Purificacion y Caracterizacion Del ADN de La Cebolla

PAULA ANDREA GUERRERO GOMEZ KELLY YOANA FUENTES NOVA

GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

DOCUMENTO ORIGINAL FRN-002-f1

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Fecha: 10 de Noviembre de /2016

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1. IDENTIFICACIÓN INGENIERÍA QUÍMICA

PROGRAMA ACADÉMICO

BIOQUÍMICA PROYECTO EXPERIMENTAL

UNIDAD DE ESTUDIO

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL ADN DE LA CEBOLLA

PRACTICA DE LABORATORIO

2. MEDIDAS DE SEGURIDAD PARA LAS PERSONAS Y EL AMBIENTE A TENER EN CUENTA EN EL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA REACTIVOS Cantidad

Nombre

15 mL

Agua desionizada

100 mL 100 mL

EDTA Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0.1%. Difenilalanina Etanol al 95% Ácido sulfúrico

5g 20 mL 4 mL


Clase de riesgo* Químico

Químico Químico

Medidas de seguridad Por ingestión de grandes cantidades puede presentar malestar. Adjunto Adjunto

En caso de accidente Pedir atención médica.

Adjunto Adjunto

Químico Químico Químico

Adjunto Adjunto Adjunto

Adjunto Adjunto Adjunto

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100 mL 150 mL 10 mL

concentrado (H2SO4 ) Ácido acético Químico glacial Solución de lisis Químico Reactivo de Químico difenilamina

EQUIPOS Cantidad 1 1 1

Nombre Balanza Baño maria Nevera

MATERIALES Cantidad

Nombre

1

Cebolla

1

Beaker de 250 mL vaso de precipitado de 250 Ml

3

Clase de riesgo * Eléctrico Eléctrico Eléctrico

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Adjunto

Adjunto

Adjunto Adjunto

Adjunto Adjunto

Medidas de seguridad

En caso accidente

de

Clase de Medidas de riesgo* seguridad Biológico grado No aplica 1 No aplica No aplica

En caso accidente No aplica

de

No aplica

No aplica

No aplica

No aplica

10

Tubos de ensayo

No aplica

No aplica

No aplica

2

Micropipetas automáticas

No aplica

No aplica

No aplica

2

Varilla de vidrio. Puntas desechables

No aplica

No aplica

No aplica

No aplica.

No aplica.

No aplica.

Pipeteador

No aplica.

No aplica.

No aplica.

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1


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1 1 1 1 1 1

Probeta de 20 mL embudo de filtración papel filtro Algodón Gradilla Bisturí pipeta graduada de 20 mL


No aplica.

No aplica.

No aplica.

No aplica.

No aplica.

No aplica.

No aplica. No aplica. No aplica. Fisico No aplica.

No aplica. No aplica. No aplica. No aplica. No aplica.

No aplica. No aplica. No aplica. No aplica. No aplica.

*Clase de riesgo: Biológico grado 1, Químico, Eléctrico, Físico, ninguno

3. BUENAS PRÁCTICAS DE SOSTENIBILIDAD AMBIENTAL EN EL MANEJO DE RESIDUOSA TENER EN CUENTA EN EL DESARROLLO DE LA PRACTICA Nombre residuo

Agua destilada

Clasificación de la peligrosidad *

Manejo del residuo

En caso accidente

de

Sustancia peligrosa

no Se desaconseja su Por ingestión de vertido a cursos de grandes cantidades: agua. En caso de malestar, pedir atención médica. *Clasificación de peligrosidad: según la “Guía de almacenamiento de sustancias químicas y residuos químicos”. ● EDTA RIESGOS PARA LA SALUD Ingestión accidental: Puede causar irritación en el tracto digestivo puede causar reacción alérgica De a beber inmediatamente agua o leche. Contacto con los ojos: Puede provocar Irritación en los ojos Lavar suavemente con agua corriente durante 15 min abriendo ocasionalmente los párpados. Solicitar atención médica de inmediato.


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Contacto con la piel: Puede provocar irritación de la piel. Lavar con agua corriente durante 15 min. Al mismo tiempo quitarse la ropa contaminada y calzado. Solicite atención médica Absorción Ninguno identificado No se dispone de información Inhalación Puede causar Irritación en las vías tracto respiratorias. Traslade a un lugar con ventilación adecuada, Si respira con dificultad suministrar oxigeno. Solicite atención médica de inmediato.

● Dodecilsulfato de sodio Declaraciones de peligro Sólido inflamable. Nocivo en caso de ingestión. Provoca irritación cutánea. Provoca lesiones oculares graves. Puede irritar las vías respiratorias. Nocivo para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos. Mantener alejado de fuentes de calor. Evitar su liberación al medio ambiente. Llevar gafas de protección.

● Difenilalanina Identificación de los peligros No es una sustancia o mezcla peligrosa. En caso de contacto con la piel, lavar con jabón y abundante agua durante, al menos, 15 minutos, y quitar la ropa y calzado contaminados. Llamar a un médico si persiste la irritación. Tras contacto con los ojos: aclarar con abundante agua durante, al menos, 15 minutos, manteniendo abiertos los pá rpados. Llamar a un médico si persiste la irritación. En caso de inhalación: sacar al sujeto al aire libre. Si respira con dificultad, llamar a un médico. Tras ingestión: enjuagar la boca con agua. No provocar el vómito. Si se ingiere en gran cantidad, llamar a un médico. Ligera irritación en ojos. No se han observado efectos nocivos hasta la fecha con la correcta manipulación de este producto.

● Etanol Identificación de los peligros Riesgos de fuego y explosión: Por ser un producto inflamable, los vapores pueden llegar a un punto de ignición, prenderse y transportar el fuego hacia el material que los originó. Los vapores pueden explotar si se prenden en un área cerrada y pueden generar mezclas explosivas e inflamables con el aire a temperatura ambiente. Inhalación: Los efectos no son serios siempre que se use de manera razonable. Una inhalación prolongada de concentraciones altas (mayores de 5000 ppm) produce irritación de ojos y tracto respiratorio superior, náuseas, vómito, dolor de cabeza, excitación o depresión, adormecimiento y otros efectos narcóticos, coma o incluso, la muerte. Contacto con ojos: Se presenta irritación solo en concentraciones mayores a 5000 a 10000 ppm. DOCUMENTO ORIGINAL FRN-002-f1

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Contacto con la piel: El líquido puede afectar la piel, produciendo dermatitis caracterizada por resequedad y agrietamiento. Ingestión: Dosis grandes provocan envenenamiento alcohólico, mientras que su ingestión constante, alcoholismo.

Primeros auxilios: Inhalación: Traslade a la víctima a un lugar ventilado. Aplicar respiración artificial si ésta es dificultosa, irregular o no hay. Proporcionar oxígeno. Ojos: Lavar inmediatamente con agua o disolución salina de manera abundante. Piel: Eliminar la ropa contaminada y lavar la piel con agua y jabón. Ingestión: No inducir el vómito. Indicaciones generales: En caso de pérdida del conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vómito. 4.2 Inhalación: Trasladar a la persona al aire libre. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica. 4.3 Contacto con la piel: Lavar abundantemente con agua. Quitarse las ropas contaminadas. Extraer el producto con un algodón impregnado en polietilenglicol 400. 4.4 Ojos: Lavar con agua abundante (mínimo durante 15 minutos), manteniendo los párpados abiertos. Pedir atención médica. 4.5 Ingestión: Beber agua abundante. Evitar el vómito (existe riesgo de perforación). Pedir inmediatamente atención médica. No neutralizar.

● Ácido sulfúrico declaraciones de peligro Provoca quemaduras graves. Indicaciones generales: En caso de pérdida del conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vómito. 4.2 Inhalación: Trasladar a la persona al aire libre. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica. 4.3 Contacto con la piel: Lavar abundantemente con agua. Quitarse las ropas contaminadas. Extraer el producto con un algodón impregnado en polietilenglicol 400. 4.4 Ojos: Lavar con agua abundante (mínimo durante 15 minutos), manteniendo los párpados abiertos. Pedir atención médica. 4.5 Ingestión: Beber agua abundante. Evitar el vómito (existe riesgo de perforación). Pedir inmediatamente atención médica. No neutralizar.

Efectos peligrosos para la salud: Por inhalación de vapores: Irritaciones en vías respiratorias. Sustancia muy corrosiva. En contacto con la piel: Provoca quemaduras. Por contacto ocular: quemaduras, ceguera (lesión irreversible del nervio óptico). Por ingestión: Quemaduras en el aparato digestivo. Fuertes dolores, con riesgo de DOCUMENTO ORIGINAL FRN-002-f1

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perforación. Puede provocar náuseas, vómitos, diarreas. Después de un periodo de latencia: estenosis del píloro.

● Ácido acético declaraciones de peligro Líquido incoloro ¡peligro! Líquido y vapor inflamable. Corrosivo, puede ser nocivo si se absorbe a través de la piel. Causa severa irritación y quemaduras de piel, ojos tracto respiratorio y digestivo. Inhalación : Irritación severa de la nariz y la garganta, náuseas, resfriado, dolor en el pecho y dificultad respiratoria. Altas concentraciones puede causar inflamación en las vías respiratorias (bronconeumonía) y acumulación de fluidos en los pulmones (edema) -Contacto con los ojos : Puede causar quemaduras irreversibles de la córnea. Vapores de ácido acético, o líquido pueden causar irritación. - Contacto con la piel : Es corrosivo, produce quemaduras, altamente irritante. - Ingestión : Quemaduras e inflamación de la boca, el abdomen y la garganta, vómito y deposición con sangre. Irritación tracto gastrointestinal (esófago y estómago), espasmos estomacales, también puede resultar vómito con sangre, daños en los riñones.

4. PRIMEROS AUXILIOS - Inhalación : Trasladar al aire fresco. Si no respira administrar respiración artificial. Evitar la reanimación boca a boca. Si respira con dificultad suministrar oxígeno. - Contacto con los ojos : Lavar con abundante agua, mínimo durante 15 minutos. Levantar y separe los párpados para asegurar la remoción del químico. - Contacto con la piel : Retirar la ropa y calzado contaminados. Lavar la zona afectada con abundante agua y jabón, mínimo durante 15 minutos. Si la irritación persiste repetir el lavado. - Ingestión : Lavar la boca con agua. Si está consciente, suministrar abundante agua. No inducir el vómito. Mantener la víctima abrigada y en reposo. Buscar atención médica

● Solución de lisis declaraciones de peligro · En caso de inhalación del producto: Suministrar aire fresco. En caso de trastornos, consultar al médico.

En caso de contacto con la piel: Aclarar con abundante agua. En caso de irritaciones continuas de la piel, consultar un médico. · En caso de con los ojos: Limpiar los ojos abiertos durante varios minutos con agua corriente. Proporcionar asistencia médica a la persona afectada. · En caso de ingestión: Enjuagar la boca. Consultar un médico si los trastornos persisten Medios de extinción: Medios de extinción apropiados. Usar medidas de extinción que sean apropiadas a las circunstancias del local y a sus alrededores. Medios de extinción no DOCUMENTO ORIGINAL FRN-002-f1

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apropiados No existen limitaciones de agentes extinguidores para esta sustancia/mez cla. Peligros específicos derivados de la sustancia o la mezcla No combustible. Recomendaciones para el personal de lucha contra incendios Equipo de protección especial para el personal de lucha contra incendios En caso de fuego, protéjase con un equipo respiratorio autónomo Medidas de protección individual: Los tipos de auxiliares para protección del cuerpo deben elegirse específicamente según el puesto de trabajo en función de la concentración y cantidad de la sustancia peligrosa. Debería aclararse con el suministrador la estabilidad de los medios protectores frente a los productos químicos. Precauciones personales: equipo de protección y procedimientos de emergencia Indicaciones para el personal que no forma parte de los servicios de emergencia: No respirar los vapores, aerosoles. Evacúe el área de peligro, respete los procedimientos de emergencia, con sulte con expertos

4. PRACTICA DE LABORATORIO 4.1 OBJETIVO ● Purificar el DNA de células vegetales. ● Observar la estructura fibrilar del ADN. 4.2 FUNDAMENTOS TEÓRICOS INTRODUCCIÓN ●

El ADN constituye el material hereditario de un individuo. En él están escritas las instrucciones que deben seguir las células para construir un organismo y mantenerlo vivo. Todas las células que forman un individuo contienen una copia idéntica de ADN. Cada una de ellas, sin embargo, lee una parte de estas instrucciones y por eso hay células con diferentes formas y funciones. En este experimento os proponemos extraer el ADN de las células que forman una cebolla. Las células eucariotas, como las nuestras o las de las cebollas, contienen el ADN en el interior de un compartimento llamado núcleo celular. Por ello, para extraer el ADN, deberemos romper la membrana celular y también la membrana nuclear. Las células vegetales, además, cuentan con una pared rígida de celulosa que también tendremos que romper para liberar el ADN. En todo momento será muy importante que protejamos el ADN de los enzimas que puedan degradarlo. Y, por último, hará falta aislarlo.


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El ácido desoxirribonucleico (ADN), frecuentemente abreviado como ADN, es un ácido nucleico que contiene instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria. El papel principal de la molécula de ADN es el almacenamiento a largo plazo de información. Muchas veces, el ADN es comparado con un plano o una receta, o un código, ya que contiene las instrucciones necesarias para construir otros componentes de las células, como las proteínas y las moléculas de ARN.

Los segmentos de ADN que llevan esta información genética son llamados genes, pero las otras secuencias de ADN tienen propósitos estructurales o toman parte en la regulación del uso de esta información genética. Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un polinucleótido. Un polímero es un compuesto formado por muchas DOCUMENTO ORIGINAL FRN-002-f1

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unidades simples conectadas entre sí, como si fuera un largo tren formado por vagones. En el ADN, cada vagón es un nucleótido, y cada nucleótido, a su vez, está formado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser adenina→A, timina→T, citosina→C o guanina→G) y un grupo fosfato que actúa como enganche de cada vagón con el siguiente. Lo que distingue a un vagón (nucleótido) de otro es, entonces, la base nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando sólo la secuencia de sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento de los cuatro tipos de vagones a lo largo de todo el tren) es la que codifica la información genética: por ejemplo, una secuencia de ADN puede ser ATGCTAGATCGC. En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas entre sí por unas conexiones denominadas puentes de hidrógeno.

Componentes ● Estructura de soporte: La estructura de soporte de una hebra de ADN está formada ●

por unidades alternas de grupos fosfato y azúcar. El azúcar en el ADN es una pentosa, concretamente, la desoxirribosa. Ácido fosfórico: Su fórmula química es H3PO4 . Cada nucleótido puede contener uno (monofosfato: AMP), dos (difosfato: ADP) o tres (trifosfato: ATP) grupos de ácido fosfórico, aunque como monómeros constituyentes de los ácidos nucleicos sólo aparecen en forma de nucleósidos monofosfato.

● Desoxirribosa: Es un monosacárido de 5 átomos de carbono (una pentosa) derivado de la ribosa, que forma parte de la estructura de nucleótidos del ADN. Su fórmula es C5H10O4 . Una de las principales diferencias entre el ADN y el ARN es el azúcar, pues en el ARN la 2-desoxirribosa del ADN es reemplazada por una pentosa alternativa, la ribosa.25 Las moléculas de azúcar se unen entre sí a través de grupos fosfato, que forman enlaces fosfodiéster entre los átomos de carbono tercero (3′, «tres prima») y quinto (5′, «cinco prima») de dos anillos adyacentes de azúcar. La formación de enlaces asimétricos implica que cada hebra de ADN tiene una dirección. En una DOCUMENTO ORIGINAL FRN-002-f1

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doble hélice, la dirección de los nucleótidos en una hebra (3′ → 5′) es opuesta a la dirección en la otra hebra (5′ → 3′). Esta organización de las hebras de ADN se denomina antiparalela; son cadenas paralelas, pero con direcciones opuestas. De la misma manera, los extremos asimétricos de las hebras de ADN se denominan extremo 5′ («cinco prima») y extremo 3′ («tres prima»), respectivamente.

●

Bases nitrogenadas: Las cuatro bases nitrogenadas mayoritarias que se encuentran en el ADN son la adenina (A), la citosina (C), la guanina (G) y la timina (T). Cada una de estas cuatro bases está unida al armazón de azúcar-fosfato a través del azúcar para formar el nucleótido completo (base-azúcar-fosfato). Las bases son compuestos heterocíclicos y aromáticos con dos o más átomos de nitrógeno, y, dentro de las bases mayoritarias, se clasifican en dos grupos: las bases púricas o purinas (adenina y guanina), derivadas de la purina y formadas por dos anillos unidos entre sí, y las bases pirimidínicas o bases pirimídicas o pirimidinas (citosina y timina), derivadas de la pirimidina y con un solo anillo.En los ácidos nucleicos existe una quinta base pirimidínica, denominada uracilo (U), que normalmente ocupa el lugar de la timina en el ARN y difiere de ésta en que carece de un grupo metilo en su anillo. El uracilo no se encuentra habitualmente en el ADN, sólo aparece raramente como un producto residual de la degradación de la citosina por procesos de desaminación oxidativa.


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4.3 PROCEDIMIENTO 1. PROCEDIMIENTO: Preparación de los reactivos: Soluciones Stock y buffer Obtención de Solución de Lisis:


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Obtención de Reactivo de difenilamina:


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TABLA DE DATOS DOCUMENTO ORIGINAL FRN-002-f1

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4.4 CUESTIONARIO a)

¿Cuál es la función de los dos componentes de la solución de lisis ?. Explique. b) b ¿A qué se debe la diferencia de viscosidades del DNA observada en los experimentos?

RECOMENDACIONES ● Tener los EPP básicos para entrar a los laboratorios (Bata, guantes, gafas), y cumplir con las normas de vertimientos de residuos

4.5 BIBLIOGRAFÍA. ●

hĥp://tux.uis.edu.co/quimica/sites/default/files/paginas/archivos/V00Man10Bioqca_MFOQ‐BQ.01_0


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8072013.pdf hĥps://es.wikipedia.org/wiki/Embudo_de_filtraci%C3%B3n hĥps://www.google.com.co/search?q=Bases+nitrogenadas:&rlz=1C1NHXL_esCO711CO711&espv=2& biw=1920&bih=974&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwib5pzk5pfQAhUW5WMKHb0DCo8 Q_AUIBigB#imgrc=WqWUvnZhb2vWEM%3A hĥps://es.wikipedia.org/wiki/Balanza hĥps://www.google.com.co/search?q=Desoxirribosa&rlz=1C1NHXL_esCO711CO711&espv=2&biw=1 920&bih=974&tbm=isch&imgil=uHd7N8gQsO66vM%253A%253Bjvw4h5s0__nTtM%253Bhĥps%2525 3A%25252F%25252Fes.wikipedia.org%25252Fwiki%25252FDesoxirribosa&source=iu&pf=m&fir=uHd 7N8gQsO66vM%253A%252Cjvw4h5s0__nTtM%252C_&usg=__DCHwBl5b9Mx6F6WT3qCmEOhJgi8%3 D&ved=0ahUKEwiu2M‐_45fQAhULwWMKHTiYCGoQyjcIOQ&ei=YgshWK6fD4uCjwO4sKLQBg#tbm=isc h&q=desoxirribosa+alimentos&imgrc=semjet77zc0ApM%3A hĥps://www.google.com.co/search?q=EPP&espv=2&rlz=1C1NHXL_esCO711CO711&biw=1920&bih= 974&tbm=isch&imgil=8iFtMhtSop4n3M%253A%253BnGwWXT3ySVn_mM%253Bhĥp%25253A%2525 2F%25252Fwww.vdppanama.com%25252FSeguridad.html&source=iu&pf=m&fir=8iFtMhtSop4n3M% 253A%252CnGwWXT3ySVn_mM%252C_&usg=__svAzb8PXh5qxmrOPPJuYdiIRZ0k%3D&ved=0ahUKE wiRiv‐A95fQAhVW12MKHXGxBckQyjcIOA&ei=1x8hWNHCJdaujwPx4pbIDA#imgrc=mRh5o_TaWuFPg M%3A

●

ELABORA

REVISA

APRUEBA

DOCENTE

COORDINADOR

DIRECTOR

DIANA ANGELICA VARELA

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