2
viii
18
PEWARNAAN GRAM
LAPORAN UTAMA
Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat kelulusan Praktikum Mikrobiologi Pangan Jurusan Teknologi Pangan
Oleh :
Nama : Nugraha Susanto
NRP : 113020068
Meja : 5 (Lima)
Kelompok : D
Asisten : Astrie Wijayanthi
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI PANGAN
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS PASUNDAN
BANDUNG
2012
LEMBAR PENGESAHAN
PEWARNAAN GRAM
Laporan ini telah diperiksa dan disetujui untuk memenuhi
Persyaratan Kelulusan Praktikum Mikrobiologi Pangan,
Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Teknik,
Universitas Pasundan, Bandung 2012
Menyetujui,
Astry Wijayanti
Koordinator Laboratorium
Sekaligus
Asisten Pembimbing
Rianti Herdiyanti
Asisten Laporan
KATA PENGANTAR
Segala puji dan syukur hanyalah bagi Allah SWT, Dzat Yang Maha Kuasa, dan Maha Mengetahui yang selalu memberikan karunia dan rahmat-Nya kepada penulis, sehingga penulis dapat menyelesaikan laporan utama praktikum mikrobiologi pangan ini.
Laporan utama ini disusun untuk memenuhi salah satu persyaratan kelulusan praktikum mikrobiologi pangan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Teknik, Universitas Pasundan Bandung. Laporan utama ini disusun berdasarkan percobaan yang telah penulis laksanakan selama ini di Laboratorium Mikrobiologi Pangan.
Dalam penyusunan laporan utama ini, penulis banyak sekali motivasi dari berbagai pihak dalam menyelesaikan laporan ini. Oleh karena itu pada kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Kedua orang tua yang tidak henti-hentinya mendoakan dan memberikan semangat kepada penulis dalam menjalani perkuliahan dan praktikum ini.
2. Neneng Suliasih, Ir, MP. dan Dr. H. Dede Zaenal Arief, Ir, M.Sc. selaku koordinator Laboratorium Mikrobiologi Pangan.
3. Dr. H. Dede Zaenal Arief, Ir, M.Sc. selaku koordinator Laboratorium Mikrobiologi Pangan sekalius dosen mata kuliah mikrobiologi pangan.
4.Astrie Wijayanthie, selaku koordinator asisten Laboratorium Mikrobiologi Pangan dan asisten penulis.
6. Seluruh Asisten Laboratorium Mikrobiologi Pangan, yaitu Teh Farrah, Teh Seli, Teh Vega, dan Teh Natasya, Teh Rosi, dan Kang Firman serta Teh Rianti sekaligus asisten laporan penulis, terima kasih atas bimbingannya selama praktikum.
6. Teman-teman dekat saya Aditya Bayu Devangga, Nazir Siddiq dan Egi Priadi Dwitama dan Yunus Septiawan.
7. Teman-teman angkatan 2011 "Chocolatech'11" yang telah bersama-sama melalui masa pahit dan manis dan juga memberikan dukungan kepada penulis dalam menyusun laporan utama ini.
9. Teman-teman sekelompok Bayu, Mutiani dan Nafisah yang selalu kompak dalam praktikum.
10. Semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu, yang telah membantu penulis selama prkatikum, dan juga pada saat menyusun laporan utama ini.
Dengan segala kerendahan hati, penulis menyadari bahwa "tiada gading yang tak retak, tiada gelombang tanpa ombak", untuk itu segala kesalahan merupakan kelemahan dan kekurangan penulis dan penulis menyadari laporan utama ini masih jauh dari kata sempurna karena kesempurnaan hanyalah milik sang Khalik. Segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan untuk koreksi bagi penyusunan laporan sehingga ada peningkatan untuk selanjutnya.
Akhir kata semoga laporan utama ini bisa bermanfaat bagi semua pihak teman-teman Jurusan Teknologi Pangan pada umumnya dan penulis khususnya. Semoga Allah SWT senantiasa memberikan petunjuk dan perlindungan pada kita semua.
Bandung, Desember 2012
Penulis
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR i
DAFTAR ISI iv
DAFTAR GAMBAR v
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR LAMPIRAN vii
INTISARI viii
ABSTRACT ix
I PENDAHULUAN 1
1.1. Latar Belakang Percobaan 1
1.2. Tujuan Percobaan 2
1.3. Prinsip Percobaan 2
II BAHAN, ALAT, DAN METODE PERCOBAAN 3
3.1. Bahan yang Digunakan 3
3.2. Alat yang Digunakan 3
3.3. Metode Percobaan 3
III HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN 6
3.1 Hasil Pengamatan 6
3.2 Pembahasan 7
IV KESIMPULAN DAN SARAN 19
5.1 Kesimpulan 19
5.2 Saran 19
DAFTAR PUSTAKA 20
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Metode Pewarnaan Gram………………………......5
Gambar 2. Dinding Sel Bakteri…………………………………12
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Hasil Pengamatan Pewarnaan Gram………………6
Tabel 2. Sifat Bakteri Berdasarkan Gramnya………………...11
Tabel 3 . Struktur Bakteri.....................................................12
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Pemakaian Mikroskop........................................21
Lampiran 2. Pemakaian Mikroskop........................................22
Lampiran 3. Pewarnaan Gram...............................................24
Lampiran 4. Pewarnaan Negatif.............................................25
Lampiran 5. Penetapan Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati........26
Lampiran 6. Penetapan Jumlah Sel Total..............................27
Lampiran 7. Pembentukan Spora...........................................28
Lampiran 8. Tetesan Bergantung...........................................30
Lampiran 9. Biakan Lapuk......................................................31
Lampiran 10. Peragian Gula..................................................33
Lampiran 11. Isolasi Cawan Tuang dan Cawan Gores..........34
Lampiran 12. Sterilisasi Alat dan Bahan................................37
Lampiran 13. Pemeriksaan Air...............................................39
Lampiran 14. Pembiakan Serratia marcescens.....................44
Lampiran 15. Pembentukan AMK..........................................46
Lampiran 16. Pembentukkan Indol dari Pepton.....................47
Lampiran 17. Zat Anti Mikroba...............................................48
Lampiran 18. Uji Mutu Makan (UMM)....................................50
Lampiran 19. Pembentukkan H2S..........................................56
Lampiran 20. Perubahan Air Susu.........................................57
Lampiran 21. Pembentukkan Gas..........................................59
Lampiran 22. Penguraian Enzim oleh bakteri........................60
INTISARI
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni bakteri gram positif dan gram negatif.
Tujuan percobaan pewarnaan gram untuk menegtahui atau memperjelas bentuk-bentuk sel bakteri yang kebanyakan bersifat transfaran sehingga dapat dilihat dengan jelas dan untuk membedakan morfologi dan struktur atau bagian-bagian sel bakteri gram positif dan gram negatif. Prinsip percobaan pewarnaan gram berdasarkan pewarnan langsung sehingga sel bakteri terwarnai dan terlihat jelas dan berdasarkan pewarnaan diferensial yaitu pewarnaan yang mengacu pada sifat permeabelitas dinding sel masing-masing bakteri terhadap molekul-molekul zat warna.
Berdasarkan hasil pengamatan, pada percobaan pewarnaan gram bakteri Staphylococcus aureus termasuk bakteri gram positif sedangkan bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif.
ABSTRACT
Gram staining is based on thick or thin layer of peptidoglycan in the cell wall and the extent of the layer of fat on the bacterial cell membrane. Staining is useful to differentiate bacterial species into two large groups, the gram-positive and gram-negative.
Gram staining experiments aim to clarify know or bacterial cells forms the largely transfaran can be seen clearly and to distinguish the morphology and structure of cells or parts of gram-positive and gram-negative. The principle of gram staining experiments by collorer directly so that bacteria cells stained and visible and based on the differential staining refers to staining permeabelitas properties of each cell wall of bacteria to the dye molecules.
Based on observation, the bacteria Staphylococcus aureus, including gram-positive bacteria, while the bacteria Escherichia coli including gram-negative bacteria.
I PENDAHULUAN
Bab ini menguraikan mengenai : (1) Latar Belakang Percobaan, (2) Tujuan Percobaan, dan (3) Prinsip Percobaan.
1.1. Latar Belakang Percobaan
Mikrobiologi merupakan suatu ilmu yang mempelajari kehidupan mahkluk yang bersifat mikroskopik yang disebut mikroorganisme atau jasad renik yaitu mahkluk yang mempunyai ukuran sel sangat kecil dimana setiap selnya hanya dapat dilihat dengan bantuan mikroskop (Fardiaz, 1992).
Mikrobiologi pangan merupakan ilmu yang mepelajari pola interaksi antara mikroba dengan bahan pangan baik secara keseluruhan maupun komponen bahan pangan secara sendiri-sendiri. Oleh karena itu pada hakikatnya ilmu ini mempelajari masalah ekologi mikroba sebagai satu sistem, dimana komponen – komponen bahan pangan dan sel-sel mikroba sebagai sub-sistemnya yang berintraksi secara kompleks (Ali, 2012).
Satu sel jasad mikroba merupakan satu kesatuan hidup dimana satu sel tersebut mengerjakan seluruh fungsi hidup jasad, oleh karena itu satu sel mikroba dianggap sebagai satu jasad sedangkan satu sel jasad tingkat tinggi merupakan satu kesatuan struktur dimana sel dari jasad tingkat tinggi ini hanya mengerjakan fungsi sesuai dengan jaringan dimana sel tersebut berada (Ali, 2011).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, bakteri gram positif dan gram negatif (Wikipedia, 2010).
1.2. Tujuan Percobaan
Tujuan percobaan pewarnaan gram untuk menegtahui atau memperjelas bentuk-bentuk sel bakteri yang kebanyakan bersifat transfaran dapat dilihat dengan jelas dan untuk membedakan morfologi dan struktur atau bagian-bagian sel bakteri gram positif dan gram negatif.
1.3. Prinsip Percobaan
Prinsip percobaan pewarnaan gram berdasarkan pewarnan langsung sehingga sel bakteri terwarnai dan terlihat jelas dan berdasarkan pewarnaan diferensial yaitu pewarnaan yang mengacu pada sifat permeabelitas dinding sel masing-masing bakteri terhadap molekul-molekul zat warna.
II BAHAN, ALAT, DAN METODE PERCOBAAN
Bab ini menguraikan mengenai: (1) Bahan yang Digunakan, (2) Alat yang Digunakan, dan (3) Metode Percobaan.
3.1. Bahan yang Digunakan
Bahan–bahan yang digunakan dalam percobaan pewarnaan gram adalah suspensi Staphylococcus aureus suspensi Escherichia coli, alkohol 70% dan alkohol 96% sedangkan sebagai bahan pewarnanya adalah KKV (Kristal Karbon Violet) , lugol dan fuchin basa.
3.2. Alat yang Digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan pewarnaan gram adalah mikroskop, cover glass, tabung reaksi, pipet tetes, jarum oase dan pembakar spirtus.
3.3. Metode Percobaan
Bersihkan kaca objek dengan alkohol 70% dengan menggunakan kapas maupun tisu setalah dibersihkan kemudian fiksasi kaca objek dengan tujuan untuk menghilangkan lemak yang akan mengganggu terhadap pengamatan, langkah selanjurtnya pijarkan jarum oase, ambil suspensi Staphylococcus aureus dan suspensi Escherichia coli teteskan kelensa objek dan fiksasi, berikan 1 – 2 tetes KKV (Kristal Karbon Violet) dan diamkan selama tiga menit kemudian beri satu tetes lugol dan diamkan selama 45 detik, setelah 45 detik bilas dengan alcohol 96% serta keringkan dengan mengggunakan kertas saring, selanjutnya beri 1 – 2 tetes fucshin basa diamkan tiga menit lalu keringkan dengan kertas saring, amati dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 100x dan 400x.
Bersihkan kaca objek dengan alkohol 70 % dan Fiksasi.
Bersihkan kaca objek dengan alkohol 70 % dan Fiksasi.
Pijarkan jarum oase
Pijarkan jarum oase
Ambil suspensi Staphylococcus aureus dan suspensi Escherichia coli
Ambil suspensi Staphylococcus aureus dan suspensi Escherichia coli
Fiksasi
Fiksasi
Beri 1-2 tetes KKV diamkan 3 menit kemudian beri 1 tetes lugol diamkan 45 detik.
Beri 1-2 tetes KKV diamkan 3 menit kemudian beri 1 tetes lugol diamkan 45 detik.
Bilas dengan alkohol 96% diamkan 1 menit keringkan dengan kertas saring.
Bilas dengan alkohol 96% diamkan 1 menit keringkan dengan kertas saring.
Beri 1-2 tetes fucshin basa diamkan 3 menit lalu keringkan dengan kertas saring.
Beri 1-2 tetes fucshin basa diamkan 3 menit lalu keringkan dengan kertas saring.
Amati dengan pembesaran 100x dan 400x
Gambar 1. Metode Pewarnaan Gram.
III HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN
Bab ini menguraikan mengenai : (1) Hasil Pengamatan,
dan (2) Pembahasan.
3.1 Hasil Pengamatan
Tabel 1. Hasil Pengamatan Pewarnaan Gram
Gambar
Keterangan
400X
400X
Nama Bakteri : Staphylococcus aureus
Bentuk : Coccus (bulat)
Susunan : Monococcus
Warna : Ungu
Gram : Positif
Zat warna : KKV (Kristal Karbon Violet)
400X
400X
Nama Bakteri : Escherchia coli
Bentuk : Batang (bacil)
Susunan : Monobacil
Warna : Merah Muda
Zat Warna : Fuchsin basa
Gram : Negatif
Sumber : ( Nugraha Susanto, Meja 5, Kelompok D, 2012).
3.2 Pembahasan
Berdasarkan hasil pengamatan, pada percobaan pewarnaan gram terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan bakteri Escherichia coli didapatkan bahwa bakteri Staphylococcus aureus termasuk bakteri gram positif sedangkan bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif ( Fardiaz, 1992).
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu : pewarnaan diferensial (gram), pewarnaan sederhana, dan pewarnaan khusus (Fitria, 2009).
1. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan gram, bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Fitria, 2009).
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negative tidak (Aditya, 2010).
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya, 2010)
Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuchsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan (Fitria, 2009).
a. Pewarnaan Asam, pewarnaan asam merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin (Aditya, 2010).
b. Pewarnaan Basa, pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (Aditya, 2010).
3. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel . Contoh pewarnaan khusus : Pewarnaan endospora anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dari pewarnaan ini adalah untuk membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucshin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Lay, 1994).
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Sifat
Bakteri garam positif
Bakteri gram negatif
Komposisi dinding sel
Kandungan lipid rendah (1-4%)
Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin
Lebih sensitif
Lebih tahan
Penghambatan oleh pewarna basa (VK)
Lebih dihambat
Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi
Kebanyakan spesies relatif kompleks
Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
Lebih tahan
Kurang tahan
Tabel 2. Sifat Bakteri Berdasarkan Gramnya.
(Fitria, 2009).
Gambar 2. Dinding Sel Bakteri
Tabel 3 . Struktur Bakteri
NO
Struktur
Fungsi
Komposisi
1
Capsul
Pelindung, perekat antar sel, cadangan karbohidrat
Karbohidrat (gula sederhana, amino, asam gula)
2
Fagella
Alat gerak
Protein
3
Pilli
Transfer material gen
Protein
4
Cell wall murein
Pelindung sel, pemberi bentuk pada sel
Mukokompleks
5
Cytoplasmic membrane
Pengatur transfor nutrisi pada sisa metabolisme
Protein, lipid, asam nukleat
6
Ribosom
Tempat polipeptidasi protein
RNA, Protein
7
Nukleus
Lokasi gen
Posforprotein dan lipoprotein
8
Volutin
Cadangan posfat
DNA
(Ali, 2011 ).
Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain : kristal karbon violet (KKV), lugol ,safranin dan fuchin basa.
Kristal Karbon Violet (KKV)
Kristal karbon violet (KKV) adalah pewarna triarylmethane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).
Lugol
Lugol's yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi sedangkan di dalam laboratorium digunakan sebagai pewarnaan biasanya digunakan dalam pewarnaan gram sebagai pengintensifan warna bakteri baik gram positif maupun gram negatif (Dwidjoseputro,1998).
Safranin
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruh inti sel darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia ada juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redoks dalam kimia analitik (Sutedjo,1991).
Fucshin Basa
Fucshin basa merupakan campuaran fuchsin fenol dan dasar yang digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobakteria karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba, fuchsin basa juga digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994).
Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam empat tahap yaitu:
a. Pemberian cat warna utama (karbon kristal violet) berwarna ungu.
b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan lugol.
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol 96%.
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna fucshin basa
Mekanisme pewarnaan gram dimulai dari fiksasi ke-2, dengan tujuan untuk membuka pori-pori dari dinding sel bakteri sehingga bakteri gram positif maupun negatif akan dapat menyerap warna.
Kristal karbon violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama tiga menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri (Fitria, 2009).
Pewarna lugol yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pewarnaan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat (Fitria, 2009).
Selanjutnya, pemberian tetes demi tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan selama satu menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga warnanya hilang. Alkohol 96% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pewarnaan gram ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel (Fitria, 2009).
Pada pembasuhan menggunakan alcohol 96% terjadi reaksi, reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%.
Gram Positif : lipid << + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein dinding sel terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-lugol tidak tercuci).
Gram Negatif : lipid >> + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk besar, protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-lugol tercuci).
Fucshin basa merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, fucshin basa memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan fucshin basa masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna fucshin basa tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu (Fitria, 2009).
Aplikasi dibidang pangan pada percobaan pewarnaan gram diantaranya untuk mengetahui ada tidaknya bakteri Escherichia coli dan bakteri Staphylococcus aureus dalam bahan pangan yang dapat mengganggu ketahanan pangan dan keamanan pangan karena bakteri Escherichia coli dan bakteri Staphylococcus aureus merupakan bakteri pathogen.
IV KESIMPULAN DAN SARAN
Bab ini menguraikan mengenai: (1) Kesimpukan
dan (2) Saran.
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan, pada percobaan pewarnaan gram terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan bakteri Escherichia coli didapatkan bahwa bakteri Staphylococcus aureus termasuk bakteri gram positif sedangkan bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif.
5.2 Saran
Pengamatan pewarnaan gram diperlukan ketelatenan dan ketelitian dalam pelaksanaan step demi stepnya karena jika dilakukan dengan cereboh dan tidak menggunakan prosedur yang telah ditetapkan akan mempengaruhi hasil dan tidak menutup kemungkinan akan terjadi kecelakaan kerja, serta sebelum praktikum diharapkan praktikan memahami terlebih dahulu apa yang akan dikerjakan.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2010. Pewarnaan Gram. Http://www.wikipedia.com, Akses 1/12/12.
Anonim. 2010. Bakteri Tahan Asam . http://my.opera.com/chanlightz/blog. Akses 1/12/12.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Penerbit : PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Krueger, RG , N.W. Gillham, dan J.H. Coggin JR. 1973. Introduction To Microboilogy. Penerbit : The Macmillan Compony. New York.
Muhamad, Ali. 2011 . Mikrobiologi Dasar. Penerbit : Universitas Pasundan, Bandung.
Muhamad, Ali. 2012 . Mikrobiologi Pangan. Penerbit : Universitas Pasundan, Bandung.
Pelczar, M. J. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit : Universitas Indonesia, Jakarta.
Reyza, M. 2008. Metode Pewarnaan Gram, http://qi206.wordpress.co. Akses 1/12/12
3
19
6
20
vi
vii
iv
v
iii
