Mikroteknik
A. Mikroteknik Mikroteknik adalah ilmu yang mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan agar dapat diamati dan ditelaah. Organ dan jaringan dapat berasal dari hewan maupun tumbuhan. Jaringan hewan dapat diambil dari hewan tersebut selagi masih dalam keadaan hidup, setelah mengalami pembiusan maupun yang baru saja mati dan sesegera mungkin dimasukkan dalam larutan fiksatif. Jaringan tumbuhan dapat diambil dari tumbuhan yang sedang tumbuh dengan terlebih dahulu disimpan dalam air dan disayat setipis mungkin, berwarna untuk dapat dilihat serta bersifat langgeng, baru kemudian dilakukan fiksatif. Bahan pembius yang umum digunakan adalah kloroform, eter, dan alkohol. B. Metoda Mikroteknik Metoda yang umum digunakan dalam mikroteknik adalah sediaan utuh, sediaan irisan, sediaan uraian, sediaan ulasan, sediaan rentang, sediaan gosok dan sediaan supravital. 1. Sediaan Utuh (Whole Mounts) Melalui metode ini, dipersiapkan sediaan yang terdiri atas keseluruhan organism secara utuh. Melalui metode ini diusahakan agar kita mendapat kesan bentuk aslinya dengan mempertahankan format tiga dimensinya. Pada metode ini dihasilkan sediaan dengan ketebalan 0,2 mm ± 0,5 mm dengan tingkat perbesaran 100 kali. 2. Sediaan Irisan (Sectioning) Metode ini dianggap sebagai teknik rutin bagi penyiapan spesimen. Suatu metode pembuatan sediaan dengan jalan membuat suatu irisan dengan tebal tertentu sehingga dapat diamati melalui mikroskop. Tebal-tipisnya sayatan bergantung pada tujuan pengambilan spesimen. Umumnya bersikat antara 6-15 mikron (1 mikron ± 0,001 mm). Ukuran sayatan biasanya terbatas pada ukuran panjang dan lebar yaitu 3 x 2 cm. Ada 2 macam metode irisan yaitu : a. Metode irisan dengan menggunakan tangan Pada beberapa macam jaringan, terutama dalam lapangan botani, pembuatan sediaan dengan cara ini masih dapat dipakai misalnya melihat susunan daun segar. Dengan mempelajari sediaan seperti ini dapat diperoleh beberapa keterangan mengenai luas maupun tipe fibrosis didalam jaringan yang patologis. b. Metode irisan dengan menggunakan mikrotom yang mempunyai keuntungan keuntungan yaitu yait u tebal irisan dapat diatur menurut tujuan dan kehendak pengguna.
Mikroteknik
3. Sediaan Uraian Yaitu suatu metode yang ³diuraikan´ dengan menggunakan jarum pengurai. Yang diurai adalah komponen maupun struktur tertentu sehingga memungkinkan pengamatan dengan lebih sempurna. Contoh untuk metode ini adalah penguraian guna mendemontrasikan struktur serta hubungan ujung-ujung syaraf. 4. Sediaan Ulasan (Smearing) Yaitu suatu pembuatan sediaan dengan jalan mengoles dari substansi yang berupa cairan maupun bukan cairan diatas kaca object yang bersih dan bebas lemas, kemudian difiksasi, diwarnai dan ditutu dengan cover glass. Bahan yang sering digunakan dalam metode ini adalah darah. Beberapa pewarnaan yang biasa digunakan adalah Giemsa, May Grunwald (larutan eosin-methylen blue dalam methyl alcohol), Pappenheim dan Wright. Pada metode sediaan ulasan ini mempunyai beberapa teknik yaitu : a. Teknik jenis sediaan natif Teknik ini menggunakan ulasan darah yang tipis pada gelas preparat ataupun pada kaca penutupnya. Darah pada bagian tengah kaca penutup secepatnya digeserkan sehingga darah menyebar rata pada permukaan kedua kaca penutup dengan menarik ujung-ujungnya yang bebas. b. Teknik sediaan ulas Teknik ini memerlukan dua kaca preparat. Misalnya darah diteteskan pada salah satu kaca preparat pada bagian ujungnya. Ujung kaca preparat lainnya menyentuh tetesan darah untuk kemudian ditarik dengan posisi 45 sehingga darah akan rata pada permukaan kaca preparat c. Teknik mendapatkan hasil tebal Teknik ini digunakan untuk mengamati parasit yang terdapat dalam darah, misalnya parasit malaria. Kesukaran dalam penyiapan darah tebal adalah sulit menghindarkan agar darah tidak mengalir keluar kaca preparat. 5. Sediaan Rentang Yaitu suatu metode pembuatan sediaan dengan cara merentangkan suatu jaringan pada permukaan object glass sehingga dapat diamati dengan mikroskop. Bahan yang dibuat adalah jaringan yang tipis misalnya pleura, mesenterium, peritoneum, perikardium, dan lain-lain. Bahan pewarnaan yang biasa digunakan adalah pewarnaan Mallory Acid Fuchsin, Hematoksilin dan A zure II-Eosin. 6. Sediaan Gosok
Mikroteknik
Yaitu metode pembuatan sediaan untuk jenis jaringan yang keras sifatnya seperti tulang, gigi, dan kuku. Jaringan dipotong-potong kemudian digosok pada batu gosok hingga cukup tipis untuk dapat diamati. 7. Sediaan Supravital Yaitu metode untuk mendapatkan sediaan dari sel-jaringan yang hidup. Pewarna yang biasa digunakan adalah Janus Green, Neutral Red, Methylen Blue dengan konsentrasi tertentu. 8. Pencet (Squash) Yaitu metode untuk mendapatkan suatu sediaan dengan cara memencet suatu potongan jaringan atau suatu organism secara keseluruhan sehingga didapatkan suatu sediaan yang tipis dan dapat diamati dengan mikroskop. Metode ini digunakan untuk jaringan yang sel-selnya mudah lepas misalnya lien, dan sumsum tulang. Pewarna yang biasa digunakan adala h larutan carmine. C. Metoda Parafin Metoda paraffin termasuk metoda irisan yang merupakan metoda rutin. Dalam membuat siapan melalui metoda paraffin untuk jaringan, diperlukan beberapa tahapan yaitu : 1. Pembiusan (narcose) Pembiusan dilakukan tergantung dari jenis hewan yang akan dijadikan preparat. Pembius yang biasa digunakan adalah eter, kloroform, prokain, aseton, morfin dan metan. 2. Pengambilan jaringan (diseksi) Pengambilan jaringan umumnya menggunakan pinset dengan dibantu dengan gunting bedah. 3. Fiksasi Fiksasi bertujuan untuk memberikan perlakuan tertentu terhadap jaringan sehingga dapat diawetkan dalam kondisi yang mendekati keadaan aslinya, mencegah autolisis dan menaikkan daya pewarnaan. Fiksatif dapat dikelompokkan menjadi cairan fiksatif tunggal yaitu formalin, alkohol, asam asetat dan asam pikrat, dan fiksatif majemuk yaitu larutan bouin dan formol saline. Larutan yang biasa digunakan pada fiksasi adalah larutan fisiologis NaCl dan larutan ringer. 4. Pencucian (washing) Tujuannya adalah menghilangkan cairan maupun bahan yang masih tertinggal pada jaringan. Pencucian dilakukan pada air yang mengalir. Pencucian
Mikroteknik
dilakukan sebelum proses fiksasi, sesudah proses fiksasi dan setelah proses pewarnaan. 5. Dehidrasi Yaitu proses mengeluarkan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan kimia tertentu. Proses dehidrasi umumnya dilakukan dua kali yaitu setelah proses fiksasi dan pencucian serta setelah proses pewarnaan. Syarat larutan yang digunakan dalam dehidrasi adalah : a) Harus dapat menggantikan kedudukan air dalam jaringan b) Dapat digantikan oleh medium penjerbih c) Tidak merusak jaringan Larutan yang biasa digunakan adalah alkohol. Larutan yang lain adalah dioksan, N-butyl alkohol dan aniline oil. 6. Penjernihan (clearing) Tujuannya adalah menggantikan tempat alkohol dalam jaringan. Larutan yang umum digunakan adalah xylol karena murah, bekerja cepat, membuat jaringan cepat menjadi transparan dan cepat menyingkirkan dan menggantikan kedudukan alkohol dari proses dehidrasi. Kekurangannya jika terlalu lama di xylol maka menyebabkan jaringan menjadi kering, rapuh dan getas. 7. Infiltrasi Yaitu usaha menyusupkan media penanaman ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih. Media yang umum digunakan adalah paraffin. Proses infiltrasi dilaksanakan dalam oven. 8. Penanaman (embedding) Yaitu proses memasukkan atau menanam jaringan ke dalam blok-blok paraffin sehingga memudahkan pada proses penyayatan. Blok-blok menggunakan cetakan yang terbuat dari timah, kertas atau a luminium. 9. Penyayatan (section) Penyayatan dilakukan agar menghasilkan sayatan tipis. Penyayatan umumnya menggunakan mikrotom. 10. Afiksing Yaitu proses pelekatan sayatan jaringan pada kaca preparat dengan bantuan media perekat tertentu, yaitu albumin diatas hot plate. 11. Deparafinasi 12. Pewarnaan (staining)
Mikroteknik
Tujuannya agar dapat mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop. Zat warna dapat dibedakan berdasarkan : a) Berdasarkan sifatnya, zat warna dibedakan menjadi zat warna asa m berupa garamgaram dari sodium dan zat warna basa berupa sulfat basa organik. b) Berdasarkan asalnya, zat warna dibedakan menjadi zat warna alami yang diperoleh dari alam seperti Hematoxilin dan zat warna sintesis yang dibuat di pabrik seperti basic fuchsin. c) Berdasarkan kemampuan mewarnai jaringan, yaitu zat warna substantif yang mampu mewarnai jaringan secara langsung misalnya Neutral red dan zat warna ajektif yang mampu mewarnai jaringan dengan bantuan mordan misalnya Hematoksilin. d) Berdasarkan komposisi warna, yaitu pewarna tunggal missal Gentian violet, pewarna ganda misalnya hematoksilin-eosin, pewarna rangkap tiga misalnya formula Marllory triple stain dan pewarna rangkap empat. Umumnya yang digunakan adalah pewarnaan dengan pewarna ganda. Pada pewarnaan ganda, umumnya pewarna yang digunakan adalah yang bersifat asam dan basa sehingga menyebabkan bagian-bagian jaringan yang bersifat asidotilik danbasotilik dapat ditonjolkan. Tujuan penggunaan pewarna ganda bertujuan agar terjadi kekontarsan pewarnaan sehingga pengenalan bagian tertentu dapat lebih cepat dan jelas terlihat. Kombinasi yang umum digunakan adalah zat warna berwarna biru dengan merah, contohnya Hematoksilin-Eosin. Hematoksilin selalu digunakan lebih dahulu dan setelah proses diferensiasi, maka selanjutnya eosin digunakan. Hematoksilin-Eosin umumnya digunakan untuk pewarnaan jaringan hewan, namun untuk jaringan tumbuhan tidak lazim diwarnai dengan paduan warna tersebut. Hal ini dikarenakan eosin tampak kurang efektif bagi jaringan tumbuhan. Untuk jaringan tumbuhan, biasanya digunakan pewarna Erythrosin B. D. Mikrotom Yaitu instrument ilmiah yang memotong iris tipis sesuatu untuk pemeriksaan mikroskopis atau suatu alat berpresisi tinggi sehingga harus diperlakukan secara hati-hati. Alat ini digunakan untuk menyayat jaringan sebelum ditempelkan ke atas permukann object glass.
Mikroteknik
Secara umum, suatu mikrotom memiliki bagian-bagian terpenting yaitu : 1. Skala pengatur ketebalan sayatan, biasanya terdapat di bagian kanan atas badan mikrotom. Skala ini dapat digeser ke kiri dan ke kanan sesuai dengan ketebalan sayatan yang diinginkan. 2. Pisau mikrotom, merupakan komponen yang bisa menentukan kualitas sayatan. 3. Pegangan blok jaringan, merupakan komponen yang menghubungkan mikrotom dengan blok jaringan yang hendak disayat. 4. Pengatur jarak berfungsi untuk mengatur blok jaringan dengan mata pisau. Dari beberapa jenis mikrotom yang ada, jenis-jenis mikrotom yang umum dikenal dan digunakan dalam mikroteknik adalah : 1. Mikrotom putar Umumnya dipakai pada metode paraffin. Posisi kedudukan pisau tetap sementara jaringan yang dilekatkan pada holder bergerak turun naik sehingga diperoleh sayatan yang umumnya berbentuk pita. 2. Mikrotom sorong Sering digunakan pada metode paraffin dan umumnya digunakan dalam celloidin. Kedudukan jaringan dia m sementara pisau bergerak maju mundur. 3. Mikrotom beku Digunakan untuk penyayatan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun celloidin namun dibekukan dengan karbon dioksida ataupun Freon. 4. Mikrotom Schantz Yaitu mikrotom dimana pada saat menyayat, blok jaringan yang hendak disayat tetap diam di tempatnya sementara pisau melewati blok paraffin tersebut. 5. Mikrotom Spencer Yaitu mikrotom dimana pada saat menyayat dapat menghasilkan pita sayatan yang panjang sehingga cocok untuk pembuatan preparat sayatan serial. Pisau mikrotom harus selalu dibersihkan setelah selesai dipakai, karena jika tidak maka akan menimbulkan korosi. Pisau yang biasa digunakan pada mikrotom adalah: 1. Pisau plane-edge (simple wedge razor), biasanya digunakan untuk sayatan beku dan blok paraffin. 2. Pisau konkaf, biasa digunakan untuk sayatan blok celloidin dan plastic. 3. Pisau bikonkaf sering digunakan untuk menyayat blok paraffin. Cara kerja mikrotom adalah proses pemotongan blok preparat dengan menggunakan mikrotom. Sebelum melakukan pemotongan, yang harus dilakukan adala h
Mikroteknik
1. Persiapan pisau mikrotom Pisau mikrotom harus diasah sebelum dipakai agar jaringan dapat dipotong dengan baik dan tidak koyak sehingga didapatkan jaringan yang baik. Pisau mikrotom kemudian diletakkan pada tempatnya di mikrotom dengan sudut tertentu. Rekatkan blok paraffin pada holder dengan menggunakan spatula. Letakkan tempat duduk blok paraffin beserta blok preparat pada tempatnya di mikrotom. 2. Persiapan Kaca Objek Kaca objek yang akan direkatkan preparat harus telah dicoated (disalut) dengan zat perekat seperti albumin (putih telur), gelatin atau tespa 3.
Persiapan Waterbath atau wadah berisi air hangat dengan temperatur 37-400C
4. Persiapan sengkelit atau kuas. Teknik pemotongan parafin yang mengandung preparat adalah sebagai berikut 1. Rekatkan blok parafin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat. 2. Letak pisau mikrotom pada tempatnya dan atur sudut kemiringannya. Biasanya sudut kemiringan berkisar 20-30 derajat. 3. Atur ketebalan potongan yang diinginkan, biasanya dipakai ketebalan antara 5-7 mikrometer. 4. Gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin dan potonglah blok preparat secara teratur dan ritmis. Buang pita-pita parafin yang awal ta npa jaringan hingga kita mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan.. 5. Pita
parafin
yang
mengandung
jaringan
lalu
dipindahkan
secara
hati-hati
menggunakan sengkelit atau kuas kedalam waterbath yang temperaturnya diatur 3740C dan biarkan beberapa saat hingga poita parafin tersebut mengembang. 6. Setelah pita parafin terkembang dengan baik, tempelkan pita parafin tersebut pada kaca objek yang telah dicoated dengan cara memasukkan kaca objek itu kedalam waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Dengan menggunakan sengkelit atau kuas pita parafin ditempelkan pada kaca objek. Setelah melekat kaca objek digerakkan keluar dari waterbath dengan hati-hati agar pita parafin tidak melipat. 7. Letakkan kaca objek yang berisi pita parafin di atas hotplate dengan temperatur 4045C, biarkan selama beberapa jam. Cara lainnya adalah dengan melewatkan kaca objek di atas api sehingga pita parafin melekat erat di atas kaca objek. 8. Setelah air kering dan pita parafin telah melekat dengan kuat, simpan kaca objek berisi potongan parafin dan jaringan sa mpai saatnya untuk diwarnai.
Mikroteknik
Mikrotom sebaiknya ditutup dengan plastik, atau dimasukkan ke kotaknya jika tidak sedang digunakan. Jangan memindahkan mikrotom dengan cara memegang bagian yang dapat bergerak, karena dapat menggangu akurasinya. Sebelum dan sesudah digunakan, sebaiknya mikrotom dibersihkan dari serpihan parafin dengan cara melap dengan kain lap yang telah dibasahi dengan xilol. Mikrotom harus selalu diminyaki untuk mencegah keausan dan kemacetan.
