Martínez y Navarro (2003). El Cultivo Celular en La Investigación Básica Del Cáncer de Mama

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REVISIONES

El cultivo celular en la investigación básica del cáncer de mama Pedro Antonio Martínez-Carpioa y Miguel Ángel Navarro Morenob aDepartamento de Biología Celular y

Fisiología. Facultad de Medicina. Universidad Autónoma de Barcelona. Hospital Universitario Germans Trias i Pujol. Badalona. Barcelona. bSección de Bioquímica Hormonal y Génica. Servicio de Bioquímica. Ciudad Sanitaria y Universitaria de Bellvitge. L'Hospitalet de Llobregat. Barcelona.

La técnica del cultivo celular es la que ha permitido conocer el comportamiento in vitro de las células cancerosas. En esta revisión pretendemos introducir las peculiaridades básicas del cultivo celular, referido especialmente a líneas cancerosas mamarias, relacionar el origen de las líneas celulares más utilizadas en la investigación de este cáncer, mencionar las técnicas de laboratorio que pueden aplicarse sobre estos cultivos y ejemplificar la utilidad de las mismas, tomando como modelo diversos trabajos que estudian los efectos del factor de crecimiento epidérmico sobre líneas celulares hormonoindependientes de cáncer de mama. Palabras clave:

cultivo celular, líneas celulares, cáncer

de mama.

Cell culture in breast cancer basic research

The technique of cell culture has made it possible the knowledge of in vitro behavior of cancerous cells. In this review we present the fundamentals of cell culture with a special reference to mammary cancerous lines; the origin of cell lines used most frequently in cancer research; the laboratory techniques that can be applied on these cultures; and examples of the usefulness of these techniques according to the models of various studies that evaluate the effects of epidermal growth factor on hormone-independent cell lines of breast cancer. Key words: cell culture, cell lines, breast cancer.

Martínez-Carpio PA, Navarro Moreno MA. El cultivo celular en la investigación básica del cáncer de mama. Rev Oncol 2003;5(4):184-91.c

INTRODUCCIÓN AL CULTIVO CELULAR: ASPECTOS TÉCNICOS Y CONCEPTUALES

Los primeros cultivos de los que se dispone de información datan de 1907, cuando Harrison cultivó en un coágulo linfático médula espinal de anfibio. En realidad se trataba de explantes, es decir, fragmentos de te jido cultivados sin la separación celular propia de los cultivos actuales. No es hasta principios de la década de los setenta cuando se depura la técnica de cultivo y se produce una desbordante irrupción de publicaciones cuyos resultados se basan en el cultivo celular. Al igual que en otros tipos de cáncer, los principales conocimientos in vitro que tenemos sobre el cáncer de mama se basan en esta técnica. En este apartado nos centramos en resumir los aspectos esenciales de la misma1,2. La mayoría de células de vertebrados en cultivo muere al cabo de un determinado número de divisiones.

Received 30 October 2002; Revised 9 January 2003; Accepted 16 January 2003.

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A veces, alguna de estas células sufre algún cambio genético que la hace realmente inmortal y prolifera indefinidamente (célula variante inmortal) si se mantiene en un cultivo bajo unas condiciones adecuadas, constituyendo una línea celular. Los cultivos de células cancerosas tienen algunos aspectos diferenciales si los comparamos con cultivos de células normales. Por ejemplo, muchas veces ocurre que estas células cancerosas pueden crecer sin fijarse a ninguna superficie y proliferan en una placa de cultivo hasta una densidad mucho mayor que las células normales. En ciertos casos estas propiedades de las células neoplásicas pueden inducirse en células normales, transformándolas con un virus o con sustancias químicas mutagénicas, constituyéndose una línea celular transformada. Esta línea celular transformada es capaz de provocar tumores si es inyectada a un animal de experimentación. Las líneas celulares en cultivo, transformadas o no, tienen gran interés ya que permiten obtener cantidades ingentes de células del mismo tipo y además porque pueden conservarse en nitrógeno líquido a -196°C durante un período indefinido de tiempo, siendo perfectamente viables una vez descon-

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geladas. No obstante, es importante reconocer que las células de ambos tipos de líneas celulares casi siempre difieren de las células progenitoras de los tejidos de las que derivan, y a veces, en características importantes. A pesar de que todas las células de una línea celular son muy similares entre sí, a menudo no son idénticas. La uniformidad genética de una línea celular puede mejorarse con el clonaje celular, mediante el cual se aísla una única célula y se le permite proliferar hasta obtener una colonia de células idénticas. Esto posibilita obtener líneas celulares mutantes con defectos en determinados genes. Estas células pueden tener defectuosa alguna proteína concreta, por lo que pueden revelarse algunas funciones de la misma si estudiamos tales células. En resumen, podemos decir que los subcultivos de una línea celular pueden resultar en una pérdida en el número de células y extinción del cultivo (línea celular finita), o bien una viabilidad indefinida de los mismos (línea celular continua o transformada). Cabe en esto una apreciación para diferenciar el término de cultivo inmortal de cultivo transformado, pues hay líneas celulares inmortalizadas que no presentan características tumorales y que generalmente se refieren como “transformadas”. Las líneas celulares continuas o inmortales normalmente presentan alteraciones citomorfológicas características: tamaño celular menor, menor adherencia, más redondeadas, mayor relación núcleo/citoplasma y sobre todo un incremento en la tasa de proliferación celular, una reducción del tiempo de doblaje, menor dependencia de suero en el medio de cultivo y más facilidad para crecer en suspensión. Se asume que estas líneas inmortales aparecen por anomalías cromosómicas (alteraciones en el apareamiento cromosómico, traslocaciones, no disyunciones parciales o totales o mutaciones puntuales), pero nadie ha podido descartar la preexistencia de células inmortales en tejidos cancerosos. En ellas es frecuente encontrar mayor heteroploidicidad (variaciones cromosómicas entre células) y aneuploidicidad1-4. Los cultivos preparados directamente a partir de tejidos son los denominados cultivos primarios. Las células de éstos pueden recuperarse de la placa de cultivo y utilizarse para formar un gran número de otros cultivos, denominados secundarios. De este modo las células pueden ser subcultivadas repetidamente durante semanas o meses. A menudo estas células muestran propiedades diferenciadas típicas de sus orígenes: los fibroblastos continúan segregando colágeno y las células epiteliales forman láminas extensas con muchas de las propiedades del epitelio intacto. Los cultivos primarios habitualmente son heterogéneos y de crecimiento lento, pero son más representativos del tejido original del que derivan, ya que expresan muchas de las propiedades del mismo. Sin embargo, los cultivos primarios carecen de algunos tipos celulares presen00

tes en el tejido original, que son incapaces de sobrevivir in vitro. Además, a medida que proliferan los cultivos primarios pierden aquellas células de crecimiento más lento. Por ello, en las fases precoces de los cultivos primarios es cuando debe separarse el tipo celular que interesa estudiar. Subcultivando a partir del cultivo primario obtenemos cultivos secundarios, de los que pueden obtenerse líneas celulares de gran uniformidad que proporcionan un gran número de células para estudio. No obstante, las líneas celulares procedentes de cultivos primarios pueden diferir en algunas propiedades de las células originales1-3. El medio de cultivo constituye el medio extracelular en condiciones in vitro y contiene los nutrientes necesarios para la proliferación de las células, permitiendo a la célula un constante intercambio de moléculas y electrólitos. Para cultivos rutinarios es frecuente utilizar medios líquidos que contienen sales, glucosa, aminoácidos, vitaminas y, muchas veces, proporciones mal definidas de macromoléculas en forma de suero de caballo, suero fetal de ternera, etc. Evidentemente estos medios son inadecuados para estudiar las necesidades de macromoléculas que un tipo celular determinado tiene para proliferar y funcionar normalmente. Esto ha conducido al desarrollo de medios definidos químicamente y libres de suero. Estos medios contienen moléculas imprescindibles para la célula (glucosa, aminoácidos, etc.), pero generalmente es necesario suplementarios con algunas proteínas como la insulina o algunos factores de crecimiento que estimulan la proliferación, o la transferrina, que transporta hierro al interior de las células. Estos suplementos pueden variar en función de las características de las células cultivadas. La mayoría de moléculas señalizadoras proteicas extracelulares esenciales para la supervivencia y proliferación de determinados tipos de células se han descubierto a través de estudios en cultivos celulares y la búsqueda de nuevas moléculas ha sido enormemente facilitada por la asequibilidad de los medios definidos químicamente y libres de suero. Los constituyentes habituales de un medio típico adecuado para el cultivo de líneas mamarias incluyen: 1) Aminoácidos: valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano, treonina, cisteína, glutamina, arginina, lisina, histidina, tirosina. Todos los aminoácidos se encuentran en forma levogira (L) y la mayoría se utilizan a concentraciones de 0,1 a 0,2 µM. 2) Vitaminas: biotina, colina, folato, nicotinamida, pantotenato, piridoxal, tiamina, riboflavina. Las concentraciones habituales en el medio son unas 100 veces menores que las de los aminoácidos, esto es, del orden de 1 µM. 3) Sales minerales: NaCl, KCl, NaH2PO 4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2. 4) Penicilina y estreptomicina: para inhibir el crecimiento o contaminación bacteriana.

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5) Anfotericina B: para inhibir el crecimiento o contaminación fúngica. 6) Rojo fenol: es un indicador de pH y se utiliza para observar variaciones de color en el caso que nos ale jemos del pH fisiológico (pH=7,4). 7) Glucosa: se utiliza a concentraciones de 5 a 10 mM, y es imprescindible en todos los cultivos. En el caso de medios definidos químicamente libres de suero se añade generalmente insulina, transferrina y factores de crecimiento específicos o, más frecuentemente, se adiciona suero, generalmente de caballo o ternera, hasta formar el 10% del volumen total para permitir un crecimiento prolongado y nutrido de los cultivos. Generalmente los cultivos se mantienen en recipientes de plástico o de vidrio, con una superficie preparada adecuadamente, que permite la adhesión de las células. Los recipientes se conservan en una estufa de cultivo a 37°C, en una atmósfera con un de 5% de CO 2 y un 95% de aire. El utilizar suero como medio de cultivo tiene el inconveniente que para la mayoría de células éste no es el fluido fisiológico con el que toman contacto en el tejido que constituyen en condiciones normales. Además, el suero contiene agentes potencialmente citotóxicos, sobre todo el suero fetal de ternera y el suero humano de gestante, que presentan elevadas concentraciones de la enzima poliamina oxidasa, que al actuar sobre las poliaminas generadas por las células en rápida división puede facilitar una síntesis importante de poliaminoaldehídos, altamente tóxicos para los cultivos de este tipo de células cancerosas, que acaban distorsionando los resultados obtenidos. Además existen grandes variaciones en los constituyentes entre los distintos lotes de suero que en muchos casos puede obligar a determinar factores u hormonas para verificar una mínima homogeneidad, con el coste económico adicional que esto supone. Algunas veces, incluso cuando se utiliza suero, es necesario añadir o suplementar algún factor u hormona, según los requerimientos del tipo de célula cultivado. Las principales ventajas de utilizar medios libres de suero definidos químicamente o medios bajos en suero radica en una mejor reproducibilidad de los cultivos, menor riesgo de contaminación, se evita la citotoxicidad del suero y, sobre todo, permiten purificar productos del medio de cultivo que sintetizan las propias células. El inconveniente de estos medios es que la mayoría de veces se precisa suplementarios con hormonas o con factores de crecimiento que deben implementarse adicionalmente. Además estos medios artificiales son bastante específicos del tipo de línea celular que se desea estudiar, y a veces es necesario trabajar con varios tipos de estos medios. Así pues, el uso de medios artificiales resulta caro, pero permite controlar en parte las condiciones del cultivo y a la vez evitar la incertidumbre en la composición de los sueros animales1-3. 186

LÍNEAS CELULARES CATALOGADAS PROCEDENTES DE TEJIDO MAMARIO HUMANO CON FINES EXPERIMENTALES: CLASIFICACIÓN, NOMENCLATURA Y AISLAMIENTO. Para la investigación del cáncer de mama humamo se dispone de una amplia variedad de líneas celulares obtenidas tanto de animales de experimentación como de pacientes. Aunque ciertos investigadores cultivan líneas propias no comercializadas (se comentará luego cómo se aisla una de estas líneas), la mayoría de trabajos se realizan en líneas catalogadas que se comercializan básicamente en Estados Unidos. Disponemos de información de 33 de estas líneas, 22 de ellas aisladas en la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland) y 11 en el Arizona Can- cer Center, College of Medicine de la Universidad de Arizona (Tucson, Arizona) Alrededor de un 85% de ellas son derivadas de carcinomas intraductales4. El resto derivan de carcinomas ductales con componente papilar, medular o lobular, una línea celular de Cys- tosarcoma phyllodes y 4 líneas celulares de tejido normal de mama. Una primera gran clasificación permite conocer si la línea celular ha sido obtenida del tumor primario o bien de una metástasis (tabla 1). Cultivos a corto plazo de tejidos cancerosos procedentes de cánceres de mama humano son relativamente fáciles de obtener utilizando varios medios5,6; pero mantener estas células un tiempo suficiente para obtener alguna línea celular inmortal es realmente difícil, ya que ello obedece a un hecho fortuito y ocasional tras múltiples intentos de cultivo más o menos prolongado en diferentes medios, pues parece que la posibilidad de obtener estas células inmortales ocurre sólo en fases avanzadas del tumor primario, cuando ya ha producido metástasis al menos a ganglios linfáticos7. TABLA 1. Líneas celulares de tejido primario Carcinoma intraductal

BT-20, CaMa, BTM-1, BOT-2, BT-483, YMB-1, CAL-18A, CAL-18B, Ca2-83, VHB-1, 21NT, VACC-812, VACC-893, 8701-BC, 21PT Carcinoma ductal con componente papilar

BT-549 Carcinoma ductal con componente medular

HMT-390951, HTN-390958 Tejido mamario sano

Hs57Bst, HBL-100, HMT-352, MCF-10 Carcinosarcoma

Hs578T Cystisarcina phyllodes

RW-972

Líneas celulares obtenidas de tejido mamario primario (tabla 1) Entre los tipos histológicos más frecuentes destacan: 1) Líneas celulares de carcinoma intraductal: en cul-

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MARTÍNEZ-CARPIO PA Y NAVARRO MORENO MA. EL CULTIVO CELULAR EN LA INVESTIGACIÓN BÁSICA DEL CÁNCER DE MAMA TABLA 2. Líneas celulares obtenidas de matástasis Metástasis a tejidos sólidos

AlAb (pulmón), MDA-MB-361 (cerebro) Du4475 (piel), vacc-2436 (pubis) Metástasis a líquido pleural

De carcinoma intraductal MCF-7, MDA-MB-134VI, MDA-MB-415, MDA-MB-435s, T47D, ZR-75-27, MDA-MB-468, EFM-19, EP, MW, 600 PE, 21-MT-1, 21MT-2, MFM-223, VACC-245, VACC-265, VAVV-1179 De carcinoma papilar MDA-MB-175VII, DMC-42 De adenocarcinoma SK-BR-3, MDA-MB-436, MDA-MB-453 De carcinoma medular MDA-MB-231 De carcinoma lobular MDA-MB-330 Metástasis a líquido ascítico

De carcinoma intraductal ZR-75-1, ZR-75-30

tivo forman cúmulos o colonias de células epiteliales muy compactos en los cuales es difícil visualizar la estructura interna de las células. Son células con núcleo de gran tamaño, una relación núcleo/citoplasma elevada y presentan varios nucleolos. Generalmente no forman una completa monocapa. 2) Líneas celulares de carcinoma ductal con componente papilar: sólo una línea celular (BT-549) ha sido aislada de tejido canceroso primario tipificado como carcinoma papilar intraductal. Forma monocapa en cultivo. 3) Líneas celulares de carcinoma ductal con componente medular. 4) Tipos histológicos menos frecuentes4. Líneas celulares obtenidas de tejido metastásico (tabla 2) Son bastante más fáciles de obtener que en el caso de los tumores primarios, especialmente cuando las metástasis son a líquido pleural, y en general son mucho más heterogéneas que las obtenidas del tumor primario. Se clasifican en función de la localización metastásica a partir de la cual han sido aisladas4. Es de destacar la utilización de células primarias senescentes del epitelio mamario, como las HMEC (human mammary epitelial cells) , que generalmente se utilizan como control cuando se estudia alguna de las líneas referenciadas. Luego se comentarán estas células con más detalle. A pesar de la dificultad para obtener líneas celulares mamarias, hemos enumerado una lista importante, pero debemos tener en cuenta que han sido aisladas a lo largo de muchos años, desde 1958 en que Lasfargues y Ozzello aíslan la línea BT-208 hasta 1992 en que Leibovitz y Massey aíslan la UACC-11799. De todas estas líneas, sólo algunas han sido profundamen00

te investigadas desde el punto de vista de su dependencia hormonal, de los receptores de membrana para diferentes factores de crecimiento, de la acción mitogénica o antimitogénica de éstos, etc. Probablemente cuando ha interesado estudiar células cancerosas hormonodependientes la línea celular más utilizada ha sido la MCF-7, mientras que uno de los prototipos más utilizados para el estudio de células hormonoindependientes ha sido la línea MDA-MB231, y más recientemente la MDA-MB-468, sobre todo en Europa. Nomenclatura y aislamiento de las líneas celulares Cuando se empieza a trabajar con alguna línea celular muchas veces nos preguntamos a qué se deben las siglas y los números. La realidad es que tal nomenclatura es muy heterogénea y puede responder a las iniciales de quien la aisló, a una entidad, hospital o fundación concreta, y en muchos casos resulta difícil llegar a conocer el significado al consultar en la bibliografía científica. La serie MCF, una de las más corrientes, se debe a las iniciales de la institución Mi- chigan Cancer Foundation . La historia de la nomenclatura de la serie MDA-MB resulta cuanto menos curiosa. Nos centramos en la línea MDA-MB-231. Durante 1973, Cailleau et al. ( Anderson Hospital y Tu- mor Institute , Houston, Tejas) aíslan tres líneas celulares a partir de derrames pleurales de pacientes con cáncer de mama avanzado. Descubren que los derrames pleurales son una excelente fuente de células tumorales mamarias por la alta viabilidad que presentan éstas en el líquido pleural y por la ausencia de fibroblastos en cocrecimiento. Además, la posibilidad de separar estas células de otras contaminantes resultaba sencillo por la gran diferencia en la fuerza de adhesión al frasco de cultivo. Previamente estos autores no habían sido capaces de aislar ninguna línea celular a partir de tumores sólidos de mama; ni siquiera utilizando más de 200 muestras diferentes. Las células procedentes de éstas sobrevivían días, o como mucho meses, ya que acababan invadidas por fibroblastos o bien degeneraban y morían. La línea celular MDA-MB-231 se estableció a partir de una única muestra de un derrame pleural, obtenida el 17 de octubre de 1973 de una mujer de 51 años a la que habían practicado una mastectomía radical derecha en enero de 1969. El estudio anatomopatológico de la pieza tumoral indicaba carcinoma indiferenciado con componente ductal y papilar. Además, la paciente presentó un carcinoma intraductal. En junio y julio de 1973 presentó, respectivamente, derrame pericárdico y derrame pleural izquierdo. Ambos contenían células malignas compatibles con carcinoma primario de mama. Tanto la ovariectomía, practicada el 3 de julio de 1973, como la terapia subsiguiente, con 5-FU y prednisona, fueron ineficaces. La poliquimio-

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terapia (ciclofosfamida, adriamicina y ametofterina), iniciada en septiembre de 1973, tampoco fue beneficiosa. El 21 de diciembre ingresó en el hospital donde fueron precisas varias toracocentesis. La enferma murió el 13 de enero de 1974, en la habitación 231, del edificio principal (Main Building) del Hospital Anderson, en Houston. En recuerdo a dicha paciente se denominó así esta línea. La muestra del drenaje era hemática y contenía muchas células tumorales que mostraron una viabilidad del 40%. Las células fueron lavadas, concentradas y sembradas en diferentes medios. En pocas semanas se conseguía aislar la línea MDA-MB-231. Estas células se habían mantenido en cultivo desde el 17 de octubre de 1973 hasta la fecha en que los autores enviaron a publicar sus hallazgos10. Aunque sólo habían transcurrido 7 meses, la consideraron una línea celular por su uniformidad y rápido crecimiento, así como por la gran rapidez con que estas células producían nódulos tumorales cuando se inyectaban al ratón. Estudios de estos tumores eran compatibles con adenocarcinoma mamario humano, lo que indicaba que esta línea celular procedía de un tumor de origen mamario. Las características de crecimiento de estas células, el hecho de ser aisladas a partir de metástasis a pleura y su rápida propagación a través del líquido pleural, hacía suponer que se trataba de células mutantes de gran actividad metabólica y con gran capacidad de adaptación. Las células inicialmente aisladas, a pesar de su rápido crecimiento, permanecían con forma redondeada, con gran adherencia a las células vecinas y con pocos desmosomas, con una alta relación núcleo-citoplasma y con un número de cromosomas próximo a triploide (entre 60 y 70). Constituían el paradigma de una célula altamente tumoral y con gran potencial metabólico. El comportamiento de estas células hacía apasionante su estudio y, comercializadas desde hace muchos años y hasta el día de hoy por la ATCC, pueden considerarse sin duda unas de las más investigadas en cáncer de mama. Trabajos posteriores indicarían que estas células no poseen receptores de estrógenos y que pueden crecer sin éstos. En esta línea se ha comprobado una altísima actividad transcripcional tanto para diversos factores de crecimiento como para sus receptores, lo que hace pensar que el crecimiento rápido y autónomo que presentan se debe en gran medida a mecanismos autocrinos10,11. TÉCNICAS DE LABORATORIO APLICABLES A LOS CULTIVOS. UN EJEM PLO: ACCIONE S DEL FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO SOBRE LÍN EAS CELULARES MAMARIAS HORMONOINDEPENDIENTES Como ocurre en otros tipos de cáncer, la mayor información sobre el comportamiento de las células tumorales mamarias se ha obtenido a través del estudio de 188

los cultivos celulares, sobre los cuales pueden aplicarse una gran variedad de técnicas de laboratorio, que incluyen sobre todo procedimientos habituales en inmunología, hematología, bioquímica y genética molecular y anatomía patológica. Con estas técnicas puede estudiarse el crecimiento y proliferación de los cultivos, la morfología celular y sus características bioquímicas, en especial lo que concierne a receptores de membrana y mecanismos de señalización intracelular. En la gran mayoría de casos los experimentos consisten en manipular de modo exógeno determinados cultivos y compararlos con los controles, que se dejan crecer espontáneamente, facilitando únicamente los requerimientos precisos para el crecimiento del cultivo. De este modo se han llevado a cabo numerosos estudios farmacológicos y de toxicidad, y se ha analizado el efecto de hormonas y de muchos factores de crecimiento11-16. Para evaluar el crecimiento celular, las células son tripsinizadas para arrancarlas de la placa de cultivo y contarlas utilizando procedimientos citométricos (cámara de Neubauer), con recomprobaciones con otros métodos (hemocitómetro), calculando e tiempo de doblaje mediante transformación logarítmica de los datos y contrastando los resultados con técnicas que miden proliferación o apoptosis ([ 3H]timidina, fragmentación de ADN, BrdU-HRP, cdkl, Fas, bcl-2, WAF-1, p53, NMPCD, etc., generalmente mediante ELISA). Una vez efectuado el recuento para conocer el efecto de un factor o fármaco sobre la proliferación (efecto mitógeno o antimitógeno), pueden analizarse las células individualmente y también lisarse para estudiar su contenido intracelular. A partir de aquí, se utilizará la técnica que permita analizar nuestros objetivos, siempre que sea posible utilizando la más precisa al efecto. Entre las más empleadas en el área de la investigación molecular del cáncer de mama destacan las relacionadas con las sondas genéticas (marcaje, purificación, electroforesis), el clonaje celular, todas las técnicas que estudian la expresión de los genes (hibridación in situ , Northern blot , análisis de transcritos por protección de nucleasa y ribonucleasa, Dot y Slot blotting , análisis de transcritos por reacción en cadena de la polimerasa [PCR], transferencia de cADN, técnica del radiorreceptor, métodos inmunoquímicos e inmunohistoquímicos, etc.), diversos tipos de hibridación molecular (in situ y en fase líquida) y finalmente todas las técnicas destinadas a analizar el genoma (Southern , análisis mutacional, etc.)11. Los procedimientos inmunoquímicos que cuantifican factores de crecimiento en el medio de cultivo, empleados ampliamente en el campo de la Inmunología y Hematología se han utilizado muy poco hasta el momento para el estudio in vitro del cáncer de mama, pero pensamos que se incorporarán en mayor medida en un futuro próximo, ya que el perfeccionamiento metrológico alcanzado permite utilizar también estas

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técnicas en los cultivos13,14. Recientemente hemos comprobado en nuestro laboratorio que estos mismos procedimientos inmunoquímicos (especialmente radioinmunoanálisis [RIA] y ELISA) pueden utilizarse para medir proteínas de señalización intracelular tan importantes como la p21 o la p53, así como para comprobar el efecto sobre las mismas, tanto de factores de crecimiento como de quimioterápicos 15,16. Cada una de estas técnicas se aplica con finalidades concretas y la gran mayoría de ellas se utilizan de modo común para estudiar hormonas, fármacos, factores de crecimiento y receptores de membrana para todos ellos. Para conexionar estas técnicas de laboratorio con el significado fisiológico de lo que quiere buscarse resulta útil centrarse en un factor o en una hormona y en una línea celular concreta, analizando los diversos estudios existentes. Por ello pensamos que antes de diseñar un experimento utilizando cultivos resulta muy útil centrarse en una línea celular concreta y en un factor de crecimiento o un fármaco específico. Podrá comprobarse que prácticamente todas las técnicas citadas han sido estudiadas para la mayoría de quimioterápicos comercializados y para la mayoría de factores de crecimiento, al menos para el factor de crecimiento epidérmico (EGF), descubierto por el premio Nobel de Medicina, Stanley Cohen, hace justamente 40 años. Para ejemplificar el caso, facilitamos una bibliografía sobre algunos de los trabajos más interesantes de cultivo celular que estudian el efecto del EGF sobre la líneas celulares mamarias hormonoindependientes, junto al objetivo principal planteado. La lectura atenta de los materiales y métodos de estos estudios y el relacionarlos con el objetivo propuesto y los resultados obtenidos permite comprender perfectamente cómo se correlacionan las técnicas aplicadas con lo que se busca en cada caso. Estos trabajos no han sido escogidos al azar, sino que se caracterizan por utilizar procedimientos de medida diferentes, evidenciándose algunos resultados discrepantes entre ellos que objetivan la dificultad de aplicar ciertas metodologías para determinados objetivos. ANÁLISIS POR OBJETIVOS DE LA FISIOLOGÍA CELULAR DEL EGF EN LÍNEAS MAMARIAS HORMONOINDEPENDIENTES Osborne K et al17: proliferación celular. Imai Y et al18: correlación entre actividad mitogénica y unión ligando-receptor y relación dosis exógena de EGF y efecto mitogénico. Fitzpatric SL et al19: caracterización del EGFR. Zajchowski D et al20: expresión transcripcional. Veber N et al21: proliferación celular. Armstrong DK et al22: inducción de apoptosis. Yarden RI et al23: relación EGFR/estrógenos. Buik RN et al24: estudio de transducción de señal. 00

Kaplan O et al25: toxicidad sobre el metabolismo de la glucosa. Hamburger AW26: regulación de la expresión EGFR. Dong XF et al27: correlación entre actividad mitogénica y unión ligando-receptor. Sheick MS et al28: regulación EGFR por el TGF- α (análogo del EGF). Geier A et al29: EGF como interferente en la acción de la actinomicina D. Godden J et al30: proliferación celular. Mueller H et al31: transducción de la señal. Martínez-Carpio PA et al14: cuantificación de la secreción constitutiva. A diferencia de otros tipos de cáncer el estudio in vitro de líneas celulares de cáncer de mama es muy deficitario en nuestro país. La gran mayoría de los trabajos se ha llevado a cabo en Estados Unidos, y mucho menos en algunos países europeos, especialmente en Gran Bretaña y Francia. El coste económico es alto y el rendimiento a corto plazo aparentemente sólo descriptivo y sin utilidad clínica. Pero cabe no olvidar que el cáncer de mama es el más mortal en la mujer, y que todos los esfuerzos que se llevan a cabo para conocer mejor el funcionamiento de este tipo de células cancerosas continúa siendo todavía insuficiente en nuestro ámbito. Cuando se empezó a estudiar la fisiología celular del EGF en en cáncer de mama, pocos preveían en aquel momento las aplicaciones clínicas que este factor tiene ya en estos momentos, en que por ejemplo la determinación de su receptor en muestras tumorales se correlaciona estrechamente con el pronóstico del tumor, lo que hace que tal determinación sea ya necesaria en los grandes hospitales32. Además, la posibilidad de intervenir terapéuticamente sobre el EGF, EGFR o sobre algún intermediario implicado en su mecanismo de señalización intracelular constituye una esperanza real de futuro para combatir el cáncer de mama. En este sentido, el ensayo de anticuerpos monoclonales (de ratón y humanos) contra el EGFR viene siendo una dedicación absoluta por parte de ciertos laboratorios en todo el mundo. La utilización de fármacos y/o anticuerpos monoclonales dirigidos contra el receptor de EGF (EGFR) se prevé como uno de los arsenales terapéuticos más esperanzadores contra el cáncer de mama33-39. Las líneas celulares senescentes tienen también gran interés. Estas células pierden su capacidad proliferativa o mitógena, presentan gran tamaño celular, forma aplanada y marcadores enzimáticos específicos (SAβ-galactosidasa, inactivación de la p16 y p53, acortamiento de los telómeros, etc.). Trabajos importantes parten del estudio de las células HMEC, sobre todo del proceso epigenético que conduce a la activación de la telomerasa en estas células senescentes, los cambios moleculares que se acompañan y el modo en que se dirigen a estados senescentes o inmortaliza-

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dos. Se han encontrado importantes relaciones con las ciclinas-cdk y otros intermediarios del ciclo celular, especialmente la Cdk2, p21 y p5340-42, pero las conclusiones globales son complejas dado los incontables puntos de regulación que interactúan. Tenemos aceptado un trabajo de inminente aparición donde se revisan de modo sencillo las bases actuales del ciclo celular, centrando el tema en las ciclinas-cdks y las proteínas 21 y p5316. Los grandes avances en el cáncer los debemos a investigadores que desde hace décadas, y utilizando el cultivo celular, han estudiado mecanismos fisiológicos y patológicos en el comportamiento de las líneas celulares. Estos investigadores han sido en su mayor parte eminentemente clínicos, pero han tenido que esforzarse para introducirse en el complejo mundo de la investigación básica y de la metodología del laboratorio. En nuestro país, para el oncólogo, la experimentación clínica (a partir de datos clínicos, o de laboratorio, obtenidos de pacientes) supone un importante reto, pero fácil de asumir ya que no se escapa de su terreno. La experimentación más básica, donde se necesitan complejas técnicas para manipular las células, precisa de una formación específica y complementaria a la que, sólo dedicando tiempo, alcanza a comprender al nivel necesario para efectuar novedosos descubrimientos. Los resultados de éstos no los podrá aplicar sobre ninguno de sus pacientes (eso es terreno de la investigación clínica), pero favorecerá sin duda futuros avances de los que se aprovecharán futuros clínicos, y en definitiva el paciente. Con esta revisión hemos pretendido acercar al oncólogo clínico de nuestro país el estudio de las líneas celulares en la investigación básica del cáncer de mama, cuya contribución a la literatura científica internacional en este campo es todavía escasa en España, y que pensamos debe potenciarse tanto por parte de los médicos que trabajan en el laboratorio (bioquímicos, microbiólogos, hematólogos, anatomopatólogos, inmunólogos, etc.), como de los oncólogos que, idealmente, deberían involucrarse más directamente en la investigación básica, tal como ocurre en los países científica y tecnológicamente más adelantados en la investigación oncológica. Bibliografía 1. Doyle A, Griffiths JB, Newell DG. Cell and tissue culture: laboratory procedures. New York: John Wiley and Sons Ltd, 1995. 2. Alberts B, Bray D, Lewis J, et al. Biología Molecular de la Célula. 3ª ed. Barcelona: Ediciones Omega, 1996. 3. Freshney RI. Animal cell culture: a practical approach. Oxford: IRL Press Ltd, 1989. 4. Hay RJ, Park JG, Gazdar A. Atlas of human tumor cell lines. Academic Press, Inc, 1994. 5. Feller WF, Stewart, Kantor J. Primary tissue explants of human breast cancer. J Natl Cancer Inst 1972;48:111720. 190

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