PEMBUATAN MEDIA EMB (EOSIN METHLYN BLUE) AGAR A. Tujuan a. Tujuan Umum 1. Mahasiswa mampu memahami media diferensial. 2. Mahasiswa mampu menjelaskan media EMB (Eosin Methlyn Blue) Agar. b. Tujuan Khusus 1. Mahasiswa dapat mengetahui prosedur pembuatan media EMB (Eosin Methlyn Blue) Agar. 2. Mahasiswa dapat membuat media EMB (Eosin Methlyn Blue) Agar. B. Metode Serbuk media EMB (Eosin Methlyn Blue) Agar ditimbang dilarutkan dengan aquadest disterilkan dituang ke petridisk steril C. Prinsip Penimbangan pelarutan sterilisasi D. Dasar Teori
Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan ( nutrisi )yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Syarat-syarat dari suatu media adalah: a) Media harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan oleh mikroba. b) Media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan pertumbuhannya. c) Media tidak mengandung zat penghambat kecuali yang sengaja ditambahkan pada media selektif atau one purpose media. d) Media harus steril e) Temperature / suhu yang sesuai Salah satu jenis media adalah media Eosin Metlyn Blue ( EMB ). EMB agar pertama kali dikembangkan oleh Holt-Harris dan Teague tahun 1916. Mereka menggunakan EMB agar untuk membedakan dengan jelas antara koloni laktosa fermentasi dan nonfermenting mikroba. Di media yang sama, sukrosa juga termasuk untuk membedakan antara coliform yang mampu memfermentasi sukrosa lebih cepat daripada laktosa dan bakteri-bakteri yang tidak dapat memfermentasi sukrosa. Laktosa fermentor memiliki ciri koloni hitam atau memiliki pusat gelap dengan margin luar transparan dan tidak berwarna, sedangkan laktosa atau sukrosa nonfermenters berwarna. EMB agar ditunjukkan untuk menjadi lebih sensitif dan stabil dan dibedakan antara fermentor gula dan nonfermenters lebih cepat bila dibandingkan dengan agar lainnya. Pada tahun 1918, Levine menggambarkan sebuah agar EMB yang membedakan antara jenis tinja dan nonfecal dari aerogenes kelompok coli. Hal ini juga dibedakan antara salmonella dan fermentor nonlactose lain dari ba kteri coliform. Bacto EMB agar merupakan kombinasi dari EMB agar yang dijelaskan oleh HoltHarris dan Teague dan Levine. EMB ini mengandung laktosa dan sukrosa (seperti yang
dijelaskan oleh Holt-Harris dan Teague) dan juga berisi Bacto pepton dan fosfat (seperti yang dijelaskan oleh Levine) . Kedua pewarna indikator, eosin dan metilen biru, digunakan dalam rasio untuk menyampaikan toksisitas minimal tetapi memberikan diferensiasi terbaik. Eosin metilen biru agar (EMB) adalah medium selektif dan diferensial digunakan untuk mengisolasi coliform fecal. Eosin adalah zat warna yang merespon perubahan pH, pergi dari berwarna menjadi hitam di bawah kondisi asam. Eosin Y dan biru metilen adalah pewarna indikator pH yang bergabung membentuk endapan ungu tua pada pH rendah, mereka juga berfungsi untuk menghambat pertumbuhan organisme yang paling Gram positif. EMB agar selektif untuk bakteri gram negatif. Sukrosa dan laktosa berfungsi sebagai sumber karbohidrat difermentasi yang mendorong pertumbuhan koliform tinja dan menyediakan sarana untuk membedakan mereka. Fermentor yang kuat dari laktosa atau sukrosa akan menghasilkan jumlah asam yang cukup untuk membentuk kompleks pewarna ungu tua. Pertumbuhan organisme ini akan tampak ungu tua sampai hitam. Escherichia coli, fermentor kuat, sering menghasilkan kemilau hijau metalik. Fermentor lambat atau lemah akan menghasilkan koloni merah muda berlendir. Biasanya koloni berwarna atau tidak berwarna menunjukkan bahwa fermentasi organisme tidak laktosa atau sukrosa dan bukan merupakan fecal coliform.
E. Alat dan Bahan a. Alat 1. Neraca analitik/digital 7. Pemanas Listrik 2. Gelas arloji/timbang 8. Pipet Pasteur 3. Kertas timbang 9. Petridisk steril 4. Beaker glass 10. Botol semprot 5. Batang Pengaduk 11. Autoclave 6. Gelas ukur b. Bahan 1. Media Mac Conkey Agar (Oxoid-CM0115) 2. Aquadest 3. Kertas pH atau pH meter 4. NaoH 0,01 N 5. HCl 0,01 N 6. Kapas berlemak c. Formula 1. Peptone 10,0 g/l 2. Lactose 10,0 g/l 3. Dipotassium hydrogen phosphate 4. Eosin 0,4 g/l 5. Methylene blue 0,065 g/l 6. Agar 15,0 g/l
F. Cara Kerja atau Prosedur 1. Semua APD (Alat Pelindung Diri) digunakan dengan baik, benar, dan lengkap 2. Disiapkan semua alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan 3. Dipastikan semua alat dan bahan dalam keadaan siap digunakan 4. Ditimbang serbuk media EMB (Eosin Methlyn Blue) Agar (sesuai dengan volume
yang dibuat, dengan rumus
Ket. V1 : Volume yang tertera pada etiket atau kemasan media (mL) W1: Wight atau berat media yang tertera pada kemasan media (gram) V2 : Volume media yang akan dibuat (mL) W1: Wight atau berat media yang akan ditimbang (gram) 5. 6. 7. 8.
Dipindahkan serbuk media Mac Conkey Agar ke beaker glass Ditambahkan aquadest sesuai dengan volume, dipindahkan ke Erlenmeyer Dihomogenkan larutan dengan bantuan pemanasan dan pengadukan Pelarutan tidak boleh sampai mendidik (pelarutan harus sempurna sehingga tidak ada kristal yang bersisa) 9. Dicek pH larutan sesuai petunjuk media (pH = 7,1 ± 0,2) pada suhu 25°C 10. Ditambah NaOH 0,01 N jika larutan media asam atau acid dan ditambahkan HCl 0,01 N jika larutan media basa atau alkali 11. Disterilisasi ± 121°C (1 atm), ± 15 menit 12. Dikeluarkan larutan dari autoclave, saat suhu sudah rendah (20°C) dan tekanan telah turun (dilihat indikator autoclave) 13. Dituang ke petridisk steril yang telah disediakan 14. Dibiarkan media pada petridisk membeku dengan sempurna 15. Lakukan uji kualitas media serta uji control positif dan ne gative pada media yang dibuat 16. Disimpan pada suhu 4°C-8°C untuk menyimpan media F. Hasil Praktikum
Perhitungan : Diketahui : V1 V2 W1
= 1000 mL = 27 mL = 37,5 g
Ditanya : W2
= ...... ?
Jawab : (
=
)=
=
=
= 1,0125 g
Hasil Pengamatan a)
Media ditimbang dengan neraca analitik sebanyak 3,75g sebruk media berwarna merah muda keunguan
b)
Serbuk Media dilarutkan dengan aquadest sebanyak 100mL, larutan media berwarna ungu
c)
Larutan media dihomogenkan dengan bantuan pemanas listrik dan pengadukan.
d)
Pengecekkan pH. pH yang baik untuk media EMB adalah 6,8 ± 0,2 , pH yang diperoleh = 6,8
e)
Pada Erlenmeyer di tutup dengan kapas berlemak dan aluminium foil
f)
Disterilisasi di autoclave pada suhu 121 oC tekanan (1atm) selama ± 15
menit.
g)
Larutan media dituang ke petridisk secara asptis dekat api spiritus.
h)
Media dibiarkan memadat dan petridisk dibalik
i)
Simpan pada lemari pendingin dengan suhu 4 oC - 8 oC.
G. Pembahasan
Media Eosin Methylene Blue mempunyai keistimewaan mengandung laktosa dan berfungsi untuk memilah mikroba yang memfermentasikan laktosa seperti S. aureus, P. aerugenosa, dan Salmonella. Mikroba yang memfermentasi laktosa menghasilkan koloni dengan inti berwarna gelap dengan kilap logam. Sedangkan mikroba lain yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Adanya eosin dan metilen blue membantu mempertajam perbedaan tersebut. Namun demikian, jika media ini digunakan pada tahap awal karena kuman lain juga tumbuh terutama P. Aerugenosa dan Salmonella sp dapat menimbulkan keraguan. Bagaiamanapun media ini sangat baik untuk mengkonfirmasi bahwa kontaminan tersebut adalah E.coli. Media diferensial adalah media yang karena adanya komposisi kimiawi tertentu dapat memberikan cirri khas pada genus mikroorganisme tertentu Praktikum kali ini mengenai pembuatan media EMB (Eosin Methlyn Blue) Agar. Media ini merupakan media diferensial dari bakteri gram negatif konsistensi media ini padat dalam petridisk dengan warna media ungu.
Pembuatan media EMB diawali dengan menimbang serbuk media EMB sebanyak 1,0125 Gram. Penimbangan tersebut berdasarkan rumus
=
dimana massa awal media
yang tertera pada kemasan adalah 37,5 gram dalam 1 liter. Media sebanyak 1,0125 gram tersebut akan akan dilarutkan dalam 27 mL aquadest. Kemudian larutan dihomogenkan dengan bantuan pemanasan dan pengadukan. Pemanasan tidah boleh sampai mendidih karena akan merusak zat-zat nutrisi dalam media. Pelarutan harus sempurna agar tidak ada Kristal media yang bersisa. Apabila terdapat kristal, tekstur media tidak akan baik dan tidak bisa dilakukan penanaman bakteri. Setelah homogen, ph media decek menggunakan stick ph. Ph media sangat penting untuk pertumbuhan mikroorganisme yang dikultur. Ph media yang baik untuk o media EMB adalah 6,8 ± 0,2 pada suhu 25 C. Ph media yang didapatkan pada pengecekan ph ini adalah ± 7. Kemudian media dalam Erlenmeyer ditutup dengan kapas berlemak dan aluminium foil. Kapas berlemak digunakan untuk mengurangi penguapan dan menjaga volume media agar tidak berkurang ketika proses sterilisasi. Media disterilisasi pada suhu o 121 C tekanan 1 atm selama 15 menit. Media dituang ke petridisk ketika suhu media telah turun. Apabila media dituang dalam keadaan panas, akan membentuk banyak uap air yang dapat merusak media. Penuangan media harus dilakukan secara aseptis di dekat api spiritus untuk menghindari kontaminasi. Kemudian media didiamkan hingga memadat, selanjutnya petridisk dibalik. Peletakan petridisk terbalik dimaksudkan untuk mempermudah dalam pengangkatan, memperlancar sirkulasi udara dan mencegah uap kondensasi mengenai media. Media EMB agar merupakan media diferensial dengan konsistensi media padat. Media EMB ini memiliki karakteristik sebagainya diantaranya berdasarkan sifat fisiknya merupakan media padat atau solid karena mengandung agar 15,0 g/l. Berdasarkan kandungan media EMB agar adalah media sintetis karena komposisinya tersusun dari bahan bahan kimia yang telah di ketahui komposisinya secara pasti. Media EMB ini memiliki beberapa kandungan terpenting, diantaranya lactose yang berfungsi untuk memisahkan bakteri yang memfermentasikan laktosa seperti E. Coli dan sebagai sumber karbohidrat untuk pertumbuhan mikroorganisme. Peptone berfungsi sebagai sumber protein untuk mikroorganisme yang akan dibiakkan. Dipotassium Hydrogen phosphate merupakan garam yang sangat larut dalam air, biasanya bahan ini berfungsi sebagai pupuk, makanan adiktif, dan zat penyangga. Kemudian terdiri dari Eosin Methyline Blue adalah sebagai indikator warna pada media EMB ini.
H. Kesimpulan
1. Media diferensial adalah media yang karena adanya komposisi kimiawi tertentu dapat memberikan cirri khas pada genus mikroorganisme tertentu. 2. Media EMB (Eosin Methlyn Blue) Agar adalah media isolasi untuk membedakan bakteri enterobacteriaceae yang digunakan untuk mengetahui ada atau tidaknya bakteri coliform di dalam suatu sampel. Media ini merupakan media diferensial dari bakteri gram negatif konsistensi media ini padat dalam petridisk dengan warna media ungu. 3. Media EMB (Eosin Methlyn Blue) Agar merupakan media padat karena mengandung agar 15,0 g/l dan termasuk media plate karena dicetak didalam petridisk steril. Indikator warna media ini adalah ungu akibat dari Eosin Methlyn Blue.
I. Daftar Pustaka
Merta, I Wayan, dkk. 2013. Penuntun Praktikum Pembuatan Media dan Reagensia-2. Denpasar. Politeknik Kesehatan Denpasar. Ratu Safitri, dkk. 2010. Medical Book. Medium Analisis Mikroorganisme (isolasi dan kultur). Cv. Trans. Info Medika Bandung. Desi Jumanti, 2013. Media EMB Eosin Methlyn Agar. Online. desijumanti.blogspot. com/2013/07/html. Sri Hartati, Agnes. 2012. Medical Book. Dasar – Dasar Mikrobiologi Kesehatan. Nuha Medika. Surakarta.
