Prosedur Diagnosa Laboratorium Serologis

PROSEDUR DIAGNOSA  LABORATORIUM SEROLOGIS

Disusun oleh : drh. TEDDY TURSINO

LABORATORY DEVELOPMENT PROJECT

PT. SWADESI CANDRASENTOSA

2010

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat rahmat dan karunia-Nya-lah sehingga kami dapat menyelesaikan diktat sederhana ini yang kami beri berjudul Prosedur Diagnosa Laboratorium Serologis . Diktat ini kami susun dengan maksud dan tujuan untuk membuat Standard  Operational Procedure (SOP) atau Prosedur Operasional Baku dalam melakukan

diagnosa laboratorium serologis yang nantinya akan mempermudah staff  laboratorium dalam melakukan pekerjaannya serta memberikan pemahaman dan pengertian mengenai interpretasi hasil uji laboratorium serologis. Diktat ini terdiri dari 3 Bab yang saling berkaitan, yaitu diawali dengan

Inokulasi Virus dan Preparasi Antigen , dilanjutkan dengan Uji Haemaglutinasi (HA) dan Haemaglutinasi Inhibisi (HI) , serta diakhiri dengan Uji Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) . Kami menyadari bahwa dalam penyusunan diktat ini masih terdapat kekurangan maupun kekeliruan yang mungkin luput dari jangkauan kami. Oleh karena itu, kami mengharapkan saran dan kritikan yang bersifat konstruktif demi tercapainya kesempurnaan dalam penyusunan diktat ini.

Jakarta, 10 April 2010 Penyusun,

drh. Teddy Tursino

1

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ........................................... ............................................................... ........................................ ............................ ........ 1 DAFTAR ISI ............................................ ................................................................ ........................................ ....................................... ................... 2 DAFTAR GAMBAR ............................................ ................................................................ ........................................ ............................ ........ 4 DAFTAR LAMPIRAN .......................................... ............................................................. ....................................... ............................ ........ 5 PENDAHULUAN ............................................ ................................................................ ........................................ ............................... ........... 6 TUJUAN ..................................... ............................................................... ............................................. ............................................. .......................... 8 BAB I.

INOKULASI VIRUS DAN PREPARASI ANTIGEN ................................... ................................... 11 PENANGANAN SPESIMEN SPESIMEN ........................................... ............................................................... ...................... .. 12 SPESIMEN UNTUK DIAGNOSIS ........................................... .......................................................... ............... 12 PENGIRIMAN DAN PENYIMPANAN SPESIMEN .................................. .................................. 12 PENANGANAN SAMPEL UNTUK ISOLASI VIRUS ................................ ................................ 13 INOKULASI VIRUS PADA TELUR BEREMBRIO .................................... .................................... 14 Alat dan Bahan ........................................... ............................................................... ......................... ..... 14 Cara Inokulasi ............................................. ................................................................. ......................... ..... 14 Candling Telur ....................................................... 14 Inokulasi Telur ....................................................... ....................................................... 15 Panen Inokulat Telur ............................................. ............................................. 16 16 PREPARASI ANTIGEN ......................................... ............................................................ ................................ ............. 19

BAB II. UJI HAEMAGLUTINASI (HA) DAN HAEMAGLUTINASI INHIBISI (HI) ............................................... ................................................. 21 PENGAMBILAN DARAH AYAM ................................................... ........................................................... ........ 22 Persiapan Pribadi .......................................... .............................................................. ...................... .. 22 Peralatan dan Bahan ......................................... ........................................................... .................. 22 Metode Pengambilan Darah ............................................... ............................................... 22 Koleksi Serum .......................................... ............................................................. ............................ ......... 22 Koleksi Darah Dengan Antikoagulan .................................... .................................... 24 MEMBUAT SUSPENSI SEL DARAH MERAH ATAU RED BLOOD BLOOD CELL (RBC) ............................................ ........................................................... ............... 25 Membuat Suspensi RBC 100 % ........................................... ........................................... 25 Membuat Suspensi RBC 20 % .......................................... ............................................. ... 26 Membuat Suspensi RBC 0,5 % ......................................... ............................................ ... 26 PENGUJIAN SAMPEL .......................................... ............................................................. ................................ ............. 27 Persiapan Pribadi .......................................... .............................................................. ...................... .. 27 Peralatan dan Bahan ......................................... ........................................................... .................. 27 UJI HAEMAGLUTINASI (HA) ......................................... ............................................................. ...................... .. 28 Kegunaan Uji HA ............................................ ............................................................... ..................... .. 28 Prosedur Kerja Uji HA ......................................................... ........................................................... 29 Interpretasi Hasil Uji HA ........................................... ...................................................... ........... 29 2

UJI HAEMAGLUTINASI INHIBISI INHIBISI (HI) .......................................... .................................................. ........ 30 Prinsip Uji HI ........................................... ............................................................... ............................. ......... 31 Kegunaan Uji HI .......................................... .............................................................. ......................... ..... 31 Keuntungan Uji HI .......................................... ............................................................. ..................... .. 32 Prosedur Kerja Uji HI ......................................... ........................................................... .................. 32 Interpretasi Hasil Uji HI HI ............................................ ....................................................... ........... 32 BAB III. UJI ENZYM ENZYM LINKED LINKED IMMUNOSORBANT IMMUNOSORBANT ASSAY (ELISA) ....................................... ................................................................. .............................................. ............................... ........... 35 PRINSIP UJI ELISA .................................................... ........................................................................ ........................... ....... 36 KOMPONEN YANG TERDAPAT TERDAPAT DALAM UJI ELISA .............................. .............................. 37 KOLEKSI SAMPEL ........................................... ............................................................... .................................... ................ 40 40 PERSIAPAN UJI ELISA ............................................ ............................................................... ............................. .......... 41 Pengenceran Sampel ................................................... ........................................................... ........ 41 Menyiapkan Kontrol Serum Serum Positif (Positive (Positive Control) ........ 42 Menyiapkan Kontrol Serum Negatif Negatif (Negative Control) ..... 42 Menyiapkan Larutan Konjugat (Goat) Anti-Chicken : HRPO Conjugate) Conjugate) .............................. .............................. 42 Menyiapkan Larutan Pencuci (Wash Solution) PBS – Tween 80 80 1 x ........................................... ............................................................. .................. 43 Menyiapkan Larutan Substrat (TMB (TMB Substrate) ................. 43 43 Menyiapkan Larutan Penghenti (Stop Solution) Solution) 1 x ........... 43 PROSEDUR KERJA UJI ELISA ......................................................... ............................................................... ...... 44 Menyiapkan Plate Untuk Uji Uji ELISA ..................................... ..................................... 44 Prosedur Pencucian Pencucian .......................................... ............................................................ .................. 45 Penambahan Larutan Konjugat, Substrat dan Penghenti (Stop) ........................................... .......................................................... ............... 45 MENGGUNAKAN ELISA READER TIPE DNX – 9062 PRODUKSI POTENY MEDICAL MEDICAL EQUIPMENT NANJING CHINA ............................. ............................. 46 PEMROSESAN DATA .......................................... ............................................................. ................................ ............. 48 INTERPRETASI HASIL .......................................................... .......................................................................... ................ 49 PENUTUP ...................................... ............................................................... ............................................. .......................................... ...................... 51 DAFTAR PUSTAKA ............................................ ................................................................ ........................................ ............................ ........ 52 LAMPIRAN ........................................ ................................................................. ............................................ ...................................... ................... 53

3

DAFTAR GAMBAR

No.

Teks

Halaman

Telur .......................................... .............................................................. ........................... ....... 15 1. Ilustrasi Bagian-Bagian Telur ................................................................ ............................................. ................................... ............... 18 2. Inkubator ....................................... .................................................................. ....... 18 3. Ilustrasi Panen Cairan Alantois ........................................................... ................................................................ ............................................. ................................... ............... 20 4. Sentrifuse ....................................... ............................................................... ........................................ ............................ ........ 20 5. Ultrasentrifuse ........................................... .............................................................. ........................................ ............................ ........ 25 6. Vena Brachialis .......................................... ................................................................ ......................................... ..................... 31 7. Ilustrasi HA dan HI ............................................ ................................................................. ......................................... .............. 33 8. Contoh Hasil Titrasi HI ...................................... .............................................................. ..................................... ................. 33 9. Contoh Hasil Titrasi HI .......................................... ............................................................... ........................................ ............................... ........... 37 10. ELISA Reader ........................................... .................................................................. .............................................. ...................................... .................. 38 11. Serum ........................................ .................................................. .......... 38 12. Microplate 96 Sumuran Dengan Dasar U ........................................ Yang Berlapis Ag Spesifik ........................................ .............................................. ...... 38 13. Microplate ELISA Yang ...................................... 39 39 14. Larutan Kontrol Serum Positif (Positive Control) ...................................... ................................... 39 15. Larutan Kontrol Serum Negatif (Negative Control) ................................... Anti-Chicken : HRPO Conjugate ............. ............. 39 16. Larutan Konjugat, Yaitu : (Goat) Anti-Chicken (Sample Diluent) ........................................... ............................................................... .................... 39 17. Larutan Buffer (Sample ............................................................. ...... 40 18. Larutan Substrat (TMB Substrate) ....................................................... (Stop Solution) 1x .......................................... ....................................................... ............. 40 19. Larutan Penghenti (Stop Tween 80 1x ....................... ....................... 40 20. Larutan Pencuci (Wash Solution) atau PBS – Tween ............................ 43 21. Ilustrasi Pengenceran Sampel Serum Pada Microplate ............................

4

DAFTAR LAMPIRAN

No.

Teks

Halaman

1. Interpretasi Hasil Titrasi HI ......................................... ............................................................. ............................... ........... 53 2. Contoh Laporan Hasil Titrasi HI .......................................... .............................................................. ....................... ... 55 3. Cara Pembuatan Larutan NaCl Fisiologis ................................................... ................................................... 56 4. Cara Pembuatan Larutan PBS .......................................... .............................................................. .......................... ...... 56 5. Cara Pembuatan Larutan Natrium Sitrat Sitrat 4% ........................................ ............................................. ..... 57 6. Cara Pembuatan Larutan Alsever’s ........................................ ........................................................... ................... 57 57 7. Cara Pembuatan Larutan Alkohol 70% .................................................... ...................................................... .. 58 8. Ilustrasi Tampilan ELISA ELISA Reader DNX – 9062 ....................................... ............................................ ..... 59 a. Panel Depan .............................................. ................................................................. ....................................... ........................ .... 59 b. Tampilan Menu ........................................... ............................................................... ........................................ .................... 59 c. Tampilan System Setting ........................................... ............................................................... .......................... ...... 59 d. Tampilan Program ........................................... ............................................................... .................................... ................ 59 e. Tampilan Panjang Gelombang (Wave Modes) .................................... .................................... 60 f.

Tampilan Detection Mode .......................................................... ................................................................... ......... 60

g. Tampilan Shaking Mode ............................................ ................................................................ .......................... ...... 60 h. Tampilan Pengaturan Sumuran ......................................................... ........................................................... .. 60 i.

Tampilan Penyelesaian Program Program (Program Completed) ..................... 60

 j.

Tampilan Detect .......................................... .............................................................. ........................................ .................... 6 0

9. Ilustrasi Tahapan Pemrosesan Data .......................................................... .......................................................... 61 a. Menghitung Nilai Rata-Rata Absorbansi Kontrol Serum Negatif ( NCx ) dan Kontrol Serum Positif ( PCx ) ................................ ................................ 61 b. Menghitung Nilai Koreksi Kontrol Positif Po sitif ( PCx – NCx ) ....................... ....................... 61 c. Menghitung Sampel Positif ( S/P Ratio ) ........................................ ............................................. ..... 61 d. Menghitung Titer ELISA .......................................... ............................................................. ............................. .......... 62 e. Membuat Grafik Titer Titer Maternal Antibody ......................................... ........................................... 63 ................................ 64 10. Perhitungan Pengenceran Antigen Titrasi HA 4 HAU ................................

5

PENDAHULUAN

Laboratorium serologi memiliki peranan yang penting dalam peneguhan diagnosa. Kadangkala dokter hewan maupun peternak yang sudah berpengalaman pun mengalami kesulitan untuk mendiagnosa suatu penyakit secara cepat dan tepat. Penyebabnya dapat bermacam-macam, antara lain : kasus yang ditangani merupakan kasus baru, sulitnya mengakses informasi dan teknologi terbaru, sedikitnya gejala klinis yang tampak atau gejala klinis yang tampak merupakan gabungan dari beberapa penyakit atau komplikasi. Uji serologi sebagai peneguh diagnosa merupakan sebuah metode yang digunakan untuk melihat gambaran kekebalan atau titer antibodi yang terdapat pada ayam. Prinsip utama uji serologi adalah mereaksikan antibodi dengan antigen yang sesuai. Dalam pelaksanaannya uji ini menggunakan serum sebagai sampel. Dalam sampel serum yang diperiksa terdapat antibodi. Antibodi adalah zat kekebalan yang dilepaskan oleh sel darah putih untuk mengenali serta menetralisir antigen yang ada dalam tubuh. Antigen adalah zat yang menstimulasi respon kekebalan. Seiring dengan perkembangan teknologi informasi, kesadaran peternak akan pentingnya uji serologis semakin meningkat, terutama dengan semakin banyaknya  jenis penyakit maupun padatnya jadwal vaksinasi. Melalui uji serologis, pelaksanaan vaksinasi ulang menjadi lebih tepat. Selain itu, hasil uji serologis juga dapat digunakan sebagai peneguhan diagnosa suatu penyakit. Titer antibodi dari penyakit viral seperti Newcastle Diseases (ND),  Avian Influenza (AI), Infectious Bursal Disease (IBD) atau Gumboro, Infectious Bronchitis (IB) dan Egg Drops Syndrome (EDS) maupun penyakit bakterial yaitu Coryza, Salmonella dan Chronic Respiratory Disease (CRD) dapat diketahui melalui uji serologis. Secara bahasa haemagglutination inhibition (HI) dapat diartikan sebagai hambatan haemaglutinasi. Sedangkan haemaglutinasi merupakan penggumpalan dari sel darah merah atau red blood cell  (RBC). Kemampuan mengaglutinasi tidak dimiliki oleh semua virus atau bakteri yang menyerang ayam tetapi hanya beberapa virus dan bakteri yang memiliki zat haemaglutinin, diantaranya  paramyxovirus (ND),  poxvirus (Pox), adenovirus (EDS), orthomyxovirus (AI), bakteri Mycoplasma sp., Haemophilus paragallinarum maupun Salmonella pullorum. Zat haemaglutinin yang 6

terdapat dalam virus maupun bakteri tersebut memiliki sifat antigenik yang dapat merangsang terbentuknya antibodi spesifik. Antibodi yang terbentuk memiliki kemampuan

mengambat

terjadinya

aglutinasi

RBC

yang

disebabkan

oleh

haemaglutinin dari virus atau bakteri. HI test menggunakan reaksi hambatan haemaglutinasi tersebut untuk membantu menentukan diagnosa penyakit secara laboratorium dan mengetahui status kekebalan tubuh atau titer antibodi. Prinsip kerja dari HI test ialah mereaksikan antigen dan serum dengan pengenceran tertentu sehingga dapat diketahui sampai pengenceran berapa antibodi yang terkandung dalam serum dapat menghambat terjadinya aglutinasi RBC. HI test merupakan metode uji serologis yang mudah dilakukan dan hasilnya dapat diketahui dengan cepat. Namun seringkali ketersediaan antigen menjadi penghambat untuk HI test. Hal ini disebabkan banyak laboratorium-laboratorium serologi yang tidak mau membagi atau menjual antigennya ke pada pihak lain dengan alasan keterbatasan stok. Apabila mereka mau menjualnya, itu pun dilakukan dengan memberikan harga yang sangat mahal kepada pihak pembeli. Untuk mengatasi permasalahan semacam itu hendaknya setiap laboratorium serologis menguasai prosedur inokulasi virus dan preparasi antigen. Sehingga ketersediaan stok antigen tidak menjadi kendala untuk dilakukannya HI test di laboratorium serologi. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay ) sebagai salah satu metode uji serologis mempunyai satu kelebihan, yaitu mampu mendeteksi beberapa jenis antibodi dari satu sampel serum (tergantung dari kit ELISA yang digunakan). ELISA  juga memiliki tingkat spesifikasi spesifikasi yang tinggi yaitu kemampuan kemampuan mendeteksi ayam yang tidak terinfeksi (ayam yang tidak terinfeksi dinyatakan negatif). Penggunaan ELISA sudah sangat luas karena lebih memiliki beberapa keunggulan yaitu cepat, dapat menguji sampel dalam jumlah banyak, akurat, mampu menghitung titer (kuantitatif) dan lebih fleksibel. Bahkan uji ini juga dapat digunakan di penelitian penelitian bidang tanaman serta industri makanan dalam mendeteksi alergi makanan serta efek toksik dari obat-obatan.

7

Pada unggas, metode uji ELISA sering digunakan untuk mendeteksi infeksi virus atau antibodi terhadap IB dan IBD maupun bakteri seperti Salmonella sp. dan Pasteurella multocida. ELISA juga merupakan metode uji serologis yang cepat untuk

menguji sampel dalam jumlah besar. Meski begitu, ELISA juga punya kekurangan yaitu harga peralatan yang mahal, misalnya ELISA reader, washer  dan komputer. Selain itu, ELISA kit tidak bisa dibuat sendiri.

TUJUAN

Tujuan dari disusunnya diktat Prosedur Diagnosa Laboratorium Serologis ini adalah agar para staff laboratorium memiliki pemahaman dan pengertian tentang beberapa hal, antara lain :

1. Mendiagnosa Penyakit. Ayam yang pernah di vaksin atau terinfeksi virus lapangan akan membentuk antibodi atau immunoglobulin berupa IgA, IgG dan IgM. IgG ialah antibodi utama dalam serum. Antibodi ini terdeteksi paling lambat 7 hari  post  infeksi atau vaksinasi. Uji serologi dapat dipakai untuk membantu menentukan adanya infeksi lapangan atau dari hasil kerja vaksin. Contohnya, ayam layer umur 60 hari yang belum pernah divaksin AI. Hasil uji serologi terdeteksi tingginya titer antibodi AI. Hal ini mengindikasikan adanya virus AI lapangan. Contoh lainnya pada kasus penurunan produksi telur tanpa gejala klinis. Uji serologi dapat dilakukan terhadap penyakit-penyakit yang dominan mengganggu produksi telur yaitu titer ND, IB, AI dan EDS.

2. Monitoring Titer Antibodi. Perbedaan kondisi peternakan menyebabkan titer antibodi lebih cepat turun daripada yang seharusnya. Penyebabnya adalah tingginya infeksi lapangan, stres atau penyakit immunosupressif seperti Gumboro atau CRD. Dengan uji serologis rutin

8

tiap bulan, diharapkan status titer antibodi ayam tetap terpantau dan dapat memperkirakan kapan ayam akan di vaksinasi kembali. Selain itu, uji serologis rutin berfungsi sebagai early warning system. Contohnya jika pada pemeriksaan pertama dan kedua terhadap AI diperoleh titer antibodi dan keseragaman yang bagus, namun pada pemeriksaan ketiga ditemukan titer antibodi sangat variatif dan sangat tinggi. Hal ini merupakan peringatan adanya tantangan virus lapangan. Keseragaman dan tinggi rendahnya titer antibodi antibodi dapat memberikan gambaran tahapan infeksi. Saat terjadi infeksi, tubuh ayam tidak langsung membentuk antibodi. Pada kasus ND, jika ayam tetap hidup maka 6-10 hari baru terdeteksi adanya titer antibodi. Sedangkan pada kasus AI titer antibodi baru terdeteksi 1-2 minggu  post  infeksi dengan gambaran titer yang sangat tinggi. Jika ayam yang terinfeksi belum divaksin biasanya keseragaman titer antibodinya jelek dimana bisa dijumpai titer antibodi yang sangat tinggi dan sangat rendah. Oleh karena itu, uji serologis yang dilakukan sesaat setelah virus menginfeksi tidak selalu memberikan hasil yang jelas.

3. Monitoring Hasil Vaksinasi. Waktu uji serologi untuk monitoring hasil vaksinasi dibedakan berdasarkan  jenis vaksin yang digunakan. Untuk mengetahui tingkat keberhasilan vaksinasi maka uji serologis dapat dilakukan pada 2-3 minggu  post  vaksinasi aktif dengan vaksin live atau 3-4 minggu  post vaksinasi inaktif dengan vaksin killed .

4. Pemetaan Baseline Titer. Baseline titer adalah level minimal titer antibodi agar peternakan aman dari

infeksi penyakit tertentu di lingkungan peternakan itu sendiri. Baseline titer bersifat spesifik untuk satu penyakit dan satu peternakan. Daerah yang sering terinfeksi ND tentu baseline titernya lebih tinggi dibanding daerah jarang kasus ND. Sering terjadi, peternakan yang memiliki titer antibodi ND rendah justru tidak pernah terserang ND, namun titer antibodi ND yang tinggi di peternakan lain, ternyata tidak dapat membebaskan peternakan tersebut dari serangan ND.

9

Pemantauan titer antibodi sebaiknya dilakukan secara rutin agar diketahui status ayam sakit atau sehat, mengevaluasi program vaksinasi, mendeteksi serangan penyakit sedini mungkin dan juga pemetaan baseline titer. Pada ayam petelur, pemetaan baseline titer setidaknya memerlukan data pemantauan titer antibodi selama satu periode pemeliharaan, begitu juga ayam broiler.

5. Mengukur antibodi maternal. Antibodi maternal merupakan antibodi yang diturunkan dari induk ayam kepada anaknya. Antibodi maternal ini akan berkurang (menurun) secara periodik. Pada saat antibodi maternal rendah (dibawah standar protektif) peluang ayam terinfeksi penyakit semakin besar. Oleh karena itu perlu dilakukan vaksinasi untuk menggertak pembentukan antibodi dalam tubuh ayam yang protektif. Uji serologis untuk mengukur antibodi maternal dilakukan ketika DOC. Pengukuran antibodi maternal sering dilakukan pada kasus Gumboro. Laboratorium pemeriksa

akan

memprediksi

kapan

titer

antibodi

maternal

turun

dan

memperkirakan waktu vaksinasi pertama dilakukan. Gambaran antibodi maternal ini  juga digunakan sebagai dasar pemilihan jenis vaksin Gumboro yang akan digunakan. Vaksin intermediate plus dapat bekerja akan menggertak pembentukan antibodi secara optimal ketika titer antibodi maternal 500 (ELISA), sedangkan vaksin intermediate pada titer antibodi maternal 200 (ELISA).

6. Inokulasi virus dan preparasi antigen. Inokulasi virus bertujuan untuk memperoleh isolat virus lapangan dengan cara mengolah spesimen tersebut untuk kemudian diperbanyak menggunakan telur ayam berembrio. Preparasi antigen dilakukan dengan cara menginaktivasi virus lapangan untuk kebutuhan uji HI test.

10

PROSEDUR DIAGNOSA LABORATORIUM SEROLOGI

BAB I INOKULASI VIRUS DAN PREPARASI ANTIGEN

DISUSUN OLEH :

drh. Teddy Tursino

LABORATORY LABORATORY DEVELOPMENT PROJECT PT. SWADESI CANDRASENTOSA JAKARTA 2010 11

PENANGANAN SPESIMEN

Isolasi virus dapat dilakukan dengan cara inokulasi pada telur ayam berembrio atau pada kultur sel. Keberhasilan isolasi virus sangat tergantung pada beberapa hal, antara lain : 1) Mutu spesimen. 2) Kondisi saat pengiriman. 3) Cara penyimpanan. 4) Penanganan sampel.

SPESIMEN UNTUK DIAGNOSIS

Spesimen untuk diagnosis dapat diperoleh dari unggas hidup maupun unggas mati. Spesimen yang diambil dari unggas hidup, antara lain : 1) Swab kloaka. 2) Swab trakhea. 3) Feses. 4) Serum.

Sedangkan spesimen untuk unggas mati, antara lain : 1) Swab kloaka. 2) Swab oro-nasal (mulut dan hidung). 3) Feses. 4) Organ : paru-paru, ginjal, limpa, otak, hati dan jantung.

PENGIRIMAN DAN PENYIMPANAN SPESIMEN

Pengiriman

dan

penyimpanan

spesimen

hendaknya

memperhatikan

beberapa hal, antara lain : 

Spesimen sebaiknya diperoleh dalam keadaan segar dan ditempatkan dalam termos es untuk segera dikirim ke laboratorium.

12



Spesimen yang tiba di laboratorium harus segera di inokulasikan pada pada telur ayam berembrio atau pada kultur sel.



Apabila spesimen tidak dapat diproses dalam waktu 48-72 jam, sebaiknya O

spesimen disimpan dalam freezer dengan suhu – 70 C. 

Untuk spesimen AI (avian influenza) sebaiknya tidak disimpan dalam keadaan kering beku (dry ice CO2), kecuali dalam wadah yang tertutup rapat, karena CO 2 dapat menginaktivasi virus AI jika kontak dengan spesimen.

PENANGANAN SAMPEL UNTUK ISOLASI VIRUS

Prosedur penanganan sampel untuk isolasi virus yang benar adalah sebagai berikut : 1. Untuk organ dan swab trakhea, masukkan spesimen ke dalam larutan PBS isotonis (pH 7.0-7.4) yang sudah ditambahkan antibiotik penicillin (2000 units/ml); streptomycin (2 mg/ml); gentamycin (50 µg/ml); dan antifungal mycostatin (1000 units/ml). Untuk mencegah pertumbuhan Chlamydophila sp. dapat ditambahakan oxytetracycline (0.05-0.1 mg/ml). 2. Untuk feses dan swab kloaka konsentrasi antibiotik ditingkatkan menjadi 5 kali lipat. 3. Untuk sampel berupa swab sebaiknya ditempatkan dalam media transport yang mengandung protein untuk menstabilkan virusnya, seperti brain-heart infusion 5% [v/v], cattle serum 0.5% [w/v], bovine albumen atau media transpot komersial lainnya). 4. Cek pH larutan PBS harus berada pada keadaan isotonis (pH 7.0-7.4). 5. Feses dan organ kemudian digerus halus dan dibuat suspensi 1 0-20% (w/v) dalam larutan yang mengandung antibiotik. O

6. Inkubasi suspensi tersebut pada suhu kamar 22-25 C selama 1-2 jam. 7. Suspensi yang telah diinkubasikan sebaiknya segera di proses, namun apabila hal itu tidak memungkinkan maka dapat disimpan selama 4 hari pada kulkas dengan O

suhu 4 C. 8. Sentrifugasi suspensi yang telah diinkubasi dengan kecepatan 1000 g atau 3000 O

rpm selama 10 menit dengan temperatur tidak melebihi 25 C. 13

9. Ambil cairan supernatannya.

INOKULASI VIRUS PADA TELUR BEREMBRIO

Alat dan Bahan Alat dan bahan yang diperlukan untuk isolasi virus dan preparasi antigen adalah sebagai berikut :



Telur ayam berembrio yang SPF ( specific pathogen free ) atau SAN ( specific antibody negative ) umur 9-11 hari sebanyak 3-5 butir.



Egg candler atau teropong telur.



Needle, 22 gauge, 11/2 inch.



Syringe 1 ml.



Pelubang telur.



Lem atau perekat.



Tabung 15 ml dan rak nya.



Pipet 10ml.



Gunting atau forceps steril.



Alkohol 70 %.



Inkubator (Gambar 2).



Sentrifus dan ultrasentrifus ( Gambar 4 dan Gambar 5).

Cara Inokulasi

Candling Telur

Prosedur candling telur yang benar adalah sebagai berikut : 1. Amati telur dengan egg candler  dengan sisi tumpul telur diletakkan pada bagian atas rak telur atau berlawanan dengan egg candler . Candling telur sebaiknya dilakukan didalam ruangan gelap. 2. Berilah tanda dengan pensil posisi kepala embrio dan batas kantung udara ( air  sac). Embrio akan tampak sebagai bayangan hitam dengan kepalanya sebagai

bintik hitam. 14

3. Telur dengan embrio yang hidup dan sehat ditandai dengan penampakan pembuluh darah yang jelas, menyebar seperti jala dan berwarna merah cerah serta embrio yang bergerak-gerak (sebagai responnya terhadap cahaya). 4. Telur-telur yang infertile (steril), tidak ada pertumbuhan atau yang embrionya mati dan yang memilliki cangkang keropos atau retak harus dibuang. Ilustrasi bagian-bagian telur dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Ilustrasi Bagian-Bagian Telur

Inokulasi Telur Prosedur inokulasi telur yang benar adalah sebagai berikut : 1. Bersihkan permukaan telur dengan kapas yang telah diberi alkohol 70%. 2. Letakkan telur (3-5 telur tiap spesimen) pada rak dengan sisi tumpul telur pada bagian atas rak. 15

3. Beri label atau nomor pada masing-masing telur. 4. Amati telur dengan egg candler  untuk menentukan posisi kepala embrio dan batas kantung udara ( air sac). 5. Bersihkan bagian atas telur dengan alkohol 70%. 6. Buat lubang kecil pada kulit telur tepat diatas kantung udara ( air sac). 7. Aspirasi atau hisap spesimen yang telah diproses dengan needle, 22 gauge, 1½ inch. 8. Inokulasikan 0,1 ml cairan spesimen ke dalam lubang telur yang telah dibuat sampai menembus membran amnion ( amniotic membrane), lalu jarum ditarik + ½ inch kemudian inokulasikan lagi 0,1 ml cairan spesimen ke ruang alantois (allantoic cavity ). ). Setelah itu jarum ditarik dan dijauhkan dari telur. 9. Buang syringe ke dalam kontainer yang aman. 10. Tutup lubang pada telur dengan lem atau perekat. 11. Letakkan telur pada rak dengan posisi kantung udara ( air sac) berada diatas. 12. Inkubator yang akan digunakan sebelumnya telah dibersihkan permukaannya dengan lap basah dan didesinfeksi dengan alkohol 70% atau dengan desinfektan yang non korosif. 13. Fumigasi inkubator dapat juga dilakukan dengan mencampur formalin cair dan 3

kalium permanganat (KMnO 4) dengan perbandingan 2 : 1 untuk 3 m . Setelah difumigasi inkubator harus didiamkan selama 24-48 jam dalam keadaan tertutup sebelum digunakan. 14. Inkubasikan telur di dalam inkubator dengan suhu 37

O

C (35-39

O

C) dan

kelembaban 60-65% selama 4-7 hari untuk replikasi virus. Letakkan piring berisi air dibawah inkubator untuk mempertahankan kadar kelembaban. Telur diputar O

setiap hari dengan sudut putar 180 . Pemutaran telur bertujuan agar embrio tidak menempel pada salah satu sisi kerabang telur yang akhirnya dapat menyebabkan kematian. 15. Amati telur dengan egg candler . Embrio yang mati dalam kurun waktu 24 jam dianggap gagal dan harus dibuang.

Panen Inokulat Telur Prosedur panen inokulat telur yang benar adalah sebagai berikut : 16

O

1. Telur didinginkan pada suhu 4 C selama semalam atau 4 jam sebelum di panen. Tujuannya adalah untuk membunuh embrio yang masih hidup dan mengurangi resiko kontaminasi cairan alantois ( allantoic fluid ) dengan darah selama panen. 2. Setiap telur disediakan satu tabung plastik 15 ml berlabel nomor spesimen. 3. Bersihkan permukaan telur dengan alkohol 70%. 4. Buka lem atau perekat yang digunakan untuk menutup lubang. 5. Gunting cangkang bagian atas kantung udara ( air sac) sampai tepi membran alantois (allantoic membrane) dengan forceps atau gunting steril. 6. Hisap cairan alantois ( allantoic fluid ) dengan pipet 10 ml kemudian dimasukkan ke dalam tabung plastik yang telah diberi label. Ilustrasi panen cairan alantois tampak pada Gambar 3. 7. Tusuk kantong amnion (amniotic cavity ) dengan syringe dan needle kemudian pindahkan sebanyak mungkin cairan yang ada ke dalam tabung terpisah. Apabila diperoleh sedikit cairan amnion ( amniotic fluid ), ), maka dapat digabungkan dengan cairan amnion ( amniotic fluid ) dari telur yang lain. 8. Sentrifugasi inokulat yang telah dipanen dengan kecepatan 2000 rpm selama 20 menit atau diamkan selama semalam pada suhu 4

O

C untuk mengendapkan

darah dan sel-sel. Cairan amnion ( amniotic fluid ) akan tampak jelas atau bening setelah di sentrifus atau diamkan selama semalam. 9. Apabila melalui proses sentrifugasi, dinginkan cairan amnion ( amniotic fluid ) pada

suhu

4

O

C

selama

30

menit

untuk

kemudian

diuji

aktivitas

haemaglutinasinya (HA) menggunakan RBC 2%. 10. Apabila melalui proses didiamkan selama semalam pada suhu 4

O

C, setelah 24

 jam cairan amnion (amniotic fluid ) diuji aktivitas haemaglutinasinya (HA) menggunakan RBC 2%. 11. Cairan yang memberikan reaksi negatif haemaglutinasi (HA) dilakukan inokulasi kembali ( passase  passase kedua) pada sekurang-kurangnya 1 set atau seri telur (3-5 telur). Untuk kemudian mengulangi prosedur diatas. 12. Isolat harus disimpan pada suhu – 70

O

C setiap panen. Virus cenderung tidak

O

stabil jika disimpan pada suhu – 20 C. Cairan alantois yang mengandung virus O

dan disimpan pada suhu 4 C selama 6 minggu cenderung tidak menunjukkan penurunan titer yang signifikan. 17

Gambar 2. Inkubator

Gambar 3. Ilustrasi Panen Cairan Alantois

18

PREPARASI ANTIGEN

Prosedur preparasi antigen yang benar adalah sebagai berikut : 1. Antigen dipersiapkan dengan cara mengkonsentrasikan virus dari cairan allantois (allantoic fluid ) atau mengekstraksi membran chorioallantois ( chorio allantoic membrane = CAM) yang diinfeksi dengan ultrasentrifugasi atau presipitasi dalam

kondisi asam. 2. Membran chorioallantois (chorio allantoic membrane = CAM) di gerus hingga menjadi bentuk pasta dengan 3 kali pengulangan proses beku-cair. 3. Cairan allantois ( allantoic fluid ) atau cairan ekstraksi chorioallantois ( chorio allantoic membrane = CAM) kemudian disentrifugasi dengan ultrasentrifugasi

pada kecepatan 2000-7000 rpm selama 20 menit. 4. Atau melalui cara presipitasi dalam kondisi asam, yaitu dengan pemambahan 1.0 M HCl ke dalam cairan allantois ( allantoic fluid ) atau cairan ekstraksi chorioallantois ( chorio allantoic membrane = CAM) infektif untuk memperoleh pH 4.0. 5. Endapan dibuang dan supernatan digunakan sebagai antigen. 6. Preparasi antigen atau proses inaktivasi virus dilakukan dengan cara menambahkan 0.1 % formalin atau 0.1 % ß-propiolactone ke dalam supernatan O

untuk kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 2 jam. 7. Cairan allantois yang diperoleh akan mengandung nukleokapsid dan polipeptida matriks antigen. Sedangkan cairan dari membran chorioallantois akan mengandung nukleokapsid antigen.

19

Gambar 4. Sentrifuse

Gambar 5. Ultrasentrifuse

20

PROSEDUR DIAGNOSA LABORATORIUM SEROLOGI

BAB II UJI HAEMAGLUTINASI (HA) DAN HAEMAGLUTINASI INHIBISI (HI)

DISUSUN OLEH :

drh. Teddy Tursino

LABORATORY LABORATORY DEVELOPMENT PROJECT PT. SWADESI CANDRASENTOSA JAKARTA 2010 21

PENGAMBILAN DARAH AYAM

Persiapan Pribadi Sebelum melakukan pengambilan darah hendaknya mempersiapkan diri dengan memastikan semua semua peralatan lengkap. Pakailah jas lab atau atau baju kandang, sarung tangan dan sepatu boot.

Peralatan dan Bahan Siapkan spuit (1 ml, 3 ml atau 5 ml), termos es, kapas, kertas label, larutan antikoagulan (larutan Alsever’s (pH 7.0-7.2) atau Natrium Sitrat 4 %), alkohol 70 % dan tabung untuk menyimpan darah.

Metode Pengambilan Darah Ada 2 macam metode pengambilan darah, yaitu dengan antikoagulan dan tanpa antikoagulan. Darah dengan antikoagulan atau darah dengan sitrat digunakan untuk pembuatan suspensi sel darah merah atau red blood cell  (RBC), yang akan digunakan untuk titrasi HA atau HI. Sedangkan darah tanpa antikoagulan biasanya  juga disebut darah beku atau darah utuh ( whole blood ) digunakan untuk koleksi sampel serum guna isolasi virus dan pemeriksaan serologis atau antibodi.

Koleksi Serum Teknik dan waktu pengambilan serum adalah dua faktor penting dalam penanganan serum. Waktu pengambilan yang tepat akan memperlihatkan kondisi imunitas ayam yang sebenarnya dan terhindar dari salah penafsiran. Waktu pengambilan sampel serum dapat dibedakan menjadi : 1) Saat maternal antibody  masih sangat tinggi ( pre vaksinasi), biasa dilakukan pada DOC untuk menentukan umur atau jadwal vaksinasi Gumboro yang pertama. 2) Dua hingga tiga minggu  post  vaksinasi aktif dengan vaksin live atau tiga hingga empat minggu  post  vaksinasi inaktif dengan vaksin killed . Hal ini dikarenakan vaksinasi aktif lebih cepat mencapai level protektif namun lebih cepat pula turunnya sedangkan vaksin inaktif bekerja secara perlahan mencapai level titer protektif. 22

3) Setiap satu bulan sebagai monitoring titer antibodi.

Kondisi serum yang baik akan menentukan keakuratan suatu uji serologi. Beberapa faktor penyebab kerusakan serum ialah sinar matahari, suhu tinggi, pH dan kontaminasi logam. Teknik pengambilan sampel serum yang baik dan benar akan diuraikan dibawah ini : 1. Pengambilan sampel darah dilakukan secara acak. Jumlah sampel minimal 0,5% dari total populasi atau 15-20 sampel per kandang. Sedangkan jumlah sampel untuk uji maternal antibody  IBD disarankan 18 sampel per flok dari anak ayam  pre vaksinasi). Pada kandang baterai, sampel diambil dari sehat berumur 1-4 hari ( pre

ayam di bagian bawah, tengah, atas dan ke arah diagonal. Sampel dari kandang postal diambil di masing-masing pojok dan tengah kandang. 2. Rute pengambilan darah disesuaikan dengan ukuran ayam. Untuk ayam besar darah diambil melalui vena brachialis yang terletak di sayap ( Gambar 6). Sedangkan untuk DOC darah diambil dari jantung (intrakardial). Sebelumnya cabuti bulu-bulu halus yang ada disekitar vena brachialis. Kemudian bersihkan daerah tersebut menggunakan kapas beralkohol. 3. Volume sampel darah yang diambil untuk serum hendaknya mencapai minimal 0,5 ml untuk DOC dan 1 ml untuk ayam dewasa sehingga diharapkan akan diperoleh jumlah serum yang dibutuhkan untuk titrasi HA atau HI. 4. Sampel darah harus secepat mungkin dibawa ke laboratorium untuk mengurangi resiko lisis. Hindari penggunaan serum yang telah bercampur dengan darah karena lisis. 5. Setelah darah ayam diperoleh. Letakkan spuit pada posisi miring dengan bagian O

 jarum menghadap ke atas. Diamkan terlebih dahulu pada suhu kamar 22-25 C minimal 2 jam. Hindarkan dari suhu panas dan sinar matahari langsung. O

6. Kemudian simpan pada suhu 4 C untuk memisahkan serum. Spuit masih tetap pada posisi miring dengan bagian jarum menghadap ke atas. Tiap 2 ml darah akan keluar serum sebanyak + 0,75 s.d 1 ml. 7. Setelah terbentuk serum, maka serum dipisahkan dari darah dan disimpan dalam tabung Ependorf. Serum yang bagus akan berwarna kuning bening.

23

8. Masukkan tabung Ependorf ke dalam heating block . Panaskan serum pada suhu O

57-58 C selama 30 menit. 9. Sentrifugasi tabung Ependorf yang berisi serum untuk menghilangkan sisa RBC nya. O

10. Ambil supernatannya dan beri label lalu disimpan dalam  freezer  suhu – 20 C. O

Penyimpanan serum pada suhu 2-8

C hanya bertahan 3-5 hari. Sedangkan

O

penyimpanan serum pada suhu – 20 C dapat bertahan 2-5 tahun.

Koleksi Darah Dengan Antikoagulan Berikut ini adalah prosedur pengambilan darah d engan antikoagulan : 1. Isi spuit dengan larutan Alsever`s dengan perbandingan antara larutan Alsever`s dengan darah ayam yang akan diambil sebanyak 1:1. 2. Darah ayam diambil melalui vena brachialis yang terletak di sayap. Sebelumnya cabuti bulu-bulu halus yang ada disekitar vena brachialis. Kemudian bersihkan daerah tersebut menggunakan kapas beralkohol. 3. Volume darah yang diambil dengan den gan antikoagulan hendaknya mencapai minimal 5 ml sehingga diharapkan akan diperoleh jumlah suspensi RBC yang dibutuhkan untuk titrasi HA atau HI. 4. Sampel darah harus secepat mungkin dibawa ke laboratorium untuk mengurangi resiko lisis. 5. Setelah darah ayam diperoleh. Campurkan secara merata antara darah dengan larutan Alsever`s dengan cara membolak-balikkan spuit ke atas dan ke bawah.

6. Pindahkan campuran Alsever`s dan darah ke dalam tabung dengan cara melepaskan gagang spuit atau dengan melepaskan jarum dari spuit, kemudian tuangkan darah melalui dinding tabung dalam posisi dimiringkan.

24

Gambar 6. Vena Brachialis

MEMBUAT SUSPENSI SEL DARAH MERAH ATAU RED BLOOD CELL (RBC)

Membuat Suspensi RBC 100% Berikut ini adalah prosedur pembuatan suspensi RBC 100% : 1. Tuangkan campuran Alsever`s dan darah ayam yang diperoleh ke dalam tabung sentrifus dengan dasar runcing. 2. Sentrifugasi dengan kecepatan 1200 rpm selama 10 menit. 3. Buang supernatan dan lapisan buffy coat menggunakan pipet. 4. Tambahkan 50 ml PBS (pH 7.0-7.2) dan dicampur secara perlahan. 5. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 1200 rpm selama 10 menit. 6. Supernatan dibuang lagi. 7. Lakukan hal yang sama seperti tahapan sebelumnya hingga 3 kali pencucian dengan PBS. 8. Tahapan selanjutnya yaitu menghitung endapan RBC. Hasilnya adalah suspensi RBC 100%.

25

Membuat Suspensi RBC 20% Berikut ini adalah prosedur pembuatan suspensi RBC 20% : 1. Buat Suspensi RBC 20% dengan cara menambahkan PBS sebanyak 4 kali volume suspensi RBC 100%. 2. Suspensi RBC 20% disimpan di dalam kulkas pada suhu 4

O

C tidak lebih dari 5

hari.

Membuat Suspensi RBC 0,5% Berikut ini adalah prosedur pembuatan suspensi RBC 0,5% : 1. Suspensi RBC 0,5% biasanya digunakan untuk titrasi HA atau HI pada kasus ND, AI, IB dan EDS. 2. Suspensi RBC 0,5% dibuat dengan cara pengenceran suspensi RBC 20%. 3. Hitung kebutuhan PBS. Untuk mengerjakan satu buah mikroplate 96 sumuran akan dibutuhkan PBS sebanyak 96 µl x 25 µl PBS = 2400 µl. 4. Hitung kebutuhan suspensi RBC 0,5%. Misalkan saja pada hari itu mengerjakan 1 mikroplate untuk uji HA dan 4 mikroplate untuk uji HI, maka suspensi RBC 0,5 % yang diperlukan adalah 5 x 2400 µl = 12000 µl. 5. Kemudian gunakan rumus pengenceran, yaitu :

N1 x V1 = N2 x V2 Keterangan : N1

=

konsentrasi kini

V1

=

volume kini

N2

=

konsentrasi yang diinginkan

V2

=

volume yang diinginkan

Maka volume suspensi RBC 20% yang dibutuhkan untuk pengenceran adalah : 20% x V1 = 0,5% x 12000 12000 µl V1 = 0,5 x 12000 20 = 300 µl

26

6. Sehingga suspensi RBC 0,5% diencerkan dengan cara mencampurkan 300 µl suspensi RBC 20% dengan 2100 µl PBS (2400 µl – 300 µl = 2100 µl).

PENGUJIAN SAMPEL

Persiapan Pribadi Sebelum masuk ke dalam laboratorium dan melakukan pengujian terhadap sampel pastikan memakai alas kaki yang dikhususkan untuk di dalam laboratorium. Persiapkan juga jas laboratorium dan sarung tangan serta masker apabila diperlukan.

Peralatan dan Bahan Alat dan bahan dipersiapkan sesuai dengan pengujian yang akan dilakukan. Diperhatikan juga tanggal kadaluarsa suatu bahan yang akan digunakan. Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam uji HA dan HI, antara lain :

a. Alat : 

Mikropipet multichannel (12 lubang).



Mikroplate 96 sumuran dengan dasar berbentuk U.



Mikropipet ukuran 1000 µl, 500 µl, 250 µl,100 µl, dan 50 µl.



Pipet ukur + balon sedot ukuran 20 ml dan 10 ml.



Gelas ukur 10 ml, 50 ml dan 100ml.



Pipet tetes.



Sentrifus.



Tabung reaksi bentuk V + rak.



Tip ukuran sedang (putih) dan besar (biru).



Heating block .



Botol sedang / botol kecil / botol Falcon.



Tabung Ependorf + rak.



Diluent Chamber.



Lemari pendingin atau kulkas.



Plastik wrapping.



Spuit. 27



Timer .



Sterilisator (UV, autoklaf, dll).



pH meter atau kertas lakmus.



Timbangan analitik atau digital.



Kalkulator.



Botol semprotan.



Kertas label.

b. Bahan : 

Antigen murni (ND, AI, IB dan EDS).



RBC dari ayam kampung yang belum pernah divaksin.



Alkohol 70%. Cara pembuatan larutan Alkohol 70% dapat dilihat pada Lampiran

7. 

Alsever’s atau Natrium Sitrat 4%. Cara pembuatan larutan Alsever’s dan Natrium Sitrat 4% dapat dilihat pada Lampiran 6 dan Lampiran 5.



PBS (pH 7.2) atau NaCl fisiologis. Cara pembuatan larutan PBS dan NaCl fisiologis dapat dilihat pada Lampiran 4 dan Lampiran 3.



Aquades pH 7.4.



Kapas.

UJI HAEMAGLUTINASI (HA)

Haemaglutinasi dapat diartikan sebagai terjadinya penggumpalan yang besar dari RBC. Penggumpalan tersebut disebabkan oleh virion itu sendiri, pecahanpecahan virion (oleh myxovirus) atau dapat juga disebabkan oleh haemaglutinin (oleh  pox virus) yang dihasilkan selama replikasi virus. Haemaglutinin akan melekat secara spontan kepada kedua RBC dan merupakan jembatan antara keduanya. Jadi secara sederhana dapat diartikan bahwa Haemaglutinasi (HA) terjadi karena adanya interaksi antara virion dan permukaan RBC.

Kegunaan Uji HA Kegunaan uji HA antara lain : 28

1. Untuk diagnosa. Apabila HA positif berarti pada spesimen yang diperiksa mengandung virus yang berasal dari golongan yang mampu mengaglutinasi RBC. 2. Untuk titrasi. Untuk mengetahui titer atau menghitung banyaknya virus yang terdapat pada suatu suspensi yang diperiksa. Satuan yang digunakan adalah haemaglutination unit (HAU) per satuan volume (ml).

Prosedur Kerja Uji HA Berikut ini adalah prosedur kerja uji HA : 1. Masukan 25 µl PBS dengan menggunakan mikropipet multichannel ke dalam tiap sumuran mikroplate 1 s.d 11 dan masukan 50 µl PBS pada sumuran 12. 2. Tambahkan 25 µl suspensi virus isolat lapang ke dalam kolom sumuran pertama. 3. Transfer 25 µl larutan yang ada dalam kolom pertama ke kolom kedua, dan seterusnya dari sumuran 1 s.d 11 untuk memperoleh 2 x pengenceran atau double dilution.

4. Tambahkan 25 µl RBC ke setiap sumuran, dari sumuran 1 s.d 12. 5. Goyangkan plate dan biarkan selama 30 menit sampai RBC mengendap pada O

O

suhu kamar 22-25 C atau 60 menit pada suhu kulkas 4 C. 6. Aglutinasi dibaca dengan memiringkan plate untuk melihat ada atau tidaknya aliran bentukan air mata dari RBC.

Interpretasi Hasil Uji HA Haemaglutinasi adalah pengenceran tertinggi yang menunjukkan aglutinasi (HA) sempurna (tidak ada aliran bentukan air mata dari RBC). Titrasi tertinggi ini bernilai 1 HAU. Pengenceran antigen yang digunakan untuk titrasi HI bernilai 4 HAU. Suatu unit HA didefinisikan sebagai jumlah virus yang dibutuhkan untuk mengaglutinasi sebesar volume yang sama dengan volume RBC. Ilustrasi HA diperlihatkan pada Gambar 7.

Contoh : 

5

Misalkan saja dari hasil titrasi HA terhadap Ag ND diperoleh hasil 2 (1 HAU).

29



Untuk memperoleh 4 HAU, maka perhitungan dilakukan ke belakang atau 5

4

3

2

menuju ke pengenceran terendah: 2 (1 HAU), 2 (2 HAU), 2 (4 HAU), 2 (8 HAU), dst. Perhitungan pengenceran antigen titrasi HA 4 HAU dapat dilihat pada

Lampiran 10. 

3

Pengenceran Ag ND yang akan digunakan untuk titrasi HI yaitu 2 (4 HAU) atau pengenceran Ag ND 1 : 8.



Selanjutnya Ag ND diencerkan dengan terlebih dahulu dengan mengetahui kebutuhan PBS yang akan digunakan untuk titrasi HI.



Misalkan saja dari kandang A diambil 16 sampel. Banyaknya microplate yang akan digunakan untuk titrasi HI sebanyak 2 buah (16 sampel : 8 baris plate). Satu buah microplate terdiri dari 8 baris dan 12 kolom.



Sehingga kebutuhan PBS-nya adalah 4.400 µl (2 plate x 8 baris x 11 sumur x 25 µl).



Pengenceran Ag ND untuk titrasi HI kandang A adalah 550 µl Ag ND (4.400 µl : 8) dicampur dengan 3.850 µl PBS (4.400 µl PBS - 550 µl Ag ND).

UJI HAEMAGLUTINASI INHIBISI (HI)

Haemaglutinasi inhibisi dapat diartikan sebagai terjadinya hambatan penggumpalan RBC karena adanya penghambat kemampuan aglutinasi virus, yaitu antibodi yang sejenis (homolog). Prinsip dasar uji HI adalah hambatan reaksi agglutinasi RBC oleh virus akibat terikatnya virus tersebut oleh antibodi spesifik. Oleh karena itu uji ini hanya dapat dilakukan untuk mikroorganisme yang mengaglutinasi RBC. Pada ayam virus ND, AI, IB dan EDS serta bakteri Mycoplasma sp. dapat diuji dengan HI Test. Secara singkat, metode kerja uji HI adalah pengenceran bertingkat serum sampel hingga pengenceran terbesar yang masih sanggup menghambat agglutinasi RBC. Hasil positif jika tidak terjadi agglutinasi dan hasil ne gatif jika terjadi agglutinasi. Hasil yang didapat diformulasikan sehingga diketahui titer antibodinya sehingga dapat dibandingkan dengan standar titer protektif. Titer protektif adalah batas minimal jumlah antibodi dalam tubuh yang masih mampu melindungi terhadap virus tertentu. Standar titer protektif antibodi tergantung dari jenis virus spesifik. Sebagai 30

contoh titer protektif ND untuk ayam layer adalah 64, berarti jika di bawah nilai tersebut, maka antibodi di dalam tubuh ayam tidak dapat melindungi ayam dari virus, begitu juga sebaliknya. Selain titer tersebut, kita juga perlu memperhatikan persentase kebal dan keseragamannya.

 Aglutinasi sempurna

Pengenceran Ag :

½

 Aglutinasi partial

¼

1/8

8HAU

Nilai HA :

Nilai HI :

1

2

2

2

1/16

4HAU

3

2

Tidak Aglutinasi

1/32

2HAU

4

1/64

1/128

1HAU

5

2

2

Gambar 7. Ilustrasi HA dan HI

Prinsip Uji HI Adapun prinsip kerja uji HI adalah sebagai berikut : 

Titer HA virus ditentukan sebagai antilog pengenceran tertinggi dari virus yang masih mampu mengaglutinasi RBC.



Titer antibodi HI ditentukan sebagai antilog pengenceran tertinggi dari serum yang masih mampu menghambat aglutinasi RBC.

Kegunaan Uji HI Kegunaan uji HI antara lain : 

Identifikasi jenis Ag tertentu dengan mereaksikannya dengan jenis Ab yang telah diketahui jenisnya.



Mengetahui jenis Ab (terhadap jenis Ag apa). 31



Mengetahui banyaknya atau titer dari Ab yang terdapat dalam suatu serum dengan mereaksikannya terhadap Ag yang telah diketahui jenis dan jumlahnya.

Keuntungan Uji HI Keuntungan dari uji HI adalah : 

Relatif murah, mudah, dan cepat.



Pengujian dapat dikerjakan di laboratorium dengan fasilitas yang sederhana.

Prosedur Kerja Uji HI Berikut ini adalah prosedur kerja uji HA : 1. Masukkan 25 µl PBS dengan menggunakan mikropipet multichannel ke dalam tiap sumuran mikroplate 1 s.d 11 dan masukan 50 µl PBS pada sumuran 12. 2. Tambahkan 25 µl spesimen serum ke dalam sumuran kolom pertama. 3. Transfer 25 µl larutan yang ada dalam kolom pertama ke kolom kedua, dan seterusnya dari sumuran 1 s.d 11 untuk memperoleh 2 x pengenceran atau double dilution.

4. Tambahkan 25 µl virus atau Ag standar 4 HAU ke dalam sumuran 1 s.d 11 dan O

biarkan selama 10 menit pada suhu kamar 22-25 C. 5. Tambahkan 25 µl RBC ke setiap sumuran, dari sumuran 1 s.d 12. 6. Goyangkan plate dan dicampur dengan baik, lalu biarkan RBC mengendap selama O

30 s.d 40 menit me nit pada suhu kamar 22-25 C. 7. Baca hasilnya. Ilustrasi HI diperlihatkan pada Gambar 7. Contoh hasil titrasi HI diperlihatkan pada Gambar 8 dan Gambar 9.

Interpretasi Hasil Uji HI Titer HI adalah pengenceran tertinggi dari serum yang menimbulkan inhibisi sempurna antigen 4 HAU. Pembacaan hasil dilakukan dengan dengan cara memiringkan memiringkan plate, hanya sumuran dengan RBC yang mengalir pada kecepatan yang sama dengan sumuran kontrol dapat dipertimbangkan sebagai gambaran inhibisi. Contoh laporan hasil titrasi HI diperlihatkan pada Lampiran 2.

32

Gambar 8. Contoh Hasil Titrasi HI

Gambar 9. Contoh Hasil Titrasi HI. A = Menunjukkan Tidak Terjadinya Aglutinasi. Sedangkan B = Menunjukkan Terjadinya Aglutinasi.

Titer HI dapat dianggap positif jika terdapat inhibisi pada pengenceran serum 4

1/16 (2 atau log2 4) atau lebih terhadap antigen 4 HAU. Beberapa laboratorium lebih suka menggunakan 8 HAU/50 µl pada uji HI. Interpretasi hasil titrasi HI dirangkum dalam Lampiran 1. Titer antibodi yang tinggi belum menjamin bahwa ayam tersebut akan aman dari infeksi alam. Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan interpretasi hasil uji HI ialah tingkat keseragaman atau koefisien variasi (% CV), titer antibodi, kesesuaian virus vaksin dengan virus lapangan, tingkat tantangan virus lapangan, ada tidaknya komplikasi atau penyakit immunosuppressive (menurukan sistem kekebalan tubuh) dan jumlah sampel yang kurang sesuai. Kemampuan titer antibodi dalam menetralisir infeksi akan optimal jika titernya protektif.

33

Tingginya titer antibodi hasil vaksinasi tidak menjamin perlindungan yang optimal apabila konsentrasi virus lapangan sangat tinggi atau tidak sepadan dengan titer antibodi yang terbentuk. Tantangan virus lapangan yang tinggi akan mempercepat penurunan titer antibodi dalam tubuh ayam. Hal ini disebabkan te rjadi efek netralisasi antara virus lapangan dengan titer antibodi. Monitoring titer antibodi yang dilakukan pada anak ayam seringkali

memberikan gambaran yang kurang sesuai. Saat ayam berumur kurang dari 45 hari, proses pembentukan kekebalan terutama kekebalan humoral (antibodi yang terlarut dalam darah) belum sempurna. Oleh karena itu pemeriksaan antibodi yang terlarut dalam darah dengan HI test hasilnya juga belum optimal. Pada umur tersebut ayam  juga mempunyai kekebalan jenis lain yaitu kekebalan seluler yang tidak dapat terdeteksi saat pemeriksaan HI test. Guna membuktikan vaksinasi yang telah dilakukan mampu menstimulasi pembentukan antibodi yang protektif biasanya dilakukan dengan uji tantang di kandang SPF. Selain berpedoman pada hasil uji HI, agar tindakan yang dilakukan lebih tepat perlu diketahui juga mengenai sejarah penyakit yang terjadi di farm, anamnesa peternak, gejala klinis maupun perubahan bedah bangkai (pemeriksaan patologi anatomi). Dengan demikian diharapkan tindakan yang diberikan akan mampu mengatasi kasus secara optimal, sehingga ayam dapat sembuh dan kembali berproduksi optimal.

34

PROSEDUR DIAGNOSA LABORATORIUM SEROLOGI

BAB III UJI ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (E L I S A)

DISUSUN OLEH :

drh. Teddy Tursino

LABORATORY LABORATORY DEVELOPMENT PROJECT PT. SWADESI CANDRASENTOSA JAKARTA 2010 35

PRINSIP UJI ELISA

Prinsip uji ELISA secara garis besar akan diuraikan sebagai berikut : 

Serum yang diambil dari ayam yang di vaksin IBD atau Gumboro akan mengandung Antibodi (Ab) spesifik anti-IBD virus.



Serum ini diencerkan dalam Larutan Buffer (Sample Diluent) kemudian dimasukkan ke dalam Microplate ELISA 96 sumuran dengan dasar U yang berlapis Antigen (Ag) IBD virus.



Ab spesifik IBD virus yang terdapat pada serum akan membentuk Kompleks AgAb dengan Ag yang terdapat pada microplate ELISA.



Kemudian microplate ELISA dicuci dengan Larutan Pencuci (Wash Solution) PBS – Tween 80.



Setelah microplate dicuci, maka Larutan Konjugat yaitu (Goat) Anti-Chicken: HRPO Conjugate atau Hoseradish Anti-Chicken: HRPO Conjugate ditambahkan pada tiap sumur.



Kompleks Ag-Ab akan berikatan dengan konjugat.



Setelah inkubasi singkat, konjugat yang tidak berikatan akan disingkirkan melalui pencucian.



Larutan TMB Substrat yang mengandung Chromagen (ABTS) ditambahkan pada pada tiap sumur.



Perubahan warna chromagen dari yang tidak berwarna menjdi berwarna biru kehijauan terjadi dengan adanya enzim peroksidase yang terdapat dalam larutan konjugat.



Perubahan intensitas warna yang terjadi dalam 15 menit (dibandingkan dengan kontrol) merupakan bagian yang menunjukkan jumlah Ab yang terdapat dalam serum.



Setelah substrat diinkubasikan, Larutan Penghenti (Stop Solution) ditambahkan pada tiap sumur untuk mengakhiri reaksi. re aksi.



Plate dibaca dengan panjang gelombang 450 nm selama 60 menit.

36

KOMPONEN YANG TERDAPAT DALAM UJI ELISA

Adapun komponen yang diperlukan dalam uji ELISA akan dijabarkan dibawah ini beserta gambarnya, yaitu : 1. Elisa Reader (Gambar 10). 2. Serum (Gambar 11). 3. Microplate 96 sumuran dengan dasar U ( Gambar 12). 4. Microplate ELISA yang berlapis Ag spesifik ( Gambar 13). 5. Larutan kontrol serum positif (Positive Control) ( Gambar 14). 6. Larutan kontrol serum negatif (Negative Control) ( Gambar 15). 7. Larutan konjugat, yaitu : (Goat) Anti-Chicken : HRPO Conjugate ( Gambar 16). 8. Larutan buffer (Sample Diluent) ( Gambar 17). 9. Larutan substrat (TMB Substrate) ( Gambar 18). 10. Larutan penghenti (Stop Solution) 1x ( Gambar 19). 11. Larutan pencuci (Wash Solution) atau PBS – Tween 80 1 x ( Gambar 20).

Rumus Perhitungan Vaksin ( Central Vaccination Time = CVT )

√ titer elisa – 22,36 [+ 1 hari] 2,82

Gambar 10. ELISA Reader

37

Gambar 11. Serum

Gambar 12. Microplate 96 sumuran dengan dasar U

Gambar 13. Microplate ELISA yang berlapis Ag spesifik

38

Gambar 14. Larutan kontrol serum positif (Positive Control)

Gambar 15. Larutan kontrol serum negatif (Negative Control)

Gambar 16. Larutan konjugat, yaitu : (Goat) Anti-Chicken : HRPO Conjugate

Gambar 17. Larutan buffer (Sample Diluent)

39

Gambar 18. Larutan substrat (TMB Substrate)

Gambar 19. Larutan penghenti (Stop Solution) 1x

Gambar 20. Larutan pencuci (Wash Solution) atau PBS – Tween 80 1x

KOLEKSI SAMPEL

Hal-hal yang perlu diperhatikan ketika akan mengambil sampel serum antara lain : 

Untuk monitoring flock rutin secara serologis sebaiknya diambil sekitar 30 atau lebih serum sampel per flock secara acak yang dikumpulkan selama selang waktu tertentu (misalnya setiap 4 minggu sekali). 40



Diperlukan prosedur pengambilan sampel, pengenceran serum dan penyimpanan sampel serum yang tepat agar diperoleh hasil uji yang optimal.



O

Serum sampel sebaiknya simpan pada suhu 4 C selama 4 hari. Penyimpanan O

serum pada – 20 C akan tahan untuk waktu yang lebih lama.

PERSIAPAN UJI ELISA

Persiapan uji ELISA harus melalui beberapa tahap, yaitu pengenceran sampel, menyiapkan kontrol serum positif, kontrol serum negatif, larutan konjugat, larutan pencuci, larutan substrat dan larutan penghenti. Adapun uraian secara lengkapnya akan dijabarkan sebagai berikut :

Pengenceran Sampel Berikut ini adalah tahapan yang harus dilakukan untuk mengencerkan sampel serum, yaitu : 1. Serum diencerkan dengan larutan buffer (sample diluent) pada microplate yang bersih dan tidak berlapis Ag. 2. Tambahkan 95 µl sample diluent pada tiap sumur microplate pertama yang digunakan untuk pengenceran serum yaitu kolom 1 s.d 12. Sumur A1 dan A2 digunakan untuk kontrol serum negatif (negative control). Sedangkan sumur A3 dan A4 digunakan untuk kontrol serum positif (positive control). 3. Tambahkan 240 µl sample diluent pada tiap sumur microplate kedua yang digunakan untuk pengenceran serum yaitu kolom 1 s.d 12. Sumur A1 dan A2 digunakan untuk kontrol serum negatif (negative control). Sedangkan sumur A3 dan A4 digunakan untuk kontrol serum positif (positive control). 4. Tambahkan 5 µl serum ke dalam sumur microplate pertama (sumur A5). Pengenceran dimulai dari sumur A5 s.d H 10 (bergerak dari kiri ke kanan, baris demi baris). Sumur A1 dan A2 digunakan untuk kontrol serum negatif (negative control). Sedangkan sumur A3 dan A4 digunakan untuk kontrol serum positif  (positive control). Ilustrasi pengenceran sampel serum pada microplate diperlihatkan dalam Gambar 21.

41

5. Kocok dengan cara menggoyangkan microplate pertama dan biarkan semua serum yang diencerkan dalam sample diluent menjadi seimbang selama 5 menit sebelum dipindahkan pada microplate kedua. 6. Pindahkan 10 µl serum yang telah diencerkan dari microplate pertama ke microplate kedua sesuai dengan urutannya (terjadi pengenceran 1 : 500). Biarkan semua serum yang diencerkan dalam sample diluent menjadi seimbang selama 5 menit sebelum dipindahkan pada microplate ELISA.

Menyiapkan Kontrol Serum Positif (Positive Control) Kontrol Serum Positif (Positive Control) dibuat dengan cara : 1. Larutkan 6 µl kontrol serum positif stok dengan 300 µl larutan buffer (pengenceran 1 : 50). 2. 150 µl kontrol serum positif yang dilarutkan cukup untuk 1 microplate ELISA.

Menyiapkan Kontrol Serum Negatif (Negative Control) Kontrol Serum Negatif (Negative Control) dibuat dengan cara : 1. Larutkan 6 µl kontrol serum negatif stok dengan 300 µl larutan buffer (pengenceran 1 : 50). 2. 150 µl kontrol serum positif yang dilarutkan cukup untuk 1 microplate ELISA.

Menyiapkan Larutan Konjugat (Goat) Anti-Chicken : HRPO Conjugate Larutan Konjugat Horseradish Anti-Chicken atau (Goat) Anti-Chicken : HRPO Conjugate dipersiapkan dengan cara : 1. Horseradish Anti-Chicken atau (Goat) Anti-Chicken : HRPO Conjugate dilarutkan dalam 50% Gliserol. 2. Larutkan 100 µl konjugat stok dengan 10 µl buffer buffer (pengenceran 1 : 100). 3. 10 µl konjugat yang telah diencerkan cukup untuk 1 microplate ELISA.

42

1

2

3 4

5 6

7 8 9 10 11 12

Keterangan :

A B

= Kontrol Serum Negatif  = Kontrol Serum Positif  = Serum

C D E F G H

Gambar 21. Ilustrasi Pengenceran Sampel Serum pada Microplate

Menyiapkan Larutan Pencuci (Wash Solution) PBS – Tween 80 1 x Larutan Pencuci (Wash Solution) PBS – Tween 80 1x dipersiapkan dengan cara sebagai berikut : 1. Perbandingan antara PBS dan Tween 80, yaitu 1 liter PBS : 1 ml Tween 80. 2. Larutkan 20 ml larutan pencuci pekat dengan 380 ml aquadest (terjadi pengenceran 1 : 20). 3. 400 ml larutan pencuci yang telah diencerkan cukup untuk 1 microplate ELISA.

Menyiapkan Larutan Substrat (TMB Substrate) Larutan Substrat (TMB Substrate) dipersiapkan dengan cara : 1. Larutan substrat (TMB Substrate) yang ada siap untuk digunakan. 2. Satu microplate ELISA memerlukan sekitar 10 ml larutan substrat untuk hasil optimal. O

3. Larutan substrat harus diseimbangkan dulu pada suhu kamar 22-25 C sebelum digunakan.

Menyiapkan Larutan Penghenti (Stop Solution) 1 x Larutan Penghenti (Stop Solution) 1x dibuat dengan cara : 1. Larutkan 2,5 ml larutan stop pekat dengan 10 ml aquadest (pengenceran 1 : 5). 2. 12,5 ml larutan stop diperlukan untuk 1 microplate ELISA.

43

3. Penyimpanan larutan penghenti (stop) pekat 5 x pada suhu 4

O

C dapat

menyebabkan terbentuknya bekuan putih. Hal ini tidak mempengaruhi hasil uji ELISA. Diamkan larutan penghenti (stop) pekat 5 x pada suhu kamar 22-25

O

C

O

atau panaskan pada 37 C beberapa saat sebelum digunakan.

PROSEDUR KERJA UJI ELISA

Adapun prosedur kerja uji ELISA yang akan dijabarkan dibawah ini meliputi persiapan microplate, prosedur pencucian, penambahan Larutan Substrat, Konjugat dan Penghenti serta penggunaan ELISA Reader untuk membaca hasil.

Menyiapkan Plate Untuk Uji ELISA Berikut ini adalah tahapan yang harus dilakukan untuk menggunakan microplate ELISA yang sudah berlapis antigen, yaitu : 1. Keluarkan microplate ELISA yang berlapis Ag dari kantong pelindung dan beri label menurut identifikasi pengenceran microplate. Apabila tidak tersedia microplate ELISA yang berlapis Ag, maka buatlah coating antigen menggunakan microplate kosong dan Ag. Berikut ini tahapan-tahapan yang harus dilakukan untuk membuat microplate ELISA (proses coating antigen) : a) Hitung konsentrasi Ag terlarut. b) Buat pengenceran 1:25, 1:50 dan 1:100. c) Pelarut yang digunakan adalah sample diluent. d) Untuk proses coating, masukkan 100 µl Ag ke dalam sumur 1 s.d 12. Sumur A1 dan A2 digunakan untuk kontrol serum negatif (negative control). Sedangkan sumur A3 dan A4 digunakan untuk kontrol serum positif (positive control). Buat kontrol serum positif (sumur A3 dan A4) dengan dengan PBS. o

e) Inkubasi pada suhu 4 C selama semalam (24 jam). 2. Tambahkan 100 µl kontrol serum negatif (negative control) pada sumur A1 dan A2. Buang bekas tip. 3. Tambahkan 100 µl kontrol serum positif (positive control) pada sumur A3 dan A4. Buang bekas tip.

44

4. Pindahkan 100 µl sampel serum yang telah diencerkan dari microplate kedua ke microplate ELISA sesuai dengan urutannya. Pemindahan sampel ke microplate ELISA harus dilakukan secepat mungkin. O

5. Inkubasikan microplate ELISA selama 30 menit pada suhu kamar 22-25 C.

Prosedur Pencucian Adapun prosedur pencucian harus melalui tahapan-tahapan sebagai berikut, yaitu : 1. Buang semua cairan yang ada dari tiap sumur microplate ELISA dan ketukketukkan microplate pada tisue untuk membuang sisanya. 2. Dengan micropipet multichannel, isi tiap lubang sumur microplate ELISA dengan 150 µl larutan pencuci (PBS – Tween 80). 3. Biarkkan terendam selama 3 menit, lalu buang semua cairan dari tiap sumur microplate microplate ELISA dan ketuk-ketukkan microplate ELISA pada tisue untuk membuang sisanya. 4. Lakukan hal yang sama hingga 3 kali lagi pencucian.

Penambahan Larutan Konjugat, Substrat Dan Penghenti (Stop) Penambahan Larutan Konjugat, Susbtrat dan Penghenti dilakukan melalui tahapan-tahapan sebagai berikut, yaitu : 1. Dengan micropipet multichannel, isi tiap lubang sumur microplate ELISA dengan 100 µl larutan konjugat (Goat) Anti-Chicken: HRPO Conjugate. Buang bekas tip. O

2. Inkubasikan selama 30 menit pada suhu kamar 22-25 C. 3. Ulangi prosedur pencucian. 4. Dengan micropipet multichannel, isi tiap lubang sumur microplate ELISA dengan 100 µl larutan substrat (TMB substrate). Buang bekas tip. O

5. Inkubasikan selama 15 menit pada suhu kamar 22-25 C. 6. Dengan micropipet multichannel, tambahkan tiap lubang sumur microplate ELISA dengan 100 µl larutan penghenti (stop solution). Buang bekas tip. 7. Tiup gelembung yang ada sebelum pembacaan microplate ELISA pada ELISA Reader.

45

MENGGUNAKAN ELISA READER TIPE DNX – 9062 PRODUKSI PROTENY MEDICAL EQUIPMENT NANJING CHINA

Berikut ini adalah prosedur yang harus dilakukan untuk menggunakan ELISA reader tipe DNX – 9062 produksi Poteny Medical Equipment Nanjing China, yaitu : 1) Hubungkan kabel power supply dengan stop kontak, kemudian tekan tombol ON-OFF. 2) Hangatkan mesin selama 30 menit sebelum memulai mendeteksi. 3) Akan muncul di layar tampilan program Menu, yang antara lain berisi mode Detect, Program, Inquiry, Set, Time dan Finish. 4) Ambil pilihan Set, tekan tombol enter. 5) Akan muncul di layar tampilan System Setting, yang antara lain berisi mode Time Setting, Wave lenght Setting dan Back. 6) Ambil pilihan Time Setting, tekan tombol enter. Ketika ada beberapa kesalahan dengan tanggal atau waktu yang ditampilkan di layar, anda dapat memilih fungsi ini dan masukkan tanggal dan waktu pada menu subordinat dan tekan Save pada panel. Setelah itu, alat akan akan kembali ke Menu Superior secara otomatis. 7) Ambil pilihan Wavelenght Setting, tekan tombol enter. 8) Masukkan data panjang gelombang (nm) yaitu 405 nm, 450 nm, 492 nm atau 630 nm. Ambil pilihan 450 nm. 9) Kembali ke menu awal dengan menekan tombol Reset pada panel depan. 10) Ambil pilihan Program, tekan tombol enter. 11) Akan muncul di layar tampilan Program, yang antara lain berisi mode Item Name, No, Next dan Back. 12) Ambil pilihan Item Name, tekan tombol enter. Tekan tombol angka pada panel untuk memasukkan nama item (IBD, EVE), tekan e nter. 13) Kemudian kursor akan ke No. yang berarti be rarti Nomor Item. Masukkan nomor item (01 s.d 30), kursor akan ke Next. 14) Tekan enter lagi ketika kursor di Next. Dan kemudian akan menuju ke menu subordinat (menu selanjutnya).

46

15) Masuk ke menu selanjutnya, yaitu Panjang Gelombang (Wave Modes). Masukkan panjang gelombang 450 nm. 16) Akan muncul di layar tampilan Wave Modes, yang antara lain berisi mode Single, Dual, Next dan Back. 17) Ambil pilihan Single, tekan tombol enter. Masukkan panjang gelombang 450 nm dan kursor akan ke Next secara otomatis. Jika nilai yang didefault adalah konsisten dengan spesifikasi reagen, anda dapat menekan enter secara langsung dan masuk ke menu subordinat. Apabila alat menolak panjang gelombang yang dimasukkan, silahkan kembali ke menu utama untuk mengulang panjang gelombang dan kemudian program ulang. 18) Masuk ke menu selanjutnya, yaitu Detection Mode. 19) Akan muncul di layar tampilan Detection Mode, yang antara lain berisi mode Absorbancy, Cutt Off, Con, Next dan Back. 20) Ambil pilihan Absorbancy, tekan tombol enter. Model default dari deteksi adalah deteksi absorbansi. Jika anda hanya ingin untuk mendapatkan absorbansi dari sampel tanpa analisis lainnya dan kalkulasi, maka anda dapat memilih model ini. Tekan enter dan masuk masuk ke menu subordinat. 21) Masuk ke menu selanjurnya, yaitu Shaking Mode. 22) Akan muncul di layar tampilan Shaking Mode, yang antara lain berisi pilihan No, Slow, Fast, Next dan Back. 23) Ambil pilihan Slow, tekan tombol Enter dan secara langsung dan masuk ke menu subordinat. 24) Masuk ke menu selanjutnya yaitu Pengaturan Sumuran. Akan ada tampilan B Well, Finish dan Back. Jika anda ingin memasukkan sumuran kosong, maka masukkan simbol dari sumuran kosong (1~2) pada B Well. Ambil pilihan Finish, tekan tombol Enter. 25) Akan ada tampilan Penyelesaian Program (Program Completed). Ketika layar menampilkan menu diatas, diatas, itu berarti program telah selesai. Pastikan untuk menekan Save pada panel untuk menyimpan informasi program masuk ke alat untuk penggunaan selanjutnya. Setelah anda menekan Save maka alat akan kembali ke menu utama secara otomatis.

47

26) Untuk mulai mendeteksi nyalakan alat dan ia akan mulai auto checking terlebih dahulu.

Apabila auto checking selesai, maka maka akan tampil menu menu

utama. Pada waktu itu, anda tidak dapat mendeteksi dengan segera. Tunggulah 20 menit untuk pemanasan mesin sebelum mulai untuk deteksi. 27) Ketika anda mulai untuk mendeteksi, silahkan tekan angka 1 pada p anel untuk memilih fungsi Detect. Layar akan muncul muncul daftar program pendeteksian atau Detection Mode. Tekan tombol enter untuk menemukan nomor program yang diperlukan dan kemudian tekan tombol yang sesuai pada panel. 28) Ambil pilihan program nomor 2 atau tombol Start, kemudian tekan tombol Enter. 29) Setelah pendeteksian dimulai, di layar akan muncul tampilan Checking. 30) Ketika pendeteksian selesai, di layar akan muncul tampilan Calculating dan itu akan muncul absorbansi dari masing-masing sumuran pertama setelah kalkulasi selesai. 31) Jika anda menginginkan untuk mencetak absorbansi tekan Print pada panel atau jika tidak tekan Enter maka layar akan muncul hasil deteksi. 32) Jika hasil pendeteksian perlu untuk disimpan tekan Save pada panel (hasil tidak tersimpan jika tidak menekan tombol Save). 33) Jika ingin mencetaknya, tekan tekan Print pada panel (itu akan mencetak mencetak hasil yang ditampilkan pada layar). layar). Alat akan menghubungkan data ke ke printer jika telah menekan Enter. 34) Sambungkan kabel data ketika ingin menyambungnya ke PC dan biarkan PC menunggu. Ketika deteksi absorbansi muncul tekan F1 (tombol komunikasi) pada panel. 35) Gambar dan Ilustrasi tampilan ELISA Reader DNX – 9062 diperlihatkan pada

Gambar 10 dan Lampiran 6.

PEMROSESAN DATA

Data yang sudah diperoleh melalui ELISA Reader kemudian diolah dengan tahapan-tahapan sebagai berikut, antara lain :

48

1. Hitung rata-rata absorbani (Optical Density = OD) Kontrol Serum Negatif (NCx) dengan nilai absorbansi dari sumur A1 dan A2. 2. Hitung juga rata-rata absorbani Kontrol Serum Positif (PCx) dengan nilai yang didapat dari sumur A3 dan A4. 3. Catat kedua rata-ratanya. 4. Hitung nilai Koreksi Kontrol Positif  dengan mengurangi nilai dari rata-rata absorbansi kontrol serum negatif dengan nilai dari rata-rata absorbansi kontrol serum positif. 5. Catat hasil nilai Koreksi Kontrol Positif.

Rumus : Koreksi Kontrol Kontrol Positif = PCx – NCx

6. Hitung nilai Sampel Positif (S/P Ratio) dengan mengurangi Absorbansi Sampel

Serum (Raw OD) dengan rata-rata absorbani kontrol serum negatif. Kemudian hasilnya dibagi dengan koreksi kontrol positif. po sitif.

Rumus : S/P Ratio = (Raw OD – NCx) NCx) : Koreksi Kontrol Positif 

Titer ELISA dapat dinyatakan dengan rumus sebagai berikut :

Titer Log10 = (1,09 x Log10 S/P Ratio) + 3,36 Titer = Antilog dari Titer Log10

Ilustrasi tahapan pemrosesan data diperlihatkan pada Lampiran 7.

INTERPRETASI HASIL

Hasil titer ELISA yang valid didapatkan apabila hasil tersebut memenuhi beberapa persyaratan sebagai berikut, yaitu : 

NCx < 0,250.



0,250 < PCx < 0,900.



Apabila S/P Ratio < 0,150 , maka nilai titer = 0. Artinya sampel sampel negatif antibodi. antibodi. 49

Nilai yang disarankan antara lain : 

0,080 < NCx < 0,150 dan 0,400 < PCx < 0,850.



Kondisi optimal adalah pada suhu kamar 22-25 C. Suhu yang lebih tinggi akan

O

menghasilkan nilai OD yang lebih tinggi.

Titer nilai ELISA diperoleh dari perbandingan kadar antibodi yang terdapat dalam tiap serum, kontrol serum negatif dan kontrol serum positif. Oleh sebab itu penting untuk kontrol serum negatif dan kontrol serum positif berada dalam kisaran yang valid. Titer ELISA sama dengan 0 menunjukkan sampel serum yang terdiri dari antibodi yang sangat rendah (insignifikan) jika dibandingkan dengan kontrol serum negatif dan kontrol serum positif. Titer ELISA diatas 0 menunjukkan bahwa sampel serum terdiri dari antibodi yang signifikan dan terdeteksi dibandingkan dengan kontrol serum negatif dan kontrol serum positif. Namun titer ini tidak dapar memastikan perlindungan maupun pembedaan serologis diantara respon vaksin atau infeksi lapangan. Pemberian vaksin yang optimal dan target titer protektif flock harus ditentukan oleh pemakai ELISA kit dengan membandingkan hasil flock  pre dan  post  vaksinasi, contohnya : Coefficient Variation (% CV) dan Geometric Mean Titer (GMT) dengan parameter performans flock, contohnya: morbiditas, mortalitas, BB per flock dan keseragaman.

50

PENUTUP

Ketepatan diagnosa yang dilakukan oleh seorang dokter hewan harus didukung oleh peneguhan diagnosa, yang salah satunya diperoleh melalui analisa laboratorium serologis. Akurasi hasil diagnosa laboratorium serologi terdapat pada ada atau tidaknya Standard Operational Procedure (SOP) atau Standar Operasional Baku. Namun perlu disadari bahwa peneguhan diagnosa melalui laboratorium serologi tidak dapat berdiri sendiri. Ia harus didukung pula oleh sejarah penyakit yang terjadi di farm, anamnesa peternak, gejala klinis maupun perubahan bedah bangkai yang diperoleh melalui pemeriksaan patologi anatomi. Dengan

mengkombinasikan

hasil

yang

diperoleh

melalui

diagnosa

laboratorium serologi dengan pemahaman mengenai interpretasi hasil tersebut, serta faktor peneguhan diagnosa lainnya, maka diharapkan tindakan yang akan dilakukan oleh seorang dokter hewan akan mampu mengatasi kasus yang terdapat di peternakan, sehingga ayam dapat sembuh dari penyakit serta dapat berproduksi secara optimal. Demikianlah sedikit informasi yang dapat kami sajikan melalui diktat

Prosedur Diagnosa Laboratorium Serologis yang sederhana ini. Semoga bermanfaat untuk menambah pengetahuan maupun keahlian bagi para pembaca yang berkecimpung dalam dunia peternakan.

51

DAFTAR PUSTAKA

Alexander, D.J dan Jones, R.C. 2001. Poultry Diseases, 5th Edition. WB Sanders, USA.

Alexander, D.J dan Jones, R.C. 2003. Diseases of Poultry, 11th Edition. Iowa State Press, USA.

Allan, W.H., J.E. Lancaster, et al . (1978). Newcastle Disease Vaccines Their Production and Use. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome.

[Anonim]. 2006. Info Medion Online. http://info.medion.co.id. [8 Maret 2010] .

[Anonim]. 2008. Procedures for Avian Vaccines. http://pharmacos.eudra.org. [8 Maret 2010]. Council Of Europe. 1997. European Pharmacopoeia, Third Edition. Editions Of The Council Of Europe, Strasbourg, France.

Mowat, N. dan M. Rweyemamu. 1997. Vaccine Manual : The Production And Quality Control Of Veterinary Vaccines For Use In Developing Countries. FAO Animal Production and Health Series No 35. Rome, Food and Agriculture Organization of the United Nations.

Office International Des Epizooties (OIE). 2008. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. http://www.oie.int. [8 Maret 2010].

52

Lampiran 1. Interpretasi Hasil Titrasi HI.

GMT GMT (geometric mean titer ) merupakan nilai rataan titer. Kemampuan titer antibodi dalam menetralisir infeksi akan optimal jika titernya protektif. Titer protektif  adalah batas minimal jumlah antibodi dalam tubuh yang masih mampu melindungi terhadap virus tertentu. Standar Titer Protektif antibodi tergantung dari jenis virus. Dibawah ini adalah Standar Titer Protektif antibodi menurut OIE terhadap beberapa virus tertentu, antara lain : 5



ND ≥ 32 ( 2 ).



IB ≥ 64 ( 2 ).



EDS ≥ 32 ( 2 ).



AI ≥ 64 ( 2 ).

6

5

6

% CV % CV ( coefficient of variation ) atau koefisien variasi merupakan tingkat keseragaman yang dapat menggambarkan variasi respon vaksinasi dan mengukur efektivitas suatu vaksinasi. % CV yang baik memiliki nilai < 35 %. % CV disebut juga titer uniformity .

HASIL TITER Beberapa kemungkinan hasil titer HI berdasarkan GMT dan % CV beserta interpretasinya, antara lain :

GMT rendah dibawah standat titer protektif dan CV jelek (% CV > 35). Artinya kemungkinan : 1. Ayam tersebut mengalami kondisi immunosupresif. 2. Pengaruh maternal antibody . Saat ayam berumur < 45 hari, proses pembentukan kekebalan terutama kekebalan humoral (antibodi yang terlarut dalam darah) belum sempurna. Oleh karena itu pemeriksaan antibodi yang terlarut dalam darah dengan HI test hasilnya juga belum optimal. Pada umur tersebut, ayam

53

 juga mempunyai kekebalan jenis lain yaitu kekebalan seluler ( maternal antibody ) yang tidak dapat terdeteksi saat pemeriksaan HI test.

GMT berada pada standar protektif, namun titer individual menunjukkan ada titer yang rendah dan tinggi dengan % CV yang jelek (% CV > 35). Artinya kemungkinan : 1. Ayam tersebut sedang mengalami fase awal infeksi. 2. Aplikasi, program dan kualitas vaksin yang diberikan kurang tepat sehingga dosis vaksin yang diterima masing-masing individual ayam tidak seragam. 3. Flock tersebut memiliki tingkat keseragaman bobot badan yang rendah (< 80%) sehingga

sehingga

masing-masing

individual

ayam

memberikan

respon

pembentukan antibodi yang tidak seragam.

GMT berada pada standar protektif, namun titer individual menunjukkan sebagian besar ayam memiliki titer titer yang tinggi dengan % CV yang jelek (% CV > 35). Artinya kemungkinan : 1. Ayam tersebut sedang mengalami Infeksi virus lapangan jika vaksinasi terakhir dengan vaksin live > 2 bulan dan vaksin killed > 5 bulan. 2. Ayam tersebut mengalami infeksi laten atau infeksi kronis. Ayam yang sembuh dari infeksi virus ND, AI dan IB akan berperan sebagai carrier atau pembawa. 3. Aplikasi, program dan kualitas vaksin yang diberikan kurang tepat sehingga dosis vaksin yang diterima masing-masing individual ayam tidak seragam. 4. Flock tersebut memiliki tingkat keseragaman bobot badan yang rendah (< 80%) sehingga

sehingga

masing-masing

individual

ayam

memberikan

respon

pembentukan antibodi yang tidak seragam.

GMT berada pada standar protektif, namun titer individual menunjukkan sebagian besar ayam memiliki titer titer yang tinggi dengan % CV yang baik (% CV < 35). Artinya kemungkinan : 1. Ayam tersebut sedang mengalami fase akhir infeksi atau proses penyembuhan.

54

2. Kondisi yang normal setelah vaksinasi. Respon vaksinasi yang bagus jika sampel serum dikoleksi pada 2-3 minggu post vaksinasi untuk vaksin live atau 3-4 minggu post vaksinasi untuk vaksin killed.

GMT rendah dibawah standat titer protektif namun dengan CV yang baik (% CV < 35). Artinya kemungkinan : 1. Ayam tersebut belum di revaksinasi atau vaksinasi ulang atau ayam tersebut belum diberikan vaksin killed .

Lampiran 2. Contoh Laporan Hasil Titrasi HI

Hasil Titrasi ND Umur (mgg)

Jumlah Sampel

No

Kandang

1

H1(11)

11

2

H1(12)

3

Titrasi log 2 0

1

2

3

4

5

6

Mean

St.dev

%CV

2

6.55

2.11

32.31

2

6.67

2.12

31.82

2

6.60

2.51

38.03

Mean

St.dev

%CV

7

8

9

4

2

3

9

3

2

2

A1

5

2

1

TOTAL

25

10

11

Hasil Titrasi AI Umur (mgg)

Jumlah Sampel

Titrasi log 2

No

Kandang

1

H1(11)

11

2

H1(12)

7

1

2

2

3

A1

5

1

2

1

1

TOTAL

23

7

8

9

10

11

1

2 5

2 1

7

0

1

2

3

4

5

6

7

2

3

1

8

9

10

11

2

3

9.22

3.03

32.90

2

7.71

2.06

26.69

5.00

2.38

47.61

Mean

St.dev

%CV

6

10.10

1.60

15.79

5

10.50

0.53

5.02

5

3

10.10

0.74

7.31

1

4

4

10.10

0.99

9.85

8

9

10

11

Mean

St.dev

%CV

1

2

1

1

6.67

2.24

33.54

1

6.29

1.60

25.51

6.00

1.73

28.87

Hasil Titrasi IB Umur (mgg)

Jumlah Sampel

No

Kandang

1

H1B

10

2

H2B

10

3

H3A

10

4

H3B

Titrasi log 2 0

1

2

3

4

5

6 1

10

TOTAL

40

Hasil Titrasi EDS No

Kandang

1

H1

2

H1

3

A1

TOTAL

Umur (mgg)

Jumlah Sampel

Titrasi log 2 0

1

2

3

4

5

9

2

2

7

2

4

3

1

2

19

55

6

Lampiran 3. Pembuatan NaCl fisiologis (NaCl 0,85%).

Fungsi dari NaCl fisiologis (NaCl 0,85%) adalah sebagai pelarut untuk pengenceran virus, serum atau RBC. Alat dan bahan yang diperlukan untuk pembuatan NaCl fisiologis, antara lain : 

NaCl kristal sebanyak 0,85 gram.



Aquadest sebanyak 100 ml.



Timbangan.



Botol 100 ml.

Prosedur kerja : 1. Timbang NaCl sebanyak 0,85 g. 2. Siapkan aquadest dalam botol sebanyak 100 ml. 3. Campurkan NaCl dengan aquadest dalam botol kemudian homogenkan. 4. Sterilisasi larutan NaCl fisiologis (NaCl 0,85%) dalam autoklaf selama 15 menit o

pada temperatur 121 C.

Lampiran 4. Pembuatan Larutan PBS.

Fungsi dari larutan PBS adalah sebagai bahan pengencer dalam berbagai uji serologi. Adapun alat dan bahan yang diperlukan untuk pembuatan larutan PBS, antara lain : 

NaCl sebanyak 0,8 gram.



KCl sebanyak 0,02 gram.



Na2PO4 sebanyak 0,116 gram ≈ 0,12 gram.



KH2PO4 sebanyak 0,026 gram ≈ 0,03 gram.



Aquadest sebanyak 100 ml.



Timbangan.



Botol 100 ml.

Prosedur kerja :

1. Timbang bahan-bahan yang akan digunakan, yaitu : NaCl 0,8 g, KCl 0,02 g, Na 2PO4 4

0,12g dan KH2PO 0,03 g, lalu masukkan dalam botol.

2. Siapkan aquadest dalam botol sebanyak 100 ml. 56

3. Campurkan bahan-bahan tersebut dengan aquadest 100 ml kemudian homogenkan sampai bahan-bahan tersebut larut.

4. Sterilisasi larutan PBS dalam dalam autoklaf selama 15 menit pada temperatur 121°C.

Lampiran 5. Pembuatan Larutan Natrium Sitrat 4%.

Larutan Natrium Sitrat 4% berfungsi sebagai antikoagulan RBC. Alat dan bahan yang diperlukan untuk pembuatan larutan Natrium Sitrat 4%, antara lain : 

Na Sitrat Serbuk sebanyak 1 gram.



Aquadest sebanyak 25 ml.



Botol 25 ml.



Timbangan.

Prosedur kerja : 1. Timbang Natrium Sitrat Serbuk sebanyak 1 g. 2. Siapkan aquadest dalam botol sebanyak 25 ml. 3. Campurkan Natrium Sitrat dengan aquadest dalam botol, lalu homogenkan sampai Na Sitrat larut. 4. Botol ditutup dengan alumunium foil dan disimpan pada temperatur kamar (25°C).

Lampiran 6. Pembuatan Larutan Alsever’s.

Larutan Alsever’s berfungsi sebagai antikoagulan RBC. Alat dan bahan yang diperlukan untuk pembuatan larutan Alsever’s, antara lain : 

Dextrose (C6H12O6) sebanyak 20 gram.



Sodium citrat (Trinatrium Citrat 2 Hidrat atau atau C 6H5Na3O7-2H2O) sebanyak 8,0 gram.



Citrid Acid (Citroum Saure-Hydrat) sebanyak 0,55 gram.



Natrium Chlorida (NaCl) sebanyak 4,20 gram.



Aquadest sebanyak 1000 ml atau 1 liter.



Botol 1 liter. 57



Timbangan. Prosedur kerja :

1. Timbang bahan-bahan yang akan digunakan, yaitu : C 6H12O6 20 g, C6H5Na3O72H2O 8,0 g, asam sitrat 0,55 g dan NaCl 4,20 g.

2. Siapkan aquadest dalam botol sebanyak 1 liter. 3. Campurkan bahan-bahan tersebut dengan aquadest 100 ml kemudian homogenkan sampai bahan-bahan tersebut larut.

4. Sterilisasi larutan Alsever’s dalam dalam autoklaf selama 15 menit pada temperatur 121°C.

Lampiran 7. Pembuatan Larutan Alkohol 70%.

Larutan alkohol 70% berfungsi sebagai cairan desinfektan. Alat dan bahan yang diperlukan untuk pembuatan larutan alkohol 70%, antara lain : 

Alkohol 96%.



Aquadest.



Botol.



Gelas ukur.

Prosedur kerja :

1. Takar 140 ml alkohol 96% dengan gelas ukur. 2. Siapkan aquadest sebanyak 52 ml. 3. Campurkan 140 ml alkohol 96% dengan 52 ml aquadest dalam botol, kemudian homogenkan.

4. Simpan alkohol 70% pada temperatur kamar (25°C).

58

Lampiran 8. Ilustrasi Tampilan ELISA Reader DNX – 9062.

a. Panel Depan.

1

01

2

02

3

03

4

04

5

7

07

8

08

9

09

0

10

.

A

13

B

14

C

15

D

16

E

G

19

H

20

I

21

P

22

T

25

V

26

M

27

g

28

R

→

F1 b. Tampilan Menu. 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Detect Program Inquiry Set Time Finish

XX-XX-XX

c. Tampilan System Setting.

SYSTEM SETTING 1. 2. 3.

Time Setting Wavelength Setting Back 

d. Tampilan Program. PROGRAM 1. 2. 3. 4.

Item Name : No. : Next Back 

59

05 11 17 23

29

6

06

,

12

F

18

Save

S

24

Reset

↓

30

Enter

F2

Print Delete

F3

e. Tampilan Panjang Gelombang (Wave Modes). WAVE MODES 1. single 2. dual 3. Next 4. Back 

nm ,

nm

f. Tampilan Detection Mode. DETECTION MODE 1. 2. 3. 4. 5.

Absorbansi Cut-off  Con. Next Back 

g. Tampilan Shaking Mode. 1. 2. 3. 4. 5.

No Slow Fast Next Back 

h. Tampilan Pengaturan Sumuran. 1. 2. 3.

B Well : Finish Back 

i. Tampilan Penyelesaian Program (Program Completed).

Program completed, Please save,

 j. Tampilan Detect. DETECTION Name : B Well : S Well: Q Well: Use : 1. Stop at col.

Plate No.: Wave :

2. Start

3. Back 

60

Lampiran 9. Ilustrasi Tahapan Pemrosesan Data. a. Menghitung Nilai Rata-Rata Absorbansi Kontrol Serum Negatif (NCx) dan Kontrol Serum Positif (PCx). Dilution= 1:500 No

Control

O.D

A01

Negative (NCx)

0.087

A02

Negative (NCx)

0.072

A03

Positif (PCx)

0.220

A04

Positif (PCx)

0.221

TETAPAN

1.09

TETAPAN

3.36

Me an Mean 0.0795 0.2205

b. Menghitung Nilai Koreksi Kontrol Positif (PCx – NCx). No

RAW O.D

PCx-NCx

Kontrol(-)

0.087

0.141

0.072

0.141

0.220

0.141

0.221

0.141

1

0.801

0.141

2

0.242

0.141

3

0.430

0.141

4

0.647

0.141

5

0.626

0.141

6

0.310

0.141

7

0.589

0.141

8

0.304

0.141

9

0.518

0.141

10

0.317

0.141

Kontrol(+)

c. Menghitung Sampel Positif (S/P Ratio).

Rumus : S/P Ratio = (Raw OD) atau sample mean – NCx : Koreksi Kontrol Positif 

No

RAW O.D

Kontrol(-) Kontrol(+)

Sample mean -NCX

PCx-NCx

S/P Ratio

0.087

0.008

0.141

0.053191489

0.072

-0.007

0.141

-0.053191489

0.220

0.141

0.141

0.996453901

0.221

0.142

0.141

1.003546099

1

0.801

0.722

0.141

5.117021277

2

0.242

0.163

0.141

1.15248227

61

3

0.430

0.351

0.141

2.485815603

4

0.647

0.568

0.141

4.024822695

5

0.626

0.547

0.141

3.875886525

6

0.310

0.231

0.141

1.634751773

7

0.589

0.510

0.141

3.613475177

8

0.304

0.225

0.141

1.592198582

9

0.518

0.439

0.141

3.109929078

10

0.317

0.238

0.141

1.684397163

d. Menghitung Titer ELISA. Log 10 S/P

1.09*(Log 10 S/P)

Log 10 titre

TITER

-1.274157849

-1.388832056

1.971167944

93.6

#NUM!

#NUM!

#NUM!

#NUM!

-0.001542788

-0.001681639

3.358318361

2282.0

0.001537327

0.001675687

3.361675687

2299.7 

0.709017223

0.772828773

4.132828773

13577.8

4.132828773

0.061634253

0.067181335

3.427181335

2674.1

3.427181335

0.39546891

0.431061112

3.791061112

6181.0

3.791061112

0.604746753

0.659173961

4.019173961

10451.4

4.019173961

0.588371054

0.641324448

4.001324448

10030.5

4.001324448

0.213451817

0.232662481

3.592662481

3914.4

3.592662481

0.557925076

0.608138332

3.968138332

9292.6

3.968138332

0.201997233

0.220176984

3.580176984

3803.4

3.580176984

0.492750485

0.537098029

3.897098029

7890.4

3.897098029

0.226444501

0.246824506

3.606824506

4044.1

3.606824506

3.80164700 Mean titer

7186.0

GMT

6333.5

St dev

3434.044887

Jumlah Sampel

Mean

Variance (s^2)

St dev

%CV

10

7186.0

11792664.3

3434.044887

47.78811117

Rumus :

Titer Log10 = (1,09 x Log10 S/P Ratio) + 3,36 Titer = Antilog dari Titer Log10 Mean Titer = nilai rata-rata Titer Geometric Mean Titer (GMT) = Antilog dari nilai rata-rata Titer Log10 10 Standar Deviasi = standar deviasi dari total nilai Titer Coefficient Variation (% CV) = (Standar Deviasi : Mean Titer) x 100

62

e. Membuat Grafik Titer Maternal Antibody.

Titre range

No. sample

Frequency (%)

0 – 329

0

0

329 – 455

0

0

455 – 1000

0

0

1000 – 2000

0

0

2000 – 3000

1

10

3000 – 4000

2

20

4000 – 5000

1

10

5000 – 6000

0

0

6000 – 8000

2

20

8000 – 10000

1

10

≥ 10000

3

30

Maternal Antibody Titre Frequency (%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0    9    2    3   –    0

Negatif

   5    5    4   –    9    2    3

Sus

   0    0    0    1   –    5    5    4

1

   0    0    0    2   –

   0    0    0    3   –

   0    0    0    4   –

   0    0    0    5   –

   0    0    0    6   –

   0    0    0    8   –

   0    0    0    1

   0    0    0    2

   0    0    0    3

   0    0    0    4

   0    0    0    5

   0    0    0    6

2

3

6

7

Titre Group 4 5

63

   0    0    0    0    1   –

   0    0    0    0    1    ≥

   0    0    0    8

8

9

Lampiran 10. Perhitungan Pengenceran Antigen Titrasi HA 4 HAU.

211 → 29 = 512

28 → 26 = 64

1000 μl antigen = 511

ml pelarut

1000 μl

ml pelarut

500 μl

250 μl antigen = 127,75

ml pelarut

250 μl antigen = 15,75

ml pelarut

100 μl

antigen = 51,1

ml pelarut

100 μl

ml pelarut

50 μl

antigen = 25,55

ml pelarut

50 μl

antigen = 3,15

ml pelarut

25 μl

antigen = 12,775

ml pelarut

25 μl

antigen = 1,575

ml pelarut

12,5 μl

antigen = 6,3875

ml pelarut

12,5 μl

antigen = 0,7875

ml pelarut

500 μl

antigen = 255,5

210 → 28 = 256 1000 μl

antigen = 63

ml pelarut

antigen = 31,5

ml pelarut

antigen =

6,3

27 → 25 = 32

antigen = 255

ml pelarut

1000 μl

antigen = 31

ml pelarut

antigen =

127,5

ml pelarut

500 μl

antigen = 15,5

ml pelarut

250 μl antigen =

63,75

ml pelarut

250 μl

antigen = 7,75

ml pelarut

antigen = 25,5

ml pelarut

100 μl

antigen =

ml pelarut

50 μl

antigen =

12,75

ml pelarut

50 μl

antigen = 1,55

ml pelarut

25 μl

antigen =

6,375

ml pelarut

25 μl

antigen = 0,775

ml pelarut

500 μl

100 μl

12,5 μl

antigen = 3,1875

ml pelarut

29 → 27 = 128

26 → 24 = 16

1000 μl

antigen = 127

ml pelarut

1000 μl

500 μl

antigen = 63,5

ml pelarut

250 μl antigen =

3,1

31,75

antigen = 15

ml pelarut

500 μl

antigen =

ml pelarut

ml pelarut

250 μl

antigen = 3,75

ml pelarut

7,5

100 μl

antigen = 12,7

ml pelarut

100 μl

antigen =

1,5

ml pelarut

50 μl

antigen = 6,35

ml pelarut

50 μl

antigen =

0,75

ml pelarut

25 μl

antigen =

ml pelarut

12,5 μl

3,175

antigen = 1,5875

ml pelarut

25 → 23 = 8 1000 μl antigen 500 μl

64

antigen

= 7

ml pelarut

=

ml pelarut

3,5

250 μl antigen

= 1,75

ml pelarut

100 μl

=

ml pelarut

antigen

0,7

drh. TEDDY TURSINO

LABORATORY DEVELOPMENT PROJECT

PT. SWADESI CANDRASENTOSA

2010 65