TEMA 14.- ORGANOCLORADOS Y RECEPTORES DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS Las policlorodibenzo-p-dioxinas (PCDDs) son una familia de 75 compuestos aromáticos clorados similares conocidos como contaminantes ambientales por el elevado poder tóxico de algunos de sus miembros, la amplia variedad de sus respuestas tóxicas y la ubicua presencia en el ambiente.
Todos ellos parecen tener un mecanismo de acción común. El más tóxico es el 2,3,7,8TCDD. La eliminación de algunos de los sustituyentes o el cambio de un lugar a otro (1,4,6 o 9) disminuye la toxicidad. Compuestos relacionados son los PCDFs y PCBs.
2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxina
2,3,7,8-Tetraclorodibenzofurano
3,3',4,4',5,5'-Hexaclorobifenilo
EFECTOS TOXICOS Y BIOLOGICOS La toxicidad del 2,3,7,8-TCDD está asociada al propio compuesto más que a sus metabolitos, ya que prácticamente no sufre bioactivación. El metabolismo y excreción de los PCDDs representan la detoxificación, y la velocidad de estos procesos es importante en la determinación de su poder tóxico. Así, la toxicidad de un congenere de dioxina depende al menos de tres factores: su propio potencial, su velocidad de eliminación y la presencia y cantidad de otros agonistas o antagonistas.
Curso 08/09
1
Los PCDDs y compuestos relacionados presentan un amplio espectro de toxicidad y respuestas bioquímicas. El efecto más comúnmente observado en humanos es el cloracné, aunque se han asociado niveles en suero de 2,3,7,8-TCDD y/o PCBs con: TOXICIDAD ESPECÍFICA DE TEJIDO
Y
EFECTOS BIOLÓGICOS
PRODUCIDOS POR TCDD Inmunotoxicidad Toxicidad dermal Promotor de tumores Hepatotoxicidad Teratogenicidad Anomalías reproductivas y del desarrollo Alteración de rutas metabólicas (diabetes)
Inducción de la expresión de genes: Cytocromo P450 (1A1/2; 1B1) Glutation S-transferasa Ya Quinona reductasa UDP glucuronil transferasa Aldehido deshidrogenasa 3 Disrupción endocrina
Los cambios inmunológicos por acción de los PCBs se deben a la liberación de calcio intracelular, activación de tirosina quinasas y liberación de ácido araquidónico de la membrana, tres rutas importantes en la activación de neutrófilos. La toxicidad hepática del TCDD está marcadamente potenciada por la presencia de hierro, probablemente por un mecanismo oxidativo. Este aumento de la toxicidad de TCDD por hierro muestra diferencias entre especies de ratones, que son probablemente de origen poligénico. Los PCBs presentan una afinidad por los receptores estrogénicos entre 100 y 10000 veces inferior a los estrógenos naturales (17-estradiol, estrona y estriol), siendo su concentración en sangre similar (0,03-0,5 ng/mL). Sin embargo, el menor porcentaje de unión a proteínas (mayor concentración en la forma activa), y la mayor permeabilidad a través de las membranas de éstos contaminantes daría origen a la consiguiente acción farmacológica y sus efectos sobre la salud humana. La ausencia de parte de estos efectos y la elevada dispersidad en los datos con dioxinas y PCBs se explica por las limitaciones en los estudios (basados en hallazgos epidemiológicos) y la presencia simultánea de otros contaminantes (plaguicidas, por ej.) ó mezcla de congéneres, ya que el término “sustancias semejantes a dioxinas” incluyen también los PCDFs, PCBs coplanares y sus análogos bromados. Entre ratones la variación se debe a diferencias en la afinidad de sus proteínas receptoras de Ah para PCDDs y en las ratas a diferencias en el metabolismo. El 2,3,7,8-
Curso 08/09
2
PCDD es un potente inductor y modulador enzimático, induciendo la citocromo P-450 (1A1 y 1A2). El mecanismo de acción de los PCDDs actualmente reconocido se muestra a continuación.
EL RECEPTOR Ah Experimentos realizados con TCDD demostraron que la exposición al mismo producía una potencia tóxica inusual, sugiriendo la posible existencia de un receptor para dioxina. Esta proteína (el receptor) se encontró en la fracción soluble del citosol de células de hígado de ratón y tenía las características propias de un receptor: unión a dioxinas saturable (aprox. 105 sitios de unión por célula), reversible y de alta afinidad (en el rango nanomolar). El ligando de mayor afinidad era planar y contenía átomos de cloro en al menos 3 de las 4 posiciones; de esta forma la unión al ligando exhibía estereoespecificidad. A esta proteína se la llamó receptor de hidrocarburos aromáticos (AhR) porque también une y media los efectos tóxicos de otros hidrocarburos aromáticos (PCBs e hidrocarburos aromáticos policíclicos). La unión de estos compuestos al AhR activa una serie de genes, incluyendo los del Cyt P450 CYP1A1, CYP1A2 y CYP1B1. Hasta el momento, no se ha encontrado ningún ligando endógeno para este receptor aunque hay evidencias de que existen. El clonaje y secuenciación del gen del AhR ha demostrado que es un miembro de la superfamilia de factores de transcripción con secuencias básicas hélice-bucle-hélice (bHLH), que se activan por la unión a ligandos y tienen gran variedad de funciones en procesos de crecimiento y diferenciación de tejidos. Esta familia alberga también los reguladores de la transcripción Per (Period, proteína del ritmo circadiano de Drosophila), ARNT (translocador nuclear del receptor Ah) y Sim (Single minded, proteína reguladora que participa en el desarrollo del SNC de Drosophila). Esta superfamilia de factores de transcripción se llama normalmente bHLH/PAS (Per, Arnt, Sim). Otro miembro de la superfamilia de factores de transcripción es la proteína que media la activación de genes por anoxia, llamado Hif1. Tanto el AhR como Hif1 y Sim requieren la dimerización con ARNT para la activación de genes Curso 08/09
3
El dominio bHLH está situado hacia el extremo N-terminal del gen del AhR. La región básica es necesaria para la unión a secuencias específicas del DNA llamadas elementos de respuesta a dioxinas (DREs) que facilitan el acceso al promotor y aumentan la velocidad de transcripción de mRNA para CYP1A1 y otras proteínas. El dominio HLH es necesario para la dimerización con otras proteínas. En ausencia del ligando, el receptor Ah se encuentra en el citosol como un complejo oligomérico, unido a dos moléculas de hsp90 (proteína de choque térmico) y posiblemente a otras proteínas como AIP, c-Src (60 kD), además de contener la subunidad de unión al ligando (ALBS). La asociación con hsp90 se piensa que es necesaria para mantener el plegamiento adecuado del AhR para su unión al ligando y también se cree que limita el paso del AhR al núcleo por bloqueo de una secuencia de localización nuclear en el extremo N-terminal. El AhR se expresa en la mayoría de los órganos y células del organismo. Aunque los datos existentes sugieren que los tejidos humanos son menos sensibles a los efectos tóxicos del TCDD que los de rata o ratón, parece ser que el AhR en humanos puede existir en más de una forma, lo que apoyaría las diferencias encontradas. MECANISMO DE ACCIÓN A TRAVES DEL RECEPTOR Ah El ligando (por ejemplo el TCDD), debido a su estructura lipofílica, entra en la célula por difusión pasiva a través de la membrana celular, y se une en el citosol al receptor Ah. La afinidad en la unión depende de las características del receptor, del
Curso 08/09
4
huesped y de las propiedades del ligando. En ratones, por ejemplo, se puede saber si una especie es resistente o sensible al TCDD mediante las diferencias en la afinidad del receptor Ah por el TCDD. La unión del ligando implica la disociación del oligómero, desplazándose las moléculas de hsp90, tras lo cual se pueden seguir dos rutas tóxicas: 1.- Aumento rápido de la actividad tirosinquinasa. Esta actividad está mediada por el receptor Ah y no se debe a la acción directa de las TCDD sobre las proteinquinasas. 2.- Translocación del complejo ligando-receptor al núcleo donde forma un heterodímero con ARNT. Esta dimerización es necesaria para su unión, corriente arriba, a elementos del DNA de genes diana (DRE). Este complejo L-AhR-ARNT se une entonces a DREs (regiones de DNA con una secuencia específica de reconocimiento GCCTG-3’ en la región lateral 5’ de genes de respuesta) y media el aumento en la velocidad de transcripción de genes específicos. La activación de la transcripción por este complejo está mediada por co-activadores (CBP/p300, media la unión entre el complejo AhR-ARNT y factores asociados a la caja TATA), que atraen a la RNA polimerasa II. Para la asociación del complejo con DREs, parece ser que se requiere la fosforilación, ya que in vitro, la desfosforilación de extractos nucleares de células tratadas con TCDD elimina dicha capacidad de asociación.
Curso 08/09
5
Las diferentes respuestas de especies y tejidos se cree que se deben a la diferente activación de la expresión de genes, lo que lleva a la transcripción de diferentes mRNAs y subsiguiente síntesis de proteínas. Sin embargo el único camino realmente establecido es la característica inducción de las isoenzimas del citocromo P-450 CYP 1A1 y 1A2. Descubrimientos de 1996 indican que las dioxinas afectan también a la expresión del virus de la inmunodeficiencia humano (HIV-1), con activación de un factor de transcripción celular, NF-kappa B. Varios compuestos relacionados con las dioxinas han mostrado ser aditivos, sinérgicos o antagónicos con respuestas tóxicas y bioquímicas. El sinergismo o antagonismo de mezclas de congéneres de desigual potencia, podría depender del grado de ocupación del receptor Ah. OTROS LIGANDOS DEL RECEPTOR Ah: Toxinas naturales Las toxinas naturales pueden tener los mismos mecanismos de toxicidad que las sintéticas como las dioxinas. Así, sustancias como los PAH (hidrocarburos aromáticos policíclicos) (por ejemplo de un filete cocinado), tienen una elevada afinidad por el receptor Ah pero son incapaces de producir el espectro de efectos tóxicos observados tras la exposición a PCDDs debido a que son metabolizados más rápidamente. Los productos de la oxidación del triptofano, también se unen al receptor Ah y han demostrado tener propiedades similares a TCDD. Una variedad de flavonas y de otras sustancias de las plantas en la dieta contienen una sustancia química, la glucobrassicina (un glucosinolato), cuyos productos de ruptura (mayoritariamente carbinol indol) se unen al receptor Ah aunque no está claro su efecto. Pueden inducir las enzimas de defensa bajo control del receptor, causando posiblemente mutagénesis de la misma forma que la TCDD, o pueden tener un efecto protector regulando el metabolismo de estrógenos, o con actividad anticancerígena o antioxidante. La glucobrasicina está presente en grandes cantidades en vegetales del género brassica, incluyendo la col y el brócoli (cerca de 25 mg por cada 100g) o las coles de Bruselas (125 mg por 100g).
Curso 08/09
6
