praktikum hemija

Hemija sa stehiometrijom Laboratorijske vježbe

Student: ______________________

Hemija sa stehiometrijom

laboratorijske vježbe

Sadržaj vježbi 1. 2. 3 4 5 6 7 8 9.

Identifikacija organskih spojeva-reakcije na funkcionalne grupe............. Kvalitativno određivanje ugljikohidrata................................................... Polisaharidi............................................................................................... Kvantitativno određivanje glukoze polarimetrijskom metodom.............. Kvalitativno određivanje lipida................................................................. Određivanje saponifikacionog broja......................................................... Kvalitativno određivanje proteina............................................................. Hidroliza i hromatografija proteina (hromatografija na tankom sloju)..... Enzimi. Određivanje aktivnosti α-amilaze...............................................

3 19 26 30 35 41 44 51 55

2



Vježba 1 IDENTIFIKACIJA ORGANSKIH SPOJEVA TEORIJSKE OSNOVE EKSPERIMENTA Postoji fundamentalna razlika između kvalitativne analize anorganskih materijala i identifikacije organskih supstanci. Anorganski spojevi su uglavnom ionski i pošto je broj mogućih različitih ionskih čestica relativno ograničen, moguće je postaviti jedan niz shema na osnovu kojih se može postići kompletna analiza. S druge strane, organski spojevi su u biti kovalentni i kao posljedica toga, svaki od izuzetno velikog broja* poznatih spojeva je jedinstven i ne može se postaviti neka čvrsta shema koja je primjenljiva u svim slučajevima. Uzrok složenosti organske analize leži u tome što su komponente građe organskih spojeva, istina malobrojne, ograničene na svega nekoliko elemenata (uz obavezni C, tu su još najčešće H, O, N, S, halogeni i P), ali su mogućnosti spajanja ovih elemenata u razne strukture praktično neograničene. Otkuda toliko mnogo spojeva karbona? U prvom redu je to rezultat katenacije karbona, tj. jedinstvene sposobnosti karbonovih atoma da se vezuju međusobno stvarajući prstenove i lance gotovo neograničene dužine i da istovremeno stvaraju veze sa atomima drugih elemenata. Kompleksnost organske hemije je znatno pojednostavljena zbog činjenice da se organski spojevi mogu svrstati u klase prema svojim hemijskim osobinama. Karakteristične osobine jedne organske molekule potiču od izvjesnih atomskih veza koje formiraju jedan atom ili grupa atoma i koje se nazivaju funkcionalne grupe. Svaka funkcionalna grupa odražava izvjesna karakteristična svojstva cijele organske molekule, bez obzira na njenu veličinu i kompleksnost i kada funkcionalna grupa podliježe reakcijama, ostatak molekule obično ostaje nepromijenjen. Neke najvažnije funkcionalne grupe nađene u organskim molekulama date su u Tabeli 1.

Funkcionalna grupa

C C

C C

O C OH

Klasa spojeva Alken Alkin Karboksilna kiselina

O C O C

O C N O C

*

H

Ester

Amid

Aldehid

Primjer

H2C HC

CH2 CH

CH3COOH HCOOCH2CH3 CH3CONH2

HCHO

Ime prema IUPAC -u (trivijalno ime) Eten (etilen) Etin (acetilen) Etanska kiselina (acetatna kiselina; sirćetna kiselina) Etilmetanoat (etilformijat) Etanamid (acetamid) Metanal (formaldehid)

Upotreba međuprodukt; regulator rasta biljaka međuprodukt; sredstvo za zavarivanje međuprodukt; kisela komponenta “sirćeta” Aromatični dodatak u limunadi Otapalo; aditiv za plastične mase i za “denaturaciju” alkohola Prisutan u dimu koji se koristi za sušenje šunke i ribe

Prema hemijskoj literuturi, procjenjuje se da organski spojevi čine više od 90% od 50 miliona i nešto više ukupno do danas poznatih spojeva. (Chemical Abstract 2009)

3

Hemija sa stehiometrijom O C OH N X

O

laboratorijske vježbe CH3COCH3

Keton

Propanon (aceton)

CH3CH2OH

Alkohol

CH3NH2

Amin Haloalkan (Alkilhalo genid) X=F, Cl, Br, I

(aromatski karbohidr ogen)

OH

Fenol

Hlormetan (metilhlorid)

Lokalni anestetik

Etoksietan (etileter)

Otapalo

Metilbenzen (toluen)

Međuprodukt; otapalo

Hidroksibenzen (fenol; karbolna kiselina)

Dezinficijens

CH3

Aren

direktno vezana na benzenski ciklus

Metanamin (metilamin)

CH3Cl

CH3CH2OCH2CH3

Eter

Etanol (etilalkohol)

Otapalo za lakove; (Nemoj ga dovesti u kontakt sa plastikom i rayonom!) Aktivni sastojak alkoholnih pića; otapalo Sredstvo za štavljenje kože

OH

Tabela 25.1 Neke najvažnije funkcionalne grupe

Generalna procedura klasične kvalitativne analize nepoznatog organskog spoja može se podijeliti u nekoliko koraka:

• • • • • •

ispitivanje fizičkih osobina (izgled, boja, miris…), uključujući tu i utvrđivanje izvjesnih fizičkih konstanti (tačka topljenja, tačka ključanja, gustina, indeks loma svjetlosti, optička aktivnost…) elementarna analiza; kvalitativno i kvantitativno određivanje prisutnih elemenata i postavljanje molekularne formule preliminarna ispitivanja (topivost, relativna kiselost odnosno baznost, sagorljivost…) detekcija karakterističnih funkcionalnih grupa pomoću hemijskih reakcija koje ih prevode u karakteristične derivate ili su vezane s pojavama koje se našim čulima daju primijetiti (boja, miris) spektroskopske metode analize koje daju ključne informacije o strukturnim karakteristikama organske molekule sinteza karakterističnog analitičkog derivata ispitivane supstance, čije fizičke osobine treba da potvrde identitet nepoznate supstance

Cilj ovog eksperimenta nije identifikacija datog spoja kao hemijske individue, već samo utvrđivanje različitih reaktivnih grupa u molekuli, što omogućuje da se nepoznati spoj uvrsti u jednu od potpuno definisanih klasa organsko-hemijske sistematike. S obzirom na ovako skromno postavljen cilj, mora i izbor supstanci za analizu biti vrlo ograničen na prilično malu listu lako pristupačnih supstanci čija se svojstva nalaze u literaturi. U ovom eksperimentu, biće obuhvaćeno samo nekoliko klasa organskih spojeva: alkani, alkeni, alkoholi, aldehidi, ketoni, karboksilne kiseline i fenoli. Ispitivanjem osobina poznatih spojeva iz svake od ovih klasa, dobiće se kratak uvid u karakteristična svojstva svake klase spojeva, što će pomoći da se identificira nepoznati spoj poređenjem njegovih osobina sa osobinama poznatih

4



organskih spojeva. Pri interpretaciji rezultata važno je imati na umu da su negativni nalazi često važni kao i pozitivni rezultati u identificiranju nepoznatog spoja. Svaki od izabranih testova na određene funkcionalne grupe može se izvesti uz mali utrošak vremena i materijala, a da pri tome pruži važne podatke o tome kojoj klasi dati spoj pripada. TESTOVI NA FUNKCIONALNE GRUPE Karbohidrogeni (ugljikovodici) Karbohidrogeni su najjednostavnija klasa organskih spojeva koji sadrže samo atome karbona i hidrogena. Prema svojim strukturnim karakteristikama dijele se u dvije velike grupe: alifatski i aromatski. Alifatski karbohidrogeni se dalje mogu podijeliti na alkane, alkene i alkine koji imaju i svoje cikličke analoge. Alkani imaju karbonove atome povezane samo jednostrukim kovalentnim vezama i još se nazivaju zasićeni karbohidrogeni. Najjednostavniji predstavnik alkana i ujedno najjednostavniji organski spoj je metan koji ima samo jedan karbonov atom. H H

H

C H metan

Alkani su klasa hemijski relativno inertnih spojeva koji pokazuju negativan test sa iodom kao gotovo univerzalnim reagensom na organske spojeve. Molekule koje sadrže π-elektrone ili nevezane elektronske parove grade sa iodom smeđe obojenu otopinu, kao posljedica stvaranja kompleksa između ioda i raspoloživih elektrona u tim molekulama. C C

I2

:O:

I2

smeđe obojeni kompleks

Otopina ioda i zasićenih spojeva koji nemaju raspoloživih elektrona i ne učestvuju u ovoj reakciji ostaje ljubičasta. Općenito, izostanak jednostavnih reakcija za identifikaciju alkana, kao rezultat njihove hemijske indiferentnosti, je upravo njihov najvažniji znak raspoznavanja. Alkeni su nezasićeni karbohidrogeni koji imaju jednu ili više karbon-karbon dvostrukih veza u molekuli, dok je karakteristika alkina prisustvo karbon-karbon trostrukih veza. Ovi nezasićeni karbohidrogeni su hemijski prilično reaktivni spojevi i vrlo lako stupaju u reakciju sa bromom koji se adira na njihove dvostruke, odnosno trostruke karbon-karbon veze. + Br Br C C Br C C C C + Br 2 crveno-smeđ

Br

bezbojan

Potvrda prisustva nezasićene veze je iščezavanje crveno-smeđe otopine broma. Alkeni i alkini takođe reaguju sa oksidirajućim reagensima kao što je KMnO 4 gradeći dihidroksilne alkohole (1,2-diole). Test sa KMnO4 poznat je i pod nazivom Baeyerov test nezasićenosti. Tamnoljubičasti permanganat se reducira do smeđeg mangan(IV) oksida.

5


C


+ 2 MnO-4 + 4 H2O

C

C

C + 2 MnO 2 + 2 OH

:OH .. :OH ..

ljubičast

smeđ

Ovaj test nije strogo selektivan jer mu podliježu i neke druge funkcionalne grupe koje se mogu oksidirati sa KMnO4 (fenoli, većina aldehida, 1o i 2o alkoholi itd.), iako sporije i pod nešto snažnijim uslovima (veća koncentracija KMnO4, viša temperatura i različita pH vrijednost otopine). Alkoholi Spojevi koji sadrže hidroksilnu (-OH) funkcionalnu grupu vezanu na zasićeni karbonov atom svrstavaju se u alkohole. Mogu se smatrati organskim derivatima vode u kojima je hidrogenov atom zamijenjen alkilnom grupom. C O H

Prema vrsti karbonovog atoma koji nosi -OH grupu, alkoholi se mogu klasificirati kao primarni (1o), sekundarni (2o) ili tercijarni (3o). Kada je -OH grupa vezana na 1o karbonov atom, tj. onaj koji na sebe ima vezan samo jedan karbonov atom, alkohol se svrstava u primarne. Sekundarni alkoholi imaju -OH grupu vezanu na 2o karbon, koji je vezan na dva susjedna karbonova atoma, odnosno tercijarni alkoholi imaju 3o karbonov atom koji je vezan na tri druga karbonova atoma. R'' R CH2 OH R CH OH R C OH R' R'

1o alkohol

2o alkohol

3o alkohol

Strukturne razlike između primarnih, sekundarnih i tercijarnih alkohola imaju posljedicu u različitoj reaktivnosti ovih spojeva. Tako svi alkoholi ne podliježu jednako djelovanju oksidirajućih reagenasa. Samo primarni i sekundarni alkoholi se mogu oksidirati uz gubitak dva hidrogenova atoma i nastanak karbonilnih spojeva: aldehida, odnosno ketona. Molekule tercijarnih alkohola nemaju H atom na karbonovom atomu koji nosi -OH grupu, tako da se ne mogu oksidirati dehidrogenacijom. Brz i jednostavan metod za razlikovanje primarnih i sekundarnih alkohola od tercijarnih alkohola je Jonesov oksidacioni test, koji koristi hromnu kiselinu kao oksidirajuće sredstvo. Oksidirajući reagens, dihromat ion, Cr2O72-, je svijetlo narandžast, a kada se redukuje dešava se promjena boje u izrazito zelenu koja potiče od hrom(III) iona, Cr3+. RCH2OH ili R2CHOH

+ H2Cr2O7

H2SO4

narandžast

Cr2(SO4)3 +

zelen

RCOOH ili R 2C O

Test se zasniva na oksidaciji primarnih alkohola u aldehide i dalje u karboksilne kiseline, odnosno sekundarnih alkohola u ketone, dok se tercijarni alkoholi ne mogu oksidirati pod ovim uslovima. Pozitivan Jonesov oksidacioni test daju i aldehidi, ali ketoni ne. Primarni, sekundarni i tercijarni alkoholi mogu se međusobno razlikovati na osnovu brzine nastanka hloralkana (alkilhlorida), R-Cl, u reakciji sa Lucasovim reagensom koji predstavlja otopinu zink(II) hlorida, ZnCl2, u koncentrovanoj hloridnoj kiselini, HCl.

R OH + HCl topiv

ZnCl 2

R Cl + H OH netopiv

6



Niži alkoholi se otapaju u reagensu, dok su odgovarajući hloralkani, R-Cl, netopivi u Lucasovom reagensu. Tercijarni alkoholi reaguju gotovo trenutno i hloralkan se pojavljuje kao zamućenje ili čak potpuno izdvojen sloj. Sekundarni alkoholi stvaraju zamućenje obično nakon 4-5 minuta, dok primarni alkoholi ne reaguju sa ovim reagensom kod sobne temperature. Primarni, sekundarni i tercijarni alkoholi koji imaju manje od 10 karbonovih atoma grade kompleks sa cer(IV) nitratnim ionom. Pozitivan test je indiciran trenutnom promjenom boje otopine od žute u crvenu. [R-O-Ce(NO3)5]2- + H+ + NO3crven

R-OH + [Ce(NO3)6]2žut Aldehidi i ketoni

Funkcionalna grupa u aldehidima i ketonima je karbonilna grupa u kojoj su karbon i oksigen vezani dvostrukom vezom. U aldehidima je najmanje jedan hidrogenov atom vezan na karbonov atom u karbonilnoj grupi, dok su u ketonima oba atoma koja su vezana na karbonilnu grupu karbonovi atomi. O

O

O

C

R C H

R C R'

aldehid

keton

karbonilna grupa

Karbonilna grupa u aldehidima i ketonima je veoma reaktivna i ove dvije klase spojeva često reaguju slično. Svi aldehidi i ketoni brzo reaguju sa, 2,4-dinitrofenilhidrazinom koji se još naziva Bradyev reagens i grade slabo topive 2,4-dinitrofenilhidrazone. Boja ovih kristalnih derivata varira od žute do crvene, zavisno od prisustva drugih grupa u susjedstvu karbonilne grupe.

H RC O ili R2C O

NO2

H RC NNH

NO2 + H2NNH

NO2

H+

ili

NO2 NO2

R2C NNH

NO2

Pored velikog broja reakcija u kojima reaguju slično, aldehidi i ketoni se različito ponašaju prema djelovanju blagih oksidirajućih reagenasa. Aldehidi se lako oksidiraju do kiselina koje imaju isti broj karbonovih atoma.

O R C H aldehid

[O]

O R C OH kiselina

Ketoni koji nemaju hidrogen vezan na karbonilnu grupu, mogu se oksidirati samo pod drastičnijim uslovima (jači reagensi i više temperature) pošto njihova oksidacija do kiseline zahtijeva raskidanje karbon-karbon veze. Testovi koji služe za razlikovanje aldehida od ketona zasnivaju se upravo na činjenici da se ove dvije klase spojeva oksidiraju pod različitim uslovima. Reakcija srebrenog ogledala uključuje oksidaciju aldehida u odgovarajuću kiselinu uz upotrebu amonijakalne otopine srebro nitrata kao oksidirajućeg reagensa. Ovaj reagens, poznat kao Tollensov reagens, reducira se do metalnog srebra koje se taloži na zidovima reakcione posude kao srebreno ogledalo.

7



2 Ag+NO3- + 2 NaOH

Ag2O

+ H2O + 2 Na+NO3-

2 Ag(NH3)2+OH-

Ag2O + 4 NH3 + H2O

O

O +

R C H + 2 Ag(NH3)2 OH

2 Ag + R C O- NH4+ + H2O + 3 NH3

-

o

Ovaj reagens je vrlo blag tako se da pored ketona, ni alkoholi ne mogu oksidirati pod ovim uslovima. Kao oksidirajući reagens koji se koristi za razlikovanje aldehida od ketona može poslužiti i bakar(II) ion, Cu2+, u alkalnoj otopini, kompleksiran sa K, Na-tartaratom, poznat kao Fehlingov reagens. Aldehidi reduciraju bakar(II) ion, Cu2+ u bakar(I) ion, Cu+. Otopina se pri tome mijenja iz plave u prljavo zelenu i postepeno se izdvaja crvenkasti talog bakar(I) oksida, Cu2O.

O R C H + 2 Cu2+ + 5 OH-

K,Na-tartarat

plav

O R C O- + Cu2O + 3 H2O crven

Metilketoni se mogu razlikovati od drugih ketona pomoću iodoform testa. Iodoform test uključuje hidrolizu i cijepanje metilketona, pri čemu nastaje žuti talog iodoforma, CHI3,

O

O R C CI3 + 3 KI + 3 H2O

R C CH3 + 3 I2 + 3 KOH

KOH O

R C O- K+ + CHI3 žut

Pozitivan test daju i spojevi koji se lako oksidiraju do metilketona pod ovim reakcionim uslovima: 2 o alkoholi koji imaju metilnu grupu u susjedstvu hidroksilne grupe. O CH3 C

Acetaldehid je jedini od aldehida koji daje pozitivan test jer ima grupu za koju je karakteristična iodoform reakcija, kao i etanol koji se može oksidirati do acetaldehida. Karboksilne kiseline Konačni produkt oksidacije primarnih alkohola ili aldehida su karboksilne kiseline. O R C OH

Karboksilna grupa –COOH ima hidroksilnu –OH grupu vezanu na karbonov atom karbonilne grupe, ali njena hidroksilna grupa, za razliku od alkoholne –OH, pokazuje kisela svojstva. Tako karboksilne kiseline reaguju sa natrijum bikarbonatom, NaHCO3 i natrijum karbonatom, Na2CO3, i grade u vodi topive natrijumove soli i karbonsku (ugljičnu) kiselinu koja se dalje raspada na vodu i karbon(IV) oksid (ugljendioksid), koji se oslobađa kao gas. Mjehurići izdvojenog gasa, CO 2, se kreću ka površini otopine i to je propraćeno karakterističnim ˝šumećim˝ zvukom.

O R C OH + NaHCO 3

R

C

O + CO2 + H2O O- Na+

Ova reakcija može poslužiti za identifikaciju karboksilnih kiselina i posebno za razlikovanje od ostalih organskih spojeva kiselog karaktera kao što su fenoli koji se ne mogu neutralizirati bikarbonatom.

8



Fenoli Da bi se neki spoj klasificirao kao fenol, njegova molekula mora imati najmanje jednu -OH grupu direktno vezanu na benzenov prsten. Najjednostavniji član ove familije, fenol, dao je ime cijeloj klasifenoli. OH

fenol

Za razliku od alkohola koji takođe sadrže -OH funkcionalnu grupu, fenoli su slabo kiseli i mogu se neutralizirati natrijum hidroksidom, a njihovi benzenovi prstenovi se lako oksidiraju. Test za dokazivanje fenolske funkcionalne grupe zasniva se na stvaranju obojenog kompleksa u prisustvu željezo(III) iona, Fe3+. OH 3O Fe + 6 + Fe 3+ + 6H 6

žut

ljubičast

Pozitivan test daje većina fenola, a boja varira od intenzivno ljubičaste do crveno- smeđe ili zelene boje. ZADATAK VJEŽBE

-

Na uzorcima poznatih spojeva izvesti sve testove na funkcionalne grupe navedene u proceduri. Popuniti tabelu u Izvještaju nedostajućim podacima o strukturi poznatih spojeva i navesti svoja zapažanja (boja reakcione smjese, pojava taloga i sl.) pri izvođenju pojedinih testova na funkcionalne grupe. U Izvještaju opisati testove koji su izvedeni u cilju identifikacije funkcionalne grupe u uzorku nepoznatog spoja. ∗

HEMIKALIJE I REAGENSI -

Indikator fenolftalein Elementarni iod, I2 Dihlormetan (metilenhlorid), CH2Cl2 Etanol, 96% Aceton 10% vodena otopina NaOH Brom u dihlormetanu, 2% otopina Br2 u CH2Cl2. Dihlormetan (metilenhlorid) se koristi umjesto uobičajenog otapala, tetrahlormetana (karbontetrahlorida), CCl4, jer je manje toksičan. Otopina broma u dihlormetanu treba da je svježe pripremljena i čuva se u tamnoj boci. Baeyerov reagens-1% vodena otopina permanganata, KMnO4 (0.06 mol/L)



-

Sve navedene reagense dobićeš pripremljene od laboranta, a ovdje je dat opis njihovog priređivanja u slučaju potrebe da to student uradi samostalno.

9



-

Jonesov reagens: Priredi suspenziju od 13.4 g CrO 3 u 11.5 mL koncentrovane H2SO4 i pažljivo je dodaj, uz miješanje, u toliko vode koliko je potrebno da ukupan volumen otopine iznosi 50 mL. Ovako priređeni reagens ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu prije upotrebe. Lucasov reagens: Otopi 16.0 g anhidrovanog zink(II) hlorida, ZnCl 2, u 10 mL koncentrovane hloridne kiseline, HCl, uz hlađenje na ledenom kupatilu. Cer-nitratni reagens: Otopi 4.0 g amonijum-cer(IV) nitrata, [(NH4)2Ce(NO3)6], u 10 mL otopine nitratne kiseline, 1.0 mol/L HNO3. Ako je potrebno, pripremu reagensa uradi uz zagrijavanje u cilju potpunog otapanja. Bradyev reagens: Otopi 1.0 g 2,4-dinitrofenilhidrazina u 5.0 mL koncentrovane H2SO4. Ova otopina se polako dodaje, uz miješanje, u smjesu od 10 mL H2O i 35 mL 96% etanola. Nakon miješanja, ako je potrebno, profiltriraj otopinu. Tollensov reagens-amonijakalna otopina srebro nitrata: Pripremi 5% vodenu otopinu AgNO3, 10 % vodenu otopinu NaOH i koncentrovanu otopinu amonijaka, NH 4OH, koji se pomiješaju neposredno prije upotrebe prema datoj proceduri. Važno: Višak Tollensovog reagensa treba uništiti sa HNO3 jer može stvoriti eksplozivne fulminate! 3 Ag2O + 2 NH3 (aq) 2 Ag3N + 3 H2O eksplozivan

-

Fehlingov reagens : Otopina I: 36.64 g kristalnog bakar(II) sulfata, CuSO4, otopi u vodi koja sadrži par kapi razblažene sulfatne kiseline i dopuni otopinu vodom do 500 mL. Otopina II: Otopi 60 g čistog natrijum hidroksida, NaOH, i 173 g kalijum, natrijum-tartarata (Roshelleova so) u vodi, filtriraj kroz sinterovani stakleni lijevak i dopuni otopinu vodom do 500 mL. Obje otopine se čuvaju odvojeno, dobro zatvorene i neposredno prije upotrebe se pomiješaju isti volumeni otopine I i II. Iod u kalijum iodidu: Otopi 10 g kalijum iodida, KI i 5 g elementarnog ioda, I 2, u 40 mL vode. 1% vodena otopina natrijum bikarbonata, NaHCO3 FeCl3-reagens: 1% neutralna otopina željezo(III) hlorida (oslobođena HCl) priređuje se dodatkom razblažene otopine natrijum hidroksida u osnovnu otopinu 1% FeCl3 dok se ne stvori talog željezo(III) hidroksida, Fe(OH)3. Odfiltriraj talog i za test upotrijebi bistar filtrat. PRIBOR I OPREMA -

epruvete, manje Pasterove pipete porculanska pločica za testove vodeno kupatilo (čaša sa vodom) termometar indikator papir

MJERE OPREZA Za sve spojeve koje dobiješ kao poznate uzorke, koristeći se raspoloživim priručnicima ili komercijalnim katalozima (konsultuj asistenta!), uz podatke o strukturi i fizičkim svojstvima, prikupi informacije o toksičnim i/ili zapaljivim svojstvima koja uključuju i specifične mjere opreza pri radu. Pri identifikaciji nepoznatog organskog spoja, uvijek imaj na umu da bilo koji takav spoj ima potencijalno opasna svojstva i sve hemijske testove obavljaj uz mjere opreza koje su neophodne u radu sa toksičnim i zapaljivim supstancama! Mnogi organski spojevi su zapaljivi i brzo reaguju sa oksigenom u prisustvu vatre ili iskre. Tokom izvođenja eksperimenta eliminiši otvoreni plamen u blizini.

10



Iod i posebno brom su veoma toksični i mogu izazvati opekotine na koži ili udisanjem njihovih para. Obavezno radi u digestoru i koristi zaštitne rukavice. Neki od reagenasa se pripremaju uz upotrebu koncentrovanih mineralnih kiselina. Pridržavaj se opštih pravila o radu sa ovim agresivnim hemikalijama. Hlorirana otapala, kao dihlormetan (metilenhlorid), CH2Cl2, su toksični i moguće kancerogeni. Izbjegavaj udisanje njihovih para i obavezno radi u digestoru. Mnogi spojevi hroma (VI) su moguće kancerogeni. Izbjegavaj kontakt sa prahom hrom(VI) oksida, CrO3. Otopina srebro nitrata izaziva tamne mrlje na koži. Koristi zaštitne rukavice. IZVOĐENJE VJEŽBE U cilju identifikacije nepoznatog organskog spoja, dobićeš od asistenta JEDAN uzorak koji predstavlja monofunkcionalni organski spoj (ima samo jednu funkcionalnu grupu), što ga svrstava u jednu od klasa organskih spojeva koje imaju svoje predstavnike među poznatim uzorcima koji će Ti biti na raspolaganju. Spisak mogućih supstanci koje mogu biti date kao poznati uzorci organskih spojeva: • alkani: heksan, pentan, metilcikloheksan • alkeni: penten-1, penten-2, cikloheksen • aldehidi: benzaldehid, propanal, formaldehid, glukoza • ketoni: aceton, cikloheksanon, acetofenon, metil etil keton • alkoholi: etanol, cikloheksanol, terc.butanol, n-butanol • fenoli: fenol • karboksilne kiseline: acetatna kiselina, benzojeva kiselina, buterna kiselina Kako ne postoji neko jedinstveno uputstvo za rad sa nepoznatim uzorkom, data je shema koja može biti pomoć u planiranju redoslijeda hemijskih reakcija potrebnih u cilju identifikacije funkcionalnih grupa (Slika 25.2). Na bazi tako dobivenih rezultata treba izvesti i druge testove za potvrdu prisustva pojedinih funkcionalnih grupa.



Sve testove na nepoznatom uzorku izvodi paralelno sa poznatim spojem koji daje POZITIVAN test i sa kontrolnom probom (koja sadrži otapalo i reagens, ali BEZ analiziranog uzorka) i koja daje ∗ NEGATIVAN test . Na ovaj način je olakšana interpretacija pozitivnih reakcija, a eventualno onečišćeni ili nedovoljno svježi reagensi mogu se tako otkriti i zamijeniti novim. Vrlo je važno da detaljno opišeš sva svoja opažanja i rezultate pri izvođenju svakog pojedinačnog testa i to prikažeš u Izvještaju.

Pri izvođenju hemijskih testova, svi reagensi se uzimaju pomoću kapaljke ili Pasterove pipete.

11



T

e s t

s a

3

N

(+

) a H

C

O

(- ) a l k a n a l k e n a l d e h i d a l k o h o l k e t o n f e n o l T

e s t

s a4

( - )

e s t

s a

T

n O ) a l k e n a l d e h i d f e n o l

( + ) i t r o f e n i l hT i e d s r t a s3z a i n F f o e e mn C o l l ( - ) ( + ) a l k e n k e t o n a l d e h i d

2 , 4 - d i n

( - ) a l k a n a l k o h o l T

M ( +

a l k a n k e t o n a l k o h o l T

K

I o d o f o r m t e s t c e ( r - - ) n i t r ( a + t )o m T e s t s a ( + ) N I J mE e t i l ( - ) ( - ) a l k a na l k o hm o el t k i l e t o n a l k e n k e t o n e s t

s a

e s t

s a

( - ) a l k

aT n e s t ( +

1o

o

) i

s a

d

( - ) a l k o

2

3

L

o

u

a l

( +

a e s t s a b r o m ( + ) i h r o m a tl ok me n T e s t s a r e a g e h o l ( + k o h o l T

i o d o m

2 , 4 - d i n i t r o f e n i l h i d r a z i n o m

c a s o v

l d e h i d o m

F e h l i n g o v i m n s o m )T

e s t s r e b r e n o g o g l e d a l a ( +

t e s t

t r e n u t n o

)

a l d

)

e h i d

o

3 a l k o h o l Slika 25.2 Shema za identifikaciju nepoznatih organskih spojeva

12



TEST SA IOD-KOMPLEKSOM Na bijelu porculansku pločicu stavi mali kristal ioda, a zatim dodaj 23 kapi ispitivane tečnosti. Alkani daju negativan test i ljubičasta boja ioda ostaje nepromijenjena. Svi ostali organski spojevi koji grade kompleks sa iodom daju smeđe obojenu otopinu. Napomena: Test se izvodi samo na tečnim uzorcima.

TEST SA BROMOM U manju epruvetu unesi 2 kapi nepoznate ispitivane tečnosti (ili par kristalića ako je uzorak čvrst) i otopi ih u 0.5 mL dihlormetana. Dodaj 2 kapi 2% otopine broma u dihlormetanu, uz mućkanje. Gubitak crvenosmeđe boje broma je dokaz prisustva nezasićenog karbohidrogena. Napomena: Nemoj udisati pare reagensa i obavezno izvodi test u digestoru.

TEST SA PERMANGANATOM: BAEYEROV TEST NEZASIĆENOSTI U manju epruvetu otopi 2 kapi ispitivanog uzorka u 0.5 mL čistog acetona (bez primjesa alkohola) i dodaj 2-3 kapi 1% otopine KMnO4, uz miješanje. Pozitivan test nezasićenosti je promjena ljubičaste boje permanganata u talog smeđeg mangan(IV) oksida, MnO2. Napomena: Test je negativan ako se ne obezbojava više od 3 kapi otopine permanganata.

TEST SA HROMNOM KISELINOM: JONESOVA OKSIDACIJA Otopi 2 kapi ispitivane tečnosti (ili par kristalića ako je uzorak čvrst) u 0.5 mL čistog acetona u manjoj epruveti i ovoj otopini dodaj 2 kapi Jonesovog reagensa (hromna kiselina u sulfatnoj kiselini). Promiješaj otopinu i prati promjenu boje. Pozitivan test je nastanak zelene boje par sekundi nakon dodatka narandžasto-žutog reagensa. LUCASOV TEST U manjoj epruveti pomiješaj 3 kapi ispitivane tečnosti sa 2 mL Lucasovog reagensa. Dobro izmućkaj otopinu i ostavi da malo odstoji. Posmatraj promjenu reakcione smjese i na osnovu vremena potrebnog za pojavu zamućenja ili izdvajanje netopivog sloja, klasificiraj ispitivani uzorak kao 1o, 2o ili 3o alkohol. Napomena: Pošto se kao sporedni produkt reakcije izdvaja HCl, test izvedi pažljivo u digestoru.

TEST SA AMONIJUM-CER(IV) NITRATOM Tri kapi ispitivanog spoja dodaj u epruvetu u kojoj se nalazi 0.5 mL reagensa amonijum cer(IV) nitrata i promućkaj sadržaj epruvete. U

13


laboratorijske vježbe slučaju pozitivne reakcije, blijedožuta boja reagensa prelazi crvenu, koja potiče od nastalog kompleksa koji je topiv u vodi. Napomena: Ukoliko ispitivani uzorak nije topiv u vodi, biće prisutna dva sloja. Crvena boja u jednom od slojeva, indikacija je pozitivnog testa.

TEST SA 2,4-DINITROFENILHIDRAZINOM: BRADYEV TEST U manjoj epruveti otopi 3 kapi ispitivanog uzorka u 0.5 mL etanola i zatim dodaj 1 mL reagensa 2,4-dinitrofenilhidrazina. Dobro promiješaj smjesu i ostavi da stoji par minuta. Stvaranje žuto do crveno obojenog taloga 2,4-dinitrofenilhidrazona je pozitivan test na karbonilne spojeve. Napomena: Ponekad prvo nastane uljasti talog, ali nakon stajanja postane kristaličan.

TEST SREBRENOG OGLEDALA: TOLLENSOVA REAKCIJA U čistu epruvetu odpipetiraj 1.0 mL 5% otopine AgNO3 i dodaj 1 kap 10% otopine NaOH. Nastali talog srebro oksida otopi u minimalnoj količini koncentrovane otopine amonijaka (2-4 kapi), uz miješanje. Bistroj otopini dodaj 1 kap ispitivane tečnosti (ili par kristalića ako je uzorak čvrst), uz miješanje i ostavi reakcionu smjesu da stoji 5 minuta na sobnoj temperaturi. Ako nema reakcije, stavi epruvetu u vodeno kupatilo (čaša sa vodom), zagrijano na 40oC, 5 minuta. Nastanak srebrenog ogledala je pozitivan test. Napomena: - Epruveta treba da je temeljito oprana, jer u protivnom neće nastati sloj srebrnog ogledala na zidovima epruvete, već će se elementarno srebro istaložiti kao tamni prah na dnu. - U pripremi reagensa, izbjegavaj upotrebu viška amonijaka. - Tollensov reagens se uvijek koristi svježe pripremljen jer nakon stajanja može da se raspada, uz stvaranje eksplozivnog AgN3! - Višak reagensa treba uništiti sa HNO3- konsultuj asistenta! - Nitratna kiselina takođe uklanja srebrno ogledalo nastalo u epruveti i nakon izvedenog testa, odmah isperi epruvetu razblaženom otopinom HNO3.

TEST SA FEHLINGOVIM REAGENSOM Dvije kapi ispitivane tečnosti (ili par kristalića ako je uzorak čvrst) i 2 mL Fehlingovog reagensa (priređenog miješanjem jednakih volumena otopine I i II, neposredno prije upotrebe) zagrij u epruveti, na ključalom vodenom kupatilu, tokom 3-4 minute. U slučaju pozitivnog testa, izdvaja se crveni talog bakar(I) oksida, Cu2O. IODOFORM TEST Otopi samo 1 kap ispitivane tečnosti (ili kristalić ako je uzorak čvrst) u 0.5 mL vode i dodaj 0.5 mL 10% otopine NaOH.

14


laboratorijske vježbe Napomena: Ukoliko uzorak nije topiv u vodenoj fazi, ili snažno promućkaj otopinu, ili dodaj par kapi dioksana (obavezno u digestoru!) ili 1,2-dimetoksietana da bi se otopina homogenizirala.

Nakon otapanja uzorka, dodaj polako, u kapima i uz miješanje, otopinu ioda u kalijum-iodidu, dok se tamno smeđa boja otopine ne zadrži (1-2 mL I2 /KI). Ostavi reakcionu smjesu da stoji 2-3 minute. Ako se ne izdvoji talog iodoforma kod sobne temperature, zagrij epruvetu par minuta na vodenom kupatilu na 60oC. Ukoliko boja ioda iščezne, nastavi dodavati reagens dok se smeđa boja, koja potiče od neizreagiranog ioda, ne zadrži. Višak ioda ukloni dodatkom par kapi razblažene otopine NaOH, uz mućkanje i ostavi reakcionu smjesu da stoji 10 minuta. Izdvajanje žutog taloga iodoforma, karakterističnog mirisa, je dokaz pozitivnog testa. TEST KISELOSTI POMOĆU INDIKATORA a) Na komad plavog lakmus papira, nakvašenog destilovanom vodom, stavi kristal ili kap vodene otopine ispitivane supstance. Ukoliko uzorak nije topiv u vodi, upotrijebi alkoholno-vodenu smjesu ili čist alkohol. Promjena boje plavog lakmusa u crvenu govori o kiselom karakteru supstance. b) Na bijelu porculansku pločicu stavi 1 kap otopine fenolftaleina kome je predhodno dodata minimalna količina razblažene otopine NaOH (0.01 mol /L) da bi postao crven. Na tu kap dodaj malo ispitivane supstance. Ako se kap obezboji, test je pozitivan, tj. supstanca ima kiseo karakter. TEST SA NATRIJUM-BIKARBONATOM Dodaj oko 0.2 g nepoznatog spoja u oko 1 mL 5% vodene otopine natrijum bikarbonata. Oslobađanje karbon dioksida, CO2, dokaz je prisustva karboksilne grupe. TEST SA ŽELJEZO(III) HLORIDOM Zavisno od osobina topivosti, 3 kapi ispitivanog spoja (ili par kristalića ako je uzorak čvrst), otopi u epruveti u 0.5 mL vode ili etanola (ili smjese voda-etanol, 1:1) i zatim dodaj 1-2 kapi 1% neutralne otopine FeCl3. Pozitivan test je promjena žute boje reagensa u crvenu, ljubičastu ili zelenu. Napomena: Prije dodatka reagensa, indikator papirom provjeri pH otopine. U prisustvu fenola, pH treba da je ispod 7.

15



PRIPREMNA VJEŽBANJA

1. Po čemu se organski spojevi razlikuju od anorganskih? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

2. Ispiši strukturne formule za sva četiri alkohola molekularne formule C4H9OH i označi svaki kao 1o, 2o ili 3o alkohol.

3. Navedi funkcionalne grupe koje su prisutne u slijedećim spojevima: a) b) c) O C H CH2 C O H CH3 C CH2CH3 d)

OH

e) f) O CH3 C O C OH CH O CH CH CH CH 3 2 2 2 3

__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

4. Koje je IUPAC ime za: a) acetaldehid b) aceton c) n-pentil metil keton?

___________________________________________ ___________________________________________ ____________________________________________

5. Šta nastaje oksidacijom slijedećih alkohola sa CrO3/H2SO4? a) etanol b) 1-propanol c) cikloheksanol d) terc.butanol

______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________

16



REZULTATI TESTOVI SA POZNATIM SPOJEVIMA Ime spoja

∗

Strukturna formula

Test/reagens za dokazivanje funkcionalne grupe

Opažanja i rezultati

alkan: alken: alkohol: aldehid: keton: karboksilna kiselina: fenol:

TESTOVI SA NEPOZNATIM ORGANSKIM SPOJEM Opažanja i rezultati Test/reagens za dokazivanje funkcionalne grupe

POZITIVAN test sa poznatim uzorkom

NEGATIVAN test sa kontrolnom probom

NEPOZNATI UZORAK

Nepoznati organski spoj sadrži __________________________funkcionalnu grupu.



PITANJA: Posebno označi (drugom bojom) atome koji predstavljaju funkcionalnu grupu.

17



1. Koristeći se testovima u ovom eksperimentu, predloži hemijsku reakciju kojom možeš razlikovati spojeve u parovima: a) pentan i penten-1 ___________________________________________________________________ b) 2-pentanon i 3-pentanon ___________________________________________________________________ c) 3-pentanon i pentanal ___________________________________________________________________ d) aceton i cikloheksanon ___________________________________________________________________ e) benzaldehid i acetofenon (fenil metil keton) ___________________________________________________________________ f) benzaldehid i salicilaldehid (2-hidroksibenzaldehid) ___________________________________________________________________ g) etanal i propanal ___________________________________________________________________ h) etanol i fenol ___________________________________________________________________ i) terc.butanol i n-butanol ___________________________________________________________________ j) fenol i benzojeva kiselina ___________________________________________________________________

OVJERA VJEŽBE:

18



Vježba broj 2 KVALITATIVNO I KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE UGLJIKOHIDRATA 1. TEORETSKI DIO Ugljikohidrati (šećeri, saharidi) su spojevi koji u svom sastavu sadrže C, H i O, a u jednostavnim šećerima (monosaharidima) imaju opću formulu CnH2nOn. Oni predstavljaju najrasprostranjenije organske supstance u prirodi. U biljnom organizmu služe kao gradivni materijal (celuloza) ili rezervna hranljiva supstanca (škrob). U organizmu čovjeka i životinja služe kao izvor energije, a u manjoj mjeri kao gradivni materijal. Dijelimo ih na monosaharide, oligosaharide i polisaharide. Monosaharidi su aldehidi ili ketoni polihidroksilnih alkohola, koji se procesom hidrolize ne mogu rastaviti na prostije šećere. Po osobinama razlikuju se od drugih organskih supstanci: • Oksidacija i redukcija - monosahatida: procesom oksidacije monosaharidi prelaze u onske, uronske i dikarbonske oksikiseline. Onske nastaju oksidacijom aldehidne grupe u karboksilnu, uronske oksidacijom primarne OH-grupe u karboksilnu, a dikarbonske kiseline nastaju oksidacijom aldehidne i primarne alkoholne grupe. Na bazi oksidacije monosaharida uvedene su reakcije dokazivanja šećera u rastvoru, kao što su: Tromerova, Benediktova, Bottger-ova, Nylander-ova, Felingova i dr. Monosaharidi uz prisustvo nekog redukujućeg sredstva mogu preći u odgovarajuće alkohole, pri čemu se redukuje aldehidna grupa aldoze, a keto grupa ketoze. Šećeri sastavljeni iz dva ili više monosaharida (npr. oligosaharidi imaju 2-10 monosaharida) mogu zadržati reducirajuća svojstva ako im jedna reducirajuća grupa (aldehidna ili keto) nije stupila u glikozidnu vezu. • Optička aktivnost - Biot je 1815 godine otkrio da izvjesna organska jedinjenja imaju sposobnost da obrću ravana polarizovanog svjetla. Ta jedinjenja je nazvao optički aktivne supstance, ato su supstance koje imaju najmanje jedan asimetričan ugljikov atom. Asimetrični ugljikov atom je onaj atom na čije su četiri valencije vezana četiri različita liganda. Na bazi otičke aktivnosti može se odrediti koncentracija određenog monosaharida u nekom rastvoru. Primjer je hidrolize saharoze, koja se još zove inverzija saharoze, jer je saharoza kao spoj desnogira (zakreće ravan polarizovane svijetlosti udesno), a produkt koji nastaje hidrolizom je lijevogira Hidrolizom je nastala ekvimolarna smjesa glukoze i fruktoze. Obzirom da je fruktoza lijevogira, glukoza desnogira, u otopini dva šećera dominira onaj smjer obrtanja polarizovane svijetlosti čiji je specifični ugao zakretanja veći. U ovom slučaju to je specifični ugao fruktoze i otopina je lijevogira. Zato se ekvimolarna smjesa glukoze i fruktoze naziva invertni šećer. • Konfiguracija monosaharida - označava se velikim slovima D i L, pa šećeri koji nose oznaku D imaju desnu, a šećeri koji imaju oznaku L imaju lijevu konfiguraciju. Svi monosaharidi koji imaju raspored H i OH-grupe na posljednjem asimetričnom, odnosno pretposljednjem C-atomu kao i Dglukoza imaju desnu konfiguraciju bez obzira kako obrću ravan polarizovane svjetlosti. Većina šećera ima svojstvo zakretanja ravni polarizirane svjetlosti kao posljedicu posjedovanja asimetrično-og/ih C-atoma, što se koriste za kvalitativno (provjerom specifičnog ugla zakretanja) i kvantitativno (mjerenjem ugla zakretanja) određivanje. Pouzdano kvalitativno i kvantitativno određivanje ugljikohidrata vrši se brojnim hromatografskim metodama uz primjenu čistih šećera kao standarda. Monosaharide dijelimo prema vrsti karbonilne grupe na aldoze i ketoze, a također dijelimo i prema broju C-atoma na trioze, tetroze, pentoze, heksoze i heptoze. Reakcije koje se koriste za kvalitativno dokazivanje prisustva ugljikohidrata temelje se najčešće na reducirajućim svojstvima mono- i disaharida, oksidaciji mono- i disaharida uz vezivanje nastalih produkata pogodnim reagensima u specifično obojene komplekse. Vrlo jednostavan eksperiment za kvalitativno dokazivanje šećera je karameliziranje koje se dešava na povišenoj temperaturi kada

19



nastaju produkti (boja može varirati od žute preko smeđe do crne ovisno o visini temperature i vremenu zagrijavanja) uz izdvajanje karakterističnog i ugodnog mirisa. Temperatura topljenja (preciznije temperatura raspadanja) kao fizička konstanta također služi pri identifikaciji šećera. Fermentacija - pri djelovanju kvasca na otopine većine monosaharida, nekih disaharida i oligosaharida, dolazi do selektvne fermentacije. Ovisno o prisustvu odgovarajućih enzima u pekarskom ili pivskom kvascu fermentacija može biti alkoholna i mliječno-kiselinska. Kod prve nastaje etanol, a kod druge kojoj podliježe mliječni šećer laktoza nastaje mliječna kiselina. Savremene metode za kvantitativno određivanje šećera u dijagnostici i liječenju temelje se i na primjeni specifičnih enzima koji u reakciji sa supstratom (šećerom) stvaraju produkt čije se nastajanje može pratiti pogodnom metodom (najčešće spektorfotometrijski). Količina tog produkta srazmjerna je količini prisuutnog šećera u uzorku. Jedan takav set za određivanje nivoa glukoze u krvi je Glucose Flex TM reagent catridge, Dimension® sistem kliničke hemije, kompanije Dade behring Inc.

2. EKSPERIMENTALNI DIO •

Reducirajuća svojstva monosaharida i disaharida

1. Trommerova reakcija Na ispitivanu probu (1-2 ml otopine šećera) dodaje se isti volumen 2 M NaOH i uz mješanje toliko 0,25 M otopine CuSO4 dok se ne stvori talog Cu(OH)2 koji se više ne otapa. Zagrijavanjem, reducirajući šećeri izdvajaju crveni talog Cu2O:

2. Fehlingova reakcija U epruvetu sipati 1 ml reagensa Fehling I i Fehling II i zagrijavati na ključalom vodenom kupatilu nekoliko minuta. Zatim dodati ispitivanu otopinu šećera i ukoliko se odmah ne pojavi crveni talog Cu2O nastaviti grijati.

-Fehling I: vodena otopina bakar(II)-sulfata (6,25 g CuSO4x5H2O u 100 ml H2O) -Fehling II: alkalna otopina kalijum-natrijum tartarata (15 g NaOH i 5 g soli u 100 ml H2O)

20



3. Benedictova reakcija U epruvetu se stavi 1,5 ml Benedictovog reagensa i nekoliko kapi ispitivane probe i zagrijava 2 minute na ključalom vodenom kupatilu. Crveni talog Cu2O dokaz je prisustva reducirajućih šećera. Benedictov reagens: 1. Otopi se 173 g bezvodnog Na-citrata i 90 g bezvodnog Na-karbonata u 600 ml destilovane vode uz grijanje. Po potrebi se filtrata. Nadopuniti sa destilovanom vodom do 850 ml. 2. otopi se 17,3 CuSO4x5H2O u 150 ml H2O. Nakon toga otopina 1, postepeno, uz mješanje, dodaje se u otopinu 2.

4. Nylanderova reakcija Na 2 ml ispitivane itopine dodaje se 0,5 ml Nylanderova reagensa i zagrijava do pojave smeđeg do crnog taloga od izdvojenog bizmuta:

Nylanderov reagens: otopi se 4g K-Na tartarata u 100 ml 10 %-og NaOH. Tome se dodaje 2 g bizmutnitrata i zagrijava. Nakon toga filtrirati i ohlađeni filtrat koristiti kao reagens.

5. Reakcija srebrnog ogledala U epruvetu sipati 2 ml 10 %-og AgNO3 i dodavati NH4OH do alkalne reakcije. Zatim dodati 2 ml 1 %ne otopine glukoze i grijati na vodenom kupatilu. Nakon izvjesnog vremena na zidovima epruvete stvara se ogledalo od izdvojenog srebra.

•

Ostale bojene reakcije za dokazivanje ugljjikohidrata

1. Molischeva reakcija Molischeva reakcija je opća reakcija na prisustvo šećera. Negativna proba isključuje njihovo prisustvo u ispitivanom uzorku. Temelji se na dehidratacionom djelovanju koncentriranih kiselina pri čemu nastaje furfural ili njegovi derivati koji sa α-naftolom daju obojene spojeve.

21



Postupak: na 2 ml ispitivane otopie dodati nekoliko kapi Molischeva reagensa, potresti i vrlo pažljivo, niz zidove epruvete dodati 3 ml konc. H2SO4. Na dodirnom sloju dvije tečnosti javlja se crvenoljubičasto obojenje, koje ukazuje na prisustvo šećera.

2. Seliwanov test-razlikovanje aldoza i ketoza Specifična reakcija na ketoze izvodi se Seliwanovim reagensom (otopina rezorcinola u HCl). Ketoze se dehidratizraju sa rezorcinolom do furfurala (derivata furfurala) mnogo brže od aldoza, a furfural se kondezira sa rezorcinolom i gradi kompleks crvene boje. Postupak: na 2 ml Seliwanov-og reagensa dodati nekoliko kapi ketoze (fruktoze) i zagrijavati do ključanja u toku 60 sekundi. Nastaje crvenkasto obojenje, a zatim crveni talog.

•

Razlikovanje pentoza i heksoza

1. Tauberova reakcija Ova reakcja je selektivno pozitivna na pentoze. Reagens sadrži benzidin u koncentrovanoj acetatnoj kiselini. Postupak: na 0,5 ml pentoze (arabinoza, riboza, ksiloza) dodati 2 ml Tauberovog reagensa, zagrijati do ključanja do smanjenja volumena na polovicu. Epruvetu zatim uroniti u hladnu vodu i dopuniti vodom na polazni volumen. U toku nekoliko sekundi javlja se vrlo stabilna svijetlo-crvena boja.

2. Bialova reakcija Ova reakcija je pozitivna na pentoze, a reagens sadrži orcinol i željezo(III)-hlorid u HCl. Postupak: Na 1,5 ml pentoze dodati 2,5 ml reagensa i grijati na ključalom vodenom kupatilu. Pentoze zagrijavanjem sa HCl daju furfural koji se u prisustvu feri jona kondenzira sa orcinolom (1,3-dihidroksi-5metilbenzen) pri čemu se javlja zeleno obojeni kompleks. Ponoviti reakciju sa glukozom i ustanoviti negativan test.

•

Fermentacija

Na suspenziju kvasca u vodi dodati otopinu koja se ispituje (2 %-nu fruktozu). Zatvoriti epruvetu (tzv. patkicu), okrenuti je i držati u termostatu pri 37 °C. Nakon 30 minuta zapažaju se mjehurići izdvojenog CO2, koji idu prema vrhu epruvete i potiskuju tečnost. Dok se čekaju ova zapažanja,

22



pripremiti eksperiment fermentacije na sljedeći način: na 2 ml 2 %-ne fruktoze dodati 2 kapi indikatora fenol-crveno i nekoliko kapi 1 %-og Na-karbonata (do crvenog obojenja) te staviti na termostat pri već podešenoj temperaturi. Kada nastupi fermentacija boja indikatora prelazi u žutu.

•

Hidroliza i inverzija saharoze

1. Sa 1-2 ml otopine saharoze izvesti neku od reducirajućih proba (npr. Trommerovu ili Benedictovu) i zabilježiti ishod. Nakon toga, na 5 ml otopine saharoze dodati 0,5 ml konc. HCl i zagrijavati 20-30 minuta na ključalom vodenom kupatilu. Ohladiti i hidrolizat neutralizirati zasićenom otopinom Nakarbonata. 2. Na neutraliziranoj otipini izvesti Benedictovu probu i konstatirati prisustvo reducirajućih grupa, nastalih hidrolitičkom cijepanjem glikozidne veze.

3. ZADACI I VJEŽBE -Odgovorite na slijedeća pitanja: 1. Prikazati cikličnu sturkturu D-glukoze?

2. Koji od navedenih ugljikohidrata će dati pozitivnu (+) ili negativnu (-) reakciju sa navedenim reagensima? Benediktova reakcija

Selivanov test

Fermentacija

Reakcija sa jodom

Glukoza Fruktoza Galaktoza Saharoza Laktoza Maltoza -

Izvršiti eksperimentalni dio vježbe

4. REZULTATI • Određivanje redukcionih osobina monosaharida i disaharida 1. Tromerova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Felingova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3. Benedictova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

23



4. Nylanderova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5. Reakcija srebrnog ogledala __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

•

Ostale bojene reakcije za dokazivanje ugljikohidrata

1. Molischeva reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Seliwanov test-razlikovanje ketoza i aldoza __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

•

Razlikovanje pentoza i heksoza

1. Tauberova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Bialova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

•

Fermentacija

__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

-

Napisati konačnu reakciju alkoholne i mliječno-kiselinske fermentacije

24


•


Hidroliza i inverzija saharoze

__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

OVJERA VJEŽBE:

25



Vježba broj 3 POLISAHARIDI 1. TEORETSKI DIO Polisaharidi su sastavljeni od većeg broja monosaharida (više od 10) međusobno povezanih glikozidnom vezom i nemaju reducirajuća svojstva. Najčešće imaju koloidni karakter (škrob, glikogen itd.) ili su netopivi u vodi (celuloza). Koloidno stanje se može potvrditi taloženjem. Kod biljaka je velika raznolikost polisaharida koji uglavnom ispunjavaju dvije funkcije: izgrađuju stanične stijenke i stanične potporne elemente, ili su rezervne tvari u obliku škroba i inulina. Hidrolizom polisaharida nastaju postepeno slijedeći proizvodi razgradnje: dekstrini, disaharidi i najzad monosaharidi. Tokom hidrolize gube se karakteristične reakcije polisaharida, a postepeno se javljaju redukujuće osobine nastalih di- i monosaharida. Celuloza – je raširena u biljnom svijetu. Obično je povezana sa ostalim tvarima za izgradnju (lignin). Gotovo čista celuloza nalazi se u staničnim stijenkama dlačica pamuka. Tehnička se dobiva najčešće od drveta te različitim metodama čisti od lignina i drugih popratnih tvari. Prirodna celuloza sadrži oko 8000-12000 jedinica glukoze povezane glikozidnim vezama između C1 i C4. Celuloza se ne rastvara u vodi, ni u razblaženim kiselinama i bazama. Rastvara se u Schweizerovom reagensu [Cu(NH3)4][OH]2. Hidrolizom sa koncentrovanom sumpornom kiselinom se razlaže do glukoze. Hidroliza se pogodno izvodi zagrijavanjem sa hloridnom kiselinom. Tretiranjem celuloze sa dušičnom kiselinom dobiva se nitroceluloza, koja je eksplozivan spoj. Škrob – je biljna rezervna tvar, koja se osobito mnogo nakuplja u sjemnkama (žito) i gomoljima u obliku škrobnih zrnaca. Ekstrakcijom i frakcioniranjem škrob se može razgraditi na dva različita spoja amilozu i amilopektin. Čisti škrob je bijeli prah, nerastvorljiv u hladnoj vodi, a u toploj daje koloidni rastvor. Pod djelovanjem enzima (α i β amilaze) komponente škroba se postepeno razlažu na dekstrine (smjesa polisaharida niže molekularne težine), (+)-maltozu i konačno D(+)-glukozu. Smjesa svih tih spojeva se nalazi npr. u kukuruznom sirupu. Glikogen – je rezervni ugljikohidrat unutar životinjskih stanica. Sadržaj glikogena u jetri ovisi o prehrani jer se već nakon kratkog gladovanja spušta na minimalnu vrijednost. Glikogen je veoma razgranat polisaharid, velike relativne molekulske mase (od 105 do 107) Razlikovanje polisaharida se zasniva na: • rastvorljivosti u vodi (koloidne otopine) • specifičnim reakcijama


Koloidne osobine

1. Taloženje alkoholom Škrob se taloži 95 %-tnim etanolom tako što se na određeni volumen suspenzije škroba u vodi dodaje isti volumen etanola. Otopina se promućka i ostavi da se izvrši taloženje, a zatim talog odvoji filtriranjem. Na filtrat i na talog izvesti reakciju sa jodom. Glikogen se taloži na isti način kao i škrob uz duže stajanje.

2. Taloženje amonijum-sulfatom

26



Na određeni volumen škroba dodaje se isti volumen zasićenog rastvora (NH4)2SO4. Dobro promućka i ostavi da stoji neko vrijeme. Škrob se taloži, a supernatant daje negativnu reakciju sa jodom.

• Reakcije sa jodom 1. Reakcije na škrob Na 5 ml suspenzije škroba u vodi dodati Lugolov reagens (J2 u vodenom rastvoru KJ). Javlja se izrazito plava boja koja je pri jačoj koncentraciji tamno-modra.

2. Reakcija na glikogen Na 5 ml suspenzije glikogena dodavati kap po kap Lugolovog reagensa. Javlja se crvenkasto smeđa boja. Ukoliko je pojava boje otežana može se dodati 1 kap 10 %-nog NaCl i još nekoliko kapi reagensa.

•

Hidroliza škroba

Hidroliza škroba provodi se u kiseloj sredini uz zagrijavanje. Na nekoliko mililitara vodene otopine škroba doda se 2-3 ml HCl (3 mol/dm3) i stavi u ključalo vodeno kupatilo. Poslije svaka dva minuta uzima se po nekoliko kapi hidrolizata i izvodi proba Lugolovim reagensom. Označi se vrijeme koje je potrebno za prvu promjenu boje sa škrobom i nastave probe sve dok reakcija sa jodom ne postane negativna. Dio finalnog hidrolizata neutralizirati sa Na2CO3 i izvesti jednu od reducirajućih reakcija, čiji će pozitivni test ukazati da je škrob razložen na disaharid maltozu, odnosno monosaharid glukozu.

Napomena Tokom hidrolize škrob daje sljedeće međuproizvode: • amilodekstrine, koji sa jodom daju crvenosmeđe obojenje; • eritrodekstrine-sa jodom daje purpurnocrveno obojenje; • ahrodekstrine-sa jodom ne daju boju; • maltozu i glukozu-sa jodm ne daju boju, ali daju pozitivne redukujuće probe. Proizvodi hidrolitičke razgradnje škroba mogu se utvrditi na primjer u hljebu. Na nekoliko komadića hljeba dodati vodu, homogenizirati, ostaviti da stoji izvjesno vrijeme, filtrirati kroz gazu, a zatim kroz filter-papir. Sa malom količinom filtrata izvesti jodnu probu, čija purpurnocrvena boja ukazuje na nastali eritrodekstrin tokm pečenja hljeba. Maltoza i glukoza nastaju hidrolitičkom transformacijom jednog dijela škroba iz brašna pod uticajem enzima amilaze iz pšenice, koja se aktivira temperaturom u toku procesa kvasanja hljeba. U hljebu dakle, postoje istovremeno, škrob, dekstrini, maltoza i glukoza, jer proces kvasanja i pečenja uslovljava prelaz jednog dijela škroba u njegove razgradne proizvode.

•

Hidroliza celuloze

U posudu za hidrolizu staviti usitnjeni filter papir ili mikrokristaličnu celulozu i dodati oko 3 ml hloridne kiseline (6 mol/dm3). Dobija se gusti sirup, koji se pažljivo sipa u vodu (oko 5 ml) i pusti da ključa 30 minuta. Ohladiti, neutralizirati 10%-tnim NaOH (pažljivo uz lakmus papir). Na neutralnom hidrolizatu izvesti neku od redukujućih proba.

Napomena: tokom hidrolize iz celuloze nastaju celobioza i glukoza, koje imaju redukujuća svojstva. 3. ZADACI I VJEŽBE -Odgovorite na slijedeća pitanja:

27



1. Kojom su vezom vezani monisaharidi u di- i polisaharidima?

2. Prikazati strukturu α-D-maltoze?

3. Prikazati reakciju hidrolize α-D-maltoze?

4. Koji monosaharid nastaje kompletnom hidrolizom skroba?

-Izvršiti eksperimentalni dio vježbe

4. REZULTATI •

Koloidne osobina polisaharida

1. Taloženje alkoholom __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Taloženje amonij-sulfatom __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

•

Reakcije sa jodom

1. Reakcija na škrob __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Reakcija na glikogen

28



__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________

•

Hidroliza škroba

•

Hidroliza celuloze

__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

OVJERA VJEŽBE:

29



Vježba broj 4 KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE GLUKOZE POLARIMETRIJSKOM METODOM (ODREĐIVANJE SADRŽAJA GLUKOZE (IZRAŽEN U %) U NEPOZNATOM UZORKU) 1.

TEORETSKI UVOD

Polarimetrija je optička metoda pomoću koje se prati zakretanje ravni polarizirane svjetlosti. To zakretanje ravni polarizirane svjetlosti naziva se optička rotacija, a jedinjenje koje zakreće ravan je optički aktivno jedinjenje. Jedinjenja koja se međusobno razlikuju prema položaju atoma i atomskih grupa u prostoru zovu se stereoizomeri. Ukoliko su ti stereoizomeri i optički aktivni, zovu se enantiomeri ili optički izomeri. Veličina i pravac skretanja ravni polarizovane svjetlosti koje prolazi kroz rastvor neke asimetrične supstance je reprodukujuća i stalna veličina i može se kvantitativno odrediti. Skretanje ravni polarizovane svjetlosti može da bude desno (u pravcu kazaljke na satu) i lijevo (suprotno o pravca kazaljke na satu). Supstanca koja skreće desno ima desnu rotaciju i obilježava se sa (+), a supstanca koja skreće lijevo ima lijevu rotaciju i obilježava se sa (-). Uslov za asimetriju jednog organskog molekula je prisustvo jednog asimetričnog centra u molekuli, odnosno atoma ugljika sa kod kojeg su sve četiri valencije zasićene različitim grupama ili radikalima. U takvom slučaju ne može se kroz centar molekule postaviti nijedna ravan koja bi mogla dati sliku u ogledalu. Osnovu asimetrije kod šećera čine asimetrični C-atomi u molekulu. Najrasprostranjenija aldoza sa asimetričnim C-atomom u molekulu je glicerinski aldehid koji ima dva optički aktivna izomera. (Lizomer i D-izomer). Šećeri koji na asimetričnom C-atomu, najviše udaljenom od karboksilne grupe, imaju strukturnu konfiguraciju L- ili D-glicerinskog aldehida spadaju u L-, odnosno D- steričkog rada bez obzira na rotaciju ravni polarizovane svjetlosti. Npr. D-glukoza može biti u zavisnosti od rotacije D(+)-glukoza ili D(-)-glukoza. Fruktoza spada u desni sterički red, a zakreće ravan polarizovane svjetlosti ulijevo. (D(-)-fruktoza). Instrument pomoću kojeg se određuje vrijednost ugla zakretanja ravni polarizirane svjetlosti zove se polarimetar. Elementi polarimetra su: • Izvor svjetlosti • Sočivo • Prizma-polarizator • Ćelija sa rastvorom optičke supstance • Pravac polarizovane svjetlosti • Prizma-analizator • Skala • Okular Polarizirana svjetlost nastaje kada se svjetlost određene valne dužine iz vidljivog dijela elektromagnetnog spektra propusti kroz sistem Nikolovih prizmi. Znak polarizovane svjetlosti, žute svjetlosti iz svjetlosnog izvora prolazi kroz sabirno sočivo i pada na nepokretnu prizmu, izrađenu od kalcita koja ima osobinu dvostrukog prelamanja svjetlosti. Ona je polarizator svjetlosti. Polarizovani zrak svjetlosti iz polarizatora dolazi na drugu prizmu, koja se okreće oko svoje horizontalne ose. Iz analizatora zrak kroz sistem sočiva dolazi do oka posmatrača.

30



Slika 1: Princip rada polarimetra Svjetlost kod koje su smjerovi oscilacija sređeni na neki način se naziva polarizovana svjetlost. Ako se oscilacije svjetlosnog vektora vrše samo u jednoj ravni, svjetlost se zove ravno ili linearno polarizovana. Ravan u kojoj oscilra svjetlosni vektor zove se ravan osciliranja, a ravan okomita na nju je ravan polarizacije. Ravac oscilitanja i ravan polarizacije su okomite na pravac prostiranja svjetlosti.

Slika 2: Polarizovana svjetlost Svjetlost može biti djelimično polarizovana (kada sadrži talase pretežno sa svjetlosnim vektorom orijentisanim jednom pravcu, a manji broj u ostalim pravcima) kao i cilkularno i eliptično polarizovana. Kada se linearno polarizovana svjetlost propusti kroz pločicu kristala koji ima svojstvo dvojnog prelamanja, razložiće se na dvije okomite komponente, od kojih će jedna imati svojstvo redovnog, a druga neredovnog zraka, pa će im i brzine prostiranja kroz kristal biti različite. Zbog toda će jedan zrak izlaziti iz kristala sa određenim zakašnjenjem, odnosno faznom razlikom, ali će oba imati istu frekvenciju. U zavisnosti pod kojim uglom je postavjena optička os kristala kao i od fazne razlike između dva zraka dobiva se eliptično polarizovana svjetlosti. U specifičnim slučajevima kada je fazna razlika π/2 i ugao optičke osi u odnosu na ravan upadne polarizovane svjetlosti 45o dobiva se cirkularno polarizovana svjetlost, a kada je fazna razlika π dobiva se prava. Vrijednost ugla rotacije ravni polarizirane svjetlosti za neku optički aktivnu tvar ovisi o: • Strukturi molekule • Broju molekula na svjetlosnom putu (koncentraciji) • Temperaturi • Talasnoj dužini • Otapalu Koncentracija rastvora kao i priroda otapala utiču na specifičnu rotaciju. U vodenim rastvorima efekat nije od naročitog značaja. Sa porastom temperature raste vrijednost za specifičnu rotaciju, jer povećana temperatura uzrokuje širenje ćelije sa test-rastvorom. Osim toga, porast temperature smanjuje gustinu rastvora, te je po jedinici dužine ćelije redukuje broj optički aktivnih molekula.Smatra se takođe, da se efekat toplote manifestuje u tendenciji rastvorenih molekula u rastvoru ka asocijaciji, kada pokretljivost grupa oko asimetričnog C-atoma raste. Uticaj talasne dužine upotrebljene svjetlosti je također od velikog značaja. Preporučuje se mjerenje optičke rotacije u ultravioletnom regionu jer se osjetljivost povećava od 100 do 1000 puta. Specifični ugao rotacije nekog enantiomera je veličina ugla rotacije koja potiče od 1,00 g tvari u 1 cm 3 otapala u cijevi dužine 1,00 dm na određenoj temperaturi, valnoj dužini svjetlosti i određenom otapalu.

31



Najčešće se koristi svjetlost valne dužine 589,3 nm (natrijumova D linija). Specifični ugao rotacije ( [α ] TD ) za neku optički aktivnu tvar izračunava se iz izmjerenog ugla rotacije na polarimetru (α) pomoću slijedeće formule:

[α ] TD

=

α l ⋅c

gdje je: l – dužina kivete (dm) T – termodinamička temperatura D – valna dužina volframove lampe koja odgovara žutoj natrijevoj liniji pri 589,3 nm. c – koncentracija tvari (g/cm3) Mnogi optički aktivni spojevi daju otopine kod kojih se vrijednost ugla zakretanja ravni polarizirane svjetlosti mijenja tokom vremena. Ova pojava, koja se naziva mutarotacija (lat. mutare = mijenjati) posljedica je aldehid-poluacetalne ravnoteže: O CH2OH O HO

OH

OH OH

α-D-glukoza

C

H OH

CH2OH O OH

HO OH OH CH2OH

D-glukoza (lančani oblik)

HO

OH OH

β-D-glukoza

Svježe pripremljena otopina α-D-glukoze ima specifični ugao zakretanja +112°, a β-D-glukoze +18,7°. Tokom vremena bilo koji od ova dva oblika glukoze mutarotacijom dostigne konačnu vrijednost specifičnog ugla zakretanja od +52,7°. Prema tome, oblik glukoze koji pokazuje specifični ugao zakretanja od +52,7° predstavlja u stvari ravnotežnu smjesu α i β oblika.

2. EKSPERIMENTALNI DIO Potrebni reagensi

-

Uzorak glukoze za analizu može biti različit: krv, urin (kod dijabetičara), sokovi (ovdje treba naglasiti da je u sokovima velika zastupljenost i drugih šećera tako da bi izmjereni ugao predstavljao ukupnu optičku aktivnost) itd. U ovoj vježbi uzorak za analizu biće pripremljen od strane laboranta otapanjem određene mase tehničke glukoze u poznatom volumenu destilirane vode.

-

Standard-D(+)-glukoza, anhidrovana, Semikem Sarajevo,

Potrebna oprema i pribor

-

Polarimetar (na raspolaganju je model D polarimetar, Bellingham + Stanley Limited, England) sa izvorom napajanja za volframovu lampu i kivetom za uzorak

32

Hemija sa stehiometrijom -

-


Vaga (obzirom da se radi o procentnim koncentracijama, opravdano je koristiti tehničku vagu   boljih karakteristika), na raspolaganju je model CENT-0-GRAM balance, kompanije OHAUS , Florham Park, N.J. 07932, USA, kapacitet 311 g, čaše od 100 ml (5 kom.) menzura od 50 ml stakleni štapić

Optička metoda koja će se koristiti je polarimetrija. Detektija se ostvaruje očitavanjem ugla zakretanja vrši se na odgovarajućoj mjernoj skali koja je povezana sa analizatorom. PROCEDURA ZA RAD Pripremiti po 50 ml 5 %, 10 %, 15 % i 20 %-tne otopine glukoze i držati 30 minuta na temperaturi 40 50 °C, da bi se mutarotacija svela na minimum (U svrhu dobijanja boljih rezultata otopine se pripreme 24h prije mjerenja i ostave na temperaturu od 2 – 8 °C). Prije rada sa otopinama potrebno je naći korekciju (odstupanje od nule na mjernoj skali) polarimetra pomoću destilirane vode. Nakon toga za svaku otopinu izmjeriti ugao zakretanja na polarimetru i nacrtati grafik na milimetarskom papiru gdje je α = f(c), gdje je α mjereni ugao, a c koncentracija glukoze u g/100 ml, odnosno u %. Zatim se mjeri ugao zakretanja otopine glukoze nepoznate koncentracije i na osnovu kalibracione krive očitava ta koncentracija koja se može dobiti i računskim putem koristeći se T jednačinom pravca kalibracione krive. Povezanost mjerenog (α) i specifičnog ( [α ] D ) ugla zakretanja i koncentracije (izražene u % za otapala gustoće približno 1 g/cm3) također je data jednačinom:

c=

α ⋅ 100 [α ] TD ⋅ l

gdje je: l – dužina kivete (dm) T – termodinamička temperatura D – valna dužina volframove lampe koja odgovara žutoj natrijevoj liniji pri 589,3 nm. [α ] TD za vodenu otopinu D-glukoze pri 25 °C i uz upotrebu volframove lampe preračunat na koncentraciju 1 g/ml (100%) iznosi 52,7°.

3. ZADACI I VJEŽBE - Odgovorite na slijedeća pitanja: 1. Šta je stereoizomer, a šta enantiomer! __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Koja je razlika između ugla zakretanja i specifičnog ugla zakretanja i čemu služe ovi parametri? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

33



3. Koristeći se podacima navedenim za specifične uglove zakretanja anomernih oblika glukoze (u teorijskom dijelu) izračunaj procentualnu zastupljenost tih oblika glukoze u stanju ravnoteže!

α (H2O)

Izvršiti eksperimentalni dio vježbe Vrijednosti mjerenja ugla zakretanja α 5% glukoza

α 10% glukoza

α 15% glukoza

-

Koncentracija nepoznatog uzorka

-

Uz izvještaj priložiti i grafik kalibracione krive.

α 20% glukoza

α 25% glukoza

nepoznati uzorak

OVJERA VJEŽBE

34



Vježba broj 5 KVALITATIVNO ODREĐIVANJE LIPIDA 1. TEORETSKI DIO Lipidi su jedinjenja esterskog tipa sa kiselinskom komponentom iz reda viših masnih kiselina, dok je alkoholna komponenta glicerol ili neki visokomolekularni alkohol. Dijele se na: proste i složene lipide. Prosti (jednostavni) lipidi sadrže alkohol i masnu kiselinu, a složeni (kompleksni) sadrže pored alkohola i masne kiseline i neka druga jedinjenja, pa veza može biti i estarska i amidna. Prosti lipidi se dijele prema vrsti alkohola koji esterifikuju masne kiseline na: • gliceride (masti i ulja) -alkohol je glicerin, aesterifikuju se tri masne kiseline • ceride - alkohol je visokomolekularan alifatičan i esterifikuje jednu masnu kiselinu • steride - alkohol je derivat sterola, a esterifikuje jednu masnu kiselinu. Predstavnik je lanolin, ester holesterola i masnih kiselina Složeni lipidi se dijele na: • fosfolipide-sadrži, pored osnovnih sastojaka, i fosfornu kiselinu, H3PO4, esterificiranu na jednu OH grupu glicerola. U zavisnosti od vrste sadržanog alkohola, mogu se dijeliti na glicerofosfolipide (alkohol je glicerol i veza je esterska) i na sfingolipide (alkohol je sfingozin i veza je amidna) • glikolipide-sadrže, pored osnovnih sastojaka, i ugljikohidratsku komponentu. Lipidi su jedinjenja uglavnom nepolarne prirode. Konzinstencija masti i ulja zavisi od sadržaja masnih kiselina. Masti sadrže zasićene masne kiseline, dok ulja sadrže nezasićene masne kiseline. Najčešće zasićene masne kiseline su : palmitinska i stearinska, a najčećše nezasićene kiseline su: oleinska, linolna, linoleinska. Katalitičkom hidrogenizacijom ulja se mogu prevesti u masti (npr. industrijski postupak dobijanja margarina). Prirodne masti ili ulja nisu hemijske jedinke, već sadrže veliki broj raznih glicerida. Opšte karakteristike lipida su rastvorljivost, emulzifikacija i saponifikacija. Zbog svoje nepolarne prirode nerastvaraju se u vodi, ali se rastvaraju u organskim rastvaračima. Energičnim mućkanjem vode i ulja dobija se emulzija, koja nije stabilna i strajanjem se razdvaja na dvije faze. Postoje jedinjenja koja mogu stabilizirati emulzije, a najznačajnija su ona koja se nalaze u probavnim sokovima (npr. Na2CO3, žučne kiseline i njihove soli, itd...). Saponifikacija je alkalna in vitro hidroliza masti i ulja i ima veliki industrijski značaj. Soli viših masnih kiselina nastali ovim postupkom nazivaju se sapuni. Sapuni alkalni metala su topivi u vodi (meki sapuni), a sapuni zemnoalkalnih metala su netopivi u vodi (tvrdi sapuni).


Rastvorljivost

U pet epruveta staviti nekoliko kapi ulja ili malo masti, a zatim dodati 1-2ml: • Hloroforma • Acetona • Hladnog etanola • Zagrijanog etanola • Vode Sadržaj svake epruvete dobro promućkati i zabilježiti svoja zapažanja o rastvorljivosti lipida.

35


•


Emulzifikacija

U tri epruvete staviti nekoliko kapi ulja i malo vode. U prvu eppruvetu dodati 5 kapi 0,5 %-tnog Na2CO3, u drugu 0,5 %-tnog NaHCO3, a u treću nekoliko kapi destilovane vode. Epruvete dobro promućkati i ostaviti da stoje neko vrijeme i posmatrati gdje dolazi do stabilizacije emulzije.

•

Saponifikacija

U epruvetu uzeti 0,5 ml ulja, dodati 10 ml 10%-tne otopine NaOH u etanolu i držati u ključalom kupatilu 5 -10 minuta. Nastaje mliječna emulzija sapuna, na koju se dodaje topla, destilovana voda do otapanja. Podijeliti dobijenu otopinu sapuna na tri epruvete i izvesti slijedeće probe.

1. Isoljavanje sapuna U prvu epruvetu dodati malo čvrstog NaCl. Promućkati, a zatim dodavati i dalje, sve dok se so rastvara. Stvara se tzv. isoljeni sapun (jer je dodan višak elektrolita).

2. Nastajanje sapuna netopivih u vodi U drugu epruvetu dodati 2 ml otopine CaCl 2 (0,5 mol/dm3). Nastaje netopljivi Ca-sapun (tzv. tvrdi sapun).

3. Precipitacija sapuna U treću epruvetu dodavati kap po kap konc. HCl ili konc. CH3COOH i dobro promućkati. Stvara se bijeli talog, jer se zakiseljavanjem, topivi sapun prevodi u netopive masne kiseline.

•

Dokazivanje sastojaka jednostavnih lipida

1.Dokazivanje alkoholne komponente a) Dokazivanje glicerola U suhu epruvetu staviti nekoliko kapi ulja, dodati malo anhidrovanog CaCl2 i grijati na plamenu. Vježbu obavezno raditi u digestoru. Nastali akrolein napada disajne organe.

CH2OH CHOH CH2OH

200 C CaCl2 bezvodni (veze vodu)

O CH2

CH akrolein

C H

b) Dokazivanje holesterola 1. Salkovskijev (Salkowsky) test na holesterol U epruvetu staviti 2ml hloroformne otopine holesterola. Pažljivo dodati 2ml koncentrovane H 2SO4 i blago promućkati. Ostaviti kratko vrijeme i utvrditi da gornji hroloformni dio postaje crven, a donji žut sa zelenom fluorescencijom.

2. Libermanova (Liebermann) reakcija

36



U epruvetu nasuti oko 2ml hloroformne otopine holesterola, dodati 10 kapi anhidrida acetatne kiseline i 2 kapi konc. H2SO4. Izmješati staklenim štapićem. Kao pozitivan test javlja se prvo ružičasto, zatim plavo obojenje, koje prelazi u zelenkasto. Holesterol se djelovanje H2SO4 dehidratizira i oksidira. Iz dvije molekule holesterola kondezacijom nastaju ugljikovodici sa dvostrukim vezama koji daju različite proizvode H2SO4 i acetanhidridom, što je uzrok prelaza boje jedne u drugu boju.

2. Dokazivanje kiselinske komponente a) Dokazivanje masnih komponenti Kao dokaz prisustva masnih kiselina služe pozitivne reakcije saponifikacije i precipitacije sapuna.

b) Dokazivanje nezasićenih masnih kiselina Na 2 ml hroloformne otopine uzoraka lipida (izvestu probu na puter i jestivo ulje) dodavati u kapima otopinu joda u hloroformu uz mućkanje i blago zagrijavanje na vodenom kupatilu. Ukoliko je u uzorku prisutna neka od nezasićenih masnih kiselina, otopina joda će se obezbojiti.

•

Dokazivanje prisustva složenih lipida i njihovih sastojaka

1. Dokazivanje prisustva lecitina Na otopinu žumanca jajeta dodati zasićenu alkoholnu otopinu kadmij-klorida. Ukoliko u uzorku ima lecitina izdvaja se bijeli talog kompleksnog spoja glicerolfosfolipida sa kadmijem. Također, izvesti reakciju na alkoholnu otopinu uzorka lecitina poznate čistoće.

2. Hidroliza lecitina Staviti u epruvetu 6 ml otopine lecitina, dodati 2-3 ml otopine NaOH i pažljivo kuhati 5 minuta. Hidrolizat je potrebno razdijeliti u četiri epruvete.

a) Dokazivanje holina (trimetiletanolamin) Pri ključalju, tokom hidrolize, može se osjetiti karakterističan miris rasola, svojstven trimetilaminu, koji nastaje iz holina. Postavleni crveni lakmus papir (na otvor epruvete u kojoj se vrši hidroliza) poplavi ulijed isparavanja baznog trimetilamina.

b) Dokazivanje fosfata Na 2 ml hidrolozata lecitina dodavati 10 %-tnu HNO3 do neutralizacije. Na neutraliziranu otopinu dodati 2 ml amonijum-molibdata, pri čemu nastaje karakteristična žuta boja amonijum-fosfomolibdata.

c) Dokazivanje kisele komponente a) Dokazivanje masnih kiselina Ovaj eksperiment zasniva se na istom principu kao i dokazivanje prisustva masnih kiselina (saponifikacija i precipitacija). U ovom slučaju izvešćemo samo precipitaciju. Na 2-3 ml hidrolizata lecitina dodavati u kapima 10 %-tnu HCl do kisele reakcije. U kiseloj sredini se iz natrijevih soli masnih kiselina (nastalih baznom hidrolizom) stvaraju slobodne masne kiseline koje

37



isplivavaju na površinu otopine i grade masni, odnosno uljasti sloj. Jaka kiselina HCl istiskuje slabu organsku kiselinu.

b) Dokazivanje prisusutva nezasićenih masnih kiselina Na 2 ml otopine nehidroloziranog lecitina ili njegovog ekstrata dodavati jod u hloroformu (raditi u digestoru). U kapima uz mućkanje i zagrijavanje.

3. Dokazivanje glicerola Dokazuje se na isti način kao i kod prostih lipida s tim što se uzima suhi ekstrakt lecitina (akroleinska proba).

3. ZADACI I VJEŽBE -

Odgovorite na slijedeća pitanja:

1. Napiši stukturu linoleinske kiseline? Zašto se ova kiselina naziva nezasićena masna kisleina?

2. Tačka topljenja stearinske kiseline je 700C, a oleinske 40C. Objasni razliku? _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ 3. Šta je funkcionalna grupa kod triglicerida?

4. Prikazati jednačinu esterifikacije i hidrolize gliceriletanoata?

5. Koji tip rastvarača je potreban da bi se otklonila fleka od ulja? Zašto? _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ -


4. REZULTATI •

Rastvorljivost

38



__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

•

Emulzifikacija

__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

• Saponifikacija 1. Isoljavanje sapuna __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

2. Nastajanje sapuna netopljivih u vodi __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

3. Precipitacija sapuna __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

• Dokazivanje sastojaka jednostavnih lipida 1. Dokazivanje alkoholnih komponenti __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

a) Dokazivanje glicerola __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

b) Dokazivanje holesterola 1.Salkovskijev (Salkowsky) test na holesterol __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

2. Libermanova (Liebermann) reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

2. Dokazivanje kiselinske komponente a) Dokazivanje masnih kiselina - saponifikacija 39



__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

b) Dokazivanje nezasićenih masnih kiselina __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

• Dokazivanje prisustva složenih lipida i njihovih sastojaka 1. Dokazivanje prisustva lecitina __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

2. Hidroliza lecitina __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

a) Dokazivanje holina __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ____________________________________________________ _____________________________

b) Dokazivanje fosfata __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

c) Dokazivanje kisele komponente a) Dokazivanje prisustva masnih kiselina __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

b) Dokazivanje prisustva nezasićenih masnih kiselina __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

3. Dokazivanje glicerola __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

OVJERA VJEŽBE:

40



Vježba broj 6 ODREĐIVANJE VAŽNIJIH HEMIJSKIH KONSTANTI UZORAKA LIPIDA 1. TEORETSKI DIO Za karakterizaciju uzoraka lipida, u praksi, se pored ostalog, najčešće koriste hemijske i fizičke konstante kao na primjer: saponifikacijski broj, kiselinski broj, esterski broj, jodni broj, određivanje neosapunjenih tvari, indeks loma itd. Saponifikacijski broj predstavlja broj miligrama KOH ili NaOH potreban za potpunu saponifikaciju 1g masti. Iz vrijednosti saponifikacijskog broja dobija se uvid o zastupljenosti masnih kiselina u uzorcima lipida. Ovaj broj je manji ukoliko je molekulska masa masnih kiselina veća. Kiselinski broj je broj miligrama KOH ili NaOH potreban za neutralizaciju slobodnih masnih kiselina u 1 g masti. U praksi ima važnost pri određivanju ispravnosti namirnica, ukazuje na proces raspadanja tokom stajanja masti ili ulja. Esterski broj predstavjlja razliku saponifikacijskog i kiselinskog broja, a ukazuje na broj vezanih – COOH grupa. Jodni broj je broj grama J2 koji se adira na 100 g masti ili ulja. Ovaj broj je veći ukoliko su masti ili ulja tečniji tj. ukoliko je sadržaj nezasićenih masnih kiselina, na čije dvostruke veze se i vrši adicija joda, veći.


Određivanje saponifikacijskog broja

Odvagati 0.5-1,0 g masti u suhoj erlenmajerovoj tikvici, dodati 50 ml NaOH etanol (c= 0,1 mol/l) i kuhati jedan sat na vodenom kupatilu uz povratno hladilo. Nakon toga smjesa se retitrira sa o,1 mol/l HCl uz indikator fenolftalein. Dobijeni volumen predstavlja volumen HCl koji je utrošen na titraciju viška NaOH (koji se nije saponificirao). Pored glavne izvodi se i kontrolna proba koja sadrži istu količinu alkohola i baze koji su dodani pri saponifikacijin (radi uštede hemikalija i vremena može se odmjeriti 10,00 mL o.1 M NaOH i titrirati sa HCl, čiji se utrošak u tom slučaju množi sa 5), a titrira se sa HCl. Utrošena količina HCl odgovara količini NaOH koja je bila prisutna prije početka procesa saponifikacije. Iz razlike ove količine i količine NaOH koji se nije saponificirao dobije se količina NaOH koja se saponificirala sa masnim kiselinama u uzorku masti. Ako je rađeno sa tačno 1 g masti dobijena masa NaOH izražena u miligramima, predstavlja saponifikacijski broj, a ako to nije slučaj preračunati na 1g.

•

Određivanje kiselinskog broja

Odvagati 1 g lipida i u digestoru otapati u 30 ml smjese alkohol-eter (1:1) uz blago grijanje na vodenom kupatilu. Nakon što se uzorak otopi, dodati dvije kapi indikatora fenolftaleina u etanolu sa = 0,1 mol/dm3 otopinom KOH do pojave ružičaste boje. Zabilježiti utrošak KOH, a potom blago

41



zagrijavati probu na vodenom kupatilu. Ukoliko ružičasta boja nestane, nastaviti titraciju dok boja ne bude stabilna. Za izračunavanje kiselinskog broja (K. Br.) potrebno je odrediti tačnu koncentraciju KOH. U tu svrhu sipati 10 ml otopine KOH/etanol u tikvicu, dodati 1-2 kapi indikatora fenolftaleina u etanolu i titrirati sa 0,1000 mol/dm3 otopinom HCl do nestanka ružičaste boje. Zabilježiti utrošak HCl i na osnovu reakcije HCl i KOH izračunati koncentraciju KOH. Nakon toga izračunati K.br. po obrazcu:

K.br. = m(KOH) = c(KOH) x V(KOH) x M(KOH) V(KOH) - volumen KOH utrošen za titraciju uzorka lipida 3. ZADACI I VJEŽBE -Odgovorite na slijedeća pitanja: 1. Zašto se produkt saponifikacije naziva so? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

2. Zašto su sapuni više rastvorljivi u vodi nego masne kiseline? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

3. Kako sapun otklanja uljne fleke? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ____________________________________________________

-


4. REZULTATI •

Određivanje saponifikacijskog broja

42

Hemija sa stehiometrijom •


Određivanje kiselinskog broja

OVJERA VJEŽBE:

Vježba broj 7

KVALITATIVNO ODREĐIVANJE PROTEINA 1. TEORETSKI DIO Aminokiseline su organske kiseline koje u svojoj molekuli sadrže najmanje jednu amino i jednu karboksilnu grupu. Prema broju karboksilnih, odnosno amino-grupa aminokiseline dijelimo na: • Monoamino-monokarboksilne koje se dalje dijele na alifatske nerazgranate (glicin, alanin, β-alanin, α-aminobuterna kiselina, γ-aminobuterna kiselina, norvalin, norleucin); alifatske razgranate (valin, leucin, izoleucin); oksiaminokiseline (serin, treonin); tioaminokiseline (cistein, cistin, homocistein, metionin); ciklične aminokiseline (fenil-alanin, tirozin, triptofan, histidin, prolin, oksiprolin). • Monoamino-dikarboksilne kiseline (asparaginska, glutaminska, oksiglutaminska) • Diamino-monokarboksilne kiseline (ornitin, citrulin, arginin, lizin, oksilizin). Prema sposobnosti ljudskog organizma da ih sintetiše dijelimo ih u dvije grupe:

43

Hemija sa stehiometrijom • •


Esencijalne koje moramo unositi stalno unositi putem hrane (valin, leucin, izoleucin, metionin, treonin, fenil-alanin, triptofan i lizin) Neesencijalne koje organizam sam sintetizira

Histidin je esencijalna kiselina za pacove, a neki autori ubrajaju i arginin kao esencijalnu kiselinu za čovjeka koja se može sintetizirati u organizmu, ali sinteza se sporo odvija. Opšte osobine aminokiselina • Rastvorljivost - Prirodne aminokiseline su kristalne i bezbojne supstance. Sve su osim prolina i oksiprolina rastvorljive u vodi, a ne u alkoholu i drugim organskim rastvaračima. • Amfoterne osobine aminokiselina - Zbog toga što imaju amino i karboksilnu grupu tj. baznu i kiselu komponentu tako u baznom području pH disociraju karboksilnom, a u kiseloj amino komponentom. Prema tome aminokiseline su amfoterna jedinjenja. Vrijednost izoelektrične tačke se dobije ako se vrijednosti negativnog logaritma konstante disocijacije kisele (pK1) i bazne grupe (pK2) saberu i podijele sa dva.

• • •

Optička aktivnost - Sve prirodne aminokiseline osime glicina, β-alanina, γ-aminobuterne kiseline imaju jedan ili više asimetričnih C-atoma u molekuli pa su optički aktivne supstance. Konfiguracija aminokiselina - Sve prirodne aminokiseline imaju lijevu konfiguraciju (L). Reaktivnost aminokiselina - Aminokiseline stupaju u reakcije s čitavim nizom jedinjenja, pri čemu nastaju derivati, pomoću kojih se neke aminokiseline mogu identificirati, a druge se kvantitativno određuju, a neke od njih se mogu izolirati. Kao amfoterna jedinjenja reaguju sa jakim kiselinama i bazama pri čemu nastaju soli. Opšta hemijska svojstva su povezana prisutnošću karboksilne i aminogrupe, a s druge strane prisutnost reaktivnog R ostatka objašnjava specifična svojstva pojedinh aminokiselina.

Reakcije karakteristične na karboksilnog grupi su:  Esterifikacija alkoholima u prisustvu jakih kiselina  Reakcija dekarboksilacije i nastajanje amina (moguća je hemijskim i enzimskim putem)  Stvaranje amida (reakcija aminokisliena sa aminima)  Za većinu aminokiselina pK1 ≈ 1,5 – 2,5 pK2 ≈ 9,5 – 10, 5 pHi ≈5,5-6,5 Reakcije karakteristične na amino grupi su:  Dezaminacija (sa nitratnom kiselinom, uz nastajanje kiseline (alkohola) i oslobađanje nitrogena)  Stvaranje imina (kondezacijom sa aromatiskim aldehidima)  Reakcije sa fenilizotiocijanatom u baznoj sredini

44



 Denziliranje aminokiselina sa denzilhloridom pri čemu nastaje fluorescentni derivat.

45



Tabela 1: Strukturne formule i oznake aminokiselina

Alanin (Ala / A)

Arginin (Arg / R)

Asparagin (Asn / N)

Asparaginska kiselina (Asp / D)

Cistein (Cys / C)

Glutaminska kiselina (Glu / E)

Glutamin (Gln / Q)

Histidin (His / H)

Izoleucin (Ile / I)

Leucin (Leu / L)

Lizin (Lys / K)

Metionin (Met / M)

Fenilalanin (Phe / F)

Prolin (Pro / P)

Serin (Ser / S)

Treonin (Thr / T)

Triptofan (Trp / W)

Tirozin (Tyr / Y)

Valin (Val / V)

Glicin (Gly / G)

Dvije ili više aminokiselina se mogu međusobno povezati tako da čine amid između α-karboksilne skupine jedne aminokiseline i α-amino skupine druge aminokiseline. Tu posebnu vrstu veze E. Fischer nazvao je peptidna veza.

46



Molekule koje sadrže dvije amonokiseline povezane peptidnom vezom su dipeptidi, a koje sadrže više aminokiselina međusobno povezanih u lanac peptidnim vezama zovu se tripeptidi, tetrapeptidi, pentapeptidi itd. Peptidi izgrađeni od 10 amnikiselina su oligopeptidi, a sa više od 10 polipeptidi. Peptidi imaju vrlo bitnu biološku ulogu. Najpoznatiji peptidi su sa jedne strane hormoni (oksitocin, vazopresin, adrenokortikotropni hormon, inzulin), a sa druge antibiotici (penicilin). Imaju ulogu i kao moždani neuroprijenosnici kao što je glutation. Molekule biološkog porijekla izgrađene uglavnom od aminokiselina međusobno povezanih petidnom vezom u dugačke lance zovemo proteini. Za razliku od peptida, proteini imaju karakterističnu višestepenu strukturu. Njenu osnovu predstavlja polipeptidni lanac, u kome su aminokiseline poredane određenim redom i povezane peptidnim vezama. Ovaj lanac se označava kao primarna struktura proteina, a redoslijed aminokiselina u njemu je genetski uslovljen, s obzirom da poziciju jedne aminokiseline u lancu determinira položaj odgovarajućeg tripleta purinskih i pirimidinskih baza u strukturi odgovarajuće DNK odgovorne za sintezu dotičnog peptidnog lanca. Usljed karakteristika bočnih grupa, primarna struktura uslovljava i sve ostale stupnjeve strukture, a to su : sekundarna, tercijarna, kvarterna. Proteini se mogu podijeliti na: • Proste (koji predstavljaju polipeptide koji su izgrađeni iz velikog broja aminokiselina međusobno povezanih peptidnim vezama) Tu spadaju protamini i histoni, prolamini i glutelini, skleroproteini, albumini i globulini • Složene (pored polipeptidnih lanaca sadrže i neku neproteinsku komponentu vazanu za te lance). Tu spadaju hromoproteidi, nukleoproteidi, glikoproteidi i fosfoproteidi. Proteini se dokazuju velikim brojem bojenih reakcija, karakterističnih za funkcionalne grupe i radikale pojedinih aminokiselina. Taložne reakcije također mogu poslužiti za kvalitativno dokazivanje proteina, a neki zahvaljujući tom svojstvu mogu se razdvojiti. Taložne reakcije mogu se podijeliti na reverzibilne (sa solima lakih metala i amonijevim solima) i ireverzibilne (sa solima teških metala, kiselinama i alkaloidnim reagensima). Ireverzibilno taloženje je ustvari denaturisanje proteina.


Bojene reakcije za određivanje proteina

1. Ninhidrinska reakcija Napravi se svježa 0,2 %-tna vodena otopina ninhidrina. Zagrijavanjem otopine proteina sa otopinom ninhidrina nastaje plava boja. Ovu reakciju daju proteini koji imaju slobodnu amino grupu i sve amonokiseline.

2. Ksantoproteinska reakcija Uzmi u epruvetu malo razrijeđene otopine proteina (npr. otopina bjelanca jajeta i otopina želatine) i istu količinu konc. HNO3. Zagrij oprezno do ključanja i pri tome će nastati žuti talog. Na ohlađeni talog dodaj konc. NH4OH, žuta boja prelazi u narandžastu. Reakcija je pozitivna kod proteina koji u

47



sebi sadrže aromatske amonokiseline. Reakciju izvesti i sa otopinom triptofana ili tirozina (aromatske aminokiseline) i nekim od alifatskih aminokiselina (alanin, glicin), te uoči razlike.

3. Biuret reakcija (Reakcija na peptidnu vezu) Na 2 ml otopine proteina dodaj 2-3 ml 10 %-tne otopine NaOH i 1-2 kapi 1 %-tne otopine CuSO 4 nemiješajući. Na površini nastaje plavi talog Cu(OH)2, a između tih plavo obojenih dijelova ljubičasti prsten kao znak pozitivne Biuret reakcije. Reakciju izvesti i sa nekom od aminokiselina.

4. Cisteinska proba Na 2 ml otopine proteina dodaj 2-3 ml 5 %-tne otopine NaOH i nekoliko kapi 5%-tnog olovnog acetata. Zagrijavanjem nastaje crni talog PbS. Reakcija je pozitivna kod proteina koji sadrže aminokiseline sa sumporom. Uraditi reakciju i sa cisteinom (aminokiselina sa sumporom) i nekom od aminokiselina koje ne sadrže sumpor, te uoči razliku.

5. Adamkijevičeva reakcija Na 2 ml razrijeđene otopine bjelanca jajeta dodaju se 4 ml konc. glacijalne acetatne kiseline i epruveta protrese. Zatim se pažljivo dodaje niz zid epruvete, 2 ml konc. H2SO4. Nastaje ljubičasti prsten na nivou kontakta dvije tečnosti. Ako se lagano promućka (uz hlađenje), ljubičasta boja difunduje u cijelu otopinu. Reakcija je karakteristivna za triptofan (slobodan ili u sastavu proteina). Zasniva se na reakciji između glioksalne kiseline (sadržane u glacijalnoj acetatnoj kiselini) i triptofana, a nastali spoj ima ljubičasto obojenje kada dođe u kontakt sa H2SO4.

• Taložne reakcije 1. Reverzibilno taloženje Otopini proteina dodati čvrsti amonijum-sulfat. Nastale talog koji dodatkom vode nestaje.

2. Ireverzibilno taloženje Uzmi u epruvetu 2-3 ml otopine proteina, dodaj nekoliko kapi konc. Acetatne kiseline i kap po kap kalijum ferocijanata [K4Fe(CN)6]. Nastaje bijeli talog koji se dodatkom viška reagensa ne otapa.

•

Uticaj pH kod taloženja toplotom

U tri epruvete nasuti po 2 ml otopine bjelanceta jajeta. U prvu dodati nekoliko kapi acetatnog pufera (pH = 4,7), u drugu 2 kapi konc. HCl, a u treću 2 kapi 10 % NaOH. Lagano zagrijavati i uočiti gdje dolazi do taloženja. Nakon toga u epruvetama gdje nije došlo do taloženja dodati 0,5 ml acetatnog pufera te ponovo zagrijavati. Komentirati učinak pH.

•

pHi kazeina mlijeka

U pet epruveta stavljaju se različiti omjeri acetatne kiseline (c = 0,2 mol/dm3) i vode i na to dodaje po 0,2 ml otopine kazeina (o,4 % u 0,2 mol/dm3 Na-acetatu). Dodavanjem kazeina u Na-acetatu u epruvete koje sadrže različite omjere acetatne kiseline postiže se skala pH od 3,8 do 5,3: Br. epruvete 1 2 3 4 5

ml acetatne kiseline 1,6 0,8 0,4 0,2 0,06

ml vode 0,4 1,2 1,6 1,8 1,94

ml kazeina 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

pH 3,8 4,1 4,4 4,7 5,3

48



U svim epruvetama se javlja zamućenje različitog intenziteta, uz taloženje nakon izvjesnog vremena. U epruveti u kojoj je najveća količina taloga postignut je pHi, pa treba zabilježiti tu vrijednost.

3. PRIPREMNA VJEŽBANJA 1. Za koje spojeve je karakterisitčna Ninhidrinska reakcija i prikazati njen mehanizam?

2. Cisteinilalanin (Cys-Ala) je dipeptid sastavljen iz aminokiselina cisteina i alanina. Predloži metodu kojom možeš dokazati strukturne sastojke ovog dipeptida? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 3. Opiši primarnu, sekundarnu, tercijarnu i kvarternu strukturu proteina? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________

4. REZULTATI •

Bojene reakcije za određivanje proteina

1. Ninhidrinska reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

2. Ksantoproteinska reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

49



3. Biuret reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

4. Cisteinska proba __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

5. Adamkijevičeva proba __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

•

Taložne reakcije

-Reverzibilono taloženje __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

-Ireverzibilno taloženje __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

•

Uticaj pH od taloženja toplotom

•

pHi kazeina mlijeka

__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

OVJERA VJEŽBE:

50



Vježba broj 8

HIDROLIZA I HROMATOGRAFIJA PROTEINA 1. TEORETSKI DIO Denaturacija i proteoliza Višestepena struktura proteina učvršćuje se vezama različite jačine. U stvaranju primarne strukture angažirane su isključivo kovalentne peptidne veze. Međutim u formiranju i obezbjeđenju drugih (natprimarnih) α-struktura mnogo veći značaj pripada slabim vezama, prije svega vodikovoj vezi. Zbog toga će za razaranje ovih veza, a i time za narušavanje pojedinih stupnjeva strukture proteina biti potrebno primijeniti sile različite jačine. Svi ovi procesi mogu se podijeliti u dvije skupine: • To su procesi u kojima se narušavaju natprimarni stupnjevi strukture, bez afekcije osnovnog polipeptidnog lanca tj. primarne strukture. Ti procesi se ostvaruju primjenom slabijih sila, a nazivaju se procesima denaturacije proteina. Kao denaturišući agensi mogu se primijeniti fizički i hemijski postupci kao što su: zagrijavanje, djelovanje rengenskih ili ultravioletnih zraka, djelovanje ultrazvuka, promijene pH dodavanjem kiselina ili baza, efekti nekih specifičnih hemijskih agenasa (urea), te enzimi. • Procesi kojima se narušava primarna struktura proteina tj. kojima se cijepa polipeptidni lanac, predstavljaju procese proteolize ili hidrolize proteina, čime nastaju krupniji ili sitniji fragmenti (peptidi) označeni kao albuminoze i peptoni. Proteoliza se može postići djelovanjem proteolitičkih enzima (pepsin, tripsin i dr), kao i kuhanjem rastvora proteina uz dodatak mineralnih kiselina. Hidroliza proteina može se vršiti kiselinama, bazama i enzimima. Od kiselina se najčešće radi sa rastvorom HCl koncentracije 6 mol/dm3 (kuhanjem 10 sati na temperaturi 80-90 ° C) ili sa 35 % H2SO4, sa kojom se hidroliza vrši 12 – 14 sati na temperaturi 105 – 110 °C. Hromatografija Aminokiseline iz hidrolizata proteina se mogu odvojiti i identificirati primjenjujući metodu hromatografije (npr. papirne, tankoslojne, jonoizmjenjivačke, tečne hromatografije pri visokom pritisku – eng. High performance liquid chromatography HPLC itd.). Hromatografija na tankom sloju spada u podionu hromatografiju kod koje se razdvajanje zasniva na kontinuiranoj raspodjeli molekula hromatografirane supstance između dviju faza: stacinarne (silika gel, koji se u tankom sloju nanosi na staklene ploče odgovarajučih dimenzija) i mobilne (smjesa otapala obično različite polarnosti). Različite molekule putovat će različitom brzinom (raspodjela zavisi od strukture), a ta brzina je definirana Rf vrijednošću kao benzdimenzionalnim parametrom:

Rf = d1/d2 d1 – put hromatografirane molekule (cm)

d2 – put mobilne faze – eluenta (cm)

2. EKSPERIMENTALNI DIO Uzeti 1 g proteina i 15 ml 6 mol/dm3 HCl. Hidroliza se može vršiti u tikvici sa povratnim hladilom ili u staklenoj ampuli koja je uronjena u vodeno kupatilo na navedenoj tmeperaturi ili se može držati u sušnici na toj temperaturi. Prije aplikacije potrebno je hidrolizat proteina upariti na mali volumen. Kao mobilna faza za tankoslojnu hromatografiju aminokiselina služi: hloroform : metanol : 17 % otopina NH3 u volumnom omjeru 40:40:20. Od čistih aminokiselina uzeti npr. 0,5 % otopine alanina, triptofana, lizina i leucina (kao standarda).

51



Na lijevu poziciju startne linije aplizirati po pet kapljica (ne aplicirati narednu kapljicu dok se prethodna ne osuši) hidrolizata bjelanceta, zatim standarde aminokiselina, a na desnu poziciju hidrolizat 1%-tnog kazeina. Nakon što se kapljice osuše, ploča se stavi u posudu za razvijanje (u kojoj se već nalazi mobilna faza) pazeći da mobilna faza bude barem 1 cm ispod startne linije. Ploča se vadi kada mobilna faza dospije 2 cm prije kraja ploče i ostavi da se osuši na sobnoj temperaturi u digestoru. Zatim se ploča prska sa 0,2 % ninhidrinom u acetonu i nakon 2-3 minute ostavi u sušnicu na 90 °C 10 minuta. Pojaviće se različito obojene mrlje (najčešće ljubičaste, ali boja može da bude na prijelazu od narandžaste, preko crvene do ljubičaste). Ako se Rf vrijednost obojene mrlje iz uzorka proteinskog hidrolizata poklapa sa Rf vrijednošću obojene mrlje standardne aminokiseline može se reći da je data aminokiselina identificirana u ispravnom uzorku.

3. PRIPREMNA VJEŽBANJA 1. Navesti najznačajnije biološke uloge proteina? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

2. Struktura i hemijski sastav jajeta? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

3. Topivost proteina i faktori koji utiču na topivost? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

4. REZULTATI •

Hromatografija

Uzorak Hidrolizat bjelanceta Alanin Triptofan Lizin Leucin Hidrolizat 1% kazeina

d1

d2(mobilna faza)

Rf

52



Komentar rezultata __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

OVJERA VJEŽBE:

53



Vježba broj 9

ENZIMI 1. TEORETSKI DIO Enzimi su globularni proteini tercijarne ili kvarterne sturkutre koji na površini imaju većinu polarnih aminokiselinskih ostataka, doku su nepolarni ostaci okrenuti prema unutrašnjosti molukule. Ovako organizovane proteinske molekule nazvane enzimi imaju visoku kalatitičku moć i specifičnost za pojedine hemijske reakcije i supstrate u živim organizmima. Katalitička moć enzima se manifestira njegovom sposobnošću da smanjuje energiju hemijskih reakcija. Enzimi ubrzavaju reakcije i vrlo često kataliziraju samo jednu hemijsku reakciju ili skup vrlo srodnih reakcija, a specifičnost za supstrat je najčešće potpuna.

U trenutku katalitičke promjene supstrat je s enzimom povezan uglavnom slabim nekovalentnim vezama (vodikove, hidrofobne ili Van der Walsove veze) što omogućava brzu izmjenu molekula supstrata na enzimu. Ta izmjena se događa u jednom dijelu enzimu nazvanom aktivno mjesto. Aktivno mjesto predstavlja mali broj aminokiselina smještenih u unutrašnjosti u hidrofobnom dijelu proteinske molekle, čije prostorno uređenje odgovara molekuli supstrata. Taj prostoj u hidrofobnoj unutrašnjosti je odgovoran za njegovu katalitičku moć. Internacionalnom konvencijom enzim se svrstava u jednu od šest vrsta na osnovu hemijske reakcije koju katalizira. Svaka vrsta se dijeli prema prirodi hemijske grupe, koenzima i drugih grupa uključenih u reakciju. Saglasno pravilima Evropske komisije (EC), svaki enzim može se označiti jedinstvenim kodom od četiri broja i nedvosmislenim sistemtivnim imenom zasnovanim prema kataliziranoj reakciji. Šest vrsta enzima su: • Oksidoreduktaze, koje prenose atome hidrogena, oksigena ili elektrone od jednog substrata na drugi • Transferaze, koje prenose hemijske grupe između substrata • Hidrolaze, koje kataliziraju hidrolitičke reakcije • Liaze, koje razlažu substrate reakcijama različitim od hidrolize • Izomeraze, koje pretvaraju izomere jedanu drugi intermolekularnim premještanjem

54

Hemija sa stehiometrijom •


Ligaze (sintetaze), koje kataliziraju nastajanje kovalentne veze, sa odgovarajućim cijepanjem nukleozid trifosfata.

Jedinica za enzimsku aktivnost Jedna enzimska jedinica definira se kao količina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25°C, 1 bar), razloži 1 μmol supstrata za jednu minutu. Specifična aktivnost enzima može se izraziti kao broj enzimskih jedinica po miligramu proteina. Nova internacionalna jedinica (IU) određena od strane EC je katal (kat). Definira se kao količina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25 °C, 1 bar) razloži 1 mol supstrata za jednu sekundu. Iz praktičnih razloga u upotrebi su manje jedinice kao mikrokatal (μkat), pikokatal (pkat), nanokatal (nkat) itd. Amilaza spada u grupu hidrolaza koja se zove karbohidraze, jer kataliziraju hidrolizu oligo- i polisaharida 8složenih karbohidrata). Hidroliza se vrši razlaganjem glukozidnih veza između monosaharida, koji izgrađuju oligi- i polisaharide. α-amilaza se nalazi u svim organima čovjeka i drugih sisara (ubikvitaran enzim), a najveća aktivnost je u pljuvački (gdje se nalazi ptijalin) i u pankreasnom soku (gdje se naziva dijastaza). Specifična je za 1α-4 glikozidna veza u polisaharidima (škrob i glikogen). Pošto ne može da cijepa 1α-6 glikozidnu vezu, razlaže se oko 80% molekule škroba tj. potpuno hidrolizira amilozu i amilopektin. Krajnji produkti koji nastaju hidrolizom škroba ovim enzimom su maltoza i granični dekstrini koji nastaju na mjestima grananja u amilopektinu, tj. gdje se nalazi 1α-6 glikozidna veza. Zato se α-amilaza još naziva i endoamilaza (unutrašnja) ili,dekstrinogena amilaza. Za razliku od α-amilaze, β-amilaza je biljnog porijekla. Specifična je, takođe, za 1α-4 glikozidnu ezu, ali djeluje na krajevima polisaharidnog lanaca. Zato novi nazivegzoamilaza (spoljašnja) i krajni produkti njenog djelovanja su molekule maltoze. Pepsin spada u peptid-hidrolaze, enzime koji kataliziraju hidrolizu proteina i peptida na niže produkte. Hidroliza proteina i peptida se vrši razlaganjem peptidnih veza između aminokiselina, koje izgrađuju protein odnosno peptide. Pepsin je izrazito aktivan u kiseloj sredini i djeluje na peptidne veze unutar molekula proteina. Aktivan je na prirodne i denaturirane proteine. Ima proteolitičko i laktokoagulirajuće djelovanje. Poznato je da pepsin ima i dodatno djelovanje kod odraslih sisavaca, a to je koagulacija mlijeka. Ovu funkciju kod mladih sisavaca vrši enzim himozin koji nije zastupljen u želučanom soku odraslih sisavaca. Koagulacija mogućava duže zadržavanje u želucu i samim tim veći proteolitički efekat pepsina.


Dokazivanje aktivnosti i termolabilnosti ptijalina (α-amilaze iz pljuvačke)

Skupiti 2-3ml pljuvačke, profiltrirati je, podjeliti na dva dijela. Jedan dio proključati na plameniku ili rešou. U šest epruveta pripremiti smjese prema datoj tabeli: Epruveta Škrob Lugolov reagens Neprokuhana pljuvačka Prokuhana pljuvačka

I

II

III

IV

V

VI

2-3ml

2-3ml

2-3ml

2-3ml

2-3ml

2-3ml

2-3 kapi

2-3 kapi Nekoliko kapi

2-3 kapi

Nekoliko kapi Nekoliko kapi

Nekoliko kapi

Svih šest epruveta staviti u vodeno kupatilo na 37 °C na inkubiranje od 30 minuta. Nakon tog vremena izvaditi epruvete i zaključiti šta se desilo u epruvetama.

55



Izvesti Felingovu reakciju na sadržaje u prvoj, trećoj i petoj epruveti. U svaku dodati po 1-2ml pripremljenog Felingovog reagensa i zagrijavati do ključanja. Zaključiti šta se desilo u ovim epruvetama.

•

Praćenje aktivnosti pepsina

1. Proteolitička aktivnost U tri epruvete odmjeriti po 1,0 ml 1 % otopine pepsina u 0,5 % otopini HCl. U četvrtu epruvetu odmjeriti 1,0 ml iste otopine pepsina, ali prethodno prokuhanog na 70 - 100 °C (u tu svrhu za čitavu grupu studenata odmjeriti manju čašu 10 ml otopine pepsine i prokuhati). Nakon toga dodaj po slijedećoj šemi u epruvete:  Epruveta 1 dodaj 4 ml destilovane vode  Epruveta 2 dodaj 4 ml 0,5% HCl  Epruveta 3 dodaj 4 ml 0,5% Na2CO3  Epruveta 4 dodaj 4 ml 0,5% HCl U svaku epruvetu dodati tačno 1,00 ml svježeg, razrijeđenog (1:1) bjelanca jajeta, a zatim ih staviti u termostat pri 36,5 °C i držati 30 minuta. Nakon toga vizuelno ocjeniti u kojoj epruveti ima najmanje supstrata (bjelanceta), te sve upruvete podvrći Biuret testu na slijedeći način: Na 1,00 ml vodene otopine NaOH (6 %) dodati 1,0 ml Biuret reagensa i sadržaj protresti. Na to dodati 0,4 ml otopine uzorka iz epruvete i prmomiješati. Nakon 15 minuta na spektrofotometru izmjeriti apsorbansu pri 545 nm prema slijepoj probi pripremljenoj na slijedeći način: Na 1,0 ml otopine NaOH dodati 1,00 ml Biuret reagensa i sadržaj protresti. Na to dodati 0,4 ml otopine pepsina i promiješati. Zabilježiti izmjerene vrijednosti apsorbanse.

2. Laktokoagulirajuće djelovanje pepsina U dvije epruvete odmjeriti po 5,0 ml mlijeka, a zatimu prvu dodati 1,0 ml kisele otopine pepsina, a u drugu isti volumen prethodno prokuhane otopine pepsina. Sadržaj promućkati, uroniti na 36,5 °C i nakon 30 minuta utvrditi gdje mlijeko koagulira.

3. PRIPREMNA VJEŽBANJA 1. Kinetika enzima je rješena preko Michael-Mentenove konstante. Pronađi jednačinu i prikaži je grafički?

56



2. Koji je značaj ove konstante? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

4. REZULTATI •

Dokazivanje aktivnosti i termolabilnosti ptijalina (α-amilaze iz pljuvačke) Epruveta

I

II

III

IV

V

VI

Zapašanja

Epruveta

I

III

V

Zapašanja

• Aktivnost pepsina 1. Proteolitička aktivnost R.br. epruvete 1 2 3 4

Apsorbansa (A)

Komentar rezultata 57



__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

2. Laktokoagulirajuće djelovanje pepsina __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________

OVJERA VJEŽBE:

Student je završio i ovjerio sve vježbe: Datum:______________________

Potpis:_________________

58

praktikum hemija

Recommend Documents