METALES PESADOS EN SUELOS Y PLANTAS: CONTAMINACIÓN Y FITOTOXICIDAD

VICERRECTORADO DE INVESTIGACIÓN

Metales Pesados en Suelos y Plantas: Contaminación y Fitotoxicidad

Cecilia Maura Mejía Dominguez M(o) Ciencia de Alimentos Departamento Académico de Bromatología y Nutrición

AGRADECIMIENTO: A mis alumnos quienes me incentivan cada día a ser mejor.

INDICE

Pag PRÓLOGO I.

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METALES PESADOS Y FITOTOXCIDAD

6 6 6 11 15 16 16 16 16 16

1.6 Clasificación de los cultivos en relación al riesgo alimentario 1.7 Fitotoxicidad 1.7.1 Metales en plantas y fitotoxicidad

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II. CADMIO: INGRESO, TRANSPORTE Y ACUMULACIÓN EN SUELOS Y PLANTAS 2.1 Generalidades. 2.2 Aspectos del cadmio 2.2.1 Caracterización 2.2.2 Aportes al ambiente 2.2.3 Efectos sobre la salud humana 2.2.4 Relación con el medio ambiente 2.3 Fuentes de contaminación de cadmio 2.4 Ingreso del cadmio en la cadena trófica 2.5 Ingreso, transporte y acumulación de cadmio 2.6 Toxicidad del cadmio 2.7 Estrategias de tolerancia al cadmio 2.8 Hiperacumulación y fitoextracción de cadmio 2.9 Modelo de evaluación y manejo del riesgo del cadmio en el suelo 2.9.1 Descripción general del modelo de acumulación 2.9.2 Concentraciones de cadmio en suelos agrícolas 2.9.3 Tasa anual de entrada de Cd a los suelos agrícolas (Ke) 2.9.4 Extracción de cadmio vía cultivos 2.9.5 Lixiviación de cadmio en suelos agrícolas

III.

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1.1 Características de los metales pesados 1.2 Origen y destino de los metales pesados en el suelo 1.2.1 Presencia de Metales en los suelos 1.3 Estrés por metales pesados 1.4 Absorción y traslocación de metales pesados en las plantas 1.5 El problema de la entrada de metales pesados en la planta 1.5.1 Contaminación del suelo 1.5.2 Dinámica de los metales pesados en el suelo 1.5.3 Transporte 1.5.4 Toxicidad de los metales pesados

FITOTOXICIDAD DEL PLOMO

3.1 Generalidades 3.2 Estrés por plomo 3.3 Distribución de plomo en la raíz 3.4 Plomo en el apoplasto 3.4.1 Pared celular

FITOTOXICIDAD 26 27 27 28 28 29 31 32 32 33 35 35 36 37 38 39 39 39 42 42 42 45 45 45

3.4.2 Membrana plasmática 3.5 Transporte de plomo 3.6 Efectos fisiológicos 3.6.1 A altas concentraciones de Pb 3.6.2 A bajas concentraciones de Pb 3.6.3 Efectos ultraestructurales 3.7. Efectos bioquímicos 3.7.1 Efectos sobre las actividades enzimáticas 3.7.2 Efectos sobre la fotosíntesis. 3.7.3 Efectos sobre la respiración y contenido en ATP 3.7.4 Efectos sobre la absorción de nutrientes 3.7.5 Efectos sobre las relaciones hídricas 3.8. Tolerancia al plomo 3.8.1 Metabolismo oxidativo 3.8.2 Mecanismos de protección vegetal 3.8.3 Mecanismos de tolerancia al plomo 3.9 Remediación de suelos contaminados con plomo

IV. OTROS METALES 4.1 Cromo 4.2 Manganeso 4.3 Níquel 4.4 Cobre 4.5 Cinc 4.6 Arsénico 4.7 Selenio 4.8 Molibdeno 4.9 Mercurio

45 46 48 49 49 50 50 51 51 53 54. 55. 56 56 56. 57 59

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V. MECANISMOS CELULARES PARA TOLERANCIA Y DETOXIFICACIÓN DE METALES PESADOS EN PLANTAS 5.1 Aspectos de interacción planta- metal relacionado con tolerancia y detoxificación 75 5.1.1 Micorrizaas 75 5.1.2 Pared celular y exudados de raíz 76 5.1.3 Membrana Plasmática 77 5.1.4 Quelación 78 5.1.5 Compartimentalización vacuolar 82 5.1.6 Biotransformación 84 5.1.7 Mecanismo de reparación celular 84 5.2 Mejora de la entrada y acumulación de los metales pesados en plantas 85 EPÍLOGO APÉNDICE GLOSARIO BIBLIOGRAFIA

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Metales Pesados en Suelos y Plantas: Contaminación y Fitotoxicidad

RESÚMEN

Debido a la diversidad de fuentes que pueden incrementar el contenido de metales pesados en los suelos agrícolas, se requieren estudios que evalúen el contenido y la distribución de los metales pesados en las distintas zonas geográficas, para estimar la calidad medioambiental de estas áreas y evitar su continuo deterioro. Asimismo, el estudio del contenido de metales pesados en los cultivos hortícolas permite evaluar la calidad de una parte de los alimentos consumidos, que pueden incrementar los niveles de estos elementos en el cuerpo humano con las posibles repercusiones para la salud. En el humano las tres principales vías entrada al cuerpo son: la inhalatoria ya sea en forma de partículas (gas o vapor) en forma elemental o como combinaciones inorgánicas u orgánicas, la dérmica a través de la piel y la oral cuando se ingiere bebidas o alimentos contaminados. Por lo mencionado es necesario contar con información actualizada sobre los contaminantes metálicos en el medio ambiente y los mecanismos que ocurren en el los sistemas biológicos y que factores pueden afectar la absorción y acumulación de estos metales en el suelo y plantas y por consiguiente en los alimentos los cuale son utilizados por el hombre y animales, siendo una fuente de exposición a estos contaminantes metálicos. En el presente se han considerado cinco capítulos: I. Metales pesados y su fitotoxcidad; II. Ingreso, absorción y acumulación del cadmio en suelos y plantas; III. Fitotoxicidad del plomo; IV. Otros metales pesados; V. Aspectos de Interacción de planta-metal relacionadas con tolerancia y detoxificación.

PRÓLOGO

Los metales pesados han sido ampliamente utilizados en muchas actividades, tales como la agricultura, la minería, la fundición, la galvanoplastia y el refinado del oro. Por lo tanto, se han documentado serios problemas asociados a la contaminación de los suelos en estas actividades. La acumulación de metales pesados en las plantas inhibe o activa algunos procesos enzimáticos que afectan su productividad tanto cualitativa como cuantitativamente. El plomo (Pb), el arsénico (As), el cadmio (Cd) y el zinc (Zn) y otros metales pesados pueden ser absorbidos por las plantas (Rodríguez-Ortíz et al., 2006) hasta concentrarse en sus tejidos a niveles tóxicos. Tal situación puede ser una posible vía de entrada de estos metales en la cadena alimentaria humana a través del consumo de plantas, directa o indirectamente por los seres humanos. Hay evidencias de que el Pb y Cd han sido la causa de efectos negativos sobre la salud humana, de la mortandad en animales, y la perturbación de los ecosistemas naturales y los agro-ecosistemas. En general, los metales pesados pueden ser potencialmente tóxicos para la salud humana. Los metales pesados acumulados en el suelo superficial se reducen lentamente mediante la lixiviación, el consumo por las plantas, la erosión y la deflación. Sin embargo, los niveles de contaminación y su impacto en algunas áreas requieren de alternativas que en periodos relativamente cortos reduzcan los niveles de contaminación por metales pesados y otros contaminantes. Debido a la diversidad de fuentes que pueden incrementar el contenido de metales pesados en los suelos agrícolas, se requieren estudios que evalúen el contenido y la distribución de los metales pesados en las distintas zonas geográficas, para estimar la calidad medioambiental de estas áreas y evitar su continuo deterioro. Asimismo, el estudio del contenido de metales pesados en los cultivos hortícolas permite evaluar la calidad de una parte de los alimentos consumidos, que pueden incrementar los niveles de estos elementos en el cuerpo humano con las posibles repercusiones para la salud. En el humano las tres principales vías entrada al cuerpo son: la inhalatoria ya sea en forma de partículas (gas o vapor) en forma elemental o como combinaciones inorgánicas u orgánicas, la dérmica a través de la piel y la oral cuando se ingiere bebidas o alimentos contaminados. Por lo mencionado es necesario contar con información actualizada sobre los contaminantes metalicos en el medio ambiente y los mecanimsos que ocurren en los sistemas biológicos y que factores pueden afectar la absorción y acumulación de estos metales en el suelo y plantas y por consiguiente en los alimentos los cuale son utilizados por el hombre y animales, siendo una fuente de exposición a estos contaminantes metálicos. En el presente texto, se han considerado cinco capítulos: I. Metales pesados y su fitotoxcidad; II. Ingreso, absorción y acumulación del cadmio en suelos y plantas; III. Fitotoxicidad del plomo; IV. Otros metales pesados; V.Aspectos de Interacción de planta-metal relacionadas con tolerancia y detoxificación. Para el desarrollo de estas unidades se han considerado los trabajos de investigaciòn de diferentes autores, los cuales se mencionan en el desarrollo de este texto, asi como en las referencias bibliográficas.

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I.

METALES PESADOS Y FITOTOXICIDAD

1,1 Características de los metales pesados El término de metal pesado refiere a cualquier elemento químico metálico que tenga una relativa alta densidad y sea tóxico o venenoso en concentraciones incluso muy bajas. Los ejemplos de metales pesados o algunos metaloides, incluyen el mercurio (Hg), cadmio (Cd), arsénico (As), cromo (Cr), talio (Tl), y plomo (Pb), entre otros ( Lucho et al., 2005a). Los metales pesados se encuentran generalmente como componentes naturales de la corteza terrestre, en forma de minerales, sales u otros compuestos. No pueden ser degradados o destruidos fácilmente de forma natural o biológica ya que no tienen funciones metabólicas específicas para los seres vivos ( Abollino et al., 2002 ). Los metales pesados son peligrosos porque tienden a bioacumularse en diferentes cultivos. La bioacumulación significa un aumento en la concentración de un producto químico en un organismo vivo en un cierto plazo de tiempo, comparada a la concentración de dicho producto químico en el ambiente ( Angelova et al., 2004 ). En un pequeño grado se pueden incorporar a organismos vivos (plantas y animales) por vía del alimento y lo pueden hacer a través del agua y el aire como medios de traslocación y dependiendo de su movilidad en dichos medios ( Lucho et al., 2005ª ). Como elementos traza, algunos metales pesados [por ejemplo, cobre (Cu), selenio (Se), zinc (Zn)] son esenciales para mantener un correcto metabolismo en los seres vivos y en particular en el cuerpo humano. Sin embargo, en concentraciones más altas pueden conducir al envenenamiento. Los metales pesados pueden incorporarse a un sistema de abastecimiento de agua por medio de residuos industriales que son vertidos sin previos tratamientos, los que posteriormente se depositan en lagos, ríos y distintos sistemas acuíferos ( García et al., 2005). La absorción de metales pesados por las plantas es generalmente el primer paso para la entrada de éstos en la cadena alimentaria. La absorción y posterior acumulación dependen en primera instancia del movimiento (movilidad de las especies) de los metales desde la solución en el suelo a la raíz de la planta. En plantas, el concepto de bioacumulación se refiere a la agregación de contaminantes; algunos de ellos son más susceptibles a ser fitodisponibles que otros (Kabata-Pendias, 2000). 1.2 Origen y Destino de los Metales en el suelo 1.2.1 Presencia de Metales en los suelos Los metales pesados están presentes en el suelo como componentes naturales del mismo o como consecuencia de las actividades antropogénicas. En los suelos se pueden encontrar diferentes metales, formando parte de los minerales propios; como son silicio (Si), aluminio (Al), hierro (Fe), calcio (Ca), sodio (Na), potasio (K), magnesio (Mg).

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También puede encontrarse manganeso (Mn), que generalmente se presenta en el suelo como óxido y/o hidróxido, formando concreciones junto con otros elementos metálicos. Algunos de estos metales son esenciales en la nutrición de las plantas, así son requeridos algunos de ellos como el Mn, imprescindible en el fotosistema y activación de algunas enzimas ( Mahler, 2003) para el metabolismo vegetal. Se consideran entre los metales pesados elementos como el plomo, el cadmio, el cromo, el mercurio, el zinc, el cobre, la plata, entre otros, los que constituyen un grupo de gran importancia, ya que algunos de ellos son esenciales para las células, pero en altas concentraciones pueden resultar tóxicos para los seres vivos, organismos del suelo, plantas y animales (Spain et al., 2003), incluido el hombre. En la corteza terrestre existe una similitud entre la distribución de níquel (Ni), cobalto (Co) y hierro (Fe). En los horizontes superficiales del suelo (capa arable), el Ni aparece ligado a formas orgánicas (Corinne et al., 2006), parte de las cuales pueden encontrarse formando quelatos fácilmente solubles. El níquel (Ni) es también un elemento esencial para el metabolismo de las -1 plantas, aún cuando éstas requieren menos de 0.001 mg kg de peso seco ( Mahler, 2003). También de forma natural puede encontrarse el zinc (Zn) en los suelos, y es un nutriente requerido por las plantas para su desarrollo.. Las actividades geológicas naturales, como desgastes de cerros y volcanes, constituyen una fuente de aportaciones importante de metales pesados al suelo. También las actividades antropogénicas como la industria minera, que está catalogada como una de las actividades industriales más generadora de metales pesados. En el suelo, los metales pesados, pueden estar presentes como iones libres o disponibles, compuestos de sales metálicas solubles o bien, compuestos insolubles o parcialmente solubilizables como óxidos, carbonatos e hidróxidos, (Pineda, 2004). La movilidad relativa de los elementos traza en suelos es de suma importancia en cuanto a su disponibilidad y su potencial para lixiviarse de los perfiles del suelo hacia las agua subterráneas y difiere de si su origen es natural o antrópico y, dentro de este último, al tipo de fuente antrópica ( Burt et al., 2003). Dentro de los metales pesados, los denominados oligoelementos, y que pueden servir como micronutrientes para los cultivos, ya que son requeridos en pequeñas cantidades y son necesarios para que los organismos completen su ciclo vital. Pasado cierto umbral se vuelven tóxicos, como el B, Co, Cr, Cu, Mo, Mn, Ni, Fe, Se y Zn y el metaloide As. También hay metales pesados sin función biológica conocida, cuya presencia en determinadas cantidades en seres vivos lleva aparejada disfunciones en el funcionamiento de sus organismos. Resultan altamente tóxicos y presentan la propiedad de acumularse en los organismos vivos, elementos tales como el Cd, Hg, Pb, Sb, Bi, Sn, Tl. (García y Dorronsoro, 2005). Cuando el contenido de metales pesados en el suelo alcanzan niveles que rebasan los limites máximos permitidos causan efectos inmediatos como inhibición del crecimiento normal y el desarrollo de las plantas, y un disturbio funcional en otros componentes del ambiente así como la disminución de las poblaciones microbianas del suelo, el término que se usa o se emplea es “polución de suelos” (Martín, 2000).

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En el suelo, los metales pesados como iones libres, pueden tener acción directa sobre los seres vivos lo que ocurre a través del bloqueo de las actividades biológicas, es decir, la inactivación enzimática por la formación de enlaces entre el metal y los grupos –SH (sulfhidrilos) de las proteínas, causando daños irreversibles en los diferentes organismos. La contaminación en suelos por metales pesados ocurre cuando estos son irrigados con aguas procedentes de desechos de minas, aguas residuales contaminadas de parques industriales y municipales y filtraciones de presas de jales (Wang et al., 1992). Una vez en el suelo, los metales pesados pueden quedar retenidos en el mismo pero también pueden ser movilizados en la solución del suelo mediante diferentes mecanismos biológicos y químicos (Pagnanelli et al., 2004). Los metales pesados adicionados a los suelos se redistribuyen y reparten lentamente entre los componentes de la fase sólida del suelo. Dicha redistribución se caracteriza por una rápida retención inicial y posteriores reacciones lentas, dependiendo de las especies del metal, propiedades del suelo, nivel de introducción y tiempo (Han et al., 2003). Los factores que influyen en la movilización de metales pesados en el suelo son características del suelo: pH, potencial redox, composición iónica de la solución del suelo, capacidad de intercambio (catiónico y/o aniónico), presencia de carbonatos, materia orgánica, textura, entre otras. La naturaleza de la contaminación y el origen de los metales y formas de deposición y condiciones medio ambientales producen acidificación, cambios en las condiciones redox, variación de temperatura y humedad en los suelos (Sauquillo et al., 2003). En general, los metales pesados incorporados al suelo pueden seguir cuatro diferentes vías: la primera, quedar retenidos en el suelo, ya sea disueltos en la fase acuosa del suelo u ocupando sitios de intercambio; segunda, específicamente adsorbidos sobre constituyentes inorgánicos del suelo; tercera, asociados con la materia orgánica del suelo y cuarta, precipitados como sólidos puros o mixtos. Por otra parte, pueden ser absorbidos por las plantas y así incorporarse a las cadenas tróficas; pueden pasar a la atmósfera por volatilización y pueden ser movilizados a las aguas superficiales o subterráneas (García y Dorronsoro, 2005). Para elucidar el comportamiento de los metales pesados en los suelos y prevenir riesgos tóxicos potenciales se requiere la evaluación de la disponibilidad y movilidad de los mismos (Banat et al., 2005). La toxicidad de los metales depende no sólo de su concentración, sino también de su movilidad y reactividad con otros componentes del ecosistema (Abollino et al., 2002). Los metales pesados contribuyen fuertemente a la contaminación ambiental, la cantidad de metales disponibles en el suelo está en función del pH, el contenido de arcillas, contenido de materia orgánica, la capacidad de intercambio catiónico y otras propiedades que las hacen únicas en términos de manejo de la contaminación (Sauve et al., 2000). El plomo (Pb), por ejemplo, es un contaminante ambiental altamente tóxico, su presencia en el ambiente se debe principalmente a las actividades antropogénicas como la industria, la minería y la fundición. En los suelos contaminados con Pb se suele encontrar también Cd y Zn (Hettiarchchi y Pierzynski, 2002) por analogía entre sus propiedades y características metálicas algo similar a lo que ocurre para la triada de Fe-Ni-Co. En estos casos la barrera suelo-planta limita la traslocación de Pb a la cadena alimenticia, ya sea por procesos de inmovilización química en el suelo según se ha reportado (Laperche et al., 1997) o limitando el crecimiento de la planta antes de que el Pb

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absorbido alcance valores que puedan ser dañinos al ser humano. El Pb presente en suelos contaminados puede llegar a inhibirse mediante la aplicación de fósforo y óxidos de magnesio; sin embargo estos tratamientos pueden llegar a afectar la biodisponibilidad de otros metales esenciales como el Zn ( Hettiarchchi y Pierzynski, 2002). Por otra parte, en lugares donde se han venido utilizando aguas residuales para el riego agrícola, se reporta una tendencia creciente en las concentraciones de metales en los suelos, por efecto en el tiempo (años) de uso de esta agua, donde las cantidades de metal que se extraen y se miden en estos suelos, se han asociado positivamente con el tiempo de uso de agua residual; mostrando una mayor tasa anual de acumulación el Ni y Pb. En suelos estudiados con diferente pH y contenidos de arcilla y materia orgánica, y donde se han añadido intencionalmente concentraciones de Pb y Zn, ha sido determinada la capacidad de la absorción de los mismos en cada tipo de suelo. Se sembró lechuga y después de cosechar las mismas se evaluaron nuevamente los suelos y se observó que disminuyó la concentración de estos metales en los suelos (Stevens, et al., 2003), lo que pone de manifiesto que éstos suelos contaminados son un riesgo para la salud porque las plantas pueden absorber estos metales. También el uso de fertilizantes ha venido a causar incremento de algunos compuestos en los suelos, que en ocasiones han causado algunos cambios en las características. Algunos fertilizantes como los nitrogenados que incluyen los nitratos, de amonio (NH 4NO3) y de sodio (NaNO3); la urea ((NH2)2CO); el fosfato de amonio (NH4H2PO4); los polifosfatos amónicos, entre otros, aportan al suelo los nutrientes básicos para el desarrollo de las plantas (Baur, 2004), permitiendo que aumenten la disponibilidad de los mismos, ya que son productos todos solubles en agua. Estos tienen algunos inconvenientes para los suelos, entre ellos, que pueden contener residuos de metales pesados como impurezas y que pueden quedar igualmente disponibles para las plantas y provocar daños en las mismas. Actualmente existen estudios tendientes a resolver la contaminación originada por metales pesados en suelos, mediante estrategias basadas en el uso de plantas que tienen la propiedad de acumular metales pesados; proceso denominado “fitorremediación” que consiste en la remoción, transferencia, estabilización y/o degradación y neutralización de compuestos orgánicos, inorgánicos y radioactivos que resultan tóxicos en suelos y agua. Como ejemplo, Rodríguez-Ortiz et al., (2006) estudiaron la extracción de Cd y Pb en plantas de tabaco encontrando potencial en dicha planta para este fin. Esta novedosa tecnología tiene como objetivo degradar y/o asimilar los metales pesados presentes en el suelo, lo cual tiene muchas ventajas con respecto a los métodos convencionales de tratamientos en lugares contaminados. En primer lugar es una tecnología de bajo costo, en segundo lugar, posee un impacto regenerativo en lugares en donde se aplica y en tercer lugar su capacidad extractiva se mantiene debido al crecimiento vegetal (Harvey et al., 2002). La fitorremediación no es un sencillo remedio o receta que sea aplicable para todos los suelos contaminados, antes de que esta tecnología pueda volverse técnicamente eficiente y económicamente viable, hay algunas limitaciones que necesitan ser superadas. Por ejemplo, sus mecanismos tanto moleculares, bioquímicos y fisiológicos, son pocos conocidos e insuficientemente

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entendidos; sin embargo, a pesar de esto, un gran número de plantas definidas como hiperacumuladoras, todavía pueden darse a conocer e identificarse (Freitas et al., 2004). La fitoremediación de suelos contaminados es una técnica con grandes posibilidades. El uso de especies vegetales tolerantes a altos niveles de metales en suelos y agua, permite actividades de restauración con menor impacto ambiental sobre los terrenos que otras técnicas tradicionales, más invasivas y con efectos secundarios adversos. Las enmiendas orgánicas pueden utilizarse igualmente para la remediación de suelos contaminados. La unión entre la materia orgánica y los metales (formación de moléculas complejas de elevada estabilidad), puede disminuir la capacidad de fitoextracción, disminuyendo así la fitotoxicidad y permitir que se pueda reestablecer la vegetación de sitios contaminados (Robinson et al., 1997). Desde 1991, el gobierno de China desarrolló y se han reportado pautas, para monitorear y evaluar los niveles de metales pesados en lugares contaminados (Chen et al., 1996; Wang et al., 1994). Estas pautas están basadas principalmente en las propiedades del suelo y el efecto de los metales pesados sobre la calidad de agua, en la actividad de los microorganismos en los suelos, en la salud humana y en los rendimientos y calidad de las cosechas. Han sido formulados tres valores para evaluar la calidad de los suelos. Los Valores A (definidos como el límite superior de concentración frecuente de metales pesados encontrados en suelos), Valores de B (definidos como el nivel aceptable de metales pesados en suelos), y Valores de C (niveles excesivos en muy altas concentraciones de metales que indican la necesaria intervención para soluciones, es decir, se hace necesario y obligatorio el control de la contaminación). Los niveles de concentración de metales pesados consideran no sólo el contenido total en suelos, si no también el nivel asimilable por las plantas, por ejemplo, por extracción con HCl de 0.1M (Wang et al., 1994). En el Tabla 1 se pueden apreciar algunos de estos valores propuestos para tres metales tóxicos (Cd, Cr y Pb) y para el metaloide As. Por su parte algunos trabajos, indican valores como los que se muestran en el Tabla 2, sobre las concentraciones típicas de metales pesados encontradas en hortalizas (Lin, 1991). Como se observa de las dos tablas, los valores que reporta Lin (1991) son varias veces inferiores a los valores indicados como A, B y/o C en el sentido de estándares de metales pesados para suelos. Tabla 1. Estándares de evaluación para suelos contaminados por metales pesados Valor A Elemento Extracción Concentración HCl 0,1 M Total Arsénico Cadmio Cromo Plomo

--0,4 12,0 18,0

16,0 2,0 100,0 50,0

Valor B Extracción Concentración HCl 0,1 M Total ppm (base seca) --30,0 1,0 4,0 25,0 250,0 150,0 300.0

Valor A Límite superior de concentración frecuente de metales pesados en suelos Valor B Nivel aceptable Valor C Límite requerido para intervención. Es necesario el control de la contaminación Fuente: ( Chen 1992; Wang et al. 1994; Chen et al 1996).

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Valor C Extracción Concentración HCl 0,1 M Total --2,0 40,0 200.0

40,0 5,0 400,0 500,0

Tabla 2. Estándares de evaluación de contaminación por metales pesados en hortalizas (Lin 1991). Elemento Arsénico Cadmio Cromo Plomo

Hortalizas de fruto (n=90) 0,05 (0,002) 0,11 (0,004) 0,26 (0,010) 2,11 (0,060)

Hortalizas de hojas (n=44) 0,12 (0,003) 0,24 (0,006) 0,02 (0,001) 3,69 ( 0,050)

Hortalizas de raíz ( n= 112) 0,05 (0,001) 0,21 (0,006) 0,03 (0,002) 2,58 (0,035)

1.3 Estrés por metales Pesados. Algunos metales como el Mn+2, el Fe+3, el Zn+2 o el Cu+2 son esenciales para el desarrollo normal de las plantas ya que son componentes estructurales y/o catalíticos de proteínas y enzimas. Algunos metales, como el Cr+3, V, Ti, Co y Se, a pesar de no ser esenciales, son beneficiosos. Sin embargo, la actividad humana libera, sobre todo al suelo, grandes cantidades de metales. El exceso de Al+3, Cd+2, Hg+2, As+3 o Pb+2, resultan de especial relevancia tóxica para las plantas. La fitotoxicidad por metales tóxicos se manifiesta particularmente en suelos ácidos y afecta tanto el crecimiento como a la formación de raíces laterales y secundarias. Además, la acumulación de Cd+2 o Pb+2 supone un peligro adicional al integrarse en la cadena trófica. Actualmente se conocen aun poco los mecanismos específicos de absorción de metales pesados por las membranas vegetales. Sin embargo, se sabe que por difusión, flujo en masa e intercambio catiónico, los metales alcanzan fácilmente la raíz para seguir la ruta apoplástica o la ruta simplástica. Este órgano constituye la entrada principal de metal pesado en plantas superiores. La raíz posee cargas negativas en sus células rizodérmicas, pertenecientes a polímeros como los grupos carboxilo del ácido péctico y diversas proteínas estructurales y enzimáticas. Estas cargas negativas, al unirse en el espacio de la rizosfera a cargas positivas, como las de los cationes metálicos Pb+2, forman una interfase en equilibrio. Estos cationes entraran por la pared celular, que es hidrófila y facilita el transporte e intercambio de iones y una vez allí, se unirán a las cargas negativas de la pared celular y serán transportados radialmente, en parte por la vía apoplástica y en parte por la vía simplástica. En las zonas apicales jóvenes la banda de Caspari no se ha formado y todo el metal pasa apoplásticamente hasta la zona vascular, lo que no sucede con raíces adultas, donde la diferenciación de tejidos y formación de endodermis y exodermis obliga a abandonar la vía apoplástica y utilizar la simplástica (Barceló et al., 2005). Recientes estudios han demostrado el uso de transportadores en membrana, los cuales tienen diferente afinidad por algunos metales y facilitan su paso a través de la misma. La principal familia se denomina ZIP (ZRT, IRT-like Proteine) (Guerinot, 2000). Respecto al transporte a larga distancia, se considera que los metales viajan desde la raíz hasta el xilema de las hojas como iones libres o acomplejados con un ácido orgánico, siguiendo la corriente de la transpiración (Longnecker y Robson, 1993). En el floema se considera la translocación sistémica de metales absorbidos por las hojas desde la atmósfera y la acumulación vía floema en semillas y/o

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frutos. La solubilidad del metal en el floema se dificulta por la presencia de P y por el pH alcalino. Sin embargo, se pueden formar complejos con aminoácidos o con la nicotinamida. El primer compartimento celular en contacto con los metales pesados en el espacio del apoplasto es la pared celular, donde los iones se adsorben a las cargas negativas de la misma y se almacena gran proporción de los metales pesados antes de ser absorbidos por las raíces. Estos metales se almacenan como precipitados o en forma cristalina en las paredes de las células epidérmicas o del córtex exterior y se ha observado que se puede favorecer in vitro el desplazamiento de los iones adsorbidos en la pared celular con soluciones de intercambio catiónico. Algunos metales pueden ocasionar reducción de la elasticidad y de la extensibilidad de las paredes celulares (Gunsé et al., 1997). Estas alteraciones fisicoquímicas de las paredes celulares se sugiere que pueden deberse a trastornos enzimáticos en la biosíntesis de los constituyentes macromoleculares de la pared, cambios en la distribución de cargas y en el ensamblaje de los polímeros, cambios en la distribución de los microtúbulos y del sistema endomembranoso (aparato de Golgi) y/o cambios en la adhesión entre pared y membrana citoplasmática. El segundo compartimento celular en contacto con los iones metálicos es la membrana plasmática; por lo tanto, el centro controlador del síndrome tóxico de la absorción de ion metálico hacia el interior de las células es el plasmalema. Los efectos iniciales sobre la membrana citoplasmática dependen de la actividad iónica en la superficie externa del plasmalema de las células radiculares según cálculos utilizando el método de Gouy-Chapman-Stern (Kinraide, 1994), aunque generalmente los efectos observados se traducen en rotura de membranas, pérdida de la compartimentación celular y, como síntomas finales, apoptosis y necrosis. En condiciones normales, las cargas negativas del plasmalema están neutralizadas por cationes +2 +2 +2 como Ca y Mg proporcionando estabilidad a la membrana. Cationestóxicos como el Hg , con elevada afinidad por los grupos sulfhidrilo de las membranas ocasionan cierre de las acuaporinas o + canales hídricos y excesivo flujo de K (Ernst, 1998), a la vez que puede ocasionar la inhibición +2 competitiva de canales iónicos como el canal de Ca . Aunque el mecanismo primario responsable de la disfunción de las membranas es la peroxidación de lípidos, no se puede confundir el estrés oxidativo de la fase degenerativa con el metabolismo oxidativo causado por cationes metálicos. Existen varias estrategias de acción directa e indirecta de los iones metálicos para generar radicales libres de oxígeno y de especies reactivas al oxígeno (ROS) que, a su vez, dañan crónicamente las membranas, los ácidos nucleicos y la fotosíntesis (Dietz et al., 1999). Los metales pesados inhiben el flujo de electrones de la cadena de transporte o del Ciclo de Calvin; por lo tanto, cuando la intensidad lumínica es alta, el aparato fotosintético absorbe más energía lumínica que la que suele utilizarse en reacciones metabólicas normales. Como consecuencia, el aparato fotosintético transfiere la energía a los únicos aceptores disponibles en los cloroplastos: los radicales de oxígeno, donde sucede la reacción de Mehler, cuyo producto, el radical anión superóxido, forma peróxido de hidrógeno. El exceso de peróxido de hidrógeno fomenta la formación de radicales hidroxilo (OH-), oxidantes fuertes de ácidos orgánicos que pueden iniciar la formación en cadena de nuevos radicales altamente tóxicos para las células.

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Adicionalmente, la inhibición de la cadena de transporte electrónico fotosintético también puede favorecer la transferencia de energía desde la clorofila excitada por la luz hacia el O 2 formándose oxígeno en estado de singlete, el cual, debido a su elevada reactividad es altamente tóxico para las células. La reacción de defensa de las células consiste en la producción de enzimas antioxidantes como la peroxidasa y superóxido dismutasa (SOD), mediante la cadena redox ascorbato-glutatión; sin embargo, la toxicidad de los metales pesados ocasiona disminución de la capacidad antioxidante de las células (Van Assche y Clijters, 1990). También se ha observado la inhibición de la asimilación de CO2, tanto por aumento en la resistencia estomática, como de la resistencia mesofílica. Plantas expuestas a Cd, Al, Cu, Cr, Ni, Zn o Hg mostraron cierre estomático por déficit hídrico inducido por los metales a causa de sus efectos tóxicos iniciales en las raíces y su interferencia con la absorción y translocación del agua. La reducción de la apertura estomática en la inhibición de la fotosíntesis inducida por metales pesados seguramente depende del tipo de metal (Poschenrieder y Barceló, 1999). El Cd y el Al inhiben, con similar intensidad, la fotosíntesis y la transpiración, mientras que Zn, Pb y Cu pueden causar una drástica reducción en la eficiencia del uso del agua, lo que sugiere que factores diferentes a los propios del cierre de estomas juegan un papel en la inhibición de la fotosíntesis por estos metales. Las adaptaciones específicas de las plantas al estrés por metales se basan en mecanismos de resistencia que reducen su entrada en la planta, o que, una vez absorbidos, permiten su almacenamiento en lugares no perjudiciales para las células. Inicialmente se manifiestan los mecanismos de prevención o .avoidance. según Levitt (1980), que permiten mantener una baja concentración de metal en el simplasto tales como:  la exudación de sustancias hacia la rizosfera.  la inmovilización en el apoplasto.  la secreción foliar.  la volatilización.  el eflujo. La absorción de metales puede disminuir por unión a ácidos orgánicos exudados al suelo por los ápices radiculares o por los localizados en las paredes celulares, así como por la restricción de su transporte a través de la membrana plasmática. La naturaleza quelante de metales de los ácidos orgánicos es característica de cada especie. Para el maíz y la judía es el citrato, y para el trigo es el malato (Tudela y Tadeo, 1993). Adicionalmente, los metales también tienen afinidad por fenoles y ciertos aminoácidos tales como los sideróforos de origen microbiano y los fitosideróforos exudados por las propias plantas. El mucílago (mucopolisacáridos) segregado por la cofia, mantiene húmeda la zona apical radicular y favorece la penetración de la raíz a través del suelo; además, puede retener en sus cargas negativas cationes como Pb2+, Cu2+ o Cd2+ previniendo la entrada de estos iones tóxicos al ápice radicular (Marschner, 1995).

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La inmovilización acumula una proporción importante del contenido total de metales de una planta en tres fracciones apoplásticas radiculares: en el espacio libre dagua para las formas solubles; en el espacio libre de Donnan formado por cargas negativas de los ácidos poligalacturónicos, los cuales se unen a los cationes metálicos en función de la secuencia Al > Pb > Cr > Cu > Zn = Mn (Ernst et al., 1992, Rengel, 1997) y en la superficie, pared o espacios intercelulares de las raíces como depósitos sólidos (Barceló y Poschenrieder, 1999). El eflujo activo a través del plasmalema puede cambiar las propiedades fisicoquímicas del suelo y la especiación de los metales manteniendo bajas concentraciones de metales en el simplasto. Una vez han entrado los metales en la célula, empiezan a funcionar los mecanismos de tolerancia que permiten soportar altas concentraciones de metal en el simplasto y facilitan el almacenamiento de los iones tóxicos en lugares no perjudiciales para las células. Estos mecanismos son:  Desintoxicación (complejos con ácidos orgánicos).  Compartimentación (acumulación en vacuola).  Actividad de enzimas tolerantes. Los metales absorbidos en la célula pueden ser eliminados del citoplasma por unión a los mismos ácidos que también están presentes en la pared, o mediante enlaces tiol a péptidos de bajo peso molecular ricos en el aminoácido cisteína (fitoquelatinas). Posteriormente, los metales unidos a estos compuestos son almacenados en la vacuola (Ernst, 1975). Las fitoquelatinas son ricas en grupos SH, por lo que también se les conoce como cadistinas.y presentan elevada afinidad para cationes de metales. Los diferentes iones metálicos tienen diferente capacidad de inducir la síntesis de fitoquelatinas, según la progresión Hg > Cd > As > Ag > Cu > Ni > Pb > Zn. La sensibilidad al Cd aumenta en plantas tratadas con BSO (un inhibidor de la síntesis de fitoquelatinas) y en mutantes de Arabidopsis thaliana con bajos niveles de glutatión el cual es un precursor de la síntesis de fitoquelatinas. Parece que la síntesis de fitoquelatinas es esencial para niveles constitutivos normales de tolerancia al Cd, Hg y As, pero no para la tolerancia normal al Cu o Zn. La hipótesis de que las fitoquelatinas actúen como posible forma de transporte de metales, especialmente del Cd, las relaciona, además, con la compartimentación vacuolar. No obstante, la elevada tolerancia al Cd seleccionada bajo condiciones naturales en metalofitas no se debe, aparentemente, a las fitoquelatinas. Así, a igual concentración externa, algunos ecotipossensibles al Cd de Silene vulgaris sintetizan más fitoquelatinas que los tolerantes. El estímulo de la síntesis de fitoquelatinas es una respuesta a la presencia de elevadas concentraciones internas de iones metálicos tóxicos de forma que más que un síntoma de tolerancia, parece ser un marcador bioquímico de la tensión sufrida por la planta (De Knecht et al., 1994). El análisis de la actividad enzimática en medios con concentraciones crecientes de metales pesados, por regla general, muestra que no hay diferencias sustanciales entre metalofitas y plantas no tolerantes en la sensibilidad de las enzimas citoplasmáticas a la toxicidad de iones metálicos (Ernst et al, 1992). Sin embargo, se han observado diferencias en la actividad de enzimas extracelulares tales como fosfatasa ácida en ecotipos de Agrostis tenuis con tolerancia diferencial al Cu (Woolhouse y Walter, 1983). Esta observación implica que diferencias en la tolerancia a elevadas concentraciones tisulares de metales pesados se deben, por regla general, a diferencias en la especiación y/o

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compartimentación de estos metales. No obstante, hasta la fecha hay pocos datos para poder establecer, con carácter general, una clara relación entre la especiación apoplástica y/o simplástica de los metales, las actividades enzimáticas y las diferencias genéticas en la tolerancia (Poschenrieder y Barceló, 2003). 1.4 Absorción y traslocación de metales pesados en las plantas. Las plantas han desarrollado mecanismos altamente específicos para absorber, traslocar y acumular nutrientes (Lasat, 2000), sin embargo, algunos metales y metaloides no esenciales para los vegetales son absorbidos, traslocados y acumulados en la planta debido a que presentan un comportamiento electroquímico similar a los elementos nutritivos requeridos. La absorción de metales pesados por las plantas es generalmente el primer paso de su entrada en la cadena alimentaria. La absorción y posterior acumulación dependen de: (1) el movimiento de los metales desde la solución suelo a la raíz de la planta, (2) el paso de los metales por las membranas de las células corticales de la raíz, (3) el transporte de los metales desde las células corticales al xilema desde donde la solución con metales se transporta de la raíz a los tallos, y (4) la posible movilización de los metales desde las hojas hacia tejidos de almacenamiento usados como alimento (semillas, tubérculos y frutos) por el floema. Después de la absorción por los vegetales los metales están disponibles para los herbívoros y humanos directamente o a través de la cadena alimentaria. Otro mecanismo de ingreso de sustancias potencialmente tóxicas a las plantas, como los metales pesados, es mediante la absorción foliar. La disponibilidad a través de las hojas de algunos elementos traza provenientes de fuentes aéreas puede tener un impacto significativo en la contaminación de las plantas y también es de particular importancia en la aplicación de fertilizantes foliares (Kabata – Pendias, 2000). La absorción foliar es mediada por una fase de penetración cuticular y un mecanismo de carácter metabólico que considera la acumulación del los elementos contra un gradiente de concentración. Las especies vegetales, incluidos algunos cultivos, tienen la capacidad de acumular metales en sus tejidos. Las plantas capaces de absorber y acumular metales por sobre lo establecido como normal para otras especies en los mismos suelos se llaman hiperacumuladoras y se encuentran principalmente en suelos que son ricos en metales por condiciones geoquímicas naturales o contaminación antropogénica. Las plantas hiperacumuladoras generalmente tienen poca biomasa debido a que ellas utilizan más energía en los mecanismos necesarios para adaptarse a las altas concentraciones de metal en sus tejidos (Kabata –Pendias, 2000). La capacidad de las plantas para bioacumular metales y otros posibles contaminantes varía según la especie vegetal y la naturaleza de los contaminantes. Los tallos de arveja (Pisum sativum) acumulan más cadmio que plomo en suelos tratados con dosis crecientes de metales. Estas diferencias en la absorción de metales puede ser atribuida a la capacidad de retención del metal por el suelo y a la interacción planta-raíz-metal (Naidu et al. 2003). El comportamiento de la planta frente a los metales pesados depende de cada metal

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1.5 El problema de la entrada de metales pesados en la planta 1.5.1 Contaminación del suelo El concepto de contaminación también merece reflexión. Se define como contaminación, según la Unión Europea, “la introducción directa o indirecta como consecuencia de la actividad humana de sustancias, vibraciones, calor o ruido en el aire, el agua o el suelo que pueden ser nocivos para la salud humana o la calidad del medio ambiente, causar daños a la propiedad material o perjudicar o entorpecer las actividades recreativas y otros usos legítimos de medio ambiente”. Por tanto, nos podemos encontrar con suelos con niveles extraordinariamente elevados de metales pesados por causas naturales (por ejemplo suelos mineros), y no estar catalogados como suelos contaminados. Las concentraciones anómalas de metales pesados en los suelos pueden deberse básicamente a dos tipos de factores: causas naturales y causas antropogénicas. Las causas naturales pueden ser entre otras, actividad volcánica, procesos de formación de suelos, meteoros, erosión de rocas, terremotos, tsunamis, etc. Las causas antropogénicas pueden ser la minería, la combustión de carburantes fósiles, la industria a través de los vertidos, emisiones, residuos (incineración, depósito), como algunos pesticidas y fertilizantes, etc. 1.5.2 Dinámica de los metales pesados en el suelo Los metales pesados presentes en los suelos no se comportan como elementos estáticamente inalterables, sino que siguen unas pautas de movilidad generales La dinámica de los metales pesados en el suelo puede clasificarse resumidamente en cuatro vías:  Movilización a las aguas superficiales o subterráneas.  Transferencia a la atmósfera por volatilización.  Absorción por las plantas e incorporación a las cadenas tróficas.  Retención de metales pesados en el suelo de distintas maneras: disueltos o fijados, retenidos por adsorción, complejación y precipitación. 1.5.3 Transporte Los iones inorgánicos y el agua (sabia bruta) se transportan desde la raíz hasta las hojas mediante una serie células tubulares que pertenecen a un tejido leñoso denominado xilema. La fuerza que mueve esta solución no radica en las células del tejido xilemático, sino en la fuerza propia del proceso de ósmosis y en otra fuerza, menos habitual, conocida como fuerza de succión. La ósmosis se produce porque existe una gran diferencia de concentración entre la parte superior de la planta (hojas, inflorescencias) donde es mayor y la parte inferior, es decir existe un potencial hídrico favorable al impulso ascendente. La fuerza de succión se produce cuando en las hojas se pierde agua por transpiración, pues las moléculas perdidas producen una succión de nuevas moléculas cercanas para reemplazar a las anteriores, de tal manera que se produce una fuerza que atrae agua desde las raíces hacia las hojas. 1.5.4 Toxicidad de los metales pesados La toxicidad de los metales pesados depende, como ha quedado expuesto previamente, de la concentración, la forma química y la persistencia. Un elemento indispensable para un ser vivo en concentraciones traza puede llegar a ser tóxico en concentraciones elevadas. Por otra parte, la mayoría de metales pesados se combina con otras formas químicas, antes de entrar en los organismos o cuando se encuentra en el interior de los mismos; por tanto, antes de determinar la

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toxicidad de un elemento es necesario determinar la forma química en la que se encuentra. La persistencia se define como el tiempo que tarda un contaminante en transformarse en una forma no tóxica. Los metales pesados están considerados como muy peligrosos para los seres vivos en general, pues poseen una gran toxicidad, en parte debido a su elevada tendencia a bioacumularse. La bioacumulación es un aumento de la concentración de un producto químico en un organismo biológico en un cierto plazo, de forma que llega a ser superior a la del producto químico en el ambiente. La toxicidad está causada frecuentemente por la imposibilidad del organismo afectado para mantener los niveles necesarios de excreción. El proceso se agrava durante el paso por las distintas cadenas tróficas, debido a que los niveles de incorporación sufren un fuerte incremento a lo largo de sus sucesivos eslabones, siendo en los superiores donde se hallan los mayores niveles de contaminantes. A este proceso se le denomina biomagnificación; es decir, muchas toxinas que están diluidas en un medio, pueden alcanzar concentraciones dañinas dentro de las células, especialmente a través de la cadena trófica. Otro aspecto importante a considerar es la presencia simultánea (mezcla) de los metales pesados, ya que sus efectos pueden ser tanto tóxicamente sinérgicos o antagónicos (la toxicidad se reduce al mezclarse), por tanto existe cierta dificultad para predecir los efectos reales de los contaminantes en el medio. Los efectos de un compuesto o de la mezcla de ellos pueden ser inocuos, letales o subletales (no matan al individuo pero producen daños a nivel genético o fisiológico). Con frecuencia, los daños subletales suelen ser más perjudiciales para la población en general, ya que afectan al desarrollo o a la reproducción. La causa primaria del elevado nivel de toxicidad a nivel químico es que los metales pesados poseen una gran capacidad para unirse con moléculas orgánicas. En efecto, estos efectos tóxicos en sistemas biológicos dependen de reacciones con ligandos que son esenciales para su asimilación, y estos ligandos están, a su vez, presentes en gran abundancia en la célula, ya sea formando parte de moléculas de mayores dimensiones, ya sea como moléculas aisladas. En este sentido, cabe destacar la gran afinidad que muestran los metales pesados, como principales ligandos, por grupos sulfidrilo, radicales amino, fosfato, carboxilo e hidroxilo. El resultado de estas uniones ligando-metal puede ser muy perjudicial para la célula, destacando en este aspecto sobre otros fenómenos, (1) la acción genérica sobre proteínas por inhibición de la actividad o por disrupción en la estructura de las mismas, (2) el desplazamiento de elementos esenciales de su metabolismo estándar, produciendo efectos de deficiencia, y (3) la catálisis de reacciones de generación de moléculas ROS (Reactive Oxigen Species) o radicales libres que provocan fenómenos de estrés oxidativo. El estrés oxidativo es un fenómeno que merece ser estudiado aisladamente, dada su complejidad e importancia en el desarrollo de los mecanismos básicos de la célula. Como resumen de dicho fenómeno baste decir que provoca daño a distintos niveles, destacando los siguientes aspectos: 

Inactivación de proteínas y enzimas, fundamentalmente por la oxidación de los grupos sulfhidrilo, dando lugar a puentes disulfuro que causan la interrupción del funcionamiento normal de la proteína o enzima.

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 

Peroxidación lipídica de membranas, causando rupturas y subproductos de las cadenas hidrocarbonadas. Efectos de daño sobre el ADN. Estos pueden ser desperfectos genotóxicos: mutaciones, aberraciones cromosómicas, alteraciones en la síntesis y reparación de ácidos nucleicos y transformaciones celulares.

El estudio de la toxicidad y, en general, del comportamiento oxidativo de los metales pesados en el interior de la célula de un organismo viene determinado en gran medida por dos tipos de reacciones químicas, causantes a su vez de dos elementos ROS clave: H 2O2 y O2−. Estas dos reacciones son las siguientes:  Reacción de Fenton La reacción de Fenton, según la terminología de la IUPAC, consiste en la descomposición del peróxido de hidrógeno mediante la adición de sales de hierro, para formar un radical OH·.

Este radical es tremendamente reactivo, y puede producir procesos de oxidación en cascada. En general lo que se produce en la célula son interacciones que causan una fuerte descompensación electrónica, principalmente por la acción de los radicales formados por el radical OH, bien generando otros radicales, bien oxidando o reduciendo especies químicas presentes en el medio. En la práctica, el apelativo “reacción de Fenton” se utiliza para metales diferentes al Fe.  Reacción de Haber - Weiss La reacción de Haber-Weiss, según IUPAC, es en realidad un ciclo de dos reacciones. La primera reacción aprovecha el radical OH· producido por la reacción de Fenton para reaccionar con más peróxido (como en la reacción de Fenton) y originar un elemento crucial en las reacciones redox elaboradas en la célula, el radical superóxido:

El radical superóxido recién producido va a reaccionar entonces con más peróxido de hidrógeno (como en la reacción de Fenton), para volver a dar los productos no metálicos de la reacción de Fenton.

El resultado final es que el hierro se ha oxidado (en Fenton), y el aceptor final de electrones es el oxígeno (reacción de Haber- Weiss), que se libera en forma de oxígeno molecular, cerrando el proceso de cesión de los electrones por oxidación del metal. Acoplado a todo el sistema formado por las distintas reacciones, se producen radicales OH· que, como se ha mencionado anteriormente, pueden seguir desarrollando un mecanismo en cascada de consecuencias importantes para el equilibrio interno de la célula. Además, estos OH inducen daños sobre el ADN, lo que puede conducir a carcinogénesis por alguna de estas rutas: -

alteraciones producidas en oncogenes y factores de crecimiento. alteraciones en los genes supresores de tumores. alteraciones en los genes reguladores del crecimiento.

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Como ha quedado descrito, en este conjunto de reacciones participan dos elementos ROS (O 2− y H2O2) que han demostrado jugar un papel esencial en la interacción de los metales pesados con las células de los seres vivos. Ambos son, además, elementos señalizadores relevantes. No obstante, es interesante señalar que todas estas reacciones requieren la presencia previa de H2O2. ¿Qué ocurre cuando el metal está presente y no hay suficiente cantidad de H2O2? ¿o esto no ocurre nunca?. 1.6 Clasificación de los cultivos con relación al riesgo alimentario. Se han propuesto tres patrones que relacionan la biodisponibilidad de los nutrientes y su absorción en los cultivos (Figura1) (Chen, 2000). En el patrón tipo 1, la absorción incrementa con el crecimiento del cultivo para luego caer cuando el cultivo alcanza madurez. Este patrón es observado en la absorción de la mayoría de los macronutrientes como el nitrógeno, fósforo y potasio. El patrón tipo 2, es similar al 1 pero presenta un pico más pronunciado y se ha observado que se asocia con la absorción de micronutrientes como cobre y cinc. El patrón tipo 3, presenta una absorción elevada en las primeras etapas del desarrollo y cae durante las siguientes etapas. Este patrón se ha observado para metales pesados como arsénico, cadmio, cromo, plomo, níquel y mercurio.

Figura 1. Patrones de crecimiento o rendimiento en función de la concentración de nutrientes y elementos tóxicos en cultivos. Fuente, Modificado de Chen (2000).

El Tabla 3. muestra hortalizas según grado de acumulación de metales pesados. Tabla 3: Hortalizas acumuladoras de metales. Modificado de Alloway, 1995 Metal Cadmio Cobre Plomo Cinc

Acumuladoras Lechugas, espinacas, apio, repollo Betarragas, cebada Berro, apio Betarragas, espinacas

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Baja Acumulación Papas, maíz, habas Puerros, repollo, cebolla Cebada, papas, maíz Papas, puerros, tomates, cebolla

El contenido máximo permitido de Pb, Cd y Hg en algunos alimentos, de acuerdo a la Unión Europea, se indica en el Tabla 4. El contenido máximo de algunos metales pesados en alimentos en general, permitido en Argentina y en Chile se indican en los Tablas 5 y 6, respectivamente. Tabla 4. Contenido máximo de Pb, Cd y Hg en algunos alimentos, según la Unión Europea

Cereales, legumbres y leguminosas Vegetales Vegetales de hoja, hongos Frutas Berries Cereales Soya Vegetales y frutas Vegetales de hoja, hongos y hierbas Vegetales de raíz, papas Pescados en general

Pb ( mg.kg -1) 0,2 0,1 0,3 0,1 0,2 Cd ( mg.kg-1) 0,1 0,2 0,05 0,2 0,1 Hg ( mg.kg-1) 0,5

Tabla 5: Contenido máximo de metales pesados en alimentos en general en Argentina. Metales Arsénico Boro Cobre Estaño Plomo Cinc

-1

Contenido máximo (mg.kg ) 1 80 10 250 2 100

Tabla 6: Contenido máximo de metales pesados en alimentos Chile.INN Alimentos

Cereales, leguminosas, legumbres Otros Sal Agua Otros Cereales Cereales Otros

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Contenido máximo -1 ( mg/kg ) Arsénico 0,1 1,0 Cadmio 0,5 0,001 Cobre 10 Mercurio 0,05 Plomo 0,5 Zinc 100

Magnicol y Beckett (1985) encontraron valores críticos para producir fitotoxicidad en 20 elementos, -1

algunos de estos valores, expresados en mg kg de peso seco, en el tejido de las plantas son: Cd 825, Cr 2-8, Co 10-20, Cu 10-20, Mn 100-400, Hg 1-6, Ni 10-20, V 2-6, Zn 150-300. Los cultivos se pueden clasificar según el riesgo alimentario en relación a cada metal como inocuo, susceptible y peligroso, dependiendo en primer lugar si se encuentran cultivados en suelos con alta biodisponibilidad del elemento y si son ingeridos directa o indirectamente por el ser humano. Existen tres situaciones: 1. Los cultivos no presentan toxicidad ni son bioacumuladores de elementos trazas potencialmente dañinas al ser humano. 2. El cultivo presenta toxicidad por metales pesados, alterando su rendimiento, entonces se debiera restringir el consumo de aquellos alimentos afectados con elementos que no son esenciales al hombre como As, Cd, Hg y Pb. 3. El suelo tiene elevadas cantidades de metal disponible, pero permite el desarrollo y cosecha de un cultivo. En este caso se debe definir el riesgo alimentario del cultivo en relación al destino que pueda tener en la industria alimentaria, considerando qué órgano de la planta será procesado o consumido directamente. Los cultivos cuyos productos son utilizados en la industria, como la madera de las plantaciones forestales y las fibras naturales, no revisten un riesgo directo para la salud humana y pueden considerarse inocuos, independientemente del contenido de metal presente en sus tejidos. Debido a que el fin último de cualquier normativa o recomendación es la protección de la salud del hombre, se deben tener presente tres factores esenciales en la cadena suelo –planta – hombre, estos son: - Adsorción del elemento en el suelo (grado de disponibilidad) - Riesgo en la cadena alimentaria (bioacumulación) Basándose en estos factores, Chaney (1980) formó cuatro grupos de metales y metaloides según biodisponibilidad y riesgo potencial (Tabla 7). 1.7 Fitotoxicidad El término fitoxicidad se ha asociado normalmente con la acumulación de una sustancia dañina en el tejido de una planta en niveles que afectan su crecimiento y normal desarrollo. Sin embargo, esta definición muchas veces no es adecuada porque las plantas presentan distintos grados de fitoxicidad mostrando una gran variedad de síntomas durante su ciclo de crecimiento, existiendo distintos niveles de daño. Además, el crecimiento no sólo se ve afectado por la acumulación de sustancias tóxicas, sino que también por factores medioambientales como deficiencias nutricionales, estrés hídrico, daño en raíces u otros, los cuales producen disminución del rendimiento (Naidu et al., 2003). Chang et al. (1992), indican que para confirmar que existe fitoxicidad por metales se requiere que: • Las plantas sufran un daño. • El metal potencialmente tóxico sea acumulado en el tejido de vegetal. • Las anomalías observadas no correspondan a otros desórdenes del crecimiento de la planta, y • Se observen los mecanismos bioquímicos que causan la toxicidad del metal en las plantas durante el ciclo de crecimiento.

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Tabla 7: Grupos de metales y metaloides según biodisponibilidad y riesgo para la cadena alimentaria ( Chaney 1980) Grupo

Metal

Adsorción en el suelo

Fitotoxicdad

1

Ag, Cr, Sn, Tl, Y y Zr

Baja solubilidad y fuerte retención en el suelo

Baja

2

As, Hg y Pb

Adsorbidos fuertemente por los coloides del suelo

3

B, Cu, Mn, Mo, Ni y Zn

Menos fuertemente adsorbido al suelo comparado con los grupos 1 y 2

4

Cd, Co y Se

Menor grado adsorción al suelo en relación a los otros metales

Las plantas pueden absorbérselos pero no trastocarlos a los tallos o generalmente no son fitotóxicos excepto a concentraciones muy altas Fácilmente tomados por las plantas, son fitotóxicos a concentraciones que causan bajo riesgo a la salud humana Causan riesgo en la salud humana o animal a concentraciones en el tejido de la planta que generalmente no son tóxicas

Riesgo para la cadena alimentaria Bajo riesgo, porque ellos son toma dos en menor grado por las plantas Causa mínimos riesgos para la cadena alimentaria humana

Conceptualmente la barrera “suelo-planta” protege a la cadena alimentaria de estos elementos Existe bioacumulación a través de la cadena alimentaria sueloplanta-animal

En general, las plantas son mucho más resistentes a los incrementos en la concentración que a una insuficiencia de un elemento esencial dado. Distinto es el caso de un elemento no esencial, donde el nivel de daño aumenta conforme lo hace el elemento (Figura 2) En general, se puede establecer que los metales más tóxicos tanto para plantas superiores como para ciertos microorganismos son Hg, Cu, Ni, Pb, Co, Cd y posiblemente también Ag, Be y Sn (Kabata – Pendias, 2000).

Figura 2. Respuesta de las plantas al estrés por deficiencia y toxicidad de elementos traza. a) elementos traza esenciales, b) elementos traza no esenciales (Kabata – Pendias, 2000).

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La Tabla 8 presenta los rangos de concentraciones para los elementos traza, presentes en los tejidos de hojas maduras de varias especies. Aun cuando lo rangos mostrados corresponden a aproximaciones generales, es importante notar que los rangos de suficiencia y toxicidad se encuentran muy cercanos haciendo difícil marcar una clara división entre ambos. 1.7.1 Metales en Plantas y Fitotoxicidad Es importante determinar el nivel de riesgo ambiental de los metales pesados sobre diversos representantes del ecosistema terrestre utilizando bioensayos ecotoxicológicos (Iannacone y Gutiérrez, 1999; Arkhipchuk et al., 2000); entre ellos, las plantas presentan diferentes especies representativas de los agroecosistemas hortícolas (Wang, 1991; Arambasic et al., 1995; Iannacone et al., 2000). Los ensayos de fitotoxicidad con semillas germinadas son simples, versátiles y útiles para evaluar la toxicidad de aguas, sedimentos y muestras de suelo (Walsh et al., 1991; Lewis, 1995; Rosa et al., 1999). Las pruebas de fitotoxicidad que emplean plantas terrestres, no son usadas frecuentemente en ecotoxicología (Wang, 1991; Calow, 1993; APHA, 1995). Las tres características más importantes de los ensayos con plantas terrestres, es que se les puede usar con muestras coloreadas o turbias, en ensayos estáticos, semiestáticos y de flujo continuo, y con un mínimo costo de mantenimiento en el laboratorio (Wang, 1991). Tabla 8. Concentraciones de elementos traza para varias especies en tejidos de hojas maduras ( Kabata – Pendias,2000). -1

Elemento Cromo Manganeso Niquel Cobre Cinc Arsénico Selenio Molibdeno cadmio Mercurio Plomo

Concentración ( mgKg , peso seco) Suficiente o normal Excesiva o tóxica 0,1 – 0,5 30 - 300 0,1 - 5 5 - 30 27 - 150 1 – 1,7 + 0,01 – 2 0,2 - 5 0,05 – 0,2 --5 - 10

5 - 30 400 - 1000 10 - 100 20 - 100 100 - 400 5 - 20 5 - 30 10 -50 5 - 30 1 -3 30 - 300

Tolerable en cultivos agrícolas 2 300 1 – 10 5 – 20 50 – 100 0,1 – 1,0 ++ 1,0 – 5 --0,05 – 0,5 0,05 – 0,5 0,5 – 10

+

Base húmeda 2 – 5 mg/ Kg forraje peso seco causa toxicidad en animales Los valores no incluyen a especies muy sensibles o tolerantes ++

Calow (1993) señala la potencialidad del uso de cebolla (Allium cepa L., Liliaceae), betarraga (Beta vulgaris L., Chenopodiaceae), arroz (Oriza sativa L., Poaceae) y rabanito (Raphanus sativus L., Brassicaceae) para evaluar la toxicidad y el riesgo de sustancias químicas peligrosas en el ambiente. Sin embargo, el efecto de metales pesados sobre plantas vasculares no se conoce bien (Lerda, 1992; Barone et al., 1997; Rosa et al., 1999; De Jong y De Haes, 2001).

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La determinación de algunos aspectos de la ecotoxicidad de metales pesados empleando bioensayos sencillos y prácticos para catalogar toxicológicamente muestras ambientales contaminadas por Pb, Hg y Cr contribuye a tomar medidas para evaluar la perturbación de los ecosistemas y promover alternativas de biorremediación (Shanker et al., 1996; Iannacone y Alvariño, 1999; 2005).El empleo de las semillas de plantas terrestres como herramientas ecotoxicológicas es ventajoso, por requerir poco volumen de muestra (1 mL envase-1), comparado con otros organismos que requieren de 50 a 200 mL envase-1 (Arambasic et al., 1995). Las plantas vasculares han sido recomendadas por la Agencia de Protección Ambiental (EPA) y por la Administración de Drogas y Alimentos (FDA), ambas de los Estados Unidos, debido a su buena sensibilidad, en comparación con semillas de otras especies de plantas terrestres (Wang, 1991). El ensayo ecotoxicológico con semillas de plantas vasculares presenta algunas ventajas sobre otras especies terrestres, lo que permite usar cuantitativamente el crecimiento de la raíz. Wang (1991) indicó que el crecimiento de raíz como punto final de lectura, es más sensible a la toxicidad que la germinación de semillas, la cual presenta un alto coeficiente de variación (Rosa et al., 1999). Calow (1993) presentó un resumen de los protocolos de bioensayos de germinación de semilla y de elongación de raíz con diferentes especies de plantas, siendo comparables al protocolo usado en este estudio. La sensibilidad de las especies vegetales a los metales pesados varía considerablemente a través de reinos y familias, siendo las plantas vasculares ligeramente más tolerantes (Rosa et al., 1999). Las diferentes respuestas de las plantas vasculares a metales pesados pueden ser atribuidas a factores genéticos y fisiológicos (Calow, 1993). En este sentido, Lerda (1992) encontró que el Pb reduce el crecimiento radicular y la frecuencia de células mitóticas y el incremento de la frecuencia de células aberrantes en A. cepa. La intensidad del efecto está en función de la concentración del Pb. Pal y Nandi (1990) y Liu et al. (1995) evaluaron por ejemplo, el efecto citológico del Hg en las raíces de bulbos de A. cepa. Todas las plantas absorben metales del suelo donde se encuentran pero en distinto grado, dependiendo de la especie vegetal, y de las características y contenido en metales del suelo. Las plantas pueden adoptar distintas estrategias frente a la presencia de metales en su entorno (Baker, 1981; Barceló et al., 2003). Unas basan su resistencia a los metales con la estrategia de una eficiente exclusión del metal, restringiendo su transporte a la parte aérea. Otras acumulan el metal en la parte aérea en una forma no tóxica para la planta. La exclusión es más característica de especies sensibles y tolerantes a los metales, y la acumulación es más común de especies que aparecen siempre en suelos contaminados. Algunas plantas son capaces de acumular cantidades excesivas de metales pesados, y se les conoce con el término "hiperacumuladoras" que fue introducido primero por Brooks y colaboradores (1977), refiriéndose originalmente a las plantas que adquirieron una concentración excesiva del níquel (1000 mg/g) sobre una base del peso seco. El concepto fue ampliado más adelante a otros elementos tales como cadmio, cobalto, cobre, plomo, selenio y zinc. Las plantas hiperacumuladoras generalmente tienen poca biomasa debido a que ellas utilizan más energía en los mecanismos necesarios para adaptarse a las altas concentraciones de metal en

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sus tejidos (Kabata-Pendias, 2000). La capacidad de las plantas para bioacumular metales y otros posibles contaminantes varía según la especie vegetal y la naturaleza de los contaminantes. Estas diferencias en la absorción de metales, pueden ser atribuidas precisamente a la capacidad de retención del metal en cuestión, por el suelo de cultivo y a la interacción planta-raíz-metal y al metabolismo vegetal propio (Vig et al., 2003). De acuerdo con la estrategia de acumulación de Baker (1981), las plantas hiperacumuladoras pueden superar en 100 ó más veces los valores normales de metales acumulados. Estas plantas son especies muy tolerantes a uno o más metales pesados y a menudo su distribución está restringida a suelos ricos en un amplio rango de concentraciones de metales, pues no son competitivas en zonas no contaminadas. La hiperacumulación ha evolucionado en más de 400 especies de plantas repartidas en 45 familias botánicas, siendo la familia Brassicaceae una de las que cuenta con más géneros de este tipo; familia que se encuentra distribuida por todo el mundo, predominando en Nueva Caledonia, Cuba y la región Mediterránea, entre otros lugares (Baker et al., 2000). Existen varias hipótesis de cómo se pueden adaptar las especies a la hiperacumulación, pero la más actual es su función en la protección de la planta contra el estrés biótico causado por patógenos y herbívoros. Esta propuesta es muy atractiva para explicar la razón de ser de las plantas hiperacumuladoras y difiere de la defensa química natural existente en todas las plantas, basada en la síntesis de productos orgánicos procedentes del metabolismo secundario (Llugany et al., 2007). Este tipo de protección requiere ciertas condiciones: la primera es que el metal sea más tóxico para el patógeno o herbívoro que para la planta; la segunda, que el metal impida la virulencia del patógeno o herbívoro y finalmente, la tercera, que el metal incremente la resistencia de la planta frente al factor causante del estrés biótico. La fitorremediación aplicada a suelos contaminados con elementos o compuestos inorgánicos, incluye básicamente, tres mecanismos los que se muestran en la figura 1: fitoextracción o fitoacumulación, la fitoestabilización y la fitovolatilización (Singh et al., 2003, Prasad y Freitas 2003).

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II.

CADMIO: INGRESO, TRANSPORTE Y ACUMULACIÓN EN SUELOS Y PLANTAS. TOXICIDAD

2.1. Generalidades. Se ha constatado que la acumulación progresiva de ETM (elementos traza metálicos) en los suelos, particularmente cadmio, tiene efectos negativos en la salud humana. Dichos metales una vez absorbidos por el organismo interfieren en procesos enzimáticos causando diversas patologías. Particularmente el cadmio, produce trastornos renales, daño a los huesos, edema pulmonar, daño al hígado, anemia e hipertensión. La principal fuente de consumo de cadmio en el ser humano son los alimentos de origen vegetal (Norvell et al., 2000), sin embargo, también, éste puede llegar al ser humano mediante la ingesta de alimentos de origen animal y por la inhalación del humo del tabaco (Staessen et al., 1999, Dey y Dwivedi, 2000). El cadmio ingresa a la malla trófica, desde el suelo, produciéndose fenómenos de bioacumulación y biomagnificación. En el caso del ser humano, el cadmio es de alta toxicidad a niveles traza acumulándose en el cuerpo (particularmente en el riñón) y persistiendo cerca de 10 a 30 años hasta su eliminación (Staessen et al., 1999). En cuanto a los cultivos (especies y variedades), éstos presentan diferentes niveles de fitotoxicidad frente a una misma concentración de cadmio en sus tejidos y el cadmio se acumula a distintas concentraciones dependiendo del tipo de tejido (hoja, grano, raíz). Asimismo, algunos cultivos son eficientes acumuladores de cadmio, por ejemplo la lechuga (Lactuca sativa), no presentando síntomas de fitotoxicidad a concentraciones reducidas de cadmio (Jinadasa et al., 1997). Una fuente de aporte de cadmio en los suelos es el uso de fertilizantes fosfatados derivados de la roca fosfórica. Durante el proceso de elaboración de los fertilizantes fosfatados, a partir de dicho material, quedan metales como impurezas, a nivel de trazas (Gavi et al., 1997; Driver, 1998; Grzmil, 1998; Anonymous, 1999; Carbonell et al., 1999; Tyler y Barnes, 1999; Davis, 2000). Un aspecto importante de destacar es que los ETM están presentes en la corteza terrestre, por lo que aportes antrópicos se sumarán al contenido basal cambiando el estado de equilibrio original en relación a la magnitud de estos aportes. Respecto de la nutrición vegetal, si bien la aparición de daños a largo plazo podría asociarse al contenido total de un elemento en el suelo, en el corto plazo la carga agregada tiende a mantenerse en la forma en que fue emitida (no soluble). Para que esta carga adquiera forma soluble capaz de inducir efectos tóxicos, debe ser modificada en el suelo. Por ello, más que determinar los daños actuales de una contaminación específica, debe poder inferirse los daños de largo plazo, determinando el área total de dispersión probable y el tipo y tiempo de emergencia de daños futuros (González, 2001). La acumulación de Cd en el suelo por el uso de fertilizantes fosfatados es una materia relevante desde el punto de vista ambiental y de la salud humana dado que la concentración total de cadmio -1 en el suelo normalmente fluctúa entre valores menores de 1 a 3 [mg kg ] (Adriano, 1992; Carrasco, 1994) y aplicaciones sucesivas podrían incrementar estos valores afectando la salud humana en el largo plazo.

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Con el desarrollo de las “Buenas Prácticas Agrícolas” se busca la prevención del deterioro ambiental y de los efectos negativos sobre la salud humana ocasionados por las prácticas tradicionales (uso indiscriminado de agroquímicos, degradación de recursos naturales, etc.). 2.2 Aspectos del cadmio -3 El cadmio, por su densidad de 8,25 [g cm ], forma parte de los metales pesados, término -3 aplicado a los elementos con una densidad superior a 6 [g cm ] (Carrasco, 1994). Otra denominación es elemento traza, es decir, elemento presente en la corteza terrestre en un valor inferior a 1% (González, 1994). Últimamente, también se está usando la denominación elemento traza metálico para referirse a los metales pesados (Kaemmerer, 2001; Lavado, 2001). 2.2.1. Caracterización El cadmio (número atómico 48; masa atómica relativa 112,40) es un elemento metálico que pertenece, junto con el zinc y el mercurio, al grupo IIb de la tabla periódica. La principal especie del 2+ cadmio en la solución suelo es Cd , pero, este metal puede formar los siguientes complejos iónicos: + +3 -2 -2 Puede formar los siguientes complejos iónicos: CdCl , CdOH , CdHCO , CdCl 3, Cd Cl 4, Cd(OH) 3 y -2 Cd(OH) 4 además de complejos orgánicos, En las soluciones suelo en condiciones aeróbicas las especies de cadmio serán las siguientes (en orden decreciente): 0 + - Suelos ácidos; Cd (II), CdSO4 y CdCl4 + 0 + - Suelos alcalinos: Cd (II), CdCl , CdSO4 y CdHCO3 Además del Cd2+, son frecuentes las especies neutras CdSO4 y CdCl2, presentes en altas concentraciones en los suelos con pH superiores a 6,5. La especie acuosa dominante en aguas subterráneas a pH menores que 8,2, con moderada a 22+ baja concentración de sulfato (menor a 10-2,5M de SO4 ) es la especie Cd . A medida que aumenta el pH, se espera que se formen otras formas complejas de este metal. Tal como aprecia en la Figura 3, se espera que en aguas subterráneascon pH menor de 6 todo el cadmio disuelto esté bajo la 2+ forma de la especie Cd (EPA United States, 1999a).

Figura 3. Distribución de las especies acuosas de cadmio según pH (EPA- United States, 1999ª)

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2.2.2. Aportes al ambiente El cadmio ingresa al ambiente mediante diversas fuentes tanto naturales como antropogénicas. En la Tabla 9 se indican las fuentes de entrada de cadmio al ambiente. Tabla 9. Fuentes de cadmio Antropogénicas Lodos residuales y estiércol Fertilizantes fosfatados y nitrogenados Industria de plateado y galvanizado Minería del cinc, cobre, plomo y otros metales Incineración Industria de alimentos fosfatados para animales

Naturales Actividad volcánica Rocas

-1

En la corteza terrestre el cadmio se encuentra en cantidades muy bajas (< 1. [mg kg ]), en promedio -1 se encuentran valores de 0,1 a 0,2 [mg kg ] (Roberts, 1996). -1

Sin embargo, en los suelos su contenido fluctúa entre valores menores de 1 a 3 [mg kg ] de Cd. -1 La concentración de cadmio en un suelo no contaminado es inferior a 1 [mg kg ] (EPA – United States, 1999). Las concentraciones del cadmio podrían aumentar dependiendo de las actividades humanas, el material parental del suelo y de condiciones climáticas. Las principales fuentes de emisiones de cadmio son los servicios eléctricos, minería de yacimientos de oro y plata y manufactura de productos de arcillas estructurales. El carbón y otros combustibles fósiles contienen cadmio y su combustión lo libera al ambiente. El cadmio también se encuentra en los yacimientos de azufre que contienen sulfuro de zinc y en yacimientos de plomo y cobre que contienen zinc. El cadmio se ha detectado en esquistos carbonáceos y rocas fosfóricas. Las emisiones volcánicas contienen aerosoles enriquecidos con cadmio. Otra fuente de cadmio que afecta directamente al ser humano es el humo de tabaco que corresponde a una fuente de contaminación interna de cadmio. 2.2.3. Efectos sobre la salud humana Investigaciones recientes señalan que la exposición a reducidas concentraciones de cadmio produce alteraciones a los huesos con consecuentes riesgos de fracturas. Esto debido a que el cadmio puede interferir con el metabolismo del calcio, la vitamina D y el colágeno, produciendo, a largo plazo, alteraciones de los huesos tales como la osteomalacia y la osteoporosis (Staessen et al., 1999). El cadmio, una vez aportado por la vía de la fertilización fosfatada, puede ser absorbido por los cultivos y llegar hasta quienes se alimentan de ellos. Los vegetales se presentan sanos y vigorosos aún cuando contengan más cadmio que lo normal. En Japón se ha tipificado la enfermedad “ItaiItai”, en seres humanos, causada porconsumo durante largo tiempo de arroz contaminado con cadmio (Carrasco, 1994; Staessen et al., 1999; CONAMA, 2001). 2+

2

3+

Un aumento en la dieta de Ca , Zn + y Fe , disminuye la absorción de cadmio, cobre, plomo o 2+ 2+ mercurio; en cambio, un exceso de Cd en la dieta induce síntomas por deficiencia de Ca en humanos. En el caso de la carboxipeptidasa pancreática (cinc dependiente), disminuye la actividad y

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especificidad ante cadmio, mercurio, plomo, cobre o níquel, por intercambio del cinc desde el sitio activo (Tapia, 1994). El cadmio puede sustituir el calcio de los huesos, con resultados nefastos, tal como fue demostrado en Japón en los años 50, con agricultores que vivían en tierras contaminadas cercanas a una mina de cinc-cadmio (Gillett, 1999). Existen antecedentes de que el cadmio se relaciona con tumores en testículos y cáncer a la próstata en trabajadores expuestos (Tapia, 1994). Se ha demostrado que el riñón es el órgano crítico para el cadmio (WHO-IPCS, 1992). La exposición crónica al cadmio produce nefrotoxicidad (Tang, 2000). Otra situación de cuidado, particularmente en niños, es que se ha encontrado Cd y Pb en huevos de gallina alimentados con materiales inorgánicos (Dey y Dwivedi, 2000). El cuerpo absorbe aproximadamente 5% del Cd tomado del alimento y el agua y 10% del Cd inhalado del humo del cigarrillo. En promedio, un paquete de 20 cigarrillos contiene 20-25μg de Cd. Un no fumador, en un área no contaminada absorbería cerca de 0,5-1,3μg por día desde el alimento y el agua (Roberts, 1996). WHO (World Health Organization), 1972, estableció que el máximo de ingesta diaria de Cd (IDA -1 o Ingesta Diaria Admisible) no debería sobrepasar 1 *μg kg + del peso del cuerpo (es decir, 70 *μg -1 día-1] para un hombre promedio). La ingesta dietética de Cd se estimó en 15-30 *μg día ] para los -1 habitantes estadounidenses y 20- 40 *μg día ] para los europeos (OECD, 1994). Debido a que el alimento es la mayor fuente de ingesta de Cd, las estrategias de reducción del riesgo tendrán importantes implicaciones para la producción agrícola (Roberts, 1996). 2.2.4. Relación con el medio ambiente La contaminación ambiental por cadmio es un tema complejo que ha sido analizado por diversos investigadores desde diversos frentes: desde el punto de vista de la salud humana y otros seres vivos, la toxicología ambiental, las implicancias en la industria y la economía en la elaboración de diversos productos que contienen cadmio, con distintas aplicaciones, etc. Particularmente, en el sector agropecuario la preocupación por el cadmio se centra principalmente en la fertilización fosfatada, el uso de biosólidos, la alimentación animal con productos fosfatados, el agua de riego y la biodisponibilidad para los cultivos. Algunos países se han preocupado seriamente del desarrollo de estrategias para la reducción del cadmio ya sea en el origen de la fabricación de fertilizantes fosfatados, usando rocas fosfóricas de bajo contenido en cadmio, o en campo, usando fertilizantes fosfatados con menores concentraciones de este metal. Otra estrategia de campo ha sido la aplicación de correctores de pH del suelo ya que se ha comprobado que a pH ácido el cadmio se solubiliza, volviéndose más biodisponible para las plantas. En Dinamarca se ha desarrollado un modelo que explica el ciclo del cadmio y se ha llegado a cuantificar las entradas y salidas del sistema (Figura 4).

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Figura 4. Ciclo del cadmio en la agricultura danesa (Hovman et al. 1983).

Este modelo muestra las implicancias ambientales del cadmio, lo cual puede contribuir a su manejo y prevención de episodios adversos tanto para la salud humana como para el ambiente en general. Es destacable que la cuantificación de las entradas y salidas de cadmio en el sistema permitiría una evaluación del impacto de este metal y tomar las medidas necesarias para prevenir el deterioro del suelo, y consecuentemente los efectos adversos en la salud humana. Otro país que presenta avances en materia del cadmio y de la fertilización fosfatada es Australia, a través de programas de información a agricultores donde se tratan diversas estrategias para la disminución de las concentraciones de cadmio en el ambiente, particularmente en el recurso suelo (Mc Laughlin, 2001; Senn y Milham, 2001). En la Figura 5 se presenta una cartilla destinada a los productores de papas donde se reseñan ambos manejos, “malo” y “bueno”, para ilustrar los aspectos que se pueden manejar para la reducción del cadmio en los cultivos.

Figura 5. Cartilla de manejo del cadmio en papas para un producto de calidad (CSIRO, 1996, citado por Senn y Milham, 2001).

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El estudio del cadmio es un tema complejo debido a los fenómenos de bioconcentración y biomagnificación en el ambiente. Es un tema que ha sido abordado por diversos autores, especialmente por un grupo de expertos, reunidos en dos oportunidades en el marco de International Programme on Chemical Safety (IPCS, 1992) de la Organización Mundial de la Salud (OMS) en trabajo conjunto con la International Labour Organisation. 2.3. Fuentes de contaminación de cadmio El cadmio es un elemento no esencial y poco abundante en la corteza terrestre y a bajas concentraciones puede ser tóxico para todos los organismos vivos. La contaminación ambiental por cadmio ha aumentado como consecuencia del incremento de la actividad industrial que ha tenido lugar a finales del siglo XX y principios del siglo XXI, afectando de forma progresiva a los diferentes ecosistemas (Pinto et al., 2004). Entre los factores antropogénicos de contaminación de cadmio (Cd), caben destacar los siguientes (Fig. 6): a)

Emisiones atmosféricas. Se originan a partir de las minas metalúrgicas, ya que el cadmio se extrae como subproducto del Pb, Zn, Cu y otros metales, las incineradoras municipales, y emisiones industriales procedentes de la producción de pigmentos para cristales, anticorrosivos, baterias de Ni/Cd, e insecticidas (McLaughlin y Singh, 1999).

b) Depósitos directos. El uso de fertilizantes fosfatados es la principal fuente de contaminación de Cd en suelos agrícolas. Otra fuente de Cd la constituyen los fangos procedentes de aguas residuales que se utilizan en agricultura (Alloway y Steinnes, 1999). c)

Contaminación accidental. Ocurre eventualmente debido a la contaminación de tierras por procesos industriales, residuos de la minería y corrosión de estructuras galvanizadas. Un ejemplo son los vertidos de Aznalcóllar que tuvieron lugar en 1998, en la provincia de Sevilla, como consecuencia de la rotura de una balsa que contenía concentraciones elevadas de metales pesados procedentes de una mina de esta localidad (Aguilar et al., 2003).

Figura 6: Contribución relativa de las diferentes fuentes de cadmio. Tomado de la presentación L. Regoli para la LR/UNECE-LRTP Heavy Metals 16-03-05 (Comisión Económica de las Naciones Unidas para Europa-Contaminación Transfronteriza del Aire de Larga Distancia por metales pesados). Disponible en: www.chem.unep.ch/pb_and_cd/SR/Files/Submission%20NGO/ICdA/L.%20Regoli-Cd% 20contribution%20to%20human%20health-Berlin%202005.pdf

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2.4. Ingreso del cadmio en la cadena trófica La principal fuente de contaminación de cadmio en el ser humano es la ingesta de vegetales contaminados con este metal (Norvell et al. 2000). Químicamente, el cadmio se puede encontrar disuelto en el agua contenida en el suelo, adsorbido en superficies orgánicas e inorgánicas, formando parte de minerales, precipitado con otros compuestos del suelo o incorporado a estructuras biológicas. Sin embargo la biodisponibilidad del cadmio para la planta depende de numerosos factores físicos, químicos y biológicos que modifican su solubilidad y el estado del metal en el suelo. Uno de los principales factores es el pH del suelo, el potencial redox, la temperatura y el contenido en arcillas, materia orgánica, y agua (Christensen y Haung 1999). Por último es importante destacar el tipo de cultivo del que se trate, ya que no todas las plantas acumulan cadmio en igual medida (Prince et al. 2002). En la Figura 7, se muestra la capacidad para acumular cadmio de distintas especies vegetales de interés agrícola.

Figura 7: Acumulación de cadmio en cultivos vegetales de interés agrícola (*Variedades específicas de patata). Tomado de Managing Cadmium in Vegetables. VEGEnotes, Julio 2003. Disponible en: www.cadmium-management.org.au

2.5. Ingreso, transporte y acumulación de cadmio Por ser un metal no esencial se asume que no existen mecanismos de entrada específicos para el cadmio. Entre las proteínas responsables de la entrada de cadmio a la célula cabe destacar el transportador específico de calcio LCT1 (Clemens et al. 1998), y la proteína IRT1, perteneciente a la familia de transportadores de Zn y Fe (ZIP) (Guerinot 2000). Otra familia de transportadores implicados es la Nramp, localizada en la membrana de la vacuola, por lo que probablemente tenga una función en la movilización del metal y no en el ingreso del mismo a la raíz (Thomine et al. 2003). Una vez dentro de la célula el cadmio puede coordinarse con ligandos de S como glutation (GSH) o fitoquelatinas (PCs) y ácidos orgánicos como el citrato (Clemens 2006; Domínguez-Solís et al. 2004). Otras posibles moléculas responsables de la quelación del cadmio son pequeñas proteínas

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ricas en cisteína denominadas metalotioneínas (MTs). De esta forma, los complejos Cd-ligando pueden ser transportados al interior de la vacuola o a otras células (Shah y Nongkynrh 2007). En la planta, el cadmio se acumula preferentemente en la raíz secuestrado en la vacuola de las células, y solo una pequeña parte es transportada a la parte aérea de la planta concentrándose en orden decreciente en tallos, hojas, frutos y semillas (Chan y Hale 2004). En células de levadura se ha demostrado que el cadmio ingresa en la vacuola unido a fitoquelatinas (PCs) a través de un transportador de tipo ABC (Ortiz et al. 1995). Otro posible mecanismo de entrada del cadmio en la 2+ + vacuola es mediante un cotransportador de Cd /H ubicado en la membrana de la misma (Salt y Wagner 1993). Los transportadores de cationes CAX, implicados en el transporte de calcio a la vacuola, también transportan otros metales como el cadmio (Park et al. 2005). Una vez en la raíz, el cadmio puede pasar al xilema a través del apoplasto y/o a través del simplasto formando complejos (Clemens et al 2002). En la Figura 8 se muestra un esquema del ingreso del cadmio a través de las células de la raíz, hasta llegar al xilema.

Figura 8: Representación esquemática de los mecanismos de ingreso, secuestro y translocación del Cd en raíces (adaptado de Clemens, 2006). Aparecen representadas dos células, la de la derecha en contacto con la rizosfera, y la adyacente en contacto con el xilema. La capacidad de secuestro del metal en las células de la raíz juega un papel clave en la translocación del mismo a la parte aérea. Otro factor importante es la accesibilidad y movilización del metal secuestrado, la eficiencia del paso radial por el simplasto y a través de la endodermis, y por último el flujo al xilema. Abreviaturas: GSH; glutation, posible ligando del Cd, con el que formaría el complejo bisglutationato-Cd (GS2-Cd2+). PC, fitoquelatina; CAX2, posible proteína de Arabidopsis, responsable del transporte de H+/Cd2+; ABC, transportador de tipo ABC; HMA4, posible bomba de Cd de Arabiopsis; ZIP, transportadores ZIP; Nramp3, transportador de la familia Nramp; HMW y LMW, complejo Cd-PC de elevado y bajo peso molecular, respectivamente. (Rodriguez y colab, 2008. Ecosistemas 17 (3): 139-146.)

2.6. Toxicidad del cadmio Los efectos tóxicos del cadmio sobre las plantas, han sido ampliamente estudiados (Sanitá di Toppi y Gabrielli 1999; Benavides et al. 2005), sin embargo los mecanismos de su toxicidad aun no se conocen completamente. En general el Cd interfiere en la entrada, transporte y utilización de elementos esenciales (Ca, Mg, P y K) y del agua, provocando desequilibrios nutricionales e hídricos en la planta (Poschenrieder et al. 1989; Sandalio et al. 2001; Singh y Tewari 2003). El Cd también reduce la absorción de nitratos y el transporte de los mismos de la raíz al tallo, además de inhibir la actividad nitrato reductasa en tallos (Gouia et al. 2000). Las plantas expuestas a suelos contaminados con cadmio presentan modificaciones en la apertura estomática, fotosíntesis y transpiración (Sandalio et al. 2001). Uno de los síntomas más extendidos de la toxicidad por cadmio es la clorosis producida por una deficiencia en hierro (Benavides et al. 2005), fosfatos o por la reducción del

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transporte de Mn (Goldbol y Hutterman 1985). El tratamiento con cadmio produce reducción de la actividad ATPasa de la membrana plasmática, (Astolfi et al. 2005), alteraciones en la funcionalidad de la membrana plasmática (Fodor et al. 1995; Sandalio et al. 2001) y desequilibrios en el metabolismo del cloroplasto, inhibiendo la síntesis de clorofila y reduciendo la actividad de enzimas implicadas en la fijación de CO2 (Ali et al. 2000; Maksymiec et al. 2007). La toxicidad por metales pesados se debe en parte al estrés oxidativo producido por las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas a través de diferentes mecanismos dependiendo del 2+ 2+ metal de que se trate (Stohs y Bagchi, 1995). Los cationes metálicos Cd y Pb no experimentan 2+ 2+ cambios redox y por lo tanto, a diferencia del Fe o Cu , no actúan directamente en la generación de ROS. Sin embargo, pueden actuar como prooxidantes a través de la reducción del contenido de GSH, necesarios para la síntesis de PCs, disminuyendo así su disponibilidad para la defensa antioxidante (Pinto et al. 2003). El estrés oxidativo producido por el cadmio se manifiesta por daños oxidativos a membranas tales como peroxidación lipídica (Lozano-Rodríguez et al. 1997; Sandalio et al. 2001; Wua et al. 2003; Balestrasse et al. 2004), y también se han descrito daños oxidativos a proteínas por formación de grupos carbonilo (Romero-Puertas et al. 2002). Las actividades de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa (SOD), glutation reductasa (GR), ascorbato peroxidasa (APX), peroxidasas (POD) y la catalasa (CAT), encargadas de la defensa celular frente a las ROS, experimentan reducciones o incremento de su actividad en función de la concentración de cadmio incluida en el medio de crecimiento, la duración del tratamiento, el tipo de tejido y la especie vegetal de que se trate (Sandalio et al. 2001; Benavides et al. 2005). En los últimos años se ha incrementado el interés por el estudio de los mecanismos íntimos implicados en la producción de ROS en respuesta al Cd. Como consecuencia de ello, se ha demostrado la producción de ROS en distintos compartimentos celulares (membrana plasmática, mitocondrias y peroxisomas) siendo la NADPH oxidasa una de las principales fuentes de ROS (Olmos et al. 2003; Romero-Puertas et al. 2004; Garnier et al. 2006). En los últimos años se ha prestado una atención especial al estudio de la regulación de la producción de ROS y la síntesis de antioxidantes, así como la implicación de hormonas como el ácido jasmónico y el etileno, y de moléculas como el NO. En la Figura 9 se muestra un esquema que resume la respuesta al Cd de la planta, teniendo en cuenta los resultados obtenidos por distintos autores (Romero-Puertas et al. 2004, 2007; Olmos et al. 2003, entre otros). Según este esquema, el Cd podría inducir la NADPH oxidasa de membrana y las ROS que se formarían (O2 .- y H2O2) podrían intervenir en la lignificación de la pared celular que actúa como barrera de entrada del metal (Sanitá di Topi y Gabbrielli 1999). Las ROS pueden ser eliminadas por los sistemas antioxidantes pero cuando la intensidad y duración del tratamiento superan la barrera antioxidante, se produce un exceso de ROS que se traduce en daños oxidativos a membranas y proteínas. Los daños a membranas van acompañados de un incremento en la síntesis de etileno y jasmónico (JA), que junto con el H2O2 van a regular la expresión de un gran número de proteínas de defensa (HSPs, quitinasa o antioxidantes, entre otras). Recientemente se ha demostrado un importante papel regulador del NO en distintos procesos de desarrollo en vegetales (del Río et al. 2004). El papel de esta molécula está siendo estudiado y parece ser que el Cd reduce considerablemente la acumulación de NO en tratamientos largos, si bien no se conocen los mecanismos implicados en este proceso (Rodríguez-Serrano et al. 2006).

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Figura 9. Esquema de la respuesta celular al cadmio: producción de ROS, daños oxidativos y señalización. Modificado de Romero-Puertas (2002). HSP 71,2, proteína de estrés térmico de 71,2 kDa; PrP4A, proteína relacionada con la patogénesis. C2H4, etileno. (Rodriguez y colab, 2008. Ecosistemas 17 (3): 139-146.)

2.7. Estrategias de tolerancia al cadmio Las plantas han desarrollado distintas estrategias para evitar la toxicidad de metales pesados. En general, la tolerancia a metales viene determinada por la reducción del transporte del mismo al interior de la célula y/o una mayor capacidad para secuestrar estos metales. La raíz constituye una de las principales barreras de defensa mediante la inmovilización del Cd por pectinas de la pared celular. Los carbohidratos extracelulares (mucílago y calosa) de la raíz también pueden intervenir en la inmovilización del metal (Benavides et al. 2005). La acumulación del metal en los tricomas de la superficie foliar también es un mecanismo de inmovilización y defensa celular (Salt et al. 1995). Otro mecanismo consiste en la reducción del transporte o aumento de la extrusión del Cd por transportadores de cationes de la membrana plasmática (Thomine et al. 2000). Una vez dentro de la célula, el Cd u otros metales, pueden ser secuestrados por ácidos orgánicos, aminoácidos, fitoquelatinas y metalotioneínas, y posteriormente compartimentalizados en la vacuola para prevenir su toxicidad. Las fitoquelatinas constituyen uno de los principales mecanismos de defensa frente a metales pesados. Su síntesis tiene lugar a partir del glutation y se induce en presencia de metales pesados (Clemens, 2006). Plantas que sobreexpresan la enzima fitoquelatina sintasa muestran una mayor tolerancia frente al Cd (Pomponi et al. 2006). Otras posibles moléculas responsables de la acumulación del cadmio son las metallotioneínas (MTs), pequeñas proteínas ricas en cisteína, si bien en las plantas no son las principales responsables de la detoxificación del cadmio, como ocurre en células animales (Hamer 1986). 2.8. Hiperacumulación y fitoextracción de cadmio Las plantas hiperacumuladoras son, en muchos casos, endémicas de suelos ricos en metales pesados. El contenido en Cd de estas plantas es aproximadamente 100 veces superior al de plantas no hiperacumuladoras cultivadas en las mismas condiciones (Brooks 1998). La mayoría de estas plantas pertenecen a los géneros Thlaspi, Silene o Arabidopsis.

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Los mecanismos responsables de la hiperacumulación pueden variar dependiendo de la especie y consisten, básicamente, en una o varias estrategias de tolerancia mencionadas en el apartado anterior. En Thlaspi caerulescens la hiperacumulación de Cd y Zn se debe a una estimulación del transporte de los metales a la raíz y alteración del transporte intracelular con disminución de la acumulación del metal en la vacuola y aumento del transporte a la parte aérea (Shah y Nongkynrich 2007). Diferentes autores han propuesto aprovechar la característica inusual de estas plantas para la limpieza de terrenos contaminados (Raskin et al. 1997; Shah y Nongkynrich 2007). Sin embargo, la limitación principal de este tipo de fitoextracción es la pequeña biomasa de estas plantas, y el escaso tamaño y poca profundidad de sus raíces. Es por ello, que se ha potenciado el uso de plantas de mayor biomasa y crecimiento rápido modificadas genéticamente para sobreexpresar genes responsables de la hiperacumulación (Yang et al. 2005; Shah y Nongkynrich 2007). Así, se han obtenido plantas transgénicas tolerantes que sobreexpresan genes que codifican enzimas del metabolismo del glutation, fitoquelatinas, o transportadores de cationes (Shah y Nongkgnrih 2007). 2.9. Modelo de evaluación y manejo del riesgo del cadmio en el suelo De Meeûs et al., 2002, publicaron las aplicaciones de un modelo para la evaluación y manejo de los riesgos alcanzados por la exposición al cadmio de los fertilizantes. Este modelo fue propuesto por la Unión Europea, en el marco de una serie de estudios realizados por la institución Environmental Resources Management (ERM) por encargo del European Commission Directorate General III (ERM, 1999, ERM, 2000, ERM, 2001). Dichos estudios surgen de un mandato al interior de la Unión Europea por la necesidad de evaluar los efectos del cadmio en sus Estados Miembros. El modelo consta de tres etapas indicadas en la Figura 10, donde se señalan las entradas y salidas de información en cada una de ellas.

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Figura 10. Entradas y salidas de información de las etapas del modelo de manejo del riesgo ( De Mee+us, 2002). En cada etapa del modelo se necesitan datos según las condiciones locales y a la escala espacial en que se va a aplicar (por ejemplo a nivel país) con los cuales se llega a los siguientes resultados:  Etapa 1 o de acumulación: se obtiene la acumulación neta de cadmio en el suelo y en la solución suelo.  Etapa 2 o de exposición: se obtiene la captación de cadmio desde el suelo hacia las plantas y la consecuente captación del cadmio por el ser humano, a través de aquellos alimentos sensibles a la captación de cadmio tales como granos, cereales, tubérculos, raíces y hojas).  Etapa 3 o de caracterización del riesgo: se hace una estimación de los efectos adversos del cadmio en base a sus concentraciones actuales o estimadas. 2.9.1. Descripción general del modelo de acumulación La concentración ambiental estimada de cadmio en el suelo, y más específicamente en la solución suelo, son parámetros claves para determinar la captación de cadmio por los cultivos destinados al consumo humano. La Figura 11 muestra las vías de transferencia del cadmio hacia y desde el suelo.

Figura 11. Suelo – vías de transferencia del cadmio en la solución suelo ( ERM, 1999, De Meeús eta al 2002)

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Después del ingreso al suelo, el cadmio se distribuirá entre las partículas de suelo y la solución suelo, según dos mecanismos principales de remoción (ERM, 1999; de Meeûs et al., 2002):  Captación del cadmio desde la solución suelo por la vegetación, la cual será subsecuentemente cosechada para el consumo humano.  Lixiviación del cadmio desde el suelo, lejos de la capa arable, pero con el peligro de la contaminación de aguas subterráneas. Ambos mecanismos son críticamente dependientes del pH y otras propiedades del suelo (EPA, 1999a; de Meeûs et al., 2002). La entrada de cadmio vía aplicación de fertilizantes constituirá un subconjunto del total de entradas -1 -1 de cadmio al suelo. Otras fuentes incluyen la depositación atmosférica (0,4 a 1,1 [g ha año ] en la -1 UE), la aplicación de lodos (0,05 a 0,4 [g ha-1 año ] en la UE) y el acondicionamiento de suelos (ERM, 1999). La aplicación directa de químicos así como los niveles basales no se consideran en el presente modelo. La acumulación de cadmio en el suelo se puede expresar en forma dinámica usando la siguiente expresión matemática (Harmsen, 1992; Vissenberg y Van Grinsven, 1995 y Moolenaar et al., 1997):

Donde: -1 Cd s(t): concetración de cadmio en la capa arable ( mgkg ) al tiempo t en años -1 Cds (o): concentración de cadmio inicial (día presente) en el suelo (mgkg ) -1 Kp: tasa anual de extracción de cadmio por las plantas (g ha ) -1 Ki: tasa anual de lixiviación de cadmio ( g ha ) t: tiempo en años -1 Ke: tasa anual de entrada de cadmio (g ha ) -3 Da: densidad aparente del suelo (Kg m ) p: profundidad de la capa arable ( m) -1 Cds(EE): concentración de cadmio en estado estable en la capa arable ( mg kg ) Todas las concentraciones de cadmio en el suelo se expresan en términos de peso seco (a 105°C). Cada una de las tasas se describe en mayor detalle más adelante. 2.9.2. Concentraciones de cadmio en suelos agrícolas -1 En la Ecuación 1 se requiere conocer los niveles actuales de cadmio en el suelo Cds(0) [mg kg ] para hacer proyecciones futuras sobre el estado de la contaminación de los suelos y asimismo, comparar estos valores con las tendencias futuras reales de cadmio. Todos los suelos tienen un contenido base de cadmio que varía de acuerdo a la roca parental de la cual se deriva. La concentración de cadmio media, para los países europeos, según la mayoría de los estudios, están en

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-1

el rango de 0,06 a 1,1 mg kg (De Meeûs, 2002). En el perfil de suelo, el cadmio está normalmente a niveles más altos en el horizonte superficial. Los suelos agrícolas pueden tener contenidos más altos de cadmio respecto de los suelos no intervenidos como ocurre, por ejemplo, en los suelos forestales, debido a la aplicación de cal, -1 fertilizantes y lodos (Römkens and Salomons, 1998). Un valor de Cds(0) de 0,3 mg kg (peso seco) fue sugerido por Belgian Federal Department of the Environment (BFDE) en 1999 como promedio de la Unión Europea, no obstante, el modelo de acumulación debería ser simulado con un rango de concentraciones de cadmio dependientes de la variación del contenido de cadmio dentro de cada país. 2.9.3. Tasa anual de entrada de Cd a los suelos agrícolas (Ke) La expresión matemática para el cálculo de Ke es la siguiente:

Donde el término Ke representa la tasa de entrada de cadmio al suelo agrícola y comprende tres componentes -1 -1 que tienen unidades de [g ha año ]: Kdep : tasa de entrada vía depositación atmosférica. Kfer : tasa de entrada vía aplicación de fertilizantes. Kle : tasa de entrada vía aplicación de lodos/estiércol. Para el presente estudio sólo se considerará la entrada de fertilizantes fosfatados. Sin embargo, se debe tener presente que para los países miembros de la Unión Europea se ha estimado una tasa -1 promedio base de depositación atmosférica anual de cadmio de 0,4 g ha , informado por BFDE (Belgian Federal Department of th eEnvironment), en 1999 (de Meeûs et al., 2002). 2.9.4. Extracción de cadmio vía cultivos La extracción de cadmio de los cultivos es variable, sin embargo, se puede adoptar un valor -1 -1 anual de 0,5 g Cd ha con una concentración inicial de cadmio al tiempo 0 de 0,3 mg kg De Meeûs et al. (2002), proponen la siguiente ecuación para calcular el Kp requerido en la Ecuación 1 y Ecuación 2 del modelo.

Donde, -1 Kp: tasa de extracción de cadmio del cultivo [año ] -1 -1 Cdp: cadmio extraído por el cultivo [g ha año ] p: profundidad de la capa arable [m] -3 Da: densidad aparente del suelo [kg m ] -1 Cds(0): concentración inicial de cadmio en el suelo [mg kg ] 2.9.5. Lixiviación de cadmio en suelos agrícolas

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En el modelo se considera que la pérdida de cadmio debida a la lixiviación desde la capa arable dependerá inicialmente de la distribución del cadmio entre las partículas de suelo y la solución suelo, en función de propiedades tales como su pH, materia orgánica y textura. La remoción de cadmio será subsecuentemente función de las propiedades químicas y físicas del suelo, de la tasa de infiltración y del flujo neto de agua. La BFDE (1999) adoptó un modelo simple de lixiviación el cual ha sido ampliamente usado en estudios de acumulación del cadmio y carga crítica en suelos; el modelo la expresa como:

Donde, -1 L: lixiviación neta anual de cadmio [g ha ] -1 Cdss : concentración de cadmio en la solución suelo *μg L ] F: exceso de precipitación anual [m] El exceso de precipitación se define como la parte del agua precipitada, en estado sólido o líquido, que puede estar disponible potencialmente para escurrimiento superficial, infiltración o almacenamiento (CECW-EH-Y, 1994). El Cdss se calcula mediante la siguiente ecuación:

Donde: -1 Cdss: concentración de cadmio de la solución suelo *μg L ] -1 Cds: cadmio de la fracción particulada del suelo *μg kg ] -1 KD: coeficiente de partición fracción sólida/líquida [L kg ] El cálculo de KD es válido sólo para un elemento particular (en este caso cadmio) y para las características químicas de la solución suelo para la cual se realice la estimación de este parámetro. En el valor de KD intrínsicamente se asume que el sistema cadmio solución suelo/fracción sólida es reversible. Otros supuestos implícitos son: (1) los contaminantes están a concentraciones traza en las fases sólida y líquida del suelo, (2) la relación del contaminante en la fase sólida respecto de la fase líquida es lineal, (3) existen condiciones de equilibrio, (4) cinéticas de adsorción y desorción igualmente rápidas, (5) describe partición del contaminante entre un sorbato (contaminante) y un sorbente (suelo), (6) todos los sitios de adsorción están accesibles y tienen la misma fuerza (EPA–UNITED STATES, 1999a). Por otro lado, experimentalmente es muy difícil distinguir las distintas especies de una sustancia química, por ello normalmente se asume que no hay diferenciación en especies químicas.

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En las ecuaciones 1 y 2 se requiere calcular la tasa de lixiviación anual (Kl). La Ecuación 5 puede -1 -1 ser convertida a un valor anual dividiendo L [g ha año ] por la cantidad inicial de cadmio en el suelo -1 (Cds(0) [mg kg ]), contenida en 1 ha de suelo aprofundidad de aradura. Insertando Cdss despejado de la Ecuación 6 en la Ecuación 5, el algoritmo compuesto para Kl (valor anual) es:

Donde, -1 Kl: tasa anual de lixiviación de cadmio [año ] F : exceso de precipitación anual [m] -1 KD : coeficiente de partición fracción sólida/líquida [L kg ] p : profundidad de la capa arable [m] -3 Da : densidad aparente del suelo [kg m ] El escurrimiento superficial3 anual está dado por:

Donde, -1 F : tasa de escurrimiento [m año ] -1 P : tasa de precipitación [m año ] -1 finf : tasa de infiltración [ m año ]

-1

Valores representativos para la Unión Europea son 0,25 [m año ] para finf y

-1

0,2 [m año ] para F.

El coeficiente de distribución, KD, es dependiente del tipo de suelo, del pH, contenido de materia orgánica, capacidad de intercambio catiónico, etc. En la Unión Europea cada Estado Miembro ha desarrollado su propio algoritmo para determinar el KD del cadmio (De Meeûs et al., 2002), asimismo, en Estados Unidos se ha destacado que es esencial medir este valor para condiciones sitio-específicas antes de hacer cualquier estimación sobre el impacto de un contaminante en un sistema ambiental (Environmental Protection Agency, 1999).

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III. FITOTOXICIDAD DEL PLOMO

3.1 Generalidades -1

El plomo varía en los horizontes superficiales del suelo en un rango de 3 a 189 mg kg , mientras -1

que los valores medios para tipos de suelo varían entre 10 a 67 mg kg con un promedio de 32 mg -1

-1

kg . Se han informado valores altos de Pb (sobre 100 mg kg ) para suelos de Dinamarca, Japón, Gran Bretaña e Irlanda, los que probablemente reflejan el impacto de la contaminación. Davies (1977) -1

estableció que el límite superior para el contenido de Pb de un suelo normal podría ser 70 mg kg . La solubilidad del Pb puede disminuir mediante el encalado. En condiciones alcalinas el Pb precipita como hidróxido, fosfato o carbonato, y también se promueve la formación de complejos orgánicos estables de Pb. La acidez creciente del suelo puede aumentar la solubilidad de Pb, pero su movilización generalmente es más lenta que su acumulación enlas capas de suelo ricas en materia orgánica. La localización característica del Pb cerca de la superficie del suelo, se relaciona principalmente con la acumulación superficial de materia orgánica. En suelos contaminados con Pb, éste se encuentra comúnmente asociado a Cd y Zn. La barrera suelo-planta limita la trasmisión de Pb a la cadena alimenticia, ya sea por procesos de inmovilización química en el suelo (Laperche et al., 1997), o limitando el crecimiento de las plantas antes que el Pb absorbido alcance niveles que pueden ser dañinos para el ser humano. La absorción y traslocación de Pb por depositación atmosférica en las hojas puede llegar a ser un 73 a 95% del contenido de Pb total en plantas de hoja (como espinacas) y cereales (Kabata –Pendias, 2000). La estabilización del Pb en suelos contaminados puede lograrse mediante la aplicación de fósforo y óxido de manganeso. Sin embargo, estos tratamientos afectan la biodisponibilidad de otros metales (Cd y Zn). Además, la continua remoción de P y otros elementos químicos inducidos por el crecimiento de las plantas puede afectar la biodisponibilidad de Pb en el suelo. En las plantas el Pb se almacena principalmente en las raíces, siendo mínima su presencia en las estructuras reproductivas. Tabla 10 muestra algunos rangos y contenido medio de Pb en vegetales de consumo

3.2 Estrés por plomo El plomo es un miembro del Grupo IVB de la tabla periódica de los elementos. Tiene dos estados de oxidación, Pb (II) y Pb (IV), que son estables, pero la química ambiental del elemento es dominada 2+ 3 por el ion plumboso (Pb ). El Pb elemental es un denso metal azul grisáceo (11.3 g/cm ) con punto de fusión a 327 °C y de ebullición a 1744 °C. El bajo punto de fusión permitió fundirlo y trabajarlo en las sociedades primitivas. El metal es muy blando y tiende a deslizarse. Es por eso que fácilmente se puede cortar y moldear y durante mucho tiempo ha sido usado sobre tejados o para la fabricación de cañerías. El plomo metálico es relativamente opaco a la radiación ionizante, y hace de escudo de defensa al trabajar con rayos X y radioisótopos.

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El plomo se une a otros metales fácilmente: el Pb/Sb es principalmente usado para hacer placas de baterías pero también es usado para las balas de las armas y frecuentemente ésta aleación se usa para soldar. El plomo metal en combinación con PbO2, es usado para fabricar el plomo ácido en los electrodos de acumuladores y baterías. Otros componentes inorgánicos son ampliamente usados. Por ejemplo, el cromato amarillo para pintar las calzadas y muchas otras pinturas contienen óxidos de plomo. También se usan jabones de plomo para promover la polimerización en la industria petroquímica del plástico. Existe una extensa química orgánica de los compuestos del plomo (IV), especialmente tetra-alquilos y tetra-arilos (Greninger, 1974).

Tabla 10: Rangos y contenidos medios de Pb en vegetales de conusmo (Kabata-Pendias 2000)

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El plomo no es un elemento esencial o beneficioso para las plantas y animales. Es un veneno bien conocido para los mamíferos y en humanos se teme a los síndromes clínicos de la toxicidad por plomo. El plomo afecta el sistema nervioso humano, la producción de células sanguíneas, los riñones, el sistema reproductivo y la conducta. La intoxicación producida por el plomo se denomina saturnismo y sus síntomas se manifiestan como la aparición de fatiga, dolores de cabeza, dolores musculares y de estómago, anorexia, estreñimiento y, en su fase más crítica, "cólico del plomo", es decir, calambres abdominales intensos, acompañados de náuseas, vómitos y presión arterial elevada. Han sido observados casos concretos en niños que han estado en contacto con el suelo o con partículas en suspensión (Wixson, 1994) que presentaron plomo en sangre. La contaminación por plomo originariamente es debida a la extracción de minerales de plomo del suelo utilizando el calor en los afloramientos naturales. El agua transportada por percolación, lixiviación o escorrentía, es decir, por procesos propios del ciclo hidrológico transporta plomo en pequeñas partículas provenientes de las minas (Laxen y Harrison, 1977). Otras actividades antropogénicas hacen que predomine en las zonas rurales, urbanas e industriales. Las principales fuentes de contaminación por plomo son:  Deposición aérea en minas explotadas  Gases contaminantes urbanos  Partículas de combustible no quemado  Deposición de residuos sólidos urbanos (Chaney y Ryan, 1994)  Fundición de minerales  Efluentes de plantas de reciclaje de baterías industriales  Chimeneas de fábricas  Aditivos para pinturas y gasolina (Eick et al., 1999)  Uso de municiones militares (Shmaefsky, 2003; Brian, 2003)  Procesos de plateado y terminación de metales  Uso de fertilizantes (Stefanov et al., 1995; Shmaefsky, 2003) El plomo se une preferentemente a oxígeno, grupos amino o sulfhidrilo y ocasiona estrés iónico 2+ debido a su elevado índice de covalencia. En la mayoría de los casos, el catión libre (Pb ) suele ser la forma más fitotóxica. Los factores que afectan la disponibilidad y absorción de plomo son el tamaño de las partículas del suelo y la capacidad de intercambio catiónico, además de los factores de la planta tales como la superficie de la raíz, los exudados de la raíz, la micorrización y la tasa de transpiración (Davies, 1995). El plomo está clasificado como un ácido débil de Lewis dado que es una sustancia que sin contener hidrógeno se comporta como un ácido siendo capaz de aceptar un par electrónico mediante la formación de enlaces covalentes coordinados según la Teoría de Lewis Gilbert Newton (1875-1946). Por lo tanto, el plomo presente en el suelo esta estrechamente ligado a la materia orgánica de las plantas o materia coloidal del suelo o como precipitado. Todas estas formas reducen la absorción de plomo por las raíces de las plantas.

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La absorción de plomo como plomo metal en el suelo sigue la relación de Langmuir, incrementándose en función del incremento del pH desde 3.0 hasta 8.5 (Lee et al., 1998). En este sentido, Nikazar y Afshari (2005) en un estudio sobre la adsorción de Pb (ІІ), Cd (ІІ) y Cr (VI) sobre paja y salvado de trigo empleando técnicas de columna observaron que la adsorción de Pb (ІІ), Cd (ІІ) y Cr (VI) aumenta al crecer el pH, y disminuye cuando se aumenta la temperatura y la velocidad de flujo de la solución. Sin embargo, Blaylock et al. (1997) han mostrado que en el suelo con un pH entre 5.5 y 7.5 la solubilidad del plomo es controlada por fosfato o precipitados de carbonato y muy poco plomo está disponible para las plantas incluso aunque éstas presenten la capacidad genética para acumularlo. En la investigación sobre la fitototoxicidad del plomo predomina el estudio de la capacidad de acumulación del plomo y su posible transmisión hacia el hombre a travésde la cadena trófica. Por tal razón, las plantas son útiles para conocer los mecanismos de absorción y transporte de plomo con el objeto de conseguir la selección y el desarrollo de variedades tolerantes, capaces de aumentar la acumulación del elemento en sus tejidos. 3.3 Distribución de plomo en la raíz 2+ Hacia la superficie de la raíz el Pb se une a los grupos carboxilo del ácido urónico del mucílago. El mucílago establece una barrera importante protegiendo el sistema radicular del metal entrante. Algunas de las uniones de los metales son liberadas cuando el mucílago es biodegradado (Morel et al., 1986). Los microorganismos del suelo pueden afectar la disponibilidad del metal pesado por procesos de biosorción, bioacumulación y solubilización. Adicionalmente, las ectomicorrizas pueden 2+ influenciar la entrada, transporte y toxicidad del Pb en abeto noruego (Marschner et al. 1996). 3.4. Plomo en el apoplasto 3.4.1 Pared celular 2+ La retención de plomo en las raíces está basada en la unión de Pb hacia iones con sitios intercambiables sobre la pared celular formando depósitos en la misma. Esta precipitación extracelular corresponde principalmente a la forma de carbonato de plomo. La adición de quelantes sintéticos, tal como H-EDTA o EDTA, en combinación con un bajo pH, 2+ previene la retención de Pb en la pared celular, permitiendo su absorción y translocación hacia la parte aérea (Jarvis y Leung, 2002), siendo la localización del metal mayor en raíces que en otras 2+ partes de la planta. El Pb se une fuertemente a los grupos carboxilo del ácido galacturónico y al propio ácido galacturónico en la pared celular, el cual restringe su transporte vía apoplasto (Rudakova et al., 1988). 3.4.2 Membrana plasmática En general, las plantas dicotiledóneas acumulan significativamente altas cantidades de plomo en raíces en comparación con las raíces de las plantas monocotiledóneas (Huang y Cunningham, 1996). El plomo transportado desde el suelo hacia las células tiene que cruzar la membrana plasmática de las células de la raíz. Una posible vía de transporte de plomo a través de la membrana plasmática parece que es a través de los canales catiónicos de la mísma, tales como canales de Calcio. En este sentido, ha sido

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+2

caracterizado un canal de Ca operado por voltaje en la membrana plasmática de raíz en trigo y 2+ maíz (Marshall et al., 1994; Huang et al., 1994). Huang y Cunningham (1996) encontraron que el Pb +2 inhibe significativamente el voltaje medido como consecuencia de la actividad de los canales de Ca +2 2+ en el plasmalema de raíces de trigo. La inhibición de los canales de Ca por Pb puede originarse 2+ 2+ por bloqueo del canal por el Pb o debido a transporte competitivo de Pb a través del canal de +2 Ca . Los bloqueadores de los canales del calcio son capaces de inhibir la proliferación celular y la falta de calcio ocasiona la apoptosis o muerte celular. En este sentido, Tomsig y Suszkiw (1991), observaron permeación de plomo a través de los canales de calcio en células cromafínicas de médula de glándulas suprarrenales de bovino. Estos investigadores encontraron que el voltaje emitido por +2 transporte de plomo fue bloqueado por nifedipina (bloqueador del canal de Ca ) e incrementado +2 por BAY K8644, un canal de calcio tipo-L que inhibe el flujo de Ca a través de un receptor con un ligando de glutamato (Donald 1999). Su toxicidad depende parcialmente de su activación por voltaje emitido (sensibilidad al tóxico .plomo.) por los canales de calcio. Sin embargo, se puede hacer reversible la toxicidad por despolarización, ya que puede beneficiar la supervivencia de las células a través de otros mecanismos diferentes al flujo de calcio a través del voltaje emitido por los canales de calcio. 2+

2+

Por otra parte, el Ca bloquea el transporte de Pb dentro de la raíz y, en consecuencia, disminuye 2+ +2 la toxicidad por Pb sobre el crecimiento de la misma. El efecto protector del Ca sobre la toxicidad 2+ del Pb puede ser relacionada con su inhibición para ser acumulado el metal pesado en la punta de 2+ 2+ la raíz, sitio potencialmente blanco de la toxicidad del Pb . El Mg , a pesar de que bloquea tanto 2+ 2+ como el calcio la absorción de Pb , no mejora la toxicidad por Pb sobre el crecimiento de la raíz +2 tanto como el calcio. Estos resultados sugieren que el efecto protector del Ca sobre la toxicidad del 2+ 2+ 2+ Pb involucra múltiples mecanismos, incluyendo la competición para entrar, y que el Pb y el Cd pueden competir con cationes divalentes por el transporte dentro de las raíces de plantas de arroz (YoYoung., et al. 2002). 3.5. Transporte de plomo El plomo se mueve predominantemente dentro del apoplasto de la raíz en una forma radial a través del córtex y se acumula cerca de la endodermis. La endodermis actúa como una barrera parcial al movimiento de plomo entre la raíz y la parte aérea. Tal y como muestran la mayoría de datos referidos a la elevada acumulación de plomo en raíces comparada con la de la parte aérea (Jones et al., 1973; Verma y Dubey, 2003). En semillas de Oryza sativa L. germinadas durante 10 ó 20 días en cultivos de arena con solución nutritiva a la que se añadió 500 µM o 1000 µM Pb(NO3)2, el crecimiento de las raíces fue reducido entre un 22 % y un 42 %, mientras que el crecimiento de la parte aérea fue reducido en un 25 %, ya que la localización de plomo absorbido fue 1.7 a 3.3 veces más alta en las raíces que en la parte aérea. El transporte limitado de plomo desde las raíces hacia otros órganos es debido a la barrera de la endodermis de la raíz. Parece ser que la banda de Caspari de la endodermis es el mayor factor limitante que restringe el transporte de plomo dentro del tejido del cilindro central (Seregin e Ivanov, 1997). Sin embargo, parece haber controversia sobre el movimiento del plomo en la raíz pues, si bien Lane y Martin (1977) afirman que el plomo se mueve en el simplasto, según Broyer et al., (1972) el movimiento del plomo en la raíz sigue primariamente la vía del apoplasto debido a que una proporción representativa de plomo es extraída del agua.

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Teóricamente, según Sánchez y Aguirreola (1993) se pueden resumir tres vías anatómicamente diferentes a través de las cuales podría moverse el agua:  En primer lugar, la ruta externa al citoplasma vivo, es decir, el continuo de paredes celulares externo a la membrana celular. Esta vía se denomina apoplasto. El apoplasto de la raíz representa, aproximadamente, un 10% del volumen de la misma y equivale al espacio libre.  En segundo lugar, existe la posibilidad de que el agua atraviese la pared celular y el plasmalema, para entrar luego en el citoplasma. Posteriormente, se movería a lo largo del continuo citoplasmático a través de los plasmodesmos que conectan el citoplasma con las células adyacentes. Esta ruta, que representa la porción viva de la célula, se denomina vía del simplasto.  Finalmente, existe la posibilidad de que el agua atraviese tanto el plasmalema como el tonoplasto, de tal manera, que la vacuola pasaría a ser una parte integral de la vía de transporte. La posibilidad de transporte simplástico del plomo ha sido demostrada en raíces de cebolla e hipocótilos de berro (Wierzbicka, 1987). Altas concentraciones de plomo causan lesiones e interrupción en la función de la barrera del plasmalema tanto en la permeabilidad selectiva del plasmalema como en el tonoplasto. Se ha demostrado que el plomo se retiene más en la superficie del plasmalema que en las paredes celulares. El plomo puede entrar en células dañadas junto con otros componentes como determinados colorantes, los cuales no entran en células no dañadas (Seregin et al., 2004). El patrón de distribución de plomo en la raíz difiere considerablemente dependiendo de concentraciones de plomo y variando según la concentración (Seregin et al., 2004). A bajas concentraciones de plomo predomina el flujo de iones plomo en el apoplasto, mientras que a altas concentraciones, la barrera funcional de plasmalema es dañada y una gran cantidad de plomo penetra dentro de las células. En general, la aparente concentración de plomo en partes aéreas de la planta decrece con la distancia desde las raíces. La principal causa es que la mayor concentración de plomo se halla en las paredes celulares de la raíz a diferencia de otras partes de la planta. Adicionalmente, se presentan uniones con el plomo en tejidos lignificados con mayor frecuencia que en tejidos no lignificados. En este sentido, Suchodoller (1967) observó mayor retención de plomo en la epidermis de la raíz de cebada y una mínima cantidad en los tejidos vasculares, lo que sugiere que hasta cierto punto la localización de plomo en diferentes tejidos de la planta es también dependiente de la especie. En semillas, la testa previene la entrada de plomo dentro de los tejidos internos hasta su ruptura por el desarrollo de la radícula. Una vez la testa se rompe, el plomo entra rápidamente, con notables excepciones, en las regiones meristemáticas de la radícula e hipocótilos. En los cotiledones, el plomo se mueve a través de los tejidos vasculares y tiende a acumularse en áreas discretas en las partes dístales (Lane y Martin, 1977). El contenido de plomo en varios órganos de la planta tiende a decrecer en el siguiente orden: raíces > hojas > tallos > inflorescencia > semillas. Sin embargo, este orden puede presentar variaciones intraespecíficas (Antosiewicz, 1992).

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En plantas de cebolla (Allium cepa), el plomo absorbido es localizado en altas concentraciones en las puntas de la raíz seguidas por partes proximales de la raíz, mientras que bajas concentraciones han sido encontradas en la base de la raíz (Michalak y Wierzbicka, 1998). Las hojas difieren su capacidad para acumular plomo dependiendo de la edad. El máximo contenido de plomo es encontrado en hojas senescentes y el mínimo en hojas jóvenes (Godzik, 1993). Estudios ultraestructurales han revelado que cantidades variables de depósitos de plomo están presentes principalmente en el espacio intercelular, pared celular y vacuolas, mientras que pequeños depósitos de este metal han sido vistos en el retículo endoplasmático, dictiosomas y vesículas derivadas de los mismos. La pared celular y la vacuola juntas suman 96% del plomo absorbido (Wierzbicka y Antosiewicz, 1993). El factor por el cual el plomo es encontrado en el retículo endoplasmático y dictiosomas está aparentemente relacionado con la secreción del metal de la superficie celular dentro de la vacuola. Puesto que una pequeña cantidad de plomo alcanza el núcleo, cloroplastos y mitocondrias, es lógico suponer que ejerce su efecto tóxico sobre estos orgánulos. Los gradientes del potencial electroquímico entre vacuolas y la solución externa de células de la hoja de Potamogeton sp., varía entre [-150 y -240 mV], lo cual debe favorecer una entrada pasiva de plomo dentro de las vacuolas durante el tratamiento con este metal (Denny y Weeks, 1968). De particular interés es la invaginación del plasmalema para formar vacuolas pinocitóticas en muchas especies de plantas, tal como en Stigeoclonium. La formación de tales vacuolas es importante para el secuestro del exceso de iones metálicos de forma que dichas vacuolas podrían proteger los contenidos celulares de los efectos tóxicos del plomo (Silverberg, 1975). Frecuentemente, en regiones muy próximas a los plasmodesmos, se encuentran partículas grandes de plomo ocupando una elevada porción del volumen de la pared celular. En otras regiones donde la pared celular es más gruesa y substancial, partículas pequeñas se sitúan dentro de la pared celular hacia la periferia. La deposición de aquellas partículas pequeñas de plomo ocurre posiblemente a través de la acción de vesículas pinocitósicas (Ksiazek et al., 1984). Por otro lado, el estudio de la localización del plomo en células de plantas acuáticas aún está en proceso de investigación. Plantas de Lemma minor L. tratadas durante una hora con plomo mostraron contenidos elevados de plomo en vacuolas pequeñas, a la vez que en tratamientos a más largo plazo (6 y 12 h) se observó un incremento del contenido en Pb en la pared celular (Samardakiewicz y Wozny, 2000). La localización de plomo en la pared celular posiblemente es consecuencia de una redistribución de plomo y refleja un incremento en el transporte apoplástico A su vez, la presencia de plomo en vesículas pequeñas en Lemma minor sugiere que la endocitosis juega un papel importante en la entrada de plomo en estas plantas.

3.6. Efectos fisiológicos La fitotoxicidad por plomo ocasiona desordenes en las actividades fisiológicas normales de las plantas hasta matar eventualmente las células a altas concentraciones (Ernst, 1998; Seregin e Ivanov, 2001). Los principales procesos fisiológicos afectados son la actividad enzimática, la nutrición

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mineral, el potencial hídrico, el estatus hormonal, la estructura de la membrana y el transporte de electrones. Los síntomas de toxicidad por Pb pueden dividirse en síntomas no específicos y específicos. Según Burton et al. (1984), los síntomas visuales no específicos consisten en una inhibición rápida del crecimiento radicular, reducción del área foliar, clorosis y aparición de manchas pardo-rojizas fenólicas en tallos, pecíolos y hojas, y necrosis foliar. Por otra parte, según Mishra y Choudhari (1998), la toxicidad por plomo inhibe la germinación de las semillas y retarda el crecimiento de las plantas. Los síntomas específicos consisten en una disminución del porcentaje e índice de germinación, de la proporción longitud radicular/parte aérea, del índice de tolerancia a plomo y mercurio, y del peso seco de las raíces y de la parte aérea. La anterior síntesis permite introducir varias investigaciones publicadas sobre efectos adversos por plomo en plantas. Estos efectos se pueden separar en dos grupos:  efectos adversos a altas concentraciones de plomo y  efectos adversos a bajas concentraciones de plomo. 3.6.1. A altas concentraciones de Pb Los efectos ocasionados por el plomo a altas concentraciones son: • Disminución del 14 al 30 % en la germinación de semillas de arroz y reducción del crecimiento de semillas de 13 a 45 % con 1mM Pb (Verma y Dubey, 2003). • Reducción del número de semillas en germinación y encogimiento del hipocótilo de Lupinus (Wozny, et al., 1982). -2

-6

• Inhibición de crecimiento de la raíz a 10 - 10 M Pb in vitro o con un contenido superior a 10 mg / kg de contenido de plomo en el suelo (Breckle, 1991). • A nivel celular el plomo inhibe las actividades de enzimas que contienen grupos sulfhidrilo (-SH) necesarios para su actividad (Van Assche y Clijsters, 1990). 3.6.2. A bajas concentraciones de Pb Los efectos ocasionados por el plomo a bajas concentraciones son: • Mayor sensibilidad en el desarrollo y la extensión de la raíz principal a diferencia de las raíces laterales (Obroucheva et al., 1998). • Incremento del contenido de plomo en las raíces en relación directa con la concentración en niveles de entre 0.1 y 2 µM de Pb en Picea abies. Paralelamente, cuando se realiza una exposición de las plantas a 0.5 µM de Pb durante 4 semanas se reduce el crecimiento de las raíces primaria, secundaria y terciaria (Godbold y Kettner, 1991). • En semillas de Zea mays, se ha observado una fuerte inhibición del crecimiento de la raíz primaria y una corta zona de ramificación cuyas raíces laterales son más compactas, ocupando una posición mucho más íntima en la punta de la raíz con respecto a raíces crecidas en la ausencia de plomo (Obroucheva et al., 1998). 3.6.3. Efectos ultraestructurales Estudios sobre el crecimiento radicular, división celular, morfología cromosómica y de los nucleolos de las células de las puntas de raíz de Allium cepa L. a diferentes concentraciones de Pb(NO3)2, realizados por Yang et al. (2000), pusieron de manifiesto una inhibición en el crecimiento

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radicular. Este efecto fue posteriormente confirmado por la presencia de irregularidades mitóticas y adhesión de los cromosomas. Durante la interfase, las células de las raíces tratadas con Pb presentaban micronucleosis, irregularidad en la forma del núcleo y descomposición del material nuclear (Wierzbicka, 1994). Paralelamente, se detectaron perturbaciones en el alineamiento de los microtúbulos a una concentración dependiente de una concentración inicial de 10 µM, lo que contribuye a la inhibición del crecimiento de la raíz (Yang et al., 2000). El plomo destruye los microtúbulos del huso mitótico causando c.mitosis (colchicina-mitosis) caracterizada por bloqueo celular en prometafase. En otras palabras, el plomo inhibe la formación del huso cromático. Este bloqueo, sin embargo, no es permanente (Wierzbicka, 1994). En conclusión, los microtúbulos de diferentes regiones del meristemo de la raíz y de diferentes estadios del ciclo celular muestran susceptibilidad diferencial al plomo. Poschenrieder et al (2004) hallaron que el Al induce alteraciones de la organización y orientación de los microtúbulos antes de que se produzca la inhibición de la elongación radicular. A partir de las anteriores experiencias se ha propuesto como hipótesis que la inhibición del crecimiento radicular bajo toxicidad con plomo puede ser un resultado de la inhibición de la división celular de las puntas de la raíz (Eun et al., 2000). 3.7. Efectos bioquímicos Los primeros estudios sobre la acción del plomo a nivel bioquímico se centraron en descripciones sobre la considerable reducción de la síntesis de DNA, RNA y proteínas en el embrión axial, y en los endospermos de plantas de arroz en germinación sometidos a concentraciones crecientes de plomo (Maitra y Mukherji, 1977). Asimismo se ha aceptado que la toxicidad por plomo además de disminuir los niveles del contenido de proteínas en tejidos también causa alteraciones significativas en la composición lipídica. En el caso de P. vulgaris y Z. mays se observaron cambios sustanciales a nivel de glucolípidos, especialmente monogalactosil y diacilgliceroles, los cuales fueron asociados con alteraciones en la permeabilidad de la membrana en los cloroplastos Específicamente, al incubar cloroplastos con concentraciones constantes de sales de plomo, los niveles de ácidos grasos insaturados ascendieron notablemente con respecto a los ácidos grasos saturados (18:3) (Stefanov et al., 1995). Los datos sobre la disminución en el peso seco presentan variabilidad. Así, (Kosobrukhov, 2004) observaron una disminución en Plantago major bajo tratamiento con plomo pero en ciertos casos, tales como en plantas de maíz, se ha observado un aparente incremento en el peso seco de los órganos de las plantas que fueron correspondidos con un incremento de la síntesis de polisacáridos de la pared celular al ser expuestos a tratamientos con plomo (Wierzbicka, 1998). -4

Por otra parte, Malkowski et al., (2002) trabajando con maíz con concentraciones de plomo 10 - 10 M, observaron que el crecimiento del mesocótilo y del coleóptilo fueron afectados de forma similar; sin embargo, la concentración de plomo en el mesocótilo fue tres veces mayor que en el coleóptilo, proponiendo que la disminución del crecimiento de la parte aérea en maíz no es una -3

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consecuencia de la liberación de potasio o de la acumulación de plomo en la raíz, sino que es debido a una .señal. no conocida inducida en las raíces, como respuesta a la exposición por plomo la cual es transmitida a la parte aérea.

3.7.1. Efectos sobre las actividades enzimáticas Las actividades de un amplio rango de enzimas de diferentes vías metabólicas son afectadas por el plomo. La inhibición del 50 % de la mayoría de enzimas se produce a una concentración de -5 -4 entre 10 y 2x10 M de plomo. A esta concentración se hace referencia en términos de la constante de inactivación (Ki). La inhibición sobre la actividad enzimática es causada por la interacción de Pb con los grupos sulfidrilo (.SH) que están presentes en el centro activo de los enzimas, los cuales son esenciales para la estabilización de su estructura terciaria. Además, la reacción con los grupos (.SH) puede bloquear los grupos .COOH con iones plomo, lo que parecer también juega un papel importante en la inhibición de la actividad enzimática bajo el tratamiento con este metal (Levina, 1972). El plomo forma un mercáptido con el grupo (.SH) de la cisteína y también forma complejos con grupos fosfato. La inhibición de metaloenzimas bajo tratamiento con plomo parece ser debida a un desplazamiento del metal esencial por plomo. La inhibición de la actividad enzimática debida al plomo no parece ser específica para este metal: tales inhibiciones son también evidentes con otros cationes que tienencomparables afinidades por grupos proteicos funcionales. Sin embargo, las actividades de algunos enzimas se han visto incrementadas al ser expuestas a plomo. Tales resultados aparentemente conciernen a cambios en la síntesis enzimática, inmovilización de los inhibidores de los enzimas, o como un resultado efector de moléculas, las cuales son sintetizadas bajo fitotoxicidad con plomo. Las actividades enzimáticas afectadas por la toxicidad por Pb han sido ampliamente reportadas por varios investigadores basándose en los principales procesos metabólicos que suceden en las especies vegetales. Los efectos del plomo se presentan con un signo (+/-) indicando un incremento o un decrecimiento de la actividad enzimática por acción del plomo (Tabla 11). 3.7.2. Efectos sobre la fotosíntesis El proceso de la fotosíntesis de las plantas es alterado en los cloroplastos por la toxicidad por plomo causando innumerables efectos adversos. Sin embargo, se pueden resumir a continuación para facilitar su comprensión:  Disminución de la tasa fotosintética  Distorsión de la ultraestructura del cloroplasto  Restricción de síntesis de clorofila, plastoquinona y carotenoides  Obstrucción de transporte de electrones  Inhibición de actividades enzimáticas del ciclo de Calvin.  Deficiencia de CO2 como un resultado de cierre estomático. Los cloroplastos son los principales órganos indicadores de los daños ocasionadospor el plomo sobre el proceso metabólico de la fotosíntesis. Plantas de Ceratophyllum demersum crecidas en

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medio acuático con Pb (NO3)2 mostraron distintos cambios en la ultraestructura de los cloroplastos (Rebechini y Hanzely, 1974). Las células de las hojas de tales plantas exhibieron reducción de apilamientos de granas junto con una reducción en la cantidad de estroma en relación con la del sistema lamelar. También exhibieron ausencia de granos de almidón. El tratamiento con plomo también cambió la composición lipídica de las membranas tilacoidales en hojas de Zea mays L. (Stefanov et al., 199 Tabla 11. Inhibición (-) o incremento (+) de la actividad enzimática en plantas tratadas con Plomo

PROCESOS METALICOS

ENZIMAS

Síntesis de Clorofila Fijación de CO2

Alfa-amino levulinato dehidrogenasa Ribulosa-1,5 bis fosfato

Pennisetum typhoideum Avena sativa

Fosfoenol piruvato Carboxilasa Gliceraldheido 3fosfato dehidrogenasa Ribulosa 5 fosfato kinasa Glucosa 6-fosfato dehidrogenasa Nitrato reductasa Glutamina sintetasa Deoxyribonucleasa

Spinach oleracea

Ciclo de Calvin

Vía Pentosa fosfato Asimilación de Nitrógeno Enzimas Nucleoliticas

ESPECIES VEGETALES

EFECTO DEL PLOMO (-)

Prassad & Prassad (1987)

(-)

Moustakas et al (1994)

Zea mays

(-)

Vojtechova & Leblova (1991)

Spinach oleracea

(-)

Vallee & Ulmer (1972)

(-) (-)

Vallee & Ulmer (1972) Vallee & Ulmer (1972)

(-) (-) (+)

Burzynski (1984) Lee et al (1976) Jana & Choudhary (1982)

(+)

Jana & Choudhary (1982)

(+)

Jana & Choudhari (1982)

(+)

Jana & Choudhari (1982)

(+) (-)

Lee et al (1976) Mukherji & Maitra (1977)

Spinach oleracea

REFERENCIAS

Metabolismo glucosa

de

Acido fosfatasa a-amilasa

Cucumis sativus Glicine max Hydrilla verticillata Hydrilla verticillata Hydrilla verticillata Hydrilla verticillata Glycine max Oryza sativa

Generación energía

de

ATP sintetasa

Zea mays

(-)

Tu Shu & Brouillette (1987)

ATPasa

Zea mays

(-)

Tu Shu & Brouillette (1987)

Catalasa

Oriza sativa

(-)

Verna & Dubey (2003)

Guaiacol peroxidasa Ascorbato oxidasa Ascorbato peroxidasa Glutatión reductasa Superoxido dismutasa

Glicine max Pkaseolus aureus Oryza sativa Oryza sativa Oryza sativa

(+) (+) (+) (+)

Lee et al ( 1976) Rashid & Mukherjee (1991) Verna & Dubey (2003) Verna & Dubey (2003) Verna & Dubey (2003)

Ribonucleasa Hidrólisis de Proteínas Fosfohidrolasa

Metabolismo antioxidativo

Proteasa Alcalina fosfatasa

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Fuente: Sharma y Dubey ( 2005)

El plomo perjudica la absorción de elementos esenciales tales como hierro y magnesio en plantas de pepino y, como consecuencia, inhibe la síntesis de clorofila (Burzynski, 1987). Estos daños de los aparatos fotosintéticos son debido a la afinidad del plomo por ligandos de proteínas N- y S(Ahmed y Tajmir-Riahi, 1993). Asimismo se ha observado degradación de la clorofila debido al incremento de la actividad clorofilasa (Drazkiewicz, 1994). También se ha hallado que la clorofila b es más afectada que la clorofila a por tratamiento con plomo en abetos de Noruega (Vodnik et al., 1999). Acerca del efecto sobre la obstrucción del transporte de electrones (Rashid et al., 1994) se sabe que el plomo afecta el sitio donador y el sitio receptor del fotosistema II (PS II), el complejo citocromo b/f y el fotosistema I (PS I). Esto ha sido en su mayor parte aceptado ya que la inhibición del transporte de electrones del PS I es más sensible que la del PS II en cloroplastos de espinaca (Mohanty et al., 1989; Sersen et al., 1998). El plomo también causa una fuerte disociación del polipéptido extrínseco del complejo disociador de oxigeno del PS II originando desplazamiento de Ca, Cl- y Mn desde este sitio donador del PSII (Rashid et al., 1991). Esto hace proponer que los cambios conformacionales de las LHC II (Light Harvesting Complexes) subunidades fundamentales del PSII, conllevan al no ensamblaje de los componentes redox, de los cofactores y de las proteínas extrínsecas, conduciendo a la degradación de las subunidades PSII (Ahmed y Tajmir-Riahi, 1993). En suma, el plomo in vitro altera los complejos proteína-pigmento responsables de la absorción de la radiación incidente. Retomando esta última anotación Sarvari et al. (2002) probaron concentraciones de plomo en el desarrollo del tilacoide de pepino y álamo, y observaron incremento del contenido de clorofila en las LHC II a bajas concentraciones de plomo, mientras que a una concentración de 50 mM de plomo el nivel de clorofila decreció en las plantas. Este hecho ha sido comprobado nuevamente en segmentos de hojas de Pisum sativum tratados a 50 mM Pb por Sengar y Pandey, 1996. Consecuentemente, el nivel de concentración de plomo dentro de la hoja puede incidir directamente en la síntesis de clorofila. Para limitar la descripción sobre los múltiples efectos del plomo en el proceso fotosintético existen otras hipótesis importantes para cerrar el tema, como la de Bazzaz et al., (1975) quien considera que el decrecimiento de la fotosíntesis en maíz es el resultado del cierre estomático. Hipótesis respaldada por Kosobrukhov et al., (2004) quienes consideran que la actividad fotosintética es gobernada por factores como el tamaño de la célula estomática, el número de estomas, la conductancia estomática y el área foliar. 3.7.3. Efectos sobre la respiración y contenido en ATP Con el objeto de determinar los efectos sobre la respiración se han realizado experimentos in vitro con preparaciones de mitocondrias de células vegetales de Nicotiana tobacum L. var. Xanthí

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encontrándose que la tasa de respiración disminuye cuando se incrementan las concentraciones de plomo aplicadas (Reese y Roberts, 1985). Además de las mitocondrias se han aislado cloroplastos de diferentes especies de plantas para mostrar que el plomo afecta el flujo de electrones vía el sistema de transporte de electrones (Miles et al., 1972; Bazzaz y Govindjee, 1974). De este modo, parece ser que el Pb a elevadas concentraciones ocasiona desacoplamiento de la fosforilación oxidativa (Miller et al., 1973; Koepfe, 1977; Ernst, 1980), mayor oxidación de sustratos (glicina, succinato, malato), incremento de la demanda de ATP como de ATP / ADP e incremento de la actividad de NAD+malatodeshidrogenasa a altas concentraciones (Romanowska et al., 2002), y por el contrario, se estimula la respiración a bajas concentraciones (Lee et al., 1976), lo cual ha sido demostrado en hojas cortadas (Lamoreaux y Chaney, 1978), en protoplastos aislados (Parys et al., 1998) y en mitocondrias (Koeppe y Miller, 1970). En relación con los enzimas fotorrespiratorios el mecanismo sobre la estimulación de la respiración por plomo aún no está claro. Se plantean varias incongruencias; una de éstas es que se inhibe la actividad cloroplástica de la ATP sintetasa /ATPasa (Tu Shu y Brouillette, 1987) y no se afectan otros enzimas como NADH-hidroxipiruvato reductasa, glicolato oxidasa y el enzima NAD-málico (Romanowska et al., 2002) bajo exposición a plomo. Aunque la sensibilidad de la fotofosforilación a los iones de los metales pesados está bien documentada, no hay un acuerdo general sobre el sitio de acción ni sobre el mecanismo señalado. Solamente algunos experimentos pueden sugerir diferentes mecanismos existentes para la acción de los iones de los metales pesados sobre la actividad ATPasa cloroplástica cuando estos iones metálicos son aplicados bajo condiciones in vivo o in vitro. 3.7.4. Efectos sobre la absorción de nutrientes Muchas de las acciones atribuidas al plomo parecen ser indirectas como un resultado del desequilibrio mineral dentro de los tejidos. Así, se sabe que altas concentraciones de plomo en el suelo causan desequilibrio en las proporciones de nutrientes minerales dentro de los tejidos de las plantas en crecimiento. Cambios significativos se han observado tanto en los contenidos de nutrientes como en las proporciones internas de nutrientes en plantas bajo la toxicidad con plomo (Kabata-Pendias y + +2 +2, Pendias, 1992). En la mayoría de los casos, el plomo bloquea la entrada de cationes (K , Ca , Mg +2 +2 +2 +3 3Mn , Zn , Cu , Fe ) y aniones (NO ) en el sistema radicular. Hasta el momento, los mecanismos sugeridos para regular la entrada de micro- y macronutrientes bajo toxicidad por plomo consisten en el mecanismo físico y químico. El primer mecanismo, se relaciona con el tamaño de los radios iónicos del metal, que pueden actuar bloqueando el acceso de muchos iones en los sitios de absorción de las raíces (Godbold y Kettner, 1991). Aunque tanto el contenido de plomo en la punta como en la base de la raíz pueden parecer similares, el plomo altera los niveles de elementos minerales en las mismas. En las puntas de +2 +3 +2 la raíz los niveles de Ca , Fe y Zn decrecen después de la exposición a Pb. En el abeto noruego, después de aplicar plomo se presenta la inhibición del crecimiento de la raíz que puede ser debido a +2 +2 una disminución de los niveles de Ca , puesto que en las puntas de la raíz un 40 % del Ca absorbido es usado para su crecimiento, de forma que pueden decrecer la división o la elongación +2 celular (Haussling et al., 1988). Concomitantemente, en agujas de abeto noruego los niveles de Ca y

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+2

Mn decrecen con el tratamiento con plomo, lo cual no puede ser un resultado del decrecimiento en el número de las puntas de raíz y de los sitios destinados para el flujo de solutos apoplástico a través de la endodermis. Al valorar el nivel de manganeso bajo condiciones de tratamiento con plomo, se observó una disminución del mismo en agujas de Picea abies (Sieghardt, 1988). En plantas de Cucumis sativa el +2 +2 +3 3 +2 plomo disminuye la absorción de K+, Ca , Mg , Fe y NO y, en Zea mays la absorción de Ca , +2 + Mg , K y P (Walker et al., 1977). El plomo influye en la distribución total de los elementos nutritivos dentro de los diferentes órganos de la planta. Ya que, la distribución total de Mn y S cambió a favor de la raíz por encima de la parte aérea bajo condiciones de toxicidad con plomo, lo cualrepresenta retención de estos iones en la raíz. Con respecto al contenido de fósforo, en Pisum sativum siempre se han hallado correlaciones negativas con el contenido de plomo en el suelo, y también se ha detectado que la actividad fitasa es afectada por el contenido de plomo (Paivoke, 2002). En relación con el nitrógeno sucede que el contenido de nitrógeno en la raíz es significativamente reducido bajo toxicidad por plomo. La absorción de nitrato declina en plantas de pepino expuestas a plomo con una concomitante bajada de la actividad nitrato reductasa NR y afecta el metabolismo del nitrógeno. El descenso de la absorción de nitrato debido al plomo puede ser como resultado del estrés hídrico creado por el plomo (Burzynski y Gabrowski, 1984). En ciertas especies como Pisum sativum, incrementa el contenido de nitrógeno de raíces bajo tratamiento con plomo a una concentración de 2 mmol kg -1 de suelo, lo cual probablemente ocurre debido a efectos inhibitorios de plomo sobre la actividad nitratoreductasa (Paivoke, 2002). El segundo mecanismo sugerido para explicar la disminución de la absorción de micro y macronutrientes bajo toxicidad con plomo se relaciona con el desorden que induce el plomo en el metabolismo celular causando cambios en las actividades enzimáticas de la membrana y en la estructura de la membrana. Aparentemente, un ejemplo puede ser el eflujo de K+ desde las raíces, el cual es debido a la extrema sensibilidad de la ATPasa y de los grupos .SH de las proteínas de la membrana celular hacia el plomo. 3.7.5 Efectos sobre las relaciones hídricas. Una disminución en la tasa de transpiración y en el contenido hídrico de los tejidos ocurre en plantas crecidas bajo exposición con plomo. Varios mecanismos se han sugerido para comprender cómo el plomo induce estos efectos. Inicialmente, el plomo retarda el crecimiento dando como resultado una reducida área foliar, y por consiguiente una desventaja para los órganos con mayor transpiración en las plantas, las hojas . Así, se ha observado que las células guarda generalmente presentan un tamaño menor al ser tratadas con plomo. El plomo baja el nivel de componentes que están asociados con el mantenimiento de la turgencia celular y de la plasticidad de la pared celular. De esta forma, baja elpotencial hídrico dentro de la célula. Los iones metálicos, incluyendo el plomo, incrementan el contenido en ABA e inducen el cierre estomático. Desordenes en la respiración y en la fosforilación oxidativa observados bajo toxicidad con plomo también pueden causar desajustes en el régimen hídrico. Así, experimentos con fragmentos de epidermis flotando en solución con plomo han mostrado que el

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plomo induce el cierre de estomas (Bazzaz et al., 1974). Experimentos con hojas separadas de maíz y soja han indicado que los metales incrementan la resistencia estomática no únicamente cuando se aplican directamente a células guarda o células epidérmicas sino también cuando éstos alcanzan los conductos del xilema (Bazzaz et al., 1974). Una hipótesis unificada con respecto al cierre estomático inducido por plomo indica que tal efecto es + debido a la inhibición de un sistema de energía o debido a alteraciones de flujos de K a través de las membranas (Bazzaz et al., 1974). 8. Tolerancia al plomo 8.1. Metabolismo oxidativo Uno de los efectos del plomo consiste en la inducción del estrés oxidativo en partes de plantas en crecimiento debido a un aumento de la producción de Especies Reactivas del Oxígeno (ROS) provocando un desequilibrio del estado redox celular. 2-

Un número de diferentes ROS: el anión superóxido (O ), oxígeno singlete (1O2), peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidrófilo (.OH) son producidos durante el metabolismo normal oxidativo en organismos aeróbicos, pero estas ROS pueden ser severas cuando se producen elevadas cantidades, puesto que aunque algunas ROS pueden funcionar como importantes señales moleculares alterando la expresión génica y modulando la actividad de proteínas específicas de defensa. Todas las ROS pueden ser extremadamente dañinas para los organismos a altas concentraciones. El plomo induce la producción de ROS dentro de las plantas y ésta depende de la intensidad del estrés, períodos repetitivos de estrés, tipo de especie y edad de la planta (Asada, 1994; Chaitnya y Naithani, 1999; Verma y Dubey, 2003). La peroxidación de lípidos, la cual es conocida como un indicador de daño oxidativo, involucra la degradación oxidativa de residuos acil grasos poliinsaturados de membrana (Girroti, 1990). Los iones de plomo inducen la peroxidación lipídica, por lotanto decrece el nivel de ácidos grasos saturados e incrementa el nivel de ácidos grasos insaturados de membrana en varias especies de plantas (Halliwell y Gutteridge, 1999). Aunque la generación de ROS es suave bajo condiciones normales, el plomo acelera este proceso (Verma y Dubey, 2003). En el estudio de caso de Oryza sativa se han expuesto a 500 y 1000 µM Pb (NO3)2 en un medio con arena. Durante un período de 5 a 20 días se ha incrementado el nivel de lípidoperoxidasas del 21 al 177 %, indicando que el plomo induce estrés oxidativo en estas plantas (Verma y Dubey, 2003). 3.8.2. Mecanismos de protección vegetal Existe un amplio rango de mecanismos de protección en las células vegetales que sirven para eliminar las especies reactivas de oxígeno (ROS) antes de que puedan dañar partes sensibles de la maquinaria celular. Es conveniente dividir estos mecanismos en dos grupos, estos son, antioxidantes-no-enzimáticos tales como tocoferoles, carotenoides, componentes del ácido ascórbico (AsA) y glutatión (GSH), incluyendo sus formas oxidadas, -el ácido dehidroascórbico (DHA) y GSSG y, antioxidantes enzimáticos tales como catalasa, peroxidasas y superóxido dismutasas (SOD)- además de los enzimas del ciclo ascorbato.glutatión, tales como: ascorbato peroxidasa (APX),

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monodehidroascorbato reductasa (MDHAR), dehidroascorbato reductasa (DHAR) y glutatión reductasa (GR) dependiente de NADPH (Verma y Dubey, 2003) . Este mecanismo funciona con la base química del Ciclo Haber Weiss y el mecanismo Fenton, los 2cuales generan H2O2 y radicales hidróxilo (-OH) desde el anion superóxido O . El plomo no es un metal oxido-reductor como el hierro. Por eso el estrés oxidativo parece ser un efecto indirecto de la toxicidad del plomo llevando a producción de ROS, aumentando el estado pro-oxidante de la célula por reducción de las moléculas de glutatión reducido (GSH), activando sistemas calcio.dependientes y afectando los procesos mediados por el hierro (Pinto et al., 2003). Entre los enzimas antioxidantes, se encuentra la catalasa, que descompone H2O2 produciendo agua y oxígeno. Se ha observado disminución en la actividad catalasa sobretodo en dos isoenzimas de la catalasa en la parte aérea de plantas tratadas con plomo (Verma y Dubey, 2003). Estas isoformas están controladas por diferentes genes (Frugoli et al., 1996). Tal disminución parece ser debida a una menor síntesis de enzimao a un cambio en el ensamblaje de subunidades enzimáticas (Hertwig, 1992). La toxicidad por plomo induce la actividad peroxidasa en plantas de soja, arroz, etc. (Lee et al., 1976; Verma y Dubey, 2003). Este enzima ha sido ampliamente aceptado como un enzima de estrés en plantas (Gaspar, 1982; Subhashini y Reddy, 1990), y se cree que el incremento de su actividad se debe a la liberación de peroxidasa localizada en la pared celular (Gaspar, 1982). La actividad superóxido dismutasa (SOD) se ha detectado en plantas de Lupenus lutius y O. sativa (Przymusinski et al., 1995; Verma y Dubey, 2003). El incremento de la SOD en respuesta a la presencia de plomo es debido a la síntesis de novo de proteína enzimática (Lozano et al,. 1996). El estrés por plomo en plantas de arroz también se manifiesta como un incremento de la actividad de la APX y de la GR (Verma y Dubey, 2003). Aunque la APX es considerada el enzima clave del mecanismo de defensa antioxidativo (Sharma y Dubey, 2004) porque condiciona la concentración 2celular de O y H2O2, parece ser que dos enzimas (SOD y GR) combaten los daños ocasionados por el estrés oxidativo inducido por el plomo en plantas de arroz (Verma y Dubey, 2003). Bajo la toxicidad con plomo también se incrementa la actividad GR cuya función de defensa es reciclar glutatión oxidado para reducirlo a glutatión (GSH/GSSG) y a glutatión total (Foyer et al., 1997). El incremento en la actividad GR bajo estrés ha sido atribuido a síntesis de novo del enzima (Baisak et al., 1994). 3.8.3. Mecanismos de tolerancia al plomo Baker (1981) ha sugerido dos estrategias básicas relacionadas con la absorción del metal y la tolerancia de las células vegetales. Las respuestas celulares al estrés tóxico son tolerancia por exclusión y tolerancia por acumulación. La estrategia por exclusión consiste en el mantenimiento de niveles bajos y constantes del metal en el suelo, y se mantiene hasta que las concentraciones en el mismo alcanzan niveles críticos a partir de los cuales no pueden ser mantenidos y se produce toxicidad. Por otra parte, la tolerancia por acumulación consiste en concentrar el metal activamente dentro de los tejidos vegetales,

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implicando procesos fisiológicos altamente especializados. En este sentido, Berry W.L. (1986) sugirió tres estrategias básicas de respuesta: evitación, detoxificación y tolerancia bioquímica, cada una de lascuales afecta las concentraciones del metal en los tejidos en diferentes formas. La tolerancia por exclusión esta relacionada con la capacidad de las plantas para transportar oxígeno y perder radicales de oxígeno por las raíces resultando en una gran habilidad para modificar la rizosfera e inmovilizar metales en la mísma. Estas observaciones se han deducido colectivamente en Typha latifolia por Ye et al., 1997, quienes sostienen que Typha latifolia es una planta que puede colonizar tanto áreas contaminadas con plomo como no contaminadas con plomo, y que, por lo tanto, sirve como indicador biológico de investigación. Así, se ha encontrado que sus hojas pueden mantener bajas las concentraciones de plomo bajo estrés con plomo. Un aspecto importante de la tolerancia por exclusión se ha encontrado en las raíces de arroz, donde se sintetiza oxalato por oxidación de glicolato para obtener glioxilato y luego oxidación de glioxilato para obtener oxalato. Así, pues, las variedades tolerantes de arroz autorregulan la síntesis y secreción de oxalato, un compuesto que precipita el plomo y reduce su absorción por las raíces (Yang et al., 2000). También se ha observado que los grupos .COO del ácido urónico del mucílago se unen al plomo restringiendo su entrada a la raíz (Morel et al., 1986). Por otro lado, la fuerte unión del plomo a los grupos carboxilo de los carbohidratos de la pared celular disminuye el transporte por vía apoplástica (Rudakova et al., 1988). Este mecanismo de tolerancia se presenta en Anthoxanthum odoratum, ya que la observación de las puntas de raíz mediante microscopía electrónica reveló la presencia de plomo tanto en la pared celular como en el citoplasma. Así, se sugiere que el mecanismo de tolerancia de esta planta está asociado con la capacidad de restringir la localización del plomo en la pared celular (Qureshi et al., 1986). Dentro de la célula, la mayor parte de plomo es secuestrado en la vacuola en forma de complejos. Esto puede representar otro mecanismo de detoxificación de plomo en plantas. Por ejemplo, la pinocitocis es observada en células foliares de muchas plantas tratadas con sales de plomo en solución debido a estas vesículas pinocíticas, las partículas de plomo pueden ser descargadas dentro de la vacuola (Wierzbica y Antosiewicz, 1993). La acumulación total de un exceso de aminoácidos en respuesta al plomo puede ser conocida como una importante respuesta adaptativa de las plantas para evitar la toxicidad al plomo. Varios trabajos han enfatizado la importancia de la síntesis decompuestos quelantes del metal tales como aminoácidos afines a la prolina para evitar la toxicidad de metales pesados (Alia y Saradhi, 1991). En estudios de toxicidad por Cu en Silene armeria se ha considerado que prolina y glicina pueden estar implicadas en la detoxificación del Cu en raíces (Barceló et al. 2005). Plantas expuestas a plomo y otros metales pesados altamente contaminantes como Cd, Zn, Cu, Hg sintetizan cisteína y polipéptidos de bajo peso molecular llamados fitoquelatinas (Cobbet, 2000). Las fitoquelatinas (PCs) forman una familia de estructuras repetitivas del dipéptido γ-Glu-Cis seguidos por una estructura terminal Gli; (γ-Glu-Cis) n-Gli, donde n alcanza un valor máximo de 11, pero generalmente se sitúa en el rango de 2 a 5 (Zenzk, 1996). En muchas especies se ha demostrado que los metales Cd y Pb, se unen a las fitoquelatinas después de inducir su producción (Grill et al., 1987). Además, la capacidad de unión de las fitoquelatinas a los diferentes metales difiere, ya que

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compuestos de Cd se unen con más fuerza a las PCs que los del Pb, debido a que éste último presenta un radio iónico de conformación octahedral y tiene un número de coordinación alto (Pb, 6 . 8). La inducción de las PCs se ha demostrado en cultivos de Rauwolfia serpentina a las que se añadió 1 mM Pb a su medio. Tal síntesis fue acompañada por una disminución del glutatión celular total (Grill et al., 1987). Estos resultados reforzaron la creencia con respecto a que la síntesis de fitoquelatinas parte del glutatión y que tal síntesis es debida a la transpeptidación de dipéptidos de γ-glutamil cisteinil desde glutatión por la acción de una enzima constitutiva presente, la PC sintetasa (Chen et al., 1997). Las uniones entre fitoquelatinas y los iones de plomo llevan al secuestro de iones plomo en plantas y de esta forma sirve como un importante componente que favorece el mecanismo de detoxificación en vegetales. Además de las estrategías vegetales de tolerancia por exclusión y por acumulación, se ha de tener en cuenta otros sistemas de defensa no-específicos que se manifiestan cuando las plantas sufren estrés por plomo. Estos sistemas de defensa no-específicos incluyen síntesis de substancias osmóticamente activas (prolina) y poliaminas (putrescina), antioxidantes, aminoácidos, cambios en la composición química de la pared celular (deposición de callosa y suberina), y cambios en el balance hormonal, principalmente sobre el etileno y ABA (Seregin e Ivanov, 2001). Hay diferentes opiniones sobre los mecanismos de defensa no específicos medianteel cual las sustancias osmóticamente activas como la prolina alivian los efectos de la toxicidad del metal dentro de la célula. Paleg et al., (1984) han demostrado que la prolina libre actúa como osmoprotectora; Sharma y Dubey (2004), como proteína estabilizadora (Farago y Mullen, 1979), como quelante del metal; (Mehta y Gaur, 1999), como inhibidor de la peroxidación lipídica (Alia et al,. 2001) o como un radical libre reciclador o como un productor de oxígeno singlete. 3.9. Remediación de suelos contaminados con plomo La remediación de suelos contaminados con plomo representa un significativo desafió para muchas industrias e instituciones gubernamentales. Hasta la fecha las áreas contaminados con plomo han sido remediadas con una amplia gama de técnicas basadas en la ingeniería (Salt et al., 1995).Los suelos excesivamente contaminados inicialmente son excavados, estabilizados con cemento y luego localizados en terrenos seguros. Este proceso es costoso y requiere lugares de restauración adicionales a los terrenos de partida. Desde hace unos años el concepto de usar plantas para remediar la contaminación de los suelos ocasionada por los metales pesados, denominado fitorremediación, ha recibido gran atención (Raskin et al., 1994; Vassil et al., 1998; Jarvis y Leung, 2002; Barceló, 2003; Barceló y Poschenrieder, 2003). La fitorremediación puede involucrar dos procesos: fitoestabilización y fitoextracción. La fitoestabilización reduce a niveles constantes la contaminación del suelo o la biodisponibilidad del metal pesado, mientras que, la fitoextracción usa plantas para extraer el contaminante del suelo. El concepto de usar plantas para acumular metal para su posterior procesado es técnica y económicamente atractivo.

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Por razones prácticas, la concentración de plomo en la parte aérea es el parámetro fisiológico más importante para evaluar el potencial de fitoextracción de plomo de las plantas (Huang y Cunningham, 1996). Esto es debido a que la acumulación de plomo en raíces es significativamente superior que en la parte aérea, posiblemente debido a la baja translocación de plomo desde las raíces hacia la parte aérea (Cunningham et al., 1995; Verma y Dubey, 2003). Sin embargo en Thlaspi rotundifolium, se ha encontrado una alta acumulación de plomo en la parte aérea en relación con la raíz, ya que acumula entre 130 y 8200 mg Pb.kg-1 de peso seco de la parte aérea (Reeves y Brooks, 1983). Por lo tanto algunas especies vegetales tienen la capacidad de translocar plomo con mayor eficiencia que otras. A razón de que su crecimiento es lento y su biomasa es pequeña, no obstante, estas especies no son candidatos vegetales ideales para hacer fitoextracción de plomo de suelos contaminados. En algunos cultivos de Brassica juncea se ha determinado una acumulación tan alta como el 1.5 % de Pb en la parte aérea cuando crece en solución nutritiva con 760 µM Pb (Kumar et al,. 1995). Sin embargo, un año después se observó que la concentración de plomo en la parte aérea de maíz era más alta que la acumulada por el mejor cultivo acumulador de plomo cuando las plantas fueron crecidas sobre un suelo contaminado con plomo (Huang y Cunningham, 1996). Los resultados de experimentos de quelación indicaron que la concentración de plomo en la parte aérea puede ser incrementada dramáticamente cuando la concentración de plomo en el suelo es incrementada por la adición de un quelante sintético al suelo contaminado. Es decir, el uso de quelantes en el suelo puede favorecer la toxicidad del plomo. El quelante sintético EDTA forma un complejo soluble con muchos metales, incluyendo plomo (Kroschwitz, 1995) y puede solubilizar plomo desde partículas del suelo (Vassil et al., 1998). La aplicación de EDTA a suelos contaminados ha mostrado que la absorción por plantas causa que el plomo se acumule por encima del 1% (p/p) de la biomasa seca de la parte aérea (Huang y Cunningham, 1996; Huang et al., 1997). Las grandes partículas de Pb no pueden cruzar fácilmente la banda de Caspari debido a su tamaño y a sus cargas características, pero una vez forman un complejo con tales quelantes, como EDTA, su solubilidad incrementa y el tamaño de la partícula decrece haciendo creer que son parcialmente .invisibles. hacia aquellos procesos que normalmente deberían prevenir su movimiento sin restricción tal como precipitación con fosfatos y carbonatos o uniones a la pared celular mediante el mecanismo de intercambio catiónico (Jarvis y Leung, 2002). El mecanismo por el cual los solutos se mueven simplásticamente se ha considerado como un tipo de transporte que utiliza una molécula de alta selectividad, que se opone a la difusión facilitada (Raven et al., 1999). Aunque es claro que este mecanismo no involucra el transporte de plomo, y que el movimiento de partículas cargadas de plomo a través de esta vía podrían ser impedidas por su extensión, parecer ser que el complejo plomo-quelante facilita su transporte vía simplasto pudiendo pasar por esta víasucesivamente. Como punto final es importante controlar el uso y manejo de quelantes añadidos a los suelos, ya que el plomo acomplejado se moviliza dentro de las partículas del agua y se facilita su migración a otros medios en el ambiente. (Huang y Cunningham, 1996). Otra tecnología limpia prometedora es la rizofiltración para eliminar contaminantes tales como metales pesados de aguas contaminadas utilizando raíces de plantas (Dushenkov et al., 1995). Basándose en este planteamiento, Tung y Temple (1996) determinaron la deposición de plomo en las puntas de las raíces de maíz mediante estudios de microscopía electrónica e histoquímica

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realizados en plantas incubadas en un medio con 0.66 mM Pb durante 19 días. Estos autores observaron una fuerte deposición tanto en la superficie como en los tejidos internos dentro de los 2 primeros milímetros de la raíz principal y de las raíces secundarias. Malkowski et al., (2002) también han encontrado mayor acumulación de plomo en las puntas de las raíces de Zea mays L., en las puntas de las raíces se halló una concentración de Pb de 138,430 mg Kg-1 en comparación con la acumulación en la parte basal de la raíz de 26,833 mg Pb.Kg-1. A partir de las anteriores investigaciones, se deduce que de todo el sistema radicular, aproximadamente el 50 % del plomo es acumulado en los primeros 8 mm de la parte apical de la raíz, y a su vez, que los sistemas radiculares con mayor ramificación pueden absorber más cantidad de plomo u otros metales pesados, a diferencia de plantas que tienen raíces largas y sistemas radiculares poco ramificados. Actualmente se está avanzando en el conocimiento y desarrollo de la investigación en tecnologías como la fitoremediación y rizofiltración, ya que parecen ser tecnologías de futuro con un gran potencial para limpiar los suelos contaminados con plomo y otros metales pesados.

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IV. Otros Metales

4.1 Cromo. El Cr puede presentarse en varios estados de valencia, los más comunes e importantes son: Cr metálico (valencia 0), Cr trivalente (Cr III) y Cr hexavalente (Cr VI). El Cr trivalente comúnmente está en la naturaleza y es un nutriente esencial para el ser humano ya que estimula la acción de la insulina en los tejidos. No se ha informado que el Cr como metal puro presente efectos tóxicos al ambiente o al ser humano. La toxicidad aguda y crónica por Cr es causada principalmente por los compuestos de Cr hexavalente (Cunat, 2002), siendo ésta la forma más disponible, pero inestable en el suelo, para la absorción por las plantas. No existe evidencia que el Cr sea un elemento esencial para el metabolismo de las plantas.

La mayoría de los suelos contienen cantidades significativas de Cr, pero su disponibilidad para las plantas es limitada. Los suelos ricos en serpentina y los desechos de curtiembre tienen una concentración alta de Cr (III), sin embargo, el Cr (VI) es la forma más biodisponible (pero inestable) para las plantas en el suelo. Los cambios de pH y los exudados radicales pueden influenciar el estado de oxidación del Cr y con esto aumentar o disminuir la cantidad de Cr disponible para las plantas (James, 2002). El Cr (VI) aumenta su solubilidad en rangos de pH bajo 5,5 y sobre 8. James y Bartlett (1984), observaron que la reducción del Cr(VI), seguida de la complejación del recién formado Cr (III), en la zona radical, puede aumentar la absorción y traslocación de Cr en raíces y tallos de poroto (Phaseolus sp.) y maíz (Zea mays L.). Los ácidos carboxílicos también incrementan la absorción de Cr en tomate y maíz. La Tabla12 muestra contenidos de cromo en plantas de consumo directo y en forraje. En las plantas generalmente se observa un contenido de cromo mayor en las raíces que en las hojas y tallos, mientras que la concentración más baja está en los granos (James, 2002). 4.2 Manganeso El Mn es un elemento muy común en la corteza terrestre, generalmente se presenta en el suelo como óxido e hidróxido, formando concreciones junto a otros elementos metálicos. El Mn es esencial en la nutrición de las plantas, es requerido en el fotosistema II y en la activación de algunas enzimas (Mahler, 2003). Aparentemente la absorción de Mn es mediante transporte activo de 2+

2+

manera similar a la absorción de otros cationes divalentes como Mg y Ca . Sin embargo, cuando el metal se encuentra en alta concentración en la solución del suelo puede ocurrir absorción pasiva (Kabata – Pendias, 2000). Cuando la disponibilidad de Mn es elevada en el suelo (suelos mal drenados, de pH menor a 5,5 o mayor a 8) el Mn es rápidamente traslocado dentro de la planta a otros órganos, por lo que es probable que en los tejidos de la raíz y el xilema no se encuentre ligado a moléculas orgánicas insolubles sino más bien en formas catiónicas libres, siendo traslocado

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principalmente a los tejidos meristemáticos. En la Tabla 13 muestra algunos contenidos de manganeso en vegetales de consumo.

Tabla 12. Rango y contenido medio de Cr en plantas de consumo directo y forraje (Modificado de Kabata - Pendias, 2000).

4.3 Níquel El Ni es un elemento esencial para el metabolismo de las plantas, aun cuando éstas requieren -1

menos de 0,001 mg kg de peso seco (Mahler, 2003). En la corteza terrestre existe una similitud entre la distribución de Ni, Co y Fe. El Ni presenta afinidad con Fe y S, pero también con carbonatos, fosfatos, silicatos y óxidos de Fe y Mn. En los horizontes superficiales del suelo, el Ni aparece ligado a formas orgánicas, parte de las cuales pueden encontrarse en quelatos fácilmente solubles. Sin

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embargo, la fracción más soluble a las plantas parece ser la asociada a los óxidos de Fe y Mn. Generalmente, la solubilidad del Ni se encuentra inversamente relacionada con el pH del suelo. El Ni -1

varía en el suelo en un amplio rango de 0,2 a 450 mg kg , pero los valores típicos totales en los -1

suelos del mundo varían entre 5 y 22 mg kg . El Ni es un elemento móvil en la planta, y se acumula preferentemente en hojas y semillas (Halstead et al., 1969). Aun cuando los síntomas de la exposición a altas concentraciones de Ni varían entre especies, es común que se produzca clorosis.

Tabla 13. Rango y contenido medio de Mn en vegetales de consumo (Modificado de Kabata – Pendias, 2000).

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La Tabla 14 muestra rangos y contenido medio de Ni en vegetales de consumo. Tabla 14. Rango y contenido medio de Ni en vegetales de consumo (Kabata – Pendias, 2000)

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4.4 Cobre En el suelo los iones de Cu presentan una alta afinidad para formar complejos con la materia orgánica. De esta forma, es frecuente que la materia orgánica del suelo sea el factor más importante en determinar la biodisponibilidad del Cu (del Castilho et al., 1993). El rango de pH de mayor disponibilidad de Cu en el suelo varía entre 4,5 y 7. Los mecanismos de absorción de Cu por las plantas aun no están del todo claros, ya que se ha observado una probable absorción pasiva de Cu, especialmente cuando la concentración de la solución en que crecen las plantas está en el rango tóxico del metal, aun cuando existen numerosas

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evidencias respecto a su absorción activa (Kabata – Pendias, 2000). En los tejidos de la raíz, el Cu se encuentra casi completamente en formas complejas, sin embargo, es muy probable que el metal ingrese a las células de las raíces en formas disociadas y a tasas diferentes según la especie del metal. Se ha observado una alta capacidad de los tejidos de las raíces para almacenar Cu tanto en condiciones de deficiencia como de exceso de Cu en el medio. En la savia xilemátca de las plantas el Cu se encuentra casi un 100% ligado a aminoácidos, aun bajo condiciones de suplemento excesivo de Cu (Liao et al., 2000a; Liao et al., 2000b). Esto sugiere que aun bajo condiciones de toxicidad de Cu, las plantas lo complejan, minimizando el daño potencial de altas concentraciones de iones libres de Cu (Welch, 1995). El Cu tiene una movilidad relativamente baja respecto a otros elementos en las plantas, permaneciendo en los tejidos de las raíces y hojas hasta su senescencia. De esta forma, los órganos jóvenes generalmente son los primeros en desarrollar síntomas de deficiencia de Cu. La movilidad del Cu dentro de los tejidos de las plantas depende directamente del nivel de Cu en el substrato. La acumulación de Cu en órganos reproductivos varía ampliamente con la especie. Las mayores concentraciones de Cu en órganos reproductores se han encontrado en el embrión y la cubierta seminal de granos de cereales. Pérez et al. (2004) señalan que la relación (metal en grano y en hoja)/ (metal cambiable en suelo) decrece en orden Zn>>Cu>>Pb>Cd, siendo los valores más altos para hojas, que para granos. En trigo (Triticum aestivum) excesos de Cu reducen el transporte de Zn en el floema debido a que Cu y Zn compiten por los mismos sitios de transporte (Pearson et al., 1996). La Tabla 15 (Kabata – Pendias, 2000) muestra rangos y contenido medio de Cu en vegetales de consumo. 4.5 Cinc El Zn es un elemento esencial a las plantas, participa en varios procesos metabólicos y es un componente de varias enzimas. El contenido medio de Zn en la superficie de los suelos de diferentes -1

países varía de 17 a 125 mg kg . La adsorción y desorción de Zn en el suelo se encuentra vinculada a los coloides orgánicos e inorgánicos. Existen dos mecanismos en la adsorción de Zn, uno en medio ácido relacionado con los sitios deintercambio catiónico, y otro, en medio alcalino asociado con la quimisorción que es influenciada por ligandos orgánicos. La movilización y lixiviación del Zn es mayor en suelos ligeramente ácidos al aumentar la competencia con otros cationes por los sitios de intercambio. La solubilidad y disponibilidad de Zn se correlaciona negativamente con la saturación de Ca y compuestos fosforados presentes en el suelo. El mecanismo mediante el cual el Zn es absorbido por las raíces no ha sido definido con precisión. Sin +2

embargo, el ingreso predominante es como Zn hidratado y Zn , aun cuando pueden ser absorbido como complejos y quelatos orgánicos. En la planta es frecuente que las raíces contengan mucho más Zn que la parte aérea. En condiciones de exceso, el Zn se puede acumular en la canopia. La Tabla 16 muestra rangos y contenido medio de Zn en vegetales de consumo.

Tabla 15. Rango y contenido medio de Cu en vegetales de consumo.

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4.6 Arsénico El As es un elemento no esencial para las plantas. En altas concentraciones interviene en los procesos metabólicos de las plantas, pudiendo inhibir el crecimiento y frecuentemente llegar a la muerte de la planta (Tu y Ma, 2002). Sin embargo, los niveles de As en vegetales, granos y otros cultivos alimenticios son bajos, aun cuando los cultivos se desarrollen en suelos contaminados (O’Neill, 1995). El As en el suelo se encuentra en formas móviles en el rango de pH 7 a 9. Con altas concentraciones de As la producción de biomasa y el rendimiento de varios cultivos se -1

reduce significativamente (Carbonell-Barrachina et al., 1997), con la aplicación de 50 mg As kg de suelo los rendimientos de cebada (Horedum vulgare L.) y ballica (Lolium perenne L.) disminuyeron significativamente (Jiang and Singh, 1994). Tabla 16. Rango y contenido medio de de Zn en vegetales de consumo. (Kabata – Pendias , 2000).

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En arroz (Oryza sativa L.), el As absorbido como ácido dimetil arsénico es fácilmente traslocado a los brotes, mientras que el As (III), As (V) y el ácido monometil arsénico son acumulados principalmente en las raíces (Marin et al., 1992). En plantas de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) tanto el ácido dimetil arsénico como el ácido monometil arsénico mostraron una alta traslocación hacia las partes aéreas superiores con valores cercanos al límite máximo permisible, en comparación con el arsenito y el arseniato, reduciendo significativamente el crecimiento y rendimiento de frutos (Burlo et al., 1999). Las plantas de tomate acumulan As principalmente en las raíces (85 % del total de As), el resto es acumulado en brotes (14 %) y frutos (1 %) (Burlo et al., 1999). La Tabla 17 muestra rangos y contenido medio de As en vegetales de consumo. 4.7 Selenio El papel fisiológico del Se en el metabolismo de las plantas no está claramente dilucidado. El 2-

selenio puede existir en el suelo en cuatro estados de valencia, como seleniuro (Se ), Se elemental

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0

4+

6+

(Se ), selenito (Se ) y seleniato (Se ). El Se a pH alcalino predomina como seleniato con alta movilidad, a pH neutro lo hace como selenito con movilidad media, y a pH ácido, lo hace como seleniuro con baja movilidad. Las plantas varían considerablemente en sus respuestas fisiológicas al selenio. Algunas especies vegetales que crecen en suelos seleníferos son Se – tolerantes y acumulan grandes cantidades de Se. Ellas pueden acumular, desde cientos a varios miles de miligramos de Se por kilogramo, base peso seco, en sus tejidos. Sin embargo, la mayoría de lasplantas, entre ellas muchas forrajeras y cultivos agrícolas no acumulan grandes cantidades y son Se-sensibles. Las -1

plantas Se sensibles contienen menos de 25 mg de Se kg en peso seco, no acumulando más de 100 -1

mg Se kg en peso seco, cuando crecen en suelos seleníferos (Terry et al., 2000). Las plantas cultivadas que crecen en suelos no seleníferos presentan concentraciones de Se que varían entre -1

0,01 a 1,0 mgkg de peso seco. Especies de rápido crecimiento del género Brassica como mostaza india (Brassica juncea) y raps (Brassica napus) acumulan grandes cantidades de Se, del orden de -1

varios cientos de mg kg de peso seco, en sus tallos cuando crecen en suelos contaminados con niveles moderados de Se (Bañuelos et al., 1997). El selenio compite con el azufre en el paso a través de membranas (Figura12). Por ser de naturaleza química similar puede ser transportado por los mismos transportadores hacia el interior de las células. Los suelos afectados por salinidad con sulfatos reducen notablemente la absorción de selenato en las plantas. La expresión de la alta afinidad del transportador de sulfato por selenato es regulada positivamente por o-acetilserina, y negativamente por el sulfato y la glutathiona (Terry et al., 2000).

Figura 12. Absorción de selenato al interior de una célula vegetal. SO4= sulfato; SeO4= selenato; GSH = glutathiona reducida (Terry et al., 2000).

Tabla 17. Rango y contenido medio de As en vegetales de consumo (Kabata – Pendias (2000).

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La absorción de Se en suelos salinos que tienen alta concentración de sulfatos no afecta a las especies vegetales en la misma magnitud. En las plantas Se-acumuladoras, el selenato es absorbido con preferencia en relación al sulfato. Cálculos del coeficiente de discriminación Se/S indican que Astralagus bisulcatus, arroz , y mostaza india (Brassica juncea), tienen la capacidad de absorber Se preferentemente en presencia de un alto suministro de sulfato (Bell et al., 1992). Otras especies, como alfalfa, trigo, ballica, cebada y bróccoli tienen un coeficiente de discriminación con valores menores a uno, y la absorción de selenato se inhibe significativamente en presencia de un suministro de sulfato (Terry et al., 2000). La traslocación de Se desde la raíz a los brotes depende de la forma del Se suministrado. El selenato es transportado más fácilmente que el selenito o el Se orgánico hacia las partes superiores de las plantas. La distribución del Se en los distintos órganos de las plantas varía con la especie, la fenología y su condición fisiológica. En plantas acumuladoras, el Se es almacenado en las hojas jóvenes durante los estados tempranos de desarrollo, en la fase reproductiva se translocan altos niveles de Se a las semillas a medida desde las hojas. Los cereales no acumuladores cultivados tienen

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similares contenidos de Se en grano y raíces, con pequeñas cantidades en tallos y hojas (Terry et al., 2000). Las plantas también pueden absorber el Se en formas volátiles desde la atmósferan por las hojas, acumulándose en las raíces de algunas especies como chépica (Agrostis tenuis), cebada (Horedum vulgare), tomate (Lycopersicon esculentum) y rábano (Raphanus sativus). Tabla 18 muestra rangos y contenido medio de Se en vegetales de consumo.

Tabla 18. Contenido medio de Se en vegetales de consumo. (Kabata – Pendias, 2000). Planta

Órgano

Rango ( ugKg-1, peso seco)

Granos

1 – 430 (690)*

Granos

2 – 110 (1800)*

Granos

3 -140( 1000)*

Granos

9 - 250

Granos

10 – 2030*

Hojas

150

Hojas

57

Raíz

64

Bulbo

42

Tubérculo

11

Fruto

36 - 83

Fruto

2,6 - 8

Fruto

7,7

Hojas

21 - 980

Pastos **

Hojas

1 - 450

Tréboles ***

Hojas

5 - 880

Trigo Cebada Avena Centeno Maíz Repollo Lechuga Zanahoria Cebolla Papa Tomate Manzano Naranjo Te

* Valor máximo en USA **Las medias no superan las 352 uhkg-1 ***Las medias no superan las 672 ugkg-1

4.8. Molibdeno

68

El contenido de Mo en los suelos generalmente se encuentra asociado al material parental, -1

variando entre 0,013 y 17,0 mg kg para la mayoría de los suelos del mundo. El Mo se encuentra asociado a rocas félsicas como el granito. El Mo es más soluble en suelos alcalinos, asociándose principalmente a compuestos orgánicos e hidróxidos de Fe. Por esto el Mo aumenta su solubilidad cuando se aplican enmiendas calcáeras en el suelo. Otro factor importante en la solubilidad del Mo es el drenaje del suelo que influye en el potencial redox. El Mo está disponible para las plantas bajo condiciones de oxidación, sin embargo, presenta especies móviles (thiomolibdatos) en condiciones de reducción. El Mo es un micronutriente esencial a las plantas, aun cuando su requerimiento fisiológico es relativamente bajo. El Mo se encuentra presente en ácidos nucleicos y forma parte de algunas enzimas como la nitrogenasa y la nitrato-reductasa, presentándose en forma más abundante en los nódulos de las raíces de plantas leguminosas. Las concentraciones óptimas de Mo en trébol -1

-1

subterráneo se encuentran en el rango de 0,5 a 1,0 mg kg y no superior a 5,0 mg kg considerado como un valor excesivo (Opazo et al., 2000) ( Tabla 19). 4.9 Mercurio La acumulación de Hg en el suelo se encuentra controlada principalmente por la formación de -

complejos orgánicos y por la precipitación. El Hg se encuentra asociado a Cl . En presencia de un -

+

exceso de Cl la adsorción de Hg en las partículas minerales del suelo y la materia orgánica disminuye debido a la formación de complejos de Hg-Cl altamente estables que son poco adsorbidos. La movilidad del Hg requiere procesos de disolución y degradación biológica y química de los compuestos orgánicos de mercurio, especialmente hacia formas metiladas del Hg elemental. En condiciones de suelo aeróbicas dominan especies catiónicas de Hg, En condiciones de suelo anóxicas es probable que ocurran complejos aniónicos de Hg y S, mientras que los compuestos de Hg metilados predominan en suelos de condiciones redox intermedias. -1

La concentración media de Hg para los suelos del mundo, raramente excede las 400 μg kg , asociándose principalmente a suelos orgánicos, suelos inundados para el cultivo de arroz y suelos -1

urbanos. Suelos con valores de Hg superiores a 500 μg kg pueden considerarse contaminados. La absorción de Hg desde el suelo a las plantas es baja constituyéndose en una barrera para la traslocación desde las raíces a las partes aéreas de las plantas (Patra y Sharma, 2000). De esta forma, altas concentraciones de Hg en el suelo producen sólo aumentos moderados en los niveles del metal en las hojas por absorción desde el suelo. El Hg aerotransportado contribuye significativamente al contenido de este metal en los cultivos y por esta razón, al consumo humano y animal (Patra y Sharma, 2000). Una parte del Hg atmosférico es absorbido directamente por las hojas de las plantas, el que pasa al humus del suelo por abscisión foliar.

69

Tabla 19. Contenido medio de Mo en vegetales de consumo (Kabata – Pendias (2000).

Patra y Sharma (2000), informaron que la incorporación de vapor de Hg por las hojas de plantas C3 (avena, cebada y trigo) fue cinco veces mayor que la absorción por las hojas de especies C4 (maíz, sorgo y digitaria). Los daños a las semillas de cereales por compuestos orgánicos de Hg, se han caracterizado por una germinación anormal y una hipertrofia característica de las raíces y el coleoptilo. La exposición de las plantas al Hg puede deberse a:

70

- Administración directa como agentes funguicidas en el tratamiento de las semillas o aspersión foliar. - Exposición accidental en el suelo, agua y contaminación del aire. La tabla 20 muestra rangos y contenido medio de Hg en vegetales de consumo. Tabla 20. Rangos y contenido medio de Hg en vegetales de consumo. ( Kabata – Pendias , 2000). Planta Trigo Cebada Avena Centeno Maíz Poroto Repollo Lechuga Zanahoria Cebolla Papa Tomate Manzano Naranjo Te

Organo Granos Granos Granos Granos Granos Granos Hojas Hojas Raíz Bulbo Tubérculo Fruto Fruto Fruto Hojas

71

Rango (ug Kg-1, peso seco) 0,2 - 33 5 - 82 < 4 - 45 3 - 18 3 – 4,6 3 - 11 6,5 8,3 5,7 - 86 < 10 < 10 - 47 3,1 - 34 < 10 2,6 34 – 46

V. MECANISMOS CELULARES PARA TOLERANCIA Y DETOXIFICACIÓN DE METALES PESADOS EN PLANTAS

Para poder comprender la genética molecular de la acumulación de los metales pesados es necesario un conocimiento profundo de la interacción de los mismos con el entorno tanto en el interior de la planta como en el exterior de la misma. Conseguir este conocimiento requiere el estudio de diferentes aspectos bien delimitados (Fig. 13).

Figura 13. Interacción de los metales pesados con plantas. Aspectos clave que determinan su acumulación.

5.1 Aspectos de Interacción planta- metal relacionado con tolerancia y de detoxificación Estos son los siguientes: 5.1.1 Micorrizas Las micorrizas son ciertos hongos del suelo que se encuentran en asociación simbiótica con las raíces de (la mayoría) de las plantas. La propia palabra define la simbiosis entre un hongo (mycos) y las raíces (rhizos) de una planta. La asociación física se produce porque las raíces de las plantas se unen con las hifas de determinados hongos (Fig. 14). La planta obtiene del hongo la parte que viene del suelo mientras el hongo obtiene la parte que viene del aire, así la simbiosis proporciona por parte del hongo nutrientes minerales y agua (suelo), y por parte de la planta, sustratos energéticos y carbohidratos (fotosíntesis).

72

Figura 14. Detalle de la morfologia de raices colonizadas por ectomicorrizas. Las plantas micorrizadas presentan una mayor tolerancia a los metales pesados gracias, en parte, a la capacidad para inmovilizar los metales en la raíz, impidiendo que éstos pasen a la parte aérea de la planta. Una primera barrera a la entrada de metales pesados la constituirí a la pared celular del hongo, que tiene una gran capacidad de adsorber cationes sobre su superficie, puesto que está se encuentra cargada negativamente. Además, el hongo restringe el movimiento del metal a las raíces de la planta. Para ello se sirve de diversos mecanismos que varían según la especie de hongo y planta, y del metal. Sin embargo, se ha observado también una intensa actividad de translocación y absorción de metales pesados en algunas especies por efecto de las micorrizas, evidenciando que funcionan en ambos sentidos, impidiendo la entrada de metales pesados y favoreciendo su acumulación y, por tanto, procurando una alternativa de utilización en fitorremediación. En cualquier caso, los procesos esquematizados, en que participan las micorrizas son:   

absorción/adsorción de metales pesados en el hongo. reducción del acceso de los metales pesados al apoplasto por hidrofobia. quelación de los metales pesados con exudados del hongo.

5.1.2 Pared celular y exudados de raiz La raíz constituye el tejido de entrada principal de metales pesados en la planta. Hasta allí los metales pesados pueden llegar, fundamentalmente, por un proceso de difusión en el medio, mediante un flujo masivo y por intercambio catiónico. La raíz posee cargas negativas en sus células, debido en gran medida a la presencia de grupos carboxilo del ácido péctico. Las cargas negativas de estas células de la rizodermis interaccionan con las positivas de los metales pesados presentes en el suelo, creando un equilibrio dinámico que facilita la entrada hacia el interior celular. De esta forma, los cationes entran por la pared celular, que además es hidrofílica, lo que facilita el transporte iónico. Una vez unidas las cargas positivas a las negativas de la pared celular, los metales pesados se transportan, en parte por la vía apoplástica, y en parte por la simplástica. No obstante, se ha demostrado recientemente que parte del flujo de metales pesados, al menos en el caso del Pb puede quedar retenido en la pared celular por la estructura de lignina y celulosa (Marmiroli et al. 2005). Los exudados son compuestos orgánicos liberados por la raíces de la planta. Existen dos tipos: de bajo peso molecular y de alto peso molecular. Los primeros se liberan a favor de gradiente de concentración, y los segundos se liberan por mecanismos de transporte activo o por lisis celular. Entre los de bajo peso molecular encontramos ácidos orgánicos, azúcares, fenoles, aminoácidos, y gases como el etileno. Los exudados de alto peso molecular, por el contrario, son productos de

73

lisados (como la autolisis de células epidérmicas y corticales), secreciones (que implican un proceso metabólico de liberación) y mucílagos. Los exudados facilitan la disponibilidad de los metales. Por ejemplo, se ha observado que los exudados favorecen la absorción de Fe en suelos deficientes en el mismo. La exudación de mucílagos que forman una capa externa a la raíz (mucigel), también favorece la complejación de metales pesados como el Cd, Cu y Pb. 5.1.3 Membrana plasmática La célula necesita tener los siguientes caminos metabólicos en buen estado: la producción de ATP m itocondrial, el metabolismo de calcio, la síntesis de proteínas, la regulación del ADN, la glicólisis y el ciclo del ácido cítrico o ciclo de Krebs. Estos dos últimos proporcionan los precursores para síntesis de aminoácidos y los equivalentes reducidos, cuya oxidación genera la mayoría del ATP. Los daños a la membrana plasmática, a la producción de ATP mitocondrial y al control de los niveles de calcio intracelular son rutas comunes para la destrucción final de la célula y merecen especial atención. La membrana plasmática es un sistema complejo y de un funcionamiento altamente sofisticado, siendo como es la puerta de entrada de cualquier elemento (señal, nutriente, tóxico, etc) al lugar donde se realiza la química que mantiene la vida de la célula. La membrana plasmática es utilizada por la célula para mantener los gradientes iónicos, que a su vez regulan el volumen celular. Si se daña la membrana, entran iones Ca2+ y salen iones K+ (responsables de los fenómenos de polarización y despolarización de la membrana y, en definitiva, de la transmisión eléctrica). La salida de K+ favorece la entrada de agua. El aumento de agua incrementa el volumen celular. Hay varios mecanismos que pueden inducir estos cambios, algunos ejemplos son fluidización de la membrana, peroxidación de lípidos, daño al citoesqueleto, bloqueo de canales etc. Independiente de la agresión tóxica, la membrana plasmática es uno de los componentes que primero responde al daño, siendo el resultado final del mismo la pérdida de la integridad es de la membrana. Por tanto, conviene tener en cuenta que el daño al citoesqueleto causará daños también a la membrana plasmática. La membrana plasmática, por tanto, se ve rápidamente afectada por metales pesados. Sobre ella se producen efectos específicos según el metal, promoviendo daños mediante varios mecanismos. De manera resumida:   

Oxidación y entrecruzamiento de proteínas (conteniendo grupos tiol). Inhibición de proteínas de membrana que son esenciales (como por ejemplo la H+-ATPasa). Cambios en composición y fluidez de los lípidos de membrana, y cambios en la permeabilidad. Por ejemplo, se sabe que el Cu y el Cd alteran la composición de los lípidos de membrana y provocan la fuga de solutos de la célula.

En cualquier caso todos estos mecanismos esencialmente acaban alterando las propiedades eléctricas de la membrana plasmática. Sin embargo la membrana plasmática puede estar involucrada en la tolerancia a metales pesados reduciendo la captación o estimulando las bombas de flujo de metales que promueven la entrada al citosol. Se sabe que las plantas tolerantes protegen la membrana. ¿Cómo?. Básicamente:  

Mediante mecanismos de reparación que mantienen la integridad de la membrana plasmática Utilizando mecanismos de protección como proteínas de choque térmico, metalotioneinas, etc.

74

  

Mejorando los mecanismos de homeostasis de metal Promoviendo un influjo reducido a través de la membrana plasmática Promoviendo un eflujo selectivo (metabólicamente, es decir energéticamente, más conveniente que los mecanismos específicos de influjo y restricción).

Las plantas poseen varias clases de transportadores de metal que deben estar involucrados en la homeostasis y la tolerancia. Hay, sin embargo, pocas evidencias directas al respecto, sobretodo para el sistema de eflujo. Como ejemplo de influjo reducido, en Nicotiana tabaccum se ha descrito la tolerancia conferida por un transportador (NtCBP4) regulado por calmodulina para el caso del Ni. También se han descrito transportadores que facilitan el eflujo a través de la membrana plasmática (CPx-ATPases, Nramps, familia CDF, familia ZIP, Tabla 21).

5.1.4 Quelación Uno de los aspectos más importantes de la acumulación de metales pesados es el que se refiere al proceso de complejación. Un complejo o compuesto de coordinación es el resultado de la interacción de un átomo central, esto es, un ion metálico con orbitales de valencia vacíos que puede actuar como ácido de Lewis (aceptor de electrones), y una o varias bases de Lewis (dador de electrones) con pares de electrones libres. Estas bases se conocen como agentes complejantes o ligandos. Esta interacción lleva a la formación de un enlace covalente coordinado o dativo. El átomo central debe disponer de orbitales vacíos capaces de aceptar pares de electrones. En consecuencia, los cationes de los grupos I y II del sistema periódico tienen poca tendencia a formar complejos, al disponer de orbitales poco profundos y, por tanto, con poca disposición a captar electrones. Por el contrario, los metales de transición sí que presentan una elevada tendencia al proceso de quelación, puesto que poseen orbitales profundos (tipo d o f). El metal se rodea de los ligandos formando un complejo. Los ligandos simples, como el agua, sólo forman un enlace con el átomo central, y se llaman monodentados o monocoordinados. Algunos ligandos son capaces de formar múltiples enlaces de coordinación, y se describen como bidentados (bicoordinados), tridentados (tricoordinados), lo cual va incrementando la estabilidad de los complejos. Generalmente tienen mucha mayor tendencia a formar complejos que sus homólogos monocoordinantes. La planta utiliza este mecanismo de complejación en el interior de la célula para detoxificar (amortiguar) los metales pesados, uniendo a ellos ligandos para formar complejos. De esta manera, el metal queda inmerso en una interacción química que le mantiene en equilibrio electrónico (acomplejado), pero que no lo deja fuera del metabolismo, no se ha eliminado del citoplasma de la célula y, por ello, sigue siendo potencialmente tóxico. Como se ha mencionado anteriormente, los metales pesados muestran gran afinidad por determinados grupos funcionales como principales ligandos, como grupos sulfidrilo, radicales amino, fosfato, carboxilo e hidroxilo. Los ligandos que utiliza son básicamente aminoácidos y ácidos orgánicos, y más específicamente, dos clases de péptidos: fitoquelatinas y metalotioneinas. Entre los aminoácidos y los ácidos orgánicos se encuentran los ácidos cítrico y málico, la histidina, la cisteína etc. (Tabla 22).

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Tabla 21. Principales transportadores de membrana plasmática dxe metales pesados

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Tabla 22. Principal metabolito que actúa de ligando para la formación de complejos de citrato y metales pesados Proteínas

Donante

Receptor

Citrato sintasa

Tabaco

Tabaco, Papaya

Aspectos relevantes Tolerancia al Al

Referencia De la Fuente et al, 1997

- Metalotioneinas (MTs) Existieron las primeras proteínas identificadas (en mamíferos) como transportadoras de Cd. Son polipéptidos de unos 70-75 aminoácidos con un alto contenido en cisteína, aminoácido capaz de formar complejos con cationes mediante el grupo sulfidrilo que posee como radical. Son pues proteínas de transporte de metales, ricas en cisteína y de bajo peso molecular. Se cree que son las responsables esenciales de la quelación de metales pesados en el citoplasma de las células de mamíferos y bacterias, pero se piensa también que no son proteínas tan decisivas en el proceso de quelación de metales pesados en plantas (Tabla 23). Tabla 23. Principales metalotioneinas implicadas en la tolerancia y/o acumulación de metales pesados Proteínas

Donante

Receptor

MT2

Humano

Tabaco

MT1

Ratón

Tabaco

MT

Guisante

Arabidopsis

CUP1

Levadura

Coliflor

Aspectos relevantes Tolerancia Cd en germinación Tolerancia Cd en germinación Acumulación de Cu 16 veces la tolerancia a Cd y acumulación de Cd

Referencias Misra y Gedamu 1989 Pan et al, 1994 Evans et al, 1992 Hasegawa et al, 1997

- Fitoquelatinas (PCs) Las fitoquelatinas son ligandos de alta afinidad que complejan metales pesados. Se identificaron después que las MTs. Se piensa que las fitoquelatinas pueden desempeñar en plantas el papel equivalente al que las metalotioneínas desempeñan en mamíferos y bacterias. Las fitoquelatinas se inducen rápidamente en plantas por tratamiento con metales pesados. Su disminución provoca una mayor sensibilidad a metales pesados, por tanto su papel en la tolerancia y acumulación de metales pesados en plantas es crítico (Tabla 24). Las fitoquelatinas tienen como sustrato el glutatión. El glutatión está considerado el péptido más abundante de la Tierra. Además, o quizás esto explique su abundancia, es una molécula clave en el balance del estado oxidativo de la célula. También participa en procesos de detoxificación de diversas sustancias lesivas, y es capaz de quelar metales pesados por sí misma. En realidad el

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glutatión participa en una gran variedad de procesos de los cuales se han señalado sólo los más esenciales. La estructura del glutatión (GSH) está constituida por 3 aminoácidos: Glutámico (Glu), Cisteína (Cys) y Glicina (Gly), unidos por enlaces peptídicos. Sin embargo, de forma inusual, el primer aminoácido, Glu, se une al segundo por el grupo carboxilo, no cercano al amino en a, como sería habitual, sino por el grupo carboxílico residual. Es en ese sentido, el glutatión un péptido inusual, cuya estructura primaria es: γ-GluCysGly. Numerosos estudios indican, como se ha mencionado previamente, que el GSH es el sustrato para la biosíntesis de las PCs. Este proceso de síntesis se acomete a través de los enzimas que se indican en el esquema (Fig. 15). Se ha demostrado que estructuralmente la síntesis de PCs se produce por unión de GSH, con residuos de Glu y Cys ligados a través de repeticiones de (γ-GluCys)n-Gly donde n= 2-5…..11. En cuanto al consumo energético, los dos primeros pasos (es decir la síntesis completa de glutatión) requiere consumo de ATP. No así la síntesis de PCs.

Tabla 24. Principales fitoquelatinas implicadas en la tolerancia y/o acumulación de metales pesados.

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Figura 15. Esquema del proceso de síntesis de PCs.

Es importante señalar que el Cd es un efector positivo de la síntesis de PCs, actuando sobre los pasos 1, 2 y 3, es decir, sobre todos los enzimas que intervienen en la síntesis. Sin embargo, aún es quizás más relevante señalar que el paso de inicio de síntesis de glutatión, y por tanto de PCs, está inhibido por el mismo glutatión obtenido en el paso 2. En consecuencia una sobreexpresión o incremento de los enzimas que intervienen en la síntesis de glutatión, sin un incremento de la producción o actividad de la PCs, llevará a una producción limitada de los mismos, o al menos más limitada que si se incrementa la actividad PCS. Esto es importante a la hora de diseñar una estrategia biotecnológica de mejora en la acumulación de metales pesados.  Modo de acción de las PCs Las PCs se sintetizan en el citosol, donde se unen a compuestos metálicos formando complejos. Sin embargo, técnicas de HPLC y rayos X detectan mayores concentraciones de metal y PCs en el interior de la vacuola, por lo que se deduce que el transporte y acumulación en su interior están implicados en tolerancia y detoxificación. En consecuencia, parece ser que el paso final en el proceso de detoxificación, esto es, desde la movilización del metal del suelo a las raíces hasta llegar al interior de las células tanto de la raíz como de las hojas, es la compartimentalización vacuolar. 5.1.5 Compartimentalización vacuolar El eflujo de iones y el transporte al interior de la vacuola constituyen dos maneras diferentes de conseguir el mismo objetivo: reducir la concentración de metales tóxicos en el citoplasma. La diferencia importante entre ambos, es que mientras en el primer caso no es una garantía de que el problema de la toxicidad esté resuelto, en el segundo caso sí lo es. Además del bien documentado proceso de acumulación, de los complejos PCs-Cd en vacuola, hay evidencias de acumulación de otros metales, involucrando diferentes sistemas de transporte desde el tonoplasto como Zn, Ni, etc. (Tabla 25). Dentro de la vacuola se forman complejos PCs-Cd de alto y bajo peso molecular (LMW: low molecular weight y HMW: high molecular weight) lo que parece indicar que el mecanismo de procesamiento en citoplasma y almacenamiento es un proceso sofisticado y complejo que requiere un mejor conocimiento (Fig. 16).

79

Tabla 25. Principales transportadores vacuolares de metales pesados.

80

5.1.6 Biotransformación Al conjunto de caminos metabólicos por medio de los cuales los tejidos incrementan la polaridad de un tóxico, o a la transformación química de un compuesto en el organismo, se le denomina biotransformación. Para reducir la respuesta tóxica de una sustancia en un organismo hay que disminuir la cantidad de sustancia en forma activa (tóxica) y el tiempo de permanencia de la misma en el sitio de acción. ¿Cómo? Incrementando la polaridad ya que ello aumenta la difusibilidad del tóxico y por tanto puede incrementar la velocidad de excreción. Además, muchas sustancias tóxicas que ven incrementada su polaridad se convierten en sustratos accesibles para posteriores reacciones de detoxificación, reacciones que, por otra parte, no serían posibles de no incrementar la polaridad. Con frecuencia pues, se trata de convertir un xenobiótico (compuestos cuya estructura química en la naturaleza es poco frecuente o inexistente debido a que son compuestos sintetizados por el hombre en el laboratorio) no polar en un compuesto soluble en agua. Estas reacciones se agrupan en dos conjuntos denominados Biotransformación Fase I y Biotransformación Fase II:  

Fase I. Biotransforma los xenobióticos conviertiéndolos en substratos de los enzimas de la Fase II, al mismo tiempo que los hace más hidrófilos. Fase II. Agrega un grupo polar de tamaño relativamente grande a los productos de las reacciones de la Fase I, o a los xenobióticos originales que contienen los grupos funcionales apropiados para ser substratos de las reacciones de conjugación (Fig.16).

Figura 16. Raciones de conjugación 5.1.7 Mecanismo de reparación celular Se denomina mecanismos de reparación celular al conjunto de procesos que se activan como respuesta a los fenómenos de deterioro celular (como estrés oxidativo). Estos mecanismos se activan para restablecer las características iniciales de la célula. Los mecanismos mejor conocidos son los que participan en la síntesis de componentes de pared, y aquellos mecanismos que participan en la activación de procesos de reparación de errores rutinarios en la copia de ADN. Este es un tema complejo y bien estudiado, en el caso, sobretodo, de daños al DNA. Se sabe que en la reparación de la membrana plasmática después del daño causado por la presencia de metales pesados están involucradas las metalotioneinas y, sobre todo, las proteínas de choque térmico. Estas últimas

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incrementan su expresión en gran variedad de organismos en respuesta a la subida de temperaturas por encima de la óptima. También se expresan en respuesta a otros estreses como metales pesados, de forma que actúan como protección y reparación de proteínas. Se ha comprobado que un corto estrés por calor antes de estrés por metales pesados induce un efecto de tolerancia, previniendo el daño en la membrana. 5.2 Mejora de la entrada y acumulación de metales pesados en plantas El conocimiento de todos los procesos descritos hasta ahora nos podría permitir mejorar la entrada y acumulación de metales pesados, sin grave perjuicio para la célula. ¿Cómo se consigue que una planta acumule más metales? Para abordar este problema se sugiere recapitular la secuencia de acontecimientos que se mencionan por orden temporal de precedencia: Se ha hablado de:     

Transporte: entrada y salida de metales pesados al interior de la planta primero y al interior de la célula después. Quelación: secuestro de los metales contaminantes mediante la unión a ligandos específicos (principalmente peptídicos) producidos por la propia planta. Compartimentalización: proceso por el que el complejo ligando-metal queda retenido en una vacuola. Biotransformación: conjunto de reacciones de descomposición, conjugación o síntesis implicadas en el correcto procesamiento de los contaminantes. Mecanismos de reparación celular: mecanismos que en respuesta al deterioro sufrido, reestablecen las características iniciales de la planta.

Se ha hablado de todos estos procesos. El modo de abordar el problema con éxito, consiste en ponderar los pasos a realizar. En primer lugar hay que asegurar que el metal no produce un efecto tóxico importante. En efecto, para poder mejorar la acumulación se debe, ante todo, evitar que el metal pesado provoque daño en su transporte. El daño no se producirá, en buena medida, si el metal fluye de una manera rápida por la raíz y los tejidos, de tal manera que llegue cuanto antes a un destino final donde sea convenientemente amortiguado y empaquetado en forma no tóxica. Para ello, habrá que conseguir que el metal no sea lesivo en el citoplasma, procurando suficiente cantidad de ligando para que inmediatamente se amortigüe el efecto tóxico (quelación). En segundo lugar, hay que disponer el complejo metal-ligando en vacuola, porque el metal sigue siendo potencialmente tóxico mientras no se deposite en este reservorio, donde queda convenientemente almacenado (compartimentalización). Y en tercer lugar, se puede incrementar el transporte, puesto que el metal será adecuadamente dispuesto. En un segundo orden de importancia quedan los procesos de Biotransformación y los Mecanismos de reparación celular, que serán, en todo caso, procesos que perfeccionarán lo conseguido con la mejora de los procesos anteriores.

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EPILOGO

El tema de contaminación de metales pesados en suelos y plantas resulta muy interesante.es importante considerar la complejidad del tema para explicar los diferentes mecanismos que se dan en la interacción entre los diferentes contaminantes presentes en el suelo y ´ppor consigueinte la absorcióna travez de las raíces d ela splantas que crecen sobre éstos. La información sobre este aspecto es amplia, divulgada en muchas revistas científicas, publixaciones en congresos y libros.Los que se consideran a continuación son algunos de los títulos que son de interés para el lector: Revista Chapingo Serie Horticultura 15(2): 161-168, 2009. FITOEXTRACCIÓN DE PLOMO Y CADMIO EN SUELOS CONTAMINADOS USANDO QUELITE 3 (Amaranthus hybridus L.) Y MICORRIZAS. H. G. Ortiz-Cano; R. Trejo-Calzada ; R. D. Valdez-Cepeda ; J. G. Arreola-Ávila1; A. Flores-Hernández; B. López-Ariza Unidad Regional Universitaria de Zonas Áridas. Universidad Autónoma Chapingo, MÉXICO. Las actividades mineras y metalúrgicas practicadas en la Comarca Lagunera, México han contaminado el suelo, el aire y el agua. El uso de plantas es una de las estrategias para la remediación de suelos contaminados con metales pesados. Sin embargo, son pocos los estudios sobre remediación con plantas de zonas áridas y su asociación con micorrizas. El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad extractora de Plomo (Pb) y Cadmio (Cd) del quelite (Amaranthus hybridus L.) al adicionar una mezcla de micorrizas arbusculares (Entrophospora columbiana, Glomus intraradices, G. etunicatum, G clarum) al sustrato contaminado con Pb o Cd. Dos experimentos, uno por cada metal, con diseño experimental de bloques al azar con cuatro repeticiones fueron desarrollados. En el primero se adicionaron tres cantidades de micorrizas (0, 2.5 y 5.0 g·kg-1) en suelos con 300 mg·kg-1 de Pb. En el segundo experimento, las mismas cantidades de micorrizas fueron probadas en suelos contaminados con 15 mg·kg-1 de Cd. Las concentraciones de Pb y Cd en raíz, hoja y tallo a los 65, 95 y 125 días de edad de la planta se determinaron con un espectrofotómetro de absorción atómica. Los resultados indican que la adición de micorrizas incrementó significativamente (P<0.05) la concentración de Pb y Cd en raíz, tallo y hoja de quelite. Las concentraciones de estos metales se incrementaron significativamente conforme la edad de la planta. TERRA Latinoamericana VOLUMEN 23 NÚMERO 1, 2005 RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON METALES PESADOS UTILIZANDO PLANTAS Y MICROORGANISMOS RIZOSFÉRICOS† Ma. del Carmen Ángeles González-Chávez Instituto de Recursos Naturales, Colegio de Postgraduados. 56230Montecillo, estado de México En México, al igual que en muchos países, la prevención de la contaminación del ambiente (suelo, agua y aire) y su recuperación es una prioridad. La Biotecnología del Suelo nace como una rama trascendental dentro de la Ciencia del Suelo, y los resultados muestran el enorme potencial de los microorganismos del suelo, en el mejoramiento de la calidad del suelo, degradación e inmovilización de contaminantes, su efecto en el crecimiento y en la protección de las plantas frente a diferentes factores. Como resultado, se incrementa el interés de los investigadores por la aplicación de los microorganismos en diferentes áreas. Dentro de los métodos biológicos de recuperación de suelos contaminados por metales pesados, metaloides y otros contaminantes, el uso de plantas y microorganismos rizosféricos representa una alternativa de bajo costo y con enormes ventajas

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ambientales. Las tecnologías que consideran el uso de estos organismos son llamadas: fitorecuperación y biorecuperación, respectivamente. Se resumieron las principales alternativas biológicas que pueden usarse para la descontaminación y recuperación de suelos contaminados por metales pesados. Se hizo énfasis que el uso de plantas requiere considerar a sus microorganismos simbióticos mutualistas de la rizosfera. Papeles de Geografía 2010, 51-52; pp. 45-54 AFECCIÓN DE SUELOS AGRÍCOLAS POR METALES PESADOS EN ÁREAS LIMÍTROFES A EXPLOTACIONES MINERAS DEL SURESTE DE ESPAÑA. F. Belmonte Serrato1, A. Romero Díaz1, F. Alonso Sarría1, J. Moreno Brotóns y S. Rojo López-Universidad de Murcia Se analiza la contaminación por metales en suelos agrícolas en el entorno de la Sierra minera de Cartagena-La Unión. El muestreo se realizó cogiendo 20 muestras de suelo en uso agrícola mediante una distribución aleatoria en un área de unos 100 km2 en torno a la Sierra Minera. Los resultados han detectado concentraciones importantes, que alcanzan y superan los niveles máximos permitidos por diversas normativas internacionales de hasta 11 de los elementos denominados «metales pesados». Aluminio y Hierro destaca sobre los demás con concentraciones medias porcentuales de 13% y 10% respectivamente. Pero hay que destacar la contaminación excesiva de plomo (Pb) y Zinc (Zn) que duplica e incluso triplica el máximo establecido por las leyes más permisivas, superando con mucho los niveles máximos a partir de los cuales se requiere una intervención obligatoria en todas las legislaciones consultadas

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APÉNDICE A

Valores comparativos de inhibición de crecimiento de radícula en términos de concentración de -1

inhibición media, CI50 (mg L ) para cuatro ensayos ecotoxicológicos con semillas de plantas terrestres para la evaluación de tres metales pesados.

6+

Para el Cr se da el siguiente orden decreciente de ecotoxicidad: O. sativa > B. vulgaris > A. cepa > R. 2+

sativus. Para el Hg la siguiente secuencia: B. vulgaris > R. sativus ~ O. sativa > A. cepa. Para el Pb

2+

se da la siguiente secuencia: B. vulgaris > A. cepa > R. sativus > O. sativa. La secuencia de sensibilidad 2+

6+

2+

promedio en orden decreciente fue: Hg > Cr > Pb .

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GLOSARIO

Contaminación: La contaminación es la introducción de algún tipo de sustancia o energía que atentará contra el normal

funcionamiento y equilibrio que ostentaba el medio inicialmente,

provocando además un daño casi irreversible.

Fitotoxicidad: Acumulación de una sustancia dañina en el tejido de una planta en niveles que afectan su crecimiento y normal desarrollo. Efectos de toxicidad en especies vegetales sensibles, donde diversos factores edáficos pueden determinar la biodisponibilidad de un compuesto químico, y por lo tanto, la intensidad del efecto fitotóxico, tales como el contenido de materia orgánica y el pH del suelo, además del grado de solubilidad de la forma química.

Metal pesado: El término “metal pesado” suele referirse a metales cuyo peso específico es superior a 5 g.cm-3 y que tiene un número atómico por encima de 20. No obstante, no todos los elementos que tienen esas características tienen análogas funciones biológicas. Debido a las pequeñas cantidades que se manejan se denominan, a veces, “elementos traza” o “metales traza” y se incluye el aluminio que no se puede calificar de metal pesado.

Toxicidad: Es el grado de efectividad de una sustancia tóxica. Se trata de una medida que se utiliza para nombrar el grado tóxico de los elementos, tanto sobre un organismo completo como sobre una subestructura (célula).

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LISTADO DE ABREVIATURAS

As = arsénico APX = ascorbato oxidasa Cd = cadmio Zn = cinc Cu = cobre Cr = cromo GR = glutatión reductasa Hg = mercurio Kg = kilogramos M = mol mM = milimoles mg = miligramos Mn = manganeso Mo = molibdeno Ni = níquel PS = peso seco Pb = plomo Se = selenio

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BIBLIOGRAFÍA

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