MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE HEMATOLOGIA
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CARLOS ARMANDO ESQUECHE ANGELES Biologo – Microbiologo C.B.P. 3913 2011
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TOMA DE MUESTRA
Se elige la vena que favorece la toma de la muestra, preferiblemente de la región venosa antecubital, porque a este nivel la piel es fina y móvil y las venas son de grueso calibre y relativamente superficiales. Cuando este lugar no favorece para la punción, se observan otras venas como de la mano o de la cara anterior del antebrazo. ♦ El personal encargado de la toma de muestras se colocara los guantes de látex, previo lavado de las manos. venas no son muy superfic superficiales iales se coloca coloca un torniqu torniquete ete 5cc ♦ Si las venas arriba del sitio elegido para puncionar, se le pide al paciente que empuñe la mano y si es necesario se frota suavemente suavemente con la mano de de quie quien n va a punc puncio iona narr el luga lugarr de la vena vena eleg elegid ida. a. Si la vena vena es superficial solo se le pide al paciente que empuñe la mano. Una vez vez eleg elegid idaa el área de punció punción n se este esteri rili liza za con algod algodón ón ♦ Una empapado con alcohol antiséptico, se emplea jeringa desechable y se procede a la punción. ♦ La cinta elástica debe retirarse después de introducida la aguja en la vena vena,, se aspi aspira ra la sang sangre re con con la jeri jering ngaa y una una vez vez reti retira rada da,, se presionará la zona puncionada con un algodón empapado en alcohol antiséptico. tomar únicamente para para exámenes de hematología, se ♦ Cuando se va a tomar toman 2cc de sangre, cuando además el paciente tiene orden para exámen exámenes es de química química clínica clínica y/o inmuno inmunolog logía ía se toman toman 5cc. La mues muestr traa para para CH se almac lmacen enaa en los los tubo ubos tap tapa lila lila que que son son previamente organizados y deben contener 2 gotas de de EDTA. ♦
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FROTIS SANGUINEO Y COLORACION
Para el frotis sanguíneo se emplea el método de los dos portaobjetos: ♦ Identificar la lámina. ♦ Colocar una pequeña gota de sangre no más de 3 mm de diámetro de un portaobjetos a 2 cm de uno de los extremos. ♦ Colocar el canto de otro portaobjetos, por la parte anterior a la gota de sangre sangre,, sobre sobre la superf superfici iciee del primer primer portao portaobje bjetos tos,, forman formando do un ángulo de 45 grados y desplazarlo suavemente hacia atrás, hasta que alcance la gota de sangre. rar que por capilarid ridad toda la sangre se distrib ribuya ♦ Esperar uniformemente, es aconsejable que la sangre no llegue a los lados del portaobjetos, sobre el que que se realiza la extensión. portaobjetos sobre el ♦ Deslizar suavemente y a velocidad moderada un portaobjetos otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida, sobre la superficie del primer portaobjeto. El grosor del frotis sanguíneo puede variar de acuerdo al ángulo empleado durante la extensión, si es superior a 45° será gruesa y corta y si es inferior será larga y fina. Se deja secar a temperatura temperatura ambiente y en en posición horizontal.
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Para la coloración, una vez seco el extendido no se deja pasar más de una hora: ♦ Se aplica 1 cm colorante de Wright por 1 minuto. Giordano (que debe mantenerse en la nevera, nevera, pero a ♦ Se aplica buffer Giordano temperatura ambiente en el momento de emplearlo) por 6 minutos. ♦ Se lava la lámina con agua de chorro, se seca por la parte posterior y se deja secar a temperatura ambiente en posición vertical.
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HEMOGLOBINA
Servir en un tubo de ensayo 2,5 ml de Drabkin y tomar 10 ul de sangre con anticoagulante, limpiar muy bien la punta y llevar al fondo del tubo y apl aplicar icar,, enju enjuag agar ar la punt unta con con el rea reactiv ctivo o en la part partee supe superi rior or.. Homogeneizar el tubo por inversión con movimientos suaves. Dejar en reposo de 5 a 10 minutos. Leer a 540 nm, llevando a cero con el blanco del reactivo y calibrando con el patrón de hemoglobina.
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HEMOGLOBINA: HEMOGLOBINA: ESPECTROFOTOM ESPECTROFOTOMETRICA ETRICA ICSH
FUNDAMENTO
El ión ferroso de la HB se oxida a ión férrico por acción del ferricianuro potásico formándose hemiglobina (metahemoglobina). La hemiglobina reacciona con el cianuro para formar cianhemiglobina (cianmetahemoglobina) que se puede medir por espectrofotometría. REACTIVOS
Reactivo concentrado y patrón de Hb, deben guardarse en refrigeración, bien cerrados, protegidos de la luz y evitar su contaminación durante su uso para que se conserve hasta la fecha indicada en la etiqueta. Pres Presen enci ciaa de turb turbid idez ez,, part partíc ícul ulas as en el reac reacti tivo vo y el blan blanco co son son indicaciones de deterioro, además de lecturas superiores de 0,010 a 540 nm del blanco. Reactivo de trabajo: Dilu Diluiir el cont conten enid ido o del del fras frasco co de reac reacti tivo vo concentrado hasta 1000 ml con agua destilada, agitar. Para preparar otros volúmenes mezclar en proporción 1 ml de reactivo concentrado + 49 ml de agua destilada. Conservar en frasco oscuro siendo estable 6 meses a 15-30°C: No congelar. MUESTRAS
Sangre capilar o venosa recogida con EDTA EDT A o heparina. La Hb en sangre es estable 6 días de 2-8°C.
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PROCEDIMIENTO
PATRON MUESTRA REACTIVO TRABAJO
BLANCO
PATRON
MUESTRA
--2.5 ml
10 ul -2.5 ml
-10 ul 2.5 ml
Agitar y dejar por 3 minutos a temperatura ambiente. Leer las absorbancias a 540 nm frente al blanco. El color es estable por varias horas. Cálculos:
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Con patrón: A muestra ------------ X C patrón = C muestra A patrón Sin patrón: A muestra X 37,5 = C muestra VALORES NORMALES:
HOMBRES
12-14 años 15-17 años 18-74 años
12,0-16,0 g/dl 11,7-16,6 g/dl 13,5-17,5 g/dl
MUJERES
11,5-15,0 g/dl 11,7/15,3 g/dl 12,0-16,0 g/dl
CARACETERISTICAS CARACETERISTIC AS METROLOGICAS METROLOGICAS
Límite de detección: 0,2 g/dl de Hb. Límite de linealidad: 20 g/dl. Para valores superiores diluir la muestra ½ con agua destilada destilada y repetir. Interferencias: La bilirrubina no interfiere. La lipemia puede elevar falsamente los resultados debido a la turbidez. Otros medicamentos y sustancias pueden interferir.
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HEMATOCRITO
Se llena el capilar de la muestra tomada con anticoagulante, hasta las 3/4 partes y sellar por este extremo con plastilina, colocarla en la microcentrifuga de 5 a 10 minutos entre 10.000 y 5.000 r.p.m. Cuando la centrifuga pare, leer el valor en la tabla de hemotocrito. Tomando el punto cero donde la plastilina se une con la muestra hasta la línea superior que marque con sangre en el capilar. Solamente se lee si no han quedado espacios, ni burbujas.
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RECUENTO DE LEUCOCITOS
Aspirar mediante la pipeta de Thoma sangre total hasta el enrose de 0.5 y limpiar la punta de la pipeta. Aspirar líquido de turk hasta el enrose de 11. Con el dedo índice tapar la parte superior de la pipeta y con el dedo pulgar la parte inferior y mezclar suavemente. Desechar las tres primeras gotas. Llenar la cámara. Realizar la observación y conteo en 10X. Contar los leucocitos presentes en los 4 cuadrados grandes (los de las 4 esquinas), se cuentan las células contenidas en el interior del área de recu recueento nto y las las que sea sean tang angente ente o seca secan ntes tes a las las líne líneaas de demarcación superior y derecha. El total de leucocitos en los 4 cuadrados se multiplica por 50 y este será el valor del recuento r ecuento de leucocitos. RECUENTO DIFERENCIAL
En la lámina una vez coloreada se lee con objetivo de 100X las células vistas hasta llegar a 100 células contadas. La lectura se realiza en sentido vertical y de derecha a izquierda buscándose con anterioridad en 10X la zona ideal, en la parte media del frotis. Cada valor se dará en porcentaje de células vistas. Es importante diferenciar los tres tipos de células que podemos observar: f unción defensiva. ♦ Células nucleadas (leucocitos) con función
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Células anucleadas (hematíes) con función respiratoria. Seudo ofrag fragme ment ntos os cito citopl plas asmá máti tico coss (pla (plaqu quet etas as)) con con ♦ Seud hemostática. ♦
func funció ión n
Los Los leuc leucoc ocit itos os tien tienen en la carac caracte terí ríst stic icaa de tene tenerr núcl núcleo eo y orga organé nélo loss citoplasmáticos lo que permite su diferenciación morfológica con los hematíes y las plaquetas. Estos pueden ser: Polinu Polinucle cleare ares: s: de núcleo núcleo lobula lobulado do de aparie aparienci nciaa múltip múltiple le como los neutrofilos, eosinófilos y basofilos. Mono Mononu nucl clea eare res: s: núcl núcleo eo únic único o y redo redond ndo o como como los los linf linfoc ocit itos os y monocitos.
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Neutrofilos:
Es el más predominante, su citoplasma es ligeramente acid acidóf ófil ilo o (ros (rosaa páli pálido do)) y cont contie iene ne abun abunda dant ntes es gran granul ulac acio ione ness distribuidas en todo el citoplasma; el núcleo es de color violeta oscuro y de cromatina densa y esta divido en lóbulos unidos por puentes de cromatina, dando la apariencia de tener varios núcleos, cuando el puente es muy ancho adquiere forma de C siendo propio de los cayados o células inmaduras de esta línea granulocítica. Eosino nofi filo los: s: Su cito citopl plas asma ma esta esta llen lleno o de granu granula laci cion ones es de colo color r Eosi naranj naranjaa que se observ observan an de gran gran tamaño tamaño,, bien bien indivi individua dualiz lizado adoss y redondos, casi nunca cubren el núcleo, el que se observa de un violeta más tenue que el neutrofilo y por lo general de dos masas. Basofi filo los: s: Es el menos menos abun abunda dant nte. e. su cito citopl plas asma ma se obse observ rvaa de Baso grán gránul ulos os irreg irregul ular ares es que que cubr cubren en comp comple leta tame ment ntee el núcl núcleo eo y se observan de color muy oscuro entre azul y morado. Linfocitos: El citoplasma puede ser escaso o abundante y de color azul azul claro, claro, se observ observan an pequeñ pequeñas as y escasa escasass ganula ganulacio ciones nes de color color rosado a rojo. Su núcleo es redondo y abarca gran parte de la células, se pueden observar espacios en el núcleo que están compuestos por cromatina laxa. Monocitos: De citoplasma abundante y color gris azulado. Aveces posee vacuolas. Posee granulaciones finas azurofilas por todo el citoplasma , el núcleo es central por lo general redondo aunque con una o más escotaduras ocupa gran parte del citoplasma, su cromatina es laxa, filamentosa e irregular.
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Se debe debe inform informar ar la presen presencia cia de neutró neutrófil filos os con granul granulaci ación ón tóxica tóxica,, restos nucleares nucleares o normoblasto normoblastos, s, cayados, cayados, linfocitos linfocitos atípicos atípicos (cuando (cuando es superior a el 10% del total de linfocitos), reacción leucoeritoblástica que serán contados dentro de las 100 células del recuento diferencial. Ante la presencia de normoblastos realizar la corrección corrección de leucocitos. RECUENTO DE PLAQUETAS
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Se busca busca entre el cuerpo cuerpo y la cola del frotis frotis sanguín sanguíneo eo una zona zona de distribución uniforme de hematíes (que no estén amontonados y no se observen observen grandes grandes espacios espacios en blanco blanco entre ellos), se cuenta cuenta la presencia presencia de 100 de estos por campo. Así, se contara en cada campo, siendo 10 en total, el número de plaquetas observadas, se suman, se divide por 10 y se multiplica por 21.000, siendo este el valor del número total de plaquetas por milímetro cúbico. ANALISIS DE FROTIS DE SANGRE PEIFERICA
Seleccionamos la zona ideal de lectura en 10X, hacia la parte de la pluma y el cuer cuerpo po del del froti frotis, s, dond dondee las las célu célula lass se endo endosa san n unas unas con con otra otrass observándose bien delimitados sus contornos.
Para valorar el recuento total de blancos, miramos 3 campos en forma vertical en 10X, homógenos en cuento a número de hematíes, contar la cantidad de células blancas en cada uno de ellos. Promediar y multiplicar este valor por la constante 250, dándonos el valor de leucocitos en mm3. (a+b+c) / 3 X 250 = leuc / mm3 Estos datos son confiables cuando la cantidad de blancos no sobrepasa los 20.000 mm3. Cifras mayores se pueden considerar fuentes de error y es necesario realizar el recuento total por líquido de turk confirmando el valor repitiendo la prueba. Observar la morfología de los leucocitos en 100X e informar: Cuanttitat itativ ivam amen ente te:: la can cantid tidad por por mm3 mm3 como como norm normaales, les, • Cuan leucocitosis, leucopenia.
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Cualitativamente: el diferencial, si hay disminución o aumento en alguna de las líneas, morfología normal o las alteraciones observadas en las las dife diferen rente tess líne líneas as.. Anot Anotar ar la pres presen enci ciaa de neut neutró rófi filo loss con con granulación tóxica, cuerpos de Dohle, degranulados, macropolicitos (hiper (hiperseg segmen mentad tados) os),, hipolo hipolobul bulaci ación ón (síndr (síndrome ome de Pelger Pelger – Huet) Huet) vacuol vacuolas; as; linfoc linfocito itoss atípic atípicos, os, vacuol vacuolado ados; s; monoci monocitos tos vacuol vacuolado ados; s; eosi eosinó nófil filos os y basó basófi filo loss hipe hiperlo rlobu bula lado dos, s, con con alte altera raci cion ones es en los los gránulos; restos nucleares; núcleos picnóticos; presencia de células inmaduras. •
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Para linfocitos atípicos se debe informar: si son mas del 10% (es decir, sumándolos al total de los linfocitos) se deben informar en el diferencial de los 100 leucocitos. Si es menor del 10% del total de linfocitos solo se anotan como: se observan linfocitos atípicos escasos.
En caso de reacción leucoeritoblástica se incluyen por aparte dentro del recuen recuento to difere diferenci ncial. al. Además Además la presen presencia cia de normob normoblas lastos tos deberá deberán n incluirse como se menciono. En caso de reacción leucoblástica o desviación a la izquierda también se deberá incluir en el recuento diferencial).
Observar en 100X los eritrocitos para determinar y valorar: el tamaño o anisocitosis, el color, la variación de formas o poiquilocitosis y, la inmadurez globular o policromatofilia que es la presencia de hematies con tonalidad gris azulada y de mayor tamaño. • La anisocitosis se puede cuantificar así: Se determina al compararlos con los linfocitos pequeños, un glóbulo rojo normal debe tener el mismo tamaño de un linfocito. Se cuantifica en 10 campos: Normal Ligera Moderada Marcada 0–5 6 – 15 16 – 30 mayor 30 El tamaño se relaciona con el VCM 76 – 96 fl. Puede ser normocítico, microc microcíti ítico co o macroc macrocíti ítico, co, para para estos estos dos último últimoss se informa informa ligera ligera,, moderada o marcada. De acuerdo al VCM: Macrocitosis:
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Ligera H 95 – 108, M101 – 108; moderada 109 – 120; marcada mayor de 120. Microcitosis: Ligera 76 – 80, moderada 66 – 75, marcada menor de 65. El color dado normocrómico como: Normal 0- 5 •
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por la cantidad de hemoglobina presente puede ser o hipocromía. Esta última se determina en 10 campos Ligera 6 – 15
Moderada 16 – 30
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Marcada mayor 30
Para Para la poiq poiqui uilo loci cito tosi siss se debe debe info informa rmarr la forma forma prev preval alen ente te y cuantificar así: Normal Ligera Moderada Marcada 0 1–5 6 – 15 mayor de 15 •
Pueden ser: esferocitos, ovalocitos, estomatocitos, codocitos, dacriocitos, esquitocitos, queratocitos, acantocitos, knizocitos, célula falciforme. La policromatofilia y los reticulositos (se valoran con coloración de azul de cresil brillante) son proporcionales en 10 campos, pero solo determinaremos la policromatofilia como: Normal Ligera Moderada Marcada 0–2 2–3 3–4 mayor 4 •
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Además se debe informar la presencia de inclusiones como punteado basófilo, cuerpos de Howell Jolly, cuerpos de Heinz, anillos de Cabot, restos nucleares, parásitos y normoblastos si los hay.
Para las plaquetas se debe informar si son normales en número y morfología. Si no se solicito antes un recuento de plaquetas que nos de un valoración de la cantidad se observa 100X, 10 campos en proporción cada uno de 100 hematíes y se debe encontrar de 7 a 21 plaquetas por campo para considerarlas normal, , en casos contrarios se informa trombocito trombocitosis sis o trombocitopeni trombocitopeniaa y la morfología cuando cuando se encuentran mas de 3 macroplaquetas lo que se debe informar o por el contrario microplaquetas.
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NORMOBLASTOS
Ante Ante la presen presencia cia de normob normoblas lastos tos se debe debe realiz realizar ar la correc correcció ción n de leucoc leucocito itos. s. En este este recuen recuento to interfie interfiere re los normob normoblas lastos tos y los restos restos nucleares. Se corrigen siempre que se encuentren mas del 10% al realizar el recuento diferencial. Deberán ser anotados a medida que se realice el recuento diferencial anotán anotándol dolos os apearte apearte y se inform informaa la cantid cantidad ad de normob normoblas lastos tos en100 en100 células blancas contadas.
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FORMA DE CORRECCION: 1. Hacer Hacer el recu recuent ento o difere diferenci ncial. al. 2. Saber cuántos cuántos normobla normoblastos stos o cuantos cuantos restos restos nucleares nucleares se obtuvieron obtuvieron en este recuento. 3. Conocer Conocer el el recuento recuento total total de blancos. blancos.
Leucocitos corregidos: número de leucocitos contados X 100 / número de normoblastos + 100 Recuento total de leucocitos por mm3 por cualquier método, es decir, automatizado o manual por líquido de Turk. X 100 % que es le número de leucocitos contados para el diferencial / (100 % que es el número de leucoc leucocito itoss contado contadoss para el difere diferenci ncial al + el % de restos restos nuclea nucleares res o normoblastos contados en el diferencial). Ejemplo: 7.500 mm3 de leucocitos por líquido de turk 100 % de células contadas para el diferencial 20% de restos nucleares o normoblastos hallados en el diferencial 7.500 7.500 mm3 de leucoc leucocito itoss X 100% 100% total total de célula célulass contad contadas as en el diferencial / 120% 120% = 6.250 mm3 de leucocitos corregidos.
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LINEA MEGACARIOCITICA MEGACARIOCITICA
MEGACARIOBLASTO: De tamaño grande, núcleo con cromatina laxa laxa,, pres presen enci ciaa de nucl nucleo eolo lo,, cito citopl plas asma ma inte intens nsam amen ente te azul azul,, sin sin gránulos, gránulos, presenta prolongac prolongaciones iones a modo de seudópodo seudópodoss útiles útiles para su identificación morfológica.
PROMEGACARIOCITO: De mayor tamaño que la anterior, núcleo multilobulado, citoplasma basófilo con abundantes granulaciones y desflecado.
MEGACA MEGACAROC ROCITO ITO:: Es el de mayor mayor tamaño tamaño.. Gran Gran citopl citoplasm asmaa de colo colorr gris grisác áceo eo y reple repleto to tota totalm lmen ente te de grán gránul ulos os azur azuróf ófil ilos os,, gran gran número de los cuales se agrupan y rodean lo que se denomina una membrana membrana de demarcación demarcación.. La fragmentaci fragmentación ón final del citoplasma citoplasma dará origen a las plaquetas.
PLAQUETAS: Se observan de pequeño tamaño, de color rosado y con gránulos en su interior.
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LINEA ERITROIDE
La maduración eritropoyética se caracteriza por: 1. El aume aument nto o prog progre resi sivo vo de la acid acidof ofil ilia ia celu celula lar, r, más más que que la líne líneaa mieoloide. 2. Desaparició Desaparición n de todos todos los organel organelos os citoplasm citoplasmático áticos. s. 3. Su núcleo núcleo es más central central y pequeño pequeño que la línea línea granulo granulocític cítica. a.
PROERITOBLASTO: Gran tamaño, intensa basofilia citoplasmática, núcleo grande con cromatina laxa, alrededor del núcleo se observa como como encaje, encaje, en el que pueden pueden aprecia apreciarse rse dos o más núcleolo núcleolos, s, aunque son muy difusos.
ERITOBLASTO BASOFILO: Es de menor tamaño que la anterior, la cro cromati matin na es más más burd burdaa como como gru grumos mos y los los nuc nucleo leolos los poc poco distinguibles o completamente ausentes. El citoplasma conserva su intensa basofilia, núcleo más central.
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ERITOBLASTO POLICROMATICO: Es de menor tamaño que la anterior, su citoplasma es de color gris azulado, cromatina gruesa e irregularmente condensada se nota como un tablero de ajedrez.
ERITOBLASTO ORTOCROMATICO: Su tamaño es un poco menor a la anterior sin ser muy notoria la diferencia, núcleo picnótico, más pequeño y más condensado, condensado, citoplasma gris rosado.
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RETICULOCITO RETICULOCITO:: Tiene un tamaño tamaño un poco mayor que el hematie hematie,, no tiene núcleo, citoplasma de tono azulado, con coloración supravital revela un retículo granulofilamentoso. LINEA GRANULOPOYETICA GRANULOPOYETICA
Es cara caract cter erís ísti tico co que que el núcl núcleo eo dism dismin inuy uyaa de tama tamaño ño en rela relaci ción ón al citoplasma.
MIELOBLASTO MIELOBLASTO:: Citoplasma Citoplasma azulado azulado y granulacio granulaciones nes primarias primarias o azurófilas muy escasas o inexistentes. Cromatina muy laxa con dos o tres nucleolos definidos definidos y oscuros, oscuros, el núcleo ocupa la mayor parte de la célula quedando solo una pequeña cantidad del citoplasma.
PROMIELOCITO: De mayor tamaño que la anterior, con abundante granu ranula laci ción ón azu azurófi rófila la (se (se obs observ ervan rojo rojos, s, tosc toscos os y gran randes) des) citoplasmática. Los gránulos son visibles en el núcleo como en el citoplasma. Núcleo redondo y relativamente grande, aún se pueden dist distin ingu guir ir los los nucl nucleo eolo los. s. El cito citopl plas asma ma es azul azul con con una una zona zona relativamente clara alrededor del núcleo.
MIELOCITO: De menor tamaño que la anterior, la cual se caracteriza por la gran abundancia de granulaciones específicas citoplasmáticas. Según su naturaleza se clasifican en neutrófilo, eosinófilo y basófilo. El núcl núcleo eo cont contie iene ne una una crom cromat atin inaa más más cond conden ensa sada da que que la del del promielocito, es excéntrico y no posee nucleolos. Es de forma redonda u ovalada.
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METAMIELOCITO: De menor tamaño que la anterior con núcleo excéntrico, presenta una ligera invaginación dando aspecto de frijol, citoplasma rosado.
EN BAND BANDA A O CAYA CAYADO DO:: La inva invagi gina naci ción ón es más más pronu pronunc ncia iada da arqueando la totalidad del núcleo, que se va a lobular generalmente a neutrófilo, eosinófilo o basófilo según los gránulos que se observan cerca del núcleo.
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LINEA MONOCITICA
MONO MONOBL BLAS ASTO TO:: Son Son simi simila lare ress a los los mielo mielobl blas asto toss y difí difíci cill de diferenciar diferenciar entre sí. El citoplasma es basófilo basófilo y tienen tienen un halo pálido pálido alrededor del núcleo. El núcleo tiene una cromatina fina, suave y homogénea que se ve interrumpida por los núcleolos, que pueden ser de 2 a 4 redondos y de color azul claro.
PROMONOCITO: Tiene un núcleo regular e irregular, citoplasma azul grisáceo más abundante que en el monoblasto. Escasos gránulos azurófilos, el citoplasma presenta ligeras prolongaciones simulando pseudópodos.
MONOCITO: Núcleo irregular en forma de frijol. Un pliegue en el núcleo es bastante caracterís rístico. La crom romatina es fin fina e irregularmen irregularmente te distribuid distribuida. a. El citoplasma citoplasma es de color color azul – grisáceo. grisáceo. Casi siempre contiene gránulos azurófilos. HISTIOCITOS
Son los monocitos que de sangre periférica pasan a los diferentes tejidos, con actividad macrofágica. Sus características dependen del tejido al cual ha migrado: NOMBRE TEJIDO Histiocitos Conjuntivo Células de Kupfer Hígado Macrófagos alveolares Pulmón Macr. de cordones y senos es esplénicos Bazo
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Células sinusoidales Macrófagos medulares Macrófagos de las serosas Osteoclastos Células de la microglia
Ganglio linfático Médula ósea Pleura y peritoneo Hueso Sistema nervioso
Los Los hist histio ioci cito toss son son célu célula lass gran grande dess con con abun abunda dant ntee cito citopl plas asma ma que que contiene vacuolas digestivas y/o partículas fagocitadas bien visibles, de núcleo excéntrico. El citoplasma es azul claro o gris azulado, con o sin gránulos. Algunos pueden presentar seudópodos obtusos, sin gránulos. Otros Otros bordes bordes citopl citoplasm asmáti áticos cos dilace dilacerad rados, os, caract caracterí erísti sticos cos de célula célulass tisulares fijas que han sido arrancadas de su sitio normal.
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LINEA LINFOIDE
LINFOBLASTO: Tiene la cromatina homógena y delicada pero es un poco más burda que la de los los mieloblastos y monoblastos. monoblastos. Tiene uno o dos nucleolos, escaso citoplasma azul, sin gránulos y un halo claro perinuclear.
PROLINFOCITO: Más basófilos que los linfocitos, más grandes, de núcleo núcleo ligera ligeramen mente te excént excéntric rico, o, con un nucleo nucleolo, lo, cromat cromatina ina menos menos densa que el linfocito, el citoplasma a veces parece rugoso y granular. granular. LINEA PLASMOCITICA
PLASMOBLASTO: Célula de tamaño intermedio. Por lo general es redonda pero no necesariamente, de núcleo grande con cromatina fina y presencia de nucleolo bien definido, citoplasma de color azul oscuro y algunas veces se puede observar una zona clara perinuclear.
PROPLASMOC PROPLASMOCITO: ITO: forma ovalada, ovalada, núcleo núcleo excéntrico excéntrico grande grande que contiene el nucleolo, mayor cantidad de citoplasma que presenta color azul intenso y la zona clara perinuclear se observa mejor.
PLASMOCITO: el núcleo es muy excéntrico con una cromatina muy condensada da el aspecto de radios de rueda, el citoplasma ha tomado
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forma ovalada. El citoplasma citoplasma no es granuloso granuloso pero sí de gran tamaño contrario al linfocito, se tiñe de azul oscuro y presenta una brillante translucidez o zona clara. HEMOCLASIFICACION
Si el paciente llega únicamente con orden de hemoclasificación, se toma la muestra del pulpejo de su dedo índice. índice. Se limpia la zona con algodón impregnado con alcohol antiséptico, se deja secar a temperatura ambiente toma una lanceta y se punciona por la zona del lado del pulpejo del dedo, se desc escarta arta la prime rimera ra gota gota y se toma toma tres tres gota otas en una una lámi lámin na portaobjetos, separadas entre sí, se colocara una torunda de algodón en la zona puncionada y se le dirá al paciente que la sostenga por un minuto.
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La lámina portaobjetos en su posición horizontal se divide en 3 partes, en cada una en la parte superior se marca como A, B y D. Cada gota se colo coloca ca deba debajo jo de cada cada letra letra y se apli aplica can n los los reac reacti tivo voss del del jueg juego o de hemoclasificadores, en la zona A, se aplica una gota de Anti A, en la zona B una gota de Anti B y en la zona d una gota de Anti D. Para los dos primeros espacios se determina el grupo sanguíneo y para el último el Rho. Si solo se observa aglutinación en la zona A, el paciente es grupo A; si solo se observa aglutinación el la zona B, el paciente es grupo B; si la aglutin aglutinación ación es es para las dos zonas, zonas, el paciente paciente es grupo AB y si no se observa observa aglutinac aglutinación ión para ningun ningunaa de las dos zonas, zonas, el paciente es grupo sanguíneo O. En la zona D la presencia de aglutinación nos indica rho positivo y la no aglutinación aglutinación un rho negativo. Si la orden además indica otro examen que implique la toma de tubo con EDTA, la muestra será tomada del mismo tubo y no se puncionara al paciente en su dedo índice. índice. DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO PRINCIPIO BOLOGICO DE LA PRUEBA
Se basa en la hemaglutinación directa. La incubación de los hematíes muestra con el reactivo Anti A, Anti B, Anti D produce una reacción específica de antígeno - anticuerpo, si el correspondiente antígeno esta
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presente en los hematíes muestra. La reacción es demostrada por la aglutinación visible. La no aglutinación indica ausencia del antígeno para cada uno de los reactivos siempre que se hayan cumplido correctamente la indicaciones del procedimiento. DESCRIPCION DEL PRODUCTO
Los reactivos son preparados de pool de suero humano obtenidos de donantes inmunizados. Deben almacenarse de 2-8°C, no congelar. Si se observ observaa turbid turbidez ez no emplea emplearlo rlo,, puede puede presen presentar tar contam contamina inació ción n bacteriana o deterioro del producto, tampoco usarlo después de la fecha de vencimiento. El material biológico con los que se preparó el reactivo fue sometido a pruebas de HBsAg y Anti VIH dando negativo, sin embargo, se deben manipular como si fueran material sospechosos de infección.
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MUESTRA
No se requiere preparación especial del paciente para obtener la muestra. Se puede tomar muestra venosa (usando anticoagulante) o por punción capilar en este caso si la prueba se realiza de una vez sin retrasos para evitar que la muestra se seque. Lavado de glóbulos rojos de pueden almacenar en solución preservante de 2-8°c por no más de 35 días. GOTA GRUESA
Puede hacerse con sangre con anticoagulante o de gotas obtenidas por punción, que se obtienen de la parte lateral de la yema del dedo medio de la mano y en niños pequeños del dedo gordo del pie. Se debe limpiar la piel con alcohol, se deja secar, se punciona con lanceta desechable y se limpia la primera gota con algodón seco. Se presiona para obtener una gota pequeña. Se coloca dos gotas en una lámina portaobjetos sin tocar la piel, la cual se ha divido imaginariamen imaginariamente te en 3 partes, partes, una para marcarla en el extremo derecho derecho y los otros dos espacios espacios para colocar colocar cada gota. gota. Se extiende extiende la sangre de cada gota utilizando el ángulo y los primeros 5 mm del borde longitudinal de otro portaobjetos se extiende la gota amanera de “N” para
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formar un rectángulo de 1,5 a 0.5 cm; se hacen 2 laminas que se dejan secar a temperatura ambiente en posición horizontal, se deben colorear antes de 2 horas horas de tomadas empleando empleando la coloración de Field. Limpiar con alcohol la lámina que se utilizó para las gotas gruesas con el fin de evitar la contaminación de las siguientes muestras. Es importante tener en cuenta que el exceso en el tiempo de secado, el alcohol o el calor pueden fijar la hemoglobina, haciendo inadecuada la muestra para el diagnóstico de malaria.
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Primero se hace una precoloración: Se sumerge durante 1 segundo la lámina en azul de metileno fosfatado, se deja escurrir sobre una toalla de papel en posición vertical. Enjuagar con solución amortiguadora rápidamente La coloración se realiza colocando la lámina boca abajo en una superficie cóncava, allí se adiciona el colorante de Field evitando la formación de burbujas que se ha preparado previamente adicionando 3 ml de solución amortiguadora, una gota de solución A y una gota de solución B; se deja actuar por 9 minutos, luego se escurren sobre el papel absorbente y se deja secar. La observación se realiza en 100X, examinando la gota a partir de uno de sus sus bord bordes es,, y move moverr la lámi lámina na en brev breves es traz trazad ados os hori horizo zont ntal ales es y verticales (zig – zag) en la que se identifica la presencia del parásito, su especie en caso de observarse y el recuento del plasmodium. También se puede hacer extendido coloreando la lámina con 2 ml Wright por 1 minuto y luego 0.5 de buffer Giordano por 6 minutos, se lava con agua de chorro, se escurre y se deja secar a temperatura ambiente en posición vertical. Para hacer el diagnóstico por la lectura de extendido se debe realizar hematocrito al paciente. LECTURA: Con base en el número de leucocitos. En gota gruesa se cuentan los trofozoitos, esquizontes y gametocitos para P. vivax; y/o trofozoitos y/o y/o game gameto toci cito tos, s, aunq aunque ue ocas ocasio iona nalm lmen ente te esqu esquiz izon onte tess para para P. falciparum, presentes en los campos microscópicos determinados con
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10X y 40X donde se encuentre mayor número de leucocitos. Un buen campo microscópico es aquel en donde se encuentran de 10 a 20 leucocitos, mirando los campos hasta que estos sumen 100 leucocitos. Conociendo el número de leucocitos por mm3 se puede calcular la cantidad de parásitos en este volumen de sangre. De no visual visualiza izarr el parási parásito, to, se deben deben observ observar ar 200 campos campos para para calificar la muestra como negativa. Ejemplo: paciente con malaria con un recuento de 8.000 leuc/ul de sangre sangre.. Se establ establece ece la propor proporció ción n de parási parásitos tos en 100 leucoc leucocito itoss encontrados: # de parásitos X 8.000 luec/ul de sangre / 100 leucocitos = # de parásitos/ul de sangre.
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Con base en el número de sangre de la gota gruesa. Se calcula que en una preparación bien hecha, 100 campos microscópicos en 100X, equivalen a 0.2 mm3 de sangre. Puede determinarse la parasitemia contando en los 100 campos, los trofozoitos y esquizontes presentes.
Con base en el número de eritrocitos. En un extendido de sangre periférica se busca el porcentaje de eritrocitos parasitados por trofoz trofozoit oitos os y esquiz esquizont ontes es presen presentes tes en 10.000 10.000 eritroc eritrocito itos, s, lo que equivale a 100 campos microscópicos, asumiendo que cada campo tiene tiene igual igual cantid cantidad ad de eritro eritrocit citos. os. Se busca busca campos campos en donde donde la distri distribuc bución ión de los eritro eritrocit citos os sea homogéne homogéneaa y no se encuentr encuentren en superpuestos, hacia el segundo tercio del extendido. Ejempl Ejemplo: o: serían serían necesa necesario rioss 33 campos campos micros microscóp cópico icos, s, si hay 300 eritrocitos por campo.
INFORME DE RESULTADOS: Con base en el número de leucocitos: Para los casos de P. vivax no se debe hacer recuento ni diferenciación entre las formas sexuadas y asex asexua uada das. s. En los los caso casoss de P. falc falcip iparu arum m se debe debe info informa rmarr por por separado separado las formas sexuadas sexuadas y asexuadas. asexuadas. En las infecciones infecciones mixtas mixtas se debe registrar primero el parásito prevalente y luego la especie subordinada. Ejemplos: • Hemoparásitos: Negativo.
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• • •
• •
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Hemoparásitos: Positivo para P. vivax. Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum (50.000 trofozoitos/ul). Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum (100 trofozoitos/ul y 5 gametocitos/ul). Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum (200 gametocitos/ul). Hemo Hemopa parás rásit itos os:: Posi Positi tivo vo para para infe infecc cció ión n mixt mixta: a: P. viva vivax x (5.0 (5.000 00 parásitos/ul) y P. falciparum ( 2.000 trofozoitos/ul). trofozoitos/ul). Hemoparásitos: Positivo aunque no se puede precisar la especie. Se sugiere nuevo examen.
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Con base en el número de sangre de la gota gruesa. El recuento semi cuan cuanti tita tati tivo vo cons consis iste te en info informa rmarr la espe especi ciee de Plas Plasmo modi dium um que que ocas ocasio iona na la infec fecció ción y el núme úmero apro aprox xima imado de pará arásito sitoss encontrados. Así: 1 – 10 en 100 campos microscópicos + 11 – 100 en 100 campos microscópicos ++ 1 – 10 por campo microscópico ++ + mayor de 10 por campo microscópico ++++
En las infec fecciones por P. falciparum, por la facilidad en el reconocimiento de los gametocitos de los trofozoitos, es posible informar separadamente las forma sexuales de las asexuadas. Ejemplo: Hemoparásitos: Positivo para P. falciparum: trofozoitos ++ y gametocitos + Hemoparásitos Positivo para P. vivax ++.
Con base en un extendido de sangre periférica. Para determinar el número de parásitos en 10.000 eritrocitos serian necesarios 33 campos si hay 300 eritrocitos por campo microscópico. Para un hematocrito de 40% estimamos que el paciente tienen 4.000.000 eritrocitos/ul de sangre. Ejemplo: # parásitos parásitos X # de eritrocitos eritrocitos/ul /ul de sangre / 10.000 10.000 eritrocitos eritrocitos = parásitos/ul de sangre
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3 eritrocitos/ul = hematocrito x 100.000 reemplazando y simplificando: # de parásitos parásitos en 10.000 10.000 eritrocitos eritrocitos parásitos/ul de sangre.
X
hematocrito hematocrito
X
10
=
#
Se indica la presencia y la cantidad de formas presentes.
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COMP COMPAR ARA ACIO CION DE LAS LAS ESPE ESPECI CIES ES DE PLA PLASMO SMODIUM DIUM EN EXTENDIDO G.R parasitados
Forma especiales del parásito Tamaño del parásito Fase de anillo de los trofozoitos (T. Jóvenes)
P. vivax P. falciparum Agrandados, pálidos. No agrandados. Color Punteado fino (punteado de norma normal, l, Punt Puntea eado do grues grueso o Schuffner, puntos (hen (hendi didu dura rass de Maur Maurer er,, pequeños de rosa a rojos puntos rojos generalmente que aumentan con escasos.). Invade todos los intensidad con el eritrocitos. * crecim crecimien iento to del parási parásito, to, numero numerosas sas). ). Inicia Inicialme lmente nte invade los reticulocitos, Marginales raras En “i”, “” “ ”, candelabro.
Grande Pequeño Anillos grandes (1/2 a 1/3 Anillos muy pequeños (1/5 del diámetro de los del diámetro de los erit eritro roci cito tos) s) a vece vecess con con hemati hematies) es).. Muchas Muchas veces veces cit citopla oplasm smaa ameb ameboi oide de o dos gránulos o dos puntos amorfo, vacuolados. de cromat cromatina ina;; infecc infeccion iones es General Generalmen mente te un gránul gránulo o múltiples; anillos delicados de cromatina, y regulares; pueden ocasionalmente adherirse a los eritrocitos. granulaciones de Shuffner. Pigmento en los trofozoitos Partí Partícu cula lass finas finas de colo color r Grum Grumos os burd burdos os de colo color r en desarrollo pardo ligero carmelito, negro negro o carmel carmelit ito o oscuro oscuro,, amarillent amarillento, o, diseminados diseminados,, esca escaso sos, s, disp disper erso soss en el en el citoplasma del citoplasma del parásito. En parásito, en los esquizontes los esquiozontes se se condensan en una masa con condensa nsa en una masa única. única. Trof Trofoz ozoi oittos viej viejos os Muy Muy pleom eomorf orfos, os, rico en Com Compact actos y red redon onde dead ados os,,
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Esquizontes maduros (segmentados)
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Gametocitos
Distribución en sangre periférica Para Parasi site temi miaa habi habitu tual al
citoplasma muy ameboide, presencia de granulaciones vacu vacuol olad ado, o, aum aumenta enta el de Maurer * tamaño del eritrocito. Ocupa Ocupa genera generalme lmente nte todo todo De 2 a 4 merozoitos. Muy el glóbulo rojo. De 12 a 24 raros raros en sangre sangre perifé periféric ricaa mer merozoi ozoito toss. Pose Poseee una una pero puede llegar a tener de de masa de pigmento 8 y 40merozoitos.. * malá malári rico co,, granu granula laci cion ones es Shuffner. Redondos u ovales, Semil Semiluna unare ress o salc salchi hich cha. a. gra grandes des, ocup cupa por lo Masa de cromatina central general general todo todo el eritr eritroci ocito, to, rodeada ada por pigmento nto cromat cromatina ina abundan abundante te laxa laxa malárico en forma de puede se claramente bastones. distinguible (macrogametocito femenino) o difusa (microgametocitomasculino) Todas las formas. Solamente anillos y semilunas (gametocitos). * Hast Hastaa 30.0 30.000 00 /ul /ul de sang sangre re.. Hast Hastaa más más de 200. 200.00 000 0 / ul. ul. Comúnmente 50.000 / ul
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* Ordinariamente solo se observan etapas de anillo o gametocitos en sangre periférica con P. falciparum; las etapas consecutivas a la fase de anillo hacen adherentes a los eritrocitos y tienden a ser retenidos en los lechos capilares profundos en infecciones masivas. CARACTERISTICAS DEL PLASMODIUM EN GOTA GRUESA PARASITO Trofo rofozo zoiitos tos jóve jóvene ness
Trofozoito maduro
P. VIVAX For Formas mas de ani anilllo peq peque ueño ño,, aveces aveces abiert abierto o mostr mostrando ando un cito citopl plas asma ma regu regula larr o ameboide.
P. FALCIPARUM Ani Anillos los muy peque equeño ños, s, finos y delicados, regulares. regulares. A veces abierto form forman ando do figu figura ra de i, “”, “”, candelabro. Grande con variedad de Com Compact acto con con asp aspecto ecto formas ameboides. sóli sólido do,, vacu vacuol olaa peque pequeña ña,, Vacuola presente. usualmente contiene Pigmen Pigmento to malári malárico, co, color color pigmento. Raro de carmel carmelit ito. o. Granul Granulaci acione oness encontrar. de Shuffner
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Esquizonte
Gametocitos
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Grandes, redondos. Peq Pequeños ños, redon dondos y Gránulos de pigmento nto comp compac acto tos. s. Con Con 2 o más más marrón o negro esparcidos merozoitos, una sola masa por el citoplasma. De 12 a de pigmen pigmento to malári malárico. co. En 14 merozoitos distribuidos infecciones severas irregularmente. acom acompa paña ñado do de un gran gran Granulaciones de Shuffner número de trofozoitos. a manera de halo rosado. Redondos ovalados con Forma Forma crecie creciente nte de media media una única cromatina luna luna o salchi salchicha cha,, tambié también n grande, pigmento malárico pueden demostrase distribuido en el redo redonde ndead ados os.. Crom Cromat atin inaa citoplasma, citoplasma, granulacion granulaciones es central rodeada de de Shuf Shuffn fner er com como halo halo pigmento malárico de color rosado. negro a manera de bastones. Se puede diferenciar el femenino del masculino.
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