1. Mahasiswa mampu untuk membuat sediaan histologi jaringan yang dapat dianalisa lanjut dengan mikroskop 2. Mahasiswa mampu untuk melakukan berbagai macam pewarnaan hematoxylin-Eosin (HE) dalam proses pembuatan sediaan histologi.
PENDAHULUAN
Metode pembuatan sajian preparat jaringan dari spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi preparat histologi yang baik dan siap untuk dianalisis dinamakan histoteknik. Spesimen dapat berasal dari manusia, hewan maupun tumbuhan. Preparat yang baik dapat digunakan untuk mempelajari peran sel/jaringan dalam keadaan fisiologis atau patologis, mempelajari perubahan sel/jaringan akibat suatu perlakuan pada penelitian, dan penegakan alat bantu diagnosis diagnosis penyakit. Pembuatan preparat histologi dapat dilakukan menggunakan metode parafin dan teknik pengecatannya pengecatannya dapat dilakukan dengan pewarnaan HE HE ( Haematoxylin-Eosin) Haematoxylin-Eosin) dan MT ( Mason Trichome). Trichome ). Pada umumnya pembuatan preparat histology banyak menggunakan pewarnaan HE dengan harapan sudah cukup baik untuk menampilkan secara jelas strukturstruktur jaringan, karena secara teoritis Haematoxylin dapat mewarnai inti sel dan memperlihatkan bagian dalam inti sel, sedangkan Eosin dapat mewarnai sitoplasma. Salah satu langkah langkah penting dalam pembuatan preparat histology adalah pewarnaan . Pewarnaan dilakukan agar unsur jaringan menjadi kontras dan dapat diamati dibawah mikroskop. Munculnya warna pada sediaan terkait dengan terjadinya ikatan antara molekul tertentu yang terdapat pada daerah dan struktur jaringan yang tertentu. Sinar dengan panjang gelombang tertentu yang terdapat dalam sinar yang berasal dari cahaya mikroskop yang dipaparkan pada sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi (diserap) atau diteruskan. Zat Zat warna yan terikat pada jaringan akan menyerap sinar dengan panjang gelombang tertentu sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna.
Adapun Pewarnaan yang dapat digunakan adalah Hematoxylin Eosin (HE) digunakan untuk
memberikan
efek
warna
pada
inti
sel
dan
sitoplasma
serta
jaringan
penyambungnya.Pada pewarnaan HE digunakan 2 macam zat warna yaitu hematoksilin yang berfungsi untuk memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik), eosin merupakan counterstaining hematoksilin digunakan untuk memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda dengan nuansa yang berbeda. Hematoxylin Eosin (HE)
Adapun beberapa larutan hematoksilin yang digunakan sebagai berikut. a.
Hematoksilin Erlich Hematoksilin Erlich ini mudah berdiferensiasi dan warnanya relative tahan lama. Waktu inkubasi yang digunkan sekitar 30 menit dengan counterstaining eosin dalam air sekitar 0.5 -1% Formula Hematoksilin Erlich adalah sebagai berikut
Hematoksilin .................... 6 gram
Alkohol absolut ................ 300ml
Akwades ........................... 300ml
Glycerol ........................... 300 ml
Glacial acetic acid ............. 30 ml
Potassium alum .......... berlebihan
b. Hematoksilin Delafield Hematoksilin Delafield ini tahan disimpan dalam bertahun-tahun dan dapat digunakan 3 hari setelah pembuatan. Waktu inkubasi yang digunakan sekitar 15-20 menit menit dengan counterstaining eosin dalam air sekitar 0.5 -1%. Formula Hematoksilin Delafield adalah
Hematoksilin kristal ............. 6 gr
Alkohol absolut ................. 50 ml
Ammonium alum ............... 55 gr
Aquades ........................... 600ml
Glycerol ............................ 150ml
c. Hematoksilin Mayer Hematoksilin Mayer ini membutuhkan waktu inkubasi yang sekitar 10-15 menit menit dengan counterstaining eosin dalam air sekitar 0.5 -1%.
Larutan ini hanya tahan
disimpan dalam hitugan bulan. Formula Hematoksilin Mayer sebagai berikut.
d. Hematoksilin Harris Larutan pewarna Hematoksilin Harris membutuhkan waktu inkubasi 15-20 menit dengan counterstaining eosin 0.5-1% larutan eosin. Formulanya Hematoksilin Harris sebagai berikut.
Kristal hematoksilin .......................... 5.0 gr
Alkohol 100% ................................... 50 ml
Ammonium/potassium alum ........... . 100 gr
Distilled water ............................... 1000 ml
Merkuri oksida ................................. 2.5 gr
Larutan Counterstaining
Pewarna yang digunakan sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah eosin, safranin dan phloxine. 1. Larutan Eosin Larutan eosin yang digunakan terdiri dari larutan stok (Stock solution) dan larutan kerja (working solution). Larutan kerja (working solution) dibuat sesaat sebelum digunakan dan perlu penambahan asam asetat glasial 0.5 ml per 100 ml larutan. Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut 1% Stock Alkohol-Eosin Eosin Y, water soluble ................... 1.0 gr
Distilled water .............................. 20 ml Larutkan dan tambahkan Alkohol 95% ................................ 80 ml Working Eosin Solution Eosin stock solution ................. 1 bagian Alkohol 80% .............................. 3 bagian
2. Larutan Phloxine Laurtan phloxine terdiri atas larutan stock eosin, stock phloxine, working solution dan larutan Safran. Larutan-larutan tersebut adalah sebagai berikut Stock Eosin Eosin Y water soluble................... 1 gram Distilled water .............................. 100ml Stock Phloxine Phloxine B .................................... 1.5 gr Distilled water .............................. 100ml Working Solution Stock Eosin .................................. 100ml Stock Phloxine ................................. 10ml Alkohol 95% ............................... 780ml Asam asetat glasial ......................... 4ml 2% Alkohol Safran Safran du Gatinais ...................... 2 gram Alkohol 100% ............................ .. 100ml
Larutkan pewarna hematoksilin dalam alkohol, kemudian tambahkan zal lainnya
2. Aduk zat warna dengan baik agar seluruh partikel zat warna terlarut dengan baik 3. Tuangkan larutan zat warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses pewarnaan dengan menyaringnya menggunakan kertas saring 4. Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses pewarnaan dan tuangkan dalam wadah yang sesuai 5. Atur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses pewarnaan 6. Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan alkohol yang akan menyebabkan presipitasi (pengendapan) zat warna I. Pulasan Mayer hematoksilin-eosin
Prosedur yang dipakai adalah sebagai berikut 1. Deparafinisasi dengan xylol (2x2 min) 2. Hidrasi dengan serial Alkohol 100% (2x2 min) – 95% (2min) – 90% (2 min) – 80% (2 min) - 70% (2min) – Distilled water (3min) 3. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayers selama 15 min 4. Cuci dalam air mengalir selama 15-20menit 5. Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi di air mengalir selama beberapa menit. Bila sudah cukup warnanya lanjutkan ke langkah selanjutnya 6. Counterstaining dalam larutan Eosin working solution selama 15 detik hingga 2 menit tergantung pada umur eosin dan kedalaman warna yang diinginkan 7. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat perlahan mulai 70% hingga 100% masing-masing 2 menit. 8. Jernihkan dan dealkoholisasi dalam xylol 2x2min 9. Tutup dengan balsem kanada
Hasil/ Interpretasi adalah
Inti sel bewarna biru
Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu
II. Pewarnaan Hematoksilin Harris-Eosin
Protokol pulasan hematoksilin Harris – eosin adalah sebagai berikut 1. Deparafinisasi dalam xylol 2. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%90%-80%-70% 3. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Harris selama 15 min 4. Bilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat 5. Celup dalam campuran asam-alkohol secara cepat 3-10 celup cek differensiasi warna di bawah mikroskop 6. Bilas dalam air mengalir secara singkat 7. Celup sebanyak 3-5 kali dalam larutan ammonium atau lithium karbonat hingga potongan bewarna biru cerah 8. Cuci dalam air mengalir selama 10-20 menit Bila pencucian tidak maksimal jaringan sulit terwarna oleh Eosin 9. Inkubasi dalam eosin selama 15 detik hingga 2 menit 10. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan, masing-masing selama 2 menit 11. inkubasi dalam xylol 2x2menit 12. Tutup dengan kaca penutup Hasil/Interpretasi hasil pulasan
Inti sel bewarna biru
Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu
III. Pewarnaan Hematoksilin Mayer-Phloxyne-Safran Prosedur pewarnaan adalah sebagai berikut 1. Deparafinisasi dalam xylol
2. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%90%-80%-70% 3. Inkubasi dalam larutan asam pikrat jenuh selama 5 menit
4. Cuci dalam air mengalir hingga seluruh asam pikrat hilang 5. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayer selama 15 menit 6. Basuh dengan air mengalir selama 20 menit 7. Warnai dalam larutan 1.5% larutan Phyloxine B selama 2 menit 8. Basuh dengan air selama 5 menit 9. Cuci dengan alkohol absolut 3 kali 10. Warnai dalam 2% larutan alkohol Safran selama 5 menit 11. Cuci dengan alkohol absolut 2 kali 12. Inkubasi dalam xylol 2 kali masing-masing selama 2 menit 13. Rekatkan dengan objek glass menggunakan Balsam Kanada Hasil/interpretasi
