PRACTICA 5 ENSA ENSAY YO
COLO OLORIM IMET ETR RICO ICO
DEL
TETRA TRAZOLIUM IUM
NITR ITROBLUE BLUE
(NBT):EVALUACION DE LA PRODUCCION DE ANION SUPEROXIDO (O2-) I. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN Los neutróflos juegan un rol clave en proteger al cuerpo, utilizando una ampl amplia ia
vari varied edad ad
de
meca mecani nism smo os
micr microb obio ioci cida das s
depe depend ndie ient ntes es
e
independientes de oxigeno para eliminar los agentes inecciosos. Los meca mecani nism smos os depe depend ndie ient ntes es de oxige xigeno no impl implic ican an la prod produc ucci ción ón de especies reactivas de oxigeno (ROS, atravez de lo !ue se conoce como la explosión respiratoria oxidativa, !ue implica un elevado consumo de oxigen xigeno o por por estas estas c"lul c"lulas, as, # !ue !ue son escen escencia ciale les s para para la prot protecc ección ión cont contra ra
los los
patóg atógen enos os
inva invaso sorres. es.
$ien $ientr tras as
!ue !ue
los los
meca mecani nism smos os
inde indepe pend ndie ient ntes es de oxige xigeno no incl inclu# u#en en muc% muc%as as otra otras s unc uncio ione nes s del del neutr neutróf óflo, lo, tales tales como como !uimi !uimiot otaxa axais is , agoci agocito tosis sis,, desgr desgranu anulac lacio ion n # liberación de enzimas l&ticas # p"ptidos bactericidas 'l sistema sistema respon responsabl sable e de esta explo explosión sión respir respirator atoria ia oxidat oxidativa iva es la )*+ )*+ oxida xidasa sa,, !ue !ue es un sist sistem ema a de tran trans ser eren enci cia a elec electr trón ónic ica a mult multic icom ompo pone nent nte, e, !ue !ue cata catali liza za la reduc educci ción ón del del O - molecul molecular ar Los Los electro electrones nes son transeri transeridos dos desde desde el citosol citosol # entregad entregados os al oxigen oxigeno o presente en un compartitmiento intracelular (agosoma o extracelular 'l producto primario de la )*+ oxidasa es el O - # su metabolito metabolito inicial el -O-O-,a ,ade dem/ m/s s esto estos s ROS ROS son son meta metabo boli liza zado dos s en otr otros meta metabo boli lito tos s reactivos de oxigeno, !ue son uertes microbiocidas. La importan tancia cia de la producció ción de ROS por los neut eutróflos los es ejem ejempl plif ifca cada da
por por
la
ene enerrmeda medad d
gran granul ulom omat atos osa a
cró crónica nica
(01* (01*, ,
caracter caracterizad izada a por recurr recurrente entes s ineccio inecciones nes bacteria bacterianas nas # 2ngicas 2ngicas a lo largo de la vida # la ormación de granulomas tisulares
'l ensa#o del 34 se basa en la acumulación del precipitado ormazan azul oscuro 'l 34, permeable a la membrana es reducido al ormazan por el O- el cual es generado luego de la activación de los neutróflos 'ste ensa#o es colorimetrico, sensible # cuantitativo # puede detectar pe!ue5as cantidades de O -
II. OBJETIVOS 'valuar la producción de anion superoxido (O - por neutróflos activados
III. REACTIVOS Y MATERIALES Mat!"a#$ - 4ubos de centriuga de 67ml (alcon - 0entr&uga - $icropipetas - 4ubos eppendots - emocitometro - 'spectrootometro
Ra%t"&'$ - 8icoll 9 %#pa!ue - dextrano - medio de cultivo R+$: 9 6;<= - +3S - Sangre con anticoagulante ( '*4) - )zul de tr#pan - a0l 6,> ? - 34 - *imetilormamida - @O -$ - *$SO - '*4)
IV. PROCEDIMIENTO 6. )islar neutróflos %umanos apartir de sangre entera -. Sembrar 6x 6=7 neutroflos por pozo en una placa de cultivo
celular de -< pocillos en 7== ul de medio *$'$ A. )dicionar 6==ul de solución de 34 a cada pozo <. )dicionar 6ul de +$) (-==ngBml o buCer
(control no
estimulado a los pozos e incubar por A= min a AD o0 7. Lavar las celulas dos veces con +3S (AD o0 ;. 8ijar las celulas con metanol # dejar secar las placas al aire D. )gregar 6-=ul de @O -$ por pozo >. )gregar 6<=ul de *$SO por pozo # disolver el ormazan precipitado por pipeteo E. 4anserir
la
solución
de
34
disuelta
a
una
cuveta
de
espectrootómetro # medir la absorbancia a ;-=nm 6=.
0omparar la absorbancia entre lo neutrflos estimulados # los
no estimulados para cuantifcar la producion de O - en cada muestra
V. RESULTADOS 6. 's!uematice el ensa#o del 34
-. acer los c/lculos para determinar la cantidad de O - producida 6-= 6==? ue en A<-? <6=x FGA<-
la cantidad de O- !ue aumento respecto al control
VI. CUESTIONARIO 6. :ndi!ue el undamento del ensa#o del 34 'l 34 es un oxidante poderoso en medio acuoso, en especial en condiciones /cidas, por lo !ue debe ser tratado con muc%o cuidado para evitar su reducción una vez disuelto, manteni"ndolo al abrigo de la luz # el calor. 'l 34 es una sal de tretrazolio soluble en agua, de color amarillo, con órmula emp&rica 0O0l # con peso molecular de >6D,;D< gBmol. 'l t'*' $ +,*ata
# %' * /, # NBT 0!$%"a * O 2 $ !*,%"*' a +'!a13 ,a $,$ta%"a * %'#'! a1,#-4!' /, $ *0'$"ta %'' 0a!t%,#a$ "$'#,6#$ *t!' * #a$ %#,#a$. E$t $a7' $ ,a 0!,6a "*"!%ta ,t"#"1a*a 0a!a &a#,a! *$8!*$ * #a +a4'%"t'$"$ 7 *# $"$ta 6a%t!"%"*a *0*"t *# '94'3 # constitu#e la prueba esencial para el diagnóstico de la enermedad granulomatosa crónica, inmunodefciencia cong"nita caracterizada por el deecto de la capacidad oxidativa.
-. HIu" es la explosión respiratoriaJ )l activarse el neutróflo anion superoxdo, peróxido de %idrogeno, siendo el mas importante el anion superoxido, !ue produducido como el producto de un complejo enzim/tico )*+ . 'L )*+ saca un electron su#o para pasrselo al O-, # asi!ueda omo anion superoxido , +ara cumplir esta unción el neutrofo debe consumir bastante oxigeno a esta accio se le llama explosión respiratoria. A. indi!ue los tipos de ROS producidos por los neutróflos
Se Se
han identificado al menos 5 componentes de la oxidasa. Dos unidos a la membrana
plasmática:
gp91-phox(phagocyte
oxidase) y
p-phox! "ue
#untos
forman
el
citocromo b55$% y tres componentes citos&licos p'-phox! p-phox y p'*-phox
<. HIu" importancia diagnostica tiene la determinación de O -J )l producir O- nos indica !ue el neutróflo esta activado , #a !ue se aislo el neutróflo , # posteriormente se le mezclo co +$) !ue es !uien activa las v&as de se5alización de ls v&as de protein cinsa . )l activarse el ne#troflo !uiere decir ! este se a activado. 7. :ndi!ue la reacción catalizada por la )*+ oxidasa +a acti,idad de la D/0 oxidasa fagoctica constituye una de las fuentes end&genas más importantes de especies reacti,as del oxgeno en el organismo. 2lla catali3a la transferencia de un electr&n desde el D/0 hacia el 4 con la formaci&n del radical super&xido (4 -) y reacciones posteriores producen per&xido de hidr&geno (0 4)! ácido hipocloroso (04l) y otros productos microbicidas (40! 14)! ya sea en el espacio extracelular o en la ,acuola fagoctica! "ue son capaces de e#ercer efectos t&xicos sobre los organismos ingeridos o microbios extracelulares.
C'%#,$"'$ : Los neutróflos tienen una unción undamental en los mecanismos de deensa contra los agentes microbianos . Son las células que más rápidamente llegan al sitio de la inección en la respuesta inmune innata y tienen una actividad undamental en la destrucción de los microorganismos. La destrucción de los patógenos por los neutróflos es mediada por dos procesos undamentales: la activación del sistema enzimático N!"# o$idasa que permite la producción de especies reactivas del o$%geno durante el enómeno conocido como estallido respiratorio& y la ormación del agolisosoma con destrucción de los patógenos por acción de las enzimas lisosomales
