Pemisahan Antisera Dan Antigen

LAPORAN PRAKTIKUM IMUNOLOGI PEMISAHAN ANTISERA DAN ANTIGEN PEMERIKSAAN SPESIFITAS ANTISERA PEMERIKSAAN AVIDITAS AVIDITAS DAN TITE TITER R ANTISERA

OLEH : NUR ALIMIN [0901037] KELOMPOK II-A/ GANJIL

TANGGAL PRAKTIKUM : KAMIS, 8 NOVEMBER 2012

DOSEN PEMBIMBING: Dra. SYILFIA HASTI, M.Farm.,Apt.

ASISTEN : ALFIONITA SERAGIH ALIFIANA ANGGRAINI ONA SISCANOVA

SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU PEKANBARU 2012

The world’s largest digital library

Try Scribd FREE for 30 days to access over 125 million titles without ads or interruptions! Start Free Trial Cancel Anytime.









PEMISAHAN ANTISERA DAN ANTIGEN PEMERIKSAAN SPESIFITAS ANTISERA PEMERIKSAAN AVIDITAS AVIDITAS DAN TITE TITER R ANTISERA

1. TUJU TUJUAN AN PERC PERCOB OBAA AAN N –

Menget Mengetah ahui ui cara cara penge pengerja rjaan an pemeri pemeriksa ksaan an pemisa pemisaha han n antise antisera ra dan dan antigen, spesifitas antisera, aviditas dan titer antisera

–

Memahami prinsip reaksi aglutinasi antara antisera golongan darah dengan suspensi eritrosit 5% golongan darah tertentu (A, B, AB & O)

–

Untuk mendapatkan serum/plasma dari sel darah

–

Untuk mendapatkan sel darah merah pekat yang bebas protein

–

Untuk membuat kepekatan sel darah menjadi enceran tertentu guna mengoptimalkan reaksi antigen pada sel darah merah terhadap antibodi

2. TINJ TINJAU AUAN AN PU PUST STAK AKA A

Preparasi Preparasi sampel adalah adalah proses proses penyiapa penyiapan n sampel sampel sebelum sebelum dilakukan dilakukan analisis yang bertujuan untuk memisahkan atau menyingkirkan pengotor atau zat yang tidak diinginkan (selain analit) sehingga didapat hasil yang valid. Darah adalah jaringan cair yang terdiri atas dua bagian yaitu plasma darah dan dan sel sel dara darah. h. Sel Sel dara darah h terdi terdiri ri dari dari tiga tiga jeni jeniss yait yaitu u erit eritro rosi sit, t, leuk leukos osit it dan dan trombosit. Volume Volume darah secara keseluruhan adalah satu per dua belas berat badan atau kira-kira lima liter. Sekitar 55% adalah plasma darah, sedang 45% sisanya terdiri dari sel darah Darah kita mengandung beberapa jenis sel yang terangkut di dalam cairan kuning yang disebut plasma darah. Plasma darah tersusun atas 90% air yang mengandung sari makanan, protein, hormon, dan endapan kotoran selain sel-sel darah. (Evelyn C. Pearce, 2006) Ada tiga jenis sel darah, yaitu sel darah merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping darah (trombosit).

Sel Darah Merah









setiap 1 cm kubik darah terdapat 5,5 juta sel. Jumlah sel darah merah yang diproduksi setiap hari mencapai 200.000 biliun, rata-rata umurnya hanya 120 hari. Semakin tua semakin rapuh, kehilangan bentuk, dan ukurannya menyusut menjadi sepertiga ukuran mula-mula. Sel darah darah merah merah mengan mengandun dung g hemog hemoglob lobin in yang yang kaya kaya akan akan zat zat besi. besi. Warnanya yang merah cerah disebabkan oleh oksigen yang diserap dari paru-paru. Pada saat darah mengalir ke seluruh tubuh, hemoglobin melepaskan oksigen ke sel dan mengikat karbon dioksida. Sel darah merah yang tua akhirnya akan pecah menjadi menjadi partikel-partik partikel-partikel el kecil kecil di dalam dalam hati dan limpa. limpa. Sebagian Sebagian besar sel yang tua tua diha dihanc ncur urka kan n oleh oleh limp limpaa dan dan yang yang lolo loloss diha dihanc ncur urka kan n oleh oleh hati hati.. Hati Hati menyimpan kandungan zat besi dari hemoglobin yang kemudian diangkut oleh darah ke sumsum tulang untuk membentuk sel darah merah yang baru. Persediaan sel darah merah di dalam tubuh diperbarui setiap empat bulan sekali.

Whole Blood Whole blood adalah darah tanpa perlakuan. Istilah ini digunakan dalam transfusi transfusi obat.. obat.. Darah Darah biasanya biasanya dikombinas dikombinasikan ikan dengan dengan antikoagu antikoagulan lan selama selama proses proses pengumpul pengumpulan, an, tetapi tetapi pada umumnya dinyatakan dinyatakan belum diolah. diolah. Di AS, mengka mengkapit pitali alisas sasii "Darah "Darah Keselu Keseluruh ruhan an"" berart berartii produk produk standa standarr terten tertentu tu untuk untuk transfusi atau diproses lebih lanjut, dimana "seluruh darah" adalah setiap darah yang dikumpulkan tidak dimodifikasi. Seluru Seluruh h darah darah biasan biasanya ya disimp disimpan an di bawah bawah kondis kondisii yang yang sama sama Darah Darah Merah Sel dan dapat disimpan sampai 35 hari jika dikumpulkan dengan CPDA-1 solusi penyimpanan 2 atau 21 hari dengan lain solusi penyimpanan umum seperti CPD. Jika darah tersebut akan digunakan untuk membuat trombosit, itu disimpan pada suhu kamar sampai proses selesai. Hal ini harus dilakukan dengan cepat untuk meminimalkan penyimpanan sel darah merah hangat di unit.

Plasma Darah









jumlah/volume darah merupakan plasma darah. Volume Volume plasma darah terdiri dari 90% berupa air dan 10% berupa larutan protein, glukosa, faktor koagulasi, ion mineral, hormon dan karbon dioksida. Plasma darah juga merupakan medium pada proses ekskresi. Plasma darah dapat dipisahkan di dalam sebuah tuba berisi darah segar yang telah dibubuhi zat anti-koagulan yang kemudian diputar sentrifugal sampai sel darah merah jatuh ke dasar tuba, sel darah putih akan berada di atasnya dan memben membentuk tuk lapisa lapisan n buffy buffy coat, coat, plasma plasma darah darah berada berada di atas atas lapisa lapisan n terseb tersebut ut dengan kepadatan sekitar 1025 kg/m3, or 1.025 kg/l. Serum darah adalah plasma tanpa tanpa fibrinogen fibrinogen,, sel dan faktor koagulas koagulasii lainnya. lainnya. Fibrinoge Fibrinogen n menempati menempati 4% aloka alokasi si protei protein n dalam dalam plasma plasma dan dan merupa merupakan kan faktor faktor penti penting ng dalam dalam proses proses pembekuan darah. Plasmapheresis adalah jenis terapi medis yang menyuling (en:extraction) plasma darah keluar dari kumpulan partikelnya untuk diolah lebih lanjut dan memasukkan memasukkan kembali plasma darah tersebut pada akhir terapi.









Bungkusan plasma yang mengering yang digunakan oleh militer Britania Raya dan Amerika Serikat selama Perang Dunia Kedua.

Serum Darah Di dalam darah, serum (bahasa Inggris: blood serum) serum ) adalah komponen yang bukan berupa sel darah, juga bukan faktor koagulasi; serum adalah plasma









Serum terdiri dari semua protein (yang tidak digunakan untuk pembekuan darah) termasuk cairan elektrolit, antibodi, antigen, hormon, dan semua substansi exogenous. Rumusan umum yaitu: serum = plasma - fibrinogen - protein faktor koagulasi. Studi yang mempelajari serum disebut serologi. Serum digunakan dalam berbagai uji diagnostik termasuk untuk menentukan golongan darah.

Serum protein Serum protein (bahasa Inggris: globular protein, spheroprotein) merupakan salah satu dari tiga jenis protein di dalam tubuh yang terbentuk dari asam amino berupa larutan koloidal di dalam plasma darah. Protein (bahasa Yunani: πρωτεϊνη - proteios) berarti utama (bahasa Inggris: first rank). Serum protein tidak mengandung fibrin (bukan merupakan fibrous protein) sehingga dapat terlarut. Total serum protein dalam darah sekitar 7,2 - 8 g/dl[2] atau sekitar 7% dari volume darah keseluruhan dengan berbagai kegunaan: kegunaan: •

Sirkulasi molekul lipida, hormon, vitamin dan zat besi

•

Enzim, komponen komplemen, protease inhibitor dan kinin precursor

•

Regulasi aktivitas, fungsional non seluler dalam sistem kekebalan.

Total serum protein dapat melonjak karena: infeksi kronis (termasuk tuberkolosis, tuberkolosis , Adrenal cortical hypofunction , disfungsi hati, Collagen Collagen Vascular ascular Disease Disease ( Rheumatoid Rheumatoid Arthritis, Systemic Lupus, Scleroderma), Scleroderma ), gejala hipersensitivitas, Sarcoidosis, dehidrasi ( diabetic acidosis, chronic chronic diarrhea, diarrhea, dll.), dll.), Respiratory distress, distress, Hemolisis, Cryoglobulinemia, Alcoholism, Alcoholism, Leukemia . dan menurun antara lain disebabkan oleh: Malnutrition dan malabsorption (insuff insuffici icient ent intake intake and/or and/or diges digestio tion n of proteins proteins), Liver disease (insufficient production of proteins ), Diare (loss ( loss of protein through the GI tract ), ), Severe burns (loss of protein through the skin ), Hormone Imbalances that favor breakdown breakdown of tissue, Loss through the urine in











Protein darah

Level kadar normal %

Kegunaan

Serum albumin

3,5-5,0 g/dl

60%

Memelihara tekanan osmosis dan pengusung molekul lain

Immunoglobulin

1,0-1,5 g/dl

18%

Memb Memben entu tuk k tubuh

Fibrinogen

0,2-0,45 g/dl

4%

Koagulasi darah

sist sistem em

keke kekeba bala lan n

-1 fetoprotein



Protein wewenang

<1% Mengatur ekspresi genetika

Terdapat dua jenis protein yang utama di dalam serum, yaitu albumin dan globulin. Albumin dibuat di dalam hati, merupakan protein yang paling menonjol dan bermuatan negatif yang terkuat guna mengikat molekul kecil untuk diedarkan melalui darah. Albumin juga berguna untuk menjaga tekanan osmosis darah. Beberapa jenis globulin diproduksi di dalam hati, sementara yang lain diprod diproduks uksii di dalam dalam sistem sistem kekeb kekebala alan. n. Semua Semua jenis jenis serum serum protei protein n yang yang lain lain diproduksi di dalam hati. Arti kata globulin menunjukkan sekelompok protein heterogen dengan berat molekul tertentu yang cukup tinggi, dengan kecepatan terlarut terlarut (en:solubil (en:solubility ity rate) dan laju migrasi migrasi elektrofore elektroforetik tik (en:electr (en:electropho ophoretic retic migration rate) yang lebih rendah daripada albumin. Rasio normal di dalam darah sekitar 2 hingga 3,5 g/dl. Elektrofor Elektroforesis esis protein protein serum serum (en:serum (en:serum protein protein electroph electrophoresi oresis, s, SPEP) SPEP) adalah uji laboratorium untuk menentukan jenis globulin (alfa-1, alfa-2, beta dan gamma) dan albumin. Cara yang digunakan adalah pengambilan serum darah dari bekuan darah, kemudian diletakkan di atas medium yang dibubuhi agarose gel,









Gambar 1 : Ilustrasi skema gel protein hasil elektroforesis,

Serum albumin Serum Serum albumin, albumin, sering disebut disebut albumin albumin adalah adalah protein protein dengan dengan jumlah jumlah terbanyak terbanyak di dalam tubuh. Albumin Albumin sangat sangat penting penting demi memelihara memelihara tekanan tekanan osmos osmosis is untuk untuk distri distribus busii fluida fluida tubuh tubuh antara antara intrav intravasc ascula ularr compa compartm rtment ent dan jaringan tubuh. Albumin juga berfungsi sebagai pengusung plasma dengan secara tidak tidak langsu langsung ng mengi mengikat kat bebera beberapa pa hormon hormon steroi steroid d hydrop hydrophob hobic ic dan protei protein n pengusung bagi hemin dan asam lemak dalam sirkulasinya. BSA, fraksi V dari serum albumin berguna untuk meluruhkan beberapa substansi dari sirkulasi darah melalu melaluii jaringa jaringan n hati, hati, antara antara lain lain biliru bilirubin bin,, tiroks tiroksin, in, tauroli taurolitho thocho cholic lic acid, acid, chenodeoxycholic chenodeoxycholic acid, digitoksin dan juga heme peptida dari cytochrome C . 60% dari protein di dalam plasma darah, jumlah serum yang melebihi batas normal









sistem kekebalan. Beberapa jenis globulin mengikat hemoglobin, beberapa yang lain mengusung zat besi, berfungsi untuk melawan infeksi, dan bertindak sebagai faktor koagulasi. Globulin terdiri dari: lakto globulin • •

tiroglobulin serum globulin, terbagi terbagi menurut laju migrasi elektroforesik menjadi: alfa globulin (protein yang mengusung tiroksin dan retinol/vitamin A). alfa-1 globulin alfa-1 antitripsin (bahasa Inggris: Transcortin, corticosteroid-binding corticosteroid-binding globulin, CBG) CBG ) disebut juga acute phase reactant [1] reactant [1] atau serpin peptidase inhibitor, inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase antiproteinase), ), member 6. alfa-1 antisimotripsin orosomukoid (asam glikoprotein) serum amiloid A alfa-1 lipoprotein (HDL) alfa-2 globulin alfa-2 makro globulin ( protease protease inhibitor) inhibitor) haptoglobin protein C (inhibitor ( inhibitor of activated coagulation factors FVIII and FV ) seruloplasmin (pengusung zat tembaga) alfa-2 lipoprotein (VLDL) beta globulin beta-1 globulin transferin •

•

•

• • • •

•

• • •

• •

•

•









yang berfungsi sebagai antibodi) IgM, IgA, IgG makro globulin transkobalamin •

• •

Serum lipoprotein Serum lipoprotein adalah senyawa biokimiawi yang mengandung protein dan lemak. Lemak atau produk turunannya dapat terikat secara kovalen maupun non kovalen kovalen dengan dengan protein. protein. Lipoprote Lipoprotein in dapat dapat berbentuk berbentuk enzim, transporter, transporter, protein struktural, antigen, adesin, toksin, high density lipoprotein dan low density lipoprotein yang yang memung memungkin kinka kan n lemak lemak terusu terusung ng di dalam dalam darah, darah, dan protei protein n transmemb transmembran ran yang terdapat pada mitokondri mitokondriaa (terdapat (terdapat juga pada kloroplas kloroplas tanaman), serta lipoprotein bakterial. Lipoprotein di dalam tubuh manusia terbagi menjadi 5 golongan utama: •

kilomikron (bahasa Inggris: chylomicron) chylomicron )

•

VLDL

•

LDL

•

IDL

•

HDL

Serum wewenang Seru Serum m wewe wewena nang ng (bah (bahas asaa Ingg Inggris ris:: Regulatory protein) protein) yang yang hany hanyaa berjumlah 1% dari protein plasma, terdiri dari enzim, proenzim dan hormon. Riset









merupakan komponen yang krusial pada reaksi ini. 2. prot protei ein n tert terten entu tu yang yang meng mengik ikat at dere derett wewe wewena nang ng (bah (bahas asaa Ingg Inggri ris: s: regulatory sequence ) dari DNA, dan berfungsi untuk mengatur ekspresi gene geneti tik. k. Prot Protei ein n ini ini meng mengge gera rakk kkan an pros proses es dife difere rens nsia iasi si selu selule lerr dan dan morfogenesis menuju pada penciptaan jenis sel yang baru pada makhluk multicellular. multicellular. Pada tahap ini, jenis sel yang berbeda dapat memiliki profil ekspresi genetik yang berbeda-beda dalam deret genome yang sama.

3. ALAT & BA BAHAN HAN a. Alat –

tabung reaksi 10 ml

–

rak tabung reaksi

–

sentrifus

–

pipet tetes

–

gelas ukur

–

objek gelas

–

tusuk gigi

–

kaca pembesar

–

stop-wacth

b. Bahan











4. CARA KERJA PEMISAHAN ANTISERA DAN ANTIGEN a. Pemisahan plasma (antisera) dan eritrosit (antigen) –

ambil darah 5 ml, masukkan dalam tabung sentrifus

–

sentrifugasi 2000 rpm selama 10 menit

–

ambil ambil plasma plasma dan dan masukk masukkan an dalam dalam tabung tabung reaksi reaksi (antis (antisera era golon golongan gan darah)

b. Pemurnian eritrosit (antigen) –

eritrosit pada tabung sentrifus ditambah dengan larutan NaCl fisiologis sama banyak, aduk dengan cara memutar tabung sentrifus pada kedua telapak tangan

–

sentrifugasi 2000 rpm selama 10 menit

–

buang supernatannya (lapisan NaCl), lalu tambahkan lagi dengan larutan NaCl fisiologis sama banyak, aduk dengan cara memutar-mutar tabung sentrifus pada kedua telapak tangan









–

antisera siap untuk digunakan

PEMERIKSAAN SPESIFITAS ANTISERA a. Pembuatan eritrosit 5% –

masukkan ke dalam tabung reaksi larutan NaCl fisiologis sebanyak 19 tetes

–

dengan menggunakan pipet tetes yang sama, masukkan ke dalam tabung reak reaksi si di atas atas 1 tete tetess erit eritro rosi sitt golo golong ngan an dara darah h (ses (sesua uaii pemb pembag agia ian n kelompok)

–

aduk hingga homogen dengan cara memutar-mutar menggunakan kedua telapak tangan sehingga diperoleh larutan 5%

–

beri label

b. Uji spesifitas antisera –

tete tetesk skan an di atas atas 4 buah buah obje objek k glas glasss bers bersih ih laru laruta tan n anti antise sera ra (pla (plasm smaa golongan darah [B] yang telah dimurnikan) masing-masing sebanyak 1









tabel pengamatan yang harus dilakukan Plasma A

Plasma B

Plasma AB

Plasma O

Eritrosit 5% A Eritrosit 5% B Eritrosit 5% AB Eritrosit 5% O

PEMERIKSAAN AVIDITAS AVIDITAS DAN TITER TI TER ANTISERA a. Uji aviditas antisera –

pengujian aviditas dilakukan terhadap antisera yang memberikan reaksi aglutinasi terhadap antigen eritrosit reaksi positif pada uji spesifitas

–

pengerjaan pengujian sama dengan uji spesifitas, tapi disini yang dihitung berapa lama waktu yang diperlukan mulai ditetesi larutan eritrosit 5% sampai terbentuk aglutinasi

–

tabelkan waktu yang diperoleh untuk terjadinya aglutinasi tersebut









ml (1 tetes) –

biarkan selama 10 menit, lalu disentrifusi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit

–

amati pengencaran yang tertinggi yang masih mengalami aglutinasi. Untuk memudahkan pengamatan pengamatan gunakan tabung reaksi ke-10 (K)

–

catatan : 1. Cairan plasma golongan A dilakukan terhadap eritrosit golongan B & AB 2. Cairan plasma golongan B dilakukan terhadap eritrosit golongan A & AB 3. Cairan plasma golongan O dilakukan terhadap eritrosit golongan A, B & AB 4. Bandingkan hasil yang diperoleh

–

tabelkan hasil pengamatan

P -> E A->B A->AB

½

¼

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128 1/256 1/512

K









5. Hasi Hasill & Pem Pembaha bahasa san n a. Hasil pengamatan

PEMERIKSAAN SPESIFITAS ANTISERA Uji spesifitas antisera Tabel 1 : Pengamatan uji spesifitas antisera Plasma A

Plasma B

Plasma AB

Plasma O

Eritrosit 5% A

[ -]

[ +]

[- ]

[ +]

Eritrosit 5% B

[+]

[- ]

[- ]

[ +]

Eritrosit 5% AB

[+]

[ +]

[- ]

[ +]

[ -]

[- ]

[- ]

[- ]

Eritrosit 5% O Keterangan : [+]

= po positi sitiff ter terja jad di re reaksi ksi agl aglut utin inaasi

[-] [-]

= nega negati tif, f, tida tidak k terj terjad adii reak reaksi si aglu agluti tina nasi si

PEMERIKSAAN AVIDITAS AVIDITAS DAN TITER TI TER ANTISERA











Uji titer antisera

1

2

3

4

5

6

Tabel 3 : Pengamatan uji titer antisera

7

8

9

K









Pencucian sel darah merah pekat, gunanya untuk melarutkan protein yang masih terkandung di dalam sel darah merah. Dengan mencucinya menggunakan larutan NaCl fisiologis 0,9% diharapkan protein yang masih terkandung dapat larut bersama larutan NaCl fisiologis 0,9% dan dapat dengan mudah dibuang sehingga didapatkan sel darah merah pekat yang bebas dari protein/globulin. Pemurnian antisera, menggunakan kristal CaCl  untuk mengikat senyawa murni antisera, antisera, lalu diberi kristal kristal amonium amonium oksalat oksalat yang mengendapk mengendapkan, an, dan terakhir diberi natrium azida sebagai pengawet.

PEMERIKSAAN SPESIFITAS ANTISERA Pembuatan suspensi sel darah bertujuan untuk membuat kepekatan sel darah menjadi enceran tertentu guna mengoptimalkan reaksi antigen pada sel









mengalami aglutinasi pada waktu pengamatan 56 detik, hal ini terjadi karena ikatan antibodi B dengan antigen A. Sedangkan pada pengamatan plasma B + eritro eritrosit sit 5% AB waktu waktu untuk untuk terjad terjadii agluti aglutina nasi si lebih lebih lama lama 3 menit menit 4 detik, detik, kemungkinan yang dapat kami jelaskan bahwa eritrosit AB memiliki antigen A dan dan antige antigen n B, sehing sehingga ga ikatan ikatan yang yang terjad terjadii pada pada antibo antibodidi-an antige tigen n memili memiliki ki afinitas lebih lemah dibandingkan pada ikatan antibodi B dengan antigen A. Pada Pada uji titer titer,, konsen konsentra trasi si plasma plasma B diturun diturunkan kan dari dari ½ sampai sampai 1/512. 1/512. Pengamatan ini bertujuan sampai batas mana pengenceran plasma B (antibodi B) efektif terhadap ikatan antibodi-antigen. Dari hasil pengamatan, dari tabung 1 hingga 9 masih menunjukkan aktivitas ikatan antibodi-antigen (reaksi aglutinasi), hal ini menunjukkan bahwa sampai dengan pengenceran 1/512 plasma B masih

Pemisahan Antisera Dan Antigen

Recommend Documents