Hidrolisis de una proteína y ensayos para proteínas y aminoácidos Alfaro M. Paola V. Vázquez M. Selene I. y Solís C. Korina A. esumen Se llevó acabo la hidrolisis de una proteína así como su identificación, para ello se prepararon cuatro soluciones la A que fue a reflujo con grenetina, B que es la solución A neutralizada con NaO, la ! grenetina con agua destilada " la # la albumina $clara de huevo% con agua, procediendo a la identificación de amino&cidos con' reacción (antoproteica, reacción de precipitación, reacción de Biuret, reacción de nihidrina, reacción de &cido nitroso, acción reguladora de amino&cidos " cromatografía en placa fina)
Introducci!n *as proteínas son biopolímeros de los +amino&cido, llamados así debido a que el grupo amino esta enlazado al &tomo de carbono + ad"acente al grupo carbonilo) *as propiedades físicas " químicas de una proteín proteína a est&n est&n determ determina inadas das por los amino& amino&cid cidos os que la constitu"en) constitu"en) *as subunidades subunidades individuales individuales de los amino&cidos amino&cidos se unen por medio de enlaces de amida llamados enlaces peptídicos)
poli polip. p.pt ptid ido o es un p.pti p.ptido do que que cont contie iene ne much muchos os resi residu duos os de amino& amino&cido cidos s pero pero por lo genera generall tiene tiene una masa masa molecu molecular lar de alrede alrededor dor de 2333) 2333) *as proteín proteínas as contie contienen nen m&s unidad unidades es de amino&cidos, con masas moleculares que van de alrededor de 4333 a 53333333)
Niveles de estructura de la proteína' 6estructura primaria' estructura enlazada de manera covalente de la mol.cula, esta inclu"e la secuencia de los amino&cidos) 6estru 6estructur ctura a secund secundari aria' a' tienden tienden a formar formar arregl arreglos os ordena ordenados dos enlazados por puentes de hidrogeno) 6estructura 6estructura terciaria' inclu"e todas las estructuras estructuras secundarias secundarias " 1n p.ptido es un compuesto que contiene dos o m&s amino&cidos todos los dobleces " plegados entre ellas) unidos por medio de enlaces de amida entre el grupo amino de cada 6estructura cuaternaria' a la asociación de dos o m&s cadenas de amino& amino&cid cido o " el grupo grupo carbo0 carbo0ilo ilo del amino& amino&cido cido vecino) vecino) A cada p.ptidos en la proteína completa) unid unidad ad de amin amino& o&cid cido o en el p.pt p.ptid ido o se le llam llama a resid residuo uo)) 1n
-l termin termino o amino& amino&cid cido o podría podría signifi significar car cualqu cualquier ier mol.cu mol.cula la que conten contenga ga un grupo grupo amino amino " cualqu cualquier ier tipo de grupo grupo acido/ acido/ sin embargo, el termino casi siempre se usa para referirse a un &cido carbo0ílico +amino)
"iscusi!n de resultados Se pudier pudieron on identif identifica icarr distin distintos tos amino& amino&cid cidos os presen presentes tes en las proteínas siguientes por medio de reacciones de identificación' #.
0squema '. )renetina (idrolizada neutra
Hidrolis Hidrolisis is de de una una proteín proteína a $Solu $Soluci! ci!n n A%& A%&
-n un matraz se colocaron 733m*, 8g de grenetina ,83m* de !l concen concentr trad ado o " 83m* 83m* de agua agua desti destila lada da,, se colo colocó có a reflu reflujo jo " calentamos durante 92 minutos, obteniendo una solución por a la cual se le a:adió un poco de carbón activado para eliminar estas traza trazas s de olor " color color se calent calentó ó a ebul ebulli lició ción n por por 7 minu minutos tos poster posterior iorment mente e se filtró filtró la soluci solución, ón, obteni obteniend endo o la soluci solución ón ;A<, ;A<, $grenetina hidrolizada%) =osteriormente se realizaron las pruebas de identificaron para conocer los amino&cidos de nuestra solución A) *a reacción de hidrolisis de nuestra proteína fue la siguiente)
+. Soluci!n de )renetina sin Hidrolizar $Soluci!n C%& -n un vaso de precipitados a:adimos 3)2g de grenetina " 73m* de agua destilada " se agitamos vigorosamente, hasta disolución disolución total) !on lo cual se obtuvo nuestra grenetina desnaturalizada) ,. Soluci!n de Al-mina $Soluci!n "%& Se agito la clara de huevo por 83 segundos, se le agrego 23m* de agua agua,, agita agitamo mos s " filt filtra ramo mos s la solu soluci ción ón)) $#es $#esna natur tural aliz izac ació ión% n%.. =oster =osterior iorment mente e se realiza realizaron ron las prueba pruebas s de identi identifica ficación ción de amino& amino&cido cidos s que poseía poseían n nuestr nuestras as proteín proteínas as de grenet grenetina ina " de albumina I.
0squema #. Hidr!lisis de una proteína
'.
Solu ci ci !n !n n eu eutral iz iz ad ad a )renetina $Soluci!n *%&
de
(i dr droliz ad ado
de
=ara =ara la neutral neutraliza izació ción n de la proteín proteína, a, se colocar colocaron on 2m* de la grenet grenetina ina hidroliz hidrolizada ada " NaO NaO al 83>, 83>, hasta hasta obtene obtenerr un p de ?$neutro%, lo cual se verifico con a"uda de papel p, obteniendo nuestr nuestro o compue compuesto sto llamad llamado o z@itte z@itterió rión n que es un amino& amino&cido cido estabilizado por una carga positiva " una negativa $er esquema 7%)
eacci!n /antoproteíca&
*os amino&cid amino&cidos os arom&ti arom&ticos cos como como la tirosi tirosina, na, el triptó triptófan fano o " la fenilalanina presentes en las proteínas dan un precipitado de color amarillo cuando son calentados con NO9 concentrado) !on adición de un medio alcalino, el precipitado se vuelve naranja debido a la nitración nitración del anillo anillo arom&tico) arom&tico) *a reacción reacción solo dio positiva positiva a la solución # "a que esta proteína $albumina de huevo% cuenta con tirosina, tirosina, triptófano triptófano " fenilalani fenilalanina na en su estructura) estructura) ientras ientras que la solución A $grenetina% solo tiene trazas de tirosina " fenilalanina, pero carece de triptófano) II.
eacci!n de Precipitaci!n&
-l enlace disulfuro es un enlace covalente que se produce cuando V. eacci!n con ácido nitroso dos grupos grupos sulfhid sulfhidríl rílo o $S% $S% reacci reacciona onan n para para formar formar un puente puente determino la cantidad cantidad de grupos grupos aminos aminos libres libres de los disulf disulfuro uro $SS%) $SS%) *os residu residuos os de cisteín cisteína a pueden pueden formar formar puente puentes s -sta reacción determino p.ptidos " las proteínas midiendo la cantidad de nitrógeno liberado " disulfuro) disulfuro) =ueden unir 7 cadenas cadenas peptídicas o una sola para formar un anillo anillo)) #icha #icha prueba prueba identi identifica fica los enlace enlaces s disulf disulfuro uro de las esto se puso de manifiesto mediante un burbujeo) proteínas, en donde a ma"or parte las proteínas que contengan un Soluci!n eaccion! nCmero ma"or de puentes disulfuro, 3A4$)renetina% Si Sustrato 1-ser2aciones 3C4 $)renetina desnaturalizada% No Soluci!n 3A4$)renetina% DormacióDormación de precipitado blanco
3"4 $Al-mina%
No
Soluci!n 3"4 $Al-mina% DormacióDormación de precipitado caf.
H'1 $sin proteína%
No
VI. III.
Acci !n !n re re5ul ad adora de de ami no noáci do do s
eacci!n de *iuret
*a reacción de Biuret es un m.todo general para la determinación de proteínas o p.ptidos, se basa en la reacción del sulfato de cobre con compuestos que tengan 7 o m&s enlaces peptídicos, en un medio alcalino) -l producto es un complejo color violeta, cu"a intensidad depend depende e la cantid cantidad ad de enlace enlaces s peptíd peptídicos icos presen presentes tes)) *os di p.ptidos " amino&cidos dan esta prueba negativa)
*os αamino&cidos son anfóteros) *a zona de viraje del rojo congo es de 2)7, así que el empleo de gotas de !l para alcanzar una coloración azul en la solución B confirma que se lleva a cabo una reacción &cidobase) *a zona de viraje de la f la f enoftaleina enoftaleina es en un p de F)4, de tal manera que la adición de unas gotas de NaO a la solución B demuestra la propiedad anfótera) Soluci!n
Indicador
A5ua
Eojo !ongo
Color inicial Eojo
Sol. *
Eojo !ongo
Eojo
2 !l
Azul
A5ua
Denoftaleina
Gransparente
8 NaO
Eosa
Sol. *
Denoftaleina
Gransparente
5 NaO
Eosa
0squema +. eacci!n *iuret -n caso dio positiva en la solución ! " presencia de hidró0ido de sodio, por lo soluciones ! " # tienen enlaces peptídicos)
tanto
nuestro la prueba #, solo en las
VII. IV.
)otas 8 !l
Color final Azul
Cromato5rafía en en Ca Capa fi fina
eacci!n con nin(idrina
!uando !uando la ninhid ninhidrin rina a reaccio reacciona na con un amino& amino&cid cido o uno de los productos es un anión violeta obscuro estabilizado por resonancia llamado purpura de Euhemann) *a ninhidrina produce este mismo colorante purpura sin importan la estructura del amino&cido original, por lo tanto, tanto, va identi identifica ficarr amino& amino&cid cidos os libres libres primar primarios ios,, como resultado nuestra solución B " patrón tomaron una tonalidad violeta)
=or medio de la cromatografía en capa fina se separaron la mezcla de amino& amino&cid cidos os de la soluci solución ón B con 7 amino& amino&cid cidos os patron patrones es $Denilalanina " glicina% tomando como base su polaridad) #ependiendo de sus polaridades, los amino&cidos tienen diferentes afinid afinidade ades s a la fase móvil móvil " la estaci estaciona onaria ria " en consecu consecuenc encia ia ascienden ascienden en la placa con distinta rapidez) *os amino&cidos menos polares ascienden por la placa con una ma"or rapidez por su afinidad a la placa obteni.ndose los siguientes siguientes resultados'
Sustancia Solución ;B< Denilalanina Hlicina
Ef No corrió 3)?2 3)9I
Conclusi!n& -0isten varios m.todos para identificar los amino&cidos amino&cidos pres presen ente tes s en una una prot proteí eína na com como es la reac reacci ción ón (antoproteica para identificar amino&cidos arom&ticos, la reacción de precipitación para identificar enlaces disulfuro en los amino&cidos, la reacción de biuret para identificar
enlace enlaces s peptí peptídic dicos, os, la reacc reacción ión con ninhid ninhidrin rina a para para identi identific ficar ar amino& amino&cid cidos os libres libres , la reacc reacción ión con &cido &cido nitroso para identificar aminos libres de los p.ptidos, p.ptidos, por Cltimo Cltimo en la cromatogr cromatografía afía identificar identificar los amino&cidos amino&cidos presentes presentes en una proteína proteína hidrolizada hidrolizada con base a su polaridad)
*i-lio5rafía Jade, *ero") Kuímica Org&nica, olumen 7) S.ptima) .0ico' =-AESON -#1!A!LON, 7388) =aginas consultadas' 8829
