Pemotongan DNA Dengan Enzim Restriksi

PEMOTONGAN DNA DENGAN ENZIM RESTRIKSI

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Rekayasa genetika bertujuan memperbaiki ekspresi gen pada suatu organisme. Perbaikan ekspresi gen dilakukan dengan merekombinasi potongan DNA. Tahap awal rekombinasi DNA adalah pemotongan fragmen DNA. Pemotongan fragmen DNA ini disebut restriksi (Champbell et al.  al.  2005). 2005). Restriksi dilakukan dilakukan dengan menggunakan  Polimerase Chain Reaction (PCR) (PCR) enzim restriksi. Enzim restriksi atau endonuklease restriksi adalah enzim yang mengenali nukleotida spesifik dalam suatu DNA utas ganda dan memisahkan DNA pada lokasi tersebut (Nugroho dan Rahayu 2017). DNA yang dipisahkan oleh enzim ini bervariasi tergantung pada jumlah pengulangan situs pemotongan yang ada pada DNA tersebut. Enzim ini dimiliki oleh organisme prokariot. Modifikasi restriksi pada prokariot disebabkan  selfish gene  gene  yang berperan dalam peningkatan diversitas gen (Pignoud 2004). Tujuan

Praktikum bertujuan mengetahui dan melakukan pemotongan DNA dengan enzim restriksi. TINJAUAN PUSTAKA

EcoR1 adalah enzim restriksi endonuklease tipe II yang umum digunakan dalam  pemotongan sekuens DNA. Enzim ini memotong sekuens DNA dari 5-3) G - *A  –  A –   A  –  T  –  T –   T  –  C   C dan 3-5) C –  C  –  T –   T  –  T –   T  –  A –   A  –  A –   A  – * G (Woodhead dan Malcolm 1980). Sisi aktif EcoR1 terdiri dari dua sub unit meliputi 20 lisin dan beberapa residu sistein(Modrich dan Zabel 1976). Kerja enzim EcoR1 dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti pH dan keberadaan ion Mg2+(Boyer 1971). Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan perbanyakan DNA secara in vitro. Komponen utama yang berperan dalam proses PCR adalah DNA cetakan, Polinukleotida primer, Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), Enzim DNA Polimerase, dan Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer (Yusuf 2010). DNA merupakan polinukleotida utas ganda yang tersusun secara antiparalel. Pembukaan utas DNA oleh helikase yang searah membuat satu utas DNA mengalami replikasi dari ujung 5’P ke ujung 3’OH dan sebaliknya di ujung yang lain. Proses PCR umumnya menggunakan dua jenis primer yaitu primer L1 dan primer L2. Menurut Sorenson et al. (1994), primer L1 digunakan sebagai primer untuk replikasi DNA dari ujung 3’ ke ujung 5’ sedangkan primer L2 L2 untuk replikasi DNA dari ujung 5 ke ujung 3.

METODE

a. Restriksi Sebanyak 5μL DNA ditambahkan dengan 0,5 μL EcoR1 Campuran DNA dan EcoR1 ditambahkan buffer EcoR1 sebanyak 2 μL Campuran tersebut ditambahkan ddH 2O sebanyak 2 μL dan disuspensi Hasil suspensi diinkubasi pada suhu 37°C over night  Hasil inkubasi disiman dalam freezer  Hasil inkubasi dielektroforesis pada 100 V selama 28 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan UV  b.  Polymerase Chain Reaction (PCR) Sebanyak 1 μL template ditambahkan dengan PCR mix ( PCR mix: primer L1 (f), Primer L2 (r) ddH2O, loading dye, Taq Pol. buffer , dan dNTP) Campuran tersebut disuspensi dan dimasukkan kedalam tabung ependorf dan dimasukkan ke alat PCR sebanyak 30 siklus. Hasil PCR dielektroforesis selama 28 menit 100 volt

Hasil elektroforesis diamati dengan sinar ultraviolet HASIL PENGAMATAN

Marker Kel 2

Pita DNA

Pita DNA tipis Kel 2

Marker

Tidak ada pita DNA Pita DNA

Gambar 1 Hasil elektroforesis DNA dengan PCR (atas) dan DNA dengan perlakuan restriksi (bawah), literatur 1 kb (Kanan)(Hadi 2005). Keterangan: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Sumur 1: Marker Sumur 2: Kelompok 1 Sumur 3: Kelompok 2 Sumur 4: Kelompok 3 Sumur 5: Kelompok 4 Sumur 6: Kelompok 5

7. Sumur 7: Kelompok 6 8. Sumur 8: Kelompok 7 9. Sumur 9: Kelompok 8 10. Sumur 10: Kelompok 9 11. Sumur 11: Kelompok 10

PEMBAHASAN

Restriksi merupakan proses pemotongan DNA dengan enzim restriksi endonuklease yang spesifik. Praktikum ini menggunakan dua cara untuk restriksi DNA yaitu dengan penambahan enzim restriksi dan PCR. PCR yang dilakukan bertujuan untuk memperbanyak DNA sehingga DNA mudah dianalisis. Hasil elektroforesis DNA yang telah di PCR menunjukkan plasmid yang diisolasi berukuran 3000 pasang basa. Banyak DNA hasil elektroforesis adalah 1.073.741.824 DNA. Hasil elektroforesis DNA yang telah dipotong oleh enzim restriksi tidak terdapat  pita DNA. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor di antaranya adalah lama waktu elektroforesis. Lama waktu elektroforesis mempengaruhi seberapa jauh DNA bergerak ke arah kutub positif. Waktu elektroforesis yang lebih lama menyebabkan DNA hasil restriksi yang kecil sudah keluar dari agarose sehingga tidak terdapat pita DNA pada hasil elektroforesis. SIMPULAN Pemotongan DNA dengan enzim restriksi dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi dan PCR. Enzim restriksi berfungsi memotong DNA pada tempat yang spesifik. PCR berfungsi menggandakan DNA agar DNA mudah dianalisis dengan elektroforesis. Hasil restriksi DNA dipengaruhi oleh lama waktu elektroforesis dan  proses pembuatan suspensi DNA.

DAFTAR PUSTAKA

Boyer HW. 1971. Influence of Mg 2+ absence to EcoR1 activity. Ann. Rev. Microbiol. 25: 153-174. Champbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2005. Biologi Edisi Kelima. Jakarta (ID): Erlangga. Hadi S. 2005. Karakterisasi fragmen DNA gen glukoamilase (GLUT) produk PCR dengan analisis restriksi. J. Penelitian Hayati. 11: 79-88. Modrich P, Zabel D. 1976. Protein composition of EcoR1 and its characteristics.  J. Bio Chem. 251: 5886-5874  Nugroho ED, Rahayu DA. 2017. Pengantar Bioteknologi (Teori dan Aplikasi). Yogyakarta (ID): Penerbit Deepublish

Pignoud A. 2004. Restriction Endonuclease. New York (US): Springer. Sorenson GD, Pribish DM, Valone FH, Memoli VA, Bzik DJ, Siu LY. 1994. Solubel normal and mutated DNA sequences from single copy genes in human blood. Cancer Epidemiology, Biomarkers, and Prevention. 43(5): 67-71. Woodhead JL, Malcolm DB. 1980. Non-spesific binding of restriction endonuclease EcoR1 to DNA. Nucleic Acid Research. 8(2): 389-402 Yusuf ZK. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek . 5(6):125-135.