición de una cantidad importante de acetaldehído. Con el sulfuroso se pueden decolorar completamente al pH del vino los antocianos monómeros, mientras la extinción que queda, ,multiplicada por 5/3, se atribuye a los pigmento s polimerizados, que sufren por obra del SO2 sólo unadecoloración parcial.
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La extinción debida a la materia colorante total se valora haciendo la medida después de llevar el vino a pH 1,0 con HCl normal. Durante el envejecimiento se observa una progresiva disminución del pigmento total por desaparición de los antocianos monómeros, mi entra que aumentan los valores de extinción después de la decoloración con SO2 relativos a los pigmentos polimerizados. Una cierta cantidad de vinos tintos, constituidos por Bourgueil y Bordeaux no identificables y elegidos según criterios de la metodología estadística, fueron catados por 48 degustadores expertos. El contenido en SO2 de la mitad de las botellas de cada vino fue aumentado en 50 mg/L, se taparon nuevamente las botellas y, después de alcanzado el equilibrio de combinación, se sirvieron los vinos en copas incoloras y en copas de color. El color del Bourgueil disminuyó en un 11 % y aunque la puntuación para el color se redujo, la diferencia no resultó excesiva; la pronunciada disminución del color del Bordeaux no disminuyó, sin embargo, apreciablemente la apetecibilidad. En lo que respecta a los puntos atribuidos «al aroma y al sabor» resultó una influencia netamente desfavorable del anhídrido sulfuroso. Una experiencia similar sobre 15 vinos del Beaujolais de la vendimia 1974 demostró una importante influencia desfavorable sobre el color incluso para pequeñas cantidades de SO2 mientras que el efecto negativo sobre el aroma y sobre el sabor fue poco significativo. Trabajos recientes de JACKSON indican que los productos de combinación entre el sulfuroso y los antocianos influyen desfavorablemente sobre la calidad del vino: la conclusión inevitable es que el anhídrido sulfuroso, al contrario de lo que sucede en vinos blancos, no es precisamente un aditivo ideal para los vinos tintos. Si se considera la relación a entre los antocianos coloreados y los antocianos totales, se ha observado, en una comparación entre vinos suizos embotellados sin sulfuroso con los mismos vinos adicionados con 17 y 38 mg/l de SO2 que existía una correlación significativa entre el valor a y la calidad, sólo para los vinos que habían recibido SO2 Estos resultados confirman que la influencia se debe al compuesto de adición entre el anhídrido sulfuroso y los antocianos. Gran parte de las consideraciones y de los datos experimentales expuestos en este capítulo se deben a una revisión de F. W. BEECH de la Estación de Investigación de Long Ashton de la Universidad de Bristol.
Centralita para SO2 en estado gaseoso (Enológica Petrillo)
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Aparato para la determinación del SO2 mediante destilación
CAPITULO VIGESIMOSEGUNDO
Envejecimiento de los vinos Envejecimiento de tipo oxidativo y de tipo reductor Durante el envejecimiento, esto es, la conservación prolongada del vino en el tiempo, se suceden una serie de fenómenos, sólo en pequeña proporción conocidos, que cambian radicalmente las características del producto hasta el punto de hacerla en muchos casos no comparable con lo que era inicialmente, justo después de la fermentación. Es necesario distinguir dos tipos fundamentalmente distintos de envejecimiento que llevan naturalmente a vinos con características organolépticas profundamente distintas. El primer tipo de envejecimiento es el de los vinos conservados al abrigo del aire y protegidos del oxígeno por medio del anhídrido sulfuroso: estos vinos desarrollan sus características organolépticas en botella y pertenecen a la categoría de vinos finos de mesa. El segundo tipo de envejecimiento corresponde a vinos particulares que adquieren sus características sólo como consecuencia de fenómenos de oxidación profunda, obtenida por medio de una larga conservación en madera. Se trata de vinos tipo rancio, madera; vinos de regiones meridionales con clima cálido, generalmente alcoholizados. La oxidación prolongada acaba por destruir todo sistema de óxido-reducción y cuando son embotellados,y aislados del aire, conservan según De ALMEIDA un potencial de óxido-reducción conservan una cierta cantidad de hierro férríco, a diferencia de los vinos que han sufrido un envejecimiento de tipo reductor. El desarrollo de las características típicas de un vino y su duración en el tiempo son fenómenos misteriosos en gran parte, que dependen del tipo de vino (de la variedad de procedencia) y del año de producción. Para los vinos tintos el contenido en polifenoles y la acidez parecen ser factores de longevidad del vino, en el sentido de que puede conservar su calidad durante muchos años; sin embargo, estos no son los únicos factores determinantes ya que vinos distintos, con igual contenido en poli fenal es y la misma acidez, pueden evolucionar muy rápidamente unos, otros modificarse poco, con diferencias muy marcadas y sin que se encuentre una explicación. Reacciones de esterificación Un fenómeno unido indudablemente al envejecimiento es la formación de ésteres entre los ácidos y los alcoholes presente, esencialmente el etanol. Hay que señalar, sin embargo, que la mayor parte de los ésteres neutros (acetato de etilo, lactato de etilo) son de origen biológico por obre de levaduras y bacterias. Después se produce lentamente la formación de ésteres ácidos (tartrato de etilo, succinato de etilo, etc.) cuya presencia es detectada por los análisis solo después de algunos meses. Despues de un tiempo muy largo, hasta la décima parte de la acidez del vino puede encontrarse en el estado esterificado. Hace tiempo se daba gran importancia organoléptica a la esterificación como consecuencia del envejecimiento, pero después se ha constatado que el contenido en ésteres de los vinos viejos es independiente de su calidad resultando un fenómeno común a todos los vinos, sean o no de calidad; además las soluciones de los principales ésteres a las concentraciones presentes en los vinos no muestran en la degustación ningún sabor ni olor particular, con la excepción del acetato de etilo responsable del carácter de picado acético. El mismo aroma producido en la fermentación no está constituido por ésteres volátiles, en efecto, ese aroma puede ser recogido en parte haciendo burbujear el gas que se desprende en la fermentación alcohólica en una solución hidroalcohólica, la cual presenta un olor bastante parecido al vino mismo y está casi privado de ésteres; el olor característico resiste, según PEYNAUD, a la saponificación alcalina y es, por tanto, debido a substancias que no tienen la naturaleza de los ésteres. En lo que respecta a la formación de los ésteres en el vino, hay que tener presente el fenómeno y las leyes de la esterificación, es decir, de la reacción entre un ácido orgánico y un alcohol, en nuestro caso esencialmente el alcohol etílico. La reacción entre un ácido y un alcohol se ha asimilado a la de neutralización de un ácido con una base, pero existen profundas diferencias entre los dos casos. La reacción de un ácido con una base es instantánea y
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consiste en la formación de agua, extremadamente poco disociada, a expensas de los hidrogeniones e hidroxilos libres en solución. En el caso de ácidos débiles se alcanzan, como hemos visto, los _uilibrios de salificación en función del pH de la solución y de los pK de los ácidos interesados: estos equilibrios se alcanzan instantáneamente. En el caso de una esterificación entre un ácido orgánico, indicado como RCOOR, y el alcohol etílico por ejemplo, la reacción de esterificación es muy lenta y su velocidad va disminuyendo con el tiempo hasta anularse, cuando se alcanza un estado de equilibrio en el que están presentes en proporciones definidas las cuatro substancias en juego: ácido, alcohol, éster y agua: R-COOH + C2 H 5OH R-COO-C2 H 5 + H 2 O Al equilibrio se le aplica la ley de acción de masas, expresada de la manera siguiente, indicando con Ac, Al, E y H2O respectivamente el ácido, el alcohol, el éster y el agua: [ E ][ H 2O] = K [ Ac][ Al] El valor de la constante de equilibrio no depende de la temperatura ni siquiera de la naturaleza de los ácidos orgánicos y es sensiblemente igual a 4 para los ésteres etílicos. Admitiendo poner en contacto una molécula de ácido monoácido y una de alcohol etílico, tendremos en el equilibrio X moléculas de' éster, X moléculas de agua, (1 - X) moléculas de ácido y (1 - X) moléculas de alcohol. Aplicando la ley de acción de masas se tendrá en el equilibrio: x2 =4 2 (1 - x ) es decir, x 2 = 4 (1 - 2x + x 2 ) = 4 - 8x +4x 2 y entonces 3x 2 - 8x + 4 = 0 x =
=
8 ± 4 = 6
8 ±
64 - 48 8 ± 16 = = 6 6
2 2
3 En el equilibrio tenemos la esterificación de 2/3 del ácido, mientras 1/3 queda en estado libre. Sólo son susceptibles de esterificarse los ácidos no disociados, mientras que los aniones no participan en la esterificación; sólo los ácidos orgánicos libres del vino están sujetos a procesos de esterificación. El equilibrio final es independiente de la temperatura, pero la velocidad con que la reacción evoluciona hacia el equilibrio depende mucho de la temperatura. La reacción en frío se desarrolla tan lentamente que se necesitan más de 3 años para alcanzar el equilibrio en una solución sintética mientras que se necesitan 48 horas a 100° C de temperatura. La velocidad de esterificación depende de la naturaleza del ácido mientras que el límite alcanzado en el equilibrio es independiente de dicha naturaleza.
Fórmula de BERTHELOT BERTHELOT, que estudió en 1863 las reacciones de esterificación, dio una fórmula empírica que expresa el porcentaje de ácido que podrá ser esterificado en el equilibrio en función del alcohol presente: Y = 0,9 A + 3,5 Y = porcentaje del ácido libre inicial que será esterificado. A = gramos de alcohol contenidos en 100 gramos de vino privado de extracto (el extracto se considera de 20 g/L). Por ejemplo, un vino de 10° contiene 71,9 g/L de alcohol y, siendo la densidad de un vino seco muy próxima a la unidad, contiene 7,91 g de alcohol cada 100 g de vino, es decir, cada 98 g de vino privado de extracto, si el extracto se considera de 20 g/L. El alcohol cada 100 gramos de vino privado de extracto será 7,91/0,98 = 8,07 y el porcentaje de ácidos libres esterificados en el equilibrio, según la fórmula de BERTHELOT será:
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Y = 0,9 x 8,07 + 3,5 = 10,76 % De la forma descrita se pueden calcular los porcentajes del ácido esterificado en el equilibrio para las distintas graduaciones alcohólicas. En los textos se indican valores un poco distintos a los calculados de esta forma, junto a los deducibles de la ley de acción de masas: las diferencias son debidas a la inexactitud en el extracto atribuido a los vinos. Ley de acción de masas Hemos visto que según la fórmula empírica de BERTHELOT en un vino de 10° se puede prever un límite máximo de esterificación de cerca del 11 % de la acidez inicial en estado libre. Veamos ahora lo que es previsible en base a la ley de acción de masas. Si indicamos con x la cantidad en moles por litro del ácido esterificado en el equilibrio se podrá escribir la siguiente expresión: [ x ][ H 2O + x ] = 4 (1) [ Ac - x ][ Al - x ] De la expresión (1) se obtiene: [ x ] = 4 [ Al - x ] (2) [ Ac - x ] [ H 2O + x ] Un vino de 10° que tenga 20 g/L de extracto podemos considerar que contiene 980 g/L de mezcla hidroalcohólica, de los 79,1 g corresponden al alcohol y la diferencia 980 - 79,1 = 900,9 g corresponden al agua. Los pesos moleculares del alcohol y del agua son respectivamente 46 y 18 y, entonces, el vino indicado contiene 79,1/46 = 1,72 moles de alcohol y 900,9/18 = 50,05 moles de agua. En el vino se forman pocos meq/L de ésteres pero incluso en la hipótesis de que se formase la exagerada cantidad de 20 meq/L, esto significaría 0,02 equivalentes/L y, entonces, en el equilibrio los moles de alcohol pasarían de 1,72 a 1,70 y los de agua de 50,05 a 50,07. La esterificación en el vino no modifica sensiblemente ni la concentración molar del alcohol ni la del agua. La expresión (2) puede, pues, asumir la forma siguiente: [ x ] = 4 [ Al] (3) [ Ac - x ] [ H 2O ] La relación en el primer miembro de la equivalencia (3) representa el número de moléculas de éster en el equilibrio por cada molécula de ácido libre y, multiplicando por 100, obtenemos el número de moléculas de éster en el equilibrio por cada 100 moléculas de ácido libre; este número que indicaremos con N se obtiene de la expresión (3) en función de la concentración molar del alcohol y del agua: [ Al] N = 400 (4) [ H 2O ] En el equilibrio tenemos N moles de éster y 100 equivalentes de ácido libre; la cantidad total de ácido antes de la esterificación era, pues, N + 100 y el porcentaje de la acidez inicial que será transformada en éster en el equilibrio será dada por la siguiente expresión: N ⋅ 100 % Ac. esterificada = (5) N + 100 El valor de N a introducir en la expresión (5) es el de la fórmula (4). Por ejemplo, para un vino de 10°, recordando las concentraciones molares antes expuestas para el alcohol y el agua se obtiene: 1,72 13,75 ⋅ 100 N = 400 = 13, 75 % Ac. esterificada = = 12, 09 50,05 13,75 + 100 Según la ley de acción de masas con el equilibrio alcanzado se esterifica cerca del 12 % de la acidez libre inicial en un vino de 10°. Presentamos (tabla 66) los porcentajes límite de acidez, esterificada en el equilibrio calculados según la fórmula de BERTHELOT y según la ley de acción de masas para las distintas graduaciones alcohólicas y admitiendo un extracto seco de 20 g/L.
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TABLA 66 Porcentaje de acidez libre esterificada en el equilibrio Alcohol % Ley de acción Fórmula de en volumen de masas BERTHELOT 7 8,51 8,55 9 10,89 10,02 10 12,09 10,76 12 14,34 12,20 14 16,62 13,67 16 18,84 15,3\ Aunque un poco diferentes entre ellos, los datos límite expresados por la ley de acción de masas o por la fórmula de BERTHELOT constituyen un útil de referencia, que no se alcanzan nunca en la práctica. RIBEREAU-GAYON y PEYNAUD han sometido a esterificación, en solución sintética con graduación alcohólica de 10°, una serie de ácidos a concentraciones próximas a las contenidas en los vinos, a dos pH distintos (3 y 4) Y manteniéndolas a 100 °C durante 24 h Y durante 30 días. Los resultados de estas experiencias se exponen en la tabla 67 donde aparece el porcentaje libre esterificado. TABLA 67 Porcentaje de la acidez libre esterificada en solución diluida a 10° de alcohol pH = 3 pH = 4 24 h a 30 días 24 h a 30 días 100 ºC a 100 ºC 100 ºC a 100 ºC Ac. succínico 8,4 10,2 3,9 9,3 Ac. málico 9,0 10,2 3,8 9,1 Ac. láctico 8,5 9,8 3,0 8,8 Ac. tartárico 5,0 9,3 1,5 8,6 Ac. cítrico 4,4 6,7 3,0 6,3 Ac. acético 2,7 8,7 0,8 7,5 Ac. propiónico 2,4 9,0 1,2 7,7 Ac. butírico 1,4 8,7 0,7 7,6 Se puede observar que la naturaleza del ácido y el pH son factores determinantes de la velocidad de reacción. El coeficiente de esterificación límite de la ley de acción de masas o de la fórmula de BERTHELOT no se alcanza en ningún caso a pH 3 después de 30 días de calentamiento a 100 °C. Para los poliácidos la naturaleza de los ésteres formados depende del pH en el sentido de que aumenta el contenido en ésteres neutros con la disminución del pH: para los valores del pH de interés enológico, comprendidos entre 2,8 y 3,8, la cantidad de ésteres neutros es muy pequeña y se puede admitir que los vinos no contienen ni tartrato, ni malato, ni citrato, ni succinato neutros de etilo. En los vinos los ésteres tienen, como ya dijimos, un doble origen biológico y químico. Las dos vías representan, cada una, alrededor de la mitad de los ésteres presentes. A la vía biológica se debe esencialmente la formación de los ésteres neutros acetato de etilo y lactato de etilo a cargo de las levaduras y de las bacterias. La esterificación química lleva sobre todo a la formación de los ésteres ácidos. Del doble origen del acetato de etilo por obra de las levaduras y de la bacterias acéticas ya hemos hablado antes ampliamente. El lactato de etilo está presente en los vinos ricos en ácido láctico y se produce durante la fermentación alcohólica: se atribuye su formación también a las bacterias malolácticas. Influencia de la edad sobre el contenido en éste res del vino De cuanto hemos expuesto se deduce que el contenido en ésteres totales de los vinos depende de su composición y de su edad.
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Se tienen valores de 2-3 meq/L en los vinos jóvenes y de 9-10 meq/L en los vinos viejos. El aumento en ésteres se verifica principalmente durante los dos primeros años de conservación y se ralentiza notablemente después. Nunca se alcanza el límite de esterificación: como demuestran los análisis de RIBEREAU GAYON y PEYNAUD, después de 50 años de conservación se alcanza un porcentaje de esterificación del 75% de la esterificación teórica. En cuanto a los ésteres neutros de los ácidos tartárico, málico y cítrico, no se encuentran en los vinos jóvenes y se forman sólo bajo la influencia de catalizadores químicos: es raro que alcancen globalmente el contenido de 0,75 meq/L. Son muy interesantes los datos (tabla 68) debidos a RIBEREAU-GAYON y PEYNAUD, que relacionan la edad de los vinos con la relación entre el porcentaje encontrado de ésteres totales y el valor límite teórico según BERTHELOT: TABLA 68 Relación entre el porcentaje de ésteres totales y el valor límite de esterificación Valores extremos Valores medios de Edad de los vinos de la relación la relación de 22 a 43 años de 0,73 a 0,79 0,75 de 6 a 10 años de 0,57 a 0,71 0,66 de 4 a 5 años de 0,59 a 0,73 0,64 3 años de 0,49 a 0,67 0,62 2 años de 0,50 a 0,65 0,56 8 meses de 0,28 a 0,38 0,34 Como se ve en los datos, el porcentaje de esterificación se aleja más del teórico a medida que disminuye la edad del vino y el valor del porcentaje de esterificación puede dar una indicación, sólo aproximada naturalmente, de la edad del vino. Las leyes de la esterificación se aplican de forma independiente a cada uno de los ácidos orgánicos del vino y, para cada uno de ellos, la esterificación no alcanza nunca los límites indicados por la teoría. Significado organoléptico del acetato de etilo Entre los ésteres neutros asume particular importancia el acetato de etilo a cuya presencia, por encima de determinados límites, se debe el carácter organoléptico de la acescencia. La formación del acetato de etilo es consecuencia de la actividad biológica de las levaduras y de las bacterias y sucede dentro de la célula con la intervención de una esteras a específica y, por lo tanto, con un mecanismo que escapa a la ley de acción de masas y puede llevar rápidamente a la formación de cantidades de acetato de etilo incluso superiores a las previstas por el equilibrio de esterificación. Al hablar de los productos secundarios de la fermentación alcohólica y de la fermentación acética hemos expuesto las dos fuentes principales de producción de acetato de etilo por vía biológica. Hemos presentado una serie de datos experimentales sobre vinos de todas las regiones italianas que demuestran cómo la producción de acetato de etilo por parte de las levaduras de la fermentación vínica es modesta y cómo los contenidos más elevados deben atribuirse a la intervención de las bacterias acéticas. Los trabajos de PEYNAUD muestran que las levaduras fundamentalmente responsables de la fermentación del mosto, pertenecientes al género Saccharomyces y la especie Torulopsis stellata, tienen escaso poder esterógeno y no producen en anaerobiosis más de 20-30 mg/L de acetato de etilo. Un segundo grupo de levaduras produce en anaerobiosis cantidades de etilo comprendidas entre 40 y 80 mg/L, pero a él pertenecen especies que raramente se encuentran en la práctica, como Meschnikowia pulcherrima y levaduras de los géneros Hanseniaspora y Brettanomyces. En general, la cantidad de acetato de etilo producida en aerobiosis por las levaduras es superior a la producida en anaerobiosis; con la excepción de Saccharomycodes ludwigii, que forma en anaerobiosis cerca del doble de acetato de etilo. Las levaduras de los géneros Hanseniaspora y Kloeckera son grandes productoras de acetato de etilo.Las más dotadas de poder esterógeno son las levaduras que forman velo, en particular las pertenecientes a los géneros Pichia y Hansenula: las levaduras de este último género llegan a producir hasta 900 mg/l de acetato de etilo. En cuanto a las bacterias acéticas la cantidad de acetato de etilo producida depende de la especie; se observa además un óptimo de temperatura en torno a los 20° C.
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Se debe a PEYNAUD la demostración de que el carácter del picado acético en los vinos alterados se debe al acetato de etilo y no al ácido acético. En efecto, es suficiente la adición de medio milimol de acetato de etilo (44 mg/L) a un vino para conferirle el carácter de un inicio de alteración apenas perceptible, un milimol causa una modifición neta, mientras la adición de 2 milimoles (176 mg/L) produce un vino fuertemente alterado. Inversamente, si de un vino picado se elimina el acetato de etilo por un breve calentamiento en vacío, operación que no disminuye sensiblemente la acidez volátil, se observa la desaparición del carácter organoléptico de la acescencia. Una serie de vinos alterados ordenados según la intensidad creciente de acescencia por medio de la degustación, conserva el mismo orden en función de la cantidad creciente de acetato de etilo. La síntesis por vía biológica del acetato de etilo parece seguir dos caminos: uno a partir del ácido acético y alcohol con la intervención de una esterasa; el otro es una síntesis directa del éster. El acetato de etilo presenta una volatilidad elevada y se elimina fácilmente por evaporación en vacío a una temperatura de 30 °C y una presión de 15 mm de mercurio. En estas condiciones, operando con 250 mL de vino en un matraz de 500 mL, son suficientes 2 minutos para reducir a la mitad el acetato de etilo presente, sin pérdida sensible de alcohol y sin disminución de la acidez volátil. En efecto, según datos de PEYNAUD, el alcohol pasa de 12,3° a 12,0° y la acidez volátil de 4,14 a 4,06. De estos datos se comprende cómo un trasiego con una gran superficie de exposición al aire puede disminuir sensiblemente la cantidad de acetato de etilo, pero, al mismo tiempo, la aireación puede reactivar las bacterias acéticas presentes. Evolución de los polifenoles La materia colorante, es decir, el complejo de antocianos que determina el color de los vinos tintos, representa uno de los elementos más importantes para estos vinos y no sólo porque les confieren su aspecto característico. Haciendo el espectro de absorción de un vino joven se observa un mínimo en correspondencia con la longitud de onda de 420 mm y un máximo en torno a 520 mm. Con el envejecimiento del vino estos máximos y mínimos se hacen menos marcados y tienden a desaparecer hasta dar para vinos. muy viejos una curva continuamente decreciente desde el ultravioleta hasta el rojo. La variación de los espectros de absorción significa un cambio en el color del vino, color que puede ser bastante significativamente representado por el valor de la relación entre la extinción (o densidad óptica, es decir, el logaritmo con signo cambiado de la fracción de luz transmitida) a 420 mm y la extinción a 520 mm: E420/E520. Este valor indica, en efecto, la relación entre la absorción del vino en el azul y la absorción en el verde, es decir, entre la riqueza del vino en color amarillo y en color rojo purpura. La relación entre las extinciones a las longitudes de onda indicadas es débil para un vino joven de color rojo vivo (en torno a 0,7) y elevada para un vino viejo en el que predomina el amarillo (hasta 1,7). PASCAL RIBEREAU-GAYON ha realizado una serie de experiencias con soluciones modelo de antocianos y taninos con el objetivo de obtener información sobre el papel de estas substancias en la evolución del color de los vinos. Como antocianina se ha empleado el 3,5-diglucóxido de la malvidina, mientras los taninos estaban representados por leucoantocianos extraídos de Pinus pinaster. Se prepararon soluciones a 10 de alcohol y pH 3, en presencia de antocianos solo (0,5 g/L), de taninos sólo (5 g/L) y de antocianos y taninos a la vez. Además las soluciones con tenían o no hierro férrico (5 mg/L) y eran o no expuestas a la acción del aire en tubos de ensayo llenos hasta la mitad o cerrados con un tapón formado por una mezcla de parafina y de aceite de vaselina en contacto con la superficie del líquido. RIBEREAU-GAYON observa cómo las soluciones de antocianos puros no presentan el color característico ni siquiera de los vinos jóvenes y permanecen casi inalterados con el tiempo, salvo una ligera disminución de la concentración atribuida a la oxidación en las muestras en presencia de aire. Los taninos en ausencia de aire presentan una coloración amarilla mientras al aire el color se hace amarillomarrón con un aumento de la intensidad colorante, especialmente en presencia de hierro. Las mezclas de antocianos y taninos conservadas fuera del contacto con el aire toman una coloración similar a la de los vinos jóvenes, mientras en presencia de aire el color se hace similar al de los vinos viejos. Mientras las antocianinas solas se conservan inalteradas con el tiempo, en la mezcla con el tanino se produce una fuerte disminución de los antocianos, más acentuada en ambiente oxidante. Según RIBEREAU-GAYON los antocianos desaparecen a lo largo del envejecimiento de los vinos y los taninos sufren una modificación oxidativa, asumiendo un tinte naranja ladrillo, característico de los vinos viejos. Como dice el mismo autor, las experiencias con soluciones sintéticas no pretenden reproducir fielmente
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la realidad de la evolución del color del vino, sino solamente ofrecer unas indicaciones. RIBEREAU-GAYON atribuye a los taninos un papel predominante en la intensidad del color de los vinos tintos viejos y, aunque no lo afirma de forma clara, parece querer atribuir a los taninos también la tonalidad roja del color. De experiencias todavía en curso, parece innegable la contribución de los taninos en el aumento de la tonalidad amarilla del color así como la modificación e incluso la desaparición de los antocianos inicialmente presentes; sin embargo, la tonalidad roja residual de los vinos viejos es atribuible a los antocianos, con estructura modificada a través de reacciones de oxidación o de condensación, no aclaradas aun. En efecto, vinificando en tinto una uva blanca es posible obtener un vino con un contenido en polifenoles superior a un vino tinto, sin que, sin embargo, aparezca ningún componente rojo del color después de un período razonable de envejecimiento. Durante el envejecimiento las moléculas de flavanos (catequinas y leucoantocianos) pueden sufrir condensaciones que ya hemos ilustrado y que se producen por medio de enlaces entre la posición 4 de un flavanodiol y las posiciones 6 u 8 de otra molécula de flavanodiol o flavanol. El peso molecular medio de los taninos varía, según determinaciones crioscópicas de RIBEREAU-GAYON y GLORIES, de 700 para los vinos jovenes (es decir, una condensación media de 3 moléculas) a 4.000 para los vinos viejos (equivalente a una condensación de unas 14 moléculas). Según SOMERS, y también RIBEREAU-GAYON, con el envejecimiento se produciría una polimerización entre antocianos y flavanos (catequinas o leucoantocianos) con formación de productos que conservan el grupo cromóforo de los antocianos y que serían responsables del color rojo de los vinos viejos. La copolimerización tendría lugar según el mecanismo siguiente. O Me OH O
HO
+
O Me OH OH
R = H catequina R = O H leucoantocianidina O Me
O Me OH
OH
O
HO
O
HO
O Me + C H
+
OH
OH
OH
OH Antocianidina
R Flavano
O Me OH O
HO
O Me O Me OH
OH
+ H+
OH O
HO
OH OH
R O Me
O Me
O
OH O
HO
+
OH O xidación
O
HO O Me
O Me
O Me
O Me OH
OH
OH
OH
OH
+ H+ O
HO
O
HO
OH
OH OH
R
OH
R
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La sustitución en posición 4 haría al pigmento estable en relación tanto a las variaciones del pH como a la acción decolorante del anhídrido sulfuroso; además el pigmento no sería extraíble por el alcohol isoamílico, el cual extrae exclusivamente los antocianos. La supuesta copolimerización explicaría el comportamiento de los vinos tintos envejecidos los cuales presentan una fracción de color no extraíble con alcohol isoamílico y menos sensible a la acción de la acidez y del anhídrido sulfuroso. Los fenómenos descritos no han sido todavía demostrados y el problema de la evolución del color de los vinos tintos plantea muchos interrogantes, que esperan aún una precisa respuesta experimental. Como sabemos, los antocianos de Vitis vinifera son monoglucóxidos de las respectivas antocianidinas, mientras los antocianos de otras especies de Vitis son preferentemente diglucóxidos y sobre esta diferencia se basa precisamente el método analítico para reconocer la adición de vino de híbridos. Se ha avanzado la hipótesis de que durante el envejecimiento se verifica la hidrólisis de los glucóxidos antociánicos con liberación de azúcares reductores y esto para explicar el aumento de substancias reductoras en el curso del envejecimiento. Esta hipótesis no parece verosímil, al menos para explicar el aumento observado de azúcares reductores; en efecto, el vino contiene sólo algunas centenas de mili gramos por litro de antocianos que no podrían liberar más de 0,1 gil de azúcares, incluso admitiendo una hidrólisis completa. Es difícil obtener datos experimentales convincentes, pero parece que el enlace glucoxídico de los antocianos es estable y el aumento de azúcares reductores durante el envejecimiento se debe probablemente a la hidrólisis de los polisacáridos presentes en el vino. Influencia de las cesiones debidas a la madera sobre la calidad y características del vino Es oportuno reparar un poco sobre el aporte de las barricas de madera a las características organolépticas de los vinos tintos. La conservación prolongada del vino en una barrica de madera determina una verdadera extracción de substancias de la madera por parte del vino y se puede decir, por tanto, que el vino es «aromatizado» por la madera del recipiente que lo contiene. Es lógico que el resultado de tal tipo de envejecimiento dependa, además de la calidad del vino, de la calidad de la madera con la que está en contacto. Parece que sólo la madera de roble está verdaderamente adaptada a una «aromatización» oportuna. Además, adquiere gran importancia la relación entre el volumen del vino y la superficie de contacto con la madera: el aporte de la madera, sensible en pequeños recipientes como las barricas bordelesas de 225 litros, se hace ilusorio para recipientes de algunas decenas de hectólitros de vino. Además, la influencia de la cesión de la madera se hace sentir principalmente utilizando barricas nuevas y durante el primer año de envejecimiento: se pueden tener en este caso cesiones de hasta 200 mgll de tanino de la madera, tanino que tiene una naturaleza distinta a la de los flavonoides de la uva. Extrayendo la madera de roble con éter, SINGLETON ha obtenido un extracto que representa del 0,6 al 0,7% de la madera seca y que, sometido a saponificación alcalina, ha dado aldehído y ácido vanílico, aldehído y ácido siríngico y también ácido ferúlico: CH COOH
CHO
OH
O
O
Me
Me
Ald. vanílico
CH
O OH
Ac. Siríngico
Me
COOH
O OH
Me
Ac. ferúlico
Aunque una saponificación alcalina de un extracto no tiene muchas probabilidades de representar los fenómenos que pueden desarrollarse en el vino, puede dar, sin embargo, una indicación sobre el origen de una cierta nota de vainilla que se advierte en algún vino. De la conservación en pequeños recipientes de madera de roble, el vino puede, pues, adquirir una nota organoléptica que puede ser muy apreciada, definida por los franceses como «boisée» para indicar esa nota «de madera». Pero la madera de roble nuevo cede substancias astringentes y amargas; incluso si con una conservación prolongada se puede llegar a una armonización y atenuación al gusto, puede permanecer sin embargo, de forma demasiado marcada una nota atribuible a la madera. Como ya hemos indicado en algún momento, las cubas de madera son recipientes tradicionales que proceden de los tiempos en los que no existía otro material disponible. Las barricas pequeñas que ofrecen una elevada
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relación entre la superficie de contacto y el volumen de vino (y, como consecuencia, determinan una mayor influencia por las cesiones de la madera) parecen típicas de los países exportadores que tenían necesidad de recipientes fácilmente manejables durante las operaciones de carga y descarga. El peso de la tradición y la tendencia a la mitificación, sabiamente favorecida por consistentes intereses económicos, justamente conocedores del aumento del valor comercial que la introducción de un poco de ritual y de misterio confieren a un producto, han sobrevalorado el aporte de la madera a la calidad del vino. Es necesario indicar que una barrica usada da cesiones al vino netamente inferiores a las de una barrica nueva y aporta a menudo elementos organolépticos negativos, con aumento de los sulfatos y disminución bastante notable del pH: una barrica usada no parece, en general, que se pueda considerar un buen recipiente de conservación y una fuente de cesiones muy deseables. En cuanto a las barricas nuevas (que como hemos recordado no deben ser de dimensiones demasiado grandes) es innegable que, con un vino de una añada particular y como consecuencia de una afortunada evolución de las cesiones de la madera, se llega en algún caso a una especial armonización de los aromas, que pueden dar un producto excepcionalmente agradable. Sin embargo, hay que preguntarse cuándo es posible, incluso para los grandes vinos que alcanzan elevados precios en el mercado, destinar a cada vendimia nuevas barricas de roble. Son muy significativos los resultados obtenidos por RIBEREAU-GAYON en una experiencia con un vino Merlot de la vendimia 1966. En el mes de noviembre, terminadas las fermentaciones alcohólica y maloláctica, el vino se ha dividido en tres recipientes: una barrica bordelesa de 225 L de roble nueva; una barrica bordelesa de 225 L de roble usada; un tonel de acero inoxidable de 125 L. Omitiendo el examen de los resultados analíticos que no dan grandes diferencias, salvo una intensidad colorante un poco inferior (a pesar del mayor contenido en antocianos) del vino conservado en acero inoxidable y un menor pH y mayor contenido en sulfatos del vino conservado en la barrica usada, es interesante comentar la comparación organoléptica tal y como describe RIBEREAU-GAYON, así como las conclusiones de este autor: a) El vino conservado en la barrica de roble nueva presenta a lo largo de toda la experiencia el olor más fino, más rico, más complejo y más desarrollado; en enero de 1969, algunos meses después del embotellado, se advierte netamente en el «bouquet», que recuerda ya el de un vino viejo, la nota de vainilla de la madera. También el gusto aparece como el de mayor complejidad. En diciembre de 1967, después de un año de permanencia en barrica, la componente procedente de la madera domina en el gusto de manera excesiva; sin embargo, se armoniza bien con los otros sabores, sin una predominancia de la astringencia de los taninos. b) El vino conservado en la barrica usada presenta olores que recuerdan al vino anterior, pero menos acentuados y menos finos, de forma que adquiere un carácter más grosero. Pero donde se aprecia una diferencia más importante es en relación con el gusto: a partir de diciembre de 1967 se advierten ciertos sabores extraños y una sequedad que se acentúa en el curso de la conservación hasta determinar en enero de 1970 una neta desvalorización del vino. Estos caracteres aparecen ligados al aumento de acidez. c) El vino conservado en el tonel de acero inoxidable se caracteriza por una evolución más lenta que los precedentes, necesita mucho más tiempo en adquirir el carácter de vino viejo y presenta un color menos intenso. Después de un año de conservación, en diciembre de 1967, presenta un olor menos complejo que el de los vinos precedentes, pero más afrutado. La intensidad olorosa queda siempre más débil y menos provista de matices. Por el contrario el gusto de este vino resulta siempre, especialmente en relación con el segundo, pero también relativamente con el primero, más fresco, más carnoso, más redondo, más suave, aunque sin alcanzar la complejidad del primero. En cuanto a las conclusiones a extraer de la experiencia descrita, he aquí las expuestas por el autor: 1) La conservación del vino tinto en barricas de madera nuevas aporta una mejora organoléptica, aumentando la variedad y la intensidad de los olores y sabores. Esta mejora es, probablemente, tanto más importante cuanto más elevada es la cantidad intrínseca en el vino, de forma que se hace posible una armonía entre los caracteres particulares de la madera y los del vino, sin que los primeros sobresalgan exageradamente. 2) La conservación el1 barrica usada puede aportar un cierto carácter que contribuye a la calidad, pero supone una acidificación por ácido sulfúrico procedente de la oxidación del anlÍídrido sulfuroso, acidificación que puede conferir una dureza tal que anule cualquier otra ventaja.
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3) La conservación en recipiente metálico que no aporta nada al vino y permite mantenerlo al máximo abrigo del aire, conduce a un vino menos rico en olor y gusto, pero más suave y más redondo que los conservados en madera; la acidez total, la acidez volátil y el contenido en acetato de etilo son menos elevados. Esta forma de conservación puede ser preferida en muchos casos y corresponde, para ciertas produc ciones, a una tendencia en la evolución del gusto de los consumidores. Parece oportuno hacer unas puntualizaciones a las experiencias y conclusiones expuestas por RIBEREAUGAYON. Es evidente de cuanto acabamos de exponer que, dentro de un prudente respecto a la tradición por el conocimiento de sus resultados económicos concretos, especialmente en una región tan prestigiosa en enología como la de Bordeaux, el autor francés no oculta que, en esencia, el vino mejor conservado es el envejecido en recipiente inerte, al abrigo completo del aire. Aunque posea un perfume y un gusto definidos como «menos complejos», este vino tiene, sin embargo, una calidad bien expuesta por el autor, calidad «que corresponde a una tendencia en la evolución actual del gusto de los consumidores». A nuestro juicio, debido a que la barrica usada es fuente de más defectos que ventajas e incluso la barrica nueva, a pesar de la enorme incidencia de su coste, no garantiza una segura armonización organoléptica en el producto acabado, parece llegado el momento de valorar objetivamente el empleo, incluso en fase de conservación precedente al embotellado, de recipientes de material inerte, que permiten mantener el vino fuera del contacto con el aire (el efecto positivo de una. acción demasiado prolongada del oxígeno es muy discutible) y, sobre todo, dar un vino obtenido íntegramente del fruto de Vitis vinifera, sin el aporte de la madera de Quercus robur, que con el género Vitis no tiene nada en común.
Uno de los aspectos de la diversidad: las condiciones de envejecimiento de los vinos Las condiciones de envejecimiento de los vinos influyen sobre sus características diversificándolos de manera profunda. Es, sobre todo, el empleo de madera durante períodos más o menos prolongados, lo que supone modificaciones importantes de los caracteres organolépticos. La conservación en recipientes de madera debe ser considerada como una verdadera aromatización del mismo que se ha impuesto entre el consumidor por razones esencialmente históricas. El único contenedor de una cierta capacidad disponible en el pasado era de madera; además, los países y regiones que exportaban sus vinos, para facilitar el transporte han utilizado recipientes de madera de capacidad modesta como la barrica bordelesa de 225 litros o la borgoñona de 228 litros, con una elevada relación entre la superficie de contacto y el volumen del vino y, como consecuencia, con cesiones importantes de sustancias procedentes de la madera. La apreciación del gusto «a madera» es, pues, en gran medida, una consecuencia histórica. Los recipientes de madera representan, sin duda, un mito, en el sentido más amplio del término, pero conviene recordar que, al
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consumo del vino, aparece ligada toda una visión tradicional de ciertos valores de la vida que no debe ser olvidada. En la mayor parte de los países se observa que no se utiliza la madera para los vinos blancos, excepto para algún vino de postre. Sin embargo, en Francia, la permanencia del vino en barrica no es sólo practicada aún, sino que es considerada imprescindible para ciertos vinos blancos de calidad. En Alemania, la madera se considera como un factor indispensable para la enología de calidad, por consideraciones ligadas más a la tradición que a la enología. El envejecimiento de los vinos tintos En el caso de los vinos tintos, al contrario, y en particular para los que mejoran su calidad con un envejecimiento más o menos prolongado las barricas de capacidad limitada son consideradas hoy como un elemento precioso tanto desde el punto de vista económico como de imagen. A esta valorización de la madera ha contribuido de manera importante la difusión de las denominaciones de origen, que a través de sus reglamentaciones han impuesto en muchos casos, y no siempre razonablemente, permanencias en madera más o menos prolongadas. La barrica de madera produce acciones muy complejas en el vino porque no es un contenedor impermeable ni inerte. El que no sea impermeable supone la penetración de oxígeno que mantiene el potencial de óxido-reducción a un nivel de 310-350 mV frente a 150-180 mV para los vinos conservados en contenedores herméticos. La oxidación lenta y continua tiene efectos sobre los compuestos más fácilmente oxidables, los polifenoles, que en los vinos tintos forman parte de su estructura de sostén. Según las observaciones de Pontallier, el oxígeno que se disuelve lentamente en el vino reaccionando con los polifenoles daría agua oxigenada, oxidante potente, capaz de formar aldehido acético. Este último estaría implicado en las reacciones de copolimerización entre antocianos y flavonoides. En la barrica, los vinos pierden el exceso de gas carbónico que ejerce una acción desfavorable sobre los caracteres organolépticos de los vinos envejecidos. En fin, la madera cede al vino substancias que se solubilizan con el tiempo y que le confieren una nota «de madera», una verdadera aromatización, con resultados a veces excelentes, a veces desagradables, que enmascaran frecuentemente los defectos, pero que a menudo tapan los perfumes, nivelando la calidad hacia un gusto de madera, agradable, pero no típico. Las cesiones son importantes, sobre todo para recipientes nuevos de pequeñas dimensiones, aunque si la permanencia es prolongada, se aportan también modificaciones a un vino conservado en grandes recipientes. Hay que subrayar la importancia de la relación superficie/volumen: aumentando las dimensiones lineales de un recipiente cualquiera, la superficie aumenta según el cuadrado, mientras que el volumen crece según el cubo de las dimensiones. De estas observaciones resulta evidente la falta de rigor de los reglamentos de algunas denominaciones de origen que establecen un período de envejecimiento en madera, sin decir nada sobre la capacidad de los contenedores. Además, el tipo de madera, el secado y la forma de realización tienen una importancia determinante para las características del vino. Influencia del modo de envejecimiento Para juzgar la influencia del envejecimiento tenemos un ejemplo de comparación de resultados empleando dos vinos tintos, uno pobre (Barbera) y otro rico (Nebbiolo) en polifenoles y conservados durante el mismo período en toneles de roble de 5 mL y en recipientes de acero inoxidable de la misma capacidad. Los vinos elegidos son un Barbera y un Nebbiolo, ambos de la vendimia 1978, con graduación alcohólica de unos 13°, obtenidos de uvas modernas y sanas. Los vinos se han introducido en los contenedores en abril de 1979. Los rellenos se han hecho utilizando el mismo vino conservado en garrafas. Se han efectuado trasiegas antes del verano y durante el invierno. Una primera serie de muestras han sido embotellada en abril de 1980, una segunda serie un año más tarde, durante la primavera de 1981.
261
Evolución de la composición química de los vinos En la tabla 69 se presentan los datos al inicio y al final de la experiencia: no se han indicado los datos «después de un año en inoxidable» porque las diferencias en relación con el vino conservado dos años son despreciables. La disminución del grado alcohólico es apreciable, pero también debida a los trasiegos, porque disminuye en los recipientes de acero inoxidable. El aumento de la acidez volátil es evidente pero aceptable: es más baja en los recipientes de inoxidable. La fermentación maloláctica se desarrolla igualmente a excepción de la muestra de Barbera «un año en madera» lo que da algunas diferencias analíticas. Es evidente el enrique-cimiento en sulfatos de los vinos conservados en madera: este enriquecimiento no es preocupante, pero debe ser vigilado. Las muestras conservadas en madera tienen mayores contenidos en aldehido acético pero quedan bastante lejos, sin embargo. TABLA 69
Alcohol % Extracto total g/L Acidez total g/L Acidez volatil g/L pH Acido tartárico g/L Acido málico g/L Acido láctico g/L Cenizas g/L Alcalinidad cenizas meq/L Sulfatos (K2SO4) g/L Acetaldehído mg/L
Vino inicial
Barbera Después de un año en madera
12,95 30,0 10,35 0,39 3,13 3,85 2,56 0,39 2,355 27,5 0,351 n.d.
12,77 28,9 9,99 0,66 3,10 2,80 2,33 0,45 2,320 21,5 0,659 1,56
Después de dos anños en madera 12,77 26,1 8,49 0,72 3,17 2,68 1,62 1,975 16,0 0,641 14,8
Después de dos años en inoxidable 12,82 25,4 8,12 0,45 3,24 2,73 1,80 1,865 18,0 0,403 4,7
Vino inicial
12,86 28,4 8,40 0,36 3,43 2,75 3,17 0,30 2,835 30,5 0,522 n.d.
Nebbiolo Después Después de un año de dos en madera años en madera 12,60 12,51 25,3 25,8 5,86 6,15 0,60 0,63 3,43 3,40 1,67 1,70 2,47 2,31 2,813 2,795 22,0 22,0 0,690 0,701 9,9 6,7
Después de dos años en inoxidable 12,69 23,7 5,17 0,54 3,50 1,66 2,37 2,755 24,0 0,530 3,3
Fig. 60 - Evolución de la relación superficie/volumen al anmentar la capacidad de los recipientes
No aparecen diferencias para los contenidos en coloides recipitables con alcohol ni para su perfil de elución sobre Sepharose 6B. En lo que respecta a la intensidad colorante, los datos de la tabla 71 muestran un comportamiento diferente dos dos vinoso El Barbera, rico en antocianos y pobre en taninos, sufre una rápida disminución de su fuerte intensidad, de manera más acentuada en el vino conservado en madera. Al contrario, el Nebbiolo, después de una caída modesta a los 20 meses, muestra un aumento con una acentuada nota anaranjada a causa muy probablemente de la polimerización de los flavonoles: no existen diferencias entre el vino en recipiente de madera o de acero inoxidable.
262
En cuanto a los polifenoles, en la tabla 70 se presentan los valores de la relación entre los flavonoles que reaccionan con la vainilina y las protoantocianidinas determinadas por calentamiento en medio ácido. Se ve que la conservación en madera acelera la polimerización, dando vinos más bajos, al menos desde el punto de vista analítico. Como señala Singleton (1971) la madera cede polifenoles «no flavonoides»: en efecto, como muestra la figura 62; los vinos conservados durante dos años en madera difieren en el contenido en «no flavonoides», diferencia del orden de 80 mg/l para el Nebbiolo y de 130 mg/l para el Barberao En la misma figura se observa también el porcentaje mayor de flavonoides condensados en las muestras que provienen de los recipientes de madera. TABLA 70
Relación entre flavonoides reaccionantes con vainillina ácida y protoantocianidinas (V/LA). B: Barbera; N: Nebbiolo (Marzo 1979) Vino inicial B 0,43
N 0,54
(Abril 1980) Después de 1 año en madera B N 0,27 0,45 1 año en madera 1 año en botella
(Abril 1982)
B 0,22
(Abril 1981)
N 0,41
Después de 1 año en inoxidable B N 0,31 0,50
2 años en madera B 0,20
N 0,38
1 año en inoxidable 1 año en botella B 0,27
N 0,48
1 año en madera 2 años en botella
2 años en madera 1 año en botella
1 año en inoxidable 2 años en botella
B 0,19
B 0,16
B 0,20
N T 0,34
N 0,33
N 0,42
2 años en inoxidable B 0,25
N 0,48
2 años en inoxidable 1 año en botella B 0,21
N 0,41
TABLA 71
Evolución de la intensidad y de la tonalidad (entre paréntesis) B: Barbera; N: Nebbiolo (Marzo 1979) Vino inicial B 13,13 (0,42)
N 5,73 (0,61)
(Abril 1980 ) Después de 1 año en madera B N 8,11 4,27 (0,53) (0,74)
(Abril 1982)
(Abril 1981)
1 año en madera 1 año en botella B N 7,94 4,73 (0,62) (0,74) 1 año en madera 2 años en botella B N 7,28 4,66 (0,68) (0,95)
Después de 1 año en inoxidable B N 9,42 4,43 (0,52) (0,75) 2 años en madera B N 7,96 4,89 (0,63) (0,85) 2 años en madera 1 año en botella B N 7,47 4,90 (0,68) (0,93)
1 año en inoxidable 1 año en botella B N 8,80 4,78 (0,59) (0,88) 1 año en inoxidable 2 años en botella B N 8,08 4,72 (0,63) (0,93)
2 años en inoxidable B N 9,27 5,15 (0,61) (0,93) 2 años en inoxidable 1 año en botella B N 8,06 4,89 (0,63) (0,98)
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Fig. 61.-Esquema ilustrativo de las variantes adoptadas en la producción de los vinos en estudio
Las substancias volátiles, presentadas en las tablas 72 y 73, no presentan diferencias significativas y ello significa que tales compuestos no son responsables de las diferencias organolépticas. En lo que respecta al análisis sensorial se han hecho comparaciones en el momento del embotellado, después de un año de permanencia en recipientes y después de dos años. Por fin, se han hecho comparaciones, después de un año de conservación en botella.
Fig. 62 – Diferencias en el contenido en diversos tipos de polifenoles conmo consecuencia del envejecimiento en madera
264
Abril de 1981. Después de un año de envejecimiento Barbera: olfativamente el vino en madera se diferencia netamente por una nota «de madera» bien armonizada; el gusto confirma la diferencia. El vino en inoxidable presenta un perfume típico e intenso, pero más simple, y un gusto ligeramente más vacuo. Nebbiolo: el aporte de la madera resulta positivo, confirmando una mayor complejidad en el perfume y en el gusto Los vinos conservados en inoxidable parecen más jóvenes y hay que decir que el juicio de los degustadores se divide entre los que aprecian «la madera» y los que no desean el aporte organoléptico de la madera. Abril de 1981. Después de dos años de envejecimiento Barbera: el perfume del vino en madera es intenso, armónico, complejo, claramente mejor; al contrario, el gusto del vino en inoxidable es preferible, más redondo, mientras el primero resulta más seco, con un retrogusto amargo. Nebbiolo: es difícil atribuir una preferencia; la degustación señala una diferencia clara, pero los degustadores no son capaces de expresar una preferencia. TABLA 72 Contenidos en substancias volátiles (µg/L) de las muestras envejecidas dos años en madera o dos años en acero inoxidable Barbera Nebbiolo 2 años 2 años 2 años 2 años en en en madera en madera inoxidable inoxidable Etil butirato Etil capronato Etil caprilato Etil caprato Etil pirulato Etil H-OH-butirato Isoanil acetato 2-feniletil acetato Acido butírico Acido isovaleriánico Acido caprónico Acido caprílico Acido cáprico Acetona Hexanol Trans-3-hexanol 3-etoxipropanol-l * Cis-3-hexanol 3-metiltiopropanol-1 * Etilguaiocol* Etilfenol* y-butirolactona Lactona * Lactona * N-isoamiloacetamida *
96 167 188 31 186 376 127 22 82 453 1.425 2.080 438 158 1.100 11 45 148 745 53 684 3.690 1.350 1.1 90 1.800
68 119 186 24 179 401 165 43 120 581 1.560 1.735 305 212 1.160 14 52 140 822 65 705 3.750 1.220 1.200 2.215
93 185 154 24 202 234 186 46 250 510 1.520 1.315 231 956 2.840 43 106 118 902 76 435 3.060 755 770 1.800
86 185 151 12 126 335 169 58 211 438 1.475 1.315 172 n.d. 3.090 44 109 122 885 109 435 4.320 507 no 1.640
(*) Determinados considerando igual a 1 el factor de respuesta respecto a 1-heptanol
265
TABLA 72 Contenidos en substancias volátiles (mg/L) de las muestras envejecidas dos años en madera o dos años en acero inoxidable Barbera
Nebbiolo
2 años en madera
2 años en inoxidable
2 años en madera
2 años en inoxidable
159,1 13,3 2,8 6,1 28,8
162,3 14,6 3,0 13,6 36,3
148,3 8,4 1,0 3,4 51,9
127,2 6,2 1,0 1,5 53,2
Etillactato Dietil sucinato Monoetil sucinato Etil malato * 2-feniletanol
(*) Determinados considerando igual a 1 el factor de respuesta respecto a 1-heptanol.
Abril 1982 Con los objetivos de la experiencia después de un año de conservación en botella, se ha pedido a diez degustadores que indicaran el orden de preferencia, para cada serie de dos vinos, entre las cuatro muestras. Las tablas 74 y 75 presentan los resultados obtenidos. Cada degustador ha expresado solamente un juicio olfativo y un juicio conjunto. Desde un punto de vista general, cuando los degustadores ordenan según una preferencia J muestras, refiriéndose a K caracteres, se obtienen tablas, como la 74 y la 75, con 1 líneas y J columnas para cada una de las K características elegidas. Estas tablas pueden ser analizadas de diversas formas y, particularmente, se puede preguntar si existe una diferencia significativa entre las muestras. Hemos empleado el test de Friedman calculando un coeficiente F, cuya distribución y significatividad (si IJ > 30) coinciden con la de X2, con J -1 grados de libertad. El coeficiente tiene el valor siguiente: Fe =
12 = ∑ R 2J - 3 ⋅ I (J+1) I ⋅ J (J+1)
donde Rj representa la suma de los rangos de clasificación para cada muestra. Comenzamos con el examen del Nebbiolo: los Fr calculados resultan respectivamente de 3,66 para las características objetivas y de 2,34 para el juicio conjunto, es decir, muy inferiores al nivel de significación (para 3 grados de libertad es igual a 7,81). La falta de diferenciación entre las muestras parece contradecir la diversidad percibida por todos los degustadores pero la contradicción es sólo aparente. En efecto, una tabla como la 74 puede ser analizada de manera distinta. Si todos los degustadores tuvieran gustos homogéneos, cada vino sería clasificado del mismo modo, es decir, el mejor totalizaría un Rj = 1, el segundo 21, hasta el último con 11. La media de estas sumas (recordando los teoremas sobre progresiones aritméticas) es igual a I(J + 1)/2 y, en el caso de una concordancia completa, la suma de los cuadrados de las desviaciones de cada R de la media sería siempre la máxima posible e igual a: Smax =
∑(R
- I (J +1)/2 ) = I 2 J (J 2 -1)/12 2
j
Si S es la suma de los cuadrados de las desviaciones realmente observadas, la relación W entre S y Smax se llama coeficiente de concordancia de Kendall y tiene el valor de: W=
266
12 S I J (J + 1) 2
W mide la concordancia entre los degustadores y varía de 1 (concordancia completa) a 0 (ninguna concordancia). TABLA 74 Orden de preferencia indicado por los degustadores para las cuatro muestras del vino «Nebbiolo» al término de la experiencia 1 año en inoxidable
1 año en madera
2 años en inoxidable
2 años en madera
Degustadores
Juicio olfativo
Juicio general
Juicio olfativo
Juicio general
Juicio olfativo
Juicio general
Juicio olfativo
Juicio general
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 1 3 1 3 1 2 2 2 2
3 1 1 1 3 1 1 1 2 3
4 4 2 4 2 4 4 1 3 4
4 4 2 2 2 3 4 2 4 2
2 3 4 3 4 2 3 4 1 1
1 3 3 3 4 4 2 3 1 1
3 2 1 2 1 3 1 3 4 3
2 2 4 4 1 2 3 4 3 4
R, =
18
17
32
29
27
25
23
29
TABLA 75 Orden de preferencia indicado por los degustadores para las cuatro muestras del vino «Barbera» al término de la experiencia 1 año en inoxidable
1 año en madera
2 años en inoxidable
2 años en madera
Degustadores
Juicio olfativo
Juicio general
Juicio olfativo
Juicio general
Juicio olfativo
Juicio general
Juicio olfativo
Juicio general
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 3 4 2 1 3 1 2 2 1
1 3 2 2 1 4 1 4 2 1
4 4 3 4 4 4 4 4 4 3
4 4 3 4 4 3 4 2 4 3
3 2 1 1 2 2 2 1 3 4
3 2 1 1 2 2 2 1 3 4
2 1 2 3 3 1 3 3 1 2
2 1 4 3 3 1 3 3 1 2
R,=
20
21
38
35
21
21
21
23
Para estimar el significado estadístico de W se demuestra que la función 1 (J - 1) W sigue la distribución de X2 con J - 1 grados de libertad, si 1 > 7. En nuestro caso se obtienen valores de W iguales a 0,212 y 0,178, que multiplicados por 10 (4 - 1) dan respectivamente 6,36 y 5,34, valores no significativos. Se puede, pues, concluir que no hay una concordancia entre los degustadores y, como consecuencia, el intento de obtener una clasificación de las muestras examinadas no tiene sentido. Estos resultados parecen muy importantes porque demuestran que más allá de la «imagen» que da la madera, el carácter «madera» no es apreciado universalmente. El envejecimiento en madera aporta, pues, una contribución notable a la diversificación, sobre todo en el sentido de dividir a los consumidores en dos grupos: los que gustan del carácter «madera» y los que no 10 quieren del todo. Desde nuestro punto de vista, no conviene olvidar que el vino es el producto de la fermentación del mosto de la uva y no el extracto, por obra del mosto, de la madera de roble. Envejecimiento de los vinos blancos Es necesario señalar que se practica un envejecimiento de los vinos blancos ricos en alcohol en barricas de roble con el objetivo de obtener productos ricos en cuerpo, redondos, que se alejan del tipo fresco, afrutado que normalmente, salvo el caso de los vinos especiales, se busca en un vino blanco. No se trata de vinos que se adaptan a los delicados platos de pescado, sino de vinos a mitad de camino entre los vinos de postre y los vinos de aperitivo: se trata, ciertamente de una contribución a la diversificación.
267
En el campo de los vinos blancos existe una maravillosa producción de vinos muy peculiares, pero más que la consecuencia de un envejecimiento, su tipicidad deriva de una tecnología especial de producción: el Jerez, el Marsala, los vinos de Jura, el aporto blanco, el Tokay, son producidos empleando técnicas tradicionales, a veces sorprendentes, para una mentalidad estrictamente tecnológica, que demuestran el papel jugado por la imaginación del hombre en la realización de la más espléndida y diferenciada entre las bebidas que es capaz de producir. * * Nota del traductor: En Rioja, se elabora tradicionalmente un vino blanco de la variedad Viura, envejecido en barrica de roble, que no encaja con los tipos definidos por el autor y que se adapta bastante bien a un plato de pescado
268
CAPITULO VIGESIMOTERCERO
Métodos objetivos de valoración de los caracteres organolépticos La valoración de los caracteres organolépticos de un alimento, y en nuestro caso particular del vino, se denomina generalmente valoración sensorial. Con una cierta confusión de ideas se manifiesta siempre la tendencia a considerar la valoración sensorial un método «subjetivo» y, como consecuencia, a aceptada con una buena dosis de desconfianza. Como justamente señala SAUVAGEOT (1982) el término «subjetivo» puede tomarse en sentido literal y entonces el método sensorial es subjetivo porque los datos son dados por un sujeto, mientras el término «objetivo» se refiere a un método por el cual el aporte de los datos se realiza a través de un instrumento, un objeto. Sin embargo, los dos términos pueden llevar también connotaciones de valor en el sentido de que el método objetivo se supone reproducible y exacto mientras que el subjetivo (aunque sea indispensable) conduce a resultados de difícil interpretación y a menudo falseados. Debido a que estas opiniones están muy difundidas parece oportuno sustituir los términos «subjetivo» y «objetivo» respectivamente por «sensorial» e «instrumental», teniendo presente que un método objetivo puede ser definido como un «método en el que los efectos de la influencia personal son minimizados» y que, en estas condiciones, la valoración sensorial es un método objetivo. Nuestros sentidos, y en particular el gusto y el olfato, reaccionan ante estímulos que dependen de la calidad y cantidad de las substancias que se ponen en contacto con los órganos sensoriales. En lo que concierne al gusto se han individualizado cuatro sabores fundamentales: dulce, amargo, ácido y salado. Por el contrario el olfato es capaz de diferenciar un gran número de olores distintos y con una sensibilidad asombrosa, incluso al comparado con los instrumentos más sensibles. Del umbral de percepción individual al concepto de «grupo» Para que un estímulo sea registrado por los sentidos ha de alcanzar un umbral. Se distingue entre umbral de percepción y umbral de identificación: el umbral de percepción es el valor cuantitativo necesario para producir una sensación; el umbral de identificación corresponde al estímulo necesario, no sólo para percibir una sensación sino también para reconocer el tipo y tiene, obviamente, un valor superior. El mismo concepto de umbral implica la existencia de una relación cuantitativa entre el valor del estímulo (concentración de la substancia que reacciona sobre los sentidos) y la intensidad de la percepción sensorial. Cuando se habla de cantidades se debería poder proceder a su medida empleando unidades en correspondencia con la cantidad a medir. Mientras que la medida es perfectamente factible para los estímulos no es posible establecer una unidad de medida precisa para las sensaciones. Sólo se puede pedir a los sujetos el que den un juicio cuantitativo de las sensaciones percibidas, sea expresándolas con números o tratando de representarlas con reacciones proporcionales, como por ejemplo, la presión sobre un dinamómetro. Aún no poseyendo una unidad de medida precisa, sobre la base de una numerosa serie de observaciones, se puede aceptar la relación entre estímulo e intensidad de percepción indicada como ley de STIVENS, que relaciona la intensidad de la sensación S con la del estímulo I por medio de una relación de potencia: S = k In El exponente n expresa el modo según el cual varía la sensación al variar el estímulo: si es superior a 1 la sensación varía más intensamente que el estímulo, si es inferior a 1 con intensidad menor, si es igual a 1 la sensación crece en la misma proporción que el estímulo. La ley de Stivens puede expresarse también en forma logarítmica: Log S = n Log I + K Existe pues una relación lineal entre el logaritmo de la sensación y el del estímulo.
269
Volviendo al concepto de umbral en relación con un estímulo determinado, la experiencia demuestra que el valor umbral varía de individuo a individuo incluso de manera considerable. Existen casos (aunque no muy frecuentes) de insensibilidad por parte de algún sujeto a estímulos concretos, tanto concernientes al gusto como al olfato. Con el fin de objetivar el análisis sensorial, minimizando las influencias personales, se llega al concepto de «grupo».Un grupo se forma reuniendo un conjunto de personas que tengan, ante todo, intereses en la valoración sensorial de un producto. Para la elección se pueden utilizar técnicas particulares con el objetivo de asegurar, en relación con una serie de estímulos fundamentales, que todos se encuentran en condiciones de buena salud y que no existen anomalías sensoriales relevantes. El grupo está, entonces, en condiciones de dar una serie de valoraciones y juicios, que no sólo expresan concordancias que confirman los mismos juicios, sino que Rueden llevar a establecer medias, a valorar las dispersiones de datos en torno a esa media, en una palabra, que pueden ser sometidos a elaboraciones según técnicas de metodología estadística que permiten establecer diferencias significativas con una probabilidad determinada. Para constituir un instrumento de valoración sensible y eficaz el grupo debe, no sólo estar motivado, sino compuesto por expertos, habituados al análisis sensorial de los vinos. Esto es necesario especialmente para los juicios de calidad que requieren un conocimiento profundo del tipo de vino a examinar. Las valoraciones sensoriales Aunque no es posible hacer diferenciaciones precisas, distinguiremos dos tipos de valoraciones sensoriales: el primero con fines tecnológicos tiene el objetivo de verificar si alguna variación de la tecnología de producción ha tenido influencia sobre las características del vino y si esta influencia ha sido positiva o negativa; el -1 segundo con fines edonísticos para establecer el valor cualitativo de uno o más vinos en el ámbito de su tipo. Valoraciones sensoriales con fines tecnológicos Son valoraciones denominadas «forzadas» en el sentido de que los degustadores son obligados a hacer una elección. Se trata generalmente de establecer una comparación entre el mismo vino que ha sufrido, o no, un tratamiento o una intervención: se quiere saber si la intervención ha dejado huella sobre los caracteres organolépticos del vino. En este caso se prepara primero un test de diferencia, seguido, en el caso de la existencia de una diferencia significativa, de un test de preferencia. Indicaremos sólo dos tipos de test: el duo-trío test y el test triangular. Duo-trío test El test consiste en el empleo de tres copas, una indicada como testigo y las otras dos numeradas 1 y 2. En la copa testigo y en una de las otras dos se pone el primero de los vinos a comparar y en la otra copa el segundo vino: a los degustadores se les pide indicar la muestra que es diferente del testigo. Naturalmente, sólo se pueden producir respuestas correctas y erradas mientras la probabilidad de una elección al azar es evidentemente 0,5. La búsqueda de una diferencia entre dos muestras define un test con una sola posibilidad, en el sentido de que si A difiere de B, implícitamente también B difiere de A, sin otras alternativas. Por el contrario, la búsqueda de una preferencia constituye un test con dos posibilidades, en el sentido de que se puede preferir A sobre B ó B sobre A: en este caso se valora el número de juicios concordantes. La valoración de una diferencia o de una preferencia se hace por medio de la distribución correcta de la función χ2, expresada por la relación siguiente:
χ
270
2
([ X =
1
− X 2 ] − 1) N
2
(1)
donde N es el número de juicios totales, Xl, el número de los correctos y X2 el número de los errados si se trata de una diferencia, mientras que se hacen respectivamente el número de juicios favorables a la muestra 1 y el de juicios favorables a la muestra 2, en el caso de una preferencia. El valor de χ2 debe superar determinados valores (niveles de significación) correspondientes a una probabilidad elegida. En el caso de una diferencia dichos valores son 2,71; 5,41 y 9,55 respectivamente para las probabilidades del 5%, 1 % y 1 0 00 o; en el caso de una preferencia los valores son 3,84; 6,64 y 10,83 respectivamente para las mismas probabilidades. Existen tablas que para un número dado de juicios totales indican cuántos juicios correctos o cuántos juicios concordante s son necesarios para tener una diferencia o una preferencia significativa al nivel de probabilidad elegido. Test triangular En el test triangular se presentan a los degustadores 3 copas, dos de las cuales contienen un vino y la tercera copa el otro vino: se pide identificar la muestra distinta. La probabilidad de una elección al azar es de 1/3 y el valor de χ2 correcto viene dado por la siguiente expresión:
χ
2
([ 4 X =
1
− 2 X 2 ] − 3)
2
(2) 8N donde N es el número total de respuestas, Xl el número de respuestas correctas y X2 el de respuestas erradas. Los valores límites del X2 para las probabilidades del 5%, 1 % y 1 0 00 o son respectivamente 3,85; 6,74 y 1l,09. Tanto el dúo-trío test como el test triangular se prestan esencialmente para juicios de diferencia mientras que resultan menos eficaces para expresar, a la vez, una preferencia. Es evidente que sin la existencia de una diferencia no se plantea el problema de una preferencia. El modo más correcto de proceder es el de establecer una diferencia significativa por medio del dúo,trío test o del test triangular y, en caso afirmativo, preparar un test de comparación con sólo dos copas para la búsqueda de una preferencia significativa. En el test de comparación directa la probabilidad de una elección al azar es también 1/2 y la expresión que da los valores del χ2 es la misma de la fórmula (1) indicada para el dúo-trío test, pero en este caso tratándose de un test con dos posibilidades (se puede preferir Aa B o B a A) se deben emplear como límites para las probabilidades 5%, 1 % y 1 0 00 o respectivamente los valores 3,84; 6,64 y 10,83. Un ejemplo concreto De todo lo expuesto se desprende que el análisis dispone de medios, regulados por protocolos precisos, para establecer la existencia de una diferencia entre dos muestras de vinos o para expresar una preferencia segura de una muestra sobre otra. En este punto se presentan una serie de problemas. El tipo de pruebas que hemos descrito entra en la categoría de las «elecciones forzadas» en el sentido de que el degustador es obligado a hacer una elección (que puede ser exacta o errada, concorde o discorde) de forma que se evita la ambigüedad de la abstención o de la igualdad de juicio. En efecto, todos los ensayos se basan en la «hipótesis nula», esto es, que no exista diferencia o preferencia alguna entre las muestras a examinar. En el caso de que la hipótesis nula corresponda a la realidad la elección debe hacerse al azar, con la probabilidad que la elección al azar supone según el tipo de test empleado. Sin embargo, si la gran mayoría de los degustadores hace la elección correcta o expresa juicios concordantes, hay que preguntarse cuál es entonces la probabilidad de que la hipótesis nula sea válida y si esta probabilidad desciende por debajo de un cierto nivel predeterminado, se rechaza la hipótesis nula y se afirma la existencia de una diferencia o de una preferencia significativa. Hay que preguntarse ahora: ¿para que aparezca significación en una comparación entre dos vinos, cuantas respuestas hay que recoger? Se trata de un problema de sensibilidad y es evidente la necesidad de un mayor número de respuestas cuanto más pequeñas sean las diferencias a destacar.
271
Sin embargo, entre dos muestras de vinos, incluso entre dos botellas de la misma partida, existen siempre diferencias y no es oportuno, por tanto, aumentar la sensibilidad hasta una diferenciación que no tenga sentido práctico ni para el consumidor ni para el experto. Además, un aumento excesivo de las respuestas dificulta la preparación de las pruebas, requiriendo o un número de degustadores imposible de reclutar o unas repeticiones de las pruebas no soportables por parte de los mismos degustadores. La experiencia parece demostrar que un número de 20 respuestas es suficiente para asegurar un buena sensibilidad tanto de los tests de diferencia como de los de preferencia. El siguiente ejemplo ilustrará la validez de esta última afirmación. Se ha realizado una experiencia de elaboración de vino espumoso en autoclave y de conservación del espumoso obtenido en presencia y en ausencia de levaduras y a distintas temperaturas con el objetivo de verificar cuál es la influencia del contacto con las levaduras y de la temperatura sobre la calidad del espumoso obtenido. Después de la «toma de espuma» a 18 °C durante 20 días en un autoclave de 60.000 litros, el espumoso ha sido repartido isobáricamente en 6 autoclave s de 10.000 litros cada una. Autoclave 1: el espumoso se ha introducido, después de una centrifugación isobárica (separando levaduras) y ha sido conservado a 0 °C. Autoclave 2: el espumoso ha sido introducido sin centrifugación, tomándolo de la masa homogeneizada y mantenida en agitación, y se ha conservado a 0 °C. Autoclave 3: el espumoso se ha tratado como en el autoclave 2, pero ha sido sometido a agitaciones periódicas (una vez a la semana). Autoclave 4: idéntico tratamiento que en el autoclave 1, pero conservado a 10 °C. Autoclave 5: igual que en el autoclave 2, pero conservado a 10° C. Autoclave 6: igual que en el autoclave 5, pero sometido a agitaciones periódicas (una vez a la semana). De esta forma se tiene el mismo espumoso conservado a diferente temperatura, en presencia o ausencia de levaduras, con resuspensión periódica de las heces por agitación o en presencia de las heces depositadas en el fondo. Después de 13 semanas de conservación en las condiciones indicadas se ha procedido al ensayo de comparación aplicando el dúo-trío test. La primera comparación se ha efectuado entre los autoclaves 1 y 3. Parece evidente que si no se encuentran diferencias significativas entre el espumoso sin levaduras y aquél cuyas levaduras se mantienen en suspensión por agitación semanal, no es previsible ninguna diferencia para el espumoso con las levaduras depositadas en el fondo del autoclave. Se han recogido 22 respuestas. La comparación entre los autoclaves 1 y 3 no ha revelado ninguna diferencia significativa (8 respuestas exactas de 22) y lo mismo para la comparación entre los autoclaves 4 y 6 (13 respuestas exactas de 22): durante el período transcurrido las levaduras no han cedido substancias organolépticamente influyentes y relevantes. A continuación se ha efectuado un test de diferencia entre los autoclave s 1 y 4, es decir, conservados a distinta temperatura: han aparecido diferencias significativas (9 respuestas exactas de 11). Las 22 respuestas son consecuencia de una prueba repetida de 11 degustadores: en el caso de la comparación entre los autoclave s a temperatura distinta no se ha repetido la prueba al haberse alcanzado ya la significación en la primera prueba. Los resultados obtenidos merecen algunas observaciones. Se trata de productos idénticos salvo la presencia o no de levaduras y la conservación a distinta temperatura. El hecho de que la simple diferencia de 10 °C en la conservación a baja temperatura se detecte a nivel organoléptico demuestra la gran sensibilidad del método que, debido especialmente al olfato, es capaz de revelar diferencias muy pequeñas; la apreciación de una diferencia tan modesta constituye, al mismo tiempo, una prueba de la absoluta falta de influencia organoléptica del contacto con las levaduras. Transcurridos 14 meses de conservación se han repetido las comparaciones. La comparación entre 1 y 3 no ha resultado estadísticamente significativa (12 respuestas exactas sobre 22); la comparación entre 1 y 4 ha resultado significativa (16 respuestas exactas de 22). La existencia de una diferencia significativa entre los autoclave s a temperatura distinta ha sugerido una comparación de preferencia que no ha evidenciado, sin embargo, ninguna preferencia significativa (13 elecciones a favor del autoclave 1 sobre 22 juicios).
272
El ejemplo expuesto es muy importante para ilustrar la validez y eficacia de la valoración sensorial porque ha permitido obtener apreciaciones significativas y no significativas de diferencias y también detectar una diferencia significativa que no supone, sin embargo, una preferencia significativa. Se ha puesto en evidencia la gran sensibilidad y eficacia de los tests empleados y se ha demostrado que las diferencias de temperatura en la conservación de los espumosos secos por debajo de 10 °C durante más de un año no suponen preferencias significativas. También se ha demostrado que el contacto con las levaduras en la conservación no tiene ninguna influencia sobre la calidad del espumoso. Valoraciones sensoriales con fines edonísticos Los ensayos que hemos descrito no se prestan a precisar la calidad de un vino; aunque a través de la expresión de una preferencia se hace un juicio de calidad, dicha calidad no se describe ni se atribuye a factores bien definidos. Sin llegar a las poéticas y fantasiosas descripciones de los que son «capaces» de percibir en un vino el perfume de los cabellos rubios de un ángel del sexo femenino (y observo con sorpresa el haber tomado posición sobre el difícil problema del «sexo de los ángeles»), la calidad de un vino debe ser valorada sobre la base de un buen equilibrio entre una serie de características organolépticas individualizables del gusto y del olfato. Para ello se necesitan unas escalas de valoración. Las escalas de valoración de las calidades organolépticas pueden ser «estructuradas» o «no estructuradas». Las escalas estructuradas Escalas estructuradas son aquellas en las que vienen indicados puntos de referencia fijos; las más simples son las «nominales»: la propiedad valorada puede ser clasificada según un cierto número de palabras «
273
Por último, debemos considerar otro tipo de valoración reconducible a las escalas estructuradas y que conlleva un elemento más de dificultad. Frecuentemente, un juicio conjunto deriva de la confluencia de varias valoraciones parciales, cada una relativa a un aspecto del producto examinado. Sin embargo, como se supone que tales aspectos no tienen todos igual importancia, las calificaciones relativas se multiplican por distintos factores para variar su «peso» sobre la calificación final. Ahora bien, es probable que los factores de multiplicación hayan sido adoptados ,n base a criterios del «buen sentido» de aquellos que han acordado la ficha de valoración, pero se ha demostrado (LASZTITY y ORSI, 1975) que sólo mediante adecuados procedimientos matemáticos es posible establecer el «peso» que tienen verdaderamente las distintas características examinadas, en función del tipo de producto. Un control efectuado, en el caso de los vinos, sobre la ficha empleada en la Universidad de Davis ha demostrado que había que modificar casi todos los factores, y.algunos deforma substancial (KWAN y KOWALSKI, 1980). Las escalas no estructuradas Las, incertidumbres y los contrastes propios de las escalas estructuradas han llevado a idear otras soluciones que eliminen o atenúen los inconvenientes. Así, se han propuesto las «escalas no estructuradas» que son siempre escalas gráficas en las que los puntos de referencia son sólo dos (colocados en las extremidades) o desaparecen del todo. Un ejemplo de escala no estructurada es la propuesta por WEISS (1981) (fig. 60); se utiliza una línea inclinada de las dimensiones de la diagonal de un cuadrado de 15 cm de lado. El degustador ha de trazar una línea perpendicular a la diagonal en el punto más oportuno en base a su valoración; a continuación se procede a transformar tal información en un dato numérico considerando habitualmente una extremidad como «O» y la otra como «100». De esta forma se consiguen objetivos distintos: 1. Como el degustador no es obligado a escoger un intervalo o un número determinado la escala resulta «continua» desde el momento que, es posible expresar cualquier valor de 0 a 100. 2. Los resultados obtenidos con estas escalas siguen una distribución normal y son, por tantó, susceptibles de ser tratadas con adecuados procedimientos estadísticos (del tipo de los análisis de varianza) con las ventajas que esto supone para un racional aprovechamiento de los resultados.
Fig. 63.- Tipo de escala «no estructurada» utilizada para la valoración global y para algunos caracteres concretos de los vinos examinados (según Weiss, 1981).
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Pero existe una dificultad y es que los diferentes degustadores tienden a utilizar de forma personal la extensión de la línea puesta a su disposición, privilegiando uno la zona más central, otro la parte inferior y otro la superior. Esta dificultad puede superarse con procedimientos estadísticos apropiados, considerando a los degustadores como «bloques» y eliminando la variabilidad aportada por ellos, eliminándola del resultado final. Hay que señalar que con la técnica descrita se llega ciertamente a establecer un orden entre los distintos objetos examinados a la vez, pero las valoraciones siguen siendo «no paramétricas» y de reproducibilidad incierta en el tiempo. En efecto, no podemos preguntar si un vino clasificado hace un año con una puntuación media de 75,5 es realmente mejor que otro valorado hoy con una puntuación de 65,1. Sin embargo, el hecho de que tales medidas se distribuyan «como si» fueran paramétricas permite adoptar algunas técnicas estadísticas para valorar si, por ejemplo, las diferencias encontradas en los valores medios son significativas o no. Es evidente que afirmar que las muestras A, B Y C se han clasificado en el orden 1.° B, 2.° C y 3.°. A tiene distinto significado a decir que han conseguido la puntuación siguiente: B = 87, C = 82 y A = 12. Parece, en efecto, (centramos la atención sobre la palabra «parece») que la puntuación numérica aporta mayor información, al menos en el sentido de una diferencia menor entre B y C y una diferencia mucho mayor entre B, C y A.
Un ejemplo concreto de aplicación de una escala no estructurada Las prometedoras premisas teóricas expuestas para las escalas no estructuradas han sido sometidas a aplicaciones prácticas por CASTINO (1983) en un interesantísimo trabajo del que presentaremos tanto el planteamiento como los métodos de elaboración de los datos, sobre los que haremos algunas consideraciones. Con anterioridad, los procedimientos con escalas no estructurales han sido empleados una sola vez en vinos por KWAN y KOWALSKY (1980), en la versión de STONE y col. (1974). Estos autores han tomado en consideración los siguientes caracteres: color, intensidad del aroma, carácter del aroma, olores indeseables, acidez, azúcares, cuerpo, intensidad del «bouquet», características del «bouquet», madera, astringencia y gustos indeseables. Se observa que el número de los parámetros resulta excesivo y, además, no se ha hecho ningún estudio para conocer las distribuciones. En el trabajo CASTINO se ha utilizado el esquema de WEISS (1981) empleando hojas separadas para cada característica a examinar según la ficha presentada en la figura 60: En una primera serie de pruebas se examinaron sólo vinos blancos para los que se pedía la valoración de pocas características: - Color. - Olor. - Impresión gusto-olfativa. - Juicio conjunto. La experiencia ha demostrado que la insistencia sobre particularidades demasiado numerosas multiplica sin necesidad real los juicios requeridos y confunde a los degustadores. Los degustadores que han participado en el experimento han sido 9, todos ellos analistas e investigadores del Instituto de Asti y, por lo tanto, con competencia netamente superior a la del consumidor medio: esta situación, ante eventuales intervenciones tecnológicas correctivas, se presentan como favorable. Se han empleado dos grupos de vinos, el primero procedente de tres variedades del Lazio (Bombino, Bellone y Vermentino), el segundo constituido por 5 muestras de Pinot blanco, derivadas de una partida homogénea de uva, pero vinificadas con distintas intervenciones en la fase prefermentativa. Las degustaciones se han efectuado separadamente para los dos grupos; cada degustador ha recibido las muestras ordenadas al azar y ha expresado su juicio de forma independiente, sin consultar con los colegas.
275
Control del tipo de distribución de los valores obtenidos Según WEISS, con la escala no estructurada propuesta por él, los datos siguen una distribución gaussiana, es decir, una curva de frecuencia normal. Se ha procedido al control de la normalidad empleando el test W de SHAPIRO y WILK (1965), que resulta el más eficaz. El valor W es igual a 1 para una distribución perfectamente gaussiana y disminuye al alejarse de ella el grupo de los datos a examinar; los límites de significación se encuentran en la oportuna tabla. Es posible acumular los distintos valores de W obtenidos para cada grupo de datos constituidos por los juicios expresados para cada característica por los nueve degustadores, después de una oportuna transformación, en un valor Z (Conover, 1980) que sigue la distribución normal con media 0 y desviación estándar 1: una simple comparación con la correspondiente tabla permite sacar las deducciones oportunas. Como la hipótesis de normalidad debe ser verificada en cada caso, todas las muestras se han considerado juntas, pero separando las distintas características para poner en evidencia las eventuales anormalidades de comportamiento para cualquiera de ellas. Los resultados se presentan en la tabla 69 junto a las medias y desviaciones estándar. Con nueve juicios, el valor W que denuncia una anormalidad de distribución es 0,829 y se ve en la tabla que de 32 grupos de datos considerados sólo dos casos presentan un valor inferior: es evidente que se trata de casos. esporádicos que no afectan a la hipótesis general, como confirman los valores de Z. Se presenta también la relación entre las varianzas (S2) mayores y menores de cada columna (test de Hartley) para controlar la homogeneidad de las varianzas. Tal homogeneidad es, en efecto, una de las hipótesis teóricas más importantes que están implícitas en el modelo de análisis de la varianza. Se ve que sólo en el caso del color tal valor supera el umbral de significación, pero se trata de varianzas pertenecientes a dos grupos de vinos distintos lo que no invalida las comparaciones dentro de cada grupo. En conclusión, resulta objetivamente que todos los datos recogidos con el procedimiento experimental adoptado se distribuyen según una curva de GAUSS y tienen varianzas homogéneas: la aplicación del análisis de varianza es, pues, perfectamente legítima. De un exámen atento de la tabla 69 se desprende, también, el elevado valor de las desviaciones estándar de los distintos grupos de datos: esto significa una fuerte dispersión de los datos mismos en torno a la media, con consecuencias importantes que analizaremos a continuación.
Aplicaciones del análisis de varianza A los resultados obtenidos se les ha aplicado, para cada característica examinada y para cada grupo de vinos, el análisis de varianza con bloques al azar, considerando como «bloques» los degustadores para eliminar de la varianza residual o error la eventual variabilidad entre un degustador y otro en la utilización de la escala propuesta. Cuando las medias son significativamente diferentes se ha calculado la «Mínima diferencia significativa» según Tukey (Weber, 1972; Sokal y Rohlf, 1981). Hay que destacar ante todo que se ha observado diferencia significativa entre los degustadores sólo para el color; como el fenómeno se repite se ha atribuído a un comportamiento de carácter más general: en efecto, en estudios sobre fisiología de la visión se ha demostrado que el mismo color no es percibido del mismo modo por distintas personas. Si se observan las diferencias entre los vinos, relativas tanto a las distintas características como a la valoración conjunta, no se puede evitar la sensación de que la capacidad discriminante del procedimiento es muy modesta y poco satisfactoria. En efecto, si se observan los valores de las medias y los de las mínimas diferencias significativas presentados en la tabla 69 resulta evidente que, debido a la gran dispersión de los datos en torno a la media, el análisis estadístico pierde sensibilidad y sólo cuando las diferencias son muy elevadas es posible evidenciar una diferencia significativa.
276
TABLA 69 Parámetros estadísticos sobre la normalidad y sobre la variabilidad de las valoraciones organolépticas de los vinos examinados COLOR
OLOR
SENSACIONES GUSTO-OLFATIVA W X s
Vinos
Bombino Bellone Vermentino Pinot 1 Pinot 2 Pinot 3 Pinot 4 Pinot 5 «Z»
W
X
0,898 0,913 0,784* 0,971 0,987 0,938 0,950 0,887
57,6 54,6 37,4 44,7 50,7 54,8 44,4 46,1
s
W
18,57 22,47 17,22 20,15 14,95 11,13 17,65 14,04
-0,031
Relación entre la varianza máxima y mínima
0,791* 0,918 0,847 0,979 0,906 0,922 0,940 0,960
X
s
53,6 49,9 38,2 42,9 38,6 48,4 22,4 30,9
16,15 18,99 19,83 21,83 19,88 17,40 13,40 18,56
0,094 0,905 0,931 0,943 0,905 0,959 0,905 0,923
-0,815
4,07*
62,2 50,6 39,7 45,9 27,9 48,1 28,6 37,9
23,86 16,86 27,13 15,74 22,94 20,71 25,44 27,99
JUICIO CONJUNTO W
X
s
0,927 0,973 0,959 0,895 0,883 0,961 0,950 0,930
56,5 51,3 37,5 43,71 27,6 49,9 27,7 32,2
15,65 19,58 14,53 19,57 21,52 20,55 20,56 17,19
0,456
2,65
3,16
2,19
TABLA 70 Análisis de varianza de las valoraciones organolépticas sobre muestras de Bombino, Bellone y Vermentino S.C. Entre vinos Entre degustadores (bloques) Residuo Totales
Entre vinos Entre degustadores (bloques) Residuo Totales
COLOR G.L. C.M.
2227,40 2 6569,77 8 2669,72 16 11219,89 26
1063,70 816,72 163,73
OLOR S.C. G.L. C.M. 1171,73 2 585,87 1840,16 8 230,02 6278,99 16 392,44 9293,88 26
F 6,50** 5,00**
F 1,49 0,59
n.s. n.s.
SENSACIONES GUSTO-OLFATIV AS S.C. G.L. C.M. F Entre vinos 2278,77 2 1139,38 2,92 n.s. Entre degustadores (bloques) 6398,31 8 808,54 2,07 n.s. Residuo 6551,04 16 390,69 Totales 149198,12 26
Entre vinos Entre degustadores (bloques) Residuo Totales
JUICIO CONJUNTO S.C. G.L. C.M. F 1746,24 2 872,62 3,98* 3202,29 8 401,54 1,83 3504,33 16 219,02 84441,86 26
n.s.
La falta de sensibilídad deriva de la variabilidad de juicios de los degustadores y se debe esencialmente a tres causas: a) Los juicios son discordantes: es decir, lo que uno O más degustadores consideran de un cierto modo (por ejemplo, positivo) para otro tiene el significado distinto (negativo). b) Los juicios son concordantes, pero son cuantitativamente muy distintos. c) El criterio del juicio de cada degustador es distinto, es decir, su escala de medida personal es distinta a la de otros: los juicios concuerdan, pues, en sentido y amplitud, pero es distinto el punto de origen.
277
Caso a) El degustador B está en desacuerdo con el degustador A. Caso b) El degustador C concuerda con A en el sentido, pero no en la amplitud de la diferencia. Caso c) El degustador D concuerda con A en el sentido y en la amplitud de la diferencia, pero utiliza una posición distinta de la escala. Fig. 64.-Esquema ilustrativo de las tres causas principales de la variabilidad en las valoraciones organolépticas.
En la figura 64 se hace una representación de los tres casos considerados. Para obviar el caso a) habría que eliminar del grupo los degustadores discordantes, pero no hay razones fundadas para hacerla. La fuente de variación debida a c) puede ser eliminada, o en gran parte corregida, considerando a los degustadores como «bloques». En lo que respecta al caso b) parece evidente que la dificultad radica en el hecho de que las medias obtenidas, a pesar de comportarse «como si» fueran paramétricas, en realidad no lo son. Una valoración dada por un degustador respecto a una muestra estándar como «mejor del 20%, para otro puede ser sólo del 5 o, al contrario, del 35%. La conclusión parece la siguiente: la aplicación de procedimientos paramétricos a datos que no lo son, no puede más que conducir a resultados mediocres, como un traje cortado sobre un modelo distinto al que lo va a llevar. El empleo de procedimientos no paramétricos De cuanto hemos dicho se ha llegado a la conclusión de que, al menos para el caso b), es inútil preguntarse «cuanto» sino que deberíamos limitamos al «como». La única respuesta oportuna es el uso de procedimientos no paramétricos los cuales no toman en consideración los datos como tales sino sólo su distribución relativa, es decir, el orden en que se disponen. Bajo tal óptica, las series 75-48-50 y 70-15-21 son equivalentes porque sus números de orden o «rangos» serían siempre los mismos. Se anula cualquier valoración distinta al expresar su juicio po los degustadores: lo que cuenta es sólo la concordancia. Casi para cada procedimiento estadístico de tipo paramétrico existe el correspondiente no paramétrico, aunque este último sea bastante menos conocido. Así, en lugar de los análisis de varianza con bloques al azar, en el campo no paramétrico se emplean los test de QUADE y de FRIEDMANN, del nombre de los autores que los han propuesto. No descenderemos a las particularidades de los procedimientos remitiendo a los textos especialistas en la materia (CONOVER, 1980); indicaremos sólo que el test de QUADE es un poco más laborioso en el cálculo pero más eficaz si el número de grupos a comparar es inferior a cinco; con cinco grupos, o más, es preferible el test de FRIEDMANN. En cada caso el cálculo conduce a unos parámetros (T1 en el test de QUADE y T2 en el de FRIEDMANN) que siguen con buena aproximación la distribución de la F con (b- 1) (k-l) y K grados de libertad, donde K son los tratamientos a comparar y b los bloques.
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Si la aplicación de los test resulta positiva es posible establecer cuál es el valor mínimo en el que deben diferir las «sumas de los rangos» de varios grupos para ser significativamente diferentes. El camino del análisis estadístico sigue el del tipo clásico sobre las medias, pero trabajando sobre las sumas de los rangos, eventualmente corregidos por un factor ligado a la dispersión en el interior de cada grupo (test de QUADE). TABLA 71 Análisis de varianza de las valoraciones organolépticas sobre muestras de Pinot blanco
Entre vinos Entre degustadores (bloques) Residuo Totales
COLOR S.C. G.L. 723,64 4 3721,20 8 6375,25 32 10820,09 44
Entre vinos Entre degustadores (bloques) Residuo Totales
OLOR S.C G.L. 3760,87 4 4446,62 8 9143,70 32 17351,19 44
C.M. F 180,91 0,91 465,15* 199,23
n.s.
CM. F 940,22 3,29* 555,83 1,95 285,74
SENSACIONES GUSTO-OLFATIV AS S.C. G.L. C.M. Entre vinos 3163,11 4 790,77 Entre degustadores(bloques) 6347,02 8 793,38 Residuo 14723,92 32 460,12 Totales 24234,05 44
F 1,72 n.s. 1,72 n.s.
JUICIO CONJUNTIVO S.C G.L. CM. F Entre vinos 36,58 4 914,68 2,64 Entredegüstadbres (bloques) 4814,06 8 601 ,76 1,74 Residuo 11084,39 32 346,39 Totales 19557,19 44
n.s. n.s.
TABLA 72 Medias obtenidas en la valoración de los distintos caracteres del grupo de vinos 1 (Bombino, Bellone, Vermentino) y 11 (5 muestras de Pinot blanco). Las medias unidas por la línea inferior no son significativamente diferentes Mínima diferencia significativa
Grupos
I II
57,62 54,77
54,58 50,69
COLOR 37,45 46,13
44,70
44,40
15,6 -
I II
53,63 48,44
49,92 42,94
OLOR 38,18 38,64
30,96
22,41
23,10
I II
I II
CARACTERISTICAS. GUSTO-OLFATIVAS 62,17 50,59 39,67 48,10 45,87 37,48 28,68 27,94
56,53 49,92
JUICIO CONJUNTO 51,31 37,48 43,71 32,18 27,69
27,64
-
18,0 -
En las tablas 73 y 74 se presentan los resultados obtenidos. Se observa que las mejoras son verdaderamente substanciales.
279
TABLA 73 Test de Quade aplicado a la valoración de muestras de Bombino, Bellone y Vermentino COLOR T1 =5 0,05 = 40,7 0,01 = 56,1 Be Bo 21 17
Mínima diferencia significativa Suma de rangos:
Ve -38
OLOR T1 = 1,07 n.s. Be 16
Suma de rangos:
Bo 2,5
Ve -18,5
CARACTERISTICAS. GUSTO-OLFATIVAS T1 = 1,87 n.s. Suma de rangos: Be Bo Ve 21 2 -23
TABLA 74 Test de Friedman aplicado ala valoración de 5 muestras de Pinot blanco n Suma de rangos:
COLOR T2 = 1,06 n.s. 2 3 4 33,0 31,5 24,5
1 23,0
5 23,0
OLOR T2 = 7,78** (F con 4 y 32 G.L. = 3,97) Mínima diferencia significativa 0,05 = 10,26 n 3 1 2 5 4 Suma de rangos: 41,0 31,5 25,5 22,5 14,5 CARACTERISTICAS. GUSTO-OLFATIVAS T2 = 3,55* (F con 4 y 32 G.L. = 2,67) Mínima diferencia significativa 0,05 = 12,05 n 3 1 2 5 4 Suma de rangos: 17,0 34,0 25,5 22,0 17,5 JUICIO CONJUNTO T2 = 3,99** Mínima diferencia significativa 0,05 = 11,74 n 3 1 2 5 4 Suma de rangos: 35,5 35,0 26,0 21,0 17,5
En efecto, en lo que respecta a los vinos del Lazio, la diferencia en el color alcanza el nivel altamente significativo del 1 %; también en el caso del juicio conjunto en el que las diferencias son las mismas, apareciendo netamente más evidentes con el test de QUADE. En el caso de los Pinot blancos se obtiene una diferenciación neta tanto para los caracteres olfativos como para las sensaciones gusto-olfativas, las cuales no resultaban distinguibles con el análisis de varianza. La reproducibilidad en el tiempo Otro elemento de variabilidad a tomar en consideración es el ligado al factor tiempo; es evidente que por motivos prácticos no es siempre posible valorar en una sola sesión un número de muestras demasiado numerosas. Surge entonces el problema de la reproducibilidad de las valoraciones efectuadas con el fin de poder comparar juicios emitidos en diferentes tiempos. La incertidumbre deriva del hecho de que los degustadores, como instrumentos de medida, pueden modificar su escala personal de juicio en función de parámetros fisiológicos y psíquicos difíciles de valorar. Estos «disturbios» pueden tener varios orígenes: preocupaciones, leves alteraciones de la salud, etc. El remedio puede consistir en eliminar los juicios que muestran desviaciones excesivas de valoración sobre una muestra testigo introducida entre las otras.
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Desde otro punto de vista cabe preguntarse entre que límites puede variar la valoración media expresada por la misma comisión en un período razonable de tiempo. En la tabla 75 se presentan las puntuaciones medias resultantes para el mismo vino sometido a dos valoraciones distanciadas cerca de un mes, por parte de la misma comisión formada por nueve componentes. Como se ve, aparte del color, para el que entran en juego diversos factores complejos (dificultad de reproducir el mismo tipo de iluminación, etc.) y para el que existen métodos espectrofotométricos bastante eficaces, para los otros parámetros la casi coincidencia de los valores de las medias resulta verdaderamente sorprendente: cuando el número de juicios es suficientemente alto los valores expresados por la misma comisión aparecen razonablemente estables. TABLA 75 Color .......................................................... Olor............................................................ Sabor .......................................................... Juicio conjunto...........................................
Sesión 1 51,51 48,39 47,68 48,21
Sesión 2 58,98 47,70 48,89 48,90
Correlaciones entre composición química y caracteres organolépticos Si pudiéramos disponer de un análisis completo, cualitativo y cuantitativo, de todos los compuestos presentes en un vino, seríamos capaces de caracterizado unívocamente, pero no de valorado cualitativamente. Se pueden presentar muchos ejemplos de vinos con un gran número de parámetros analíticos idénticos, pero que presentan una calidad notablemente distinta e incluso opuesta. Sin embargo, es posible individualizar una serie de parámetros analíticos que deben mantenerse dentro de ciertos límites más allá de los cuales la calidad del vino resulta claramente comprometida. En lo que respecta al color, precisas medidas espectrofotométricas permiten tanto la valoración de la intensidad como la definición del color. Las características olfativas son, al contrario, muy difíciles de correlacionar con los componentes responsables: la fisiología del olfato es extremadamente compleja. Es evidente, por ejemplo, que la nota aromática del moscatel está condicionada por la presencia de particulares alcoholes terpénicos procedentes de la uva, pero lo agradable del perfume está condicionado por equilibrios muy complejos. Contenidos elevados en acetato de etilo son responsables del carácter de picado acético mientras que el carácter afrutado de los vinos jóvenes se debe indudablemente a una serie de ésteres. El análisis por cromatografía de gases, incluso el más selectivo por medio de columnas capilares, es capaz de reconocer y valorar una grandísima cantidad de componentes volátiles, pero no es capaz de dar un aromograma, en el sentido de un perfil correlacionable con las características olfativas y gusto-olfativas del vino. En lo que concierne a la característica gustativa de la acidez existe una correlación efectiva con el valor del pH, aunque el poder tampón ejerce una influencia notable y no profundamente estudiada aún: la influencia particular sobre el gusto atribuída a los distintos ácidos orgánicos no está, todavía, rigurosamente confirmada. La sensación de astringencia depende de los polifenoles y de su grado de polimerización, pero aún no son posibles correlaciones precisas con los valores analíticos relativos a estas substancias. No existe ninguna duda de que el sabor dulce procede de los compuestos hidroxilados y en particular de los azúcares; sin embargo, la combinación de influencias puede ser muy variada interviniendo el alcohol, la glicerina, la relación entre glucosa y fructosa: además, los sabores dulce y ácido se influyen reciprocamente. En conclusión, aunque algunos parámetros analíticos son importantes para garantizar algunas características fundamentales de los vinos, la calidad es apreciable esencialmente por medio del análisis sensorial. Conclusiones El análisis sensorial aplicado a los vinos permite hoy llegar a conclusiones objetivas y seguras. A través del análisis sensorial es posible establecer la existencia de diferencias y preferencias estadísticamente significativas con el empleo del tests precisos, utilizados según una metodología preestablecida.
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También es posible desarrollar una valoración cualitativa de una serie de vinos recurriendo al empleo de escalas no estructuradas y elaborando los datos obtenidos con métodos estadísticos no paramétricos, que permiten no sólo obtener un juicio objetivo sino que, además, alcanzan una buena sensibilidad de discriminación.
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