ì
ALICIA HERNANDEZ C O L A B O R A D O R E S
ILEANA ALFARO Y RONALD ARRIETA
CONTENIDO
Prólogo ....................................................................................................................................
ix
P r e s e n t a c ió n ......................................................................................................................................................
xi
GENERALIDADES
Objetivos ....................................................................................................................................
2
ANTCÇB3ENT1S HjglpRlCO S
3
...........
, .................
Louis Pasteur y sus investigaciones ........................................................................... La era después de Pasteur ............................................................................................
i 4 5
Las levaduras................................................................................................................... Los mohos .......................................................................................................................
7 g
1-a* hartonas
8
La era antes de Pasteur ..................................................................................................
.......................................................................................................................................
Ejercicios de autoevaluación .................................................................................... Fuentes y lecturas recomendadas ................................................
9 11
Catxiutoi: EL MANEIO DE LOS CULTIVOS M O O B IO IÓ G IC O S
Objetivos ..................................................................................................................
14
IN l-K Q P U C C lÓ N —............................................................................................ •
13
. ■. . *
El aislam ien to de m icroorganism os ..................................................................................
16
Los cultivos puros y los mixtos ...................................................................................
16
Las técnicas para obtener cultivos puros
.................................................................. La siembra en placas de Petri por rayado ................................................................ La siembra en placa vertida .....................................................................................
17 17 17
Las diluciones en serie .............................................................................................
1S
La desecación
...........................
19
La congelación................................................................................................................ La congelación ordinaria ......................................................................................... La congelación ultrafria ........................................................................................... La congelación con nitrógeno líquido ...................................................................... Ul r of i l i zadán. * .
.
.
.
a
.
20 20 20 21
.____ 21
XV
Copyrighted material
La fuente de energía ......................................................................................................
22
La fuente de carbono
...................................................................................................
22
La fuente de nitrógeno .................................................................................................. Las fuentes de otros elementos ...................................................................................
23 2á
LOS REQUERIMIENTOS AMBIENTALES .....................................................................................
24
La preparación pe medios de cultivo ............................................................................. Los tipos de medios de cu ltiv o s................................................................................... El medio sintético ......................................................................................................
25 25 25
El medie complejo ....................................................................................................
25
La formulación áe medios de cultivo
- .....................................................
U.£REFAKAa(>N.D£LiMX:ULQ-.^..,..^^x...^^., ^ ^ . . . . Las etapas para preparar el inoculo .......................................................................... La recuperación de la cepa .......................................................................................
26 2Z 27 27
El crecimiento en un medie de cultivo sólido ..........................................................____ 28 El crecimiento en un medio de cultivo liquido ....................................................... 28 Los aspectos por considerar en la preparación del in ó cu lo .................................... 28 La cantidad de inóculo ............................................................................................. 2& La concentración de microorganismos...................................................................... 28 Ejercicios de autoevaluación ...................................................................................................... 31 Fuentes y lecturas recomendadas ..............................................................................................
33
Guxtub3: LAS FERMENTACIONES UÜfCltVOS . . . ♦ • * .......................................................................................................................
36 37
El concepto bioquímico de fermentación .................................................................. El concepto microbiológico de fermentación ........................................................... I a r i asificactO n df. i ¡ns procesos df ffrmfntA< TQm ......................................................
37
Los productos finales de la fermentación ..................................................................
39
El oxígeno en el proceso de fermentación ..................................................................
39
..............................................................
40
Laglucólisis ..................................................................................................................... F1 rielo de Krebs ............................................................................................................
40
Los fh rm fn tad o rrs ....................................................................................................................
42
El matraz erlenmeyer ................................................................................................... El reactor de tanque agitado ....................................................................................... El sistema de agitación ............................................................................................. Las placas deflectoras ............................................................................................... Los dispositivos de adición, extracción v control ..................................................... El sistema de aireación ............................................................................................. Los sistemas de transferencia de calor ...................................................................... El reactor d e elev ación con aire
43
45 45 45 45 46
El reactor de d isco rotatorio .........................................................................................
46
Las
rutas bioquímicas de las fermentaciones
38
41
43 44
.........................................................................................................
47
La curva de crecimiento de un microorganismo ..................................................... La fase de latericia .................................................................................................... La fase logarítmica o exponencial ............................................................................
47
LOS SISTEMAS DF. FERMENTACIÓN
XVI
38
47 47
Copyrighted material
La fast’ estacionaria
48
El efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de crecimiento . . .
48
Algunos términos relacionados con la ecuación de Monod .................................... La ecuación de Monod ............................................................................................. El cultivo en lote ............................................................................................................ El cultivo continuo ........................................................................................................ El quimiostato .......................................................................................................... El turbidostato .......................................................................................................... El sistema de flujo tapón ......................................................................................... Las ventajas y las desventajas del cultivo continuo en relación con el cultivo en lote ................................................................................ I A RFCI TPFRAClO V Y 1A Pl FRIFIC A n ^ V I OS PROni IfTTK ................... ..............
48 49
53 53
La separación liquido-sólido ....................................................................................... La filtración .............................................................................................................. La centrifugación ...................................................................................................... La floculación y la flotación .....................................................................................
54 54 55 56
La desintegración celular ............................................................................................. La extracción líquido-líquido ....................................................................................... La cristalización..............................................................................................................
56 56 57
La cromatografía ............................................................................................................
57
Ejercicios de autoem luación ......................................................................................................
59
fuentes y lecturas recomendadas...............................................................................................
61
cuítalo 4: LOS PRODUCTOS LÁCTEOS Objetivos ...................................................................................................................................
64
In tr o d u c c ió n ...............................................................................................................................
65
ElYOGUR .................................................................................................................................
66
Definición ....................................................................................................................... Historia ........................................................................................................................... Los tipos de yogur ........................................................................................................
66 67 67
El proceso de elaboración del vogur batido ............................................................. La ntaieria prinui ...................................................................................................... La estandarización .................................................................................................... La homogeneización ................................................................................................. La pasteurización ...................................................................................................... El enfriamiento pospasteurización .......................................................................... La inoculación y la fermentación ............................................................................ El enfriamiento posfermentación ............................................................................ La agitación y la adición defrutas .......................................................................... El em paque ................................................................................................................ El proceso de elaboración de yogur firme ................................................................
68 68 68 69 69 70 70 70 71 71 71
La producción de "yogur" en forma casera ............................................................. La microbiología y la bioquímica de la fermentación del yogur ......................... Aspectos nutricionales del yogur ..............................................................................
71 72 73
............................................................................................................................. Las características del queso .......................................................................................
74 74
LOSOUtSOS
50 50 51 52 52
_______ XVII
Copyrighted material
Los tipos de q u e so s.................................
74
El proceso general de elaboración de quesos ............................................................ La materia prima y la estandarización .................................................................... La pasteurización ...................................................................................................... La inoculación y ¡a fermentación ............................................................................. La coagulación .......................................................................................................... El desuerado o escurrimiento ................................................................................... El moldeo y el prensado ........................................................................................... El salado ................................................................................................................... La maduración ..........................................................................................................
75 75 76 76 77 77 78 78 78
L a n a t i l l a ...............................................................................................................................
80
Definición
.......................................................................................................................
§0
El proceso de elaboración de la natilla ...................................................................... La materia prima y la estandarización .................................................................... La homogeneización .................................................................................................. La pasteurización ...................................................................................................... La inoculación y la fermentación ............................................................................. El enfriam iento .......................................................................................................... El em paque .................................................................................................................
80 80 80 80 81 81 81
El suero de queso .................................................................................................................
81
Los PROB1ÓT1COS ..................................................................................................................... Las ventajas del uso de los productos probióticos ...................................................
82 82
Los requisitos de los microorganismos probióticos .................................................
83
Ejercicios de autoew luaáón ...................................................................................................... Fuentes y lecturas recomendadas .............................................................................................
85 87
úpjhifa 5 LOS EMBUTIDOS FERMENTADOS
Objetivos ....................................................................................................................................
90
INTRODUCCIÓN..........................................................................................................................
21
LOS EMBUTIDOS FERMENTADOS .......................................................................
92
El PROCESO GENERAL DE ELABORACIÓN DE UN EMBUTIDO FERMENTADO ........................
22
La selección de la carne y la grasa ...................................................................................
94
La co n g elació n .......................................................................................................................
94
El picado de las materias primas .....................................................................................
94
La adición de otros ingredientes .....................................................................................
95
La adición del cultivo iniciador .......................................................................................
95
El embutido.
^ .^ .
96
.......................................................................................
96
..................................................................... . .......................................................
22
LA MICROBIOLOGÍA Y LA BIOQUÍMICA PE LA FERMENTACIÓN DE EMBUTIDOS ....................
97
^
^ ^
La fermentación y el ahumado El secado
El proceso de fermentación de los embutidos
............................................................
97
Los microorganismos involucrados en el proceso de fermentación de los embutidos ........................................................
98
El .desarrollo del color e n lo s em bu tid os.,
«
Los ERQCESQS ESPECIFICOS D£BJiBÜlL\QÚN±)E DOS
______ «....».........____
IDO lili
El salami duro ............................................................................. ., .........................« . . , ,......... 101 El peppenm i............................................................................................................................. 102
XVIII
Copyrighted material
Ejercicios de autoevaluación . .. Fuentes y lecturas recomendadas
103 105
CwMot: LAS BEBIDAS ALCOHÓLICAS In tro d u c c ió n ...............................................................................................................................
109
F1 alcohol Phlirn nn es solo una bebida
109
Los tipos de bebidas alcohólicas ................................................................................ Los microorganismos termentadores ........................................................................
110
La CERVEZA ...................................................................................................................................
113
Las materias primas ...................................................................................................... La malta .................................................................................................................... Los adjuntos .............................................................................................................. El lúpulo .................................................................................................................. La levadura .............................................................................................................. El a g u a ....................................................................................................................... El proceso de elaboración de la cerveza .................................................................... La molienda de la malta ........................................................................................... La macerarían .......................................................................................................... La filtración ..............................................................................................................
114
112
115 116 116 117 117 118 118 119 120
_ J2 1 La separación de precipitados (Whirlpool) ............................................................... 122 El enfriamiento del mosto ......................................................................................... 122
La aireación del mosto y la inoculación de la levadura .......................................... La fermentación ........................................................................................................ La separación de la levadura ..................................................................................... La maduración .......................................................................................................... La filtración y la carbomtación de la cerveza ......................................................... El llenado y la pasteurización .................................................................................. El deterioro de la cerveza ............................................................................................. El deterioro microbiológico ................................................................................ El deterioro químico .............................................................................................
122 123 125 125 126 128 128 128 129 129
Los últimos desarrollos tecnológicos..........................................................................
129
En nuestro país ..............................................................................................................
130
El vino
...................................................................................................................................
130
Las materias prim as........................................................................................................ La uva ....................................................................................................................... La levadura .............................................................................................................. El proceso de elaboración del vino ............................................................................. La vendimia .............................................................................................................. La eliminación de ¡os tallos y las ramas. Trituración ................................. El prensado déla uva ................................................................................................ El tratamiento del mosto de uva .............................................................................. La fermentación ........................................................................................................ El trasiego del v in o ....................................................................................................
132 132 134 135 135 136 137 13Z 139 143
La maduración de los mim
. . . . . . . ___ 1M
________ XIX
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La clarificación y la filtración ................................................................................... El embotellado .......................................................................................................... Otros vinos ..................................................................................................................... Los vinos de postre .................................................................................................... Los vinos espum osos.................................................................................................. Los defectos y las enfermedades del v in o .................................................................. En nuestro país ...............................................................................................................
144 145
Ejercicios de autoei
151
146 146 146 148 150
153
cwirt.7 LA PRODUCCIÓN DE VINAGRES Y VEGETALES FERMENTADOS
Objetivos .................................................................................................................................... In tr o d u c c ió n ......................................................................................................................... La p rod u cción de v in ag re ................................................................................................ Aspectos generales ........................................................................................................ El proceso de elaboración de vinagre a partir de frutas ......................................... La preparación de la fr u t a ......................................................................................... El tratamiento térmico .............................................................................................. La inoculación ........................................................................................................... La fermentación alcohólica ....................................................................................... La eliminación de la levadura ................................................................................... la fermentación acética ............................................................................................ La pasteurizaáón ...................................................................................................... Los métodos para obtener vinagre ............................................................................. El método de Orleans ................................................................................................ El método de la acetificación sumergida ..................................................................
156 157 158 158 159 160 160 160 160 161 161 162 162 162 163
El repollo ácido o sauerkraut ....................................................................................... El acondicionamiento ............................................................................................... El picado ................................................................................................................... La adición de sal ........................................................................................................ El prensado ............................................................................................................... La fermentación láctica .............................................................................................. El tratamiento térmico ....................................................... El empacado ...............................................................................................................
164 165 165 165 166 166 166 166
Los encurtidos—................................................................................................................ El acondicionamiento ................................................................................................ La prcfmración de la salmuera ................................................................................. La fermentación de los vegetales ............................................................................... Las operaciones postenores a la fermentación .......................................................... La preparación del medio ......................................................................................... La mezcla de iv¡(etales con el medio preparado ....................................................... El empaque y el enfriamiento ...................................................................................
167 1ÉZ 168 168 168 169 169 169
Ejercicios de autoevaluación ...................................................................................................... Fuentes y lecturas recomendadas ..............................................................................................
171
XX
173
Copyrighted material
Optobe: LA PANIFICACIÓN Objetivos ..........................................................................................................................................
176
iNrrRonirrrií'W ...............................................................................................................................
177
LOS INGREDIENTES UTILIZADOS EN LA ELABORACIÓN DEL PAN .................................................................................................... La levadura
...........................................................................................................................
La harina de trigo ................................................................................................................ El azúcar
...............................................................................................................................
El ................................................................................................................................... A-iI agua .............................................................................. La grasa ................................................................................................................................. Otros ingredientes ............................................................................................................... El
proceso de elaboración del p a n
.....................................................................................
La reconstitución de la levadura ..................................................................................... F1 mpyrladn o el amasado ................................................................................................ íji
ferm entación....................................................................................................................
El cortado y el formado de la masa ................................................................................ El horneado ...........................................................................................................................
Ejercicios de autoevaluación ...................................................................................................... Fuentes y lecturas recomendadas .............................................................................................
178 178 179
_m 181 182 182 182 182 182 183 183 184 184 ■■■— 187 189
c*/Wo9 LA PROTEÍNA UNICELULAR Y OTROS PRODUCTOS UTILIZADOS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
Objetivos ...................................................................................................................................
192
Introducción
193
La p rod u cción de p ro teín a u n ic e lu la r ............................................................................
193
La selección de microorganismos para producir la P U C ........................................
La forma de crecimiento del microorganismo ......................................................... La recuperación de la PUC .......................................................................................
194 195 196 196 196 1% 196 197 197 197
El proceso general de elaboración de la PUC ..............................................................
197
La materia prima ..................................................................................................... La inoculación y la fermentación ............................................................................ La recuperación del producto ................................................................................. Los usos de la PUC ........................................................................................................
198 198 198 199
Las ventajas y las desventajas de la PUC
199 199 200
El valor nutricional y la calidad de la PUC ........................................................... La digestibilidad ........................................................................................................ La condición de patógeno y la toxiadad .................................................................. La velocidad de creamiento específico ...................................................................... El sustrato utilizado ................................................................................................. Las condiciones del m ed io .........................................................................................
.....................................................................
Las ventajas .............................................................................................................. Las desventajas.......................................................................................................... La producción
de hongos comrstjbi.e s
..............................................................................
La producción de setas u hongos de sombrero
..........................................................
La producción de hongos por fermentación en sustrato sólido
.............................
201 201 202
________ XXI
Copyrighted material
L a producción
de ácidos o r g á n ic o s ...................................................................................
204
El ácido cítrico ................................................................................................................. El ácido glucónico .......................................................................................................... El ácido lá ctico ................................................................................................................ L a p rod u cción de am inoácidos ............................................................................................
204 204 205 205
UrRODUCClÓN DE ENZIMAS .....................
M
>...............................
L a obtención de la fructosa y la glucosa , a partir del almidón ......................... 1.a lirupfarrión ......................................................................................................................
208 208
L a^ acariñ cad ón -.... ^ =___ 208 La isomerizarión .................................................................................................................. 2Q§
Ejercidos de autoevaluación ............................................................................................................
211
Fuentes y lecturas recomendadas ........................................
213
C**futo io: EL TRATAMIENTO BIOTECNOLÓGICO DE L05 DESECHOS SÓLIDOS Y LAS AGUAS RESIDUALES Objetivos .................................................................................................................................... In tr o d u c c ió n ......................................................................................................................... Fundam entos te ó ric o s ........................................................................................................... El proceso aerobio de biodegradadón ......................................................................
La biodegradadón de los carbohidratos .................................................................... La biodegradadón de los triglicéridos ...................................................................... La biodegradadón de las proteínas ........................................................................... La biodegradadón de ¡a lignina ............................................................................... El proceso anaerobio de biodegradadón .................................................................. La hidrólisis ............................................................................................................... La acidogénesis .......................................................................................................... La acetogénesis .......................................................................................................... La metanogénais ...................................................................................................... El impacto de la materia blodegradable en el ambiente ................. LOS TRATAMIENTOS DE DESECHOS SÓLIDOS BlODECRADABl.ES ........................................... Los tratamientos aerobios de desechos sólidos biodegradables: compostajes . ■ Las tecnologías industriales de compostaje .............................................................. Las técnicas artesanales de biodegradadón .............................................................. Los tratamientos anaerobios de desechos sólidos biodegradables ........................ Las condiciones ¡meas y químicas del proceso .......................................................... Las etapas del proceso biffeico ...................................................................... LOS TRATAMIENTOS DE AGUAS RESIDUALES ........................................................................... Los tratamientos aerobios de aguas residuales ....................................................... Riego ......................................................................................................................... Biomasa inmovilizada ................................................................................................ Lodos adivados ........................................................................................................ Los tratamientos anaerobios de aguas residuales ................................................... Reactores de lecho f i j o ................................................................................................ Reactores de lecho expandido . . . . ........ Biorreactor de flujo ascendente con lecho de lodo ...................................................
176 217 2J8 219 220 220 220 221 221 222 222 222 223 223 224 225 228 229 230 231 231 232 235 235 236 238 239 240 240 240
O tra s co n sid eracio n es
...................................................................................................... Ejerddos de autoevaluación ............................................................................................. Fuentes y lecturas recomendadas ........................................................................................ A nexos ........................................................................................................................................
241 243 245 247
RESPUESTAS A LOS EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIÓN .........................................
251
XXII
Copyrighted material
Elementos didácticos de apoyo
Cuadro 1.1;
Algunos tipos de levaduras utilizadas industrialmente.......................
7
Cuadro 1-2:
Algunos ejemplos de mohos utilizados industrialmente.....................
8
Cuadro 1.3:
Algunos ejemplos de bacterias utilizadas industrialmente
8
Cuadro 2.1: Cuadro 22:
Algunas colecciones microbianas en el mundo...................................... La composición promedio de Pharmamedia............................................
Cuadro 23:
Algunos factores de crecimiento requeridos
18 23
por los microorganismos....................................................................
24
Cuadro 2.4:
La composición de un medio sintético....................................................
25
Cuadro 15:
La composición de un medio com plejo..................................................
26
Cuadro 2.6:
La composición promedio típica de los microorganismos...................
26
Cuadro 3.1:
Algunos compuestos de interés comercial
producidos por fermentacián............................................................
39
Cuadro 4.1:
La composición promedio de la leche de vaca .....................................
65
Cuadro 4.2:
Ejemplos de quesos madurados y frescos..............................................
75
Cuadro 4.3:
Diferentes tipos de queso y sus cultivos iniciadores ...........................
76
Cuadro 4.4:
La composición promedio del suero de q u e s o ......................................
82
Cuadro 5.1:
Algunos embutidos fermentados (secos y semisecos) .........................
93
Cuadro 5.2:
Algunos microorganismos utilizados en la obtención de fermentación embutidos fermentados.................
99
Cuadro 6.1:
Ejemplos de clasificación de las bebidas alcohólicas ...........................
111
Cuadro 6.2:
Los principales congenérieos presentes en las bebidas alcohólicas ..
111
Cuadro 6.3:
Distintos tipos de cerveza en el mundo: sus nombres y características..................................................................
114
Cuadro 6.5:
Los parámetros recomendados para las uvas destinadas a la elaboración de vinos . . . ........ Cuadro 6.6: Algunos agentes utilizados en los procesos de clarificación y filtración de v i n o ....................................................... C uarlm fi.7:____I m dpfprtrw del v in o ...............................................................................
145 148
Cuadro 6.8:____Las enfermedades del v in o .......................................................................
149
Cuadro 7.1:
La clasificación de los vinagres, con base en la materia p rim a
159
Cuadro 7.2: Cuadro 73:
Los tiempos de fermentación para diferentes vegetales....................... La formulación de un medio para encurtidos........................................
168 169
Cuadro 8.1: Cuadro 8.2: Cuadro 8.3:
La formulación del pan cuadrado ........................................................... La composición química de algunas m elazas........................................ La composición química aproximada del grano de trig o.....................
178 178 180
Cuadro 8.4:
La composición de la harina de trigo con diferentes grados de extracción....................................................... La clasificación y aplicación de las harinas de trigo, de acuerdo con el contenido de proteínas.............................................
Cuadro 8.5: Cuadro 9.1: Cuadro 9.2:
134
180 180
Algunos microorganismos utilizados para la producción de PUC y los sustratos en los que crecen .............................................
195
Las características que se deben considerar al seleccionar el microorganismo para producir P U C .................................................
195
_______ XXIII
Copyrighted material
Cuadro 9.3:
El contenido proteico de varias fuentes
................................
199
Cuadro 9.4:
Algunos hongos comestibles ..................................................................
201
Cuadro 9.5:
Enzimas de interés industrial obtenidas por fermentación...............
207
Cuadro 10.1:
La clasificación de los desechos biodegradables..................................
217
Cuadro 10.2:
Las condiciones recomendables de) sustrato para el proceso de compostaje ................................................................
225
Cuadro 103:
Las características deseables de la composta.........................................
227
Cuadro 10.4:
El contenido de las compostas que producen buen rendimiento de sorgo......................................................................
227
Las concentraciones máximas permitidas de metales pesados en la composta (en países de la Unión Europea).................
228
Cuadro 10.6:
La productividad de biogás, según la materia prim a..........................
232
Cuadro 10.7:
La frecuencia mínima de muestreo y los análisis para aguas residuales de tipo ordinario y especia)..............................
233
Los límites máximos permisibles para el vertido de aguas residuales en el alcantarillado o en cuerpos de a g u a
234
Comparación entre los procesos aerobios y anaerobios de depuración de aguas residuales ........................................................
235
Cuadro A.10.1: Los límites máximos permisibles para el vertido de aguas residuales al alcantarillado sanitario....................................
247
Cuadro A.10.2: Los límites máximos permisibles para el vertido de aguas residuales en cuerpos de agua.................................................
248
Cuadro A. 10.3: Las concentraciones máximas permisibles de contaminantes por tipo de actividad.................................................................................
249
Cuadro 10.5:
Cuadro 10.8: Cuadro 10.9:
Diagrama 3.1:
Las principales partes de un reactor de tanque agitado.....................
44
Diagrama 32:
Las placas deflectoras en un reactor de tanque agitado......................
45
Diagrama 3.3:
Los sistemas de transferencia de calor en un reactor de tanque agitado.............................................................. Un reactor de elevación con aire .......................................................... Un reactor de disco rotatorio .................................................................
46 46 46
El sistema de fermentación de tipo quimiostato................................
51
Diagrama 3.7
Un reactor de flujo tapón .......................................................................
53
Diagrama 3.8
El filtro p re n sa ............................................................................................
54
Diagrama 3.9
El filtro rotatorio .......................................................................................
55
Diagrama 3.10: La centrífuga de d isc o s.............................................................................
56
Diagrama 5-1
Una máquina para picar la ca rn e ............................................................
95
Diagrama 6.1
Un molino de m alta....................................................................................... Los maceradorcs involucrados en la infusión con doble macerador
118 119
Un lauter..........................................................................................................
121 121
Diagrama 6.5
Una olla de ebullición................................................................................... Un unitan qu e....................................................................
Diagrama 6.6
Dos tipos de filtros utilizados para clarificar la cerveza.........................
127
Diagrama 6.7 Diagrama 6.8
Una prensa horizontal de tomillo ..........................................................
Diagrama 3.4 Diagrama 3.5 Diagrama 3.6
Diagrama 6.2 Diagrama 6.3 Diagrama 6.4
Una cuba de madera para la fermentación y la maduracián del vino ........................................................................ Diagrama 6.9: Un tanque de fermentación de acero inoxidable para la fermentación y la maduración del vino ...................................... Diagrama 6.10: Sección longitudinal de un tanque rotatorio (Roto-tank) .......................
xxrv
123 137 140 140 143
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Diagrama 7.1:
El acetificador Frings................................................................................
164
Diagrama 7.2:
Un cavitador..............................................................................................
164
Diagrama 10.1:
Lechos sumergidos ..................................................................
237
Diagrama 10.2:
El sistema de filtro por g o te o .................................................................
237
Diagrama 10.3:
Los sistemas de incorporación de aire en procesos con lodos activados.............................
238
Diagrama 10.4:
Un biorreactor de fosa (Cía. ICI) ...........................................................
238
Diagrama 10.5:
Un biorreactor de torre (Cía. Bayer)......................................................
239
Diagrama 10.6:
Un biorreactor de lecho fijo .....................................................................
240
Diagrama 10.7:
Un biorreactor de lecho expandido ......................................................
240
Diagrama 10.8: Digestor anaerobio de flujo ascendente, con capa de sedimento . . .
241
Esquema 2.1:
La clasificación de los microorganismos, con base en la fuente de energia que u tilizan.......................................
22
Esquema 3.1:
La secuencia de reacciones de la glucólisis............................................
41
Esquema 3J2:
El ciclo de Krebs...........................................................................................
42
Esquema 3.3:
Los sistemas de operación de cultivo continuo......................................
51
Esquema 4.1:
Las etapas del proceso de elaboración del yogur b a tid o .....................
68
Esquema 4.2 Esquema 4.3:
Las etapas del proceso de elaboración del q u e s o .................................. Las etapas del proceso de elaboración de la natilla .............................
75 80
Esquema 5.1:
Clasificación general de los embutidos con base en rl tratamiento térmico.................
92
Esquema 5.2:
—____ _____
Las etapas del proceso general de elaboración de un embutido fermentado....................................................................
94
La formación de los compuestos responsables del color en los embutidos ......................................................................
lili
Esquema 5.4:
Las etapas del proceso de elaboración del salami d u ro .......................
101
Esquema 5.5: Esquema 6.1:
Las etapas del proceso de elaboración del pepperoni ......................... Las etapas del proceso general de elaboración de la cerveza ............
102 118
Esquema 6.2:
Una linea de llenado de botellas .................................
127
Esquema 6.3:
Las etapas de los procesos de elaboración de los vinos blanco y tinto ...................................................................... La producción de champán en grandes recipientes.............................
135 147
Las etapas del proceso de elaboración de vinagre a partir de una fruta .................................................................................
159
Esquema 7.2:
Las etapas del proceso de elaboración del sauerkraut.........................
165
Esquema 73:
Las etapas del proceso de la elaboración de un encurtido fermentado...........................
lóZ
Esquema 5.3:
Esquema 6.4: Esquema 7.1:
Esquema 8.1: Esquema 9.1:
Las etapas del proceso de elaboración de pan .................................... Las etapas del proceso de elaboración de proteina unicelular para alimentación a n im a l.....................................................
182 198
Esquema 9.2:
Las etapas del pnyeso de elaboración de tempe ...............................
203
Esquema 93:
Las etapas para la obtención de jarabe de fructosa a partir de almidón, por medio de enzimas .........................................
209
Esquema 10.1:
El reciclaje de materiales en la naturaleza............................................
218
Esquema 10.2:
El flujo de materiales en la sociedad de economía lin ea l...................
219
Esquema 10.3:
El flujo de materiales en una economía de recirculadón de materiales, en la que el entorno social y natural son congruentes
219
________XXV
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Esquema 10.4:
La secuencia de biodegradadón de productos por diferentes microorganismos......................................................
222
Esquema 105:
La formarión de gas metano mediante biodegradadón anaerobia . .
223
Esquema 10.6:
Las etapas del tratamiento anaerobio bifásico de desechos sólidos .
232
Esquema 10.7:
Las etapas del tratamiento biológico de aguas residuales................
234
Figura 2.1: Figura 2.2:
La siembra en placa de Petri por rayado................................................ La siembra en placa vertida .....................................................................
17 17
Figura 2.3:
El equipo utilizado para resiembra ........................................................
19
Figura 3.1:
Algunos productos que se pueden formar a partir del piruvato
40
Figura 3.2:
Erlenmeyers utilizados en procesos de fermentación...........................
43
Figura 3.3:
Los tipos de paletas utilizados en los impulsores.................................
45
Figura 4.1:
Un cultivo de microoiganismos para la preparadón deyogu r
70
Figura 4.2:
El corte de la cuajada del coágulo en la fabricadón de q u eso s
77
Figura 43:
La perforación de quesos para el desarrollo de hongos......................
79
Figura 6.1:
La espiga y el grano de cebada.................................................................
115
Figura 6.2:
La inflorescenda femenina del lúpulo....................................................
116
Figura 6.3:
El radmo de unas y la u v a .......................................................................
132
Figura 7.1: Figura 8.1:
Un densímetro o hidrómetro .................................................................. Las partes de un grano de tr ig o ..............................................................
168 179
Figura 10.1: Figura 10.2:
Las dimensiones recomendables de cúm ulos....................................... Máquinas para voltear cúmulos de composta .....................................
225 229
Figura 10.3:
La segmentadón de una vermicompostera...........................................
230
Fotografía 3.1:
Un reactor de tanque agitad o................................................................
44
Fotografía 6.1:
Diferencia entre el vino clarificado y sin clarificar............................
144
La reladón entre el comportamiento de la concentradón celular (crecimiento) y la concentración de metabolitos, a través del tiempo
7
Gráfico 1.1: Gráfico 3.1:
La curva de crecimiento de un microorganismo...........................
47
Gráfico 3.2:_____El efecto de la concentración de sustrato limitante sobre la veloddad de crecimiento de un microorganismo.......... 49 Gráfico 4.1: La influenda de la temperatura sobre la proporción de las espedes al final de la fermentación, en un cultivo de yogur . 73 Gráfico 4.2:
La influencia de la cantidad de inóculo y el tiempo sobre la propordón de las especies al final de la fermentación, en un cultivo de yogur .............................................................................
73
Gráfico 6.1: Gráfico 6.2:
Ejemplo de una curva de maceradón ................................................... Ejemplo de una curva de fermentación para la cerveza la g e r..........
121 125
Gráfico 10.1:
La evolución promedio de la temperatura de desechos biodegradables, tratados por compostaje (en un cúmulo de cincuenta centímetros de a ltu ra ).....................
226
llustradónó.l:
Vista parcial del cuarto de cocimiento...........................................
122
Ilustración 6.2:
Unitanques de fermentadón y maduración ........................................
llustradón 6.3:
Dos tipos de filtros utilizados para clarificar la cerveza..............
Ilustración 6.4:
Sección de la línea de llenado de latas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ___ 128
ilustración 6,5 ; llustradón 9.1:
Una linea de embotellado de vino , , , _____________ __ Agaricus btsporus.......................................................................
XXVI
124 126
,____140 202
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CAPÍTULO 1
GENERALIDADES
S u m a r io
Antecedentes históricos Los microorganismos utilizados industrialmente
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OBJETIVOS a)
Explicar qué es la microbiología industrial.
b)
Describir el campo de aplicación de la microbiología industrial.
c)
Explicar el origen y el desarrollo de la microbiología industrial.
d)
Explicar la importancia de las investigaciones de Louis Rasteur en el campo de la microbiología industrial.
e)
Reconocer la importancia de los microorganismos en los proce sos industriales.
2
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A ntecedentes h is tó r ic o s La historia de la microbiología industrial es muy amplia; se desarro lla en muchos escenarios y en las manos de grandes maestros de la investigación. Es sorprendente conocer la forma en que los seres hu manos incursionaron en el mundo microscópico y cómo, a partir de ese momento, el desarrollo de esta área de la microbiología crece a un ritmo cada vez mayor. Esta sección es un complemento del Capítulo 1 del libro Introducción a la microbiología, de García (1995). Se recomienda estudiar el capítulo indicado y, con base en ese material, realizar la siguiente actividad. Confeccione una lista de los acontecimientos de la historia de la microbiología, que se encuentran directamente involucrados con el área de la microbiología industrial.
Muchos investigadores han contribuido al desarrollo de la microbiolo gía industrial; sin embargo, el francés Louis Pasteur (1822-1895) es con siderado el más exitoso, por sus relevantes aportes, principalmente, en el campo de los alimentos y en el de la medicina (con el descubrimien to de los microorganismos causantes de ciertas enfermedades y la for ma de controlarlos). Con base en las investigaciones de Pasteur, se es tudiará la historia de la microbiología industrial en tres etapas: a) La era antes de Pasteur b) Louis Pasteur y sus investigaciones c)
La era después de Pasteur.
En este apartado, se proporcionará una visión general, ya que el de sarrollo de los procesos de fabricación de determinados productos, como el vino, la cerveza o el queso, será analizado en los próximos capítulos.
m m o
i:
G e n e ra lid a d e s
3
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La era antes de Rasteur En la antigüedad, el ser humano no tenía idea de la existencia de microorganismos, sin em bargo, los utilizaba para su beneficio: se repor ta el consumo de cerveza, vino y queso, cuya fabricación se inició de forma más bien acci dental. La cerveza es el primer producto -del que se tiene información- obtenido a partir de la transformación, por microorganismos, de un sustrato. Su elaboración se originó alrede dor del año 6000 a.C. en la civilización sumeria. Dos mil años después, en el año 4000 a.C., los egipcios también preparaban esta bebida; además, utilizaban la levadura de la cerveza como agente para esponjar el pan, por su capa cidad de producir dióxido de carbono (C 0 2). La fabricación de queso data del año 2000 a.C. y se menciona en el Antiguo Testamento. Ya para el siglo XIV a.C., el hombre sabía ela borar y destilar bebidas alcohólicas, a partir de fermentaciones de granos de cereales. De ahí en adelante y hasta el año 1700, los avan ces en este campo fueron lentos pero significa tivos; entre ellos, se pueden citar la produc ción de yogur, vinagre y otros alimentos fer mentados, provenientes de la cultura oriental principalmente. En 1663, el biólogo holandés Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) inventó el micros copio y, por medio de este instrumento, descu brió la existencia de los microorganismos. A partir de esa fecha, todo cuanto caía en sus ma nos era objeto de observación; sin embargo, no logró descifrar los efectos y las utilidades de los microorganismos, incógnitas que permane cieron sin resolver por dos siglos más.
Louis Pasteur y sus investigaciones En 1837, tres investigadores (Cagniard de la Tour, Schwann y Kützing) detectaron median 4
te el microscopio -en forma simultánea, pero independíente- la presencia de microorganis mos en la espuma de la cerveza. Los microor ganismos observados eran levaduras en el pro ceso de germinación, lo cual les indicó que es taban vivos y los relacionaron con la produc ción de la cerveza. Denominaron la levadura Saccharomyces (hongo del azúcar), por su capa cidad de convertir el azúcar en alcohol. A pe sar de ese descubrimiento, fue Louis Pasteur quien demostró al mundo la utilidad de los mi croorganismos para el ser humano, por lo que se le considera el pionero de estos estudios. La oportunidad de Louis Pasteur de revolu cionar el campo de la aplicación de la micro biología, se le presentó en Lille (ciudad de cul tivadores de remolacha y destiladores de alco hol). En las destilerías de este lugar, existía un problema: en unos de los recipientes que con tenían el azúcar de remolacha no se estaba produciendo alcohol, mientras que en otros sí. Hasta el momento, se sabía que el azúcar de remolacha era convertido en alcohol, pero no se conocía por cuál mecanismo. Pasteur tomó muestras de los recipientes en los que no se producía alcohol, y encontró que los microor ganismos eran diferentes de los responsables de la producción del alcohol. Analizó el con tenido de estos recipientes y descubrió que era ácido láctico. Entonces, concluyó que ha bía unos microorganismos específicos para la producción de alcohol y otros para la de ácido láctico. Con el fin de solucionar el problema de "contaminación" en las destilerías, Pasteur aconsejó a los industriales evitar la presencia de los microorganismos productores de ácido láctico en los recipientes de producción de al cohol; sin embargo, en ese momento, él no sa bía exactamente cómo lograrlo. Otro éxito de las investigaciones de Pasteur consistió en la elaboración de un medio de cul tivo artificial para reproducir los microorga
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nismos. El acontecimiento lo originó el si guiente problema: los microorganismos pro ductores de áddo láctico se desarrollaban en un líquido de color grisáceo difícil de estudiar; por lo tanto, ideó un medio de cultivo transpa rente con base en azúcar, cal y levadura seca, en el que, después de un tiempo de incuba ción, los microorganismos se multiplicaron. Continuando con sus experimentos, Pasteur detectó que, en algunos casos, no se producía ácido láctico, sino un líquido con un olor a mantequilla rancia, en el que descubrió la pre sencia de otro microorganismo: el productor del ácido butírico. De esta forma, confirmó su hipótesis de que se pueden obtener diferentes productos a partir de un determinado sustra to, dependiendo del microorganismo que se encuentre en el cultivo. Con este experimen to, accidentalmente, también se percató de otro hecho: el aire era perjudicial para esos microorganismos, pues aquellos "bichitos" que estaban en el borde de una gota no se mo vían, mientras que los que se encontraban en el centro sí tenían movimiento. Además, demostró que los microorganismos también eran los responsables de la descompo sición de los alimentos y rebatió, en definitiva, la idea de la generación espontánea, por medio de su experimento con un balón con cuello de ganso. Para ampliar la información al respec to, se puede consultar el Capítulo I del libro In troducción a la microbiología (Garda, 1995). Un problema similar al de las destilerías se presentó en la producción de vino y de vina gre: a veces, el producto obtenido no reunía las características deseadas; Pasteur, con un poco más de experiencia en estos asuntos, rá pidamente atribuyó el problema a la presen cia de microorganismos ajenos al proceso de interés. Solucionó el problema de los indus triales al descubrir que si calentaba el mosto
cvfn.w i. G en eralid ad es
empleado en la fabricación del vino por deba jo de su punto de ebullición, los microorganis mos morían y el vino se mantenía sin altera ciones. Este proceso dio origen al tratamiento térmico denominado pasteurización. La pas teurización revolucionó el campo de la con servación de los alimentos y del control de la contaminación en los procesos de fabricación de diferentes productos. Los descubrimientos de Pasteur no se detu vieron aquí: continuó investigando y hacien do aportes fundamentales en el área de la m e dicina; sin embargo, no se mencionarán en es ta unidad didáctica, pues no se encuentran dentro de sus objetivos. El doctor Louis Pasteur es considerado el "pa dre de la microbiología industrial", ya que sus investigaciones contribuyeron no solo a mejo rar los procesos existentes (que hasta el mo mento eran empíricos), sino a crear los ci mientos para el desarrollo de un sinfín de in dustrias nuevas basadas en el uso de los mi croorganismos.
La era después de Pasteur Hacia fines del siglo XIX, después de las im portantes contribuciones de Pasteur, los her manos Buchner llevaron a cabo un experi mento mediante el cual, accidentalmente, en contraron las bases de la bioquímica. Ellos querían conservar inalterado un extracto de le vaduras (líquido sin células vivas), entonces, para conseguirlo, le adicionaron una gran cantidad de azúcar, con base en el hecho de que el azúcar sirve como medio para preser var algunos alimentos; sin embargo, después de un tiempo notaron -con sorpresa- que el azúcar se transformaba en alcohol. A partir de ese experimento, se iniciaron los estudios sobre los mecanismos de transformación de los compuestos.
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En el siglo XX, continuó la ola de descubri mientos en el área de la microbiología. Desde 1900 hasta 1940, se desarrolló una serie de procesos industriales: la producción de aceto na, butanol, glicerol, ácido cítrico, ácido lácti co y biomasa. En este último proceso, se recu rrió a la rapidez de reproducción de los mi croorganismos en comparación con el tiempo que tardan las plantas o los animales para cre cer y ser fuentes de proteínas, como opción para suplir de alimento a grandes poblaciones que sufren de hambruna. También, en esos años, se empezó la producción de enzimas, ta les como proteasas, amilasas e invertasas; en 1914, se iniciaron las investigaciones para el tratamiento de las aguas negras. Estos avan ces reflejan cómo se fue ampliando el ámbito de aplicación de los microorganismos y su ín tima relación con la vida del hombre. La producción industrial de la penicilina (an tibiótico) es un hecho ligado a las necesidades del ser humano en ese momento -el trata miento de los heridos en la Ií Guerra Mun dial-, que marca la historia de la humanidad. En esa época, ya se empleaban los cultivos su mergidos y aeróbicos, y se utilizaban termen tadores agitados con controles automáticos (detalles sobre ese tipo de fermentadores se encuen tran en el Capítulo 3 de este texto). De 1960 a 1975 se lograron grandes avances en la producción masiva de enzimas a partir de microorganismos y de jarabes con alto con tenido de fructosa por vía enzimàtica. Tam bién se produjeron, por esta vía, aminoácidos, estimuladores del sabor, vitaminas (B2 y B]2) y polímeros microbianos utilizados como aditi vos en alimentos. La crisis petrolera, en 1974, incentivó al ser humano a buscar alternativas para sustituir el uso de combustibles deriva dos del petróleo, por lo que se mejoró el pro ceso de producción de alcohol, compuesto utilizado en la fabricación de gasohol.
6
En la actualidad, la microbiología industrial ha traspasado muchas fronteras que delimita ban su campo, y es difícil continuar hablando solo de "microbiología", cuando los procesos tienen componentes de disciplinas como la in geniería química, la ingeniería genética y la biotecnología, entre otras. Por ejemplo, los avances se han dirigido, principalmente, a la manipulación genética de los microorganis mos para aumentar los rendimientos de pro ducción de metabolitos, disminuir su toxici dad, erradicar enfermedades y un sinfín de aplicaciones más. Además, se desarrollan procesos para el aprovechamiento de desper dicios (agrícolas e industriales) así como para el tratamiento de residuos (líquidos y sóli dos), con la finalidad de controlar y disminuir la contaminación ambiental, y conservar los recursos del planeta.
LOS MICROORGANISMOS UTILIZADOS INDUSTRIALMENTE En los microorganismos, como en cualquier célula, ocurre una serie d e re a c c io n e s quími cas cuyo conjunto se denomina metabolismo; las sustancias que se producen se conocen co mo metabolitos. Los metabolitos primarios son los compuestos esenciales para el crecimiento del microorganismo, mientras que los produc tos sintetizados que no están relacionados con su crecimiento se conocen como metabolitos se cundarios. El Gráfico 1.1 ilustra el comporta miento del crecimiento microbiano en rela ción con la producción de cada tipo de metabolito. Los metabolitos primarios (Gráfico 1.1.a) se producen al mismo tiempo que se da el crecimiento del microorganismo, mientras que los metabolitos secundarios (Gráfico 1.1.b) se producen generalmente cuando la veloci dad de crecimiento de los microorganismos es igual a su velocidad de muerte.
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Metabolitos Crecimiento celular
a) G ráfico 1.1:
b)
La relación entre el comportamiento de la concentración celular (crecimiento) y la concentración de metabolitos, a través del tiempo, a) Metabolitos primarios, b) Metabolitos secundarios. Fuente: Adaptado de Marison (19%).
Durante un proceso industrial, es importante que el microorganismo participante se desa rrolle de tal forma que se maximice la produc ción del compuesto de interés. Los compues tos de interés pueden ser:
hos y bacterias, se estudiarán en los próximos capítulos.
•
Los mismos microorganismos (término más comúnmente conocido como biomasa).
•
Los metabolitos: primarios y secundarios.
Las levaduras son los microorganismos más importantes desde el punto de vista indus trial, porque muchas de las especies pueden convertir los azúcares en alcohol etílico y dió xido de carbono. Participan en la producción de cerveza, vino, alcohol industrial, glicerol y vinagre. Las células de levadura se utilizan también en la industria de la panificación y como alimento animal y humano, por su alto contenido de proteínas. En el Cuadro 1.1 se muestran algunos ejemplos de levaduras y los compuestos que producen.
En forma natural, los microorganismos elabo ran únicamente la cantidad de metabolitos ne cesaria para su subsistencia; sin embargo, si se conoce su metabolismo, es posible alterarlo para lograr la sobreproducción de algún com puesto en particular. Los microorganismos más utilizados son las levaduras, los mohos y las bacterias.
Las levaduras
Cuadro 1.1
En el libro Introducción a la microbiología (Garda, 1995), encontrará aspectos generales sobre es tos tres tipos de microorganismos. Con base en ese m aterial, realice la sig u ien te activ id ad .
Elabore una lista de las principales características
ALGUNOS TIPOS DE LEVADURAS UTILIZADAS INDUSTRIALMENTE Lrx.ulurn Saccharomyces ellipsoideus
Vino
Saccharomyces cerevtsiae
Cerveza y levadura de panificación
Torulopsis utilis Candida lipolytica
Fuente de proteínas
Schizosaccharomyces sp.
Alcohol industrial
de las levaduras, los mohos y las bacterias.
Algunos de los procesos de obtención de bio masa y metabolitos, a partir de levaduras, mo
I’ roduc lo
Fuente: Pelczarefa/. (1986,655).
Cirtruto i: Generalidades
1
_______________________________________
i
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Cuadro t .2
Los mohos Los mohos se han utilizado especialmente en la producción de antibióticos, enzimas, vita minas y ácidos orgánicos, tales como el cítrico, el láctico y el glutámico; también, en la madu ración de varias clases de queso, como el Ro quefort. El Cuadro 1.2 contiene información acerca de algunos ejemplos de mohos y los productos de interés comercial que se pueden obtener a partir de ellos.
ALGUNOS EJEMPLOS DE MOHOS UTILIZADOS INDUSTRIALMENTE Moho
Producto
Aspergillus rtiger
Ácido cítrico
Penicillium spp.
Ácido glucónico
PeniciHium roquefortí
Queso Roquefort
Aspergillus terreas
Ácido itacónico
Rhi/opus oryiae
Ácido láctico
Penicillium griseoiuhvm
Griseofülvina
Fuente: Pelczar et al. <1986, 658).
Las bacterias Las bacterias han sido utilizadas para la pro ducción de vinagre, ácido glucónico y cetoglucónico. Las Acetobacter conforman un grupo de especies oxidantes, entre las cuales se encuen tran aquellas productoras de vinagre, dióxido de carbono y sorbitol. Otro grupo de bacterias, de gran importancia desde el punto de vista in dustrial, son las Lactibacillus delbrueckii, cuya denominación se debe a que el ácido láctico es el producto principal de su metabolismo. Las bacterias del género Clostridium destacan en la producción de acetona y de butanol y las del género Streptomyces en la del antibiótico estreptomicina. El Cuadro 1.3 muestra algu nos ejemplos de bacterias utilizadas indus trialmente.
8
Cuadro 1.3
ALGUNOS EJEMPLOS DE BACTERIAS UTILIZADAS INDUSTRIALMENTE Bacteria
Producto
Acetobacter
Vinagre
Acetobacter suboxydans
Sorbitol
Lactobacillus bulgmcus
Yogur
Lactobacillus delbrueckii
Ácido láctico
Clostridium acetobutylicum
Acetona, butanol
Streptomyces griseus
Estreptomicina
Fuentp: Adaptado de Pelczar el al. (1986).
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FUENTES Y LECTURAS RECOMENDADAS
B u tlin , K, 1967, "Aspects of microbiology". Cap. 1. En: Biochemica! and biológica}
engineering Science. V61.1. New York: Academic Press. CRUEGER, W. Y A. C ru eg er. 1989. Biotecnología: Manual de microbiología industrial.
España: Editorial Acribía. DE KriííF, P. 1992. Cazadores de microbios. México: Editores Mexicanos Unidos. G a r c ía , V. 1995. Introducción a la microbiología. San José: EUNED. MarISON, I. 1996. "Cinética del crecimiento". Cap 10. En: Biotecnología para inge
nieros: sistemas biológicos en procesos tecnológicos. Ed. por Scragg, A. Mé xico: Editorial Limusa. P e lc z a r , M.; C h a n , E. Y N. KríEG. 1986. Microbiology. 5 'e d . U.S.A.: M cG raw H ill. P e lc z a r , M.; Reíd, R. y E. Chan. 1982. Microbiología. 4* ed. México: Me Graw Hill. QUINTERO, R. 1993. Ingeniería bioquímica: teoría y aplicaciones. México: Alhambra
Mexicana. RHODES, A. Y D. FlETCHER. 1969. Principios de microbiología industrial. España: Edi
torial Acribia. S c r a g g , A. 1996. "Biotecnología", Cap. 1. En: Biotecnología para ingenieros: Siste
mas biológicos en procesos tecnológicos. México: Editorial Limusa. STANBURY, P. Y A. W h ita k e r. 1987. Principies of fermentation technology. Great Bri-
tain: Pergamon Press.
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OBJETIVOS
a) Citar las etapas involucradas en el manejo de cultivos. b)
Explicar las condiciones que intervienen en la selección de un cultivo puro o uno mixto, en un proceso industrial.
c)
Describir los métodos involucrados en el aislamiento de microor ganismos.
d)
Establecer las diferencias entre los métodos de conservación de los microorganismos.
e)
Mencionar los principales requerimientos nutricionales de los mi croorganismos.
0
Indicar los principales factores que se deben considerar en la for mulación de medios de cultivo.
g)
Describir las etapas y los aspectos involucrados en la preparación de ¡nóculos.
14
M lCROeiOíOCU INDUSTRIAL / AttOÁ HERNÁNDEZ
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I n t r o d u c c ió n El manejo de un cultivo microbiológico involucra las siguientes etapas: a) El aislamiento del microorganismo b) La conservación del microorganismo c)
La preparación del medio de cultivo en el que se desarrolla
d) La preparación del inoculo e) El escalamiento f)
La producción industrial.
Cada una de estas etapas es importante, y un descuido en alguna de ellas puede conducir todo el proceso al fracaso. El aislamiento de un microorganismo con características específicas es una labor ardua y costosa. Muchos microorganismos son irremplazables, pues han sido obtenidos por procedimientos empíricos: no existe un método bien definido para obtener la cepa nuevamente, en caso de perderla. Además, la modificación de un microorganismo para variar sus características hace que sea muy inestable y suscepti ble de perderlas con facilidad. Actualmente, el aislamiento se realiza en condiciones cada vez más estandarizadas y repetibles, y se recurre al mejoramiento genético de las cepas para obtener cualidades especiales, tales como una mayor productividad de biomasa o sustancias de interés. Cuando el microorganismo se ha aislado, debe ser conservado: se le aplica un método que garantice la estabilidad -a través del tiempode las propiedades que lo hacen valioso. El estudio de los requeri mientos nutricionales permite realizar una adecuada formulación del
o im o 2: EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
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medio de cultivo por utilizar, para que el mi croorganismo se desarrolle y produzca los metabolitos de interés. Una vez definido el medio de cultivo, es nece sario preparar el inoculo, a partir del microor ganismo que se encuentra en conservación; fi nalmente, se lleva a cabo el proceso a escala industrial. En este capítulo se estudiarán todas las etapas antes mencionadas, con excepción de la pro ducción industrial, que se desarrollará en el Capítulo 3.
El
a is l a m ie n t o d e m ic r o o r g a n i s m o s
Cuando se examina en el microscopio una go ta de agua de lluvia, se observa gran variedad de microorganismos; algunos de ellos podrían ser útiles al hombre, mientras que otros po drían ser patógenos. La separación de cada una de estas variedades es lo que se conoce como el aislamiento de microorganismos.
Los cultivos puros y los mixtos En algunos procesos industriales es imprescin dible que se encuentre solo un tipo de microor ganismo, mientras que en otros es necesaria la presencia de un conglomerado de ellos para alcanzar los objetivos esperados. Por lo tanto, las características específicas de cada proceso industrial van a definir la conveniencia de uti lizar un cultivo puro o uno mixto. Un cultivo puro es aquella población de mi croorganismos de un mismo tipo que, gene ralmente, se producen a partir de una sola cé lula. Una cepa (cultivo) de Sacdiaromyces cerevisiae para producir cerveza es un ejemplo tí pico de un cultivo puro. En contraste, un cul tivo mixto está compuesto por varios microor
16
ganismos, cuya presencia en conjunto cumple una determinada función. Las poblaciones de microorganismos utilizados para el trata miento de desechos líquidos (aguas residua les) representan un caso común de la utiliza ción de cultivos mixtos. En varios procesos de fermentación, es estric tamente necesario mantener condiciones de asepsia para que el microorganismo pueda desarrollarse; por ejemplo, en la producción de antibióticos o ciertas vitaminas (cianocobalamina y riboflavina), si otros microorganis mos se hallan presentes, van a competir por los nutrimentos del medio, y la cepa de inte rés puede desaparecer o disminuir significati vamente la producción de metabolitos. Por el contrario, en algunas fermentaciones no es re quisito utilizar medidas estrictas de higiene, ya sea porque durante el proceso las sustan cias producidas favorecen solo la presencia del microorganismo de interés, o porque un cultivo mixto es el que participa en la reac ción. La producción de vinagre, por ejemplo, no necesita condiciones estériles, pues el me dio ácido y la temperatura a la que se lleva a cabo la fermentación son factores que se en cargan de impedir el desarrollo de otros mi croorganismos. Cuando se hace referencia a un proceso indus trial, un aspecto prioritario es el económico: el proceso debe ser rentable. Por esta razón, se efectúa un estudio de los costos involucra dos en el aislamiento del microorganismo, y se comparan con el rendimiento que se obten drá del metabolito de interés; además, es im portante tomar en cuenta la productividad de ese metabolito así como la estabilidad de la ce pa seleccionada, pues no es recomendable se leccionar una de alto rendimiento si puede perder sus características fácilmente.
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / A lic ia H e r n á n d e z
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Las técnicas para obtener cultivos puros Se ha desarrollado una serie de técnicas microbiológicas para aislar microorganismos y obtener cultivos puros. A continuación, se mencionan tres de ellas:
Posteriormente, se toma una muestra de una de las colonias separadas y se repite el proce dimiento, con la finalidad de confirmar la pre sencia de un solo tipo de microorganismos.
•
Siembra en placas de Petri por rayado
La siembra en placa vertida
•
Siembra en placa vertida
•
Diluciones en serie.
En esta técnica se hacen crecer los microorga nismos en tubos, cada uno con una concentra ción diferente, y se evalúa el tubo en el que las colonias crecieron en forma separada.
La siembra en placas de Petri por rayado Esta técnica se basa en la separación de los mi croorganismos al dispersar -por rayado sobre agar- una muestra que los contiene, según se muestra en la Figura 2.1.a. Para llevar a cabo la disgregación, se recoge una porción de la muestra con un asa bacteriológica y se raya sobre una sección de una placa de Petri; lue go, se repite el rayado en tres secciones más de la placa. En cada rayado, se toma la mues tra de la sección anterior, por lo que se logra una disminución gradual en la cantidad de microorganismos. Los microorganismos dispersos en la placa se incuban a la temperatura y el tiempo reco mendados; al crecer, formarán colonias sepa radas unas de otras en alguna de las secciones del rayado, como se puede observar en la sec ción 4 de la Figura 2.1.b. En esa figura, cada punto representa una colonia.
Como primer paso, se preparan suspensiones de la muestra en diversas diluciones y se colo ca cada una en un tubo con agar fundido, co mo se indica en la Figura 2.2.a. Luego, se mezcla homogéneamente el contenido (el agar y el inóculo) de cada tubo y se vierte (no se siembra por rayado) en una placa de Petri, según se muestra en la Figura 2.2.b. Se incuba cada placa, a la temperatura y el tiempo recomendados, y se selecciona la dilu ción en la que se haya obtenido una mayor se paración de las colonias. Por último, de esta dilución, se toma una muestra de una de las colonias y se siembra en una placa de Petri, por rayado, para confir mar si el cultivo está puro. La confirmación de pureza se puede realizar por observación a simple vista (colonias de igual morfología), por observación microscópica o mediante pruebas bioquímicas.
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a)
F igura 2.1 :
b)
La siembra en placa de Petri por rayado. a) El rayado de placas con asa microbiològica, b) El crecimiento y la separación de las colonias.
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a) Fígura 2.2:
cvttutoí: EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
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b)
La siembra en placa vertida, a) Las diluciones de la muestra, b) El vertido del cullivo en una placa de Petri.
___________ 17
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Las diluciones en serie
•
El número de muestras por conservar
Esta técnica se aplica cuando se conoce de an temano que el microorganismo de interés se encuentra en mayor cantidad que los demás. Para llevarla a cabo, se preparan varias dilu ciones de la muestra y se incuban en e! medio de cultivo adecuado para que crezca este mi croorganismo; así, se logra que en alguna de las diluciones solo él aparezca. Es necesario reconfirmar su presencia, utilizando el méto do de siembra en placa de Petri por rayado.
•
El costo del proceso de conservación
•
El periodo durante el cual se desea conser var el microorganismo
•
El tipo de equipo disponible
•
La probabilidad de contaminación que exista en el medio.
El
En muchos países, hay entidades que tienen colecciones de cultivos y se dedican al mante nimiento de los microorganismos (brindan una garantía de sus características). Muchas de estas colecciones son reconocidas intemacionalmente; por medio de ellas, se puede ad quirir la mayoría de los microorganismos exis tentes. En el Cuadro 2.1, se indican algunas de estas instituciones. Cuando se adquiere un microorganismo de una colección, viene iden tificado con las abreviaturas de la colección de la que proviene; por ejemplo, el microorganis mo Phanerochaetc chn/sosporium CDBB H-298 pertenece a la colección de cultivos del Depar tamento de Biotecnología y Bioingeniería del Centro de Investigación y de Estudios A vanza dos (CINVESTAV) del Instituto Politécnico Na cional, además, está identificado dentro de la colección como la cepa H-298.
m a n t e n im ie n t o
DE LOS MICROORGANISMOS El mantenimiento de los microorganismos consiste en la conservación de ellos y de sus características por largos periodos. A través de los años, se han desarrollado varios méto dos de conservación de microorganismos, que se basan en la reducción de su actividad me tabòlica. La selección del método de conser vación depende de varios factores, entre los que se pueden mencionar: •
La susceptibilidad del microorganismo (al proceso de conservación)
•
La facilidad con la que puedan ocurrir cambios genéticos en la cepa
Cuadro 2.1 ALGUNAS COLECCIONES MICROBIANAS EN EL M UNDO Nombre
18
País
Microorganismo
American Type Culture Collection (ATCQ
USA
Bacterias, acfinornicetos, hongos, algas, protozoarios
Colección (ie Cultivos del Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del CINVESTAV (CDBB)
México
Mongos, bacterias
National Collection of Industrial Bacteria (NCIB)
Escocia
Bacterias
Instituto Pasteur
Francia
Bacterias
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / A l ig a H e r n á n d e z
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Existen varios métodos para la conservación de los microorganismos; todos buscan que las células sufran el daño mínimo y se preserven por el máximo período posible. Los cuatro procedimientos generales son:
siembras. Sus principales desventajas radican en la alta probabilidad de que el cultivo se contamine durante las resiembras y en que el microorganismo sufra cambios genéticos y bioquímicos durante el proceso.
• La resiembra o el subcultivo • La desecación • La congelación a)
• La liofilización.
F ig u r a 2 .3 :
La resiembra o el subcultivo Este método consiste en sembrar el microor ganismo en determinado medio de cultivo y, luego, conservarlo en refrigeración. El proce dimiento se debe repetir cada cierto tiempo. Se lleva a cabo en tubos de ensayo con agar in dinado (slants), o en botellas especiales que contienen un medio de cultivo sólido y estéril (botellas de Roux). Este equipo se muestra en la Figura 2.3. El tubo de ensayo se mantiene en posición inclinada hasta que el medio de cultivo solidifique, con lo cual se logra una mayor superficie para el crecimiento del mi croorganismo; en el caso de las botellas, estas se mantienen en forma horizontal. El mi croorganismo se inocula en el medio sólido y se deja crecer durante varios días; luego, el cultivo se refrigera. Una de las desventajas del método es que los tubos guardados en re frigeración se deshidratan y, entonces, el mi croorganismo muere; por esta razón, es nece sario repetir el procedimiento periódicamen te: al menos cada seis meses, según señalan Parton y Willis (1990). La resiembra es uno de los métodos de mante nimiento de cultivos más simples y no requie re equipo especializado y costoso; sin embar go, es un método caro, ya que necesita mucha mano de obra, por la periodicidad de las re
b)
El equipo utilizado para resiembra. a) Los tubos con agar indinado (slants). b) Las botellas para resiembra (de Roux).
Una variación del método consiste en adicio nar aceite mineral estéril al tubo o la botella con el microorganismo en crecimiento, de tal forma que cubra el agar hasta una altura de un centímetro y medio, para reducir el meta bolismo del microorganismo y la deshidratación del medio de cultivo. La ventaja de esta modificación es que se puede obtener un sub cultivo sin perder el cultivo inicial; sin embar go, también se presentan problemas por cam bios en las características de los microorganis mos, tales como la pérdida de su capacidad de esporulación (reproducción) o de su actividad bioquímica.
La desecación El método consiste en remover el agua celular e impedir la rehidratación de las células de los microorganismos. Para llevarlo a cabo se ino cula una muestra de cultivo en tierra húmeda estéril (material de soporte), se espera hasta que haya crecimiento (varios días) y, luego, se seca con aire o al vacío. Después, el cultivo se guarda en una atmósfera seca o en refrigera ción. Otros materiales de soporte pueden ser sílica gel, discos de gelatina y tiras de papel.
C««Mo* EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
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Entre las ventajas del método se pueden men cionar que no necesita equipo especial ni mu cho personal para ejecutarlo y, si no sufre da ños durante la desecación, el cultivo puede continuar viable por muchos años; Parton y Willis (1990) reportan una viabilidad del 50% a los veinte años de conservación. Este método es recomendable para las especies que al ser desecadas esporulan (se encierran para prote gerse), ya que se conservan por más tiempo que las que no esporulan.
de congelación que pueda ser transportado) o se debe hacer crecer en un tubo inclinado, lo cual también representa una desventaja, por los problemas que conlleva la resiembra. El proceso de congelación se puede clasificar, con base en la temperatura en la que se lleva a cabo, en: •
Congelación ordinaria
•
Congelación ultrafría
•
Congelación con nitrógeno líquido.
La congelación La congelación ordinaria La congelación es, al igual que la liofilización, uno de los métodos de mantenimiento más uti lizados, porque se logran los periodos de con servación más largos (superiores a los veinte años, cuando se utiliza nitrógeno líquido). En el proceso de congelación, lo más impor tante es controlar la velocidad de disminución de la temperatura, porque, si es muy lenta, los cristales que se forman a partir del líquido contenido en las células serán muy grandes y pueden romper la membrana celular. Existen algunas sustancias, como el dimetil sulfóxido (DMSO) y el glicerol, que ayudan a proteger los microorganismos durante el pro ceso de congelación; se conocen como crioprotectores. Estas sustancias tienen un bajo punto de congelación (menor a 0 *’C), por lo que re ducen la velocidad de congelación de los com ponentes de la célula microbiana. El método de congelación no necesita mucha mano de obra, pero el costo del equipo y del mantenimiento de los cultivos es alto. Si se presenta una falla mecánica o un corte en el suministro eléctrico, y no se han tomado las previsiones necesarias, el material se puede perder. Durante el transporte, el cultivo debe permanecer congelado (implica tener equipo
20
Durante la congelación ordinaria se mantie nen temperaturas de -5 a -20 °C; en este inter valo, los microorganismos permanecen via bles (es decir, una vez descongelados, los mi croorganismos conservan todas sus funciones y características) por uno o dos años (Drew, im ). El método no se recomienda para perio dos de almacenamiento mayores.
La congelación ultrafría El cultivo por congelar se recoge directamente por centrifugación de una suspensión de mi croorganismos, o se prepara raspando una muestra de la suspensión en un tubo con las condiciones adecuadas para su crecimiento. Luego, el cultivo se suspende en un medio con glicerol o DMSO. La suspensión se coloca en tubos especiales. La congelación ultrafría se efectúa en congeladores mecánicos, a tem peraturas entre -50 y -80 °C. Como se mencionó, debe controlarse la veloci dad de congelación de los microorganismos para mantener su viabilidad y que la cepa no sufra daños irreparables. Dalby (1983) reco mienda congelarlos a una velocidad de 1 a 2 'XZ/min hasta llegar a -3 0 "C; después de al
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canzar esta temperatura, se acelera el proceso de congelación hasta lograr la temperatura de seada. Drew (1986) ha observado que las cepas se conservan bien, durante cinco años, a -60 °C.
La congelación con nitrógeno líquido El método de conservación por congelación más recomendado es el que utiliza nitrógeno líquido, porque se logran temperaturas de —150 a —196 C (Stanbury y Whitaker, 1987). La veloddad de congelación debe ser 1 a 2 “C/min hasta alcanzar una temperatura de -30 °C, lue go, 1 °C/min hasta -56 °C. Después, se colo can las muestras directamente en nitrógeno lí quido para acelerar el proceso de congelación. El metabolismo celular se detiene completa mente a partir de los -130 "C; por esta razón, si el microorganismo soporta el proceso de congelación, su viabilidad permanece durante muchos años. Una de las principales ventajas de este método es que son innecesarias las re siembras, por lo que se reducen al mínimo los riesgos de contaminación y los cambios gené ticos y bioquímicos en el microorganismo. Sin embargo, el costo del equipo requerido es alto y es necesario mantener un suministro cons tante de nitrógeno, lo que encarece el proceso. Además, es imprescindible tomar previsiones en cuanto a fallas mecánicas y eléctricas para evitar perder toda una colección.
La liofilización La liofilización es la remoción de agua de las células congeladas (sólidas) a presión reduci da (sublimación). Para llevar a cabo este pro cedimiento, se toma una muestra del cultivo por conservar y se suspende en algún medio con crioprotectores, como leche, suero o glutamato de sodio. Se transfieren unas gotas de la muestra a una ampolla, se congela y se some
te a alto vado hasta que el agua celular se su blima (pasa del estado sólido al gaseoso). Una vez liofilizada la cepa, la ampolla que la con tiene se sella para impedir que el microorga nismo se altere por el contacto con el medio ambiente. Es uno de los métodos más efectivos para la conservación, pues los microorganismos pue den mantener su viabilidad por veinte años o más. Una de las principales ventajas de este método es que, una vez liofilizado, el cultivo no necesita tratamientos especiales -solo se debe mantener en refrigeradón-, lo que dis minuye los costos de operación y facilita enor memente el transporte. Otra ventaja es que no requiere resiembras, lo que contribuye a evi tar la contaminación y los cambios genéticos y bioquímicos en las células. La inversión inidal en la adquisición del equi po es alta; sin embargo, los costos totales son menores que los de la congeladón en nitróge no líquido. Este es el método que selecdonan muchas instituciones para conservar las colec ciones de cultivos.
LOS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES Los microorganismos, como cualquier ser vi vo, requieren una serie de sustandas que les permitan realizar sus actividades metabólicas; básicamente, necesitan fuentes de: •
Agua
•
Energía
•
Carbono
•
Nitrógeno
•
Minerales
•
Vitaminas
•
Oxígeno (en el caso de los aerobios).
Giím o I: EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
2\_ Copyrighted materia!
La fuente de energia
Autótrofos:
Los microorganismos tienen diferentes for mas de obtener energía y, con base en esa ca racterística, se pueden clasificar en fotótrofos y quimiótrofos. Los fotótrofos obtienen la ener gía de la luz o radiación solar. Los quimiótro fos obtienen la energía de un compuesto quí mico y se dividen en litótrofos (si el compues to químico es inorgánico) y organótrofos (si el compuesto es orgánico). Esta clasificación se puede observar en el Esquema 2.1.
Obterxrión de energía _________________ I_________________
Fototrófos
Quimiótrofos
r~— Litótrofos Esq u em a 2 .1 :
--------1
Heterótrofos: Los compuestos orgánicos cons tituyen su fuente de carbono. Son los de mayor importancia comercial. Las fuentes de carbono más comunes inclu yen melazas de caña y de remolacha, granos de cereales, almidón, glucosa, sacarosa y lac tosa. La sacarosa, a su vez, se obtiene del azú car de caña o de remolacha. Los aceites co merciales (de maíz, soya, algodón y oliva) también se emplean y, además de su función como fuente de carbono, pueden servir como antiespumantes. Otras fuentes de carbono son los alcoholes, los ácidos orgánicos simples y los alcanos.
Organótrofos
La c la s ific a c ió n d e los m ic ro o rg a n ism o s, c o n b ase e n la fu e n te d e e n e rg ía q u e u tiliz a n .
La mayoría de los microorganismos de impor tancia industrial son organótrofos y aprovechan los compuestos de carbono (carbohidratos, lípidos y proteínas) como fuente de energía.
La fuente de carbono El constituyente principal de los microorga nismos es el carbono, de ahí que no pueden prescindir de la fuente de este elemento; la más empleada la constituyen los carbohidra tos, que además son fuente de oxígeno, hidró geno y energía metabòlica. Los carbohidratos participan en la biosíntesis del material celu lar así como en la formación de los productos o metabolitos. Los microorganismos se pueden clasificar, con base en su capacidad de asimilación de la fuente de carbono, en:
22
El C 0 2 es su única fuente de car bono.
La fuente de carbono se elige según una serie de aspectos, entre los que se encuentran: •
El precio de venta del producto final.
•
La presencia de impurezas en la fuente de carbono y el grado de facilidad con que se logran eliminar.
•
La legislación gubernamental sobre el tema.
•
El método de esterilización empleado, pues afecta la naturaleza de ciertas sustan cias. Por ejemplo, los azúcares pueden reaccionar con las sales de amonio y los aminoácidos, formando compuestos que inhiben el crecimiento de los microorga nismos; por esta razón se recomienda este rilizarlos por separado.
•
La velocidad de metabolización de la fuente de carbono. Stanbury y Whitaker (1987, 79) indican que "la velocidad con la que se metaboliza la fuente de carbono puede influenciar la formación de biomasa y la producción de metabolitos prima rios y secundarios. Si hay azúcares fácil
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de amonio, los nitratos, los nitritos y el nitró geno molecular).
mente metabolizables se da un rápido cre cimiento de los microorganismos, pero hay baja productividad de metabolitos se cundarios."
A escala industrial se utilizan fuentes comple jas de nitrógeno, como por ejemplo: el licor de maceración del maíz, la harina de soya, los fri joles de soya, la harina de maíz, la harina de semillas de algodón (nombre comercial: Pharmamedia y Proflo), el hidrolizado de caseína, los desechos de matadero, la harina de pesca do y el extracto de levadura. El medio de cul tivo comercial conocido como Pharmamedia es no solo una fuente de nitrógeno, sino de can tidades significativas de carbohidratos y otros compuestos. Su composición se puede obser var en el Cuadro 2.2.
La fuente de nitrógeno Después del carbono y del oxígeno, el nitróge no es el elemento más abundante en la com posición de los microorganismos. Algunos son capaces de utilizar el nitrógeno de origen orgánico (el que se encuentra en los aminoáci dos, las proteínas, la urea, las pirimidinas y las purinas), mientras que otros utilizan el nitró geno inorgánico (el del gas amonio, las sales
Cuadro 2.2
LA COMPOSICIÓN PROMEDIO DE PHARMAMEDIA Componente Sólidos totales Carbohidratos Proteína Crasa Ceniza Fibra Humedad Vitaminas Ácido ascorbico Tiamina Riboflavina Niacina Ácido pantoténico Colina Piridoxina Biotina Ácido fólico Inositol Minerales Calcio Cloro Fósforo Hierro Sulfato Magnesio Potasio Sodio
Cantidad (1)
(2)
98.00% 24.10% 56,00% 5.50%
99,00% 24,13% 59,20% 4,02% 6,71% 2,55% 1,00%
—
—
—
45,6 mjykg 15,7 mg/kg 10,8 mg/kg 59,7 mg/kg 43,2 mg/kg 3240,0 mg/kg 11,9 mg/kg 0,4 mg/kg 1,8 mg/kg 10 800,0 mg/kg
32,00 mg/kg 3,99 mg/kg 4,82 mg/kg 83,30 mgltg 12,40 mg/kg 3270,00 mg/kg 16,40 mg/kg 1,52 mg/kg 1,59 mg/kg 10 800,00 mg/kg
2360,0 ppm 486,0 ppm 12 200,0 ppm 103,0 ppm 780,0 ppm 6800,0 ppm 14 300,0 ppm
2530,00 ppm 685,00 ppm 13 100,00 ppm 94,00ppm 18 000,00 ppm 7360,00 ppm 17 200,00 ppm 31,00 ppm
—
Fuentes: (1) Stanbury y Whitaker (1987, 81). (2) Zabriskie et al. (1988, 14).
OHM0 2: EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
23
Copyrighted m atc':i '
Las fuentes de otros elementos Además de carbono y nitrógeno, los microor ganismos requieren otros elementos para sub sistir, aunque en menor cantidad; entre ellos se hallan el azufre, el fósforo, el potasio, el magnesio, el calcio y el cloro. El cobalto, el co bre, el hierro, el manganeso, el molibdeno y el zinc, también son esenciales, pero general mente se encuentran presentes como impure zas en otros ingredientes. Los fosfatos son la principal fuente de fósforo para la nutrición microbiana. Estos compues tos son reguladores del pH (buffers); se agre gan en exceso para que no se agoten durante el proceso. El fósforo contribuye en el creci miento celular y es un importante componen te estructural de la pared celular de las bacte rias Gram positivas. El azufre, presente en algunas coenzimas, es necesario en la síntesis de proteínas. El sulfa to de amonio es uno de los compuestos más utilizados en la formulación de medios de cul tivo, ya que sirve como fuente de azufre y de nitrógeno.
Los factores de crecimiento son moléculas que forman los bloques de construcción de los componentes celulares en el microorganismo. Son necesarios en la estimulación del creci miento; se deben adicionar al medio de culti vo, ya que no todos los microorganismos pue den sintetizarlos. Se clasifican en tres grupos: vitaminas, aminoácidos y factores miscelá neos de crecimiento. El Cuadro 2.3 contiene algunos ejemplos de estos grupos.
LOS REQUERIMIENTOS AMBIENTALES Además de los requerimientos nutricionales, el medio ambiente en el que crece el microor ganismo va a determinar su adecuado desa rrollo. El pH y la temperatura de cultivo son los parámetros ambientales más importantes cuando se pretende utilizar un microorganis mo industrialmente. En el Capítulo III del libro Introducción a la mi crobiología, de García (1995), se explican detalla damente los conceptos importantes de este apartado, por lo que se recomienda estudiarlo.
Cuadro 2.3
ALGUNOS FACTORES DE CRECIMIENTO REQUERIDOS POR LOS MICROORGANISMOS Vitaminas (1)
Aminoácidos (1 ) _________________
Factores misceláneos
Tiamina
Arginina
Ácidos grasos
Biotina
Lisina
Tween 80 (•)
Ácido nicotínico
Triptófano
Esteróles
Riboflavina
Metionina
Piridoxal
Cistina
Ácido pantoténico
Tirosina
Ácido lipoico
Fenilalanina
Ácido p-aminobenzoico
Acido glutámico
• Tw«»n 80:
p olkw ietilerY soíbiü no m o n o o leato
Fuentes: Adaptado de (1) Greasham (1993) y (2) Dunn (1985).
24
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / A lic ia H e r n á n d e z
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La preparació n de m e d io s de c u lt iv o
El medio sintético
Los medios de cultivo utilizados intervienen en el éxito o fracaso de un proceso industrial. La selección del medio de cultivo depende, princi palmente, del tipo de microorganismo emplea do y del producto que se quiera obtener. Por ejemplo, si lo que se desea es producir biomasa, se debe emplear un medio de cultivo que in centive la reproducción del microorganismo, mientras que si el objetivo del proceso de fer mentación es la producción de metabolitos, el medio de cultivo debe tener los componentes que promuevan su producción. Además, es importante trabajar con un medio de cultivo que sea barato y de fácil preparación.
Los medios sintéticos se preparan a partir de compuestos puros en proporciones definidas. Un ejemplo de la composición de un medio de cultivo de este tipo se incluye en el Cuadro 2.4. Su mayor aplicación se genera en el área de la investigación, porque es posible deter minar los requisitos específicos para el creci miento de los microorganismos o la formación de un determinado producto. Estos medios de cultivo son reproducibles y fáciles de manejar, producen poca espuma, son translúcidos y permiten una relativa faci lidad en la recuperación de los productos; sin embargo, su costo es elevado. Cuadro 2.4
Los tipos de medios de cultivos Según se mencionó, los medios de cultivo tie nen distintas funciones y, con base en ellas, es posible clasificarlos en: • •
Selectivos Diferenciales
LA COMPOSICIÓN DE UN MEDIO SINTÉTICO (Medio Davis) Componente
Concentración
<9/0 Fuente de energía
2,0
k, h po 4
7,0
k h 2p o 4
3,0
•
Selectivo-diferenciales
MgS04 • 7H20
0,5
•
De mantenimiento.
C6H6Na20 7 • 3H20
0,5
2s o 4
1.0
Las diferencias entre estos medios de cultivo se deben estudiar en el Capítulo III del libro Introducción a la microbiología (García, 1995). Existe otra división de los medios de cultivo, de acuerdo con el tipo de componentes pre sentes en ellos; es la que se utiliza con más fre cuencia en los procesos industriales. En esta clasificación, se identifican dos tipos de me dios de cultivo: sintéticos (o definidos) y com plejos (o naturales).
Fuente: Zabriskie et al. (1988, 1).
El medio complejo Los medios complejos se preparan a partir de ingredientes de origen natural cuya composi ción química no está del todo definida. Una de las principales desventajas que presentan estos medios es que su composición varía con el tiempo, el lugar y la forma de almacena miento. Ejemplos de ellos son: extractos de carne, melazas, harina de semilla de algodón, harina de soya y agua de maceración de maíz. A veces, es necesario suplementar este tipo de
0*11*0 2: EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
_______ 25 Copyrighted material
medios de cultivo con algún otro compuesto, de acuerdo con los requerimientos del mi croorganismo o del metabolito por producir. Generalmente, los componentes de los me dios naturales son subproductos de alguna in dustria, por lo que son mucho más baratos que los medios sintéticos y se utilizan en la mayoría de los procesos industriales. En el Cuadro 2.5, se desglosa la composición de un medio complejo, utilizado para la producción de penicilina. Cuadro 2.5 LA COM POSICIÓN DE UN M EDIO CO M PIEIO (Rara la producción de penicilina)
Componente
Concentración (% )
Lactosa (C ,2H?2O n )
2,0
Pharmamedía
1.0
CaCOj
0,5
k h 2p o 4
0,3
(NH4)2S04
0,5
MgS04 . 7H ,0
0,02
Aceite de soya
0,2
Propi lengl icol (C,H80 2)
0,025
La formulación de medios de cultivo En la formulación de medios de cultivo se de ben tomar en cuenta varios aspectos, entre los que se pueden mencionar: el rendimiento del producto (o la biomasa) por gramo de sustra to, la concentración del producto, la velocidad de formación del producto y el rendimiento de productos indeseables. Además, debe ser barato y de calidad adecuada, estar disponible durante todo el año y no ocasionar problemas serios en el área de producción, tales como di ficultad en la agitación, en la aireación, en la extracción, en la purificación y en el trata miento de los desechos líquidos. Muchos medios de cultivo han sido prescritos empíricamente; sin embargo, en la actualidad, la mayoría de ellos se formula con base en la composición elemental del microorganismo de interés. El Cuadro 2.6 muestra la composi ción elemental de los principales grupos de microorganismos. Cuadro 2.6 LA COM POSICIÓN PROM EDIO TÍPICA DE LOS M ICROORGANISM OS
Fuente: Zabriskie el al. (1988,2).
La concentración final de algunos microorga nismos depende del tipo de medio de cultivo empleado. Zabriskie et al. (1988) señala el caso de la levadura Saccharomi/ces cerevisiae: en un medio sintético que contiene glucosa, se obtie ne un rendimiento de 10 a 20 g/¿ de biomasa, mientras que, en un medio complejo con me lazas de caña o remolacha, el rendimiento es de 60 a 100 g/f de biomasa; el aumento en el rendimiento así como el bajo precio de las me lazas son factores muy atractivos para utili zarlo.
Peso seco (% p/v) Componente
Carbono Nitrógeno Proteínas Carbohidratos Lípidos Ácidos nucleicos Fósforo Azufre Potasio Magnesio Sodio Calcio Hierro Cobre Manganeso Molibdeno
Bacteria.
levadura.
48.00 12,50 55,00 9,00 7,00 23,00 2,50 0,60
48,00 7,50 40,00 38,00 8,00 8,00
2,75 0,30 0,75 0,55 0,11 0,01 0,005 —
2,50 0,30 1,40 0,20 0,30 0,75 0,15 -------
-------
—
Hongo, imoho.1
48,00 6,00 32,00 49,00 8,00 5,00 1,70 0,12 2,50 0,30 0,05 0,20 0,30 0,006 0,004 0,0002
Fuente: Adaptado de Zabriskie et al. (1988).
26
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a i / A lic ia H í r s á n d e z
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El microorganismo se hace crecer en un medio de composición típica promedio y, con base en los resultados, se calculan los rendimientos de crecimiento y de producción de metabolitos. A partir de estos datos y la composición ele mental, se plantea una ecuación estequiométrica que permita ir optimizando el medio de cultivo. La ecuación en forma generalizada, reportada por Stanbury y Whitaker (1987), es la siguiente: Carbono + Nitrógeno 4- Energía + Otros requisitos , ‘-»Biomasa + Productos + C 0 2 + H¡,0 + Calor
En un proceso industrial, inicialmente, se for mula un medio de cultivo sintético y, una vez definidos los requerimientos nutricionales del microorganismo, el medio se sustituye por uno complejo que realice la misma función. El medio de cultivo utilizado durante todo el proceso industrial no es necesariamente el mis mo. Por lo general, el medio usado para la pre paración del inoculo es diferente al utilizado en el proceso de producción, porque cumplen di ferentes funciones: cuando se prepara el inocu lo, se busca que el microorganismo salga de su etapa de "bajo metabolismo" y se adapte a las condiciones de cultivo, para lo cual se usa un medio específico; mientras que, durante el pro ceso de producción, la composición del cultivo depende tanto del microorganismo como del producto que se quiera obtener.
L a prepar ac ió n del in ó c u l o La preparación del inóculo implica el desarro llo de una población de microorganismos, desde su estado de conservación hasta obte ner una suspensión de microorganismos via bles y aptos para reproducirse y producir me tabolitos a escala industrial. Los métodos para la preparación del inóculo tienen dos finalidades: obtener el máximo de viabilidad de los microorganismos así como evitar que pierdan las características para pro ducir los metabolitos de interés.
Las etapas para preparar el inóculo El procedimiento para preparar el inóculo in cluye tres etapas: la recuperación de la cepa, el crecimiento del microorganismo en un me dio de cultivo sólido y el crecimiento del mi croorganismo en un medio de cultivo líquido; estas actividades se describen a continuación.
La recuperación de la cepa La forma de recuperar la cepa depende del mé todo de conservación utilizado; por ejemplo: •
Si el cultivo está liofilizado, se le adiciona agua destilada estéril para rehidratar las células.
•
Si el cultivo está congelado, se recomienda poner el recipiente que lo contiene en un baño de agua a 37 °C para que la descon gelación sea lo más rápida posible.
•
Si el cultivo está en tubos de agar inclina do, se adiciona agua destilada estéril y se raspa la superficie con ayuda de un asa microbiológica.
•
Si el cultivo está en una botella de Roux, se le adiciona agua destilada estéril y unas perlitas de vidrio estériles y se agita sua
En algunos casos, se reduce el abastecimiento de uno de los nutrimentos necesarios para el metabolismo normal del microorganismo, con el fin d e q u e p roduzca un d eterm in ad o m eta-
bolito. Por ejemplo, según manifiesta Butlin (1967), Aspergillus niger puede ser inducido a ela borar ácido cítrico, si se le restringe el suminis tro de hierro, cobre, manganeso y fosfato; así, se limita la reproducción del hongo y se desvía su metabolismo hacia el objetivo deseado.
Cwf»uoj: EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
___________ 2J_
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vemente con el fin de suspender los mi croorganismos. •
Si el cultivo está desecado, se le adiciona agua destilada estéril para rehidratar las células.
El crecimiento en un medio de cultivo sólido Una vez preparada la suspensión de microor ganismos, se toma una asada (muestra) y se raya en un medio de cultivo sólido en el inte rior de tubos de agar inclinado. Se incuba a la temperatura y el tiempo adecuados.
El crecimiento en un medio de cultivo líquido Se toma una asada del crecimiento del microor ganismo en el medio de cultivo sólido y se in troduce en matraces erlenmeyers de 100 ó 250 m¿ de capacidad, que contienen un medio de cultivo líquido (en una cantidad que varía del 10 al 20% de su capacidad ). Luego, se esterili zan y se incuban, de acuerdo con los requeri mientos ambientales del microorganismo.
Los aspectos por considerar en la preparación del inoculo En la preparación del inoculo se deben tomar en cuenta dos aspectos importantes: •
La cantidad de inoculo requerida para el proceso de fermentación
•
La concentración de los microorganismos en el inoculo.
26
La cantidad de inoculo La cantidad de inoculo que se prepara y se agrega, en la mayoría de los casos, es el 10% del volumen total de trabajo: si se va a traba jar con un volumen final de un litro, se debe preparar cien mililitros de inoculo. En el caso de que el volumen requerido sea muy grande, el inoculo se debe preparar en varias etapas; por ejemplo, si el volumen de producción es de un millón de litros, el inoculo que se debe sembrar en el caldo de fermentación es de cien mil litros y, para su obtención, la preparación se hace por etapas. A veces, se necesitan seis o siete etapas para lograr el volumen de ino culo requerido: las dos primeras etapas, gene ralmente, se realizan en matraces erlenmevers J y las demás en termentadores con volúmenes cada vez mayores. J Durante la preparación del inoculo, se reco mienda mantener condiciones estrictas de hi giene y esterilidad en los equipos así como ha cer varias pruebas de pureza, porque el culti vo se puede contaminar en el paso de una eta pa a otra.
La concentración de microorganismos La concentración de microorganismos es un parámetro vital que se debe conocer en un proceso de fermentación, pues suministra da tos no solo relacionados con la curva de creci miento del microorganismo, sino con la canti dad de microorganismos con la que se debe iniciar el proceso. Cuando el producto desea do es la biomasa, la concentración de microor ganismos representa la eficiencia del proceso. Si el interés va dirigido hacia los metabolitos, el mismo parámetro (la concentración de mi croorganismos) es una medida indirecta de su producción. Existen varios métodos para me
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / A l ic ia H e r n á n d e z
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dir la concentración de microorganismos, los más comunes son: •
•
•
gitudes de onda del orden de los seiscien tos nanómetros). El procedimiento gene ral incluye los siguientes pasos:
La determinación del número de células por unidad de área, Se aplica cuando los microorganismos son unicelulares (leva duras o bacterias). Se realiza por conteo, utilizando un microscopio. La determinación de la masa celular. Se emplea principalmente para microorganis mos que crecen en forma micelial. La masa celular se determina por peso seco. En esta técnica, se filtra un volumen determinado del medio con el microorganismo, se seca el residuo que queda en el papel de filtro has ta obtener un peso constante y se calcula el peso seco por unidad de volumen. La determinación de la densidad celular. Cuando se dirige un haz de luz hacia un cultivo con microorganismos, estos des vían el haz parcialmente, según su con centración en el medio. La cantidad de luz que logra atravesar y llegar hasta un detector se puede relacionar con el núme ro de microorganismos presente. Para lle var a cabo esta determinación cuantitati vamente, se utiliza la técnica de espectrofotometría (generalmente, se emplean lon
-
Se preparan diferentes diluciones, a partir del medio con microorganismos.
-
Se determina, por conteo, el número de microorganismos en cada una.
-
Se mide la absorbanda de cada dilu ción.
-
Se confecdona una curva de calibra ción (absorbanda vs. número de mi croorganismos), que se utiliza para averiguar el número de microorganis mos por volumen de una muestra, a partir del valor de su absorbanda.
Este método, como el de la determinación del número de células, se aplica solo a microorga nismos unicelulares, pues se debe hacer im conteo; sin embargo, tiene la ventaja de que una vez confeccionada la curva de calibración no se realizan más conteos. Para obtener más información sobre la deter minación espectrofotométrica de la concentra ción, se puede consultar el texto Análisis ins trumental de Skoog y West (1987).
Oftrvioi: EL MANEJO DE LOS CULTIVOS MICROBIOLÓGICOS
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EJERCICIOS DE AUTOEVALUACION
1. Mencione las etapas involucradas en el manejo de cultivos. 2. Comente las siguientes expresiones: a)
Solo los cultivos puros pueden ser utilizados en la industria.
b)
En todos los procesos de fermentación es necesario mantener con diciones estrictas de esterilidad en el equipo de producción.
3. Describa las técnicas utilizadas para el aislamiento de microorganis mos. 4. Cite dos ventajas y dos desventajas de cada uno de los métodos de con servación de microorganismos. 5. Mencione los grupos básicos de nutrimentos requeridos por los mi croorganismos, además del agua y el oxígeno (en el caso de los aero bios). Incluya tres ejemplos de cada uno de ellos. 6. Defina: a)
Microorganismo organótrofo heterótrofo.
b)
Microorganismo fotótrofo.
c)
Medio de cultivo sintético.
d)
Medio de cultivo complejo.
7. Explique cuándo es importante la utilización de un medio de cultivo sintético y cuándo la de un medio de cultivo complejo. 8. ¿Qué factores se deben tomar en cuenta durante la formulación de me dios? 9. ¿Se utiliza el mismo medio de cultivo durante todas las etapas involu cradas en la producción de un metabolito? Explique. 10. Describa brevemente cada una de las etapas involucradas en la prepa ración de un inoculo.
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FUENTES Y LECTURAS RECOMENDADAS
BRENNAN, J., J. B u tle r s , N. CORWELL y A. Lilly. 1980. Las operaciones de la ingeniería de los alimentos. España: Acribia. BUTLIN, K. 1967. "Aspects of microbiology". Cap. 1. En: Biochemical and biological
engineering science. Vol. 1. New York: Academic Press. Drew, S. 1986. "The Culture". En: Manual of industrial microbiology and biotechno
logy. U.S.A.: American Society for Microbiology. Dunn, G. 1985. "Nutritional requirements of microorganisms". Cap. 7. En: Com prehensive Biotechnology. Vol. 1. Great Britain: Pergamon Press. G a r c ía , V. 1995. Introducción a la microbiología. San José: EUNED. GREASHAM, R. 1993. "Media for microbial fermentations". Cap 7. En: Biotechno
logy. Vol. 3 .2a ed. Weinheim: VCH. P ak to n , C. Y P. WILLIS. 1990. "Strain preservation, inoculum preparation and ino
culum development". Cap 3. En: Fermentation: a practical approach. Ox ford: University Press. P e lc z a r , M.; R. Reid Y E. C h a n . 1982. Microbiología. 4a ed. México: Me Graw Hill. QUINTERO, R. 1993. Ingeniería bioquímica: teoría y aplicaciones. México: Alhambra
Mexicana. RHODES, A. Y D. F le tc h e r . 1969. Principios de microbiología industrial. España: Edi torial Acribia. Skoog,
D. Y D. W est. 1987. "Introducción a la cromatografía". Cap. 1. Análisis ins trumental. México: Nueva Editorial Interamericana.
S taísíbury ,
P. Y A . WHITAKER. 1987. Principles of fermentation technology. Great Bri tain: Pergamon Press.
Z abriskje, D., W. A rn ie r, D. P h illip s y P. A lb a n o . 1988. Traders guide to fermenta
tion media formulation. U.S.A.: Trader's Protein.
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CAPÍTULO 3
LAS FERMENTACIONES
S u m a r io
El concepto de fermentación La clasificación de los procesos de fe rm e n ta ció n Las rutas bioquímicas de las fe rm e n ta d o Los fermentadores Los sistemas de fermentación La recuperación
y
la purificación de
p ro d u cto s
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OBJETIVOS
a) Comparar los dos conceptos de fermentación: el bioquímico y el microbiología). b) Explicar dos clasificaciones de los procesos de fermentación: con base en el tipo de producto final y en la presencia del oxígeno. c) Citar algunos productos que se fabrican mediante fermentaciones. d) Reconocer las rutas bioquímicas que participan en los procesos de fermentación y su importancia desde el punto de vista de la producción del compuesto de interés. e) Describir un termentador y los tipos de termentadores más utilizados. f)
Explicar los dos sistemas de operación de los procesos de fermen tación, el cultivo en lote y el cultivo continuo.
g| Explicar la importancia de conocer, antes de la fermentación, los comportamientos del crecimiento y del metabolismo de los mi croorganismos h) Citar los métodos más comunes para llevar a cabo los procesos de recuperación y purificación del producto de una fermentación; también, los criterios que determinan la escogencia de uno o va rios de ellos en un proceso.
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MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL / ALICIA HERNÁNDEZ
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El
c o n c epto de fermentación
Según se comentó en el Capítulo 1, los procesos fermentativos o fe r mentaciones han sido utilizados y desarrollados por el hombre desde hace aproximadamente ocho mil años, a pesar de que no se conocía la existencia ni la influencia de los microorganismos en esos procesos. La palabra fermentación proviene de una adaptación del término en latín fermentare, que significa "ebullir"; se utilizó porque describía la ebullición aparente que se observa durante la fabricación de vinos, a causa de la producción del dióxido de carbono, gas que se libera en forma de burbujas y provoca movimiento en el líquido. El concepto de fermentación se ha ido modificando con el tiempo y, actualmente, abarca una gran cantidad de procesos y productos di versos: el término se aplica tanto a procesos muy simples como a los que se desarrollan a escala industrial -con controles bien establecidos y de gran utilidad para el hombre-, por lo que resulta difícil descri birlo. Sin embargo, prevalecen dos criterios para su definición, uno bioquímico y otro microbiològico. Se explicará brevemente cada uno de estos conceptos y, si lo desea, puede ampliar el material en el Te ma 3 del libro Biología aplicada de De Abate (1982).
El concepto bioquímico de fermentación Desde el punto de vista bioquímico, una fermentación se define como un proceso mediante el cual las sustancias orgánicas (sustrato) sufren una serie de cambios químicos (reducciones y oxidaciones) que pro ducen energía: al finalizar la fermentación, se presenta una acumu lación de varios productos, unos más oxidados (aceptaron electrones) y otros más reducidos (donaron electrones) que el sustrato, con un
OffTuoj: LAS FERMENTACIONES
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balance total de energía positivo. Esta energía es utilizada en el metabolismo de los microor ganismos. Es importante mencionar que, en el concepto bioquímico, no se consideran como fermenta ciones los procesos en los que participa el oxí geno. Cuando el aceptor final de electrones es el oxígeno molecular y no una sustancia orgá nica, el proceso se conoce como respiración. El concepto bioquímico de fermentación es equi valente al de respiración celular anaerobia que utiliza De Abate (1982). A continuación se in cluyen dos ejemplos de fermentaciones, desde el punto de vista bioquímico. La producción, a partir de glucosa, de etanol y dióxido de carbono:
C*H|A - * C2H5OH + C02+ HjO GIucom
tonol
Dióxido
.Agua
de CVbono
•
La producción, a partir de glucosa, de lactato:
C*H,A -*• CjH503+ HjO Glucúfei
LttUro
C*Hi A
Desde el punto de vista microbiológico, en la actualidad, se entiende por ferm entación aquel proceso en el que los microorganismos produ cen metabolitos o biomasa, a partir de la utili zación de sustancias orgánicas, en ausencia o presencia de oxígeno. La descomposición de los sustratos es llevada a cabo por enzimas producidas por los microorganismos para tal finalidad. Se debe observar que el concepto llega a excluir a los microorganismos del pro ceso, siempre y cuando estén presentes sus enzimas; sin embargo, en estos casos, la velo cidad de obtención y los rendimientos del producto son menores.
+ Oj - * C 0 2 + HjO
En el contexto de esta unidad didáctica, se uti lizará la definición de fermentación en térmi nos de la microbiología industrial. Un proceso de fermentación, visto como un todo, está compuesto por tres etapas: •
La preparación del inoculo.
•
La selección del medio de cultivo.
•
La producción de la biomasa o de los me tabolitos de interés.
Agua
El concepto microbiología) de fermentación
38
Para el microbiólogo industrial, no hay dife rencia entre fermentación y respiración, pues en ambos procesos los microorganismos hidrolizan un sustrato orgánico, ya sea en pre sencia o ausencia de oxígeno. Las conversio nes mencionadas de glucosa en etanol, dióxi do de carbono y agua, así como en lactato y agua son procesos de fertnetüación desde el concepto microbiología); pero, la conversión de glucosa -en presencia de oxígeno- en dió xido de carbono y agua, que se representa a continuación, también lo es.
Las dos primeras etapas fueron estudiadas en el Capítulo 2; la que se refiere al proceso de producción se desarrollará en este capítulo.
L a c l a s if ic a c ió n d e l o s PROCESOS DE FERMENTACIÓN
La gran cantidad de procesos y productos que involucra el término fermentación hace difícil no solo la definición del concepto, sino tam bién su clasificación. En general, se establecen divisiones con base en: •
El tipo de producto final por obtener
•
La presencia o ausencia de oxígeno en el proceso.
M i c r o b i o l o g í a in d u s t r ia l / A lig a H e rn á n d e z
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Los productos finales de la fermentación Desde el punto de vista comercial, las fermen taciones se pueden clasificar tomando en cuenta los productos que se obtendrán. Entre ellos, se pueden mencionar: •
Células microbianas (biomasa)
•
Metabolitos microbianos (enzimas, etanol, butanol, acetona, ácidos orgánicos, etcétera).
En el Cuadro 3.1, se señalan algunos de los grupos más importantes de productos obteni dos por fermentación. Cuadro 3.1
ALGUNOS COMPUESTOS DE INTERÉS COMERCIAL PRODUCIDOS POR FERMENTACIÓN Tipo de sustancia
Producios
Ácidos orgánicos
Acético, cítrico, íumárico, glucónico, itacónico, láctico
Aminoácidos
Lisina, metionína, tripudiano, vaiina
Alcoholes v solventes Acetona butanol, 2,3-butar»odíolt etanol, glicerol Antibióticos
Bacitracina, estreptomicina, neomicína, penicilina, tetraciclina
Esferoides
Corttsona, hidrocortisona, testosterona
Vitaminas
Ácido ascòrbico, cianocobalamina, caroteno, riboflavina
Proteina unicelular
Células de hongos, levaduras, bacterias y algas
(biomasa)
Otros
Alcaloides, enzimas, insecticidas biológicos, metano, polisacáridos y saborizantes
Fuente; Quintero (1993, 22).
El oxígeno en el proceso de fermentación También es posible clasificar las fermentaciones con base en la presencia o ausenda de oxígeno
G tfftuo J:
LAS FERMENTACIONES
molecular durante el proceso. De acuerdo con esta división, los procesos se denominan: •
Fermentadón aerobia
•
Fermentación anaerobia.
En la ferm entación aerobia, el aceptor final de electrones es el oxígeno; es imprescindible su presencia para el desarrollo del microorganis mo y la producdón del compuesto deseado. En este tipo de procesos, se produce funda mentalmente biomasa, dióxido de carbono y agua. En la fermentación anaerobia, el proceso de pro ducción del metabolito de interés se desarro lla en ausencia de oxígeno; los productos fina les son sustancias orgánicas, por ejemplo, ácido láctico, ácido propiónico, ácido acético, bu tanol, etanol y acetona. Sin embargo, en la mayoría de las fermentaciones anaeróbicas, se requiere un poco de oxígeno al inicio del pro ceso para favorecer el crecimiento y la repro ducción del microorganismo. En los procesos anaerobios, los microorganis mos producen mucho menos energía que en los aerobios y, para suplir sus necesidades de energía, metabolizan una mayor cantidad de azúcares; por consiguiente, elaboran más me tabolitos. Entonces, a través de la cantidad de oxígeno, se puede manipular un proceso de fermentación para incrementar la producción de la sustancia de interés; por ejemplo, cuan do se trabaja con un microorganismo faculta tivo (capaz de crecer en presencia o ausencia de oxígeno), como Saccharomyces cerroisiae, se obtienen diferentes productos mayoritarios, según la concentración de oxígeno en el me dio: si es muy limitada, habrá una mayor pro ducción de etanol, mientras que si es alta, se favorece la reproducción del microorganismo, o sea, la producción de biomasa.
__________ 39 Copyrighted material
Las
proceso anaeróbico y se divide en dos etapas. En la primera, la glucosa se fosforila (incorpo
rutas bio q u ím ic a s
DE LAS FERMENTACIONES Es de gran importancia conocer las rutas bio químicas de degradación de los compuestos orgánicos, no solo para determinar cuáles pueden ser los productos que se obtendrán en una fermentación, sino por la posibilidad de manipular el proceso para producir otro tipo de sustancias. Existen varias rutas o secuen cias bioquímicas de utilización y conversión de los azúcares; sin embargo, únicamente se mencionarán en forma general tres de ellas, consideradas como las de mayor relevancia desde el punto de vista industrial: •
La glucólisis
•
El ciclo de Krebs
•
La cadena respiratoria.
A continuación, se señalarán solo algunos as pectos de las dos primeras rutas, pues ya fue ron estudiadas en otro curso. Puede consultar al respecto en los libros Biología aplicada (De Abate, 1982), Química orgánica y bioquímica (Burton y Routh, 1977), o en o tro te x to d e b io q u ím ic a .
La glucólisis La glucólisis (vía de Embden-Meyerhof-Parnas, EMP) representa la ruta principal del me tabolismo de la molécula de glucosa. Es un
ra el fósforo) a expensas de una molécula de trifosfato de adenosina (ATP); una vez fosforilada, se rompe para formar gliceraldehído 3fosfato. Durante la segunda etapa, el gliceral dehído 3-fosfato es convertido en piruvato por oxidación. El agente oxidante es el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD). En esta etapa se producen, en total, ocho mo léculas de ATP por cada una de gliceraldehído 3-fosfato. La secuencia de reacciones se obser va en el Esquema 3.1. El piruvato es el compuesto final de la glucó lisis (por cada molécula de glucosa se forman dos moléculas de piruvato) y se considera co mo la molécula "clave" para muchos tipos de fermentación, pues, a partir de ella, se produ ce una gran cantidad de compuestos de acuer do con el microorganismo que se utilice y de las condiciones ambientales en las que se lle ve a cabo el proceso. Algunos de los produc tos que pueden ser formados del piruvato se observan en la Figura 3.1. Después de la obtención del piruvato, si las condiciones siguen siendo anaeróbicas, se pueden producir compuestos tales como el etanol y el ácido láctico. Sin embargo, en con diciones aeróbicas, la ruta bioquímica se des vía hacia el ciclo de Krebs.
Ácido láctico
Figura 3.1:
40
Algunos productos que se pueden formar a partir del piruvato.
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ciclo, se producen ocho átomos de hidrógeno (a partir de los intermediarios) que son trans feridos a la cadena respiratoria, transportado ra de electrones: los electrones fluyen dentro de esta cadena, a causa de una serie de reaccio nes enzimáticas (inician en el compuesto NADH y finalizan en el oxígeno), y originan un gran cambio de energía libre que es utilizada para formar varias moléculas de ATP. En el ciclo de Krebs, se producen quince mo léculas de ATP (doce en las reacciones cíclicas y tres en la formación del acetil CoA). Como cada molécula de glucosa proporciona dos de piruvato, se liberan por medio del ciclo de
Krebs treinta moléculas de ATP. En total, una molécula de glucosa que se oxida por ambas rutas libera treinta y ocho moléculas de ATP.
LOS FERMENTADORES Un ferm entador, también conocido como reac tor o biorreactor, es un recipiente donde se lle va a cabo el proceso de fermentación. Su fun ción principal es mantener el medio y el mi croorganismo en las condiciones adecuadas para lograr la mayor producción de los com puestos de interés. Es deseable que un ter mentador cumpla con una serie de requisitos, entre los que se encuentran:
Piruvato
5ATP
Acetil-CoA
2ATP
Esq u em a
3.2:
El
c ic lo
de Krebs.
Fuente: Adaptado de Stryer 11988Í.
42
M ic r o b io lo g ía in d u s t r ia l / A u c m H ern á n d ez
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•
Consumo bajo de energía.
•
Capacidad para mantener un mezclado uniforme del medio de cultivo y el mi croorganismo, con el mínimo de variacio nes durante su operación.
•
Adaptación fácil a diferentes procesos.
•
Precio de acuerdo con las características del fermentador.
•
Transferencia de calor buena.
•
Sistema de mezclado que mantenga los microorganismos separados entre ellos pa ra evitar un daño mecánico de las células.
•
Diseño mecánico simple.
•
Controles de pH, de oxígeno disuelto y de temperatura.
•
Facilidad en la toma de muestras.
•
Sistema de eliminación de calor.
•
Diseño que permita mantener condiciones de asepsia durante el proceso.
Generalmente, los fermentadores se constru yen de vidrio o de acero inoxidable. A escala de laboratorio, su volumen oscila desde uno hasta cincuenta litros y, a escala industrial, pueden llegar hasta los trescientos mil litros. El volumen de trabajo es, aproximadamente, el 80% del volumen total. Existen muchos tipos de reactores; cada uno se encuentra diseñado de manera que pueda adaptarse a las condiciones de operación ne cesarias para optimizar la producción del compuesto de interés. Los más utilizados son; •
El matraz erlenmeyer.
•
El reactor de tanque agitado.
•
El reactor de elevación con aire, común mente conocido por su nombre en inglés, airlift.
•
El reactor de disco rotatorio.
O rtu ü i LAS FERMENTACIONES
El matraz erlenmeyer En la historia de los procesos de fermentación, el "reactor" más utilizado a escala de labora torio ha sido el matraz erlenmeyer, que se muestra en la Figura 3.2. En la actualidad, es la herramienta más empleada para la selec ción de la cepa, la preparación del inoculo, el estudio inicial de las condiciones adecuadas para el desarrollo del microorganismo y la preparación del cultivo, antes de aumentar el tamaño del proceso. La principal desventaja del erlenmeyer es la dificultad para mantener y controlar las condiciones (pH, oxígeno di suelto, asepsia) que requiere el crecimiento óptimo del microorganismo. Se han diseñado matraces con hendiduras internas (bafles); la función de estas hendiduras es evitar la for mación de vórtices y, de esta manera, lograr un mezclado más homogéneo. Un erlenme yer con bafles se puede observar en la Figura 3.2.b.
1
1
a) F ig u ra 3.2:
Erlenmeyers utilizados en procesos
de fermentación, a) Sin bafles y b) Con bafles.
El reactor de tanque agitado Este reactor está compuesto, principalmente, por un tanque de acero inoxidable o de vidrio con un motor ubicado en su parte superior o inferior para la agitación del caldo de fermen tación (ver Diagrama 3.1). Cuando el reactor es pequeño, se puede esterilizar en un autoclave; 43
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si es de mayor volumen, debe tener un siste ma de inyección de vapor para su esteriliza ción. Un reactor de este tipo se puede obser var en la Fotografía 3.1.
Algunos de estos componentes se pueden ob servar en el Diagrama 3.1 y se describen a con tinuación.
D iagram a
3.1: Las principales partes de un reactor de tanque agitado.
El sistema de agitación El sistema de agitación está compuesto por el motor y los impulsores. En el ejemplo se en cuentra colocado en la parte superior del ter mentador. Sus funciones son:
F o to c ra fIa 3 .1 :
Un
•
Aumentar la disponibilidad del oxígeno, porque disminuye el tamaño de las burbu jas de aire y, así, aumenta la solubilidad del oxígeno en el medio.
•
Realizar el mezclado del caldo de fermen tación.
re a cto r do ta n q u e ag itad o .
Fuente: Colé Rarmer (2001-2002, 3621.
Lis partes principales de un reactor de tanque agitado son: •
Sistema de agitación (motor e impulsores)
•
Placas deflectoras
•
Dispositivos de adición, extracción y con trol
•
Sistema de aireación
•
Sistema de transferencia de calor.
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Los impulsores son los dispositivos utilizados para dar movimiento al caldo de fermenta ción. Su número se define con base en el ta maño del termentador, y su disposición den tro del termentador depende de la configura ción geométrica del recipiente. Existen dife rentes tipos de impulsores, que se diferencian básicamente por el diseño de las paletas. En la Figura 3.3 se muestran tres tipos de paletas.
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dio de cultivo y los microorganismos así como el drenaje del caldo de fermentación.
a)
b)
F ig u r a 3 .3:
c)
Los tipos de paletas utilizados en los impulsores, a) La turbina Rushton. b) La turbina abierta, c) La propela marina.
Los dispositivos de control son sensores del pH, la temperatura, la acidez y el oxígeno di suelto. Todos estos dispositivos se colocan en la tapa del termentador y deben estar bien sellados para impedir que el caldo se contamine con los microorganismos presentes en el ambiente.
Las placas deflectoras También se denominan bailes o cortacorrien tes. Son placas colocadas a lo largo del reac tor, muy cerca de sus paredes, y se utilizan para evitar la formación de un vórtice y, así, mejorar el mezclado del caldo de fermenta ción. Generalmente, se colocan cuatro; su ta maño se define con base en la configuración geométrica del reactor. En el siguiente dia grama se muestra un reactor sin y con placas deflectoras.
El sistema de aireación La mayoría de los procesos industriales requie ren oxígeno {en mayor o menor cantidad) para el desarrollo de los microorganismos. El oxíge no es muy poco soluble en agua, por lo que se debe suministrar continuamente. El aire se in corpora mediante una bomba y es esterilizado a través de filtros e inyectado por la parte infe rior del termentador, cerca de las paletas de agitación, para que estas se encarguen de su distribución en todo el caldo de fermentación.
Los sistemas de transferencia de calor
a) D
ia g r a m a
3 .2:
b)
Las placas deflectoras en un reactor de tanque agitado, a) Sin placas deflectoras. b) Con placas deflectoras.
Es necesario mantener el caldo de fermenta ción a la temperatura en la que se logra el óp timo desarrollo de los microorganismos. Cuando los reactores son de baja capacidad, la temperatura de trabajo se alcanza colocando el reactor en un baño de agua; sin embargo, para reactores de gran capacidad, se requiere sistemas de transferencia de calor. Los sistemas de transferencia de calor más co munes son:
Los dispositivos de adición, extracción y control Los dispositivos de adición y los de extracción son puertos o aberturas en el reactor, que per miten la adición de los antiespumantes, el me
OrtruoJ: LAS FERMENTACIONES
•
Los serpentines. Tuberías que se colocan dentro del termentador (Diagrama 3.3.a).
•
La camisa, también conocida como cha queta. Consiste en una doble pared que cubre el reactor (Diagrama 3.3.b).
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Serpentín
Salida de gas
a) D ia g ra m a 3.3:
Los sistemas de transferencia de calor en un reactor de tanque agitado. a) Un reactor con serpentín, b) Un reactor con camisa.
En ambos sistemas se suministra vapor de agua, agua caliente o agua fría, y se controla la temperatura por medio de termostatos. En los procesos de fermentación, se genera ca lor como consecuencia del metabolismo de las células y, principalmente, por efecto del mez clado del caldo; si la temperatura del medio aumenta a valores perjudiciales para el desa rrollo del microorganismo, se debe remover calor por medio de sistemas de alimentación de agua fría.
El reactor de elevación con aire Estos reactores están diseñados de tal forma que el aire es el que lleva a cabo la agitación. El aire es suministrado por la parte inferior del reactor y ejerce una fuerza de arrastre del líquido a tra vés de todo el recipiente, como se indica en el Diagrama 3.4. Este tipo de reactor presenta dos ventajas, respecto al de tanque agitado: •
El daño en las células es mínimo.
•
Los requerimientos de energía para su funcionamiento son menores, por no tener agitadores mecánicos.
Los reactores de elevación con aire también poseen dispositivos para el control de las con diciones ambientales, la toma de muestras y el drenaje del caldo de fermentación.
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Enlrada de aire Drenaje D ia g r a m a 3.4:
Un reactor de elevación con aire.
El reactor de disco rotatorio Este tipo de fermentador está compuesto bási camente por dos partes: un disco (es, en rea lidad, un cilindro), cuya superficie es de un material apropiado para que los microorga nismos se adhieran a ella, y un recipiente, ge neralmente rectangular, que contiene el medio de cultivo. El cilindro se encuentra inmerso hasta la mitad en el medio de cultivo y rota lentamente, de tal manera que los microorga nismos están en contacto, en forma alterna, con el aire y con el medio de cultivo {Diagrama 3.5). Este reactor se utiliza principalmente pa ra el tratamiento de desechos líquidos (aguas residuales).
D ia g r a m a 3.5:
Un reactor de disco rotatorio.
M ic r o b io lo g ía INDUSTRIAL / A lIO A HERNÁNDEZ
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LO S SISTEMAS DE FERMENTACIÓN
La fase de lateneia
Los procesos de fermentación pueden desa rrollarse por dos métodos o sistemas de ope ración distintos:
La fase de latencia también es conocida como fase lag; coincide con el periodo de adaptación del microorganismo a las nuevas condiciones nutricionales y ambientales. Se presenta in mediatamente después de la inoculación y su duración depende del estado fisiológico de la célula inoculada y de las condiciones ambien tales. Si el microorganismo se encuentra en su fase logarítmica antes de la inoculación, la fa se lag es muy pequeña o puede no presentar se. Durante este periodo, no existe aumento en el número de células, pues el microorganis mo utiliza la energía disponible con el fin de sintetizar las enzimas que requiere para su de sarrollo en el nuevo medio.
•
El cultivo en lote
•
El cultivo continuo.
Ambos tienen gran importancia desde el pun to de vista industrial y cada uno presenta ven tajas y desventajas. Antes de analizar estos dos métodos, se expli cará, en forma concisa, la curva de crecimien to de un microorganismo. Puede ampliar el estudio del crecimiento de los microorganis mos en el Capítulo III de Introducción a la mi crobiología (García, 1995). Además se estudiará el efecto de la concentración de los sustratos so bre la velocidad de crecimiento de los mi croorganismos.
La curva de crecimiento de un microorganismo Esta curva representa el comportamiento del crecimiento del microorganismo a través del tiempo. Con base en ella, se determina cuán do se produce la mayor cantidad de biomasa o de metabolitos (primarios o secundarios). En el Gráfico 3.1, se muestran las diferentes fases de crecimiento de un microorganismo.
La fase logarítmica o exponencial En la fase logarítmica, las células se multipli can a la máxima velocidad y su crecimiento puede ser cuantificado con base en el número de células que se producen por unidad de tiempo (para levaduras y bacterias) o por el aumento en la biomasa por unidad de tiempo (para hongos filamentosos). La velocidad de crecimiento durante este periodo permanece constante y es independiente de la concentra ción del sustrato, siempre y cuando esta sus tancia se encuentre en exceso.
Log biomasa
A) Fase de latencia B) Fase logarítmica
C) Fase estacionaria D) Fase de muerte
Tiem po G ráfico 3.1: La curva de crecimiento de un microorganismo. Fuente: Adaptado de Marison (19%).
csmuoJ: LAS FERMENTACIONES
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La fase logarítmica termina cuando se produ ce alguna de estas tres situaciones: los nutri mentos se agotan, las condiciones ambientales indispensables para la célula se modifican o cuando la célula produce metabolitos tóxicos o que inhiben su reproducción.
La fase estacionaria En la fase estacionaria, la velocidad de creci miento (reproducción) del microorganismo es igual a la velocidad de muerte y se llega a un equilibrio celular. La importancia de esta fase varía con el tipo de fermentación. Si el objeti vo final de la fermentación es la producción de etanol, no es necesario (ni rentable) conti nuar el proceso cuando se alcanza la fase esta cionaria, ya que una vez que obtiene la máxi ma concentración de las células, la producción de etanol disminuye. Por el contrario, en la producción de antibióticos, la mayor acumu lación de estas sustancias se presenta durante la fase estacionaria.
por Jacques Monod en 1950. Él fue el primero en estudiar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Sus estudios se compo nen de derivaciones matemáticas complejas que no se expondrán en este texto; sin embar go, es importante conocer algunos términos relacionados con el tema.
Algunos términos relacionados con la ecuación de Monod •
La velocidad de crecimiento del microor ganismo. La velocidad de crecimiento del microorganismo es el aumento en la canti dad de microorganismos por unidad de tiempo y se expresa matemáticamente co mo dX/dt; sus unidades son (g/1 Jdr1. Es proporcional al número de células presen te; alcanza un valor máximo y constante, siempre y cuando no haya un sustrato que limite su crecimiento. Estas características se cumplen cuando el microorganismo se encuentra en su fase logarítmica.
La fase de muerte
•
La fase de muerte se inicia cuando los nutri mentos que están en el medio de cultivo no son suficientes para que el microorganismo pueda reproducirse. Otro de los motivos por los cuales empieza esta etapa es la produc ción, como parte del metabolismo, de sustan cias tóxicas que impiden la multiplicación de las células.
El sustrato limitante (S). Es el sustrato que, debido a su concentración (g¡ l ) , va a ser el que restrinja el crecimiento de los microorganismos. Puede ser la fuente de carbono y de energía.
•
El tiempo de duplicación (td). Es el tiem po (en minutos) necesario para que las po blaciones de células se dupliquen. Este periodo es constante durante la fase loga rítmica.
•
La velocidad específica de crecimiento (p). Es la velocidad de aumento de la con centración celular por unidad de tiempo y se expresa en h4 . Se mantiene constante durante la fase logarítmica y, en la curva de crecimiento (Gráfico 3.1), se representa
El efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de crecimiento El crecimiento de los microorganismos duran te el cultivo en lote y el continuo puede ser cuantificado gracias a los estudios realizados
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por la pendiente de la línea que simboliza la fase logarítmica. •
La velocidad específica de crecimiento mixima Es la velocidad máxima de multiplicación que puede alcanzar el microorganismo, en las condiciones en las que está creciendo. Esta velocidad es igual a la velocidad específica de creci miento, (i, cuando el microorganismo está en la fase logarítmica.
La ecuación de Monod La ecuación de Monod, que se conoce tam bién como el modelo de crecimiento celular, describe la relación entre la velocidad especí fica de crecimiento (|i) y la concentración del nutrimento limitante (S) en un cultivo micro biano; se representa por la siguiente expresión matemática: S H e H w f a *
•
La constante específica de cada sustrato (Ks). Es la constante de utilización del sustrato limitante y representa la afinidad de los organismos por ese sustrato. La constante Ks es la concentración del sus trato a la que se producen microorganis mos con una velocidad igual a la mitad de la velocidad específica de crecimiento má xima (Gráfico 3.2). Si el organismo tiene gran afinidad por el sustrato limitante, el valor de Ks es bajo. Los valores de Ks de diferentes sustratos oscilan en un interva lo entre 1,1 x 10-3 y 25,0 mg/¿ para varios de los microorganismos.
------------------------
(Ks + S)
El Gráfico 3.2 es una muestra de esta ecua ción. Con base en la ecuación de Monod y el Gráfi co 3.2, se puede observar que: •
Si la concentración de sustrato limitante (S) es cero, la velocidad específica de cre cimiento también lo es.
•
Cuando S es muy grande, la velocidad es pecífica de crecimiento tiende a la veloci dad máxima. El microorganismo se en cuentra en la fase logarítmica, que corres ponde a la sección entre los puntos II y III en el Gráfico 3.2.
•
Si, por el contrario, S es muy pequeña, la velocidad específica de crecimiento de
fC
0 S. o
s .1 1 i Í2-S
£
Concentración del sustrato G rAfico 3.2:
El efecto de la concentración de sustrato limitante sobre la velocidad de crecimiento de un microorganismo. Fuente: Adaptado del Marison (1996).
GtrtuoJ: LAS FERMENTACIONES
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pende de S, como se muestra en la sección de la curva entre los puntos I y II. A continuación, se procederá a diferenciar los dos sistemas de operación de los procesos de fermentación.
El cultivo en lote El cultivo en lote (o por lotes) es un sistema ce rrado, porque, después de iniciado el proceso (al mezclar los nutrimentos y el microorganis mo), solo se adiciona oxígeno, antiespumantes y bases o ácidos para el control del pH. La fer mentación se lleva a cabo en un periodo defini do de tiempo, durante el cual varía la composi ción del medio de cultivo, la concentración de biomasa y la de metabolitos. Después, se inte rrumpe el proceso y se recupera el producto. Para realizar exitosamente una fermentación en lote, es necesario conocer la curva de creci miento del microorganismo: al saber el com portamiento de su crecimiento, se pueden ma nipular las condiciones de manera que se ob tenga el producto deseado, por ejemplo, si lo que se requiere es la producción de metaboli tos primarios, se debe alargar la fase logarít mica; si son metabolitos secundarios, se ex tiende la fase estacionaria y, para aumentar la cantidad de biomasa, se buscan las condicio nes de mayor producción de células.
El cultivo continuo El cultivo continuo se puede describir como un sistema abierto y, a diferencia del cultivo por lotes, se adiciona constantemente medio de cultivo fresco a los microorganismos, a una determinada velocidad, y se extrae caldo de fermentación (medio de cultivo con microor ganismos y metabolitos), a la misma veloci dad. Así, se logra mantener, en el reactor, una
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población estable de microorganismos en con diciones uniformes. En muchas fermentacio nes, el compuesto de interés se produce du rante la fase exponencial; al respecto, una de las ventajas del sistema continuo es que se puede mantener estable la población en esta fase por periodos prolongados de tiempo. Para que el cultivo continuo sea efectivo, es necesario que el proceso se encuentre en esta do estacionario. El estado estacionario se defi ne como una condición de estabilidad, en la que varios factores permanecen constantes a través del tiempo; entre ellos, el volumen del cultivo, la concentración celular y de metabolitos, y las condiciones fisicoquímicas necesa rias para el desarrollo del proceso. Como re sultado de la estabilidad, los procesos fermen tativos se pueden mantener por largos perio dos, siempre y cuando el sistema se mantenga libre de contaminación. El cultivo continuo se ha utilizado para fabri car una serie de productos, entre ellos, la cer veza y el etanol; también, se ha utilizado en el tratam ien to de las a g u as residuales. Algunas sustancias obtenidas por fermentación conti nua son: acetona, doramfenicol, ácido acéti co, etanol, ácido cítrico, estreptomicina, ácido glucónico, glucosa-isomerasa, ácido itacónico, glicógeno, ácido láctico, penicilina, butano, penicilinasa, butanodiol, proteína unicelular, celulasa y vitamina B12 (Quintero, 1 9 « , 75). La proteína unicelular se ha producido incluso a escala industrial. Existen dos técnicas básicas o sistemas de fer mentación de cultivo continuo: el mezclado ho mogéneo y e\ flujo tapón. El mezclado homogé neo se puede realizar por dos métodos dife rentes: el quimiostato y el turbidostato. Estas técnicas se presentan en el Esquema 3.3.
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Cultivo continuo
Mezclado homogéneo
Quimiostato E sq u em a 3 .3 :
Flujo tapón
Turbidostato
Los sistemas de operación de cultivo continuo.
El quimiostato El quimiostato es un sistema de fermentación en el que se introduce una suspensión del me dio de cultivo (sustrato) en el fermentador, a una velocidad definida e igual a la velocidad de salida del medio de cultivo (el medio de cultivo que sale contiene muchos microorga nismos o metabolitos y poco sustrato), por lo que el volumen de trabajo del reactor perma nece constante (Diagrama 3.6).
Vel £ = Vel s Vel € - Velocidad de entrada Vel s = Velocidad de salida
V e ls D iagram a
3.6: El sistema de fermentación de tipo quimiostato.
La característica fundamental de este sistema de fermentación es que uno de los sustratos se agrega en una cantidad limitada, de tal forma que la velocidad de crecimiento del microor ganismo se encuentra en función de la con centración del sustrato en el medio y de la ve
O riuo j LAS FERMENTACIONES
locidad a la que este se adicione. Es decir, el organismo va a crecer, o va a producir la sus tancia de interés, a una velocidad que depen de de la cantidad disponible del sustrato limi tante y del tiempo en el que permanezca el mi croorganismo en el reactor. El sistema supone que el mezclado es inmediato y homogéneo. Se debe ejercer mucho control sobre la veloci dad del flujo del caldo de fermentación: si la velocidad es muy alta, el microorganismo no permanecerá en el reactor el tiempo necesario para poder reproducirse. Lo anterior se cuantifica comparando la velocidad específica de crecimiento con el factor de dilución (D). Este se define como la relación entre la velocidad de ingreso del medio fresco (F) y el volumen de operación del reactor (V): F D = ------
V
La recíproca del factor de dilución es el tiempo de residencia del microorganismo en el reactor. Cuando la velocidad específica de crecimiento es mayor que el factor de dilución, se acumu lará biomasa en el reactor. Si, por el contrario, el factor de dilución es mayor que la velocidad específica de crecimiento, después de un tiem po de operación, no habrá microorganismos en el reactor pues todos han salido; este fenó meno se conoce en términos técnicos como lavado del reactor. La información anterior se puede resumir de la siguiente manera: Si D < p
se acumula biomasa en el reactor
Si D > p -*■ se lava el reacto r Para no correr el riesgo de que el reactor se la ve, es recomendable que el valor del factor de dilución no solo sea menor que la velocidad específica de crecimiento, sino que no alcance valores muy cercanos a ella.
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Al sistema se le denomina quimiostato, por que la velocidad de crecimiento del microor ganismo depende de factores químicos (de la disponibilidad de un compuesto en el medio). Este es el sistema de cultivo continuo más em pleado, pues permite controlar el crecimiento del microorganismo y, por lo tanto, manipular la producción de biomasa o de los metabolitos de interés.
El turbidostato En el turbidostato, el crecimiento no está limi tado por ninguno de los nutrimentos; por el contrario, todos se agregan en exceso. El con trol se ejerce con base en la turbidez que provo ca la presencia de microorganismos en el me dio de cultivo: entre mayor sea la población de microorganismos, mayor es la turbidez. Para desarrollar este sistema de control, se co loca una fotocelda en el reactor, que detecta el grado de turbidez del caldo de fermentación: cuando el sistema detecta un aumento en la concentración de la biomasa por encima del lí mite superior (valor de turbidez mayor que el límite superior), se activa una señal que accio na las bombas de entrada del medio de culti vo y salida del caldo de fermentación. El sis tema de bombeo se apaga cuando el valor de turbidez cae por debajo del límite inferior es tablecido. El procedimiento se resume a con tinuación. Primero, se determina, en forma experimen tal,g la relación entre la concentración celular y é la turbidez (revisar los métodos de determina ción de la concentración celular expuestos en la sección La prefiaracióii del inoculo del Capítu lo 2 de este texto). Luego, se compara la tur bidez con la producción de metabolitos o de biomasa, según sea el caso. Por último, se de fine un intervalo de valores (concentraciones de microorganismos en el caldo) dentro del
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cual el sistema de fermentación produce la cantidad de sustancia de interés deseada, y se ajustan los detectores de turbidez con los va lores (máximo y mínimo) permitidos. Una ventaja de este sistema respecto al qui miostato es que el microorganismo sí se pue de desarrollar a su velocidad máxima de cre cimiento y, por lo tanto, es muy útil cuando no es posible controlar la concentración de los nutrimentos, como en el caso de la degrada ción de desechos. Una de las desventajas del turbidostato es que se requiere un aparato de control complejo (fotoceldas y sistema de bombeo) para mantener el estado estaciona rio. Además, puede haber alteración en la de tección que realizan las fotoceldas, por acu mulación celular cerca de ellas y por la pre sencia de las burbujas de oxígeno.
El sistema de flujo tapón En el sistema de flujo tapón, el medio de culti vo y el inoculo entran a un reactor de tipo tu bular a una velocidad de flujo constante. Du rante la permanencia de los microorganismos en el reactor, se lleva a cabo el proceso de fer mentación. En este sistema, a diferencia de los anteriores, la solución de entrada contiene cé lulas, por lo que hay variaciones de la concen tración de las células, del medio de cultivo y los metabolitos en las distintas partes del reac tor. Al igual que en cualquier proceso de fer mentación, ya sea por lotes o continuo, es im portante conocer la curva de crecimiento del microorganismo, porque la pérdida de células en el fluido que sale del reactor debe estar ba lanceada por el crecimiento del microorganis mo. Si la velocidad del flujo de salida del cal do de fermentación es mayor que la velocidad específica de crecimiento, el reactor se lavará y no habrá síntesis de metabolitos. El Diagrama 3.7 muestra un reactor de flujo tapón.
M ic r o b io lo g ía in d u s t r ia l
t A lic ia H ern án dez
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Salida del producto + (microorganismos y metabolites eie interés)
Entrada del medio
de cultivo
------ 1
Las principales desventajas del cultivo conti nuo, en relación con el cultivo en lote, son: •
Es difícil mantener las condiciones estéri les en el fermentador por periodos prolon gados.
•
En ocasiones, se presentan mutaciones en la cepa original y, entonces, el mutante puede crecer más rápido que la cepa de la cual procede.
•
Cualquier falla en el equipo, aunque sea momentánea, puede desestabilizar el pro ceso y echar a perder la elaboración del
y los microrganismos D ia g r a m a 3 7 : Un reactor de flujo tapón.
compuesto de interés.
Las ventajas y las desventajas del cultivo continuo en relación con el cultivo en lote Las principales ventajas del cultivo continuo, en relación con el cultivo en lote, son: •
Es posible controlar la velocidad específi ca de crecimiento del microorganismo (dentro de sus límites metabólicos).
•
Se puede estudiar el efecto de algún pará metro (por ejemplo, el efecto de limitación de uno de los sustratos) sobre la actividad metabòlica del microorganismo.
•
El crecimiento del microorganismo se puede realizar en las condiciones óptimas.
•
Se elimina la fase de latencia, por lo que se reduce el tiempo real de producción del compuesto de interés.
•
Se aumenta la productividad por unidad de tiempo, ya que se elimina el tiempo empleado en la esterilización del medio así como en la limpieza y la preparación del reactor. El tiempo requerido para el arranque del equipo (limpieza, esteriliza ción y carga del equipo) se conoce como "tiempo muerto".
cXrtii.ro 3:
LAS FERMENTACIONES
La recuperación Y LA PURIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS Las etapas de recuperación y purificación re presentan una parte muy importante en el proceso de obtención del compuesto de inte rés; se desea recuperar el máximo de produc to, en el mínimo tiempo, con el mayor grado de pureza y al mínimo costo. Cliffe (1996) re porta que estas etapas pueden representar el 60% de los costos totales de producción, ex cluyendo los costos de materia prima. Si las etapas de recuperación y purificación no se manejan en forma adecuada, los costos pue den aumentar hasta ocasionar que el proceso no sea rentable. Al finalizar la fermentación, el caldo contiene una mezcla de compuestos, tales como: biomasa, restos de sustratos no utilizados por la célula y metabolitos primarios y secundarios. El método empleado para separar y purificar el compuesto deseado se escoge de acuerdo con los siguientes factores: •
El tipo y la estabilidad del producto
•
La concentración del producto
____________ 53
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•
La presencia y la naturaleza de otras sus tancias en el caldo de fermentación
•
El grado de purificación mínimo requerido
•
La localización del producto con respecto de la célula (extracelular o intracelular)
•
El uso que se le va a dar al producto y su precio de venta.
Con base en estos criterios, es más sencillo de finir el camino por seguir para obtener el pro ducto purificado. Algunos de los procedimientos necesarios pa ra recuperar y purificar el producto final son comunes a muchos de los procesos, mientras que otros son específicos. A continuación se describen los más utilizados. En los capítulos posteriores se estudiarán ejemplos concretos de producción, recuperación y purificación de productos. Puede complementar el material sobre procedimientos para recuperación y pu rificación de productos en el libro Las operacio nes de ¡a ingeniería de los alimentos, de Brennan et al. (1980), capítulos 4 , 6 , 7 , 9 y 13.
La separación líquido-sólido La separación líquido-sólido es necesaria cuando la fermentación se lleva a cabo en un medio de cultivo líquido; consiste en separar los sólidos (biomasa celular y compuestos insolubles) del caldo de fermentación. En algu nos casos, el compuesto de interés es el sólido (la biomasa), mientras que, en otros, este se encuentra en el líquido. Se puede realizar por diferentes métodos:
La filtración La filtración es el método de separación de una mezcla líquido-sólido que se emplea con más regularidad; consiste en hacer pasar la mezcla por filtros con poros que retienen las partículas y dejan pasar el líquido. La eficien cia de la filtración depende de: •
El tamaño del microorganismo y su mor fología
•
La presencia de capas mucosas en el mi croorganismo
•
La viscosidad y el pH del caldo de fer mentación.
Dos de los tipos de filtros más utilizados para realizar esta operación son el filtro prensa y el filtro rotatorio al vacío. El filtro prensa es utilizado en los procesos con tinuos y semícontinuos. En este tipo de filtro, se ejerce una presión mayor que la atmosféri ca al bombear el caldo de fermentación dentro del filtro, lo cual produce el flujo de! filtrado a través del sistema. Se alternan placas cubier tas por filtros a ambos lados, con marcos me tálicos, como se muestra en el Diagrama 3.8. Todo el sistema -los filtros, las placas y los marcos- se une por mecanismos hidráulicos. El caldo de fermentación se introduce en un
Marco
• La filtración • La centrifugación • La floculación • La flotación.
*
Filtrado
D iagrama 3.8: El filtro prensa.
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canal (en el diagrama se indica como "entrada del caldo de fermentación"), que se forma en las esquinas del sistema, y pasa por los mar cos metálicos; los sólidos quedan retenidos en el filtro, mientras que el filtrado sale por las placas filtrantes. El filtro rotatorio al vacío se emplea principal mente en procesos discontinuos, tales como la recuperación de hongos y bacterias del caldo de fermentación. Está compuesto por un tam bor cilindrico sumergido hasta la mitad en el líquido por separar (también conocido como papilla de alimentación). La superficie del tambor tiene varios compartimentos separa dos por tabiques y está cubierta por un filtro. Cada compartimento se encuentra conectado al eje por medio de una tubería, según se ob serva en el Diagrama 3.9. El tambor gira y, por vacío, empieza el proceso de separación: la papilla ingresa por succión en cada comparti mento, los sólidos quedan retenidos en el filtro y el filtrado se va por las tuberías hacia el cen tro del tambor, donde es recuperado. Des pués, los sólidos son separados del filtro por inyección de aire comprimido en la superficie del mismo y con la ayuda de una cuchilla.
La centrifugación La centrifugación es una operación en la que se separan sustancias por medio de la fuerza centrífuga. El método se basa en la diferencia de densidad entre el sólido y el líquido; tam bién puede utilizarse para separar dos líqui dos con densidades muy distintas. Es más ca ro que la filtración y se utiliza cuando esta úl tima operación es muy lenta. El éxito de su aplicación depende de la diferencia de densi dad entre los sólidos (la biomasa) y el líquido, la viscosidad del líquido y el tamaño de las cé lulas del sólido. Hay una gran variedad de centrífugas; la se lección de una se realiza de acuerdo con el pro ceso específico de recuperación; sin embargo, las que se emplean con mayor frecuencia en los procesos de fermentación son la centrífuga de discos y la centrífuga de filtro o tamiz. La centrífuga de discos se utiliza para procesos de separación a gran escala; está compuesta por una serie de conos metálicos conocidos co mo discos, separados entre sí por espacios muy pequeños. Es de mucha utilidad en la se paración de Equidos de diferente densidad. Durante la centrifugación, los sólidos, o el lí-
Torta
Tabiques de separación Cuchilla
Entrada del caldo de fermentación Salida del filtrado Caldo de fermentación filtrado Tuberías
D iagram a 3 .9 :
CA rtm oJ
El filtro
Caldo de fermentación
ro ta to rio .
LAS FERMENTACIONES
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En la flotación, se introduce un gas en el caldo de fermentación. Las células sólidas se adsor ben en las burbujas y suben a la superficie co mo una capa de espuma; ahí son recolectadas.
La desintegración celular
quido más denso, quedan retenidos en el bor de de los discos y el líquido es eliminado por la parte superior de la centrífuga. El Diagrama 3.10 corresponde a una de estas centrífugas. En la centrífuga de filtro o tamiz la separación se produce cuando el caldo de fermentación es forzado contra un material filtrante y, por la acción de la fuerza centrífuga, el líquido pasa a través de los filtros y los sólidos quedan re tenidos en ellos.
La floculación y la flotación La floculación y la flotación son métodos de separación de una mezcla líquido-sólido em pleados con menos frecuencia que los dos an teriores; generalmente, se aplican para au mentar la eficiencia en la filtración o en la cen trifugación. La floculación consiste en una separación de los sólidos por agregación y sedimentación. El proceso se puede llevar a cabo calentando la suspensión o adicionando sustancias quí micas que actúan como agentes floculantes; así, las células forman aglomerados que sedi mentan. Este método es útil cuando las célu las son muy pequeñas y no es posible su sepa ración mediante centrifugación o filtración.
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Esta etapa es imprescindible cuando el mi croorganismo no excreta el metaboíito de inte rés al caldo de fermentación. Consiste en romper la pared y la membrana celular del microorganismo. El método por escoger va a depender de cuán fuerte es la pared celular; por ejemplo, las bacterias Gram positivas y las levaduras son mucho más difíciles de romper que las bacterias Gram negativas o los hongos filamentosos. La desintegración celular se puede llevar a cabo por métodos físicos, quí micos o biológicos; sin embargo, los más utili zados son los físicos. El daño mecánico a la pa red celular de los microorganismos es uno de los métodos más comunes y se puede ejecutar con un molino de bolas. El principio de su funcionamiento radica en romper las células por efecto de la fricción que sufren al ser so metidas a altas velocidades de mezclado, en presencia de bolas de diferentes materiales (vidrio, cerámica u otros). La hontogeneización también es utilizada v consiste en someter la biomasa a altas presiones, provocando "fuer zas de corte" que rompen las células y liberan los compuestos contenidos en ellas.
La extracción líquido-líquido La extracción líquido-líquido es la operación en la que una sustancia disuelta en una fase lí quida (disolvente original) es transferida a otra fase también líquida (segundo disolven te). Para que la operación sea exitosa, los di solventes deben ser insolubles entre sí y la sus tancia de interés debe ser más soluble en el se
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gundo disolvente que en el original. Esta ope ración se puede aplicar cuando el compuesto de interés se encuentra disuelto en el caldo de fermentación. Para aplicar el procedimiento, es básico conocer las propiedades de solubili dad del metabolito. También es factible variar algunas condiciones fisicoquímicas para mo dificar la solubilidad del compuesto; por ejem plo, si se varía el pH de la disolución, la solu bilidad del compuesto en un solvente orgáni co puede variar también. La recuperación del producto se hace revirtiendo las propiedades de solubilidad o evaporando el solvente. Al gunos solventes utilizados son: acetona, ésteres, butanol y reguladores de pH (buffers).
La cristalización La cristalización, como su nombre lo indica, es la formación de cristales en un líquido. Es muy utilizada para la purificación de los metabolitos obtenidos en los procesos de fermen tación. La cristalización se puede llevar a ca bo por enfriamiento, por evaporación o por adición de una tercera sustancia (compuesto químico) que provoca la precipitación del compuesto de interés, o que disminuye su so lubilidad. Este proceso se aplica cuando los productos requieren altos grados de pureza. La cristalización se utiliza en la recuperación del ácido cítrico y de algunos aminoácidos.
O í/ U o í:
LAS FERMENTACIONES
La cromatografía La cromatografía es una técnica de separación de sustancias en un soporte (puede ser una columna) que contiene una fase estacionaria. Los componentes de una mezcla se transpor tan a través de la fase estacionaria por medio de una fase móvil que fluye. La separación se basa en las diferencias de velocidad de migra ción entre los componentes de la mezcla. Los componentes deben ser solubles en la fase móvil y deben ser capaces de interaccíonar con la fase estacionaria, ya sea disolviéndose, adsorbiéndose o reaccionando con ella. La cromatografía es de los procesos más caros y sirve para purificar compuestos metabólicos que se encuentran en una concentración muy pequeña. Se emplea para la separación de compuestos utilizados en la industria farma céutica y también en investigaciones. Las téc nicas cromatográficas se pueden clasificar, se gún el mecanismo de separación, en: croma tografía de adsorción, de intercambio iónico, de filtración en gel y de afinidad. Para ampliar el tema sobre las diferentes téc nicas de separación cromatogràfica puede es tudiar el Capítulo 24 del libro Análisis instru mental (Skoog y West, 1987).
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EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIÓN
1. Comente las diferencias, en relación con el concepto de fermentación, entre los puntos de vista bioquímico y microbiología). 2. Refiérase a las formas más comunes de clasificación de los procesos fer mentativos. 3. Cite algunos productos de interés industrial obtenidos por fermenta ción. 4. Explique las rutas bioquímicas más utilizadas para producir metabolitos, a partir de las sustancias orgánicas, en un proceso de fermentación. 5. Respecto a un fermentador: a) Explique en qué consiste. b)
Mencione cinco características que debe poseer.
6. Mencione los tipos de reactores más utilizados. 7. Explique brevemente en qué consisten los procesos de cultivo en lote y de cultivo continuo. 8. ¿Por qué es importante conocer, antes de aplicar un sistema de fermen tación, en qué fase de crecimiento del microorganismo se produce el compuesto de interés? 9. Explique las dos técnicas básicas de cultivo continuo. 10. Mencione las ventajas y las desventajas del sistema de cultivo continuo en relación con el cultivo en lote. 11. Mencione las características de los procesos de recuperación y purifi cación del compuesto de interés en una fermentación. 12. Cite los métodos más utilizados de recuperación y purificación de com puestos obtenidos mediante fermentación, y los criterios que se siguen para escoger uno determinado.
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FUENTES Y LECTURAS RECOMENDADAS
BLAKEBROUGH, N. 1967. "Industrial fermentations". Cap. 2. En: Biochemical and
biological ettgineering science. Vol. 1. New York: Academic Press. B ro w n , A. 1990. "Fed-batch and continuous culture". Cap. 5. En: Fermentation:
a practical approach. Oxford: University Press. B u rto n , D. y J. R o u th . 1977. Química orgánica y bioquímica. México: Editorial
Interamericana. Cuffe, K. 1996 a. "Biorreactores". Cap. 14. En: Biotecnología para ingenieros: sis temas biológicos en procesos tecnológicos. México: Editorial Limusa. . 1996 b. "Procesos de línea de salida". Cap. 15. En: Biotecnología para in
genieros: sistemas biológicos en procesos tecnológicos. México: Editorial Limusa. COLE Parmer 2001-2002. Catálogo comercial. U.S.A.: Cole Parmer. Pág. 362. CRUECER, W. Y A. CRUEGER. 1989. Biotecnología: Manual de microbiología industrial.
España: Editorial Acribia. DE ABATE, J. Biología aplicada. 1982. San José: EUNED. G a r c ía , V. 1995. Introducción a ¡a microbiología. San José: EUNED. H u tt, R. 1967. "Recovery of fermentation products". Cap. 7. En: Biochemical
and biological engineering science. Vol. 1. New York: Academic Press. IRVINE, T. 1990. "Laboratory fermenters". Cap. 2. En: Fermentation: a practical
approach. Oxford: University Press. MARISON, I. 19%. "Cinética del crecimiento". Cap. 10. En: Biotecnología para in
genieros: sistemas biológicos en procesos tecnológicos. México: Editorial Limusa. QUINTERO, R. 1993. Ingeniería bioquímica: teoría y aplicaciones. México: Alhambra
Mexicana, Rhodes, A. Y D. F le tc h e r . 1969. Principios de microbiología industrial. España:
Editorial Acribia. STANBURY, P. Y A. W h ita k e r. 1987. Principles of fermentation technology. Great
Britain: Pergamon Press.
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CAPÍTULO 4
LOS PRODUCTOS
S u m a rio
Introducción El yogur los quesos La natilla El suero de queso Los probióticos
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OBJETIVOS
a)
Citar los productos obtenidos por fermentación de la leche.
b)
Describir cada etapa de los procesos de elaboración del yogur, el queso y la natilia.
c)
Explicar la función de los microorganismos que intervienen en la fermentación de la leche, para obtener el yogur, el queso y la natilla.
d)
Describir las condiciones necesarias para que se lleven a cabo los procesos de elaboración del yogur, el queso y la natilia.
e)
Respecto a los productos probióticos:
64
•
Definirlos
•
Citar los requisitos que deben poseer
•
Citar las ventajas que le proporcionan al producto fermentado.
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In t r o d u c c ió n La leche es un líquido segregado por las glándulas mamarias de las hembras de los mamíferos; es blanca y opaca, posee un sabor dulce y un pH cercano a 7. Está compuesta por agua, grasa y sólidos no gra sos. Los sólidos no grasos comprenden las proteínas, la lactosa y las cenizas, mientras que los sólidos totales (ST) incluyen el contenido de los sólidos no grasos y de la grasa. La composición promedio de la leche de vaca se observa en el Cuadro 4.1. Cuadro 4.1
LA COMPOSICIÓN PROMEDIO DE LA LECHE DE VACA Constituyente
Variación
Promedio
% p/v
% p/v
Agua
70,00-90,50
87,00
Grasa
2,20-8,00
3,80
Proteínas
2,70-4,80
3,50
Lactosa
3,50-6,00
4,90
Cenizas
0,65-0,90
0,80
Sólidos totales
9,05-19,70
13,00
Sólidos no grasos
6,85-11,70
9,20
Fuente: Adaptado de Revilla (1982).
La leche dentro de la ubre de una vaca sana se encuentra prácticamente estéril; sin embargo, es contaminada por microorganismos en el canal del pezón. El número de microorganismos del líquido au menta sensiblemente durante el ordeño y durante las operaciones de manipulación antes de ser refrigerado. La contaminación microbia na proviene de varias fuentes, entre las que se pueden mencionar: el cuerpo de la vaca, los utensilios y el equipo utilizados para el orde ño, las personas, los insectos y el medio. Todas estas fuentes de con-
G *w u > 4
LOS PRODUCTOS LÁCTEOS
65
§fí!5d material
taminación hacen que, en condiciones higiéni cas, la leche cruda posea un contenido prome dio de microorganismos de 10s U FC 7m ¿; si tiene una carga microbiana mayor, se dice que no es apta para el procesamiento. La mayoría de los microorganismos presentes en la leche cruda son bacterias no patógenas, que pertenecen a los géneros Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Propionibacterium y Lactobacillus, pero también se pueden encon trar microorganismos patógenos (por ejem plo, coliformes). La presencia de la alta carga microbiana inicial (10- UFC/m¿ ) y la compo sición rica en nutrimentos de la leche, hacen que los microorganismos se reproduzcan rápi damente v la fermenten en condiciones ambientales, por lo que la vida útil de este pro ducto es muy corta. A pesar de esas caracte rísticas, el hombre aprendió a aplicar ciertos procedimientos para impedir el proceso de fermentación o, a manipular las condiciones para obtener provecho de él. La fermentación de la leche es una de las prác ticas más antiguas en lo que se refiere a la con servación de los alimentos; su utilización se menciona en el Antiguo Testamento. Se des cubrió -por accidente- al almacenar el fluido recién ordeñado en recipientes: después de un determinado periodo, al abrir los recipien tes, el producto tenía un olor ácido y se había separado en dos fases: una líquida y semi transparente y otra semisólida con grumos de color blanco y sabor agradable. Con el paso del tiempo, el hombre desarrolló métodos para elaborar una gran variedad de leches fermentadas, cuyas propiedades de penden de los microorganismos que partici pan en la fermentación, del lugar donde se produce y hasta del tipo de animal del cual se
extrae la leche. Algunas de estas leches fer mentadas son conocidas como kefir, koumiss, leche búlgara, ¡eche acidófila y yogur. En Costa Rica, por ejemplo, principalmente en las zo nas rurales, se consume leche agria, que es una leche fermentada por medio de la flora asocia da, es decir, con los microorganismos que se encuentran en la leche cruda, aunque también puede ser producida por inoculación de mi croorganismos específicos. Las leches fermentadas tienen algunas venta jas sobre la leche fluida, entre ellas: un au mento del valor nutricional y una mayor digestibilidad (por la hidrólisis de las proteínas y la fermentación de la lactosa); además, se les ha atribuido cierto poder medicinal y su con sumo se ha relacionado con un aumento de la longevidad en las personas. A causa de la gran variedad de productos lác teos que se pueden obtener por fermentación, en el capítulo se estudiarán únicamente algu nos de ellos, principalmente los de mayor consumo e importancia en este país.
EL YOGUR
Definición El yogur es un producto que se obtiene al fer mentar la leche utilizando un cultivo mixto formado por las bacterias Lactobacillus delbrueckii, subespecic bulgaricus, y Streptococcus salivarius, subespecie thernwphilus. Como re sultado de la fermentación, se produce ácido láctico -a partir de la lactosa presente en la le che- y una serie de compuestos que le impar ten al yogur un sabor y un aroma típicos. El yogur debe tener una consistencia suave y homogénea así como estar libre de suero y grumos. Para evaluar sus características, se deben tomar en cuenta los siguientes aspectos:
UFC: unidades forma doras de colonias.
M ICRO BIO LOGÍA INDUSTRIAL / A i ¡CIA HERNÁNDEZ
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aroma, sabor (acidez), cuerpo (viscosidad o consistencia) y textura (ausencia de grumos).
Historia Según las fuentes históricas, el yogur tuvo su origen en el Medio Oriente hace muchos si glos; sin embargo, los productos a los que se refieren en esa época son en realidad varias le ches fermentadas en forma empírica, con la participación de los microorganismos presen tes en la leche o en el medio, pues -com o se recordará- el descubrimiento de los microor ganismos y sus características se llevó a cabo a finales del siglo XVII y su utilidad y sus fun ciones se detectaron y desarrollaron en el si glo XIX. Desde sus orígenes, las leches fermentadas han sido ingeridas por sus propiedades medi cinales para el alivio de desórdenes estomaca les, intestinales y del hígado. Durante la pri mera mitad del siglo XX, un bacteriólogo ruso de apellido Metchnikoff relacionó la buena sa lud y la longevidad de los campesinos de los Balcanes con el consumo de un producto fer mentado, a partir de leche, al cual le llamaban Yahourth. Por este motivo, se considera que las leches fermentadas fueron las precursoras de lo que hoy se conoce como yogur. Después de la Segunda Guerra Mundial, la tecnología del yogur tuvo un avance muy sig nificativo. Actualmente, el consumo del pro ducto está muy difundido a escala mundial y, en Costa Rica, cada día gana más adeptos. En el mercado nacional, el yogur es fabricado y distribuido por varias industrias; cada una de ellas ofrece a! consumidor una gran variedad de sabores, consistencias y presentaciones.
C v*u o *
LOS PRODUCTOS LÁCTEOS
Los tipos de yogur Existe una gran variedad de yogures que di fieren entre sí por varios factores, entre ellos: el proceso de elaboración, la adición de saborizantes y la forma de presentación. En Costa Rica, el yogur más consumido es el yogur bati do, que contiene diferentes frutas; le sigue el yogur líquido, cuya introducción en el mercado es más reciente. El yogur firm e y el batido son dos tipos de yo gur que difieren en el proceso de elaboración. En el yogur firm e, la leche inoculada con los microorganismos se debe empacar en los reci pientes definitivos antes de que se inicie la fermentación, o sea, la fermentación se lleva a cabo en el mismo recipiente en el que será dis tribuido el producto. Si se desea agregarle frutas, se adicionan en el fondo del envase an tes de la leche. El yogur batido (también cono cido como yogur a granel) es producido en tanques de fermentación y se empaca una vez que las frutas o los saborizantes hayan sido mezclados con el yogur. El yogur natural no contiene ningún ingredien te adicional (como saborizantes o frutas), mientras que el yogur de frutas posee frutas en trozos o en forma de puré. El yogur líquido se puede describir como un yogur batido de menor viscosidad. Se obtiene a partir de una leche con un bajo contenido de sólidos totales (11% p/v) o mezclando iguales cantidades de agua y yogur; sin embargo, una desventaja de este último método es que, a ve ces, se separan la fase líquida y la fase sólida. El yogur bajo en calorías posee poca grasa (me nos del 1%) y de carbohidratos (azúcares). El consumo de este tipo de yogur se ha elevado mucho en la época actual, en la que existe una creciente preocupación por la calidad de los alimentos que se ingieren y, sobre todo, por su contenido de calorías. ___________ 67
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Existen otros tipos de yogur, como el yogur congelado, el yogur deshidratado y el yogur de ba jo contenido de lactosa, que no serán estudiados en este texto, pues su consumo no está muy difundido en Costa Rica. Para profundizar en el tema, puede revisar el libro de Tamine y Rob in s o n (1987).
El proceso de elaboración del yogur batido En el Esquema 4.1, se representan las etapas del proceso general para la elaboración de yo gur batido; se seleccionó ese tipo de yogur por que es el de mayor distribución en este país. Materia prima
La materia prima El yogur se elabora tanto con leche entera co mo descremada,* preferiblemente de vaca, aunque en otros países se emplea leche de ca bra, de yegua o de búfala. También, puede utilizarse leche en polvo reconstituida. La le che debe estar libre de antibióticos, porque su presencia inhibe el desarrollo de los microor ganismos que llevan a cabo la fermentación. El contenido de sólidos totales (ST) es vital en el proceso de elaboración de este producto. En general, el contenido de ST adecuado para la elaboración de yogur es de 15 a 16%; entre mayor sea su contenido, mayor será su visco sidad. Como la leche contiene un 13% de ST en promedio (ver Cuadro 4.1), este porcentaje se debe aumentar. Para reforzar el estudio de este material, reali ce la siguiente actividad: Analice las etiquetas de los yogures que se expenden en Costa Rica: haga una lista de los ingredientes utilizados e identifique su función en el producto.
Cultivo iniciador
La estandarización Para aumentar el contenido de sólidos totales en la leche, primero es necesario estandarizar la cantidad de grasa. Bottazzi (1983) reporta que el contenido de la grasa del yogur debe estar entre el 0,5%, en el caso del descremado, y el 3,5%, en el caso del entero.
Frutas
Es posible elaborar yogur sin aumentar el con tenido promedio de sólidos totales de la leche, pero el gel que se forma es muy débil y se romLa leche entera (o simplemente leche) es la que tie ne los componentes en sus cantidades originales. Esquema 4.1:
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Las etapas del proceso de elaboración del yogur batido.
La leche descremada es la que contiene 0,5%, o me nos, de grasa.
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pe con mucha facilidad, lo que provoca la se paración del suero de la leche. Para elevar la cantidad de sólidos totales, existen varias op ciones. Tradicionalmente, se concentraba la le che disminuyendo su volumen en una tercera parte, por medio de la evaporación del agua presente en ella. Actualmente, se prefiere agregar leche descremada en polvo u otros só lidos de la leche hasta alcanzar el contenido de los sólidos totales requerido, porque es un pro ceso más práctico y barato. Otros métodos uti lizados, aunque con menos frecuencia, para aumentar el contenido de sólidos totales son la ultrafiltradón y la ósmosis inversa. Para contrarrestar los efectos negativos sobre la viscosidad y la fuerza del gel, por causa del bajo contenido de los sólidos totales en la le che, también se recurre a la adición de estabi lizantes, que mejoran el cuerpo, la textura y la apariencia del yogur. Algunos comúnmente utilizados son el almidón, la carragenina, los alginatos, la goma de algarrobo, la gelatina y la pectina. Los estabilizantes se deben agregar durante la estandarización de la materia pri ma. El contenido de los estabilizantes en el yogur no debe superar el 0,3%, porque provo can consecuencias adversas en el sabor.
La homogeneización La etapa de homogeneización generalmente se lleva a cabo antes de la pasteurización, pe ro puede ser realizada después. Consiste en someter la leche a altas presiones (entre 2,6 y 6,8 kP*a) con el fin de disminuir el tamaño de las gotas de grasa y otros constituyentes y, así, que se dispersen mejor. El resultado es un yo gur más viscoso, más estable y con mejores ca racterísticas organolépticas.
*
La pasteurización La pasteurización es una de las etapas más importantes de este proceso porque: •
Se elimina la mayor parte de la flora con tenida en la leche. La disminución de la flora asociada a la leche permite el creci miento de los microorganismos (produc tores del yogur) libres de competencia, con todos los nutrimentos de la leche a su disposición.
•
Se logra la inactivación de enzimas que afectan las características organolépticas del yogur.
•
Se desnaturalizan las proteínas de la leche. Mediante la desnaturalización de las pro teínas, se liberan péptidos que contribu yen al crecimiento de los microorganis mos inoculados. Además, la modificación de la estructura de las proteínas favorece su agregación, lo que mejora la viscosidad del yogur y su capacidad de retención de agua, e impide la separación del suero de la leche.
Existe una gran gama de temperaturas y tiem pos asociados a la pasteurización de la leche, de acuerdo con el proceso de fabricación del yogur y el equipo disponible para realizarla. Algunos ejemplos son los siguientes: de 80 a 85 °C por treinta minutos, o a 90 °C por cinco minutos, para leche procesada por lotes; entre 72 y 75 °C por dieciséis segundos, si se utiliza equipo especializado. Se debe tomar en cuenta que un calentamien to débil de la leche genera un yogur bajo en viscosidad, mientras que un sobrecalenta miento puede provocar una textura granular y una tendencia a la separación del suero.
latm = 101325Pa,
Ginrwo* LOS PRO D U C TO S LÁCTEOS
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El enfriamiento pospasteurización Después de la pasteurización, la leche debe ser enfriada hasta la temperatura necesaria para el crecimiento óptimo de los microorga nismos, que oscila entre los 40 y 45 °C. El en friamiento se puede llevar a cabo de dos for mas: •
Se hace pasar la leche por un intercambia dor de calor de placas F ig u r a 4 .1 :
•
En el mismo tanque de pasteurización, se hace pasar agua fría (en lugar de caliente) por la camisa del reactor (ver el Diagrama 3.3).
La inoculación y la fermentación El cultivo iniciador se encuentra compuesto por los microorganismos S. thermophilus y L. bulgaricus en una relación 1:1, la cual garanti za una adecuada consistencia del yogur y un agradable aroma. Los cultivos iniciadores o starters utilizados en Costa Rica para la fer mentación de la leche son microorganismos liofilizados que se venden en dos presentacio nes, según la manera de aplicarlos: •
•
70
Para "reconstituir". Se preparan cultivos madre y se hacen los traspasos necesarios de acuerdo con el volumen de yogur por producir. Para preparar el cultivo madre, se inocula el cultivo iniciador en un ma traz con leche estéril y se coloca en las con diciones óptimas de desarrollo. Para "aplicación directa". Se adiciona el contenido de los sobres directamente a la leche pasteurizada. La Figura 4.1 muestra matraces con cultivo madre listo para ser inoculado en la leche.
Un cultivo d e microorganismos para la preparación de yogur. Fuente: Fábrica de yogur ¿a rueda.
El cultivo iniciador se inocula en una propor ción que oscila entre el 1 y el 5% v/vde la can tidad de leche inicial que se utiliza. Se debe mezclar muy bien con la leche para asegurar una adecuada distribución de los microorga nismos. En este momento, empieza el proceso de fermentación. La fermentación se realiza durante un promedio de tres a seis horas, a una temperatura entre los 40 y 45 °C. El tiempo de fermentación depende de la temperatura de in cubación y de la capacidad de producción de ácido láctico de los microorganismos. El proce so se debe detener cuando se alcanza una con centración de ácido láctico entre 0,70 y 1,1% p/v En este rango de concentración de ácido, el valor del pH se encuentra entre 4,6 y 3,7.
El enfriamiento posfermentación Cuando se alcanza la acidez deseada, se debe detener el proceso de fermentación. Para de tener la fermentación, se disminuye la tempe ratura, porque los microorganismos involu crados en el proceso no son capaces de crecer a temperaturas inferiores a 10 °C; además, a bajas temperaturas, se suspende la actividad de las enzimas generadas por los microorga nismos. La temperatura recomendada es la de refrigeración (5 °C). El enfriamiento, a la vez,
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tiene un efecto positivo, pues aumenta la fir meza del gel.
La agitación y la adición de frutas La adición de frutas al yogur le confiere una mayor aceptación por parte del consumidor. En Costa Rica, se agregan al yogur una gran variedad de frutas, entre las cuales se pueden mencionar: fresa, melocotón, mora, guanába na, mango, guayaba, naranja, naranjilla y combinaciones de ellas. Una vez que el yogur se encuentra frío, se de be agitar cuidadosamente para romper el coá gulo o gel; si la agitación se realiza en forma brusca, el yogur pierde su viscosidad. Duran te esta etapa, se adiciona la fruta, previamen te preparada en forma de trozos o puré, en porcentajes que varían desde el 5 al 25% del producto final. Las frutas deben recibir trata miento térmico previo, ya que, de lo contrario, son fuente de hongos y levaduras que conta minarán el yogur y disminuirán su vida útil.
El empaque Cuando el yogur se ha enfriado y se le han agregado las frutas, el producto se empaca. Los recipientes deben ser resistentes, imper meables y de un material que no reaccione con el producto para protegerlo de alteracio nes físicas, químicas y de microorganismos. Después de empacado, el yogur debe conser varse en refrigeración con el fin de aumentar su vida útil, que se calcula en un mes.
El proceso de elaboración de yogur firme Para fabricar el yogur firme, se varía el orden de las etapas de elaboración del yogur batido.
o ttn ju , 4-
LOS PRO D U C TO S LÁCTEOS
La mezcla se coloca en los empaques de distri bución inmediatamente después de que se inocula la leche y, allí, se realiza la fermenta ción. Cuando el yogur contiene frutas, estas deben colocarse en el recipiente antes de agre gar la mezcla de fermentación. El resto de las etapas y las condiciones del proceso es similar a las del yogur batido.
La producción de "yogur" en forma casera En la actualidad, existen máquinas para hacer yogur a muy pequeña escala, pero estos equi pos son poco utilizados en nuestro país. Sin embargo, muchas amas de casa fabrican un producto que llaman "yogur", el cual, en rea lidad, es una leche fermentada de composi ción variable, pues depende de la flora micro biana contenida en el inoculo utilizado para su elaboración. El inoculo tiene forma de gra nos de color blanco, conocidos como "gusanitos" por su apariencia. El principio de prepa ración es básicamente el mismo utilizado pa ra el yogur industrial, aunque las condiciones de producción son muy diferentes. Los gra nos se colocan en la leche que se quiere trans formar, el recipiente se tapa y se deja a tempe ratura ambiente por tres o cuatro días hasta que la leche cuaje. Luego, el producto se pasa por un colador, con el fin de recuperar el ino culo y el yogur se puede consumir. Por últi mo, los granos retenidos en el colador se la van y quedan listos para volver a ser inocula dos en leche. Como se mencionó, este "yogur" se debería de nominar leche fermentada, pues los análisis microbiológicos de los granos (que son en rea lidad un conglomerado de microorganismos con restos de leche) muestran la presencia de bacterias lácticas, pero también de gran canti dad de coliformes y otros microorganismos
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muy diferentes a Lactobacillus bulgaricus y a Streptococcus therniophilus. Por otra parte, a partir de las características de producción, tales como la consistencia de los granos, el "yogur" se parece más al producto conocido como kefir. Se debe tener presente que la manipulación incorrecta del conglomerado de microorganis mos puede originar un producto contamina do con algún microorganismo patógeno (per judicial para el ser humano).
La microbiología y la bioquímica de la fermentación del yogur Los microorganismos encargados de convertir la leche en yogur (Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus) son bacterias Gram positivas, y producen ácido láctico como metabolito principal (son homofermentativas). Estos microorganismos crecen en forma ópti ma en un intervalo de temperatura entre los 40 y 45 °C; su metabolismo se detiene a tempera turas por debajo de los 10 °C. L. bulgaricus es capaz de fermentar fructosa, galactosa, gluco sa y lactosa, mientras S. thermophilus puede fermentar glucosa, fructosa, lactosa y sacarosa. Ambos microorganismos tienen requerimien tos nutricionales complejos que son suplidos por la leche; utilizan la lactosa como fuente de energía y la transforman en ácido láctico. Además del ácido láctico, durante el metabo lismo de los microorganismos, se producen al gunos metabolitos que son los responsables del aroma característico del yogur; entre ellos, los más importantes son: el acetaldehído, el diacetilo y la acetoína. También, se obtienen ácidos volátiles, tales como: el fórmico, el acé tico, el propiónico, el butírico, el isovalérico y el caproico, los cuales sinèrgicamente con los metabolitos mencionados originan el aroma característico del yogur. El acetaldehído es la
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sustancia responsable del aroma que se en cuentra en mayor concentración en el yogur (entre 23 a 55 ppm); se produce por la vía de Embden-Meyerhof (Caída et ai., iw). Los dos microorganismos actúan en forma si nèrgica: las bacterias se estimulan mutua mente. Ambas especies pueden crecer en un pH bajo, pero S. thermophilus crece mejor al inicio de la fermentación cuando el pH es alto. El pH disminuye durante la fermentación, por la producción de ácido láctico, hasta alcanzar un valor inferior a 5,5. La acidez, el consumo de oxígeno y la liberación de sustancias volá tiles que produce este microorganismo, crean las condiciones ideales para que se desarrolle L. bulgaricus. Por otro lado, al liberar aminoá cidos de la caseína, el bacilo estimula el creci miento de S. thermophilus y, entonces, se pro ducen ácidos grasos y acetaldehído. Otro efecto positivo de la disminución del pH es la inhibición de los microorganismos que no cre cen en ambientes tan ácidos, como la Salmone¡la, el Staphylococcus aureus y otros microorga nismos que pueden deteriorar el producto. Desde el punto de vista bioquímico, la lactosa es hidrolizada dentro de la célula bacteriana por una lactasa, en unidades de glucosa y ga lactosa. La glucosa es metabolizada por la vía de Embden-Meyerhof, como se explicó en el Capítulo 3, hasta ácido pirúvico, el cual se convierte en ácido láctico por la acción de la deshidrogenasa láctica presente en ambos mi croorganismos. Por otro lado, ambas bacte rias carecen de la enzima alcohol deshidroge nasa, por lo que son incapaces de transformar el acetaldehído en etanol. La proporción en la que se inoculan los mi croorganismos, según se mencionó, es de 1:1 (Streptococcus; Lactobacillus). Al final de la fer mentación, la proporción en que se hallan es tos microorganismos depende de las condicio-
M ICRO BIO LOGIA INDUSTRIAL / ALICtA HERNÁNDEZ
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Relación Streptococcus: Lactobacillus
1:1
2:1
41
42
1:2
44
43
□
Streptococcus
a
Lactobacillus
45
Temperatura (°C)
G ráfico 4.1:
La influencia de la temperatura sobre la proporción de las especies al final de la fermentación, en un cultivo de yogur. Fuente: Adaptado de Ellner (1997). R e la c ió n final de» m ic r o c x g a m s m o s Streptococcus: /ac fohacillus
O >
3
3 U
2
2,5
3
Tiempo de incubación (h) G ráfico 4.2:
La influencia de la cantidad de inoculo y el tiempo sobre la proporción de las especies al final de la fermentación, en un cultivo de yogur. Fuente: Adaptado de Ellner (1997).
nes de producción y se encuentra en función directa de las características organolépticas deseadas en el yogur. En el Gráfico 4.1, se re presenta la influencia de la temperatura sobre la proporción de las dos especies en el cultivo del yogur. Así, por ejemplo, a una temperatu ra de 43 °C, la proporción de microorganis mos al final de la fermentación es de 1:1, mientras que a 45 °C, se favorece la produc ción del Lactobacillus (relación 1:2) y se obtiene un yogur muy ácido.
gur a 42 °C durante dos horas y media, con una relación final de microorganismos de 1:1, es necesario inocular con una cantidad de cul tivo equivalente al 3% v/v de la leche que se desea fermentar. Si el yogur se produce en tres horas, se inocula la leche con un 2% del cultivo (en relación con la cantidad de leche empleada).
La cantidad de inoculo y el tiempo de fermen tación también influyen en las características del yogur (Gráfico 4.2). Para producir un yo
Algunas personas no toleran la leche: su con sumo les causa desórdenes estomacales; la si tuación se debe a que no poseen, en su siste-
CAfiTt'io4 LOS PR O D U C TO S LÁCTEOS
Aspectos nutricionales del yogur
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ma digestivo, ima enzima conocida como lactasa, encargada de descomponer la lactosa en sus azúcares constituyentes. Este problema de intolerancia a la leche no se presenta al consumir yogur, ya que, durante la fermenta ción de la leche, la lactosa es utilizada por los microorganismos como fuente de energía y, por lo tanto, su contenido se reduce. Varios estudios han revelado que la lactosa residual del yogur es hidrolizada por las bacterias lác ticas dentro del intestino del ser humano. Por otro lado, la digestibilidad de las proteínas presentes en la leche aumenta por la acción proteolítica de las enzimas producidas por las bacterias mencionadas. Asimismo, se reco mienda el consumo de yogur después de al gún desorden intestinal o después de un trata miento de antibióticos, pues ayuda en la rege neración de la flora intestinal.
descubrió que era un alimento de buen sabor. En la actualidad, se sabe que esa transforma ción de la leche en queso se debió a varios fac tores: la presencia de microorganismos, la temperatura de la leche transportada y, princi palmente, la presencia de la enzima conocida como renina o quimosina. La enzima se en cuentra en los estómagos de los temeros, las cabras y las ovejas, por lo que la leche se coa gulaba cuando era colocada en estos "reci pientes". No se sabe la fecha exacta en la que se fabricó queso por primera vez, aunque se han encon trado recipientes para su fabricación, en Egip to, que fueron utilizados miles de años antes de Cristo. A mediados del siglo XIX, su elabo ración se extendió a todas las granjas en Euro pa. Hoy, es una industria de grandes propor ciones a escala mundial v se fabrican muchas é variedades de quesos.
LOS QUESOS
Las características del queso
Los tipos de quesos
En la mayoría de los casos, el queso consiste en la fracción sólida que se obtiene por coagu lación enzimàtica de la leche. Básicamente, está compuesto por caseína (proteína de la le che), grasa, sales solubles e insolubles, agua, lactosa y albúmina. Desde el punto de vista nutricional, se considera que posee gran valor alimenticio por su contenido de proteínas, grasas, calcio, fósforo y vitaminas.
Se conocen en todo el mundo más de dos mil nombres de quesos; sin embargo, en realidad, hay menos de cincuenta tipos diferentes. Los distintos nombres que se les asignan a los quesos dependen del lugar de fabricación, de ligeras modificaciones en el proceso de elabo ración o, incluso, de la presentación de los quesos (tamaño, forma) y del método de con servación.
La fabricación del queso se produjo en forma accidental: antiguamente, se utilizaban los es tómagos de cabras y ovejas para transportar la leche y, durante el transporte, la leche se coa gulaba y se separaba en una fracción líquida (el suero) y otra semisólida (el queso). Sin co nocer el origen de aquellos cambios, la gente
Una clasificación muy general se fundamenta en si los quesos, después de obtenidos, han si do sometidos o no a un proceso de fermenta ción (maduración) con microorganismos. En esta clasificación, se denominan quesos madu rados y quesos frescos. En el Cuadro 4.2 se ex ponen algunos de estos tipos de queso.
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MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAI / ÁUCIA HERNÁNDfZ
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Cuadra 4,2
EJEMPLOS DE QUESOS MADURADOS Y FRESCOS Madurado
Fresco
Rarmesano
Queso Crema
Cheddar
Ricotta
Suizo
Requesón
Gruyere
Tierno
El proceso general de elaboración de quesos Aunque cada uno de los diferentes tipos de queso tiene un proceso de elaboración dife rente, muchas de las etapas son iguales. En el esquema siguiente se presenta un diagrama general para la producción de queso.
Roquefort
Materia prima
Camembert
En Costa Rica, la mayoría de la población con sume quesos frescos o ligeramente madurados; el consumo de quesos con procesos de madu ración extensos y de aquellos madurados con hongos, por ejemplo el Roquefort, no se encuen tra muy difundido; incluso, en el caso de los madurados con hongos, la presencia "física" de los microorganismos provoca rechazo. En Francia y en otros países, donde se puede decir que existe "una cultura del queso", el consumo de quesos madurados es muy alto. Otra clasificación general se realiza de acuer do con la textura de los quesos y los agrupa en: duros o de pasta dura, semiduros y suaves o de pasta blanda. La dureza del queso depen de principalmente de su contenido de agua. En los diferentes quesos duros, el contenido de agua oscila entre un 13 y un 34%, mientras que, en los quesos suaves, el contenido de agua puede ser hasta de un 60%. En nuestro país, existen varias empresas que se dedican a la elaboración de queso, pero, también, se produce en forma artesanal en la mayoría de las lecherías y, de ahí, es distribui do y expendido en las pulperías y en las ferias del agricultor.
E sq u em a 4 .2 :
Las etapas del proceso de elaboración del queso.
La materia prima y la estandarización La mayoría de los quesos se elaboran a partir de leche de vaca; sin embargo, también se uti lizan las leches de cabra, oveja, búfala, camella y yegua. En Costa Rica, el queso que se consu
Ortimo*: LOS PRODUCTOS LÁCTEOS
___________75
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me es producido con leche de vaca, aunque se puede encontrar una pequeña cantidad de queso de cabra preparado en forma artesanal.
de la leche cuando se adiciona la renina e in fluye en la textura, el aroma y la vida útil de los quesos.
De igual forma que en la elaboración de yo gur, la leche que se emplea debe cumplir cier tos requisitos de calidad; principalmente, po seer un bajo contenido de gérmenes y estar li bre de antibióticos. La composición de la le che depende de algunos factores, como la ra za del animal, la hora del ordeño, el periodo de la lactancia, la época del año y el tipo de la alimentación del animal, por lo que debe ser estandarizada antes de iniciar el proceso. Ge neralmente, se ajustan los contenidos de gra sas y de proteínas para que cumplan con los requerimientos mínimos de las normas vigen tes. El contenido de proteínas se complemen ta añadiendo caseinatos.
El cultivo iniciador que se agrega depende del tipo de queso que se va a elaborar. Si el queso es de pasta blanda se usan cultivos de acidifica ción rápida, como el compuesto por Lactococcus Indis, subespecie Indis y Lactococcus Indis, subespecie cremoris. Para obtener quesos de pas ta dura y firme, se utilizan cultivos con capaci dad proteolítica y lenta producción de ácido, por ejemplo, el formado por Lactobncillus cnsei y Leuconostoc citrovorum. En el Cuadro 4.3 se mencionan algunos tipos de quesos y el cultivo iniciador que se añade en su fabricación.
La pasteurización La pasteurización brinda tanto ventajas como desventajas en el proceso de elaboración de queso. La leche debe ser sometida a un trata miento térmico, antes de ser procesada, para eliminar los microorganismos patógenos y fa cilitar el desarrollo del cultivo láctico; sin em bargo, este tratamiento reduce el poder de coagulación de la leche e induce la precipita ción de las proteínas, lo que puede causar pro blemas en el desuerado. Para disminuir al máximo los inconvenientes, se recomienda re ducir el tratamiento térmico: realizarlo a una temperatura entre 62 y 65 °C, durante un tiem po entre quince y veinte segundos.
La inoculación y la fermentación La adición de cultivos lácticos o iniciadores durante esta etapa tiene como finalidad pro ducir ácido láctico para acidificar la leche. La presencia del ácido favorece la coagulación
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Cuadro 4.3
DIFERENTES TIPOS DE QUESO Y SUS CULTIVOS INICIADORES Tipo de queso
Cultivo iniciador
Emmental
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus hehcricus. Lactobacillus ease/, Propionilyactcrium treudenreichii
Edam
Streptococcus thermnphilus, Lactobacillus helvéticas. Lactobacillus casei
Camembert
Penicillium candidum, Latfotoccus laciis
Roquefort
PemciIlium roquetorti, Ljc Ukocojs lactis
Cottage
LactoctKCte lacth
Cheddar
Laclocotcus crémorib
Fuentes:
Adaptado de Vedamuthu y Washam (1983), y Ellner (1997).
Antes de la inoculación de los cultivos inicia dores, es necesario ajustar la temperatura de la leche entre 28 y 32 °C, que es el intervalo ópti mo para el crecimiento de los microorganis mos. La concentración en la que se adicionan estos cultivos depende del tipo de queso por obtener y varía entre el 1 y el 6% de la cantidad de leche que se desea fermentar. El tiempo de incubación -a estas temperaturas- oscila entre
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / A u o a H ír n á n d iz
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los quince y los sesenta minutos, y finaliza cuando se alcanza un pH entre 6,5 y 5,9.
La coagulación La coagulación de la leche consiste en la de sestabilización o desnaturalización de las pro teínas de la leche. Se puede realizar de dos formas: agregando ácidos (o produciéndolos por vía microbiana) o enzimas. Algunos fac tores que afectan la coagulación son la tempe ratura, el pH y los contenidos de calcio y de fosfato de la leche. •
Coagulación acida: ocurre por la acumu lación de ácido láctico producido por la fermentación; sin embargo, la cuajada que se obtiene por este método es desmenuzable y sin cohesión. También se efectúa por adición de otros ácidos, generalmente or gánicos.
•
Coagulación enzimática: es la más fre cuente. Se lleva a cabo por la adición de un conjunto de enzimas, denominado re nina o cuajo común, extraído generalmente del estómago de los temeros. La mezcla está compuesta principalmente por las en zimas quimosina y pepsina. En la actuali dad, se utilizan otras enzimas proteolíticas, como las pepsinas bovinas y porcinas, y las de origen microbiano -cuajo microbia no- que provienen, sobre todo, de los hon gos Mucor pusillus o Mucor miehie. Antes de adicionar el cuajo, es convenien te ajustar la temperatura de la leche entre 30 y 40 °C, intervalo óptimo de actividad de estas enzimas. Una vez agregado el cuajo, la leche se deja en reposo por un pe riodo de veinte a treinta minutos, que es el tiempo requerido para su coagulación. Para ayudar ai proceso, se adiciona cloru ro de calcio en una concentración entre 0,1
CA»wio< LOS PRO D U C TO S LÁCTEOS
y 0,2 g/¿de leche, ya que, al aumentar el calcio disponible, se favorece la precipita ción de las proteínas. Hasta la etapa de coagulación, los procedi mientos básicos en la fabricación de los dife rentes quesos son muy similares; sin embargo, las etapas siguientes varían de acuerdo con el tipo de queso por producir.
El desuerado o escurrimiento Una vez que la leche se ha coagulado, se debe cortar el coágulo. Primero, se hacen cortes en forma vertical y, luego, en forma horizontal hasta que la cuajada queda convertida en cu bos pequeños. Este procedimiento ayuda a eliminar el suero, por el aumento que se logra en la superficie. En la Figura 4.2, se ilustra el corte de la cuajada.
Figura 4.2:
El corte de la cuajada del coágulo en la fabricación de quesos.
Además del corte de la cuajada, otros factores que contribuyen al desuerado son el aumento en la temperatura y la agitación. El calenta miento debe ser un proceso lento, aproxima damente 1 °C cada dos o tres minutos, pero depende del tipo de queso que se fabrique. La agitación se empieza cinco o diez minutos después de la coagulación de la leche y debe 77
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realizarse a una velocidad suficientemente al ta para impedir que los cubos de cuajada es tén en contacto, pero no tanto como para que se rompan.
El moldeo y el prensado El moldeo tiene como finalidad dar forma al queso y ayudar a que los granulos de cuajada se aglomeren. Los moldes pueden ser redon dos, cuadrados, cilindricos o alargados. El prensado se realiza para endurecer la masa de queso y eliminar el exceso de suero. Gene ralmente, el moldeo y el prensado se ejecutan utilizando el mismo equipo, pues los moldes tienen dispositivos que ejercen presión sobre el queso. La presión que se ejerce y el tiempo de aplica ción dependen del tipo de queso. Si se elabo ran quesos blandos o semiblandos no es nece sario aplicar presión, pues es suficiente con la que provoca el peso del queso. Este procedi miento se conoce como autoprensado y puede durar hasta veinticuatro horas. Es necesario, cada cierto lapso breve de tiempo, darle vuel ta al queso para lograr que adquiera la consis tencia deseada. Cuando se va a producir un queso de consistencia más dura, se utiliza las prensas neumáticas. Al usarlas, se debe con trolar la presión que se ejerce, pues si es muy alta se pueden romper los granulos en lugar de endurecer la masa de queso.
El salado El salado de los quesos tiene varias funciones: •
Proporcionar sabor al producto (es la prin cipal)
•
Evitar la proliferación de microorganis mos
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•
Ayudar al desuerado
•
Contribuir a la formación de la corteza del queso.
En el proceso, se utiliza sal cristalizada o sal mueras de diferentes concentraciones, de acuerdo con el tipo de queso. La sal cristaliza da se esparce en la superficie del queso para que se disuelva con el agua superficial y se di funda, poco a poco, hacia el interior del que so. El salado por este método puede durar desde veinticuatro horas hasta varios meses; el queso se debe voltear diariamente para lo grar una mejor distribución de la sal. Si se uti liza una salmuera, su concentración de sal de be oscilar entre el 14 y el 16% p/ppara quesos blandos y entre el 22 y el 24% para quesos du ros (DUanjan, 1974). Los quesos se sumergen en la salmuera, procurando que no queden partes expuestas en la superficie.
La maduración La maduración de los quesos consiste en una transformación microbiana de sus componen tes en sustancias con mejor sabor y aroma. Las principales modificaciones que se presen tan son reacciones de hidrólisis de la lactosa, el ácido láctico, las proteínas y la grasa. El proceso de maduración se lleva a cabo en cámaras con humedad y temperatura contro ladas y por periodos que dependen del tipo de queso. El tiempo de maduración es, por lo general, noventa días; sin embargo, en ciertos quesos, se extiende hasta cuatro años. La tem peratura de la cámara varía entre 2 y 16 ”C y la humedad relativa entre 75 y 90%. Los mi croorganismos involucrados en la madura ción son las bacterias lácticas y propiónicas, principalmente, así como levaduras y hongos. Las bacterias lácticas incluyen especies de los géneros Lactobacillus, Streptococcus, EnterococM i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / A l ic ia H e r n á n d e z
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cus, Leuconostoc, Pediococcus y Bifidobacterium. Como se ha mencionado, el producto princi pal de su metabolismo es el ácido láctico; sin embargo, también generan compuestos aro máticos y proteasas que transforman la caseí na en péptidos. En ciertos quesos duros, como el emmental, se emplean bacterias propiónicas (por ejemplo, Propionibacterium freudenreichii) en el cultivo iniciador de la maduración. Estas bacterias forman ácido propiónico, succinato, prolina y ácidos grasos volátiles, que le confieren el sa bor y el aroma característicos, así como dióxi do de carbono, gas responsable de la forma ción de los agujeros típicos de este queso. Las levaduras generan compuestos aromáti cos a partir del lactato y, además, poseen enzi mas proteolíticas y lipolíticas que hidrolizan las proteínas y las grasas, produciendo sus tancias que modifican el aroma y el sabor del queso. Algunas de las levaduras presentes con más frecuencia en la maduración de que sos son las de los géneros Kluyveromyces, Debaromyccs, Saccharomyces y Torulopsis. Los hongos utilizados en la maduración de quesos pertenecen principalmente a especies del género PenicHlium. Los quesos Camembert y Brie, por ejemplo, son elaborados con cultivos de PenicHlium camemberti, mientras que el queso Roquefort es producido con Periicillium roqueforti. Para su fabricación, la leche debe ser inoculada con esporas del hongo an tes de la formación de la cuajada. Una vez ob tenido el queso fresco se realizan perforacio nes que permiten la circulación de aire y, por lo tanto, el desarrollo de los hongos (ver la Fi gura 4.3). Los hongos son capaces de transfor mar los ácidos grasos en metilcetonas, que son los compuestos que proveen el sabor y el aroma típicos a este tipo de quesos.
Gvrrw o 4.
LOS PR O D U C TO S LÁCTEOS
F ig u ra
4.3:
La perforación d e quesos para el desa rrollo de hongos.
En el caso específico de la elaboración del queso palmito, uno de los más típicos de nuestro país, se mezcla una parte de leche descrema da (que provenga del ordeño de la tarde ante rior) con otra parte de leche sin descremar (or deñada en la mañana). Como se puede obser var, de esta forma tan empírica, se adiciona le che con cierto grado de fermentación. El cua jo enzimàtico se deshace en una determinada cantidad de suero obtenido del queso fabrica do anteriormente y se añade a la mezcla de le ches. La leche coagula en menos de treinta minutos y se corta con la mano o con una pa leta. Entonces, se procede al desuerado y se deja fermentar la cuajada por trece horas; lue go, se desuera completamente. Después, se calienta la cuajada hasta que funda y se em pieza a hilar con la mano en forma de ovillo, salando simultáneamente con una salmuera. Una vez formado el ovillo, se coloca en un molde de madera para evitar que pierda su forma. Para complementar el material expuesto so bre quesos, lleve a cabo las siguientes activi dades: Investigue el proceso de elaboración de queso en alguna lechería y compárelo con el que se realiza en las industrias lácteas. Investigue el proceso de elaboración de algún tipo de queso madurado. Haga el diagrama y describa cada una de las etapas. Enfatice en aquellas en las que intervienen microorganismos.
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La
La materia prima y ia estandarización
n a ti l la
Definición La tintilla, también conocida como crema àci da, es un producto obtenido a partir de la fer mentación de la crema de la leche, utilizando microorganismos lácticos. Se produce artesa nalmente en fincas y, en forma industrial, en plantas procesadoras de leche.
El proceso de elaboración de la natilla El proceso de elaboración de la natilla, que se resume en el Esquema 4.3, es similar al de los otros productos lácteos mencionados. Poste riormente, se explica cada una de las etapas.
Para la fabricación de la natilla se utiliza la crema de la leche, especialmente de vaca. El contenido de grasa de la crema debe ser estan darizado a un 19% pAi aproximadamente, pa ra lograr un producto de buena calidad. Si la crema contiene una cantidad de grasa inferior, se puede agregar aceite de mantequilla para aumentarla; si por el contrario, contiene más grasa de la especificada, se adiciona leche des cremada o agua hasta alcanzar la concentra ción deseada. Además de la estandarización de la grasa, se debe aumentar el contenido de sólidos no grasos de la crema con el fin de me jorar la textura y la viscosidad del producto; para hacerlo, se añade leche descremada en una proporción entre el 1 y el 3% respecto de la crema. En algunos casos, se adicionan estabilizadores para mejorar el cuerpo del producto final. No se recomienda agregar más de un 0,5% de esta bilizador durante la etapa de estandarización.
La homogeneización En la elaboración de la natilla es importante la etapa de homogeneización, porque se distri buyen mejor los glóbulos de grasa presentes en la crema, lo que contribuye a dar al produc to final una apariencia agradable. El proceso se realiza a una presión de 3000 psi (2,1 x 104 kPa); la crema debe ser precalentada a 72 UC a p r o x i m a d a m e n t e (Revilla, 1982, ISO).
La pasteurización
Esquem a
80
4.3:
Las etapas del proceso de elaboración de la natilla.
Como se estudió en los otros productos lác teos, la pasteurización tiene como objetivos principales la eliminación de los microorga nismos patógenos que pueda contener la le che así como la creación de un ambiente pro
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picio para el buen desarrollo de los microor ganismos que se inoculan posteriormente. La pasteurización de la na tilla se realiza a dife rentes combinaciones de temperaturas y tiem pos, según el equipo de pasteurización con que se cuente. Por ejemplo, se puede llevar a cabo a 74 °C por treinta minutos o a 82 °C por dieci séis segundos (Reviiia, 1982,150). Las condiciones del proceso son más severas que en el caso de la leche, por el alto contenido de grasa: la gra sa es una mala conductora del calor y, por lo tanto, ejerce un efecto de protección sobre los microorganismos que se quieren inactivar.
La inoculación y la fermentación Antes de inocular el cultivo láctico, se debe enfriar la crema hasta una temperatura entre 20 y 22 °C, que es la óptima para el crecimien to de los microorganismos inoculados. El cultivo generalmente está constituido por una combinación de cepas de Enterococcus, Lactococcus lactis subespecie lactis o Lactococcus lactis subespecie cremoris y de Leucotiostoc citrovorum o L. dextramcum. El cultivo se añade en una concentración que varía entre el 0,5 y 2,0% v/v (respecto a la cantidad de crema de leche que se va a fermentar) y, a veces, se agre ga renina, en una concentración de 0,5 m¿/10 gal de crema, para ayudar al proceso de coa gulación. A partir de la adición del cultivo, empieza el proceso de fermentación, que se extiende por un periodo de catorce a dieciséis horas hasta que el producto alcanza una aci dez del 0,7%. Desde el punto de vista microbiano, el estrep tococo empieza a multiplicarse y produce, principalmente, el ácido láctico necesario para impartir el sabor ácido, coagular la leche y ba jar el pH. El pH ácido favorece el crecimiento de Leuconostoc, que genera, a partir de la hi
c m
>4: LOS PRODUCTOS LÁCTEOS
drólisis del ácido cítrico, los compuestos que proporcionan el aroma característico de la natilla: una combinación de diacetilo, ácido acé tico y ácido propiónico.
El enfriamiento Después de obtener la acidez deseada, es ne cesario detener la fermentación para que no se genere más áddo; de no hacerlo, el producto, por su sabor, no sería apto para el consumo. Para lograr que el metabolismo de los mi croorganismos se detenga, se disminuye la temperatura a 4 °C. Se recomienda mantener la natiila a esta temperatura durante cuarenta y ocho horas, con agitación lenta, para mejo rar su textura y cuerpo.
El empaque Una vez lista la natiila, se empaca y se refrige ra hasta su consumo. Los empaques que se utilizan son muy variados en tamaño; gene ralmente, son recipientes plásticos. También se encuentra la natiila empacada en bolsas plásticas, principalmente aquella elaborada en las fincas lecheras.
El
su er o de q u e s o
El rendimiento de queso durante su fabrica ción es, aproximadamente, un 10%: de cien li tros de leche utilizados en la fabricación de queso, el 90% se convierte en un líquido semi transparente conocido normalmente como suero. Esta sustancia, a pesar de ser una fuen te de alto valor nutritivo, ha sido descartada por muchos años y ha provocado serios pro blemas de contaminación ambiental. En el Cuadro 4.4 se presenta la composición prome dio del suero de queso.
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Cuadro 4.4
LA COMPOSICIÓN PROMEDIO DEL SUERO DE QUESO Componente
Lactosa Proteína Cenizas Grasa Ácido láctico Sólidos totales Agua
% p/v
% p/v
(1)
(2)
4,9 0,9 0,6
4,85 0,80 0,50
0,3
0,50 0,05 6,35 93,70
0,2 7,0 93,0
Fuentes: (1) Desrosier (1987, 455).
nocen como microorganismos de tercera genera ción, por sus propiedades. Incluyen básica mente bacterias y levaduras. Algunos de los microorganismos probióticos son: Bifidobacte rium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobac terium in/antis, Pediococcus acidilactici, Lactoba cillus delbrueckii subespecie bulgaricus, Lactoba cillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobaci llus reuteri, Propionibacterium freudenrichi y StreptOCOCCUS faecium (Ellner, 1997). Entre los productos probióticos se encuentran: •
El "yogur probiótico", que es fermentado con Lactobacillus acidophilus o Lactobacillus casei.
•
La "leche ácida probiótica", fermentada con Lactobacillus acidophilus y Bifidobacte rium sp.
•
El "Yakult", bebida proveniente de Japón que es preparada con ciento ocho cepas de Lactobacillus Casei (Ellner, 1997).
(2) Kosikowski (1977, 450).
Hasta la fecha, se han realizado numerosas in vestigaciones con el fin de aprovechar esta sustancia, y se han obtenido muy buenos re sultados. Por su composición, algunos de los usos del suero pueden ser: •
Fabricación de "quesos de suero", como el Ricotta.
•
Elaboración de medios de cultivo. Por la composición del suero, es posible el desa rrollo de microorganismos.
•
Producción de ácidos orgánicos, como el ácido láctico, el ácido acético y el ácido propiónico. Estos ácidos son los com puestos mayoritarios que se obtienen por vía fermentativa, a partir de la inoculación del suero con microorganismos.
•
Las ventajas del uso de los productos probióticos Es recomendable la utilización de los microor ganismos probióticos para la producción de leches fermentadas, porque brindan las si guientes ventajas: •
Se aumenta la digestibilidad de la leche fermentada, ya que muchos de los nutri mentos -com o la lactosa, las proteínas y las grasas- se consumen en forma predigerida. Además de la predigestión origi nada específicamente por la fermentación, los microorganismos probióticos sobrevi ven el paso por el tracto gastrointestinal y, ahí, liberan enzimas que ayudan en la di gestión final de los nutrimentos.
•
Se presenta un efecto que protege de las in fecciones intestinales, porque inhiben el d e
Alimentación animal. El suero se puede emplear, para este fin, tanto en estado lí quido como deshidratado.
LOS PROBIÓTICOS Probióticos es un término -d e reciente utiliza ción- que se aplica a productos obtenidos por fermentación con microorganismos benéficos para la salud. Estos microorganismos se co
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M i c r o b i o i o g I a i n d u s t r i a i / A lic ia H e r n á n d e z
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sarrollo de microorganismos patógenos y controlan el equilibrio de la flora putrefac tiva que habita normalmente en el colon. •
Se estimula el sistema inmunológico. Asi mismo, se tienen reportes de que una die ta complementada con productos probióticos reduce, entre un 25 y 30%, la apari ción de tumores en el colon (Céspedes, 1995).
•
Se ha encontrado una relación directa en tre el consumo de probióticos y la dismi nución del colesterol en el organismo, o sea, que estos microorganismos poseen actividad hipocolesterolémica.
Los requisitos de los microorganismos probióticos Los microorganismos probióticos se inoculan en una alta concentración (mayor que 107 UFC/mf )• Deben cumplir con una serie de re quisitos; entre ellos, los más importantes son: •
Mantener su viabilidad en las condiciones de preparación del alimento en el que se utilizan, por ejemplo, la presencia de azú cares y aditivos.
•
Mantener su viabilidad en las condiciones de extrema acidez en el estómago, y ser capaces de colonizar el intestino.
•
Tener una alta velocidad de crecimiento para dominar sobre los otros microorga nismos intestinales.
A pesar de que este tipo de productos es de amplia distribución en Europa, en Costa Rica casi no se producen, pues únicamente algunos tipos de yogur podrían ser clasificados como tales. Sin embargo, debido a que, en la actua lidad, los consumidores se preocupan más por la adquisición de alimentos que sean be néficos para su salud, posiblemente la canti dad de productos probióticos aumentará.
G#wio* LOS PRODUCTOS LÁCTEOS
EJERCICIOS DE AUTOEVALUACION
1. Enumere algunos productos que se obtienen por fermentación de la leche. 2. Cite las funciones de la pasteurización durante la elaboración de yogur. 3. En cuanto a la producción de yogur: a)
Describa las diferencias entre la producción industrial y la producción casera. Refiérase al tipo de microor ganismos y a las condiciones de temperatura y tiempo.
b)
¿Recomendaría usted la producción de "yogur" en forma casera? Explique.
4. Utilizando el Gráfico 4.1, Influencia de la temperatura sobre la proporción de las especies al final de la fermen tación, en un cultivo de yogur, determine la temperatura óptima de incubación para obtener un producto con una relación final de Streptococcus: Lactobacillus de 2:1. 5. Utilizando el Gráfico 4.2, Influencia de la cantidad de inoculo y el tiempo sobre la proporción de las especies al final de la fermentación, en un cultivo de yogur, determine la cantidad de cultivo que se debe inocular para obte ner un producto con una relación de Streptococcus: Lactobacillus de 2:1, después de dos horas de fermentación. 6. Mencione las etapas del proceso de fabricación de queso en las que intervienen microorganismos. 7. Explique la función de los cultivos iniciadores en la elaboración del queso. 8. En la elaboración del queso: a)
Defina lo que es un cuajo común y un cuajo microbiano.
b)
Indique cuál tipo de cuajo es el que se utiliza en la actualidad y las razones por las que se escogió.
9. ¿Por qué se debe ajustar la temperatura antes de la adición de cultivos de microorganismos y del cuajo, en la ela boración del queso? 10. Indique la principal diferencia entre la natilla y la crema dulce. 11. Nombre los compuestos que dan aroma y sabor a la natilla. 12. Mencione los usos que se le pueden dar al suero de queso. 13. Enumere las ventajas de los productos probióticos.
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FUENTES Y LECTURAS RECOMENDADAS
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comprehensive treatise in 8 volumes. Vol. 5. Germany: Verlag Chemie GmbH. CÉSPEDES, I. 1995. "Probióticos lactofermentados en la salud hum ana". En: Tecno
logía láctea latinoamericana. 1:37-41. Davis, ], 1975. "The microbiology of yoghourt". Cap. 2. En: Lactic acid bacteria in beverages and food. U.S.A.: Academic Press. D esrosier, N. 1983. "Tecnología aplicada a los productos lácteos". Cap. 13. En:
Elementos de tecnología de alimentos. México: Compañía Editorial Conti nental, S.A. de C.V. DlLANJAN, S. 1976. Fundamentos de la elaboración del queso. España: Editorial Acribia.
ELLNER, R. 1997. Saninario: Tecnología de productos lácteos. Escuela de Tecnología de Alimentos de la Universidad de Costa Rica. Costa Rica: UCR. G a r c ía , M., S. Revah y L. Gómez. 1993. "Productos lácteos". Cap. 6. En: Biotec
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8B
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a i / A l ic ia H e r n á n d e z
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In t r o d u c c ió n La carne es un alimento que contiene una gran variedad y abundan cia de nutrimentos, por lo que constituye un excelente medio para el desarrollo de los microorganismos. Si no se aplican controles ade cuados, los microorganismos adquiridos durante su manipulación o aquellos presentes en el ambiente, la deterioran rápidamente. Para contrarrestar la corta vida útil de los productos cárnicos, se han desa rrollado una serie de métodos de conservación, entre los que se pue den mencionar: • La refrigeración • El secado • El salado • El curado • La fermentación. También se efectúan combinaciones de ellos. El método de curado, por ejemplo, inicialmente consistió en adicio nar sal a la carne y, con el transcurso del tiempo, se han añadido otras sustancias que, además de conservar el producto, mejoran su sabor. El curado se aplica a piezas de carne entera (jamones) y también a los conocidos y gustados embutidos. Existen muchos procesos de obten ción de embutidos, como lo confirma la gran cantidad de ellos dispo nibles en el mercado. Entre los embutidos se encuentran los fermen tados, que se estudiarán en este capítulo. Se considerará su historia, la microbiología y la bioquímica de su fermentación, así como el pro ceso general para su elaboración.* •
Si desea más información sobre el proceso general de elaboración de embuti dos, puede obtenerla en Price y Schweigert (1976), o en Paltrinieri (1978).
O w ftuo* LOS EM BU TID O S FERM ENTADOS
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üopyrignted material
Como se indicó, la carne tiene una vida útil muy corta, porque contiene gran cantidad de elementos y compuestos que permiten a los mi croorganismos desarrollarse y, al hacerlo, dete rioran el producto aceleradamente. Por este motivo, desde tiempos antiguos, el ser humano ha buscado la forma de preservar y transformar esta clase de alimentos mediante diversos mé todos; uno de ellos es la fermentación de la car ne para la producción de embutidos fermentados. En investigaciones realizadas, se detectaron indicios de que los embutidos constituían un alimento popular en las civilizaciones griega y romana (Bonilla a ai, s í ). Durante la Edad Me dia, la fabricación de embutidos tuvo gran au ge en varios lugares de Europa, de ahí que los nombres de algunos productos sean los de las ciudades de las que provienen. En esa época, la refrigeración artificial no se conocía ni se había desarrollado la industria del enlatado; la carne que se quería conservar era mezclada con sal, empacada en los intestinos (tripas) de los animales y, luego, sometida a un proceso de secado en unos cuartos especiales. El pro ducto que se obtenía poseía características di ferentes del original; en la actualidad, se sabe que la transformación sufrida por la came era causada por microorganismos que provenían de los intestinos de los animales, de la mani pulación y del aire presente en los cuartos de secado. En muchos casos, el embutido, en lu gar de convertirse en un producto de agrada ble aroma y sabor, se deterioraba. Poco a po co, los hombres seleccionaron la forma de ela borar el producto cárnico, a pesar de que no conocían el fundamento científico de la trans formación. Por este motivo, se dice que la fer mentación de la came es una de las fermenta ciones tradicionales, y que se dio en forma cir cunstancial mediante "prueba y error". El descubrimiento de los microorganismos y la determinación de su acción en los alimentos
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durante el siglo XIX han permitido al ser hu mano entender y manipular los procesos de fermentación de los productos cárnicos. En la segunda mitad del siglo XX, la introducción de cultivos iniciadores garantizó una alta cali dad en el embutido, no solo en su sabor y su aroma, sino en su estabilidad y en la prolon gación de su vida útil. En la actualidad, exis te un alto número de microorganismos paten tados, que se pueden usar específicamente pa ra obtener un producto cárnico fermentado con características determinadas previamente.
LOS EMBUTIDOS FERMENTADOS La fabricación de embutidos depende de mu chos factores, por lo que es muy difícil clasifi car estos productos. Price y Schweigert (1976) hacen una división de ellos con base en el tra tamiento térmico que reciben, y es la que se ex pone en el Esquema 5.1. Los embutidos ferm en tados se incluyen en la parte denominada "Se cos y semisecos" y pueden ser ahumados o no.
Embutidos
Esquema 5.1:
Clasificación general de los embutidos con base en el tratamiento térmico. Fuente: Price y Schweigert (1976, 495).
Los embutidos fermentados, también conoci dos como embutidos madurados, tienen un sa bor intenso y persistente, que lo causa el ácido láctico y otros compuestos producidos por la fermentación (generalmente bacteriana). Se elaboran con came de cerdo, came de res o combinaciones de ellas. Existe una gran va riedad de embutidos fermentados (secos y seM i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l / A licia . H ík n á n d íz
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Carne y grasa
Esquem a
5.2:
Las etapas del proceso general de elaboración de un embutido fermentado.
La selección de la carne y la grasa La carne que se utiliza para hacer embutidos puede ser de res o de cerdo; su selección se realiza con base en el producto por elaborar. Se pueden utilizar mezclas de ellas, por ejem plo, en los embutidos alemanes (thuringer) y en los italianos (salami) se emplea una mezcla de carne de res y de cerdo. Los animales deben estar sanos y bien nutri dos; antes del sacrificio, no deben haber sido sometidos a actividades tensas ni cansadas, ya que esto afecta la calidad del producto ela borado.
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Una vez sacrificado el animal, el glucógeno (material de reserva de energía) presente en la carne, se desdobla principalmente por vía en zimàtica para convertirse en ácido láctico, lo que provoca una disminución en el pH. El grado de acidificación que se alcance depende de la cantidad de glucógeno que tiene el ani mal en el momento del sacrificio y de la tem peratura a la que se almacene la carne; sin em bargo, en un proceso normal, el pH desciende a valores cercanos a 5,8. Si el animal ha sido sometido a fuertes periodos de stress o ejerci cio antes de la matanza, no habrá mucho glu cógeno para ser transformado cuando el ani mal muere y, por lo tanto, el pH de la carne no disminuye en gran medida. Por el contrario, si hay mucho glucógeno de reserva, el grado de acidificación que se puede alcanzar es alto. Cuando se utilizan cultivos iniciadores en la elaboración del producto fermentado, se pue de emplear carne fresca, cuyo pH promedio es de 6,2. Si no se van a emplear cultivos inicia dores, es recomendable utilizar una carne cu yo pH haya descendido hasta un valor apro ximado de 5,8. La grasa es adicionada como tocino fresco y congelado para evitar alteraciones provoca das en el producto por enranciamiento.
La congelación Es importante que la carne y la grasa estén muy frías durante el proceso para poder cor tar la grasa en pedazos sin que esta se derrita; por lo tanto deben congelarse a una tempera tura que oscile entre - 3 y -1 "C.
El picado de las materias primas El picado de la carne y el tocino se lleva a ca bo en una máquina cortadora, comúnmente
M ic r o b io lo g ía in d u s t r ia i / A
l ic ia
H
ern á n d ez
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El secado Una vez terminado el proceso de fermenta ción, los e m b u t i d o s s e c o s se colocan en cámaras de secado por aire a una temperatura entre los 12 y 15°C, y a una humedad relativa entre el 65 y 75%. Es importante verificar la velocidad del aire, porque si es muy alta, se pueden pro ducir defectos por secado excesivo, como la formación de capas superficiales por la rápida pérdida de humedad; si, por el contrario, du rante el secado, la velocidad del aire es lenta o los embutidos colgados se encuentran muy juntos, la humedad se puede quedar en la su perficie y generar el crecimiento de microor ganismos indeseables. Los e m b u t i d o s s e r n is e c o s , en general, no son secados posteriormen te, sino son cocidos; al cocerlos, las proteínas de la carne se coagulan y se inactiva la activi dad microbiana. Investigue si en Costa Rica se elaboran embutidos fermentados. Puede solicitar información en las industrias procesadoras de embutidos. Confeccione un diagrama de proceso de algún producto que se elabore en una de estas industrias.
L a MICROBIOLOGÍA
y
LA BIOQUÍMICA
DE LA FERMENTACIÓN DE EMBUTIDOS
El proceso de fermentación de los embutidos La fermentación de los productos cárnicos no ha sido estudiada tan extensamente como la de los productos lácteos y la que se lleva a ca bo para la obtención de bebidas alcohólicas. Al principio, en los años cincuentas, la adición de cultivos iniciadores no tuvo gran acepta ción, ya que se prefería la fermentación natu ral y, en esa época, se conocía más acerca de
M im os. LOS EM BU TID O S FERM ENTADOS
las desventajas de los microorganismos que de sus beneficios. La fermentación de las carnes también se co noce como m a d u r a c i ó n . En el caso de los pro ductos embutidos fermentados, se inicia una vez que la carne ha sido embutida; se efectúa con la flora asociada al animal sacrificado y con la que ha sido adquirida durante todo el proceso (la que proviene de las personas que los manipulan, de los utensilios que emplean y del aire del cuarto de embutido). Esta fer mentación se puede realizar en forma más controlada si se utilizan c u l t i v o s i n i c i a d o r e s . La fermentación depende del tipo y de la can tidad de microorganismos que se utilicen y de la temperatura a la cual se ejecute: cuan do ocurre a una temperatura menor que los 15 °C, se conoce como f e r m e n t a c i ó n l e n t a ; si la temperatura del proceso fluctúa entre los 15 y 20 °C, se tiene una f e r m e n t a c i ó n m e d i a y si se realiza a 25 °C o más, se denomina f e r m e n t a c ió n r á p id a .
En una fermentación lenta, hay un desarrollo del aroma y un enrojecimiento lentos y la con sistencia del embutido se genera muy despa cio; sin embargo, se adquiere una coloración más intensa y de mayor estabilidad, así como un mejor sabor. Por medio de la fermentación rápida, los em butidos están disponibles para ser vendidos en un menor tiempo, lo que económicamente le resulta beneficioso al productor; pero, este tipo de fermentación presenta los siguientes inconvenientes: el color del producto es me nos estable, el sabor es más fuerte y los mi croorganismos que deterioran el producto se desarrollan mejor a las temperaturas altas que se emplean en ese proceso. Cuando el proceso de la fermentación se lleva a cabo con la flora asociada, al inicio, todos los
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M a te ria p rim a
sado que comúnmente se observa en los em butidos: Nitrosomioglobina + Calor —> N itro$ohem oavm o
El Esquema 5.3 resume el proceso de colora ción.
Esquema 5.4:
Esquema 5.3:
La formación de los compuestos respon sables del color en los embutidos. Fuente: Guerrero (1993, 235).
Los
PROCESOS ESPECÍFICOS
DE ELABORACIÓN DE DOS EMBUTIDOS FERMENTADOS
El salami duro El salami, un embutido seco que posee un al to consumo en Europa, es elaborado con car ne de res y tocino de cerdo (picados finamen te), azúcar, nitrito de sodio, sal, especias y condimentos. El producto se somete a deseca ción, fermentación y, en algunos casos, al ahu mado. En el Esquema 5.4 se muestran las eta pas para su elaboración.
GtfftUOS: LOS EM B U T ID O S FERM ENTADOS
la s etapas del proceso de elaboración del salami duro.
La carne que se emplea en el salami debe es tar refrigerada antes de cortarla; se corta en pedazos de aproximadamente cinco centíme tros de lado. Estos trozos se muelen y se aña de el resto de los ingredientes. La masa se mezcla bien y se embute en las tripas. Los sa lamis se cuelgan en cámaras donde se lleva a cabo la fermentación, a una temperatura entre los 22 y 24 °C y una humedad relativa entre el 80 y 90%. Luego, el embutido permanece en estas cámaras, pero a una temperatura de 5 °C y una humedad entre el 60 y 70%, hasta que alcance un pH de 5,0 o menor. Cuando se utilizan cultivos iniciadores, las condiciones de temperatura, humedad relati va y tiempo de fermentación pueden variar, según los microorganismos presentes en el cultivo, por lo que es muy importante seguir las instrucciones del manejo del cultivo que indica su distribuidor.
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CAPITULO 6
.
't m
LAS BEBIDAS ALCOHÓLICAS Sum ario
Introducción La cerveza El vino Las bebidas destiladas
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Corte transversal
Corte longitudinal
c)
a) F ig u r a 6 .1 :
La espiga y el grano de cebada, a) Espiga de cebada, b) Corte transversal de la espiga, c) Grano de la cebada.
La malta Como se mencionó, la cebada ha sido siempre el cereal seleccionado como la materia prima principal de la cerveza. La cebada, que perte nece a la familia de las gramíneas, es parecida al trigo y su nombre científico es Hordeum spontaneum. En la Figura 6.1 se muestran di bujos de la espiga y el grano de la cebada. De acuerdo con la cantidad de hileras de gra nos que se encuentran, existen dos subespecies de espigas de cebada: • La espiga de dos hileras: es utilizada principalmente en Europa. Tiene los gra nos más desarrollados que la de seis hile ras, por lo tanto, posee más proporción de carbohidratos y el rendimiento es mayor. Su cáscara es más delgada y, como conse cuencia, la cantidad de sustancias que pueden deteriorar la calidad de la cerveza {localizadas en la cáscara) es menor. •
La espiga de seis hileras: es llamada ce bada de invierno. Tiene los granos menos desarrollados que la de dos hileras; sin embargo, presenta mayor contenido de enzimas, por lo que es principalmente em
OtfWuoí. LAS BEBIDAS ALCOHÓLICAS
pleada cuando se utilizan "adjuntos" (este término se explica en la sección siguiente). En la Figura 6.1.a, se observan cortes transver sales de estos dos tipos de espiga. La preparación de la malta o malteo es, básica mente, la germinación inducida de la cebada para que se formen las enzimas responsables de la hidrólisis de los carbohidratos. Este pro ceso se lleva a cabo en los países productores de cebada y consta de tres pasos: a) El grano de cebada se remoja hasta que el contenido de humedad se encuentre entre el 42 y 46%. Esta etapa sirve, a la vez, pa ra eliminar la suciedad de la cebada. b) Cuando el grano de cebada absorbe el agua, se induce la germinación: se modi fican las paredes celulares y se activa la formación de enzimas (en particular amilasas y proteasas) que empiezan a des componer el almidón y la protema presen tes. Para abastecerse de la energía que re quiere este proceso, la semilla empieza a respirar (consume oxígeno y genera calor y dióxido de carbono). Con el fin de asegu rar el suministro de oxígeno y eliminar el
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La elección y el control del tamaño de las par tículas de la harina influyen mucho en la efi ciencia de los pasos posteriores de extracción de sustancias y separación de la cáscara. En tre menor sea el tamaño promedio de la hari na va a existir un mayor contacto entre las en zimas y los sustratos, y la extracción será me jor; sin embargo, una molienda muy fina re ducirá demasiado la cáscara del grano de la cebada, que es una de los principales constitu yentes del residuo, y la operación de separa ción se hace más difícil. Debe seleccionarse un tamaño intermedio que asegure una apro piada extracción y una buena separación. Hoy, en la práctica, existen dos sistemas de molienda: molido en seco, con acondiciona miento de la cáscara, y molido en húmedo. En el molido en seco, la malta es ligeramente hu medecida con agua líquida o en forma de va por, inmediatamente antes de ser molida; en el molido en húmedo, la malta es puesta en remojo antes de la molienda. Ambos métodos poseen ventajas y desventa jas, por lo que la selección está en función de las características de la cervecería.
empleada varía de una cervecería a otra, pues depende de aspectos como la naturaleza del cereal utilizado, las características del produc to deseado, y el tipo y la capacidad del equipo. Cuando se utilizan adjuntos sólidos, como puntilla de arroz, se tratan primero en un tan que aparte -llamado macerador de adjuntospor medio del siguiente procedimiento: a) Al adjunto sólido se le añade una pequeña porción de malta, que proporciona las enzi mas para que se lleve a cabo la maceración. b) La mezcla se calienta hasta ebullición pa ra gelatinizar el almidón. c)
La mezcla se descarga gradualmente en el macerador principal (con lo que, además, se logra incrementar la temperatura del contenido del macerador).
Esta forma de lograr la maceración (con ad juntos) se llama proceso de infusión con doble macerador, y es la que se utiliza en la mayoría de los países de América, incluyendo Costa Rica. El Diagrama 6.2 muestra los dos maceradores del proceso.
La maceración En esta etapa se pone en contacto la malta mo lida con el agua, lo que permite que las enzi mas (formadas durante la germinación) de graden los constituyentes de la malta (carbo hidratos y proteínas) a formas solubles y, en tonces, se origina el líquido que se va a fer mentar, denominado mosto. La mezcla de agua y malta se somete a un ca lentamiento gradual en el macerador, nombre que se le asigna al tanque donde se lleva a ca bo el proceso de maceración. La temperatura
Cumio 6: LAS BEBIDAS ALCO H Ó LICAS
D ia g ra m a
6.2: Los maceradores involucrados en la infusión con doble macerador. Fuente; Adaptado de Teufel (1993).
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El llenado y la pasteurización La cerveza filtrada y carbonatada se deja en tanques cerrados; entre el líquido y la tapa se encuentra un espacio con dióxido de carbono gaseoso, que crea una determinada presión so bre la bebida y, así, ayuda a mantener la con centración del gas disuelto. Luego, se traslada al departamento de llenado para ser envasada en botellas, latas o barriles. Las líneas de llena do (Esquema 6.2 y Ilustración 6.4) están forma das por una serie de máquinas y bandas traasportadoras que, en forma automatizada, enva san gran cantidad de producto a alta velocidad y con el empleo de poco personal. Cuando se utilizan botellas reciclables, se so meten a un proceso de limpieza con una diso lución caliente de hidróxido de sodio al 1 ó 2% pA' en máquinas lavadoras especiales.
rioro del producto envasado. Para evitarlo y alargar su vida útil, la cerveza envasada se pasteuriza. Existen grandes túneles de pasteu rización que lanzan chorros de agua a diferen tes temperaturas. Al pasar por el túnel, la cer veza embotellada se va calentando hasta lle gar a los 60 °C; luego, se enfría hasta la tempe ratura ambiente. La cerveza cruda o de barril no es pasteurizada; a ello se debe las diferencias en el sabor (más fresco) y la estabilidad (menor) respecto a la pasteurizada. Una cerveza cruda puede tener una vida útil de un mes; si se pasteuriza, au menta a seis meses. Como existen muchos clientes que prefieren la cerveza cruda, algu nas empresas han desarrollado una línea esté ril, que en inglés recibe el nombre de draft, pa ra ofrecer cerveza cruda en lata o botella.
El deterioro de la cerveza La cerveza, durante el proceso de elaboración, puede tener tres tipos de deterioro: microbiológico, químico y físico.
El deterioro microbiológico
I lu st r a c ió n 6 .4 :
Sección de la línea de llenado de latas. (Instalaciones de la Cervecería Costa Rica).
Las máquinas llenadoras se encuentran dise ñadas con un sistema de válvulas que permi te ejecutar la operación en condiciones de cier ta presión de dióxido de carbono, para evitar que la cerveza pierda parte del gas que se le ha incorporado o adquiera oxígeno del medio. La cerveza que se envasa no es totalmente es téril: posee una pequeña cantidad de mi croorganismos que pueden producir el dete
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Los problemas de contaminación de la cerveza por microorganismos indeseables se han lo grado minimizar, al implantar estrictas medi das higiénicas en las diferentes etapas del pro ceso de obtención. Además, los microorganis mos que pueden contaminar el mosto lupulado o la cerveza son pocos, gracias al contenido de alcohol, el pH y el efecto antimicrobiano de algunos componentes del lúpulo. Por estas ra zones, aunque el producto no se pasteurice, los riesgos de contaminación son bajos. Los microorganismos indeseables más comu nes son: las levaduras silvestres, las bacterias lácticas de los géneros Lactobacillus y Pediococ-
M ic ro b io lo g ía in d u s tria i / I leana A lfaro
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tituía la Unión Soviética) y la templada (Alta Rioja de España, Portugal, el norte de Francia, Alemania, Suiza, Austria, Hungría, y otra par te de Yugoeslavia y de las repúblicas que per tenecían a la Unión Soviética). Los vinos pro venientes de cada una de estas regiones son diferentes: los de la primera son suaves, de baja acidez, su contenido alcohólico es relati vamente alto y poseen un aroma poco abruta do. Los de la zona templada presentan mayor acidez, menor contenido alcohólico, y sus aro mas, afrutados, son sutiles y delicados, por lo que se consideran los vinos más finos. Un aspecto que influye en las propiedades del vino es la condición climática a la que fueron sometidas las uvas durante su cultivo: este es el factor responsable de la variación en la cali dad de los vinos de una cosecha a otra, aun cuando se hayan elaborado en un mismo sitio y por medio de procesos idénticos. Para producir vino de alta calidad, la uva d e be cosecharse en estado de total madurez, lo que desafortunadamente es muy difícil de l e g ra r p o r las re striccio n es del m e d io o p o r la
dificultad de detectar ese estado óptimo de re colección. Como cualquier otra fruta, el grado de madurez se puede caracterizar por la rela ción de los contenidos de azúcar (DBrix) y de ácido (pH): durante el crecimiento, el conteni do de ácido aumenta, pero empieza a dismi
nuir en la maduración. El punto máximo en la curva de acidez es señalado como el inicio de la maduración; se reconoce por el cambio de color en la fruta, acompañado del incremento en el contenido de azúcar. El Cuadro 6.5 muestra las características ópti mas para las uvas que van a ser utilizadas en la elaboración de algunos tipos de vinos. Conociendo el contenido de azúcares y el pH de la fruta que se va a cosechar, se puede esti mar si la acidez es la correcta para la fermen tación y la estabilización del vino terminado, y también el porcentaje de alcohol que se lle ga a obtener.
La levadura Al igual que en la cerveza, la levadura más empleada para fabricar el vino es la S. cereuisiae. Dentro de esa especie, las mejores varie dades vínicas son la ellipsoideus y la pastoríanus, que se diferencian de las de la cerveza en cuatro características: •
Tienen formas elípticas o alargadas
•
Tienen una menor capacidad fermentativa
•
Pueden seguir fermentando en concentra ciones de alcohol más elevadas (hasta 18% v/v)
Cuadro 6*5 LOS PARÁMETROS RECOM ENDADOS PARA LAS UVAS
DESTINADAS A LA ELABORACIÓN DE VINOS cBri\
Acidez minima (pH)
°Br¡x/acidez
Blanco
19,5-23,0
0,70
27,9-33,0
Tinto
20,5-23,5
0,65
31,5-36,2
Dulce
22,0-25,0
0,65
33.8-38,5
Povlre
23,0-26,0
0,50
46,0-52,0
Típo de vino
Fuente: García e iá i (1993,291).
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•
Impedir la acción de enzimas oxidasas so bre los taninos y los colorantes
frado, el mosto se deja reposar y las partículas pesadas se depositan en el fondo.
•
Acidificar el medio, porque forma ácido sulfuroso (H2S 0 3).
Cuando se requiere una clarificación mejor, se pueden usar otros métodos más complejos, como la filtración o la centrifugación con la adición de agentes especiales tipo gelatina, enzimas pectinolí ticas, bentoníta o carbón ac tivado (para eliminar olores desagradables).
La cantidad de dióxido de azufre que se debe agregar al mosto depende de numerosos fac tores: la clase del vino por elaborar, la concen tración de azúcares, el pH, el estado sanitario de la vendimia, el volumen de los recipientes, el procedimiento de vinificación y la posibili dad de refrigeración. En agua pura, son sufi cientes cinco gramos por hectolitro para inter ferir en la actividad de las levaduras; sin em bargo, en los mostos se debe aumentar la do sis entre veinticinco y treinta veces (se agre gan de ciento veinticinco a ciento cincuenta gramos por litro) para lograr iguales resulta dos, ya que parte del dióxido de azufre se combina con otros constituyentes. Sin embar go, si se adiciona en exceso, puede ocasionar que el vino adquiera un sabor indeseable a sulfuro de hidrógeno (H2S). El dióxido de azufre se obtiene mediante la quema de azufre puro o por la disolución de sus sales; también, se emplean las soluciones líquidas del compuesto. El uso del meta bi sulfito de potasio proporciona dos ventajas: la facilidad para adquirirlo, manipularlo y agre garlo, y la precisión que se puede lograr en la cantidad agregada; pero, tiene el inconvenien te de aportar a los vinos un exceso de potasio.
La clarificación del mosto El mosto resultante del prensado puede estar cargado de suciedad procedente de las uvas o del equipo utilizado: partículas sólidas, gru mos, esporas y otras sustancias. Esta sucie dad debe eliminarse para realizar una fermen tación limpia, y la forma más sencilla de ha cerlo es por sedimentación. Después del azu
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El calentamiento del mosto Con la idea de inactivar las enzimas que favo recen la oxidación, eliminar los microorganis mos indeseables y estabilizar las proteínas, el mosto se somete a un calentamiento de corta duración a 87 °C, seguido de un enfriamiento rápido a 15 °C.
La corrección del contenido de azúcar y la acidez Como se mencionó, los contenidos de azúca res y ácidos del mosto determinan las caracte rísticas finales del vino; si es necesario corre girlos, es preferible modificarlos en el mosto y no en el vino. En los vinos de calidad estos dos valores se encuentran muy regulados, las adiciones son muy controladas y, en algunos casos, solo se permite trabajar con los paráme tros establecidos para la uva en condiciones normales. Generalmente, se utiliza sacarosa como enriquecedor; el rendimiento de su transforma ción en alcohol depende de las condiciones de la fermentación. La cantidad necesaria de es te sustrato se determina con base en los datos del peso específico del mosto y la cantidad fi nal de alcohol total que desea alcanzarse. El azúcar que se va a agregar se diluye con una cantidad de mosto tres o cuatro veces mayor; la mezcla se agita hasta que la dilución sea to-
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EJERCICIOS DE AUTOEVALUACION
1.
Establezca las diferencias entre la cerveza, el vino y el ron, en cuanto a: •
Presencia de los procesos de fermentación y destilación en su ela boración
•
Principal materia prima empleada para su elaboración y contenido en ella de los azúcares fermentables
•
Contenido de alcohol.
2.
Describa las diferentes formas de expresar los contenidos de alcohol en las bebidas alcohólicas.
3.
Con la información del capítulo complete el siguiente cuadro: Cerveza
Vino
Materias Primas Microorganismo termentador ¿Cómo se elabora el mosto? ¿De acuerdo con el proceso de elaboración, cuáles son los dos principales tipos de bebida? ¿En qué difieren principalmente esos dos tipos? Nombre de los tipos de termenta dores que se usan
4. Elabore un esquema con las etapas básicas de los procesos de elabora ción de la cerveza y el vino. 5. Describa tres defectos y tres enfermedades que pueden presentarse en el vino. Incluya información sobre los efectos o síntomas, las causas, y las formas de prevenirlos o eliminarlos.
151
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Cuadro 7.1
LA CLASIFICACIÓN DE LOS VINAGRES, CON BASE EN LA MATERIA PRIMA •Materia prima
Método de obtención
Vinagre de vino
Vino
Fermentación acética del vino obtenido por fermentación alcohólica del jugo de uvas
Vinagre de malla
Malta de cebada
Fermentación alcohólica de la malta de ce bada y posterior fermentación acética del producto
Vinagre de vino de fruía
Vinos de frutas
Fermentación acética de los vinos obteni dos por fermentación alcohólica del jugo de frutas diferentes de la uva
Vinagre de sidra
Jugo de manzana
Fermentaciones alcohólica y acética del ju go de manzana
Vinagre de espíritu
Alcohol destilado
Fermentación acética del alcohol destilado
Vinagre de frutas
Frutas
Fermentaciones alcohólica y acética de un tipo de fruta madura
Nombre del vinagre
zar el estudio de este material, realice la si guiente actividad:
I
Materia prima (fruta)
Visite algunos supermercados, revise las etiquetas y apunte la composición de cinco marcas de vinagre que se expendan. Construya un cuadro que muestre los contenidos y las marcas. Comente las diferencias y similitudes entre ellos.
El proceso de elaboración de vinagre a partir de frutas Como se mencionó, la elaboración de vinagre se puede dividir en dos etapas: •
La fermentación alcohólica de la materia prima que contiene azúcares
•
La fermentación acética del alcohol pro ducido.
El procedimiento por seguir en cada etapa de pende de: la materia prima, los microorganis mos utilizados y las condiciones ambientales. Si la materia prima es una fruta, las etapas del proceso general se exponen en el Esquema 7.1.
Vinagre Esq u em a 7 .1 :
CMíwio7: LA PRODUCCIÓN DE VINAGRES Y VEGETALES FERMENTADOS
Las e tap as d el p ro ce so d e e la b o ra c ió n de vinagre a partir de una fruta.
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El proceso de elaboración del sauerkraut es bas tante sencillo. Sus etapas se resumen en el Es quema 7.2 y se describen a continuación. Repollo
El picado El repollo se pica con una cortadora en reba nadas de 0,1 cm de grosor aproximadamente; de esta forma, se aumenta en gran medida el área superficial, lo que beneficia tanto la ex tracción de los líquidos del repollo como el desarrollo de los microorganismos.
La adición de sal Las principales funciones de la sal en el proce so de elaboración del sauerkraut son las si guientes:
Esq u em a
7.2:
Las etapas del proceso de elaboración del sauerkraut.
El acondicionamiento Al inicio, se eliminan las hojas superficiales del repollo; luego, se parte en dos y se le ex trae el corazón. Posteriormente, el repollo se lava para eliminar la suciedad que pueda con tener y, así, evitar la contaminación con mi croorganismos indeseables. Es importante mencionar que no se debe adicionar ningún aditivo al agua, como doro, ya que podría eli minar por completo los microorganismos que se encargarán de la fermentación.
•
Extraer -del repollo- el agua, los azúcares, las proteínas y otras sustancias que son utilizadas por los microorganismos para su desarrollo.
•
Favorecer la fermentación láctica, ya que inhibe el crecimiento de otros microorga nismos.
•
Contribuir al sabor, el aroma y la firmeza del producto final.
El repollo se debe mezclar muy bien con la sal. Normalmente, se utiliza ima concentración de un 2,5% p/p (2,5 kg de sal por cada 100 kg de repollo y sal). Una concentración mayor favo rece la extracción de jugos del repollo así co mo la firmeza del producto final; sin embargo, puede inhibir los microorganismos partici pantes en la fermentación. Luego, el repollo se coloca en el termentador (puede ser un re cipiente plástico). La fermentación se inicia cuando, por efecto del contacto entre la sal y el repollo, se extraen los jugos de este último y se forma una sal muera, es decir, una disolución de la sal en el jugo del repollo. En esta salmuera están di sueltos los nutrimentos necesarios para el de sarrollo de los microorganismos.
cwruto7'. LA PRODUCCIÓN DE VINAGRES Y VEGETALES FERMENTADOS
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La preparación del medio Una vez fermentados los vegetales, se prepara el encurtido o medio con el que se mezclarán. El medio se formula a partir de vinagre, ácido acético o mostaza; además, se le agregan otros compuestos. La formulación de un medio con ácido acético se expone en el Cuadro 7.3.
La mezcla de vegetales con el medio preparado Los vegetales se mezclan con el encurtido pre parado en una proporción 60:40, es decir, el 60% del peso corresponde a los vegetales y el resto al medio. La mezcla se calienta hasta ebullición y, luego, sin dejar que se enfríe, se envasa.
Cuadro 7.3
LA FORMULACIÓN DE UN MEDIO PARA ENCURTIDOS
•
Ingrediente
Concentración (g/< )
Ácido acético
0,25
Sal
0,15
Azúcar
0,40
Bisulfito de socio
0,20
Laurel
0,2*
en ftVg de vegetale*
Fuente: Bonilla et a/, (s.f., 50j.
o n 7VX0 7 :
El empaque y el enfriamiento Los encurtidos se envasan en recipientes de vidrio o en bolsas plásticas. Los recipientes deben ser esterilizados previamente, por me dio del procedimiento que se indicó en el pro ceso para la elaboración del repollo ácido. El llenado, como se mencionó, se realiza en caliente, y el recipiente se debe tapar inmedia tamente; luego, se deja enfriar a la temperatu ra ambiental. Mediante este tratamiento, se logra un envasado al vacío, ya que el vapor originado por el producto caliente expulsa el aire y ocupa su lugar dentro del recipiente; cuando el frasco se enfría, el vapor se conden sa y se genera un varío.
LA PRODUCCIÓN DE VINAGRES Y VEGETALES FERMENTADOS
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CAPITULO
LA PANIFICACION i 1
S u m a r io
Introducción Los ingredientes utilizados en la e la b o ra c ió n
del
pan
El proceso de elaboración del pan
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Las gluteninas y las gliadinas representan el 85% de las proteínas de la harina de trigo; se combinan con el agua para formar el "gluten", que permite a la masa retener el gas. Las glu teninas hidratadas forman una masa muy elástica, mientras que las gliadinas configuran una masa más fluida, viscosa y poco elástica. Por lo tanto, las gluteninas son responsables de la elasticidad de la pasta, es decir, su capa cidad de estirarse y recuperar su apariencia original, mientras que las gliadinas le adjudi can su extensibilidad. Estas dos proteínas se encuentran en proporciones similares y, cuan do hay variaciones, la influencia de cada una de ellas se percibe en el pan. Para conocer la textura del gluten, realice la si guiente actividad.
•
El azúcar El azúcar tiene una serie de funciones impor tantes en la elaboración del pan; las principa les son: •
Favorece el sabor.
•
Es el causante de la generación del color dorado de la corteza del pan al hornearlo. Esto es debido al compuesto llamado melanoidina, resultante de la reacción entre los azúcares y los grupos amino de las proteínas.
•
Ayuda a retener la humedad del pan una vez horneado, debido a su propiedad hi groscópica.
•
Es el sustrato que utilizan las levaduras para su metabolismo. El almidón de la ha rina es hidrolizado en azúcares por las en zimas presentes en ella, pero el proceso de hidrólisis del almidón es lento y gradual. Entonces, para que, al inicio, la levadura se reproduzca rápidamente, es necesario adicionar azúcar. Otra razón para agregar azúcar es que la concentración inicial de monosacáridos y disacáridos no supera el 0,5%, lo cual es insuficiente para mantener una velocidad adecuada de fermentación.
Moje un poco de harina con agua, colóquela en un colador y amásela con más agua hasta que el agua de lavado sea transparente y se obtenga una masa hulosa y resistente. Esta masa es el gluten.
La sal La sal se le agrega a muchos alimentos prepa rados; el pan es uno de ellos. Las funciones de este ingrediente en el pan se citan a continua ción. •
Mejora su sabor, ya que la sal resalta los sa bores de algunos de los otros ingredientes.
•
Contribuye a mantener la humedad del pan una vez horneado, a causa de su alta higroscopicidad (capacidad de absorber agua de la atmósfera).
•
Fortalece la retención del gas y facilita el manejo de la masa, porque estabiliza y contrae el gluten.
(M im o8: LA PANIFICACIÓN
Ayuda en el control del proceso de fer mentación. Cuando se requiere que la fer mentación sea lenta, se adiciona una ma yor cantidad de sal (siempre dentro de ciertos límites para que no afecte negati vamente el sabor), ya que la sal limita el crecimiento de la levadura y restringe el crecimiento de otros microorganismos in deseables.
[
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OBJETIVOS
a)
Definir el concepto de proteína unicelular,
b)
Explicar el proceso de producción de la protema unicelular y el de los hongos comestibles.
c)
Indicar, respecto de la proteína unicelular, los hongos comesti bles, los ácidos orgánicos y las enzimas:
192
•
Los microorganismos involucrados en cada proceso.
•
Los sustratos adecuados para el desarrollo de cada microorga nismo.
•
Las condiciones ambientales óptimas tpH, temperatura, oxí geno, entre otras) para que los microorganismos crezcan, en el caso de la producción de biomasa, o metabolicen el com puesto deseado.
•
La utilidad industrial.
M ic r o b io l o g ía in d u s t r ia i / A L IC IA H l k n á n d é z
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5% en las levaduras producidas a partir de alcanos y un 15%, en las bacterias obteni das del sustrato metanol. Como se men cionó, el consumo de ácidos nucleicos es perjudicial al ser humano; en ese caso, se deben eliminar estos ácidos de la proteína. Por el contrario, la mayoría de los anima les son capaces de metabolizar los ácidos nucleicos y excretarlos en la orina, por lo que su presencia no es un inconveniente. •
La presencia de sustancias tóxicas. Exis te la posibilidad de que el microorganis mo contenga restos del sustrato, ya sea in ternamente o como contaminación, lo cual es peligroso si el sustrato utilizado para la producción de PUC es tóxico, como lo son algunos hidrocarburos; otras veces, el mi croorganismo puede producir metabólicamente sustancias tóxicas. Por lo tanto, se deben hacer pruebas exhaustivas para comprobar la ausencia de compuestos tó xicos en el producto.
Para ilustrar la producción de microorganis mos como objetivo principal de la fermenta ción, realice la siguiente actividad. Mencione algún proceso en el que se produzcan microorganismos, en forma masiva, en el país. Especifique su destino final.
L a PRODUCCIÓN DE HONGOS COMESTIBLES
La producción de setas u hongos de sombrero El consumo humano de hongos cultivados se practica desde antes del nacimiento de Cristo, principalmente en los países asiáticos. En el Cuadro 9.4, se indican algunas de las especies de hongos o setas que se consumen, en la ac tualidad, a escala mundial.
Cuadro 9.4
ALGUNOS HONGOS COMESTIBLES Nombre científico
Nombre común
Agaricus bisporus
Champiñón
Lcntinus cdodes
Shiitake
Volvariella volvacea
Hongo chino
Flamulina velutipes
Hongo de invierno
Pleurotus ostreatus
Hongo ostión
Pholiota nameko
Nameko
Auncularia sp.
Auricularia
Amanita silváticas
Hongo de basura
Helvca crispa
Orejitas de ratón
Ustilago maydís
Huitlacoche
Tutxr mclanosporum
Trufas
Fuente: Adaptado de Leal (1993).
Los hongos se clasifican como organismos heterótrofos. Algunos, como el huitlacoche, son parásitos; otros, como el champiñón y el shiitake, son saprofitos o, como las trufas, forman asociaciones con las plantas. Los hongos se utilizan como complemento en las comidas; el que más se consume a escala mundial es el Agaricus bisporus, que se muestra en la Ilustración 9.1. Este hongo, según repor ta Leal (1993,353), contiene de un 82 a un 85% de humedad y un 7,75% de proteínas en base se ca. Sus proteínas poseen todos los aminoáci dos esenciales y algunos minerales, como el potasio, el fósforo, el hierro y el manganeso; además, es rico en vitaminas del complejo B. Por lo anterior, el champiñón es un alimento no solo agradable desde el punto de vista or ganoléptico, sino de gran valor nutricional. El ciclo de vida de los champiñones se divide básicamente en dos etapas: •
La fase vegetativa.
•
La fase generativa.
ghouo 9: LA PROTEÍNA UNICELULAR Y O TRO S PR O D U C TO S U TILIZADO S
201
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pleados así como los usos posteriores varían según la enzima involucrada; esa información se muestra en el Cuadro 9.5. Al igual que en la producción de otros metabolitos de interés mencionados, los microorganis mos no producen las enzimas en las cantidades necesarias desde el punto de vista industrial, por lo que se debe estimular su sobreproduc ción. Esto se hace, hoy, por manipulación ge nética de los microorganismos o por medio de cepas mutantes. Sin embargo, aunque se tenga un microorganismo con un alto rendimiento de producción de una determinada enzima, es im portante llevar a cabo su recuperación en una forma apropiada: en esta etapa, se debe asegu rar la permanencia de la actividad de la enzi ma, ya que de nada vale obtener grandes can tidades de ella, si va a perder su actividad du rante la recuperación y la purificación.
enzimas intracelulares) y la separación de los sólidos (por medio de centrifugación o filtra ción). La purificación de las enzimas se puede llevar a cabo por una serie de operaciones, en tre las que se pueden mencionar: la precipita ción de la enzima por fuerza iónica (salting out), la precipitación de la enzima por solven tes orgánicos miscibles, la ultrafiltración y la cromatografía de adsorción. Las etapas que se utilicen dependen del proceso de producción de la enzima. En el Capítulo 3 de este texto y en libro de Illanes (1994) se puede encontrar más información sobre cada una de estas etapas. Para complementar el estudio del tema, reali ce la siguiente actividad. Investigue la razón por la cual no se producen ácidos orgánicos, aminoácidos ni enzimas en el país. (Puede consultar a profesionales afines al área).
Las principales etapas de recuperación de las enzimas son la ruptura celular (en el caso de
Cuadro 9.5
ALGUNAS ENZIMAS DE INTERÉS INDUSTRIAL OBTENIDAS POR FERMENTACIÓN Sustrato
Microorganismo
Enzima obtenida
Usos
Almidón de papa, pasta de soya, Mucor miebei malta y carbonato de calcio
Proteasa
Fabricación de queso
Almidón
Bacillus licheniformis Aspergillus oryzae Bacillus amyloliquetaciens
a-amilasa
Obtención de jarabes con glucosa,maltosa y oligosacáridos
Almidón
Aspergillus niger
Amiloglucosidasa
Obtención de jarabes con glucosa,maltosa y oligosacáridos
Pecti na
Aspergillus niger
Pectinasa y Hemicelulasa
Clarificación de jugos de frutas y vinos
Glucosa
Bacillus coagulans Streptomyces phaechromogenes Streptomyces olvaceus Streptomyces o/ivochromogenes
Glucosa isomcfasa
Obtención de fructosa
Sacarosa
Leuconostoc mesenteroides
Dextransacarasa
Obtención de dextranas
Lactosa
Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis Candida pseudotropicalis
Lactasa
Obtención de glucosa y galactosa
(M u lo * LA PROTEÍNA UNICELULAR Y O TRO S PRO D U C TO S UTILIZADO S
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Leal,
H. 1993. "Producción de hongos comestibles". Cap. 10. En: Biotecnología ali mentaria. México: LIMUSA. A. y R. Q u in t e r o . 1987. Tecnología enzimàtica: Aplicaciones en ali mentos i/medicina. México: Universidad Nacional Autónoma de México.
LÓPEZ-MUNGUÍA,
a.; B r it o E. y E. G a UNDO. 1993. "Biopolímeros". Cap. 13, En: Biotecnología alimentaria. México: LIMUSA.
LÓPEZ-M u n c u ÍA,
LÓPEZ-MUNGUÍA, A.
1993. "P ro d u c c ió n d e e n z im a s m ic ro b ia n a s". tecnología alimentaria. M é x ico : LIMUSA.
C ap .
18. En: Bio
Novo's Itandbook of practica! biotechnology. 1986. Dinamarca: C.O.L. Boyce. Novo In dustri A/S. QUINTERO, R. 1993. "Proteína unicelular". Cap. 9. En: Ingeniería bioquímica: Teoría
y aplicaciones. México: Alhambra Mexicana. . 1993b. "Aminoácidos". Cap. 12. En: Bioteawlogia alimentaria. México: LIMUSA. STEVENS
F. [en 1ínea\. 1998. Agaricus bisporus. . [Consulta: 16 de marzo del 2000].
WaCHER, C.
"Alimentos y bebidas fermentados tradicionales". Cap. 9. En: Biotecnología alimentaria. México: LIMUSA. 1993.
WARD, O. 1991. Biotecnología de la fermentación: Principios, procesos y productos. Es paña: Acribia. Whitbum, T. [en línea], 1995. Single celi protein and mycoprotein. . [Consulta: 2 de marzo del 2000].
214
M i c r o b i o l o g í a i n d u s t r i a l i A lic ia H ík n á n d íz
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Por cada treinta y cinco gramos de carbono presentes en los carbohidratos, los triglicéridos y las proteínas del sustrato que se va a de gradar, debe haber un gramo de nitrógeno, que proviene principalmente de las proteínas (relación 35:1). Si la diferencia es menor, exis te un exceso de nitrógeno que es excretado de la célula en forma de amonio o de amoniaco, según el pH: en un pH ácido, gran parte se mantiene como ion amonio, de fácil lixivia ción; en un pH alcalino, el amonio se transfor ma en gas amoniaco, que se evapora (su pre sencia se detecta por su olor a orín humano). La reacción en un pH alcalino es la siguiente:
mus, que es la fracción orgánica del suelo que presenta el mayor avance de biodegradación.
El proceso anaerobio de biodegradación La ausencia de oxígeno en el medio obliga, a los diferentes organismos, a trasladar, durante la glucólisis, el hidrógeno (del NADH2) a otra sustancia (diferente del oxígeno). Por ejem plo, en las levaduras que producen la fermen tación etanólica, el NADH2 entrega sus electro nes (hidrógenos) al acetaldehído y lo reduce a etanol, mediante la reacción:
N H 4* + O H -* • N H j (gas) + H 20
Amonio
Amoniaco
Reducción
C H j-C H O + N A D H j
► C H 3-C H H O H + NAD*
Acetaldehído
La formación de amoniaco no es conveniente, porque la disipación del gas implica la pérdi da de nitrógeno, nutrimento esencial para la fertilidad de los suelos; además el amoniaco contamina la atmósfera y perjudica la salud humana. La eficiencia de la producción de biomasa a partir de las proteínas es similar a la que se lo gra a partir de los carbohidratos, es decir, aproximadamente 50% de la proteína se con vierte en biomasa.
La b io d eg ra d a c ió n d e la lignina La lignina es una macromolécula formada por múltiples sustancias fenólicas, derivadas del ácido cinámico. Es el componente más resis tente a la biodegradación y, en condiciones anaerobias, es prácticamente no biodegradable. Los mecanismos de las reacciones quími cas y bioquímicas que ocurren aún no están bien dilucidados, pero la presencia de oxígeno molecular es imprescindible en el proceso. Un producto inmediato que se obtiene es el hu
Elanol
En el caso de las bacterias lácticas, el NADH2 cede sus electrones al ácido pirúvico, y se ob tiene ácido láctico: Reducción
CHj- CO - COOH 4 NADH2 — ► CHr CHOH-COOH +NAD* Ácido pirúvico
Ácido láctico
Debido a que el sustrato no se oxida hasta C 0 2 y H20 , la energía contenida en la glucosa es aprovechada tan solo en una vigésima par te. Por esta razón, la producción de biomasa en los procesos anaerobios es veinte veces me nor que en los procesos aerobios. Esto repre senta ventajas y desventajas para los procesos de tratamiento de aguas y desechos sólidos. Cuando el proceso de tratamiento es anaero bio, la ventaja consiste en la baja producción de biomasa residual y la desventaja en que el crecimiento de la flora microbiana es muy len to. Si el tratamiento se lleva a cabo por un proceso aerobio la situación es inversa: hay un crecimiento acelerado de la flora (ventaja), pero se generan muchos lodos de desechos que deben ser tratados (desventaja).
o x m o m EL TRATAMIENTO 8IOTECNOLÓGICO DE LOS DESECHOS SÓLIDOS
221 Copyrighted materia!
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Una vez agotadas las fuentes de fácil biodegradadón, la temperatura disminuye hasta al canzar aproximadamente los 30 °C. En este proceso de disminudón de la temperatura se enmarca la tercera fase. La cuarta fase comprende el periodo de ma duración, en el que la temperatura del sustra to desciende hasta llegar a la del ambiente. El producto final debe presentar las caracterís ticas que se muestran en el Cuadro 10.3. Cuadro 10,3 LAS CARACTERÍSTICAS DESEABLES DE LA COMPOSTA Parámetro Materia orgánica Nitrógeno Relación carbono:rutrógeno
Valor 20 -40% p/p 0,8 * 1,8% p/p 10:1 -20:1
Contenido de humedad
40 - 50 % p/p
Densidad aparente
0,5 - 0,8 kg/f
pH
7,5-8
Fuente: Backhus ( 1995. 71.
Si la relación carbonoinitrógeno es mayor que veinte, el producto, al ser aplicado, toma el ni trógeno disponible en el suelo para convertirlo en biomasa microbiana y, por lo tanto, provoca un bajo rendimiento del cultivo, a causa de la deficiencia momentánea de este elemento. El contenido de humedad recomendado se fundamenta en razones de índole económica y biológica: el producto debe contener más del 40% de agua con el fin de asegurar la acti vidad de microorganismos beneficiosos para la flora edáfica; pero, por razones económicas, no debe superar el 50% de agua, pues al agri cultor no le interesa comprar agua. En una investigación sobre la eficiencia de la producción de sorgo, en condiciones de inver nadero, se encontró que solo las compostas con las concentraciones mínimas y máximas, que se indican en el siguiente cuadro, dieron resultados satisfactorios en el análisis de la productividad. Cuadro 10.4
Los componentes minerales y orgánicos de la composta se encuentran en forma de macromoléculas de difícil biodegradación (lignocelulosa, lignoproteínas y áddos húmicos), por lo que este sustrato representa una valiosa re serva de nutrimentos para la flora edáfica y se emplea como abono. Se ha encontrado que la composta brinda las siguientes ventajas a los cultivos: • Suministra nutrimentos de difícil lixiviadón. • Mejora la estructura del suelo. • Aumenta la población de lombrices. • Aumenta la flora edáfica.
CONTENIDO DE LAS COMPOSTAS QUE PRODUCEN BUEN RENDIMIENTO EN SORGO Sustancia
H ,0 *
Mat.org N
Concentración (%) -Máxima 50 Relación C:N
P Ca Mg K Mínima
30
1,2
1,0 0,1 0.4 0,6
17:1
Fuente: Arroyo (1997, 64).
No existe consenso mundial sobre los valores máximos permitidos de las concentraciones de los metales pesados que contiene la composta; en el Cuadro 10.5 se muestran los valores que rigen en los países de la Unión Europea.
• Actúa como retenedor de humedad • Favorece el escurrimiento del agua de exceso.
Ort>uo 10: EL TRATAMIENTO BIO TEC N O LÓ G IC O DE LOS DESECH O S SÓ LID O S
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las desiertas arenas y ruinas de orgullosas civilizaciones.
El objetivo de toda planta de tratamiento de aguas residuales es remover la materia -biode gradable y no biodegradable- con la que el lí quido ha sido contaminado. En Costa Rica, más del 90% de las aguas residuales de la in dustria y domiciliares no son tratadas. A partir de 1992, los principales contaminantes de los ríos de Costa Rica -los beneficios de café y los ingenios de azúcar- fueron obligados a dar tra tamiento a sus aguas residuales para reducir la carga contaminante: desde un valor de quince mil y mil miligramos de DB053 por litro, res pectivamente, hasta un valor de mil y ciento cincuenta miligramos de DBO5J0 por litro.
De acuerdo con la procedencia, las aguas resi duales se clasifican en: •
Ordinarias: generadas por las actividades domésticas de seres humanos.
•
Especiales: generadas por cualquier otra actividad diferente a la doméstica.
En Costa Rica, el marco legal que determina las cantidades máximas de contaminantes es tá definido en el Reglamento de vertido y reuso de aguas residuales, publicado en La Gaceta del 19 de junio de 1997. En el próximo cuadro se ofrece la frecuencia mínima de muestreo de los indicadores más importantes.
•
Sólidos sedimentables (arena, material biodegradable y objetos).
•
Sólidos suspendidos (coloides y microor ganismos).
La ley establece, además, los valores máximos de diferentes parámetros que varían según el destino de las aguas: vertidas en el alcantari llado sanitario o en cuerpos de agua (ríos, la gos, estuarios, manglares, entre otros). En el Cuadro 10.8, se presentan los valores relacio nados con la depuración biotecnológica de las aguas. La lista completa de valores máximos puede ser consultada en los dos primeros cua dros del Anexo de este capítulo.
•
Sólidos disueltos (compuestos orgánicos e inorgánicos).
Existen diferentes procesos de tratamiento de aguas residuales, sin embargo, todos tienen en
Según el estado físico en que se encuentren los contaminantes de las aguas, se diferencian tres tipos de estos materiales:
Cuadro 10.7
LA FRECUENCIA MÍNIMA DE MUESTREO Y LOS ANÁLISIS PARA AGUAS RESIDUALES DE TIPO ORDINARIO Y ESPECIAL Parámetro
Caudal (mVdíal TtPO ORDINARIO
pH, sólidos sedimentables y caudal Grasas y aceites» DBOs 2(>; coüíormes y sólidos suspendidos totales
<50
50 a 100
> 100
Mensual
Semanal
Diario
Anual
Semestral
Trimestral
Tip o e sp íc ia i
Temperatura, pH. sólidos sedimentables y caudal Otros parámetros obligatorios
<10
10a 100
> 100
Mensual
Semanal
Diaria
Anual
Semestral
Trimestral
Fuente: U Gaceta <19 de junio de 1997).
M w i o w EL TRATAMIENTO BIOTECNOLÓGICO DE LOS DESECHOS SÓLIDOS
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Salida de aire
D iagrama i 0.5: Un biorreactor de torre (Cía. Bayer).
Fuente: Adaptado de Dellweg (1987).
El de torre biológica. El sistema de torre, desarrollado por la empresa Bayer (se re presenta en el Diagrama 105), aprovecha la presión hidrostática que ejerce la columna de agua. La entrada de aire está ubicada al fondo del tanque sobre la entrada del agua residual; esto permite la generación de turbulencias y burbujas de pequeño diámetro, que facilitan la disolución del oxígeno. El tiempo de retención (de per manencia del agua) es de catorce horas y media. El reactor mide veintiséis metros de diámetro por treinta metros de altura y tiene una capacidad para contener trece mil seiscientos metros cúbicos de líquido. El sustrato entra al tanque por la parte infe rior y, ahí, se mezcla con aire fresco. As ciende a través del biorreactor y, por vasos comunicantes, pasa al tanque sedimenta dor ubicado en la parte superior. Aquí, los lodos sedimentables se separan y el líquido -claro y tratado- sale. Parte de los lodos pueden ser reincorporados al sistema me diante una tubería que viene del tanque se dimentador y, así, se mantiene la cantidad suficiente de microorganismos activos.
Los tratamientos anaerobios de aguas residuales Desde principios del siglo X X , los procesos anaerobios se limitaron al tratamiento de lo dos provenientes de procesos aerobios. Sin embargo, el aumento del precio de los com bustibles ha elevado los costos energéticos de la incorporación del aire y, por lo tanto, el tra tamiento anaerobio se ha convertido en un proceso rentable, sobre todo en el caso de aguas residuales con una DBO520 superior a diez mil miligramos por litro. Debido al lento crecimiento de las bacterias en condiciones anaerobias, el diseño de los dife rentes reactores tiene como objetivo la reincor poración o retención de la mayor cantidad de biomasa microbiana. Al igual que en el tratamiento anaerobio de desechos sólidos, es preferible efectuar la hi drólisis, la ácidogénesis así como la acetogénesis en una fase, y la metanogénesis en otra. Los procesos anaerobios más comunes se rea lizan en tres tipos de biorreactores:
oifíuo ta EL TRATAMIENTO BIOTECNOLÓGICO DE LOS DESECHOS SÓLIDOS
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sa a partir de la utilización de sustancias orgánicas, con la presencia o ausencia del oxígeno. 2. Las formas más comunes para clasificar un proceso fermentativo son: •
Con base en la naturaleza del producto por obtener, debido a su importan cia económica. Entre los productos que se obtienen de las fermentaciones se encuentran: biomasa, enzimas microbianas y metabolitos primarios o se cundarios.
•
Con base en la presencia o ausencia de oxígeno en las fermentaciones; pue den ser aerobias y anaerobias.
3. Algunos productos de interés industrial obtenidos por fermentación se pueden encontrar en el Cuadro 3.1. 4. Las rutas bioquímicas más comunes para la producción de diversos metabolitos, por utilización de sustancias orgánicas como fuente de carbono y energía, son la glucólisis y el ciclo de Krebs. Una breve explicación de ellas se encuentra en la sección Las rutas bioquímicas de las fermentaciones. 5. a) Un fermentador es un recipiente en el que se lleva a cabo la fermentación, en condiciones controladas. b) Las características de un fermentador se encuentran enumeradas en la sec ción Los fermeniadores. 6. Los tipos de reactores más utilizados son el matraz erlenmeyer, el de tanque agi tado y el de elevación con aire. Además, no se puede dejar de mencionar el de dis co rotatorio debido a su gran importancia en el tratamiento de aguas residuales. 7. Cultivo eti lote: el sistema se inicia con la adición de los nutrimentos y el microor ganismo en condiciones controladas. La operación es por tiempo limitado, sin adición de medio de cultivo ni microorganismos. Cultivo continuo: en este sistema se suministra la solución de nutrimentos a los microorganismos, a la misma velocidad con la cual se extrae medio de cultivo gastado y que contiene microorganismos y metabolitos. Se opera bajo condicio nes de estado estacionario. 8. Los compuestos de interés en una fermentación son generados en diferentes eta pas del crecimiento del microorganismo, entonces, si se conoce la fase durante la cual se presenta la mayor concentración del producto de interés, es posible manipular las condiciones de fermentación, de tal forma que se extienda dicha fase. También, se pueden manipular las condiciones de cultivo para regular la actividad metabòlica del microorganismo. 9. Las dos técnicas básicas de cultivo continuo son el mezclado homogéneo, que se puede realizar por quimiostato y turbidostato, y el flujo tapón. La información sobre ellas se encuentra en la sección El cultivo continuo. 10. Las ventajas y las desventajas del cultivo continuo se enumeran en la sección Las vetitajas y las desventajas del cultivo continuo en relación con el cultivo en lote.
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c)
Estos productos pueden elaborarse con o sin cultivos iniciadores, ya que los microorganismos involucrados se encuentran en el aire y en la superficie de los vegetales o las frutas; sin embargo, es importante recordar que se obten drá un producto de mejor calidad si se emplean los cultivos iniciadores.
7. Las ventajas y desventajas de los dos métodos indicados de producción de vina gre, se resumen en el siguiente cuadro: M
V en t a ja s
éto do
DE5VENTAIAS
Orleans
• Simple • Equipo sencillo y barato • Puede ser operado en pequeña escala
• lento ♦ Regimientos no mayores del 85%
Acetificación sumergida
• • • •
• Elevada inversión inicial en equipo • Gran consumo de electricidad • Se deben controlar muv bien las condiciones del proceso para tener una calidad uniforme
Alto rendimiento {del 95 al 98%) Rápido Proceso semicontinuo Vinagre de calidad uniforme
r
8. El proceso de elaboración del sauerkraut se describe en la sección El repollo ácido o sauerkraut. 9. Dos posibles efectos de no agregar sal durante la fabricación del sauerkraut, son: •
El proceso de fermentación láctica no se llevaría a cabo o sería muy lento, ya que los compuestos requeridos por los microorganismos para su metabolis mo (los nutrimentos) no estarían disponibles (no serían extraídos del repollo).
•
Podrían crecer microorganismos diferentes a las bacterias lácticas, ya que la sal es un inhibidor de microorganismos indeseables.
10. Los encurtidos son conservas de vegetales obtenidos por cocción o por fermen tación. Pueden ser mixtos (mezcla de vegetales) o de un solo tipo de vegetal. Se pueden preparar en trozos o enteros. 11. El proceso de elaboración de un encurtido fermentado se describe en la sección Los encurtidos.
C a p ítu lo 8 :
LA PANIFICACIÓN
1. Si la levadura se seca por medio de calor, lo más probable es que el microorga nismo muera y, entonces, no es útil. 2. La principal ventaja de un pan preparado a partir de levadura se encuentra en el sabor, porque, en la fermentación, no se produce únicamente etanol y dióxi do de carbono, sino además una serie de compuestos orgánicos, tales como, los ácidos láctico, acético, butírico y succínico, que contribuyen con el sabor del pan. Además, el crecimiento de la levadura, y por ende la producción de los com puestos tales como el dióxido de carbono, es gradual, lo que beneficia el desa rrollo del volumen de la miga, mientras que el efecto de los polvos de hornear es prácticamente inmediato (de una sola vez se produce todo el gas). 262 Copyrighted material
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AUCIA HERNANDEZ PEÑARANDA
ILEANA ALFARO ÀLVAREZ
RONALD ARRIETA CALVO
Lkemioda en Tecnología de Alimentos, Universidod de Costa Rica, 1988. MSc. con honores en Biotecnología, Deportamento de Biotecnología del Centro . de Investigación y de Estudios Avonzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV), México, 1995. Profesora investigadora del Centro de Investigoción en Productos Naturales de la Universidad de Costa Rica (CIPRONA) desde 1989. Dentro de sus funciones principales se encuentro el generar y ejecutar proyectos de mvestigoción, osí como organizar actividades científicas relacionados con su área de preparación. Es profesora del posgrado en Tecnología de Alimentos de la Universidod de Costa Rica desde 1997 y profesora colaboradora del posgrado en Químico también de la Universidad de Costa Rka desde el 2000. Además es miembro invitado del Consejo Asesor Gentifico del CIPRONA desde 1990.
Lketictodo en Tecnología de ARmentos, Universidad de Costo Rica, 1987. Realizo pasantías de tres meses cada una en el área de fermentaciones, en ICAIT1 (Geatemala, 1987), CODETEC (Brasil, 1991) y Cervecería del Ború, S.A. (Panamá, 1993). Fue profesora investigadora del Centro de Investigodón en Productos Naturales (CIPRONA) de lo Universidod de Costa Rico desde 1986 basta 1990, y profesora investigadora de la Unidad de Transferencia de Tecnología (UTT) de la Vkerrectoria de Investigodón de la Universidad de Costa Rka desde 1990 basta 1993. Laboró como gerente de caldod de la Cervecería Americana en Costa Rka desde 1993 hasta 1995, a lo vez que colaboró en la instaloción y la puesta en marcha de la empresa, y en la implementoción del sistema de calidad, Es profesoro de la Escuela de Tecnología de ARmentos de lo Universidod de Costo Rko desde 1999, y fundadora y gerente de uno empresa de elaborodón de chocolates personalizados desde 1995.
MSc. Ing. en Tecnología de Alimentos, Universidod Técnica de Berlín, 1977 Dr. en Biotecnología Ambiental, Universidad Técnico de Berlín, 1991. Ha posodo cursos de espeáolización en manejo de desechos sólidos biodegradables en la misma universidod (1990), asi como cursos de especialhoción en manejo de desechos sóidos reciclables en la Universidod de Stuttgart 1995. Es profesor investigador de la íscuela de Química de la Universidod de Costa Rica desde 1983 y Director del Trabajo Comunal Universitario "Apoyo a lo gestión comunal en el manejo discriminado de desechos solidos" desde 1996. Fue consultor en la elaboración del diognóstko »obre el manejo de los desechos sólidos w Costo Rico para el PNUD en 1995 y diseñador del Sistema Integrado de Manejo y Aprovechamiento de Desechos SóBdos *n el mismo año. ReoBxó el diseño y la puesta en marcha de cuatro plantas de abono orgónko en Costa Rko desde 1994 hasto el 2000. También Reafizó el diseño y la puesta en marcha del centro de ocopio y la planta de compostoje del Hotel Irazú en 1996, asi como •I diseño y la puesto en marcha del centro de acopio de Santa Ana en 1999. Fue consultor y ejecutor de la asesor» sobre diagnostico y capacitación en manejo de desechos sólidos en cinco comunidades turistkos para el K T en el 2001.
