PRUEBA DE LA REDUCTASA PRUEBA DE LA REDUCCION DEL AZUL DE METILENO (TRAM) I. INTRODUCCION
La comp comple leji jida dad d bioq bioquí uími mica ca de la lech leche e en su comp compos osic ició ión n y su elev elevad ada a acti activi vida dad d de agua agua la conv convie ierte rte en una una de los los alim alimen ento toss natu aturale raless don donde prolife lifera ran n fácil ácilm mente ente la mayor ayor parte arte de los los microorganismos y bien se podría catalogar como un medio universal de cultivo. Los microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos son son bene benec cio ioso soss por por las las tran transf sfor orma maci cion ones es que que prod produc ucen en y otro otross perjudiciales y su control presenta aspectos sanitarios y comerciales, el primero se reere al riesgo que el alimento puede suponer para la salu salud d del del cons consum umid idor or cuan cuando do es port portad ador or de micr microo oorrgani ganism smo os patógenos o de sus toinas y el segundo a las características de conservación de la misma que viene determinada por la presencia de un mayor o menor n!mero de "ora saprotita, está en elevadas conc concen entr trac acio ione ness pued puede e prod produc ucir ir defe defect ctos os y dism dismin inuc ució ión n de las las propiedades nutritivas y organol#pticas del producto. $isten grupos de microorganismos %&.'( que son tomados como indi indica cado dore ress en la )ndu )ndust stri ria a Láct Láctea ea,, pues pues su pres presen enci cia a perm permiti itirá rá comprobar el cumplimiento de la aplicación de las buenas prácticas higi#nicas. &.' indicadores*
+acterias aeróbicas &esólas
oliformes totales y fecales
$nterobacterias totales
$nterococos
$l desarrollo de m#todos rápidos y-o automatiados en el diagnostico de la calidad higi#nico sanitaria de la leche y sus productos constituye
en los !ltimos a/os una necesidad enfocada en lo fundamental en la obtención de la respuesta en el menor tiempo posible para tomar las medidas correctivas sobre las posibles brechas en la higiene de algunas de las fases de la cadena productiva antes de que el producto sea liberado en el mercado. $stos m#todos rápidos de diagnóstico bacteriológico en leche se han clasicado atendiendo a diferentes puntos de vistas, no obstante, en lo fundamental han tomado como base los aspectos siguientes* 0apide con que se obtienen las respuestas, la actividad metabólica de los microorganismos, posibilidades de automatiación y principios de medición en que se basan las lecturas. 1eniendo en cuenta la diversidad de estas clasicaciones y para una mayor inclusión de m#todos rápidos empleados en el diagnóstico microbiológico de la leche, están agrupados en tres grupos* m#todos directos, indirectos y en m#todos para diagnóstico de microorganismos especícos. $l m#todo usado en esta práctica es un m#todo indirecto, el m#todo de reducción de colorantes %0eductasa(, usando aul de metileno. $n el procedimiento se utilian patrones de aul de metileno o 0esaurina y se observa el proceso de reducción del colorante %de aul a blanco para el aul de metileno2 de aul apiarrado a rosa o blanco para la 0esaurina(. $l tiempo necesario para que se produca la reducción del colorante está relacionado con el n!mero de microorganismos de la muestra. 1eniendo en cuenta que los m#todos de reducción no funcionan ecamente en leches refrigeradas, se ha sugerido la sustitución de estas por otras t#cnicas rápidas. II. OBJETIVO •
onocer y aplicar el m#todo de 103& en la leche fresca )nterpretar los resultados
•
4eterminar la calidad de las leches frescas por m#todos
•
•
rápidos y sencillos. 3naliar la importancia del control de la calidad de la leche
•
cruda como materia prima de la )ndustria láctea. 4eterminar la calidad de la leche para comprobar si es apta o es apta para el consumo humano.
III .MARCO TEORICO
Determinación e !a Ca!ia Micr"#i"!ó$ica en !a Lec%e Cr&a
Seiment" el sedimento obtenido por el m#todo de
'.
lactofiltración mide la calidad sanitaria. La presencia de abundante partículas de sucio y su tipo %heces, insectos, tierra, restos de alimentos(, puede indicar el cuidado que se ha tenido durante el orde/o y almacenamiento de la leche cruda. .
Tem*erat&ra la determinación de la temperatura en la
recepción muestra el cuidado que se haya podido tener durante el trasporte y almacenamiento de la leche. 5in embargo una leche que se encuentre la temperatura óptima de refrigeración %678 9( no conrma que sea de buena calidad, ya que es posible que durante las fases que están desde el sitio de producción hasta la industria la misma haya sufrido fluctuaciones de temperaturas que hayan permitido la multiplicación microbiana.
+.
Lact",ermentación* esta prueba permite observar las
características del coagulo obtenido de la fermentación de una muestra de leche incubada a temperatura ambiente %:87:; 9( por <6 horas. 5eg!n las características observadas se puede presumir acerca del tipo de bacterias predominantes, ya que un coagulo homog#neo sin o con peque/as burbujas de gas, indicara predominio de bacterias lácticas homofermentativas, por el contrario un coagulo grumoso con abundante gas puede indicar la presencia de bacterias coliformes.
-&a -enera! *ara !a C!a/i0cación e !a Lec%e /e$1n /& Sa#"r
C!a/i0cac
P&nta2e De/cri*ción e! /a#"r e/*eci0c"
ión E3ce!ente 6= 7 68
5in criticismo
B&ena
:> 7 :?, 5abor ligeramente astringente y salado, 8 carente de frescura, sabor ligero o denido a cocido, a pienso o sin sabor.
Re$&!ar
:@ :;,8
7 5abor ligeramente a AestabloA y oidado2 denitivamente astringente y salado carente totalmente de frescura, pronunciado sabor a cocido o sin sabor.
P"#re
:8,8 menos
o 5abor ligero o denido a ácido, rancio y sucio2 ligero, denido o pronunciado a AestabloA, amargo, etra/o, a ajo- cebolla, a malta, metálico2 denido o pronunciado a establo y oidado2 pronunciado astringente, a pienso y salado.
In/a!&#re
5in Buntaje
5abor pronunciado ácido, rancio y a sucio.
Tomado de Nelson and Trout (1964): p 96. Se estima normal un Puntaje de 31 - 40.
4.
Acie5 Tit&!a#!e 6 *7 ya se ha estudiado estas dos
propiedades de la leche en el tema de físico químico. $sta claro que la fermentación microbiana modica estos valores, aumentando la acide y reduciendo el pC. 5in embargo hay que tener en cuenta que ciertos microorganismos proteolíticos pueden causar la coagulación dulce de la leche, es decir, sin acide o con alcaliniación de la leche. 8. Re&cción e C"!"rante/ estas pruebas se fundamentan en
como por el metabolismo microbiano hace variar el potencial de óido reducción de la leche. Bara ello se utilian como indicador el aul de metileno y la 0esaurina, los cuales van variando su coloración a medida que se van reduciendo.
PRUEBA DE LA REDUCTASA O REDUCCI9N DEL AZUL DE METILENO
$l m#todo de reducción del aul de metileno es un m#todo indirecto para calcular el contenido total de bacterias de la leche. 4e manera que en lugar de contar las bacterias se establece una correlación entre el tiempo que se necesita para reducir el colorante de 3ul de &etileno en la leche a una forma incolora y la probable población bacteriana de la muestra. Bor lo general, el tiempo que se necesita para la reducción del colorante, es inversamente oro al n!mero de bacterias presentes en a leche. $ste m#todo puede adaptarse para el eamen de gran n!mero de muestras en un tiempo corto, pero sin embargo, si la población bacteriana es alta, #ste m#todo no nos da información de la probable fuente de contaminación. Do hay necesidad de que los utensilios de vidrio utiliados para esta prueba sean est#riles, pero su contaminación puede reducirse al mínimo tratándolos con agua hirviente o vapor que circule
libremente.
1al como eiste en la ubre, la leche posee un potencial de suficientemente bajo para reducir oidación7reducción inmediatamente el aul de metileno. La incorporación de oígeno durante el orde/o, enfriamiento, trasvase, etc. eleva el potencial 0edo aproimadamente de E =.=@ a =.=F voltios. 5e cree que en el mecanismo de la reducción del colorante durante la prueba, intervengan varios factores relacionadas entre sí, pero lo que si es seguro que el proceso respiratorio de las bacterias, elimina oígeno de la leche, provocando un cambio en el potencial de 'ido70educción, puesto que, por lo general, el oígeno mantiene un potencial positivo, y que, a medida que el potencial va cayendo, el hidrógeno pasa de los elementos constitutivos de la leche y de los metabolitos aF aul de metileno, causando su reducción.
La prueba del aul de metileno, por su sencille y la rapide con que se obtienen los datos, es fácil, práctica y económica, sin embargo, este m#todo tiene sus limitaciones y son las siguientes* La temperatura de incubación de :;G %?>.@GH( no es favorable para el metabolismo de todas las bacterias contenidas en la leche. Las distintas bacterias tienen capacidades diferentes en lo que respecta a rebajar el potencial de 'ido7 reducción de la leche. Bor las siguientes raones* Las bacterias termod!ricas permanecen inactivas durante la prueba, y esta es la objeción más importante ya que estas bacterias son las que constituyen el mayor problema para el elaborador. I
I
Las bacterias sicrófilas y termófilas tendrán muy poca o ninguna actividad durante la prueba. Los materiales inhibidores de la leche impedirán tambi#n la
proliferación de muchas bacterias y harán que la prueba d# indicación de una calidad más alta que la realmente eistente.
IV. MATERIALES &uestras
de
leche
sin
conservantes
1ubos de ensayo
3ul de metileno 3lcohol 3gua destilada Bipetas
V. PARTE E:PERIMENTAL Pr&e#a e !a re&cción e! a5&! e meti!en" -
5e pipeteó F= mL de leche contenida en un tubo de ensayo est#ril y se le agregó F mL de la solución de aul de metileno.
-
3gitamos para meclar bien e incubar a:;9 en la estufa
-
Luego, rotulamos los dos tubos,
-
0evisar cada := min.
-
Bara determinar la calidad de la leche tenemos q tomar en cuenta lo siguiente
•
•
•
•
J > horas K > horas K @ horas
K < horas.
Lec%e e3ce!ente Do se decolora en ocho horas. ontiene menos de <==== microorganismos-ml. Lec%e #&ena 5e decolora en menos de ocho horas, pero no en menos de @ horas. ontiene menos de F==== microorganismos-ml. Lec%e re$&!ar 5e decolora en menos de seis horas pero no en menos de dos horas. ontiene unos :===.=== microorganismos-ml. Lec%e ma!a 5e decolora en menos de dos horas, contiene más de :===.=== microorganismos-ml. 5i el color desaparece en pocos minutos, la leche contiene unos F==.===.=== microorganismos-ml.
K de <==== microorganismos-ml K de F==== microorganismos-ml :===.=== microorganismos-ml. Jde:===.===
$celente %3( +uena %+( 0egular %(
microorganismos-ml 5i desaparece el color contiene F==.===.=== microorganismos-ml.
&ala %4(
)mportante
F. $l colorante aul de metileno el cual es un indicador de oido7reducción, es aul cuando está oidado e incoloro cuando está reducido. <.
arias especies
de bacterias,
no todas las que
pueden contaminar la leche, tienen la capacidad de secuestrar el oígeno presente en el medio y por lo tanto generar la reducción del aul de metileno con la consecuente p#rdida del tono aul. :. +ásicamente la velocidad con la cual se reduce el aul
de metileno depende del n!mero de microorganismos que tienen el efecto reductor, es decir que a mayor n!mero de bacterias con esa propiedad, menor será el tiempo necesario para que se produca el cambio de color en el tubo. $sto es lo que com!nmente se describe en bacteriología como un recuento metabólico indirecto. Internaci"na!mente !a ta#!a e inter*retación e! TRAM /e re!aci"na c"n !a/ /i$&iente/ rec&ent"/ e #acteria/ ;mL.
TRAM (min&t"/)
N" Bacteria/ ;mL.
< += min&t"/
= > += mi!!"ne/
+= min > %"ra/
4 > = mi!!"ne/
> ? %"ra/
=@8 > 4 mi!!"ne/
? %"ra/
< 8==.===
omo se puede ver en la tabla las variaciones pueden ser de n!mero de bacterias para determinado rango de variación es muy variable, raón por la cual la prueba a nivel mundial ha perdido aplicación como elemento para medir el n!mero de bacterias. 3 lo anterior se suma el hecho de que un gran n!mero de bacterias que hacen parte de la contaminación de la leche durante el orde/o tienen poca actividad reductora del aul de metileno y los n!meros de bacterias para un determinado 103& se ven incrementado en forma muy significativa, en aquellos orde/os donde las practicas de higiene son decientes. Tra#a2"/
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+ > 4 %"ra/ mi!!"ne/
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8 > ? %"ra/ mi!!"ne/
? > %"ra/ mi!!"ne/
> %"ra/
'
>
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mi!!"ne/
omo se puede observar mientras que en la tabla internacional, @ horas de 103& significan menos de 8==.===, en nuestro medio ese mismo tiempo corresponde aproimadamente a < millones de bacterias. $stas grandes diferencias se originan en la diversidad de fuentes de contaminación a que se ve sometida la leche cuando fallan las prácticas de higiene y se facilita la contaminación con microorganismos provenientes del intestino de los animales, que en general tienen muy poca actividad reductora, comparativamente
con bacterias de los g#neros 5treptococcus y Lactobacillus que son habitantes normales de la glándula mamaria y que a trav#s de ella pueden llegar a la leche. +asados en la actividad metabólica de los diferentes microorganismos que pueden contaminar la leche, la prueba 103& puede castigar leches que tienen poca contaminación ambiental pero con presencia de bacterias con gran capacidad reductora, como las mencionadas, y de otra parte favorecer a leches con alto n!mero de bacterias contaminantes ambientales producto de orde/os antihigi#nicos pero que demoran mucho en reducir el aul de metileno. 'tra raón para tener largo tiempo de 103& frente a un alto n!mero de bacterias es, que la leche eaminada contenga sustancias que inhiban el crecimiento bacteriano, por ejemplo, preservantes químicos o antibióticos, compuestos que cuando se está haciendo el 0ecuento en Blaca, por el factor de dilución a que se somete la muestra, pierden actividad o capacidad inhibitoria. $l hecho de tener cortos tiempos de 103& y 0ecuentos bajos de bacterias, es posible cuando varias c#lulas bacterianas se encuentran agrupadas y una olonia %UH( es el resultado de uno de estos grupos o de una sola c#lula. Bor esto en los recuentos de +acterias &esófilas se usa el t#rmino Unidades Hormadoras de olonia %UH(. $n la Brueba de 103& el hecho de que las bacterias est#n agrupadas o separadas no in"uye porque independientemente cada c#lula cumple su acción metabólica.
VI RESULTADOS LEC7E DE VACAFFFFF..TRAIDA DE 7UNTER
Cora <*:= B&
C o
Cora :*:= B&
ra :*== B&
Cora 6*== B&
Cora 6*:= B&
Cora 8*== B&
LEC7E U7T
$n la muestra pasteuriada %UC1( D' 3&+)3 de color porque se ha eliminado toda la "ora microbiana.
Cora <*== B& MMMMDo hay cambios
Cora <*:= B&MMMM.. Do hay cambios
Cora :*== B&MMMM.. Bresenta un precipitado aul
Cora :*:= B& MMMMM..Bresenta un precipitado aul
Cora 6*== B& MMMMM..Bresenta un precipitado aul
Cora 6*:= B& MMMMM..Bresenta un precipitado aul
Cora 8*== B& MMMMM..Bresenta un precipitado aul
4ebido al tiempo transcurrido en el cambio de viraje podemos decir que nuestra muestra tenia un rango entre :===.=== a F==.===.=== microorganismos -mL, lo cual la leche lo clasicamos como D' 3B13 para el consumo.
3 más tiempo que demore en virar el color de la reacción
con el aul de metileno2 quiere decir que esa leche $513 en mejores condiciones de consumo.
4$+) 4$ '&$0 &N5
1engo buena leche
VII. DISCUSIONES
tenerse en cuenta es que las clasicaciones dadas no siempre son apropiadas ya que eisten otros factores que pueden afectar al tiempo de reducción, entre ellos, el tipo de microorganismos, el numero de leucocitos, el tiempo de eposición a la lu, la cantidad de oigeno disuelto y la tendencia de la leche a elevar los microorganismos hacia la supercie a medida que se va separando la crema del tubo de prueba. 3sí es como ciertos microorganismos % lactococcus lactis( son más activos en su capacidad reductoras que otros, mientras que eisten especies que son menos activas en ese sentido %streptococcus agalactiae, termod!ricos(
bacillus
subtilis,
microorganismos
VIII. CONCLUSIONES
La calidad higi#nica de la leche ocupa en estos momentos una gran prioridad, para las industrias lácticas, es por eso los productores deben de producir su producto con el más cuidado.
La utiliación del 103&, tiempo de reducción del 3ul de metileno, es un m#todo practico de los tantos eistentes y que nos facilitan para analiar la calidad microbiológica de nuestra leche.
&ediante nuestra práctica realiada para lograr una coloración cambio de color rápidamente del color aul al blanco, lo cual esto nos da a conocer que nuestra leche analiada esta dentro del rango D' B$0&)1)4' y lo cual D' está 3B1' consumo humano.
Logramos
determinar
una
cantidad
para el
aproimada
de
microorganismos eistente en nuestra leche, lo cual nos permite garantiar que nuestro producto D' está 3B1' para el consumo humano. I:. BIBLIO-RAIA
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CUESTIONARIO . CUALES SON LOS COMPONENTES DEL A-AR PLATE COUNT
La composición del agar para recuento en placa puede variar, pero por lo general contiene* F. =,8Q de peptona <. =,<8Q de etracto de levadura :. =,FQ de glucosa 6. F,8Q de agar se ajustó el pC a neutral al <8 . +. 7A-A UNA LISTA DE LOS MICROOR-ANISMOS MESOILOS BENIICOS
PATO-ENOS
