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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA

NTC 282 1986-09-17

INDUSTRIAS ALIMENTARIAS. HARINA DE TRIGO. MÉTODOS DE ENSAYO

E:

ALIMENTARY INDUSTRIES. WHEAT FLOUR. TEST METHOD

CORRESPONDENCIA: DESCRIPTO DESCR IPTORES: RES:

harina de trigo; harina; producto alimenticio; determinación de la humedad; contenido de proteínas; contenido de cenizas; contenido bromato de potasio; detección sustancias oxidantes; ensayo microscópico; determinación de vitamina B1; determinación de vitamina B2; determinación de vitamina PP; determinación de vitamina D; contenido de calcio; contenido de gluten seco; ensayo.

I.C.S.: 67.060.00 Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC) Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

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Segunda actualización Editada 2002-10-07

PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último caracterizado por la participación del público en general. La NTC 282 (Segunda actualización) actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 1986-09-17. Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través de su participación en el Comité Técnico C10.4 ACEGRASAS S.A. FEDEMOL FEDEPAS INDUSTRIAS ALIMENTICIAS - NOEL INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO INSTITUTO COLOMBIANO DE BIENESTAR FAMILIAR - I.C.B.F INSTITUTO DE MERCADEO AGRO AGROPE PECU CUAR ARIO IO - IDE IDEMA MA INSTITUTO DE INVESTIGACIONES TECNOLÓGICAS

INSTITUTO INGEOMINAS LA AMERICANA DE GRASAS S.A. MINISTERIO DE AGRICULTURA NESTLÉ DE COLOMBIA S.A. QUÍMICOS COLOMBIANOS LTDA. SUPERINTENDENCIA DE INDUSTRIA Y COMERCIO UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales. DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN


NTC 282 (Segunda (Segund a actualización) actuali zación)

INDUSTRIAS ALIMENTARIAS. HARINA DE TRIGO. MÉTODOS DE ENSAYO

1.

OBJETO

Esta norma tiene por objeto establecer los métodos de ensayo para valorar las características de la harina de trigo.

6.

ENSAYOS

6.1

DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD

6.1.1 Aparatos Estufa de aire caliente y cápsula metálica o de porcelana, provista de tapa.

6.1.2 Procedimiento Se pesan 5 g de la muestra en una cápsula metálica o de porcelana provista de tapa previamente tarada. Se introduce la cápsula con la muestra junto con la tapa en la estufa y se calienta entre 100 °C y 110 °C durante 5 h. Terminado este período, se ajusta la tapa a la cápsula se deja enfriar en el desecador y se pesa a la temperatura ambiente. Se repite la operación hasta que en 2 pesadas consecutivas no se obtenga una diferencia mayor de 0,001 g. La pérdida de masa se considera como humedad.

6.1.3 Interpretación de los resultados La humedad expresada en porcentaje en masa se calcula mediante la siguiente ecuación: Humedad =

( A − B ) M

x 100

Donde: A

=

mas a de la cápsula más la muestra húmeda, en gramos.

B

=

Masa de la cápsula más la muestra seca, en gramos.

M

=

Masa inicial de la muestra, en gramos. 1

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA 6.2


DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

6.2.1 Método A 6.2.1.1 Aparatos. Matraces y alargaderas alargaderas Kjeldahl. 6.2.1.2 Reactivos -

Ácido sulfúrico concentrado (93 % - 98 %), libre de nitrógeno.

-

Óxido de mercurio o mercurio metálico, libre de nitrógeno.

-

Sulfato de sodio anhidro o sulfato de potasio, libre de nitrógeno

-

Solución de tiosulfato tiosulfat o de sodio. Se disuelven 80 g de tiosulfato tiosulfat o de sodio 3 (Na2S203.5H20) en 1 000 cm de agua. Se puede utilizar también solución de sulfuro de sodio o de potasio. Se disuelven 40 g de sulfuro de sodio o potasio en 1 000 cm 3 de agua.

-

Solución concentrada de hidróxido de sodio. Se disuelven 450 g de hidróxido de sodio en 1 000 cm 3 de agua.

-

Granallas de cinc reactivo puro que pase a través del tamiz ICONTEC 20 µm (No.841).

-

Solución de rojo de metilo como indicador. Se prepara disolviendo 1 g de rojo de metilo en 200 cm 3 de alcohol absoluto.

-

Solución 0,5 N de ácido clorhídrico o de ácido sulfúrico, Si la cantidad de nitrógeno es pequeña puede utilizarse solución 0,1 N de ácido clorhídrico o de ácido sulfúrico.

-

Solución 0,1 N de hidróxido de sodio, libre de carbonato.

6.2.1.3 Procedimiento -

Se pesan 0,7 g a 2,2 g de muestra de harina y se colocan en un matraz Kjeldahl junto con 0,7 g de óxido de mercurio ó 0,65 g de mercurio metálico, 10 g de sulfato de potasio pulverizado o de sulfato de sodio anhidro y 25 cm 3 de ácido sulfúrico concentrado. Si la masa de la muestra es superior a 2,2 g, se aumenta la cantidad de ácido sulfúrico en 10 cm3 por gramo de muestra suplementaria. Se coloca el matraz en posición inclinada y se calienta suavemente hasta que desaparezca la espuma (si es necesario se añade un poco de parafina para reducir la espuma); se hierve vigorosamente la solución hasta que quede límpida, manteniendo la ebullición durante 30 min más.

-

Se deja enfriar la solución, se añaden 200 cm 3 de agua y se enfría por debajo de 25 °C. Se agregan 25 cm 3 de solución de tiosulfato de sodio o de sulfuro de sodio o de potasio y se mezcla para precipitar el mercurio añadiendo si es necesario un poco de granallas de cinc para evitar sacudidas. Se inclina el matraz y se agrega una capa de solución concentrada de hidróxido de sodio en cantidad suficiente para alcalinizar fuertemente el contenido del matraz, la solución de tiosulfato o de sulfuro se puede de mezclar con la solución de hidróxido de sodio antes de introducirla en el matraz. 2



-

Se conecta inmediatamente inmediatamente el matraz al aparato de destilación con la punta del condensador sumergida sumergida en 25 cm 3 de la solución 0,1 N de ácido sulfúrico o clorhídrico o solución 0,5 N de estos ácidos contenida en un matraz, se agita el matraz para mezclar completamente su contenido y se calienta hasta que todo el amoníaco haya destilado. Se recogen aproximadamente 150 cm 3 de destilado.

-

Se valora el exceso de ácido con un solución valorada 0,1 N de hidróxido de sodio utilizando el indicador. Paralelamente debe llevarse a cabo la determinación de un blanco.

6.2.1.4 Interpretación de los resultados. El contenido de proteínas, expresado como porcentaje se calcula aplicando la siguiente ecuación: Pr oteínas % =

100( V 1 N 1 − V 2 N 2 )

x 0 ,014 x 5 ,7

M

Donde: V 1

=

Volumen en cm3 de la solución de ácido.

N 1

=

Normalidad de la solución de ácido.

V 2 2 =

Volumen en cm3 de la solución de hidróxido de sodio.

N2 =

Normalidad de la solución de hidróxido de sodio.

M

Masa en g de la muestra.

=

0,014 = 5,7

=

Miliequivalente Miliequivalent e de nitrógeno. Factor de proteínas en la harina de trigo.

6.2.2 Método B 6.2.2.1 Aparatos. Matraces, alargaderas Kjeldahl. 6.2.2.2 Reactivos -

Ácido sulfúrico concentrado (93 % - 98 %) libre de nitrógeno.

-

Selenio en polvo.

-

Sulfato de sodio anhidro o sulfato de potasio, libre de nitrógeno.

-

Solución concentrada de hidróxido de sodio. Se disuelven 450 g de hidróxido de sodio en 1 000 cm 3 de agua.

-

Granallas de cinc reactivo puro, tamiz ICONTEC 20 (841 µm).

-

Solución indicadora 1:1 de azul de metileno (Solución al 0,05 % en agua) y rojo de metilo (Solución al 1% en alcohol absoluto) . 3



-

Solución al 2 % de ácido bórico.

-

Solución 0,5 N de ácido sulfúrico o de ácido clorhídrico. clorhídric o. Si la cantidad de nitrógeno es pequeña puede utilizarse solución 0,1 N de ácido sulfúrico o clorhídrico.


Se pesan de 0,7 g a 2,2 g de muestra de harina y se coloca en un matraz Kjeldahl con una pequeña cantidad de selenio en polvo, 10 de sulfato de potasio pulverizado o de sulfato de sodio anhidro y 25 cm 3 de ácido sulfúrico concentrado. Si el peso de la muestra es superior a 2,2 g se aumenta la cantidad de ácido sulfúrico en 10 cm 3 por gramo de muestra suplementaria. Se coloca el matraz en posición inclinada y se calienta suavemente hasta que desaparezca la espuma (si es necesario se añade un poco de parafina para reducir la espuma), se hierve vigorosamente la solución hasta que quede límpida manteniendo la ebullición durante 30 min más.

-

Se deja enfriar la solución, se añaden unos 200 cm 3 de agua destilada y se deja enfriar de nuevo por debajo de 25 °C. Se agregan granallas de cinc. Se inclina el matraz y se agrega una capa de 75 cm 3 de solución concentrada de hidróxido de sodio.

-

Se conecta rápidamente el matraz al aparato de destilación, con la punta del condensador sumergida en unos 150 cm 3 de solución de ácido bórico con 0,35 % de la solución indicadora y se deja destilar hasta completa unos 250 cm 3 de destilado, sin que cambie el color verde del indicador.

-

Se valora con solución 0,5 N de ácido sulfúrico o de ácido clorhídrico o con solución 0,1 N de estos ácidos. Paralelamente debe llevarse a cabo la valoración de un blanco.

-

Interpretación de los resultados. El contenido de proteínas, expresado como porcentaje, se calcula aplicando la siguiente ecuación:

Pr oteínas (%) (%) =

Donde:

( a − b ) N x 0 ,014 x 5 ,7

x100

M

a

=

Volumen en cm3 del ácido gastado en la valoración de la muestra.

b

=

Volumen en cm3 del ácido gastado en la valoración del blanco.

N

=

Normalidad del ácido.

M

=

Masa de la muestra.

0,014 =

Miliequivalente del nitrógeno.

5,7

Factor de proteínas de la harina de trigo.

=

4



DETERMINACIÓN DE CENIZAS

6.3.1 Aparatos -

Mechero Bunsen

-

Mufla

-

Cápsula de platino o porcelana

-

Desecador

-

Balanza analítica

6.3.2 Procedimiento Se pesan 3-5 ( ± 0,1 g) gramos de muestra en una cápsula de platino o, en su defecto de porcelana previamente tarada. Se calienta poco a poco la cápsula en un mechero Bunsen procurando que el calentamiento no sea excesivo pero sí uniforme para lograr la carbonización carbonización completa de la muestra. Cuando se observe que ya no se desprenden vapores combustibles combustibles se introduce la cápsula a la mufla y se eleva la temperatura a 550 °C (rojo sombra) hasta que las cenizas queden grises claras. Se deja enfriar la cápsula en un desecador y se pesa a la temperatura ambiente hasta masa constante.

6.3.3 Interpretación de los resultados El contenido de cenizas, expresado en porcentaje, se calcula aplicando la siguiente ecuación:

Cenizas (%) (%) =

( B − C ) ( A − C )

X 100

Donde: A

=

Masa de la cápsula más muestra, en gramos.

B

=

Masa de la cápsula más cenizas, en gramos.

C

=

Masa de la cápsula vacía, en gramos.

Nota 1. Teniendo en cuenta que las cenizas de la harina de trigo son altamente higroscópicas no se deben enfriar más de 6 muestras en el desecador cuando el ambiente es muy húmedo.

6.4

IDENTIFICACIÓN DE SUSTANCIAS OXIDANTES

6.4.1 Principio del método Detecta la presencia de agentes oxidantes normalmente agregados a la harina, excepto percloratos, peróxido de benzoilo y azodicarbamida.

5



6.4.2 Aparatos -

Placas rectangulares de vidrio, de hierro galvanizado rígido o de madera de aproximadamente 12 cm de longitud y 8 cm de ancho.

-

Espátula para harinas.

6.4.3 Reactivos -

Solución de yoduro de potasio al 3 %

-

Solución de ácido sulfúrico al 5 %

6.4.4 Procedimiento -

Se colocan en el extremo de la placa, aproximadamente aproximadamente 10 g a 15 g de harina y con la ayuda de la espátula se extiende la muestra de tal forma que inicialmente la capa tenga un grosor de aproximadamente 0,5 cm y al final sea solo una película delgada.

-

Con la espátula se cortan los bordes de la película para formar un rectángulo perfecto y cuidadosamente cuidadosamente se sumerge la placa en agua fría, durante un minuto.

-

Inmediatamente antes del uso se mezclan volúmenes iguales de yoduro de potasio y ácido sulfúrico y con la ayuda de una pipeta con cuentagotas se aplican sobre la placa de 5 gotas a 10 gotas de reactivo.

6.4.5 Interpretación de resultados La aparición de manchas de color púrpura intenso indica la presencia de agentes oxidantes. Nota 2. El nivel de agente oxidante en la muestra de harina puede estimarse comparando la densidad de las manchas obtenidas contra una serie de muestras de harina que contengan concentraciones conocidas de agente oxidante.

6.5

DETERMINACIÓN DEL BROMATO DE POTASIO

6.5.1 Aparatos -

Agitador de vidrio cm velocidad variable.

-

Vaso de 800 cm3 de capacidad.

-

Matraz Erlenmeyer de 200 cm3 de capacidad

-

Papel de filtro Whatman No. 12.

-

Bureta, graduada en 0,05 cm3 de 10 cm3 de capacidad. 6



6.5.2 Reactivos -

Solución al 2 % de sulfato de zinc

-

Solución 0,4 N ± 0,01 N de hidróxido de sodio.

-

Solución 0,5 N ± 0,01 N de hidróxido de sodio.

-

Solución de ácido sulfúrico diluido. Se le agregan 112 cm 3 de ácido sulfúrico concentrado a 800 cm3 de agua. Se enfría y se diluye hasta 1 000 cm 3.

-

Solución de yoduro de potasio. Se le agregan 25 g de yoduro de potasio a 30 cm 3 de agua y se diluye hasta 50 cm 3. Se guarda en frascos de color ámbar y en lugares frescos. Se deben descartar las soluciones que presenten tintes amarillos producto de la presencia del yodo libre.

-

Solución de molibdato de amonio. Se le agregan 3 g de molibdato de amonio, a 80 cm 3 de agua y se diluye hasta 100 cm 3.

-

Solución de bromato de potasio. Se agregan 5,00 g de bromato, de potasio secado a 110 °C aproximadamente durante 1 h, a 800 cm 3 de agua y se diluye hasta 1 000 cm 3.

-

Solución patrón de bromato de potasio. Se diluyen 25 cm 3 de solución de bromato de potasio en 500 cm 3 de agua.

-

Solución de yodato de potasio 0,0898 N. Se le agregan 3,204 g de yodato de potasio secado a 110 °C aproximadamente durante 1 h a 800 cm 3 de agua y se diluye hasta 1 000 cm 3.

-

Solución patrón de yodato de potasio 0,003 59 N. Se diluyen 10 cm 3 de solución de yodato de potasio 0,089 8 N en 250 cm 3 de agua. Esta solución se debe preparar en el momento de usarla.

-

Solución de tiosulfato de sodio. Se disuelven 22,5 g de tiosulfato de sodio y 0,06 g de carbonato de sodio anhidro en 800 cm 3 de agua y se diluye hasta 1 000 cm 3

-

Solución patrón de tiosulfato de sodio 0,003 59 N. Se diluyen 10 cm 3 de la solución de tiosulfato de sodio en 250 cm 3. Esta solución se debe preparar en el momento de usarla.

-

Solución de almidón. Se debe preparar en el momento de usarla.

6.5.3 Procedimiento 6.5.3.1 Se transfieren cuantitativamente 200 cm 3 de solución de sulfato de cinc a un vaso de 800 cm3 y se agita por medio de una mezcladora de velocidad variable con agitador de vidrio. Se le agrega 50 g ± 0,1 g de la muestra a la solución de sulfato de cinc en porciones de 2 g a 5 g, se continúa la agitación durante 5 min o hasta tanto la harina de la superficie esté uniformemente dispersa y se le añaden 50 cm 3 de solución 0,4 N de hidróxido de sodio. Se disminuye la velocidad del agitador y se continúa agitando durante otros 5 min.

7



6.5.3.2 Si es necesario se filtra o centrifuga para clarificar la mezcla. 6.5.3.3 Se transfieren 50 cm 3 de esta solución a un matraz Erlenmeyer de 200 cm 3 o si se toma una alícuota más pequeña a ésta se diluye aproximadamente hasta 50 cm 3. Se le añaden 10 cm 3 de solución diluida de ácido sulfúrico y 1 cm 3 de solución de yoduro de potasio, una gota de molibdato de amonio y 50 cm 3 de agua. Con continua agitación se añade un exceso de solución patrón tiosulfato de sodio (5 - 10 cm 3) (V1). 6.5.3.4 Se agregan 5 cm 3 de solución de almidón y se valora el exceso de tiosulfato con solución patrón de yodato de potasio 0,003 59 N. Cerca del punto final, el yodato se añade lentamente observando el matraz contra una superficie blanca después de cada adición. La primera aparición de un tinte rojizo-púrpura se toma como punto final. Se lee la bureta (V 2) y se añaden 1 gota a 2 gotas más para confirmar. 6.5.3.5 Se añade otro cm 3 de solución patrón de tiosulfato de sodio y se valora de nuevo hasta el punto final. Se lee la bureta (V 3). 6.5.3.6 Con el fin de determinar el factor de recuperación para hacer una corrección de los resultados se procede de la manera siguiente: a)

Se diluye un volumen conocido de 4 a 10 cm3 (X) de solución patrón de bromato de potasio hasta 250 cm 3. Se toman 50 cm3 y se procede según los numerales 6.5.3.3 y 6.5.3.4.

b)

Se suspenden separadamente separadamente por medio de agitación dos porciones de 50 g de harina libre de bromato en porciones de 200 cm 3 de solución de sulfato de cinc.

c)

A una de las suspensiones suspensiones anteriores (blanco) se le añaden 10 cm 3 de agua; a la otra suspensión (recuperación) se le añaden X cm 3 de solución de bromato de potasio y (10 - X) cm 3 de agua. Se continúa como en el numeral 6.5:3.1 (Excepto que se le añaden 40 cm 3 de solución 0,5 N de hidróxido de sodio con agitación constante). Se continúa como en los numerales 6.5.3.2 y 6.5.3.3 (pero utilizando 5 cm3 de solución patrón de tiosulfato de sodio para el blanco y 10 cm 3 para la suspensión de recuperación). Se procede como en el numeral 6.5.3.4.

6.5.4 Interpretación de los resultados 6.5.4.1 La cantidad de bromato de potasio añadido (ppm) se calcula aplicando la siguiente ecuación: Bromato de potasio añadido (ppm) = 10 (V 4 - V 5 5 )

Donde: V 4

=

Volumen en cm 3 de solución patrón de tiosulfato de sodio usada en el numeral 6.5.3.6.a)

V 5 5

=

Volumen en cm3 de la solución patrón de yodato de potasio usada en el numeral 6.5.3.6.a). 8



6.5.4.2 La cantidad de bromato de potasio recuperado (ppm) se calcula aplicando la siguiente ecuación: Bromato de potasio recuperado (ppm) = Bromato de potasio en la suspensión de recuperación - Bromato de potasio en la suspensión del blanco.

Siendo: Bromato de potasio en la suspensión de recuperación = 10 (10 - V 6 6 )

En que: V 6 6

=

Volumen en cm3 de la solución patrón de yodato de potasio usada para la valoración de la suspensión de recuperación en el numeral 6.5.3.6 c).

y

=

Bromato de potasio en la suspensión del blanco = 10(5-V 7)

En que: Volumen en cm3 de la solución patrón de yodato de potasio usado en la suspensión del blanco en el numeral 6.5.3.6c).

=

V 7 7

6.5.4.3 El factor de recuperación (F) se calcula aplicando la siguiente ecuación:

F =

Bromato de potasio añadido Bromato de potasio recuperado

6.5.4.4 La cantidad de bromato de potasio (ppm) presente en la muestra se calcula aplicando la siguiente ecuación: Bromato de potasio (ppm) = 5F (1 + V 1 - V 2 2 - V 3 )

Donde: V 1

=

V 2 2

6.6

Volumen en cm3 de la solución patrón de tiosulfato de sodio usado en el numeral 6.5.3.3 (5 - 10 cm 3).

=

V 3

=

F

=

Volumen en cm3 de la solución patrón de yodato de potasio usado en el numeral 6.5.3.4. Volumen en cm3 de la cantidad de solución patrón de yodato de potasio usado en ambas titulaciones Factor de recuperación. recuperación.

ENSAYO MICROSCÓPICO

6.6.1 Aparatos -

Microscopio con objetivos y valor micrométrico 9

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA -

Portaobjetos.

-

Cubreobjetos.


6.6.2 Procedimiento 6.6.2.1 Al realizar el ensayo microscópico en la harina de trigo los gránulos de almidón se presentan aislados, generalmente grandes lenticulares casi globosos y en parte pequeños, esféricos o ligeramente poligonales e irregulares en su forma. 6.6.2.2 Los granos de almidón de trigo grandes miden de 20 micras a 30 micras de diámetro y los pequeños oscilan alrededor de 5 micras; hay pocos gránulos de tamaño intermedio. 6.6.2.3 Los granos de almidón de trigo generalmente no presentan ni estratificación, ni hilo; solo en casos raros se nota una ligera estratificación regular hacia su periferia. 6.6.2.4 Los granos de almidón de trigo vistos de perfil, presentan un aspecto elipsoide y un sombreado central lineal que es lo que lo distingue de otras harinas.

6.6.3 Resultados 6.6.3.1 Después de efectuar el anterior estudio microscópico de los gránulos de almidón de trigo se reportará como: ausencia total de otros tipos de harina si coincide en su totalidad la morfología de los gránulos con los descritos anteriormente: y mezcla con otros tipos de harinas, en el caso que haya otros tipos de gránulos de almidón diferentes a los descritos para los de trigo.

6.7

DETERMINACIÓN DE LA VITAMINA B1, MÉTODO U.S.P.

6.7.1 Aparatos -

Estufa eléctrica 105 °C.

-

Incubadora eléctrica a 42 °C ± 1 °C con control automático.

-

Baño María.

-

Fotofluorímetro Coleman Modelo 12 o equivalente. Filtros primarios 12221, Filtro secundario 14211.

-

Cronómetro.

-

Balanza de precisión.

6.7.2 Material -

Vasos de precipitados de 100 cm3.

-

Balones volumétricos de 1 000 cm3, 200 cm3, 100 cm3 y 50 cm3.

-

Pipetas volumétricas de 50 cm3, 10 cm3, 5 cm3, 3 cm3 y 2 cm3.

-

Pipetas graduadas de 5 cm3. 10



-

Papel de filtro.

-

Tubos de ensayo 25 x 210 mm.

-

Bureta de 50 cm3.

-

Mortero.

-

Erlenmeyer de 125 cm3 boca esmerilada.

6.7.3 Reactivos 6.7.3.1 Solución ácida de cloruro de potasio. potasio. Se pesan 250 g de cloruro de potasio y se llevan a 3 1 000 cm con agua destilada a 20 °C. Por cada 100 cm 3 de esta solución se agregan 0,9 cm 3 de ácido clorhídrico concentrado. Esta solución se debe conservar en un f rasco de color ámbar. 6.7.3.2 Reactivo oxidante a)

Solución de ferrocianuro ferrocianu ro de potasio al 1 %: Se disuelve 1 g de ferrocianuro ferrocian uro de potasio 3 en 100 cm de agua destilada.

b)

Solución de ferrocianuro para análisis: Se toman 4 cm 3 de la solución de ferrocianuro al 1 % y se completa a 100 cm 3 con hidróxido de sodio, al 15 %.

6.7.3.3 Solución madre de sulfato de quinina. Se pesan exactamente 10 mg de sulfato de quinia y se llevan a 1 000 cm 3 con ácido sulfúrico 0,1 N. Se debe conservar esta solución en un frasco de color ámbar en la nevera. 6.7.3.4 Solución de sulfato de quinina para análisis: Se prepara en el mometo de su uso en la siguiente forma: se mezcla 1 cm 3 de solución madré y 39 cm 3 de ácido sulfúrico 0,1 N. Esta solución tiene una fluorescencia aproximada a la obtenida del tiocromo con 1 µg de clorhidrato de tiamina. 6.7.3.5 Solución madre de tiamina. Se seca previamente la tiamina en una estufa a 105 °C durante 2 h se pesa exactamente 25 mg del clorhidrato de tiamina y se pasa a un balón aforado de 1000 cm 3, disolviendo en aproximadamente 300 cm 3 de alcohol etílico diluido 1:5. Se ajusta el pH a 4 con ácido clorhídrico y se completa a 1 000 cm 3 con alcohol etílico, 1:5 (1 cm3= 25 g de tiamina). Esta solución se debe guardar el abrigo de la luz y en la nevera. 6.7.3.6 Solución de tiamina para el análisis -

Solución a. Se miden 4 cm3 de la solución madre de tiamina y se diluye a 100 cm 3 con la solución ácida de cloruro de potasio (1 cm 3 = 0,2 µg de tiamina) .

-

Solución b. Se miden 10 cm3 de la solución y se lleva a 50 cm 3 con la solución ácida de cloruro de potasio (1 cm 3=0,2 µg de tiamina). Esta es la solución final que se utiliza en el análisis.

11



6.7.3.7 Papaína p.a. 6.7.3.8 Diastasa

6.7.4 Preparación de la muestra -

Se pesan 5 g del producto y se forma una pasta con 30 cm 3 de ácido clorhídrico 0,1 N, se traspasa cuantitativamente a un Erlenmeyer de 125 cm 3 de boca esmerilada; se enjuaga el vaso con 20 cm 3 adicionales adicionales de ácido clorhídrico 0,1 N, se coloca a reflujo en baño de María hirviente durante 30 min y en corriente de nitrógeno.

-

Se deja enfriar y se ajusta el pH a 4,6 con hidróxido de sodio al 15 %. Se añaden a la mezcla 0,3 g de papayotina y 0,6 g de diastasa puestos en suspensión con más o menos 2 cm 3 de agua destilada. Se deja fermentando durante la noche a 42 °C.

-

Se trasvasa a un balón aforado de 100 cm 3, se adicionan 10 cm 3 de la solución ácida de cloruro de potasio; se lleva a 100 cm 3 con agua destilada.

-

Se mezcla y se toma una alícuota de 50 cm3, se lleva a un balón de 100 cm 3 y se completa a volumen con la solución ácida de cloruro de potasio se mezcla y se filtra.


Se toman 3 tubos de 25 mm x 210 mm, tanto para el blanco como para el producto.

-

Serie del patrón. Se toman dos tubos y se coloca en cada uno de ellos 5 cm 3 de la solución b de tiamina. Se añaden 3 cm 3 de mezcla oxidante y antes de 20 s se agregan 20 cm3 de isobutanol.

-

Blanco del patrón. Se toman 5 cm3 de la solución b de tiamina, se añaden 3 cm 3 de hidróxido de sodio al 15 %, se mezcla y antes de 20 s se añaden 20 cm 3 de isobutanol.

-

Serie del producto. Se toman dos tubos y se coloca en cada uno de ellos 5 cm 3 de filtrado del producto. Se añaden 3 cm 3 de mezcla oxidante, se agita y antes de 20 s se agregan 20 cm 3 de isobutanol.

-

Blanco del producto. Se toman 5 cm3 del filtrado del producto y se añaden 3 cm 3 de hidróxido de sodio al 15 %, se mezcla y antes de 20 s se añaden 20 cm 3 de isobutanol.

-

Una vez concluidas las operaciones anteriormente enumeradas enumeradas se agita cada tubo durante 90 s haciendo burbujear aire; se deja en reposo hasta la separación completa de las fases; se adiciona a cada tubo 2 cm 3 de alcohol etílico se agita y se dejan separar las capas y se transfiere la capa scbrenadante a los tubos del fotofluorímetro.

-

Se ajusta el fotofluorímetro con la solución de quinina para el análisis a 60. Se procede a efectuar las lecturas, primero el blanco, luego el patrón y así sucesivamente con los productos.

6.7.6 Cálculos 6.7.6.1 El contenido de vitamina B 1 se expresa en mg vitB 1/100 g de producto. 12



St − B1St P − B1 P

mg VitB1 / 100 g =

PSt St

x Factor

Donde: B1St

=

Lectura del blanco del patrón.

St

=

Lectura del patrón.

B1P

=

Lectura del blanco del producto

p

=

Lectura del producto.

Factor =

6.8

0,8

DETERMINACIÓN DE VITAMINA B2 (MÉTODO QUÍMICO POR FLUORIMETRÍA)

6.8.1 Principio Consiste en que después de la extracción se mide la fluorescencia propia de la vitamina B 2, eliminando las fluorescencias secundarias de otras sustancias ajenas a la vitamina B 2. Un criterio que permite juzgar si el método químico es aplicable o no es el valor retenido por el blanco. Si este no pasa de 5 divisiones en la escala de 100 del fotofluorímetro. En los casos favorables las lecturas deben estar entre cero y 2 divisiones.

6.8.2 Aparatos -

Cronómetros

-

Baño María

-

Centrífuga

-

Fotofluorírmetro Coleman Modelo 12 o equivalente

-

Filtro primario 12-222

-

Filtro secundario 12-212

-

Balanza de precisión

-

Papel de filtro

-

Balones aforados de 1 000 cm3 y 100 cm3

-

Erlenmeyeres de 50 cm3 y 300 cm3. 13



-

Embudos de 75 mm de φ.

-

Pipetas volumétricas de 10,3 cm3 y 1 cm3.

-

Pipetas graduadas de 1 cm3

-

Tubos de centrifuga de 50 cm3

-

Vasos de precipitado de 100 cm3

6.8.3 Reactivos -

Acetato de sodio, 2,5 M. Se pesan 345 g de acetato de sodio y se llevan a 1 000 cm 3 con agua destilada.

-

Ácido clorhídrico 0,1 N.

-

Ácido acético glacial.

-

Permanganato, de potasio al 4 %.

-

Agua oxigenada al 3 %.

-

Ditionato de sodio.

-

Solución madre de vitamina B2. Se disuelven 50 g de vitamina B 2 en un balón aforado de 1 000 cm3 (si es posible vidrio ámbar) con una mezcla de 700 cm 3 de agua y 1,2 cm 3 de ácido acético glacial. Se calienta en baño María hasta completa disolución de la vitamina, se enfría la solución y se completa con agua hasta 1 000 cm 3, esta solución se debe conservar en un frasco de color ámbar y en la nevera.

-

Solución de vitamina B2 para análisis. Se toman 3 cm 3 de la solución madre de vitamina B2 y se lleva a 50 cm3 con agua. 3

1 cm = 3 µg de vitamina B 2

6.8.4 Procedimiento 6.8.4.1 Teniendo en cuenta que la vitamina B 2 es muy sensible a la luz, se deben proteger todas las soluciones que contienen vitamina B 2 trabajando en lo posible en vidrio de color ámbar recubriendo el material con papel aluminio común 6.8.4.2 Preparación de los productos. Para los productos que contienen almidón que son a base de cereales, se pesan 2,5 g y se procede a una hidrólisis enzimática después de la hidrólisis ácida (como los productos que no contienen almidón). a)

Para este fin se ajusta el pH de la solución a 4,6 cm con la ayuda de 5 cm 3 de acet acetat ato o de sodio 2,5 M y luego se añade 0,5 g de takadiastasa, takadias tasa, se incuba i ncuba a 42 °C durante 2 h o una noche. 14

NORMA TÉCNICA COLOMBIANA b)


Se trasvasa cuantitativamente a un balón aforado, de 100 cm 3, se lleva a volumen y se filtra.

6.8.4.3 Oxidación de las sustancias fluorescentes secundarias. Se preparan 4 tubos de centrífuga y se trabaja según el siguiente esquema: Tubos Solución problema Agua Solución madre B2 Ácido acético glacial

A1 10 cm3 1 cm3 1 cm3

A2 10 cm3 1 cm3 1 cm3

Permanganato de potasio Agua oxígena

0,5 cm3 0,5 cm3

0,5 cm3 0,5 cm3

ES1 10 cm3 1 cm3 1 cm3 Mezclar bien 0,5 cm3 0,5 cm3

ES2 10 cm3 1 cm3 1 cm3 0,5 cm3 0,5 cm3

6.8.4.4 Observaciones. Es necesario se deje reaccionar 2 min antes de añadir el agua oxigenada; por ésto es conveniente que se agregue el permanganato de potasio en cada tubo a intervalos de 15 s y se mezclen rápidamente las soluciones, se espera un minuto y se añade igualmente el agua oxigenada con 15 s de intervalo. De esta manera la reacción se efectúa en igual tiempo en cada tubo. Se debe agitar cada tubo hasta completa decoloración y se debe expulsar el oxígeno formado. Si es necesario se debe centrifugar durante 2 min para obtener soluciones claras. -

Lecturas fluorimétricas. Se trasvasa el contenido de los tubos centrifugados a los tubos originales Coleman y se coloca un tubo suplementario con agua. Se regula el cero del aparato con el tubo que contiene agua. Después con la solución Al se ajusta la aguja a 35. Se leen en seguida las soluciones A2, ES1,y ES2 sin mover el aparato. Para tener en cuenta eventuales fluorescencias secundarias, se añade en cada tubo leído 20 mg de ditionato de sodio. Se agita fuertemente y se hace la lectura en un lapso de tiempo de 10 s.

6.8.5 Cálculos El contenido de vitamina B 2 está dado por la siguiente ecuación:

mg Vita min a B2 / 100 g =

x 3 µ g x V ( ES − A ) x 100 x P ( A − B1 )

Donde: A

=

El promedio de las lecturas A1 y A2

ES

=

El promedio, de las lecturas ES1 y ES2

B1

=

El promedio de las lecturas de los 4 blancos

V

=

Volumen al que se diluyó la muestra, en cm 3

P

=

Masa de la muestra, en g. 15



DETERMINACIÓN DE VITAMINA pp (NIACINA) MÉTODO MICROBIOLÓGICO

6.9.1 Aparatos -

Balones volumétricos de 200 cm 3 y 100 cm3.

-

Pipetas graduadas de 2 cm3 y 1 cm3

-

Probetas graduadas de 200 cm3.

-

Buretas de 5 cm3

-

Erlenmeyeres de 250 cm3.

-

Autoclave

-

Centrífuga a 300 rpm

-

Incubadora a 37 °C.

-

Espectrofotómetro con sus celdas correspondientes. correspondientes.

-

Tubos 180 mm x 18 mm.

6.9.2 Reactivos -

Solución patrón de vitamina pp.

-

Ácido clorhídrico.

-

Hidróxido de sodio al 30 %.

-

Papel indicador.

-

Amilasa.

-

Papel de filtro.

-

Cultivo puro de Lactobacillus Lactobacillus plantarum.

-

Medio de cultivo para determinación de la niacina.

-

Medio de cultivo líquido para el desarrollo de la cepa de Lactobacillus Lactobacillu s plantarum.

6.9.3 Preparación de los medios de cultivo 6.9.3.1 Medio de cultivo para la determinación de la niacina. -

Solución S olución ácida de caseína hidrolizada

12 g 16



-

Dextrosa para microbiología microbiología

40 g

-

Acetato de sodio

20 g

-

L-cistina.

0,4 g

-

DL-triptófano

0,2 g

-

Sulfato de adenina

20 mg

-

Hidrocloruro de guanina

20 mg

-

Uracilo

20 mg

-

Hidrocloruro Hidrocloruro de tiamina

200 mcg

-

Pantotenato, de calcio

200 mcg

-

Hidrocloruro de piridoxina

400 mcg

-

Riboflavina Riboflavina

400 mcg

-

Ácido P - Aminobenzoíco Aminobenzoíco

100 mcg

-

Biotina

0,8 mcg

-

Fosfato dipotásico

1g

-

Fósfato monopotásico. monopotásico.

1g

-

Sulfato de magnesio

0,4 g

-

Cloruro de sodio

20 mg

-

Sulfato ferroso

20 mg

-

Sulfato de manganeso

20 mg

a)

Se disuelven los ingredientes ingredientes en 100 cm 3 de agua destilada.

6.9.3.2 Medio de cultivo líquido para desarrollo de la Cepa Lactobacillus plantarum. -

Leche peptonizada

15 g

-

Extracto de levadura

5g

-

Dextrosa para microbiología microbiología

10 g

-

Jugo de tomate (100 cm3)

5g

-

Fosfato monobásico de potasio

2g 17



Solución de polisorbato 80

1g

a)

Se disuelven los componentes en 100 cm 3 de agua destilada. Se deja en ebullición 1 min o 2 min.

b)

Se reparte en porciones de 9 cm3 en tubos de 10 mm x 160 mm y se esteriliza a 121 °C por 15 min.

6.9.4 Preparación del extracto del producto -

Se pesa 1 g del producto en un Erlenmeyer de 250 cm 3 se añaden 50 cm 3 de ácido clorhídrico y se disuelve bien.

-

Se esteriliza en autoclave 15 min a 121 °C se enfría y se ajusta el pH a 4,6 con hidróxido de sodio al 30 %.

-

Se transfiere a un balón de 200 cm3 y se completa con agua destilada. Se filtra a través de un filtro plisado.

-

Se toman 20 cm3 de esta solución y se lleva a 100 cm 3 con agua destilada.

6.9.5 Procedimiento 6.9.5.1 Preparación de la solución madre de ácido nicotínico (vitamina pp). Se pesan exactamente 10 mq de ácido nicotínico, se disuelven en 100 cm 3 de agua destilada, antes de emplearla se deben hacer las siguientes diluciones: a)

Se toma 1 cm3 de esta solución y se lleva a 100 cm 3 con agua destilada.

b)

Para la siguiente dilución se toman 10 cm 3 de la dilución anterior y se lleva a 100 cm3.

6.9.5.2 Desarrollo del cultivo. El día anterior al que se va a efectuar el ensayo, se inoculan 2 tubos que contienen el medio de cultivo para el desarrollo de la cepa con Lactcbacillus plantarum. Se incuban los tubos a 37 °C por 15 h a 18 h. 6.9.5.3 Preparación del ensayo en tubos. Serie patrón a)

Se miden en tubos de 180 x 18 mm los volúmenes siguientes de la última dilución de la solución patrón de ácido nicotínico, se enumeran de 0 a 8 (serie doble) 0,0 cm 3 - 0,25 cm3 0,50 cm3- 0,75 cm3 - 1,0 cm3 - 1,5 cm3- 2,0 cm3- 2,5 cm3 y 3,0 cm3.

b)

Se completa el contenido de los tubos en 5 cm 3 con agua destilada. Después con la ayuda de una bureta se agregan a cada tubo 5 cm 3 del medio de cultivo para la determinación de la niacina.

c)

Se prepara un blanco en un tubo que contenga 5 cm 3 del medio de cultivo más 5 cm 3 de agua éste no será inoculado. 18



6.9.5.4 Serie del producto a)

En los tubos numeradas de 9 a 13 (serie doble) se miden los volúmenes siguientes del extracto del producto: 0,25 cm 3 - 0,50 cm3 - 0,75 cm3 - 1,0 cm3 y 1,5 cm3.

b)

Se completa el contenido de los tubos a 5 cm 3 cm agua destilada. Se añade a cada tubo 5 cm3 del medio de cultivo para la determinación de la niacina. Se taponan los tubos cm los tapones adecuados utilizados en microbiología.

6.9.5.5 Esterilización Esterilización -

Se someten a esterilización esterilizac ión los tubos a 115 °C por 15 min.

6.9.5.6 Inoculación a)

Preparación del inoculum. Antes de la inoculación, inoculación, se transfiere el cultivo de Lactobacillus plantarum, preparado el día anterior a un tubo de centrífuga estéril y se centrífuga durante 5 min a 3 000 rpm. Se decanta la solución y se lava el residuo 3 veces con un suero físiológico estéril (cloruro de sodio 0,9 %). Se hace una ligera suspensión del residuo en 10 cm 3 de esta misma solución (se debe solamente observar una ligera turbidez).

b)

Se inocula cm una gota de esta suspensión cada tubo de la serie patrón y del producto, a excepción del blanco.

c)

A continuación se mezclan ligeramente los tubos para repartir uniforme mente la gota de suspensión en el medio. Todas estas operaciones se deben realizar en condiciones estériles.

6.9.5.7 Incubación -

Se incuban los tubos a 37 °C por 18 h a 24 h.

6.9.5.8 Lecturas -

Se esterilizan los tubos al vapor durante 5 min antes de efectuar o añadir a cada tubo la solución de formol al 5 %. Se mide la transmitancia con la ayuda de un fotómetro a una longitud de onda de 575 nm, observando que los microorganismos estén completamente en suspensión. Se lee contra el blanco.

6.9.6 Cálculos El contenido de vitamina pp (Niacina) está dado por la siguiente ecuación:

mg vita min a pp / 100 g =

A

19

x a x c x 100 x 100 p x b x 100



Donde:

6.10

A

=

El promedio de los valores leídos en la curva patrón

a

=

Volumen en cm3 al cual se aforó la muestra 1a. dilución

c

=

Volumen final al que se diluyó la alícuota

p

=

Masa en gramos

b

=

cm3 de la alícuota, tomados de la 1a. dilución.

DETERMINACIÓN DE LA VITAMINA D

6.10.1 Aparatos -

Balanza de precisión

-

Agitador mecánico

-

Baño María

-

Ratavapor

-

trompa de vacío

-

Espectrofotómetro

-

Cronómetro

-

Lámpara ultravioleta

6.10.2 Material -

Vasos de precipitados de 100 cm3, 250 cm3.

-

Balones de fondo redondo de 100 cm 3, 250 cm3 y 500 cm3.

-

Pipetas de 25 cm3,10 cm3,5 cm3, 3 cm3 y 1 cm3.

-

Erlenmeyeres de 250 cm3.

-

Balones aforados de 100 cm3

-

Ampollas de 500 cm3 y 1 000 cm3

-

Columnas de cromatografía con φ interior de 17 mm y una longitud de 300 m.

-

Tubos de ensayo de 18 mm x 100 mm.

-

Cámara especial para hacer vacío con la columna de cromatografía.

-

Balones en forma de corazón de 100 cm 3. 20



Celdas de cuarzo de 5 cm de paso.

Nota. De ser posible, el material debe ser vidrio ámbar.

6.10.3 Reactivos -

Alcohol absoluto.

-

Amoníaco 25 % reactivo analítico.

-

Hidróxido de potasio 60 %. Se disuelven 60 g de hidróxido de potasio en agua destilada. Se enfría y se afora a 100 cm 3.

-

Éter etílico. Se destila el éter etIlico, sobre hidróxido de potasio en pastillas antes del empleo. No se debe destilar hasta sequedad por peligro de explosión.

-

Éter de petróleo 40-60

-

Éter de petróleo 60-80

-

Cloroformo seco y destilado. Se destila el cloroformo sobre carbonato de potasio y se conserva en frasco oscuro.

-

1 - 2 Dicloroetano.

-

Metil-isobutil Metil-isobutil cetona.

-

Cloruro de acetilo.

-

Anhídrido acético.

-

Polyetilen glycol.

-

Cloruro de antimonio. Se toman 100 g de cloruro de antimonio y se disuelven en 450 cm 3 de cloroformo destilado. Se filtra rápidamente y se agregan 10 cm 3 de anhidrído acético. Esta solución se puede guardar por algunas semanas en el refrigerador. Una hora antes de empleo se agrega 2 % de cloruro de acetilo.

-

Sulfato de sodio anhidro.

-

Hidroquinona

-

Tierra silícea de 0,15 mm a 0,2 mm.

-

Silíca gel G-F 254 para cromatografía.

-

Vitamina D3 critalizada para uso bioquímico.

-

Vitamina D-2 cristalizada para uso bioqufmico.

-

Inhibidor. Se mezclan 50 cm3 de anhídrido acético con 50 cm 3 de cloroformo en un balón aforado de 100 cm 3. 21


a)


Solución de referencia de vitamina D 50 U.I/cm 3. Se disuelven 50 mg de vitamina D-3 (o vitamina D-2) en cloroformo y se completa el volumen a 100 cm 3 con el mismo solvente. Se deben efectuar las siguientes diluciones: diluciones: a)

10 cm3

=

100 cm3

b)

10 cm3 (a)

=

100 cm3

c)

25 cm3 (b)

=

100 cm3

La vitamina D es muy sensible a la luz. Se debe trabajar con vidrio y la mayor parte del tiempo posible al abrigo de la luz.

6.10.4 Procedimiento 6.10.4.1 Extracción de la grasa y de la vitamina D. -

Se disuelve, en una ampolla de decantación de 1 000 cm 3, 100 g de muestra y se añaden 10 g de takadiastasa más 200 cm 3 de agua, se coloca en la estufa a 45 °C durante 2 h o una noche, luego se añaden: 50 cm 3 de amoníaco, se agita y se añade 250 cm3 de alcohol y se agita.

-

Se extrae con 200 cm3 de éter etílico más 200 cm 3 de éter de petróleo. Se repiten 3 veces las extracciones. Después de cada adición de éter etílico se agita la ampolla con precaución para evitar las emulsiones, después se agita el éter de petróleo. Se deja en reposo hasta completa separación de las fases etéreas.

-

Se reúnen los 4 extractos en una ampolla de 2 000 cm 3. Se evaporan los solventes en un balón de 500 cm 3 hasta obtener un volumen de más o menos 40 cm 3 de líquido.

6.10.4.2 Saponificación. Se añaden 50 cm 3 de hidróxido de potasio más 100 cm 3 de alcohol y una pequeña cantidad de hidroquinona. Se calienta durante 30 min a reflujo en baño María hirviente bajo corriente de nitrógeno. Después de que la saponificación termina, se enfría el balón y se trasvasa cuantitativamente el contenido a una ampolla de decantación de 500 cm 3 lavando el balón con porciones de agua hasta un volumen total de 120 cm 3. 6.10.4.3 Extracción del insaponificable. Se extrae con 1 x 150 cm 3 y luego 4 x 100 cm 3 de éter de petróleo 40 °C/60°C. Se reúnen los extractos en una ampolla de decantación de 1 000 cm 3 y se leva la solución con porciones de 200 cm 3 de agua hasta que el agua de los lavados dé una reacción incolora con la fenolftaleína. -

Se seca el extracto sobre sulfato de sodio anhidro, se evapora el solvente bajo vacío y corriente de nitrógeno. Se suspende el residuo en 3 cm 3 de éter de petróleo. Si el producto analizado contiene muy poca vitamina A, es conveniente agregar 1 500 U.I. (vitamina A alcohol) como indicador para la cromatografía.

6.10.4.4 Cromatografía sobre columna de tierra silícea. Preparación de la columna. 22



-

En un Erlenmeyer de boca esmerilada se agita durante 5 min 20 g de tierra silícea más 120 cm3 de éter de petróleo 60 °C/80 °C.

-

Se agregan 8 cm3 de polyetilen glycol glycol y se agita durante 20 min (agitador mecánico).

-

Se coloca en la columna cromatográfica un poco de lana de vidrio y se prepara una columna muy compacta con la mezcla de tierra silícea mantenida en suspensión en los solventes. Se hace pasar el solvente teniendo cuidado de que la columna siempre esté recubierta de líquido. Finalmente se llena la columna 3 cm 3 x 10 cm3 de éter de petróleo.

6.10.4.5 Cromatografía. Se debe realizar en completa ausencia de la luz (cámara oscura) y utilizando luz roja para las manipulaciones. Se trasvasa el extracto sobre la columna. -

Se eluye con éter de petróleo 60 °C/80 °C. Se recibe la fracción en un balón en forma de corazón. La velocidad de elución debe ser de 30 gotas por minuto. Con una lámpara UV (360 nm) se debe observar la banda fluorescente de vitamina A por irradiaciones muy breves y se suspende la cromatografría en el momento en que la vitamina A se encuentra a 5 mm de la base de la columna. Se somete la fracción a evaporación bajo vacío y corriente de nitrógeno. Se disuelve el extracto en 1 cm 3 de cloroformo.

6.10.4.6 Cromatografía sobre capa fina. Preparación de las placas. a)

Se preparan las placas para la cromatografía antes del empleo siguiendo el método normal con silíce gel GF 254; espesor de la capa 0,5 mm.

b)

Se secan las placas en su lugar durante algunas horas (2 h ó 3 h) después se activan durante 2 h a 120 °C; se deben introducir las placas cuando la estufa esté fría. Las placas una vez frías son raspadas sobre tres de sus lados (superior y laterales) con una banda de más o menos 5 mm de ancho.

6.10.4.7 Cromatografía y elución. Fase móvil: Dicloroetano-Metil Dicloroetano-Metil Isobutil cetona (90 : 10). a)

Se trabaja en cámara oscura, con luz roja. Se coloca en la placa 0,5 cm 3 del extracto, en la parte derecha de la placa, en una banda de 12 cm 3 de largo. Para referencia se aplica sobre la parte izquierda un poco del extracto y una gota de vitamina D patrón; en una banda de 1,5 cm 3 de largo.

b)

Se desarrolla el cromatograma hasta que alcance el frente del solvente (al abrigo de la luz) utilizando como fase móvill dicloroetano-metil isobutil cetona 90 : 10. Una vez terminada la elución, se seca la placa de la cámara cromatográfica cuba, se localiza rápidamente la vitamina D de referencia bajo la luz U.V. (254 mm) y se determina la zona de la vitamina D del extracto con la ayuda de un instrumento apropiado para este efecto.

c)

Se raspa la capa del absorbente correspondiente correspondien te a la vitamina D. Se pasa a una columna cromatográfica que contenga contenga un anillo poroso de vidrio y se eluye con 100 cm 3 a 150 cm 3 de cloroformo. Se evapora el solvente bajo vacío y se suspende el residuo con 5 cm de cloroformo.

23



6.10.4.8 Reacción colorimétrica. La reacción se hace en doble sobre 1 cm 3 de solución (extracto del problema) en tubos de 18 mm x 180 mm. Según el esquema siguiente: Patrón

Blanco del problema Patrón 1 cm3 1 cm3 3 cm3

1 cm3 1 cm3 3 cm3

Solución patrón Problema Cloroformo Inhibidor Reactivo

Blanco del probelma 1 cm3 1 cm3 3 cm3

1 cm3 1 cm3 3 cm3

6.10.4.9 Se mide la absorbancia de cada solución 20 s después de la adición del reactivo, en celdas de 4 cm a 5 cm de paso a una longitud de onda de 500 nm.

6.10.5 Cálculo El contenido de vitamina D está dado por la siguiente ecuación: Ee − Ebe Es − Ebsw

x 50 x diluciones efectuadas

Donde:

6.11

Ee =

Absorción del problema

Es =

Absorción del patrón

Ebe =

Absorción del blanco del problema

Ebs =

bsorción del blanco del patrón.

50 =

U.I Vitamina D de la solución

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CALCIO

6.11.1 Método A 6.11.1.1 Aparatos -

Crisoles de porcelana de las siguientes dimensiones: dimensiones: Diámetro 40 mm y altura 30 mm.

-

Crisoles Gooch de porcelana.

-

Mufla capaz de operar a una temperatura temperatu ra de 650 °C.

-

Pipetas de 10 cm3.

-

Probetas de 50 y 100 cm3.

-

Bureta de 25 cm3 graduada al 0,05 cm 3 o menos, con llave.

-

Filtros de papel analítico. 24



-

Vasos de precipitado de 250 cm3 y de 1 000 cm 3.

-

Asbesto en solución

-

Mechero

6.11.1.2 Reactivos. -

Solución de ácido clorhídrico al 10,4 % (m/v).

-

Solución de acetato de amonio al 7,2 %.

-

Solución de oxalato de amonio al 2,5 %.

-

Solución de ácido sulfúrico al 10 %.

-

Solución de permanganato permanganato de potasio 0,1 N.


Se pesa con exactitud en un crisol de porcelana, previamente seco y tarado, 3 g de harina y se calcina sobre un mechero, hasta que no se produzcan más humos.

-

Se cubre el crisol con tapa de porcelana y se termina la incineración en mufla a 650 °C hasta que las cenizas sean grises homogéneas. Se enfrían y se disuelven las cenizas con 10 cm3 de ácido clorhídrico.

-

Se transfieren a un vaso de precipitados de 250 cm 3 y se añaden 25 cm 3 de acetato de amonio al 7,2 % y 30 cm 3 de oxalatato de amonio al 2,5 % medidos con bureta.

-

Se calienta en un baño de agua durante una hora y se filtra al vacío en un crisol de porcelana Gooch que previamente haya sido provisto de papel de filtro y asbesto en solución, formando una capa uniforme.

-

Luego de haber pasado todo el precipitado, precipitado , se lava dos veces con agua destilada caliente llenando cada vez el crisol completamente.

-

Se coloca en el mismo vaso de precipitados precipitado s de 250 cm 3, el crisol de porcelana y se adicionan 20 cm 3 de ácido sulfúrico al 10 % y 100 cm 3 de agua destilada.

-

Se calienta a ebullición y se titula con permanganato permanganato de potasio 0,1 N hasta que la solución tome un color rosado pálido Este color al final de la titulación debe permanecer mínimo 30 s.

6.11.1.4 Cálculos. El contenido de calcio se determina mediante la siguiente ecuación:

Calcio , en mg / kg de harina =

V

x N x 20 x 1 000 W

25

=

V

x N x 2 00 000 W



Donde: V

=

Volumen en cm3 de la solución de KMn0 4 0,1 N gastados en la titulación de calcio.

N

=

Normalidad del KMnO 4

W

=

Masa en gramos de la muestra

20

=

Equivalente en mg de calcio

6.11.2 Método B. Absorción Absorción atómica 6.11.2.1 Aparatos -

Crisoles de porcelana

-

Mufla

-

Vasos de precipitado

-

Embudos de vidrio

-

Papel de filtro

-

Plancha de calentamiento calentamiento

-

Balones aforados

-

Probetas

-

Espectrofotómetro de absorción atómica.

6.11.2.2 Reactivos -

Ácido clorhídrico

-

Ácido nítrico

-

Ácido fluorhídrico

-

Cloruro de cesio

-

Ácido bórico.


Se pesa con exactitud en un crisol de porcelana previamente seco y tarado, de 0,2 g a 0,5 g de muestra y se lleva a cenizas a 550 °C. Se enfrían y se atacan con 25 cm 3 de una mezcla 2:1 de ácido clorhídrico: Ácido nítrico. Se filtra y se lleva con agua destilada a volumen en un balón de 250 cm 3. 26



-

Se prepara un blanco que contiene 2 000 ppm de cesio y 4 % de ácido fluorhídrico fluorhídri co en solución de ácido bórico saturado; este blanco es el que se utiliza en la preparación de los patrones necesarios para hacer la curva de calibración en el equipo de absorción atómica.

-

Se prepara una dilución 1:1 de la muestra tratada; cm el blanco y en ella se realiza la respectiva lectura.

6.12

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE GLUTEN SECO (Método manual)

6.12.1 Aparatos -

Mortero de porcelana, barnizado interiormente o cápsula metálica esmaltada de 10 cm a 15 cm de diámetro.

-

Espátula de plástico o acero inoxidable, inoxidable, de 18 cm a 20 cm de longitud.

-

Tamiz con dimensiones dimensiones aproximadas a 30 cm x 40 cm, recubierto de gasa con una abertura nominal de 118 µm.

-

Balanza con precisión de 0,01 g.


Se pesa con precisión de 0,01 g, 25 g de la muestra para análisis y se transfiere cuantitativamente al mortero o a la cápsula metálica; mediante el grifo, se vierten 15 cm 3 de agua, agitando continuamente la harina con la espátula. Después de añadir el agua, se comprime la mezcla con la espátula y se forma una bola con la pasta, teniendo cuidado de no perder nada de harina. Los restos de pasta que se adhieren al recipiente y a la espátula deben incorporarse a la bola.

-

En un recipiente cubierto y con agua se deja la masa en reposo durante una hora a temperatura ambiente.

-

Se amasa con la mano, bajo una corriente de agua de grifo, permitiendo que el agua de lavado pase por el tamiz (Véase la Nota 1). Se continúa con esta operación hasta que sea removido todo el almidón y la materia soluble. Esta operación requiere de aproximadamente 12 min.

Nota 1. Con el fin de evitar pérdidas de masa, el agua de lavado debe pasarse a través de un filtro de tela de abertura nominal de 118 µm.

-

Para conocer si el gluten está libre de almidón se toman 1 ó 2 gotas de agua de lavado, obtenida por presión sobre la masa y se dejan caer sobre un vaso de precipitados que contenga agua perfectamente clara. Si aun existe almidón, aparece turbiedad.

-

El gluten así obtenido se deja en agua por una hora, se presiona entre las manos para que quede tan seco como sea posible. Se enrolla en forma de bola y se coloca en un disco de vidrio de fondo plano y se pesa como gluten húmedo. 27



Se transfiere a una estufa y se seca hasta peso constante a 100 °C durante 24 h, se enfría y cuando haya alcanzado la temperatura ambiente se pesa. Este valor corresponde al gluten seco.

6.12.3 Interpretación de resultados El gluten seco, expresado en porcentaje en masa del producto es igual a: m1 − mo m

x 100

Donde: m

=

Masa, en gramos, de la nuestra tomada para ensayo

mo

=

Masa, en gramos, del vidrio de reloj

m1

=

Masa, en gramos del vidrio de reloj y el gluten seco.

9.

APÉNDICE

9.1

ANTECEDENTES

DGN F-7-61 Harina de trigo. AACC Methodos Methodos 48 - 02, 48- 42.

Información técnica suministrada por los miembros del Comité.

28

NTC 282.pdf

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