REUNION DE LABORATORIO N° 10
IV UNIDAD
PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO
REUNION DE LABORATORIO N°10 PRACTICA N° 18 DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA
I.
INTRODUCCION: La digestión de las proteínas, o degradación hasta aminoácidos a minoácidos en el tubo digestivo, es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gástrico: pepsina y renina; renina; b) de origen pancreático: tripsina, quimotripsina, elastasa y carboxipeptidasa; c) de origen intestinal: aminopeptidasas, dipeptidasas. Son endopeptidasas: pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasas. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. La tripsina, es activada por la enterocinasa en el intestino, y es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. La quimotripsina es específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin sin carga como los aromáticos: tirosina, triptofano y fenilalanina. La elastasa tiene una especificidad amplia, ataca a los residuos pequeños, como la glicina, alanina y serina. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas. La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces, que provienen de la carne de los alimentos), y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados nitrogenados en las heces). En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa, existe hipoproteinemia, con retardo marcado del crecimiento. La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la la leche, determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina
II.
III.
REACTIVOS A UTILIZAR: - Caseína al 1% en buffer fosfato 0,1 M pH 8. - Buffer fosfato 0,1 M pH 8. - Solución de extracto pancreático. - Solución acuosa de ninhidrina al 0,25% saturada con butanol. - Acido tricloroacético al 10%. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema:
COMPONENTES (ml)
I
II
III
Caseína al 1% Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0 Solución de extracto pancreático Agua destilada
1 1 1 ---
1 1 --1
--1 1 1
Pasos: *
Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos.
*
Después del tiempo de incubado tomar 0,5 ml, de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I, II, III).
*
En este nuevo sistema, agregar 1 ml de solución de ninhidrina.
*
Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición), durante 3 a 5 minutos.
*
Observa los cambios de color de cada tubo.
*
Luego a los tubos de incubación del primer sistema, agregue gota a gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente.
Observe las variaciones que se produce en cada tubo. IV. RESULTADOS Sistema I: *
TUBO I: La ninhidrina evidencia la formación de aminoácidos, debido a esto el tubo I se va a teñir más oscuro, por la presencia de enzima y sustrato. TUBO II: En este tubo sólo hay sustrato, así que la proteína no se degrada, la ninhidrina lo reconoce con menor intensidad, haciendo que se tiña de un color rojo pardo medio. TUBO III. Ausencia de sustrato. No hay reacción alguna. La tinción es casi transparente.
Trabajando en el primer sistema: 1ml de ácido Tricloroacetico Resultados:
El ácido tricloroacético precipita la proteína que no ha sido degrada, es por esto observamos lo siguiente:
TUBO I: Presencia de sustrato y enzima. La proteólisis se dio por completo, no quedaron residuos de péptidos por lo que la solución al entra en contacto con el ácido tricloroacético no revela precipitado. TUBO II: Aquí observamos la precipitación de proteína no degradada ya que no hubo enzima que actuara sobre el sustrato. TUBO III: Ausencia de sustrato. El ácido tricloroacético no tiene proteínas que precipitar.
V. CUESTIONARIO 1. Señale las enzimas digestivas pancreaticas y los sustratos sobre los cuales actúa - Lipasa pancreática. Actúa sobre los lípidos y su producto son cadenas de ácidos grasos y glicerol. - Amilasa pancreática. Rompe el almidón en maltosas. - Tripsina. Degrada los polipéptidos en oligopéptidos. - Quimiotripsina. Actúa sobre los oligopéptidos y su producto son dipéptidos. 2. ¿Cómo se explica los cambios de color, después de la reacción con ninhidrina en un sistema donde se produce la digestión de proteínas? La ninhidrina es utilizada con fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos. Da una coloración que varía de azul a violeta intenso. La coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del aminoácido. Indica que hay aminoácidos libres hay aminoacidos libres. Por lo tanto en un sistema donde se produce la digestión de proteínas correctamente se demostraría la degradación de la proteína debido a que la ninhidrina le daría un color violeta intenso al encontrar la presencia de aminoácidos.
3. Qué efecto tiene el ácido tricloroacetico sobre las proteínas? ¿Qué variaciones se obtienen en un sistema de digestión de proteínas, después de agregar acido tricloroacetico? El ácido Tricloroacético es un precipitador de proteínas es por esta razón que en un sistema de digestión de proteínas correctamente realizado no se
observaría variación debido a que las proteínas se habrían degradado a aminoácidos. En cambio en caso de que no se haya realizado un correcta digestión de proteínas el ácido tricloroacético precipitara a la proteína que no ha sido degradada.
