1
TEKNIK PEMBUATAN PREPARAT JARINGAN
I. TUJUAN
1. Mengetahui dan memahami teknik pembuatan preparat jaringan hati babi dengan metode paraffin 2. Mengetahui dan memahami teknik pewarnaan preparat jaringan hati babi 3. Mengamati struktur jaringan hati babi II. TEORI
Proses pertama yang disiapkan dalam menyiapkan materi segar dalam pengamatan mikroskopis yaitu fiksasi. Fiksasi adalah usaha untuk untuk mempertahankan komponen-komponen sel atau jaringan agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami mengalami perubahan bentuk maupun maupun ukuran. Media yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif. Fiksatif berfungsi untuk untuk menghentikan metabolisme secara cepat, mengawetkan komponen sitologis dan histologis, memperkeras tekstur yang rapuh, dan mewarnai jaringan sehingga bagian-bagiannya dapat diketahui. Faktor-faktor yang berperan dalam fiksasi adalah buffer (pH), suhu yang rendah, ketebalan irisan, perubahan volume, osmolalitas pada larutan fiksatif, konsentrasi, dan waktu fiksasi. Dehidrasi memiliki fungsi fungsi menghilangkan menghilangkan air dalam jaringan. Bahan yang digunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air. Dehidrasi yang baik dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari konsentrasi 70% sesuai dengan pelarut Bouin formol kemudian berturut-turut ke dalam alkohol 80%, 90%, 96% dan alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi dilakukan pengulangan 3 kali. Metode paraffin merupakan cara dalam pembuatan sediaan dengan menggunakan paraffin sebagai media embedding (penanaman). Embedding ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis (10 mikrometer) dengan menggunakan mikrotom. mikrotom. Agar paraffin dapat masuk ke ke dalam sel, alkohol alkohol di dalam organ harus diganti dengan zat za t yang mudah mengusir alkohol sebelum bisa
2
diusir oleh paraffin. Clearing atau dealkoholisasi ini dapat menggunakan aceton, benzol,toluol, dan xilol. Clearing dapat dilakukan selama 24 jam. Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagian yang sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotom menggunakan pisau baja dan digunakan untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau tumbuhan dalam histologi(Wikipedia). Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah: 1. Rocking microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya untuk organ-organ keras seperti kayu 2. Rotary microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang akan mengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap. Mikrotom ini biasanya dipakai dalam mikroteknik metode paraffin 3. Sliding microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan pisau yang bergerak maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan pada mikroteknik metode paraffin, walau umumnya digunakan pada penyayayan jaringan yang di tanam dalam celloidin. Biasanya digunakan pada objek-objek yang keras. 4. Freezing microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringan yang disayat adalah jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan dengan memakai gas CO2. Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakai lebih pendek, karena langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit dipotong.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah: o Mikrotom harus seberat mungkin o Meja tempat mikrotom harus stabil o Pisau harus cocok dengan mikrotom o Posisi pisau harus stabil o Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringan yang akan disayat.
3
Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-seknya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.tanpa pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga sulit untuk diamati. Pewarnaan akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk dipelajari. Pewarnaan dibedakan antara non vital dengan vital a. Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui fiksasi. Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling alzim digunakan, terutama untuk pekerjaan rutin sehari-hari, terutama pembuatan preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa. b. Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih dalam keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna. Dengan demikian zat warna yang hendaknya yang tidak bersifat toksik bagi selsel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan lithium carmine secara umum digunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES, karena sel-sel tersebut mampu memfagosit zat warna. c. Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan anorganik, yang mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati. Ditinjau dari berbagai segi, maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada kategori-kategori tertentu.
III. ALAT, BAHAN, DAN CARA KERJA
A. ALAT
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah object glass, cover glass, pisau mikrotom, spatula, karton putih, botol film
4
B. BAHAN
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum pembuatan preparat jaringan hewan adalah larutan bouin, larutan alkohol 70%, 80%, 96%, 100%, larutan xylol, larutan benzol 1 dan benzol 2, albumin, pewarna hematoksilin, dan entelan dari minyak cengkeh.
C. CARA KERJA
1. Proses fiksasi
•
Organ difiksasi oleh larutan Bouin selama 12-24 jam.
•
direndam dalam alkohol 70% selama 3 kali @ 10 menit sambil dikocok.
•
Direndam alkohol 70% selama 24 jam. Dilanjutkan perendaman alkohol 80%, 96% , dan 100% masing-masing 2 kali dengan selang waktu satu jam
•
Berikutnya jaringan tersebut direndam dengan xilol overnight. Dilanjutkan dengan larutan benzol 1 dan benzol 2 dengan selang waktu satu jam
•
Dilakukan proses infiltrasi dengan perbandingan xilol: parafin = 1:1 selama 30 menit pada suhu 52oC.
•
Dilanjutkan pemberian parafin murni pada suhu 56 oC selama 12 menit.
•
Berikutnya dilakukan proses blocking dan sectioning dengan ukuran 5 mikron.
•
Pita hasil potongan diletakkan pada gelas objek yang telah diberi mayer albumin lalu diletakkan pada hot plate.
5
2. proses pewarnaan •
Proses berikutnya adalah pewarnaan preparat. Langkah pertama dilakukan perendaman pada xilol selama 10 menit. Lalu xilol pada slide diserap dengan tisu sampai kering.
•
Berikutnya direndaman pada alkohol absolut dengan konsentrasi 96,90,80,70,60,50,40,30(%).
•
direndam pada hematoxylin selama 30 detik, dan dicuci dengan air yang mengalir, lalu direndam alkohol 30,40,50,60,70(%).
•
Selanjutnya direndam pada Eosin selama 1-2 menit dan dilanjutkan perendaman pada alkohol 70, 80, 90, 96(%), absolut. Alkohol pada slide diserap dengan tisu sampai kering.
•
Selanjutnya direndam xilol 10 menit. Lalu diberi entelan dan selanjutnya dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.
III.HASIL PENGAMATAN
Hasil pengamatan dapat dilihat di lampiran.
IV. PEMBAHASAN
Dalam praktikum pembuatan preparat jaringan hewan, dikenal proses fiksasi, proses ini bertujuan untuk: 1. mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat, sedangkan keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula. 2. mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis.
6
3. Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan komponen jaringan fiksatif. Faktor-faktor yang berperan dalam fiksasi adalah buffer (pH), suhu yang rendah yang dapat mencegah autolisis, ketebalan jaringan untuk mendapatkan daya penetrasi yang tinggi, perubahan volume, osmolalitas pada larutan fiksatif, penambahan deterjen agar fiksatif cepat masuk, konsentrasi, dan waktu fiksatif. Dehidrasi memiliki fungsi menghilangkan air dalam jaringan. Bahan yang digunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air. Dehidrasi dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari alkohol konsentrasi 70% kemudian berturut-turut ke dalam alkohol 80%, 90%, 96% dan alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi dilakukan pengulangan 2 kali, dengan alkohol bekas, dan alkohol baru. Praktikan kelompok 2 mengguanakan hati babi dan jantung kambing sebagai sampel jaringan yang akan diamati. Secara keseluruhan, hasil preparat yang didapat oleh sebagian besar anggota kelompok 2 kurang memuaskan dan kurang representatif terhadap jaringan aslinya. Hal tersebut dapat disebabkan oleh beberapa hal, diantaranya yaitu kesalahan pada proses fiksasi, dan pada proses penyatuan jaringan dengan paraffin. Dasar dari pembuatan sajian histologi yang baik adalah melakukan fiksasi yang benar. Kesalahan yang dilakukan pada tahap fiksasi tidak akan pernah dapat diperbaiki lagi pada tahapan selanjutnya. Jadi, hasil akhir sajian histologi yang baik sangat tergantung pada cara melakukan fiksasi dengan baik. Potongan sampel yang terlalu besar menyebabkan larutan fiksatif kurang dapat menyerap ke seluruh bagian sampel jaringan
V. KESIMPULAN
1. Teknik pembuatan preparat jaringan hati babi dan jantung kambing dengan metode paraffin meliputi proses fiksasi, clearing dengan alkohol, infiltrasi, penanaman dengan paraffin, dan pewarnaan 2. Struktur jaringan hati babi dan jantung kambing tidak berhasil diamati
7
VI. DAFTAR ACUAN
Dasumiati, 2008. Diktat Kuliah Mikroteknik. Prodi Biologi Fak.Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Imron,Tamyis Ali. 2008. Pembuatan Preparat Jaringan Tumbuhan Dengan Metode Parafin. Lap.prak mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber biology.blogspot.com. Di akses tanggal 29 Desember 2008 jam 14.02
Guyton, C.A. & J. E. Hall. 1999. Textbook of Medical Physiology . 11th ed. Elsevier Inc. : xxxv + 1113 hlm.
