PRÁCTICA 11
Liliana S. Ra"re' 2 Ro,er!o C. +. *o$ane3ra
Hidr%lisis de una Pro!e"na 0 ensa0os ara ro!e"nas 0 aino$idos RESUMEN: Se realizó la hidrólisis de una proteína así como su identificación por medio de distintas pruebas y reacciones, preparando cuatro distintas soluciones con distintas proteínas, la primera solución fue etiquetada como solución A y fue grenetina con ácido clorhídrico concentrado agua destilada a reflujo, la segunda solución etiquetada como solución B que fue la grenetina hidrolizada neutralizada con hidróxido de sodio al !", la tercera solución etiquetada como solución # fue la grenetina sin hidrolizar utilizando agua destilada, la cuarta solución etiquetada como solución $, fue la solución de alb%mina preparada con clara de hue&o, posteriormente posteriormente se realizaron pruebas de identificación identificación de aminoácidos en las proteínas dichas pruebas fueron' (eacción )antoproteíca, reacción de precipitación, reacción de biuret, reacción con ninhidrina, reacción con ácido nitroso, la acción reguladora de aminoácidos y una cromatografía en placa fina para identificación de componentes de una proteína*
INTRODUCCIÓN: +as proteínas son biopolímeros de los -aminoácido, llamados así debido a que el grupo amino esta enlazado al átomo de carbono adyacente al grupo grupo carbonilo* carbonilo* +as propiedades propiedades físicas físicas y químicas químicas de una proteína están están determ determina inadas das por los aminoá aminoácid cidos os que la consti constituy tuyen* en* +as subunidade subunidades s indi&iduale indi&iduales s de los aminoácid aminoácidos os se unen por medio medio de enlaces de amida llamados enlaces peptídicos* +os aminoácidos son compuestos orgánicos que contienen las funciones ácid ácido o carb carbox oxíl ílic ico o y amin amino* o* $os $os amin aminoá oáci cido dos s se pued pueden en unir unir en condicion condiciones es adecuadas, adecuadas, a tra&.s tra&.s de un enlace amida, amida, formando formando un dip.ptido* /l dip.ptido puede incorporar incorporar un tercer aminoácido, aminoácido, formando un trip.ptido trip.ptido** #adenas #adenas con más de 0! aminoácidos aminoácidos se denominan denominan proteínas*
DISCUSIÓN DE RESULTADOS:
Es4uea 1. Hidr%lisis de una ro!e"na ro!e"na II.Solu$i%n Neu!rali'ada de (idroli'ado de )rene!ina #Solu$i%n *&: 9ara la neutralización de la proteína, tomamos 0m+ de la grenetina que hidrolizamos en el paso anterior y con hidróxido de sodio al !", hasta un p: de ;, con ayuda de papel p: determinamos el punto hasta que se neutralizó la grenetina, obteniendo nuestro compuesto llamado z
/n el desarrollo de la práctica lle&amos a cabo distintos procesos, en los cuales cuales pudimos pudimos identifica identificarr uno por uno los distintos distintos aminoácidos aminoácidos que confor conforman man a las proteí proteínas nas,, dichos dichos proces procesos os e identi identific ficaci acione ones s se mencionan a continuación'
I.Hidrolisis de una ro!e"na #Solu$i%n A&: /n un matraz balón de fondo plano colocamos 1!!m+, g de grenetina y !m+ de ácido clorhídrico concentrado, y !m+ de agua destilada, a dicho matraz balón le adaptamos un refrigerante en posición de reflujo y calentam calentamos os sua&ement sua&emente e por 20 minutos, minutos, obtu&imos obtu&imos una mezcla mezcla con contaminantes de color y olor, y lo quitamos a3adiendo un poco de carbón acti&ado, calentando a ebullición por 1 minutos y con ayuda de papel filtro, filtramos dicha solución, obteniendo la solución 4A5, que fue la grenetina hidrolizada, la proteína que en este caso fue la grenetina se separó separó en sus aminoácidos aminoácidos diferentes, diferentes, que los conforman, conforman, con eso pudimos pudimos posteriorm posteriormente ente realizar las pruebas pruebas de identifica identificación ción de los aminoácid aminoácidos os que conforman conforman la grenetina, grenetina, en general general la reacción reacción de hidrolisis es la que se muestra a continuación 67er esquema 8*
Es4uea 5. )rene!ina (idroli'ada neu!ra III.Solu$i%n III.Solu$i%n de )rene!ina )rene!ina sin Hidroli'ar Hidroli'ar #Solu$i%n C&: /n un &aso de precipitados de !!m+ colocamos !*0g de grenetina y agregamos 1!m+ de agua destilada y agitamos &igorosamente, &igorosamente, hasta disolución total* 9reparamos la solución solución e I+.S I+.Solu olu$i% $i%n n de Al,-ina l,-ina #Solu$ #Solu$i%n i%n D&: 9reparamos alb%mina 6clara de hue&o8, agitando la clara por ! segundos, agregamos !!m+ de agua, agitamos y filtramos la solución con un pedazo de manta de cielo* $ichas $ichas soluciones soluciones realizadas realizadas en el laboratori laboratorio, o, fueron fueron utilizadas utilizadas para realizar distinta pruebas de identificación de aminoácidos contenidos en la proteína de grenetina grenetina y en la alb%mina, alb%mina, a continuac continuación ión se menciona menciona cada una de ellas, así como los resultados obtenidos*
1&
Rea$ Rea$$i $i%n %n /an! /an!o oro ro!e !e"$a "$a::
PRÁCTICA 11 /sta prueba como sabemos caracteriza a los aminoácidos aromáticos* /sta reacción se debe a la presencia de un grupo fenilo en la mol.cula proteica* +os complejos de la mol.cula proteica que son de importancia en esta reacción son la tirosina y el triptófano* /n dos tubos de ensayo colocamos en el primero m+ de solución de grenetina hidrolizada 6Solución A8 y en el otro, m+ de solución de alb%mina 6Solución $8, a cada tubo agregamos 1*0m+ de ácido nítrico concentrado, calentamos lentamente en un ba3o maría, esto para fa&orecer la formación del ión nitronio para que se lle&e a cabo la reacción de nitración, en esta reacción de identificación esto nos sir&ió para poder identificar en que tubo estaban presentes anillos aromáticos, dicha reacción da positi&a mayoritariamente con la tirosina, al reaccionar obtenemos el anillo de benceno nitrado, obteniendo un precipitado amarillo del nitrocompuesto* +a reacción sólo dio positi&a en la alb%mina, ya que al analizar la tabla , nos damos cuenta que la alb%mina tiene el aminoácido tirosina, y puesto que esta reacción reacciona mayoritariamente en este, obtu&imos un color naranja intenso en este tubo al a3adir el hidróxido de sodio, mientras que en el tubo donde estaba la grenetina, no obtu&imos ninguna coloración, al no tener aminoácidos con anillos aromáticos presentes*
reaccionando tanto en la cisteína como en la metionina de la alb%mina que contienen puentes disulfuro*
Es4uea . Rea$$i%n de re$ii!a$i%n
9& Rea$$i%n de *iure!:
/s empleado para detectar la presencia de proteínas o polip.ptidos, más específicamente, para identificar enlaces peptídicos, cambiando de una coloración azul cielo a una azul rey, indicándonos que la prueba fue posti&a* /n seis tubos de ensayo colocamos distintas soluciones, en las cuales colocamos las soluciones 4A5, 4#5 y 4$5, los resultados fueron los siguientes*
SUSTRATO A3ua Des!ilada Solu$i%n 7A8 #)rene!ina Hidroli'ada& Solu$i%n 7C8 #)rene!ina sin (idroli'ar8 Solu$i%n 7D8
Ta,la 1. Aino$idos de la Al,-ina +a reacción que sucede con la tirosina de la alb%mina fue la siguiente 6/squema 28*
O*SER+ACIONES
Azul cielo Sin color Azul rey Azul rey #omo podemos darnos cuenta, en los tubos donde se encontró la solución de grenetina sin hidrolizar y en donde estaba la solución de alb%mina, dieron la prueba positi&a, esto nos quiere decir que en estos tubos las soluciones que tenían existencia de enlaces peptídicos, esto es aminos libres en su estructura, esto se debe a que en esos tubos hubo una desnaturalización de dichas proteínas, es decir la estructura terciaria de las proteínas se rompió dejando libres los aminos formando de nue&o los enlaces peptídicos no se hidrolizaron, por ello había aminos libres por tanto enlaces p eptídicos* 67er esquema 08*
Es uea 9. Rea$$i%n /an!o ro!e"$a 5&
Rea$$i%n de Pre$ii!a$i%n: /l enlace disulfuro es un enlace co&alente que se produce cuando dos grupos sulfhidrílo 6S:8 reaccionan para formar un puente disulfuro 6SS8* +os residuos de cisteína pueden formar puentes disulfuro* 9ueden unir 1 cadenas peptídicas o una sola para formar un anillo* $icha prueba identifica los enlaces disulfuro de las proteínas, n mayor parte las proteínas que contengan un n%mero mayor de puentes disulfuro, en la prueba en un tubo de ensayo colocamos 1m+ de grenetina hidrolizada, en otro 1m+ de alb%mina y en un tercero 1m+ de agua destilada, agregamos 0m+ de solución de hidróxido de sodio al !" y m+ de acetato de plomo, obtu&imos los siguientes resultados'
Sus!ra!o Solu$i%n 7A8#)rene!ina& Solu$i%n 7D8 #Al,-ina&
O,ser6a$iones =egati&o 6pp* Blanco8 9ositi&o 6pp* #af.8
#omo podemos darnos cuenta, el plomo reacciona con los puentes disulfuro 6esquema >8, formando un precipitado caf., que dio positi&a en la al%mina indicándonos la existencia de dichos puentes disulfuro,
Es4uea <. Rea$$i%n de ,iure!= >ora$i%n de $ole?o de $o,re $on los ainos Es4uea ;. Rea$$i%n $on $ido ni!roso li,res & Rea$$i%n $on Nin(idrina: /s una de las reacciones características del grupo -amino 9or calefacción de un aminoácido con dos mol.culas de ninhidrina da un producto intensamente coloreado* Aparece un color purpura con todos los aminoácidos y p.ptidos, esto es con los aminoácidos que tengan aminos libres, dándonos en esta reacción con hidróxido de sodio y ninhidrina y al calentar obtenemos una coloración purpura, esto quiere decir que las proteínas con aminos libres reaccionaron con la ninhidrina y el hidróxido de sodio, puesto que en las demás soluciones, no tenían aminos libres primarios con quien reaccionar, los resultados fueron los siguientes'
SUSTRATO
A3ua Des!ilada Solu$i%n 7*8 Solu$i%n 7C8 Solu$i%n 7D8
O*SER+ACIONES 9rueba negati&a, sin color 9rueba positi&a, color purpura 9rueba negati&a, sin color 9rueba negati&a, sin color
PRÁCTICA 11
Aino$ido a!r%n
9rueba positi&a, color purpura
#omo podemos darnos cuenta, la prueba dio positi&a en el tubo con la grenetina neutralizada 4B5, puesto que la ninhidrina reacciona con aminoácidos con un p: de entre > a ?, y la solución la teníamos en un p: neutro, por ello dio positi&a y en el aminoácido patrón, al tener aminos libres primarios pudo reaccionar, esto es un aminoácido libre y puede reaccionar libremente* 6/squema @8*
que &iraron con fenolftaleína a color rojo, los resultados fueron los siguientes 67er esquema ?8
Mues!ras SOLUCION * enilalanina
Croa!o3ra>"a en $aa >ina. Dis!an$ia ren!e del re$orrida sol6en!e 5
)li$ina
5. 5
R> .< .;5< .<
Es4uea @. Rea$$i%n $on Nin(idrina /sta prueba nos permite determinar la cantidad de hidrogeno liberado de una amina en proteínas, con la reacción de ácido nitroso, identificando los grupos aminos libres de los p.ptidos y las proteínas midiendo la cantidad de nitrógeno liberado en la reacción, las pruebas donde haya un burbujeo continuo, indica la existencia de dichos aminos libres, en la prueba de laboratorio obtu&imos los siguientes resultados*
<& Rea$$i%n $on $ido ni!roso
Sus!ra!o A3ua Des!ilada Solu$i%n 7A8 Solu$i%n 7C8 Solu$i%n 7D8
O,ser6a$iones =egati&o, no hubo burbujeo 9ositi&o, mucho burbujeo =egati&o, no hubo burbujeo =egati&o, no hubo burbujeo
#omo podemos darnos cuenta, la %nica prueba donde dio positi&o fue en la solución A, de grenetina hidrolizada, esto quiere decir que la hidrolisis fue parcial en nuestra solución, ya que quedaron aminos libres con los cuales pudo reaccionar el ácido nitroso y liberar ese nitrógeno gas 67er esquema ;8*
Es4uea ;. Rea$$i%n $on $ido Ni!roso
Es4uea B. A$$i%n re3uladora de aino$idos /n una cromatoplaca colocamos tres puntos, el primero la solución de grenetina, en el siguiente colocamos muestra de fenilalanina y al final glicina, corrimos la cromatografía en una solución de isopropanol-agua 6;'28 con 1 gotas de hidróxido de amonio para que no se corriera toda la placa en un solo rayo, al ser muy polar el isopropanol con los aminoácidos muy polares, la cromatoplaca se corrió muy lento, secamos la cromatoplaca y le aplicamos solución de ninhidrina para re&elar la placa, obteniendo distintas machas cuyo resultado se muestra a continuación*
;& Croa!o3ra>"a en la$a >ina:
@& A$$i%n Re3uladora de Aino$idos
/n esta reacción se pone en manifiesto como un aminoácido act%a como un ácido o una base, ya que los aminoácidos son anfóteros, utilizamos hidróxido de sodio y ácido clorhídrico para las diferentes reacciones* Agregamos a dos tubos de ensayo, en el primero colocamos 1m+ de sol*B y en otro 1m+ de agua destilada, @ gotas de rojo congo, primero obser&amos que ambos mostraron un color rojo intenso, esto quiere decir que nuestras soluciones estaban básicas, puesto que rojo congo al contacto si sigue rojo significa que nuestras soluciones están en un p: básico, al agregarle ácido clorhídrico, el tubo y tubo 1 cambiaron la coloración a morado en diferentes &elocidades, el tubo que contenía agua cambio rápido al agregar una gota, el cambio fue en cuestión de segundos, mientras que en el tubo que contenía la solución B cambio lento, se le tu&ieron que agregar ? gotas para ello, la diferencia entre las &elocidades del cambio de cloración se debe a que los aminoácidos presentes en la solución B producen un efecto b%fer que de alguna manera amortigua o dicho en otras palabras hace que la reacción se lle&e a cabo de manera lenta, con hidróxido de sodio fue lo mismo solo
#on estos resultados nos dimos cuenta que la grenetina por prueba de cromatografía, está compuesta en su mayor parte por glicina y no por fenilalanina*
CONCLUSIÓN: Se lle&ó a cabo la hidrolisis de una proteína
*I*LIO)RÁIA:
PRÁCTICA 11 *
ade, +eroy* uímica Crgánica, 7olumen 1* S.ptima* D.xico' 9/A(SC= /$E#A#FC=, 511*pp' 02-@
2. 7oet,
&oet,
Bioquímica
2G
panamericana, 5@= pp';-!!
edición,
D.xico,
editorial
