Fundamentos de Diferenciación Bioquímica CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ ESTEFANÍA RODRÍGUEZ SÁNCHEZ J OSÉ QUEVEDO MÓNICA MÓNICA MARCEL MARCEL A CASAS CASA S MÓNICA MÓNICA YANQUEN Y ANQUEN FUENTES 1. Resumen 2. Abstract 3. Palabras Clave: Enzimas 4. Frase introductoria 5. Introducción
6. Metodología 7. Resultados 8. Discusión 9. Conclusiones 10. Bibliografía Fundamentos de cada prueba y como se lee positivo y negativo para cada MO 1. Agar Triple Azúcar Hierro Tsi
El agar TSI En el tubo TSI debe leerse siempre la superficie y el fondo. La fermentación de glucosa se observa en el fondo del tubo por el cambio de color del indicador de rojo a amarillo. También puede observarse la fermentación de lactosa y sacarosa en la superficie del tubo, por el cambio del indicador de rojo a amarillo. La producción de H2S se observa por la aparición de un precipitado negro, debido a las sales de hierro presentes. (MCD LAB).
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2. Caldo Verde Bilis Brillante
Es te medio es recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales. En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas. Para leer si estas son positivas o negativas seguimos los siguientes pasos: Positivo Presencia de gas Negativo Ausencia de gas (Mol labs, 2007)
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3. Medio Sulfuro Indol Movilidad (SIM) 4. Agar Urea 5. Agar Rojo-Fenol Lactosa (BPL-Agar) Verde Brillante 6. Agar Hierro Lisina (LIA)
En este medio la peptona provee la fuente de carbono y nitrógeno. El extracto de levadura provee vitaminas y cofactores para el crecimiento. La dextrosa es la fuente de energía. El hidrocloruro de L-lisina es el sustrato donde actúan las enzimas descarboxilasa o desaminasa. El citrato férrico de amonio y el tiosulfato de sodio actúan como indicadores de la producción de H2S. El púrpura de bromocresol es un indicador de pH. El agar es adicionado como agente solidificante. Prueba Produccion H2S
de
Descarboxilacion de la Lisina
Reaccion positiva Formacion de un presipitado negro en la superficie Fondo y superficie del medio de color purpura (alcalino)
Reaccion negativa No hay formación de precipitado negro Fondo amarillo (ácido), superficie purpura (alcalina)
Desaminacion Superficie roja Superficie de la lisina purpura (MCD LAB, 2007) http://books.google.com.co/books?id=FYWSzy7EjR0C&pg=PA213&dq=medio+sulfuro+indol&hl =es&ei=ZVDLTemkLsK2tgfEmdnbBw&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=1&ved=0CCU Q6AEwAA#v=onepage&q=medio%20sulfuro%20indol&f=false
11. Cuestionario 1. ¿Cuáles son las rutas bioquímicas de obtención de energía de las bacterias respiradoras aerobias, las de respiración anaerobia, las fermentadoras y las anaerobias estrictas. ¿Cuál de éstas es más eficiente? ¿Por qué? La respiración celular es el conjunto de reacciones químicas mediante las cuales se obtiene energía a partir de la degradación de sustancias orgánicas, como los azucares y los ácidos, principalmente. Comprende dos fases: en la primera se oxida la glucosa (azúcar) y no depende del oxigeno, por lo que recibe el nombre de respiración anaerobica o glucólisis, reacción que se lleva a cabo en el citoplasma de la célula. La segunda fase se realiza con la
Fundamentos de Diferenciación Bioquímica CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ intervención del oxigeno y recibe el nombre de respiración aeróbica o ciclo de krebs y se realiza en estructuras especiales de la célula llamadas mitocondrias.
Obtención de energía de las bacterias respiradoras aerobias
Ciclo de krebs o respiración aerobia. Sucesión de reacciones químicas que ocurren dentro de la célula, mediante las cuales se realiza la descomposición final de las moléculas de los alimentos y en las que se producen dióxido de carbono, agua y energía. Este proceso, que se lleva a cabo por la acción de siete enzimas, es conocido también por ciclo de los ácidos tricarboxílicos. El ciclo de Krebs ocurre en todos los animales, plantas superiores y en la mayoría de las bacterias. En los organismos que tienen células con núcleo, el ciclo tiene lugar dentro de un orgánulo membranoso que se llama mitocondria, una estructura que se compara a menudo con la central de producción de energía de la célula. Los alimentos, antes de poder entrar en el ciclo del ácido cítrico, deben descomponerse en pequeñas unidades llamadas grupos acetilo. Cada grupo acetilo (CH3CO) contiene sólo dos átomos de carbono, junto con hidrógeno y oxígeno. Al comienzo del ciclo, un grupo acetilo se combina con una molécula con cuatro átomos de carbono llamada oxalacetato, para producir un compuesto con seis átomos de carbono: el ácido cítrico. En los restantes pasos del ciclo, la molécula de ácido cítrico se transforma, y pierde dos de sus átomos de carbono, que salen en forma de dióxido de carbono. Así mismo, se liberan también cuatro electrones. Estos viajan dentro de la célula gracias a una serie de móleculas transportadoras, la cadena transportadora de electrones, en la que se produce energía en forma de una molécula rica en energía llamada trifosfato de adenosina, o ATP, antes de reaccionar con el oxígeno para formar agua. Un producto adicional del ciclo es otra molécula con gran contenido energético, llamada trifosfato de guanosina, o GTP. La célula utiliza estas moléculas, el ATP y el GTP, como combustible en muchos procesos. Otra molécula usada como combustible, el fosfato de creatina, puede servir también para proveer de energía extra a las células del cerebro y de los músculos. La molécula original de oxalacetato se regenera al final del ciclo. Esta molécula puede reaccionar entonces con otro grupo acetilo y comenzar el ciclo de nuevo. En cada giro del ciclo se produce energía. En el ciclo, sólo se destruyen los grupos acetilo; tanto las siete enzimas que llevan a cabo las diferentes reacciones, como los compuestos intermedios sobre los que actúan, pueden volver a utilizarse una y otra vez. Muchos de los compuestos intermedios que se producen en el ciclo se usan también como materiales de construcción para la síntesis de aminoácidos, hidratos de carbono y otros productos celulares.
Obtención de energía de las bacterias respiradoras anaerobias
Glucolisis o respiración anaerobia. Al estudiar los cambios bioquímicos que se producían durante la contracción muscular se observó que cuando un músculo se contrae en ausencia de oxígeno (de forma anaerobia), se utiliza el glucógeno y aparecen como productos finales el piruvato y el lactato. Sin embargo, si la contracción ocurre en presencia de oxígeno (de forma aerobia), no se acumula lactato y el piruvato es oxidado completamente hasta dióxido de carbono y agua. En base a estas observaciones, se adoptó la costumbre de distinguir las fases aerobia y anaerobia en el metabolismo de los hidratos de carbono. Pero esta distinción es arbitraria, puesto que las reacciones con o sin oxígeno son las mismas, diferenciándose únicamente en el punto hasta el que se producen y, por tanto, en los productos finales. La coenzima esencial NAD (dinucleótido de adenina y nicotinamida) es necesaria para un paso de conversión enzimática en la formación del piruvato. Cuando el oxígeno es deficiente, esta coenzima sólo puede regenerarse por la reoxidación del NADH durante la producción de lactato a partir de piruvato. Esto es debido a que las centrales eléctricas de las células, las mitocondrias, sólo pueden utilizar NADH en presencia de oxígeno, produciendo NAD, energía
Fundamentos de Diferenciación Bioquímica CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ (como moléculas de trifosfato de adenosina o ATP) y agua. La glicolisis puede continuar en condiciones anaerobias con la formación de lactato y la regeneración de NAD, pero a cambio de producir menos energía por molécula de glucosa metabolizada. Secuencia de reacciones en la glicolisis En conjunto, la ecuación de la glicolisis para producir lactato es la siguiente: Glucosa + 2 ADP (adenosina difosfato) + 2 Fosfato ð 2 Lactato + 2 ATP (adenosina trifosfato) + 2 H2O Aunque las etapas intermedias implicadas son muchas y complejas, una visión simplificada podría describir el proceso como: 1. La incorporación inicial de dos grupos fosfato dentro de la molécula de glucosa de seis átomos de carbono. Los grupos fosfato los proporcionan dos moléculas de ATP, mediante la utilización de energía. 2. El compuesto intermedio de seis átomos de carbono que se forma, fructosa 1,6 bifosfato, se rompe en dos compuestos más simples, con tres átomos de carbono cada uno. 3. Estos compuestos de tres átomos de carbono, fosfato de dihidroxiacetona y gliceraldeído-3 fosfato, son cada uno metabolizados para dar piruvato, en una vía con numerosos pasos intermedios. Durante este proceso, cada uno de los compuestos de tres átomos de carbono produce dos moléculas de ATP (cuatro en total), con lo que se genera una ganancia neta de dos moléculas de ATP, ya que dos moléculas de ATP se utilizaron en la etapa 1. Además, se producen dos moléculas del cofactor intermediario NADH, las cuales pueden ser oxidadas bajo condiciones aerobias, en una ruta separada que rinde seis moléculas de ATP. De esta forma, la glicolisis puede producir seis moléculas de ATP por cada molécula de glucosa cuando hay oxígeno disponible, pero sólo dos moléculas de ATP bajo condiciones deficitarias de oxígeno. 4. Las dos moléculas de piruvato resultantes pueden ser utilizadas por el ciclo mitocondrial del ácido cítrico después de convertirse en acetil-CoA, produciendo otras 30 moléculas de ATP. En resumen, se pueden producir un total de 36 moléculas de ATP mediante el metabolismo completo de una molécula de glucosa bajo condiciones aerobias, pero sólo dos moléculas de ATP bajo condiciones anaerobias. 5. Por último, una de las moléculas intermediarias de tres átomos de carbono, el gliceraldeído-3 fosfato puede, en una reacción lateral, convertirse en 2,3 bifosfoglicerato, un compuesto que ayuda a la hemoglobina de los glóbulos rojos sanguíneos a descargar el oxígeno en los tejidos.
Obtención de energía de las bacterias fermentadoras
“La fermentación anaeróbica puede definirse como el proceso metabólico por el cual se obtiene energía química a partir de diferentes combustibles orgánicos en ausencia de oxígeno molecular. Si bien los combustibles más frecuentemente utilizados en los procesos de fermentación son los azucares, y particularmente la glucosa, de algunas bacterias son capaces de obtener energía a partir de la fermentación anaerobia de otros combustibles orgánicos como aminoácidos, purinas, piridinas, o ácidos grasos”. (Alonso, 2007) La fermentación corresponde a un proceso de oxidación, en el que las bacterias facultativas o anaerobias obligadas utilizan un compuesto orgánico como dador y aceptor final de hidrógenos. (Villafañe, 2008, marzo) El más eficiente de los métodos de obtención de energía de las bacterias es el ciclo de Kreps, debido a que los compuestos que actúan en las 7 reacciones, pueden volver a utilizarse una y otra vez, esto optimiza el rendimiento y hace que las otras vías sean menos contribuyentes al desarrollo de la producción.
Fundamentos de Diferenciación Bioquímica CORPORACIÓN TECNOLÓGICA DE BOGOTÁ 2. Describa brevemente las actividades enzimáticas que se identificaron en cada uno de los medios de cultivo utilizados en la práctica. ¿Cuál es la reacción bioquímica que cataliza cada una? ¿Cuáles son exoenzimas y cuáles son endoenzimas? 3. ¿Explique por qué los tubos de fermentación de azúcares deben evaluarse a las 24 y 48 horas? ¿Qué resultados se observarán en los tubos en el caso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente la glucosa? Una baja relación de carbohidrato:proteína reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar pequeñas cantidades de ácidos débiles provenientes del metabolismo oxidativo; las grandes cantidades de hidrato de carbono, aumentar la cantidad de ácido encontrado. (MacFaddin, 2003). En conclusión al permanecer más del tiempo adecuado, se puede determinar una oxidación positiva, cuando en realidad este cambio de pH se da por sí solo en el medio luego de 48 horas, los resultados que se observan en Escherichea Coli son de color amarillento ya que los hidratos sufren un ataque de oxidación, la glucosa es fermentada en el medio de sellado y el tubo abierto es el primer ataque de la fermentación y la respiración. En el caso del tubo sellado la coloración es verde ya que es incapaz de descomponerse el azúcar. (MacFaddin, 2003)
4. ¿Explique por qué se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el fondo del tubo de TS1 y no en la superficie? En el medio TSI por fermentación de azúcares, se provocan ácidos, que se revelan por medio del indicador rojo de fenol, el cual cambia al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro suministrando el sulfuro de hierro de color característico negro. (Britania Lab). Por tal razón se busca los en el fondo porque al formarse una sal, por diferencia de densidades este se va a precipitar.
Bibliografía MCD LAB. (s.f.). Especificaciones producto. Recuperado el 04 de mayo de 2011, de http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_hierro_lisina.pdf
