Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción Saltar a: navegación, búsqueda En biología molecular, el término polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción o RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism) se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que varían entre individuos. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción. La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relación genética entre individuos.
Metodología El ADN de un individuo se extrae y se purifica. El ADN purificado puede ser amplificado usando la técnica molecular Reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés Polymerase Chain Reaction), luego tratado con enzimas de restricción específicas para producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Los fragmentos de restricción se separan mediante electroforesis en geles de agarosa. Esto proporciona un patrón de bandas que es único para un ADN en particular.
[editar] Aplicaciones El análisis de la variación de RFLP en genomas ha supuesto en el pasado una herramienta fundamental en el mapeo genómico y el análisis de enfermedades genéticas. Cuando los investigadores pretendían determinar la localización cromosómica de una determinada enfermedad, analizaban el ADN de los miembros de una familia afectada por la enfermedad, y buscaban los alelos para RFLP que mostraban patrones de herencia similares a los de la enfermedad. Una vez el gen era localizado, el análisis RFLP de otras familias podría predecir su riesgo de padecer esa enfermedad, o quiénes tenían posibilidades de portar el gen mutante. El análisis RFLP fue también la base de las modernas técnicas de análisis de huellas genéticas (Genetic Fingerprinting analysis en inglés), útiles en la identificación de muestras recuperadas de la escena de un crimen, en pruebas de paternidad, y en el estudio de la biodiversidad en poblaciones animales.
[editar] Diagnóstico de una enfermedad mediante screening de un marcador RFLP Cuando un RFLP normalmente se asocia con una enfermedad de origen genético, la presencia o ausencia de éste puede usarse a modo de consejo sobre el riesgo de desarrollar o transmitir la enfermedad. La suposición es que el gen en el que los investigadores están realmente interesados está localizado tan cerca del RFLP que su presencia puede servir como indicador de la alteración en el gen. A veces, un RFLP en particular puede estar asociado con el alelo sano. Por esto es esencial examinar no sólo al paciente, sino a todos los miembros de la familia que sea posible. Las pruebas más útiles para tales análisis son las asociadas a una única secuencia del DNA; esto es, una secuencia que está presente en un solo lugar del genoma. A menudo, este DNA presenta una función que es desconocida. Esto puede ser de ayuda si ha mutado libremente sin dañar al individuo. La muestra del sujeto sometido al diagnóstico hibridará con distintas longitudes de DNA digerido de diferentes personas dependiendo de los sitios de corte de la enzima que haya heredado. Una gran variedad de polimorfismos puede presentarse en la población, obteniendo una gran colección de alelos. Algunas personas serán homocigotos y presentarán una única banda, otros ( ej, todos los miembros de la familia mostrados abajo) serán heterocigotos y presentarán una banda distinta por cada alelo. Archivo:RFLPSCREENING.GIF El pedigree muestra la herencia del marcador RFLP a través de tres generaciones en una sola familia. Un total de 8 alelos (numerados a la izquierda del gel) están presentes en la familia. Los RFLPs de cada miembro de la familia están enumerados justo debajo de ellos. Si, por ejemplo, cada persona que heredó el alelo RFLP 2 tuviera también cierto desorden heredado, y ninguno de los que carecieran del alelo tuviera la afección, deduciríamos que el gen de la enfermedad está ligado de manera muy próxima al RFLP. Si los padres decidieran tener otro hijo, un test prenatal podría revelar si el niño presentaría la enfermedad. Pero destacar que el cruzamiento durante la formación de los gametos podrían mover el marcador RFLP al alelo sano. Por esto, a mayor distancia entre el RFLP y el locus del gen, disminuye la probabilidad de un diagnóstico preciso.
Método RFLP - Polimorfismo de Fragmentos de Restricción RFLP (a menudo pronunciado "labio del Rif", como si se tratara de una palabra) es un método usado por los biólogos moleculares para seguir una secuencia particular de ADN, que se transmite a otras células. RFLP se puede utilizar en muchos entornos diferentes para lograr diferentes objetivos. RFLP se pueden utilizar en casos de paternidad o casos penales para determinar el origen de una muestra de ADN. RFLPs puede ser utilizado determinar el estado de la enfermedad de un individuo. RFLP se puede utilizar para medir las tasas de recombinación que puede conducir a un mapa genético con la distancia entre los loci RFLP medidos en centimorgans. En esta página web, se puede ver cómo se producen los RFLP y, a continuación tres ejemplos de la aplicación del análisis de RFLP: paternidad y estado de la enfermedad , y mapeo genético .
RFLP de Producción Cada organismo hereda su ADN de sus padres. Dado que el ADN se replica en cada generación, cualquier secuencia que se puede pasar a la siguiente generación. Un RFLP es una secuencia de ADN que tiene un sitio de restricción en cada extremo con un "blanco" secuencia en el medio. Una secuencia diana es cualquier segmento de ADN que se unen a una sonda mediante la formación de pares complementarios de bases. Una sonda es una secuencia de ADN de cadena simple que ha sido etiquetado con radiactividad o una enzima de manera que la sonda puede ser detectado. Cuando una sonda de pares de bases a su objetivo, el investigador puede detectar esta unión y saber dónde la secuencia diana es desde la sonda es detectable. RFLP produce una serie de bandas cuando una transferencia de Southern se realiza con una combinación particular de enzima de restricción y secuencia de la sonda. Por ejemplo, vamos a seguir un determinado RFLP que se define por la enzima de restricción EcoR I y la secuencia diana de 20 bases de GCATGCATGCATGCATGCAT. EcoR I se une a su GAATTC seuqence reconocimiento y corta el ADN de doble cadena como se muestra:
En el segement de ADN se muestra a continuación, puede ver los elementos de un RFLP; una secuencia diana flanqueado por un par de sitios de restricción. Cuando este segmento de ADN es cortado por EcoRI, tres fragmentos de restricción se producen, pero sólo uno contiene la secuencia diana que puede estar vinculado por la secuencia de la sonda complementaria (violeta).
Echemos un vistazo a dos personas y los segmentos de ADN que llevan a que contienen esta RFLP (para mayor claridad, sólo veremos uno de los dos stands de ADN). Desde que Jack y Jill son organismos diploides, que tienen dos copias de este RFLP. Al examinar una copia de Jack y una copia de Jill, vemos que son idénticos: Jack 1:-GAATTC --- (8,2 kb) --- GCATGCATGCATGCATGCAT --- (4,2 kb) --- GAATTC-
Jill 1:-GAATTC --- (8,2 kb) --- GCATGCATGCATGCATGCAT --- (4,2 kb) --- GAATTCCuando examinamos sus segundas copias de este RFLP, vemos que no son idénticos. Jack 2 carece de un sitio de restricción EcoRI que Jill tiene 1,2 kb upstream de la secuencia diana (diferencia en cursiva). Jack 2:-GAATTC - (1,8 kb) - CCCTTT - (1,2 kb) - GCATGCATGCATGCATGCAT - (1,3 kb)GAATTCJill 2:-GAATTC - (1,8 kb) - GAATTC - (1,2 kb) - GCATGCATGCATGCATGCAT - (1,3 kb)GAATTCPor lo tanto, cuando Jack y Jill tienen su objeto de ADN para el análisis de RFLP, tendrán una banda en banda común y una que no coincide con el otro es en el peso molecular:
Caso de paternidad Vamos a usar la tecnología RFLP para determinar si Carlos es el padre del hijo de Jill llamado Payle. En este escenario, se extrajo el ADN de las células blancas de la sangre de los tres individuos y se sometió a análisis de RFLP. Los r esultados se muestran a continuación:
En este caso, parece ser que Jack podría ser el padre, ya que Payle heredó el fragmento de 12,4 kb de Jill y el fragmento de 4,3 de Jack. Sin embargo, es posible que otro hombre
con semejante patrón de RFLP podría ser tan well.To ser cierto, varios loci RFLP más sería probado. Sería muy poco probable que dos hombres (que no sea los gemelos idénticos) que comparten múltiples patrones de RFLP y por lo tanto la paternidad pudo ser confirmado. En un escenario diferente, se extrajo el ADN de las células blancas de la sangre de los tres individuos y se sometió a análisis de RFLP. Los r esultados se muestran a continuación:
Esta vez, se puede determinar que Jack no es el padre de Payle Payle ya tiene una banda de alrededor de 6 kb y Jack no lo hace. Por lo tanto, es muy probable que el padre de Payle no es Jack, aunque es posible que Payle lleva una nueva mutación en este locus y una banda de tamaño diferente fue producido. ¿Qué podría hacer usted como a un investigador para estar más seguro de que Jack no era el padre de Payle?
Enfermedad de Estado En este ejemplo, queremos saber si una persona lleva cualquier fibrosis quística (FQ) alelos y si es así, cuántos. Debido a que la FQ es una enfermedad recesiva, anyonne con FQ debe ser homocigóticos para alelos de enfermedad. De la información de pedigrí, a menudo podemos determinar quién en esta familia es portadora. Sin embargo, si una pareja llega a un asesor en genética, a menudo un análisis de RFLP se lleva a cabo sobre el ADN de la pareja. RFLPs son conocidos por CF y por lo que sería fácil determinar si una persona eran homocigotos de tipo salvaje (wt), heterocigotos "portador", o alelos homocigotos la enfermedad y por lo tanto tienen esta enfermedad.
Para las parejas que esperan un hijo, sería fácil poner a prueba a ambos padres y hacer una predicción sobre el estado de la enfermedad final de su feto. Por ejemplo, si ambos padres son homocigotos en peso, entonces todos sus hijos también serían homocigotos peso:
Sin embargo, si ambos padres son heterocigotos, que podrían tener los niños con cualquiera de los tres genotipos, aunque los niños heterocigotos sería el doble de probabilidades que uno de los genotipos hom ocigotos.
Con el aumento de información secuencia genómica, el creciente número de enfermedades genéticas pueden predecir a partir de análisis de RFLP.
Mapeo genético Para calcular la distancia genética entre los loci que, tiene que ser capaz de observar la recombinación. Tradicionalmente, esto se realiza mediante la observación de fenotipos pero con el análisis de RFLP, es posible medir la distancia genética entre dos loci RFLP si son una parte de los genes o no. Veamos un ejemplo sencillo de moscas de la fruta. Dos loci RFLP con dos bandas RFLP posibles en cada lugar:
Estos loci se encuentran en el mismo cromosoma de la hembra (izquierda) y macho (derecha). El locus superior puede producir dos bandas diferentes llamados 1 y 3. El locus inferior puede producir bandas llamadas 2 o 4. El macho es homocigótico para la banda 1 en el locus superior y 2 para el locus inferior. La hembra es heterocigota en ambos loci. Thier patrones de RFLP de bandas se puede ver en la transferencia Southern a continuación:
El hombre sólo puede producir un tipo de gametos (1 y 2), pero la hembra puede producir cuatro gametos diferentes. Dos de los cuatro posibles son llamados los padres porque llevan ambas bandas RFLP del mismo cromosoma; 1 y 2 de la izquierda o cromosoma 3 y 4 del cromosoma derecha. Los otros dos cromosomas son recombinantes, ya ha producido la recombinación entre los dos loci y por lo tanto las bandas RFLP se mezclan de manera que uno está ahora vinculada a 4 y 3 está ligada a 2.
Cuando estos dos compañero de moscas, la frecuencia de la progenie de cuatro posibles se puede medir ya partir de esta información, la distancia genética entre los dos loci RFLP (superior e inferior) se puede determinar.
En este ejemplo, el 70% de la progenie fueron producir a partir de huevos genotipo parental y 30% fueron producidos por huevos genotipo recombinantes. Por lo tanto, estos dos loci RFLP son 30 centimorgans aparte de uno al otro.
