LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA II
MENETAPKAN KADAR KOLESTROL
SISKA AYU WULANDARI G1C 008 010
PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MIPA UNIVERSITAS MATARAM
2011
2
MENETAPKAN KADAR KOLESTROL
A. PELAKSANAAN PRAKTIKUM
1.
Tujuan
: Menetapkan kadar kolestrol dalam serum.
2.
Hari, tanggal
: Senin, 23 Mei 2011
3.
Tempat
: Laboratorium Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Mataram.
B. LANDASAN TEORI
Kolesterol adalah salah satu sterol yang penting dan terdapat banyak di alam yaitu pada hewan dan manusia. Kolesterol mempunyai gugus hidroksil yang terdapat pada atom C nomor 3 mempunyai posisi β oleh karena dihubungkan dengan garis penuh.
Gambar. Kolesterol Pada tubuh manusia, kolesterol terdapat dalam darah, empedu, kelenjar adrenal bagian luar
(adrenal cortex) dan jaringan syaraf. Kolestrol dapat larut dalam pelarut lemak, masalnya eter, kloroform, benzena dan alkohol panas. Apabila terdapat dalam konsentrasi tinggi, kolestrol mengkristal dalam bentuk kristal yang tidak berwarna, tidak berasa dan tidak berbau serta mempunyai titik lebur 150-151 0C (Poedjiadi, 2007: 74-76). Kolestrol merupakan steroid hewani yang terdapat paling meluas dan dijumpai dalam hampir semua jaringan hewan. Batu kandung empedu dan kuning telur merupakan sumber yang kaya akan senyawa ini. Kolestrol merupakan zat antara yang diperlukan dalam 3
biosintesis hormon steroid, namun tak merupakan keharusan dalam makanan karena dapat disintesis dari asetil koenzim A. Kadar kolestrol yang tinggi dalam darah dikaitkan dengan arteriosklerosis (pengerasan pembuluh darah), suatu keadaan dimana kolestrol dan lipid-lipid lain melapisi dinding dalam pembuluh darah (Fessenden dan Fessenden, 1986: 425). Adanya kolestrol dapat ditentukan dengan menggunakan beberapa reaksi warna. Salah satu diantaranya adalah reaksi Salkowski. Apabila kolestrol dilarutkan dalam kloroform dan larutan ini dituangkan di atas larutan asam sulfat pekat dengan hati-hati, maka bagian asam berwarna kekuningan dengan flouresensi hijau bila dikenai cahaya. Bagian kloroform akan berwarna biru dan yang berubah menjadi merah dan ungu. Larutan kolestrol dalam kloroform bila ditambah anhidrida asam asetat dan asam sulfat pekat, maka larutan tersebut mula-mula akan berwarna merah, kemudian biru dan hijau. Ini disebut reaksi Lieberman Burchard. Warna hijau yang terjadi ini ternyata sebanding dengan konsentrasi kolestrol. Karenanya reaksi Lieberman Burcharddapat digunakan untuk menentukan kolestrol secara kuantitatif (Poedjiadi, 2007: 74-76). Karena kolestrol tidak larut dalam darah, maka ditransportasikan dalam system sirkulasi lipoprotein. Ada beberapa jenis lipoprotein di dalam darah umumnya dari ukuran besar sampai yang terkecil : chylomicrons, very low density lipoprotein (VLDL), intermediate density lipoprotein (IDL), low density lipoprotein (LDL) dan high density lipoprotein (HDL). Sesuai dengan hipotesa lemak, abnormal level kolestrol tinggi (hypercholesterolemia), atau lebih tepatnya, semakin tinggi konsentrasi dari LDL dan semakin rendah fungsi HDL berhubungan dengan penyakit jantung (cardiovascular disease) karena merangsang pembentukan atheroma pada pembuluh darah arteri. Level partikel LDL sering diistilahkan dengan “bad cholesterol” sedangkan HDL yang tinggi memberikan proteksi sehingga diistilahkan dengan “good cholesterol” (Sudarma, 2008: 80). Kolesterol dapat mengalami autooksidasi dan fotooksidasi. Kedua proses ini akan meningkatkan oksisterol dengan berbagai sruktur tergantung dari tipe oksidasi fisik substrat. Dengan demikian identifikasi produk oksidasi kolesterol dapat digunakan sebagai bukti mekanisme oksidasi pada berbagai system. Ketika kolesterol ester teroksidasi, struktur dan banyaknya oksisterol tergantung dari jenis asam lemaknya (Raharjo, 2006: 64).
4
C. ALAT DAN BAHAN
1. Alat-alat -
Tabung reaksi panjang
-
Tabung reaksi pendek
-
Tutup tabung reaksi
-
Pipet volume 5 ml
-
Pipet tetes
-
Penjepit
-
Penangas air
-
Alat Sentrifugasi
-
Spektrofotometri UV-VIS
-
Kuvet
2. Bahan-bahan -
Serum (kadar kolesterol tinggi dan rendah)
-
Alkohol absolute
-
Petroleum eter
-
Colour reagent
-
H2SO4 pekat
-
Asam asetat glacial 5
-
Aquades
D. SKEMA KERJA
1. UJI SAMPEL Tabung reaksi bertutup (tabung S (sampel) Dimasukkan 2,5 ml alkohol absolut + 0,1 ml serum Dikocok Hasil
Hasil + 5 ml petroleum eter Ditutup tabung reaksi rapat-rapat Dimasukkan dalam alat sentrifugasi 30 detik Hasil + 3 ml aquades Dikocok 10-15 detik Didiamkan (terjadi 2 lapisan) Hasil Diambil lapisan atas dengan pipet ukur Dimasukkan dalam tabung reaksi Diuapkan cairan (dimasukkan tabung reaksi dalam penangas air, T=800 C ) Cairan tinggal sedikit Diambil tabung, biarkan mengering di udara terbuka Hasil + 4 ml Colour Reagent (1 mg FeCl3.6H2O / ml asam asetat glasial ) 6
Dimasukkan tabung S (dalam penangas air, beberapa menit) Didinginkan pada temperatur kamar Hasil + 3 ml H2SO4 pekat (dialirkan melalui dinding tabung yang dimiringkan) 2 lapisan Dimasukkan dalam alat sentrifugasi Didiamkan dalam ruang gelap, 30 menit Diukur A dan % T larutan S terhadap B, λ=560 nm (kuvet dicuci dengan asam asetat glasial dan dikeringkan di udara) Hasil
BLANGKO Tabung reaksi + 4 ml Colour Reagent (1 mg FeCl3.6H2O / ml asam asetat glasial ) + 3 ml H2SO4 pekat (dialirkan melalui dinding tabung yang dimiringkan) 2 lapisan Dimasukkan dalam alat sentrifugasi Hasil Didiamkan dalam ruang gelap, 30 menit Diukur A dan % T larutan pada λ=560 nm (kuvet dicuci dengan asam asetat glasial dan dikeringkan di udara) Hasil
2. KURVA KALIBRASI 3 tabung reaksi Dimasukkan 0,5 ml, 1 ml dan 2 ml larutan kolestrol standar 0,05 mg/ml dan petroleum benzen Diuapkan sampai kering (dalam penangas 7
air, T=800C) suhu kamar sisa yang tertinggal Hasil : larutan standar kolestrol dengan kadar 125 mg%, 250 mg% dan 500mg% + 4 ml Colour Reagent (1 mg FeCl3.6H2O / ml asam asetat glasial )
Hasil Diambil tabung lain untuk blanko (B) + 4 ml Colour Reagent Hasil
Hasil Dimasukkan tabung S (dalam penangas air, beberapa menit) Didinginkan pada temperatur kamar Hasil + 3 ml H2SO4 pekat dalam tabung S dan B (dialirkan melalui dinding tabung yang dimiringkan) membentuk 2 lapisan Dimasukkan dalam alat sentrifugasi Didiamkan dalam ruang gelap, 30 menit Diukur A dan % T larutan S terhadap B, λ=560 nm (kuvet dicuci dengan asam asetat glasial dan dikeringkan di udara) Hasil
E. HASIL PENGAMATAN
1. Uji Sampel
No.
Perlakuan
Kolesterol rendah
Kolesterol tinggi 8
1
2
3
2,5 ml alcohol + 0,1
Terbentuk endapan putih,
Terbentuk endapan putih,
ml serum
warna larutan bening
warna larutan bening
Larutan dikocok
Larutan bercampur, tapi
Larutan bercampur, tapi
tidak larut
tidak larut
Larutan ditambahan
Terbentuk 2 fase, di bawah
Terbentuk 2 fase, di bawah
petroleum eter
keruh, di atas bening.
keruh, di atas bening. Ada endapan putih
4
Larutan
Larutan terpisah sempurna,
Terbentuk 2 fase, warnanya
disentrifugasi 30
endapan putih di bawah
bening
Larutan ditambah 3
Ada 2 fase, di atas bening,
Ada 2 fase, di atas bening,
mL aquades,
di bawah keruh dan ada
di bawah keruh.
dikocok
endapan.
Lapisan atas diambil
Tersisa sedikit cairan
Tersisa sedikit cairan
dan diuapkan
bening agak kuning
bening agak kuning
Larutan ditambah 4
Larutan berwarna hijau
Warna larutan jadi biru-
ml colour reagent
keruh
hijau keruh
Dimasukkan ke
Terdapat endapan di dasar
Terbentuk endapan biru
penangas air
tabung
kehijauan di bawah larutan
detik 5
6
7
8
hijau keruh. 9
Larutan ditambah 3
Ada 2 lapisan, atas agak
Bagian atas berwarna biru-
ml H2SO4 pekat
kuning, bawah bening.
hijau, ada endapan. Bagian bawah bening. Di tengah kuning muda.
10
Larutan
Bagian bawah bening, atas
Bagian atas hijau bening,
disentrifugasi
berwarna hijau kebiruan
bawah bening, dan tengah kuning-hijau.
11
Larutan disimpan di
Tidak ada perubahan
Tidak ada perubahan.
ruang gelap
9
2. Kurva kalibrasi No. 1
Perlakuan Ketiga tabung dipanaskan
Hasil Pengamatan Larutan menjadi lebih sedikit, warna larutan tetap bening
2
Larutan ditambah colour reagent
3
Larutan dipanaskan dalam penangas Terbentuk 2 fasa, endapan berwarna biru air
4
5
Larutan menjadi warna abu-abu
pucat dan larutan berwarna biru pucat
Larutan ditambahkan asam sulfat Terbentuk 2 fasa, biru pucat di atas dan pekat
bening di bawah
Larutan disentrifugasi
Terbentuk 3 fasa, biru pucat di tengah, dan bening di atas dan bawah.
3. Pengukuran dengan spektrofotometer UV Vis No.
Larutan yang diukur 1
A
Uji sampel •
Blanko
•
Serum kolesterol tinggi
•
Serum kolesterol rendah
0,044 2,5 0,017
2
Kurva kalibrasi •
Tabung I
•
Tabung II
•
Tabung III
0,094 0,989 1,88
10
F. ANALISIS DATA
1. Persamaan Reaksi
2. Perhitungan
a. Kolesterol volume 0.5 mL Kadar kolesterol standar = 1.25 mg Massa = V x kadar = 0.5 mLx 0.05 mg/mL = 0.025 mg
b. Kolesterol volume 1 mL Kadar kolesterol standar = 0.05 mg/mL Massa = V x kadar = 1.0 mLx 0.05 mg/mL = 0.05 mg
c. Kolesterol volume 2 mL Kadar kolesterol standar = 0.05 mg/mL Massa = V x kadar = 2.0 mLx 0.05 mg/mL petroleum eter = 0.1 mg
11
Kurva Kalibrasi
Dari kurva, diperoleh persamaan y = 20,14x – 0,140 Penentuan kadar kolesterol dalam serum 1. Pada serum kolesterol tinggi y
= 20,14x – 0,140
2,5
= 20,14x – 0,140
x
= 0,1311 mg
Jadi, kadar kolesterol dalam serum kolesterol tinggi adalah = 0,1311 mg/ 0,1 ml = 1,311 mg/ ml = 131,1 mg/ 100 ml
2. Pada serum kolesterol rendah y
= 20,14x – 0,140
0,017 = 20,14x – 0,140 x
= 0,0078 mg
Jadi, kadar kolesterol dalam serum kolesterol tinggi adalah = 0,0078 mg/ 0,1 ml = 0,078 mg/ ml = 7,8 mg/ 100 ml
12
G. PEMBAHASAN
Pada tubuh manusia, kolesterol terdapat dalam darah, empedu, kelenjar adrenal bagian luar (adrenal cortex) dan jaringan syaraf. Kolesterol adalah salah satu sterol yang penting dan terdapat banyak di alam yaitu pada hewan dan manusia. Kolesterol mempunyai gugus hidroksil yang terdapat pada atom C nomor 3 mempunyai posisi β oleh karena dihubungkan dengan garis penuh (Poedjiadi, 2007: 74-76). Kolesterol tidak larut dalam air karena adanya perbedaan kepolaran. Akan tetapi kolesterol larut dalam pelarut lemak dan sangat nonpolar seperti petroleum eter.
Gambar. Kolesterol Pada praktikum kali ini digunakan serum dengan kadar kolestrol rendah dan kadar kolestrol tinggi. Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari cara menentukan kadar kolesterol dalam serum. Percobaan dilakukan dengan mencampurkan serum kolesterol dengan alcohol. Alcohol berfungsi sebagai pelarut senyawa-senyawa polar yang tercampur dengan kolesterol dalam serum agar dapat terpisah dari kolesterol. Kemudian untuk melarutkan kolesterol, digunakan
petroleum eter. Setelah
dilakukan
pengocokkan
untuk
mendistribusikan
komponen-komponen ke pelarut masing-masing yang sesuai dengan kepolaran, terbentuk 2 fase yaitu lapisan pelarut nonpolar yang mengandung kolesterol pada bagian atas dan pelarut polar pada bagian bawah. Penambahan aquadest berfungsi untuk memperjelas pemisahan dari kedua fase yang telah dihasilkan. Campuran dipisahkan, lapisan bagian atas yang mengandung kolesterol dipisahkan dari senyawa-senyawa lain yang bersifat polar yang berada di lapisan bawah. Untuk mendapatkan kolesterol, pelarutnya diuapkan dalam penangas air penguapan dilakukan pada suhu 80 0C yang merupakan titik didih alkohol.. Sehingga tersisa kolesterol dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan colour reagent untuk membentuk warna karena dalam pengukuran kadar kolestrol ini menggunakan spektrofotometri UV-VIS dimana prinsip pengukurannya 13
yaitu adanya eksitasi elektron akibat terjadinya penyerapan zat berwarna. . Karena itulah dilakukan reaksi warna dengan menambahkan colour reagent dan asam asetat glacial. Colour reagent merupakan campuran antara FeCl3 dengan asam asetat glacial. Bila kolesterol direaksikan dengan asam asetat anhidrid dan asam sulfat pekat dalam lingkungan bebas air, maka akan terbentuk warna hijau-biru yang intens akibat pembentukan polimer hidrokarbon tak jenuh (Riani, 2011). Lalu ditambahkan H 2SO4 pekat untuk mengoksidasi sehingga mempercepat terbentuknya warna. Terjadi 2 lapisan yaitu bawah = kekuningan, atas = bening. Warna kuning ini merupakan bagian dari asam dengan flourosensi hijau bila dikenai cahaya (Poedjiadi, 2007: 75).Sebelum diukur absorbansinya, larutan disimpan dalam ruang gelap dikarenakan kolestrol sangat rentan terhadap cahaya. Kolestrol menjadi 7-dehidrokolestrol yang diubah menjadi vitamin D bila terkena sinar (Fessenden, 1986: 425) sehingga dengan penyimpanan ini yang diukur adalah kadar kolestrol, bukan kadar vitamin D. Dari hasil pengukuran didapatkan absorbans untuk kolesterol rendah sebesar 0,017 dan absorbans kolesterol tinggi sebesar 2,5. Penentuan kadar kolestrol dalam serum menggunakan kurva kalibrasi dari 3 larutan larutan standar kolestrol yaitu 125 mg%, 250 mg% dan 500 mg% dengan absorban masingmasing 0,094; 0,989; 1,88. Dari kurva kalibrasi tersebut menghasilkan persamaan garis y = 20,14x – 0,140. Dari hasil perhitungan, serum yang diduga mempunyai kadar kolestrol tinggi memiliki kadar sebesar 131,1 mg/100 mL dan 7,8 mg/100 mL untuk serum dengan kadar kolestrol rendah. Berdasarkan hasil praktikum kali ini, data yang diperoleh merupakan kolestrol dengan kadar rendah karena dalam darah manusia normal terdapat antara 150-200 mg tiap 100 ml darah (Poedjiadi, 2007: 76).
H. KESIMPULAN
Berdasarkan data hasil pengamatan, analisis data dan pembahasan, maka dapat disimpulkan: 1. Pada praktikum ini menentukan kadar kolesterol dalam serum yaitu dengan mengukur nilai absobansinya menggunakan spektrofotometri UV-VIS. 2. Pemisahan kolesterol dari serum untuk mendapatkan kolesterol murni menggunakan prinsip ekstraksi pelarut.
14
3. Alcohol berfungsi sebagai pelarut senyawa-senyawa polar yang tercampur dengan kolesterol dalam serum agar dapat terpisah dari kolesterol. 4. Petroleum eter merupakan pelarut organic yang digunakan untuk melarutkan kolesterol. 5. Penambahan colour reagent untuk membentuk warna karena dalam pengukuran kadar kolestrol ini menggunakan spektrofotometri UV-VIS. 6. Penambahan H2SO4 pekat untuk mengoksidasi sehingga mempercepat terbentuknya warna. 7. Serum yang diduga mempunyai kadar kolestrol tinggi memiliki kadar sebesar 131,1 mg/100 mL dan 7,8 mg/100 mL untuk serum dengan kadar kolestrol rendah. 8. Dari data yang diperoleh merupakan kolestrol dengan kadar rendah karena dalam darah manusia normal terdapat antara 150-200 mg tiap 100 ml darah.
DAFTAR PUSTAKA 15
Fessenden, Ralp J. dan Joan S. Fessenden. 2009. Kimia Organik Jilid 2 . Jakarta: Erlangga. Murray, Robert K. 2003. Biokimia Harper . Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Poedjadi, Anna dan F. M. Supriyanti. 2007. Dasar-Dasar biokimia. Jakarta: UI Press. Riani, Rahmah Adha. 2011. Pemeriksaan Glukosa Darah. Sudarma, I Made. 2009. Kimia Bahan Alam. Mataram: FMIPA Press.
16
