Alumnos: BRAVO ESPINOSA DE LOS MONTEROS FRANCISCO JAVIER WENDY RANGEL S.
EQUIPO: 7
SEMESTRE 2012-1
Practica # 1: producción de acido cítrico por Aspergillus niger.
Objetivos:
Realizar la producción de acido cítrico mediante fermentación sumergida empleando como microorganismo productor a Aspergillus niger. Evaluar el crecimiento de Aspergillus niger mediante la determinación de la constante de velocidad de crecimiento (µ), el tiempo de duplicación (Td) y la curva de crecimiento del microorganismo. Determinar los rendimientos de acido cítrico producido y biomasa con respecto a la cantidad de sustrato proporcionado, asi como la cantidad de producto generado respecto a la cantidad de biomasa. Observar el comportamiento de la curva de formación de productos con respecto al crecimiento
Resultados: CURVA DE CRECIMIENTO Tabla 1. Datos de biomasa t de fermentación (hrs.)
X (mg/mL)
Gráfico 1. Curva de Crecimiento
45.00 40.00
0
7.39
5
8.00
10
8.50
15
9.03
20
11.59
25
14.88
30
19.11
15.00
35
24.53
10.00
40
31.55
45
40.55
50
36.60
55
40.45
60
36.60
65
40.45
70
40.45
35.00 30.00
) L 25.00 m / g m 20.00 ( X
Fase lag
5.00 0.00 0
20
40
60
Tiempo de Fermentación (hrs.)
80
DETERMINACIÒN DE LA VELOCIDAD ESPECÍFICA DE CRECIEMIENTO Tabla 2. Ln de Biomasa (X) t de fermentación (hrs.)
ln X
Gráfico 2. Velocidad específica de crecimiento
0
2.00
5
2.08
10
2.14
15
2.20
20
2.45
2.5
25
2.70
30
2.95
X n 2 l
35
3.20
40
3.45
1
45
3.70
0.5
50
3.60
55
3.70
60
3.60
65
3.70
70
3.70
4 3.5 3
y = 0.0501x + 1.4488 R² = 1
1.5
0 0
20
40
h Constante de velocidad específica de crecimiento
DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE DUPLICACIÓN (Td) ln 2
Td=
0.69314718
=
=
13,863 h.
0.05
DETERMINACIÓN DE SUSTRATO CONSUMIDO Tabla 3. Curva Patrón Glu. (mg/mL)
Abs 1
60
tiempo de fermentación (hrs.)
Abs 2
Abs promedio
0.2
0.117
0.183
0.15
0.4
0.324
0.422
0.373
0.6
0.551
0.555
0.553
0.8
0.855
0.734
0.7945
1
0.91
0.896
0.903
rs -1
Gráfico 3. Curva Patrón 1 0.8 a i c n 0.6 a b r o s 0.4 b A
y = 0.9638x - 0.0236 R² = 0.9891
0.2 0 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Concentración de Glucosa mg/mL
Concentracion de glucosa al tiempo 0 =
0.324 mg/mL
Concentracion de glucosa al tiempo final =
0.0249 mg/mL
Tabla 4. Eficiencia de uso de sustrato tiempo de fermentación (hrs)
Sustrato (mg/mL) 0
20
5
19.4
10
18.8
15
18
20
16.5
25
14.8
30
13
35
11.5
40
9.8
45
8
50
6.3
55
4.7
60
3
65
3.2
70
3.4
25
Grafica 4. Eficiencia de uso de sustrato
o t 20 a r t s u s e15 d n ó i c a 10 r t n e c n o 5 C
Sustrato (mg/mL)
0 0
20
40
60
Tiempo de fermentación
80
EUSproblema
Si-Sf
=
EUSdatos
=
20.0-3.4
=
Si
3.4
Si-Sf
0.3240.0249
=
Si
=
4.88
=
0.923
0.324
DETERMINACIÓN DE ACIDEZ (CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTO OBTENIDO) Tabla. 5 Acidez/ Producto tiempo de % de acidez fermentación (%P) (hrs) 50
Tabla 6. Cuadro Resumen EUS datos EUS problema 0.923
50
4.88
70
80
X (mg/mL)
Yp/s
Yx/s
Y/px
228.92 %
199.16 %
114.94 %
Discusión de resultados: Dentro de la bibliografía se menciona que la velocidad especifica de crecimiento como su nombre lo indica tiene un valor característico para cada tipo de microorganismo empleado según sus características nutricionales, la composición del medio, al igual que la temperatura y el pH del mismo. Este valor al ser calculado nos indica la rapidez con la que un microorganismo se desarrolla en el medio lo que nos permite tener una mayor certeza de en que tiempo se alcanza la concentración adecuada de microorganismos para iniciar con el proceso de producción de nuestro metabolito de interés, y se ve alterado el valor con respecto a la concentración del sustrato utilizado en el medio. Velocidad especifica de crecimiento:
Bacteria 0.9 h -1 Levadura 0.45 h -1 Hongo filamentoso 0.25 h -1 Nuestro resultado fue de 0.05 h -1
Aunque estos valores representan un promedio de muchas especies en medios de referencia se puede tomar como indicadores a la hora de comparar el resultado de nuestros datos y concluir si se llevo a cabo con éxito el experimento. Por otro lado el tiempo de duplicación nos indica el tiempo requerido para que la célula se divida o para que la población de un organismo se duplique en número. Dentro de la grafica 5 se presenta el porciento de producto (acidez), en este punto se puede observar como esta grafica se comporta de igual forma que la curva de crecimiento, y esto nos da a entender que durante la fase lag y log la producción o aparición de producto es baja ya que las enzimas que catalizan el ciclo de krebs se encuentran mucho mas activas durante este intervalo lo que evita la acumulación del producto, sin embargo cuando se compara en el cartograma esta misma grafica se puede observar como cuando el microorganismo a llegado a la fase de mantenimiento el producto empieza a acumularse en grandes cantidades dentro del medio; es debido a este comportamiento que podemos saber que el acido cítrico es producido como un metabolito secundario por A. niger. Lo que se trata de representar en el cartograma es tan solo la relación que existe entre la curva de crecimiento, el uso del sustrato y la producción del metabolito; aquí se puede observar como al ir avanzando el crecimiento del hongo el sustrato es utilizado y como entre mas sustrato sea utilizado se va presentando una mayor concentración de nuestro producto.
Conclusiones: Actualmente la mayor parte del acido cítrico producido mundialmente se obtiene mediante el método de fermentación sumergida y siendo utilizado como microorganismo principal Aspergillus niger debido a que este microorganismo en condiciones de deficiencia de hierro produce acido cítrico en grandes cantidades para ser utilizado como agente quelante del hierro para lograr cumplir con sus necesidades metabólicas; es debido a este comportamiento del microorganismo por lo que se utiliza preferentemente a las especies de A. niger sobre otros microorganismos para la producción del acido cítrico. Por otra parte se debe de tener en cuenta que los resultados usados para elaborar los cálculos pertenecen a un caso teórico ya que debido a las circunstancias relacionadas al horario de clase era imposible realizar tomas de muestra en intervalos de tiempo mas corto lo que explicaría el porque al intentar leer las muestras en el espectro los valores eran prácticamente iguales. Aunque no se pudieron utilizar nuestros datos para la determinación de todos los parámetros del proceso, pudimos utilizarlos para observar que aunque el cultivo se contaminara efectivamente se produjo el acido cítrico, esto quedo evidenciado al realizar la titulación del medio.
Bibliografia:
Madigan M., Martinko J. & Parker J.” Brock Biologia de los microorganismos” 10. Ed. Prentice Hall España 975 – 976.